JP2005525114A - Apparatus and method for quantifying mRNA from whole blood with high throughput - Google Patents
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Abstract
全血からｍＲＮＡを、簡単かつ再現性よくハイスループットに定量するための方法、装置、キットおよび自動化システムを開示する。より詳しくは、該方法、装置、キットおよび自動化システムは、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィルターの組み合わせを含む。Disclosed are methods, devices, kits and automated systems for quantifying mRNA from whole blood easily, reproducibly and with high throughput. More particularly, the methods, devices, kits and automation systems include a combination of leukocyte filters attached to oligo (dT) immobilized multiwell plates.
Description
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、全血からのｍＲＮＡのハイスループット単離および定量に関する。より詳しくは、本発明はオリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けられた白血球フィルターの組み合わせを用いて、ｍＲＮＡを単離および増幅するための方法および装置に関する。
[Background of the invention]
[Field of the Invention]
The present invention relates to high-throughput isolation and quantification of mRNA from whole blood. More particularly, the present invention relates to a method and apparatus for isolating and amplifying mRNA using a combination of leukocyte filters attached to oligo (dT) immobilized multiwell plates.
［関連出願の記載］
分子生物学の分野の研究により、細胞の発生起源および機能活性が、そのリボ核酸（ＲＮＡ）の研究から推論され得ることが明らかになった。この情報は、感染を診断するため、癌遺伝子発現細胞の存在を検出するため、家族性障害を発見するため、宿主の防御機構の状態をモニターするため、およびＨＬＡ型または他のマーカーの実体を調べるため、診療上有効に用いられ得る。ＲＮＡは、３種類の機能的に異なる形態：リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で存在する。安定なｒＲＮＡおよびｔＲＮＡは、翻訳の触媒プロセスに関与し、ｍＲＮＡ分子は遺伝情報を伝達する。全ＲＮＡのわずか約１〜５％がｍＲＮＡで、約１５％がｔＲＮＡで、および約８０％がｒＲＮＡで構成される。
[Description of related applications]
Studies in the field of molecular biology have revealed that the cell's developmental origin and functional activity can be inferred from its ribonucleic acid (RNA) studies. This information can be used to diagnose infection, detect the presence of oncogene-expressing cells, discover familial disorders, monitor the status of host defense mechanisms, and identify the identity of HLA types or other markers. It can be used effectively in clinical practice to investigate. RNA exists in three functionally different forms: ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) and messenger RNA (mRNA). Stable rRNA and tRNA are involved in the catalytic process of translation, and mRNA molecules transmit genetic information. Only about 1-5% of total RNA is composed of mRNA, about 15% is composed of tRNA, and about 80% is composed of rRNA.
ｍＲＮＡは、特に遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを定量的に観察するために使用される場合は、重要な診断用ツールとなる。ヒト末梢血は、ｍＲＮＡを解析するための優れた臨床材料である。例えば、血中における特定のキメラｍＲＮＡの検出は、異常細胞が存在することを示し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の分子診断に使用される。このことは、以下の文献に記載されている。
カワサキ(Kawasaki), E. S., クラーク(Clark) S. S.,コイン(Coyne) M. Y., スミス(Smith) S. D., シャンプリン(Champlin) R., ウィッテ(Witte) O. N.およびマコーミック(McCormick) F. P. 1988。 インビトロで増幅された白血病特異的ｍＲＮＡ配列の検出による慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病の診断(Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic luekemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro)。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702,
パハマン(Pachmann) K., チャオ(Zhao) S., シェンク(Schenk) T., カンタルジャン(Kantarjian) H., エルナジャール(El-Naggar) A. K., シチリアーノ(Siciliano) M. J., グオ(Guo) J. Q., アーリンハウス(Arlinghaus) R. B.およびアンドリーフ(Andreeff) M. 2001。 インサイチュ増幅により測定された個々の慢性骨髄性白血病細胞のｂｃｒ−ａｂｌｅ ｍＲＮＡの発現(Expression of bcr-able mRNA individual chronic myelogenous leukaemia cells as determined by in situ amplification)。 Br. J. Haematol. 112:749-59。
癌特異的ｍＲＮＡを測定することにより、微小転移癌細胞も血中において検出することができる。癌特異的ｍＲＮＡとしては、大腸癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺癌に対する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、甲状腺癌に対するサイログロブリン(ウィンゴ(Wingo) S. T., リンゲル(Ringel) M. D., アンダーソン(Anderson) J. S., パテル(Patel) A. D., ルークス(Lukes) Y. D., ジュー(Djuh) Y. Y., ソロモン(Solomon) B., ニコルソン(Nicholson) D., バルドゥッキ-シラノ(Balducci-Silano) P. L., レバイン(Levine)
M. A., フランシス(Francis) G. L.およびタトル(Tuttle) R.. M. 1999。 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ測定(Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healty subject). Clin. Chem. 45:785-89)、および黒色腫に対するチロシナーゼ(ペルキー(Pe
lkey) T. J., フライアソン(Frierson) H. F. Jr.およびブランス(Bruns) D. E. 1996.
固体腫瘍由来の循環腫瘍細胞および微小転移の分子的および免疫学的検出(Molecular and
immnological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors)。 Clin. Chem. 42:1369-81) などを挙げることができる。
さらに、これらの癌特異的ｍＲＮＡのレベルは治療後に変化し得るため、特異的ｍＲＮＡの定量は治療の追跡調査の際の有用な指標を提供する。
mRNA is an important diagnostic tool, especially when used to quantitatively observe gene up-regulation or down-regulation. Human peripheral blood is an excellent clinical material for analyzing mRNA. For example, the detection of specific chimeric mRNAs in the blood indicates the presence of abnormal cells and is used for molecular diagnosis of chronic myelogenous leukemia (CML). This is described in the following document.
Kawasaki, ES, Clark SS, Coyne MY, Smith SD, Champlin R., Witte ON and McCormick FP 1988. Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic luekemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5698-5702,
Pachmann K., Zhao S., Schenk T., Kantarjian H., El-Naggar AK, Siciliano MJ, Guo JQ, Arlinghaus RB and Andreeff M. 2001. Expression of bcr-able mRNA in individual chronic myelogenous leukaemia cells as determined by in situ amplification measured by in situ amplification. Br. J. Haematol. 112: 749-59.
By measuring cancer-specific mRNA, micrometastatic cancer cells can also be detected in blood. Cancer-specific mRNAs include carcinoembryonic antigen (CEA) for colon cancer, prostate-specific antigen (PSA) for prostate cancer, thyroglobulin for thyroid cancer (Wingo ST, Ringel MD, Anderson) JS, Patel AD, Lukes YD, Djuh YY, Solomon B., Nicholson D., Balducci-Silano PL, Levine
MA, Francis GL and Tuttle R .. M. 1999. Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healty subject. Clin. Chem. 45: 785-89), and for melanoma Tyrosinase (Perky (Pe
lkey) TJ, Frierson HF Jr. and Bruns DE 1996.
Molecular and immunological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors
immnological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors). Clin. Chem. 42: 1369-81).
Furthermore, since the levels of these cancer-specific mRNAs can change after treatment, quantification of specific mRNAs provides a useful indicator during treatment follow-up.
血液は、白血球（およそ５０００白血球／μＬ）に比べて無核赤血球（およそ５００万細胞／μＬ）を大量に含むため、通常はｍＲＮＡ解析の第１段階として、全血からの顆粒球またはリンパ球の単離が行なわれる。しかしながら、異なるサンプル間で白血球の特定のサブセットの回収が整合しないため、単離白血球の数は各サンプルについて測定され、その測定結果は、血液１μＬあたりのｍＲＮＡ量としてではなく、白血球数あたりのｍＲＮＡ量として表される。さらに、ｍＲＮＡ量は、長い単離プロセスの間に変化し得る。血液から癌細胞を単離するための方法は存在しないが、遺伝子増幅技術により、異なる遺伝子からなるプールからであっても特異的ｍＲＮＡレベルの同定および定量することが可能であるので、遺伝子特異的プライマーおよび遺伝子特異的プローブが入手可能な場合には、全血はｍＲＮＡ解析用の理想的な材料となる。 Since blood contains a larger amount of anucleated red blood cells (approximately 5 million cells / μL) than white blood cells (approximately 5000 leukocytes / μL), granulocytes or lymphocytes from whole blood are usually used as the first stage of mRNA analysis. Is isolated. However, because the collection of specific subsets of leukocytes does not match between different samples, the number of isolated leukocytes is measured for each sample, and the result is not the amount of mRNA per μL of blood, but the mRNA per leukocyte count. Expressed as a quantity. Furthermore, the amount of mRNA can change during a long isolation process. Although there is no method for isolating cancer cells from blood, gene amplification technology allows the identification and quantification of specific mRNA levels even from pools of different genes, so it is gene specific Whole blood is an ideal material for mRNA analysis if primers and gene specific probes are available.
全血は大量のＲＮアーゼ（顆粒球由来）および無核赤血球を含むため、全血から純粋なｍＲＮＡを単離することは非常に困難である。種々のＲＮＡ抽出法を、全血に適用することができるが、そのアッセイ手順は多大な労力を要し、数回の遠心分離が必要であり、リボヌクレアーゼ活性を消失させるために慎重に取り扱うことが不可欠である。前記ＲＮＡ抽出法は、
デフリース(de Vries) T. J., フルコア(Fourkour) A., プント(Punt) C. J., ルイタ
ー(Ruiter) D. J.およびバンムイジェン(van Muijen) G. N. 2000. 細胞調製チューブで
の単核細胞回収後のチロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による末梢血中の黒色腫細胞の解析：全血グアニジニウム・イソチオシアネートＲＮＡ単離法との比較(Analysis of melanoma cells in peripheral blood by reverse transcription-polymerase chain reaction for tyrosinase and MART-1 after mononuclear cell collection with cell preparation tubes: a comparison with the whole blood guanidinium isothiocyanate RNA isoation method)。 Melanoma Research 10:119-26,
ヨハンソン(Johansson) M., ピサ(Pisa) E. K., トーマネン(Tormanen) V., アースト
ランド(Arstrand) K.およびカーゲダル(Kagedal) Bl. 2000. 血中のチロシナーゼ転写物
の定量解析(Quantitative analysis of tyrosinase transcripts in blood)。 Clin. Chem. 46:921-27,
ウィンゴS. T., リンゲル M. D., アンダーソン J. S., パテル A. D., ルークス Y. D., ジュー Y. Y., ソロモン B., ニコルソン D., バルドゥッキ-シラノ P. L., レバイン
M. A., フランシス G. L.およびタトル R.. M. 1999. 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ測定。 Clin. Chem. 45:785-89
に記載される。
Because whole blood contains large amounts of RNase (from granulocytes) and anucleated red blood cells, it is very difficult to isolate pure mRNA from whole blood. Various RNA extraction methods can be applied to whole blood, but the assay procedure is labor intensive, requires several centrifugations and must be handled carefully to eliminate ribonuclease activity. It is essential. The RNA extraction method includes:
De Vries TJ, Fullkour A., Punt CJ, Ruiter DJ and van Muijen GN 2000. Tyrosinase and MART-1 after mononuclear cell recovery in cell preparation tubes Analysis of Peripheral Blood Melanoma Cells by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction: Comparison with Whole Blood Guanidinium Isothiocyanate
Johansson M., Pisa EK, Tormanen V., Arstrand K. and Kagedal Bl. 2000. Quantitative analysis of tyrosinase transcripts in blood). Clin. Chem. 46: 921-27,
Wingo ST, Ringer MD, Anderson JS, Patel AD, Rooks YD, Jew YY, Solomon B., Nicholson D., Barducchi-Cyrano PL, Levine
MA, Francis GL and Tuttle R .. M. 1999. Quantitative reverse transcription PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects. Clin. Chem. 45: 785-89
It is described in.
その結果、全血から大量のｍＲＮＡを単離および定量するための、迅速かつ容易な方法および装置が要求されている。具体的には、回収の再現性があり遺伝子増幅への継ぎ目のない一連のプロセスを有する、全血由来のｍＲＮＡをハイスループットに処理する技術が必要とされている。 As a result, there is a need for a quick and easy method and apparatus for isolating and quantifying large amounts of mRNA from whole blood. Specifically, there is a need for a technique for processing high-throughput mRNA derived from whole blood, which has a series of processes that are reproducible and seamless to gene amplification.
［発明の概要］
本発明は、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィルターの組み合わせを用いて、回収の再現性を有する、全血から直接ｍＲＮＡを単離および定量するための効率的なハイスループット方法および装置を開示する。
[Summary of Invention]
The present invention provides an efficient high-throughput method for the isolation and quantification of mRNA directly from whole blood with the reproducibility of recovery using a combination of leukocyte filters attached to oligo (dT) immobilized multiwell plates. And an apparatus are disclosed.
本発明の一態様は、（ａ）全血を採取するステップ、（ｂ）赤血球と血液成分とを該全血から濾過により除去し、それにより、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、（ｃ）該白血球を細胞溶解させ、それにより、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、（ｄ）該溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移入し、それにより、該ｍＲＮＡを捕捉するステップ、および（ｅ）該ｍＲＮＡを定量するステップを含む、全血中のｍＲＮＡのハイスループット定量法を含む。 One embodiment of the present invention includes (a) collecting whole blood, (b) removing red blood cells and blood components from the whole blood by filtration, thereby obtaining white blood cells on a filter membrane, (c) Lysing the leukocytes, thereby producing a lysate containing mRNA, (d) transferring the lysate to an oligo (dT) immobilized plate, thereby capturing the mRNA, and (E) including a high-throughput quantification method of mRNA in whole blood, comprising quantifying the mRNA.
本方法の好ましい一実施態様では、白血球を回収する前に、全血に抗凝血剤を添加する。捕捉される白血球の収量を増大させるため、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせてもよい。フィルターメンブレン上に捕捉された白血球を、溶解緩衝液を用いて溶解し、白血球からｍＲＮＡを遊離させる。溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入は、遠心分離により、真空吸引により、正圧により、またはエタノール洗浄に続く真空吸引により行われ得る。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを作製して該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅することにより、定量される。 In a preferred embodiment of the method, an anticoagulant is added to the whole blood before collecting the white blood cells. A plurality of filter membranes may be overlaid to increase the yield of captured leukocytes. Leukocytes captured on the filter membrane are lysed using a lysis buffer to release mRNA from the leukocytes. Transfer of the lysate to the oligo (dT) immobilized plate can be performed by centrifugation, by vacuum suction, by positive pressure, or by vacuum suction following an ethanol wash. mRNA is quantified by preparing cDNA and amplifying the cDNA by PCR.
本発明の別の態様は、（ａ）複数のサンプルデリバリーウェル、該ウェルの下部の白血球捕捉フィルター、および該フィルターの下部のｍＲＮＡ捕捉ゾーン（これは、固定化されたオリゴ（ｄＴ）を有する）を備えるマルチウェルプレート、ならびに（ｂ）該プレートを受容し、該プレートにより密閉部が形成される真空ボックスを備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置を含む。該装置の好ましい一実施態様では、白血球は、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される。該装置の別の好ましい実施態様では、真空ボックスが真空源を受容する。該装置の別の好ましい実施態様では、真空ボックスとマルチウェルプレートの間にマルチウェルサポーターが挟持される。 Another aspect of the invention is: (a) a plurality of sample delivery wells, a leukocyte capture filter at the bottom of the well, and an mRNA capture zone at the bottom of the filter (which has an immobilized oligo (dT)) And (b) a device for quantifying mRNA in whole blood with high throughput, comprising a vacuum box that receives the plate and forms a seal with the plate. In one preferred embodiment of the device, leukocytes are captured on a plurality of superimposed filter membranes. In another preferred embodiment of the apparatus, a vacuum box receives a vacuum source. In another preferred embodiment of the apparatus, a multiwell supporter is sandwiched between the vacuum box and the multiwell plate.
本発明の別の態様は、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置、ヘパリン、低張緩衝液および溶解緩衝液を含むキットを含む。 Another aspect of the present invention includes a kit for high-throughput quantitation of mRNA in whole blood, a kit comprising heparin, hypotonic buffer and lysis buffer.
本発明の別の態様は、血液サンプル、低張緩衝液および溶解緩衝液を装置に適用するロボット、自動真空吸引装置および遠心分離機、ならびに自動ＰＣＲ機を備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための完全に自動化されたシステムを含む。 Another aspect of the present invention provides high throughput of mRNA in whole blood comprising a blood sample, a robot that applies hypotonic buffer and lysis buffer to the device, an automatic vacuum aspirator and centrifuge, and an automatic PCR machine. Includes a fully automated system for quantifying.
［好ましい実施態様の詳細な説明］
本発明は、大容量の未調製の全血の解析を可能にし、白血球のみに由来するｍＲＮＡを解析する効率的な手段を提供する。該手段は、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを除去し、一貫してｍＲＮＡを回収することができ、自動化に容易に適合され得る。本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いる絶対定量が可能であって、かつ変動係数が２０〜２５％の範囲の優れた再現性を有する感度の高い定量システムを提供する。さらにまた、本発明は種々の疾患標的に適用することができる（表Ｉ）。
Detailed Description of Preferred Embodiments
The present invention enables the analysis of large volumes of unprepared whole blood and provides an efficient means of analyzing mRNA derived only from leukocytes. The means can remove rRNA and tRNA, consistently recover mRNA, and can be easily adapted to automation. The present invention provides a sensitive quantification system capable of absolute quantification using real-time PCR and having excellent reproducibility with a coefficient of variation in the range of 20 to 25%. Furthermore, the present invention can be applied to various disease targets (Table I).
本発明は、なんら特定の機械的構造に限定されるものではない。しかしながら、図１および２は、本発明のハイスループットｍＲＮＡ定量を実施するための、好ましい構造を示す。真空ボックス１０は、前記構造の基本を構成する。真空ボックスは、真空吸引に耐え得る充分強い任意の材料で作られたものであり得るが、その材料は使い捨てプラスチック材料が好ましい。真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源１２を受容するのに適合している。フィルタープラグ１４は、真空ボックスの真空吸引装置アダプター内に配置される。真空ボックス１０は、マルチウェルフィルタープレート４０、または任意選択でマルチウェルサポーター２０とかみ合うための縁１６を有することが好ましい。マルチウェルサポーター２０は、任意選択で、マルチウェルフィルタープレート４０を支持するように、真空ボックスの上部の内部に設けられる。好ましくはシリコン系ゴムまたは他の軟質プラスチックで構成される密封ガスケット３０が、マルチウェルサポーターの上面に配置される。密封ガスケットの上部にマルチウェルフィルタープレート４０が配置され、フィルタープレートは多数のサンプルウェル４６、サンプルデリバリーウェルの下に多重白血球捕捉フィルター４２、およびフィルターの下にｍＲＮＡ捕捉ゾーン４４を備える。固定化されたオリゴ（ｄＴ）が、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェルに含まれている。
The present invention is not limited to any particular mechanical structure. However, FIGS. 1 and 2 show preferred structures for performing high throughput mRNA quantification of the present invention. The
好ましい一実施態様は、全血からｍＲＮＡを定量するための、簡単で再現性のあるハイスループット方法を含む。速やかなプロトコルであるため、採血後のｍＲＮＡの副次的な誘発または分解が最小限に抑えられ、９６ウェルのフィルタープレートおよびマイクロプレートの使用により、９６サンプルを同時処理することができる。手順間の操作が最少であることから、定量の手段としてＰＣＲを用いた場合であっても、サンプル間の変動が非常に少なく、変動係数（ＣＶ）値は３０％未満である。 One preferred embodiment includes a simple and reproducible high-throughput method for quantifying mRNA from whole blood. Because of the rapid protocol, secondary induction or degradation of mRNA after blood collection is minimized and the use of 96 well filter plates and microplates allows 96 samples to be processed simultaneously. Since the number of operations between procedures is minimal, even when PCR is used as a means for quantification, the variation between samples is very small, and the coefficient of variation (CV) value is less than 30%.
一実施態様では、本方法は真空ボックスの作製を含む。好ましい一実施態様では、ポリアクリレートポリマーマトリックス（Ｒｅｄ Ｚ、Safetec）などの血液カプセル封入体
を真空ボックスに入れ、血液を固化する。次いで、マルチウェルサポーターを真空ボックス内に配置する。次いで、シリコン系ゴムまたは他の軟質プラスチック製の密封ガスケットをマルチウェルプレートサポーターの上面に配置する。フィルタープラグ（Ｘ−６９５３、６０μ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌｕｇ ＨＤＰＥ、Porex Products Groups）を真空ボッ
クスの真空吸引装置アダプター内に配置する。
In one embodiment, the method includes making a vacuum box. In a preferred embodiment, a blood encapsulant such as a polyacrylate polymer matrix (Red Z, Safetec) is placed in a vacuum box to solidify the blood. The multiwell supporter is then placed in a vacuum box. A silicone rubber or other soft plastic sealing gasket is then placed on the top surface of the multiwell plate supporter. Place the filter plug (X-6953, 60μ Filter Plug HDPE, Porex Products Groups) in the vacuum aspirator adapter of the vacuum box.
この実施態様における方法は、フィルタープレートの作製を含む。白血球を捕捉するために、ガラス繊維膜または白血球フィルターメンブレンのいずれかを使用することができ
る。マルチウェルフィルタープレートをガラス繊維膜または白血球フィルターメンブレンを用いて作製することにより、多数の血液検体を同時に処理することができ、アッセイを簡素化することができる。白血球を捕捉するためのフィルターの例は、米国特許第４，９２５，５７２号および同第４，８８０，５４８号に記載されており、これらの記載は参照により本明細書に援用される。一般に、繊維表面上への白血球の吸着は白血球を除去する機構であると考えられている。所与の重量の繊維の表面積は、その繊維の直径に反比例する。したがって、使用される繊維の直径が小さい場合、繊維が細いほど、より大きな吸着容量(capacity)を有することが期待され、さらに所望の有効性を達成するのに必要な量（繊維の重量として測定される量）はより少ないことが期待される。一般に使用されるいくつかの繊維（ポリエステル、ポリアミドおよびアクリル系繊維など）は、グラフト重合されるために必要とされるレベルのアルファ線による分解に対して充分な耐性を有し、かつ利用可能なモノマーが反応できる構造を有するため、放射線グラフト重合されるのに適している。ＰＢＴは、本発明の製造物の開発に使用された主な樹脂であり、本実施例で使用された樹脂である。しかしながら、繊維化されることができ、１．５マイクロメートル以下の細い繊維からなるマットまたは織物を形成することができる他の樹脂も存在し得る。該樹脂は、臨界ぬれ表面張力が必要に応じて最適範囲に調整されている。また、該樹脂はフィルタープレートの効率的な製造に適しており、さらに小型の白血球除去装置の製造に適している可能性があることに注意されたい。同様にして、適切に処理されたガラス繊維が、効果的な装置を作製するために使用可能であり得る。ＣＤ４ ｍＲＮＡの吸着は、ＰＢＴ系フィルターを使用した場合、ガラス繊維系フィルターを使用した場合とは対照的に４倍まで有効である。フィルタープレートは真空ボックス内に配置される。
別の好ましい実施態様では、全血から捕捉される白血球の量を増加させるために、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせる。好ましい一実施態様では、フィルタープレートをプレートサポーターおよび密封ガスケット上に配置する。別の好ましい実施態様では、フィルタープレートはプラスチック製粘着テープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ２２３−９４４４）で密封されており、所望数のウェルのテープをカットして利用可能にすることができる。別の好ましい実施態様では、サンプルが添加される各ウェルを低張緩衝液（２００μＬ ５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄する。
The method in this embodiment involves making a filter plate. To capture leukocytes, either a glass fiber membrane or a leukocyte filter membrane can be used. By producing a multiwell filter plate using a glass fiber membrane or a leukocyte filter membrane, a large number of blood samples can be processed simultaneously, and the assay can be simplified. Examples of filters for capturing leukocytes are described in US Pat. Nos. 4,925,572 and 4,880,548, the descriptions of which are hereby incorporated by reference. In general, the adsorption of leukocytes on the fiber surface is considered to be a mechanism for removing leukocytes. The surface area of a given weight of fiber is inversely proportional to its diameter. Thus, if the diameter of the fiber used is small, the thinner the fiber is expected to have a greater adsorption capacity, and the amount required to achieve the desired effectiveness (measured as the weight of the fiber) Less) is expected. Some commonly used fibers (such as polyester, polyamide and acrylic fibers) are sufficiently resistant and available to degradation by the level of alpha radiation required to be graft polymerized Since the monomer has a structure capable of reacting, it is suitable for radiation graft polymerization. PBT is the main resin used in the development of the product of the present invention and is the resin used in this example. However, there can also be other resins that can be fiberized and that can form a mat or fabric consisting of fine fibers of 1.5 micrometers or less. The resin has a critical wetting surface tension adjusted to an optimum range as necessary. It should also be noted that the resin is suitable for the efficient production of filter plates and may be suitable for the production of smaller leukocyte removal devices. Similarly, properly treated glass fibers can be used to make an effective device. CD4 mRNA adsorption is up to 4 times more effective when PBT filters are used, as opposed to when glass fiber filters are used. The filter plate is placed in a vacuum box.
In another preferred embodiment, multiple filter membranes are overlaid to increase the amount of leukocytes captured from whole blood. In a preferred embodiment, the filter plate is placed on a plate supporter and a sealing gasket. In another preferred embodiment, the filter plate is sealed with a plastic adhesive tape (Bio-Rad 223-9444), and the desired number of wells of tape can be cut and made available. In another preferred embodiment, each well to which sample is added is washed with hypotonic buffer (200
本方法は、血液の採取、マルチウェルフィルタープレートへの血液の添加、ならびに赤血球および他の非白血球成分の除去を含むことが好ましい。好ましい一実施態様では、抗凝血剤を含む血液回収用チューブ内に全血を吸引する。これにより白血球の濾過効率が増大する。抗凝血剤であるヘパリンは、白血球の濾過効率を増大させるのに特に有効である。
好ましい一実施態様では、血液サンプルを凍結してもよい。これによりｍＲＮＡを破壊するＲＮアーゼが一部除去される。ウェルを低張緩衝液で洗浄してもよい。フィルタープレート上の所望数のウェルに血液が添加されると、血液はフィルターメンブレンにより濾過される。該濾過は、遠心分離、真空吸引または正圧などの当業者に知られた任意の技術により行なわれ得る。
The method preferably includes collection of blood, addition of blood to a multiwell filter plate, and removal of red blood cells and other non-white blood cell components. In a preferred embodiment, whole blood is aspirated into a blood collection tube containing an anticoagulant. This increases the leukocyte filtration efficiency. Heparin, an anticoagulant, is particularly effective in increasing leukocyte filtration efficiency.
In a preferred embodiment, the blood sample may be frozen. Thereby, a part of RNase which destroys mRNA is removed. Wells may be washed with hypotonic buffer. When blood is added to the desired number of wells on the filter plate, the blood is filtered through the filter membrane. The filtration may be performed by any technique known to those skilled in the art such as centrifugation, vacuum suction or positive pressure.
特に好ましい一実施態様では、血液サンプルをフィルタープレートウェルに添加した後、真空吸引を開始する（６ｃｍＨｇ）。各ウェルを、何回か低張緩衝液で洗浄する（２００μＬ ５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１２回）。別の好ましい実施態様では、サンプルの入った各ウェルをエタノールで洗浄して（２００μＬ １００％エタノールで１回）フィルターメンブレンを乾燥させ、真空吸引する際の白血球捕捉効率を有意に増加させる。別の好ましい実施態様では、次に減圧を負荷する（２０ｃｍＨｇで＞２分間）。
In one particularly preferred embodiment, vacuum suction is initiated (6 cmHg) after the blood sample is added to the filter plate well. Each well is washed several times with hypotonic buffer (12 times with 200
本方法は、細胞溶解、およびｍＲＮＡ捕捉ゾーン内に固定化されたオリゴ（ｄＴ）へのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを含む。溶解緩衝液をフィルタープレートウェルに添加し（４０μＬ／ウェル）、インキュベーションし（室温で２０分間）、捕捉された白血
球からｍＲＮＡを遊離させる。好ましい一実施態様では、マルチウェルフィルタープレートを、プラスチック製バッグ内に密封し、遠心分離機にかける（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。次いで、溶解緩衝液を再度添加（２０μＬ／ウェル）した後、遠心分離機にかける（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、３０００ｒｐｍ、４Ｃで５分間）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、インキュベートする（室温で２時間）。
The method includes cell lysis and hybridization of mRNA to oligo (dT) immobilized within the mRNA capture zone. Lysis buffer is added to the filter plate wells (40 μL / well) and incubated (20 minutes at room temperature) to liberate mRNA from the captured leukocytes. In a preferred embodiment, the multiwell filter plate is sealed in a plastic bag and centrifuged (IEC MultiRF, 2000 rpm, 4C for 1 minute). The lysis buffer is then added again (20 μL / well) and then centrifuged (IEC MultiRF, 3000 rpm, 4C for 5 minutes). The multiwell filter plate is then removed from the centrifuge and incubated (2 hours at room temperature).
本方法はｍＲＮＡの定量を含む。好ましい実施態様では、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅を含む。好ましい一実施態様では、マルチウェルフィルタープレートを、溶解緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、マニュアル）および洗浄緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、マニュアルまたはＢｉｏＴｅｋ＃Ｇ４）で洗浄する。次いで、ｃＤＮＡ合成緩衝液をマルチウェルフィルタープレートに添加する（４０μＬ／ウェル、マニュアルまたはＩ＆Ｊ＃６）。Ａｘｙｍａｔ（Amgen ＡＭ−９６−ＰＣ
Ｒ−ＲＤ）をマルチウェルフィルタープレート上に配置してもよく、次いで、これをヒートブロック（３７Ｃ、ＶＷＲ）上に配置してインキュベートする（＞９０分）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機にかけてもよい（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移す。ＰＣＲプレートを遠心分離機にかけ（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始する（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。
The method involves quantification of mRNA. A preferred embodiment includes the synthesis of cDNA from mRNA and amplification of the cDNA using PCR. In one preferred embodiment, the multi-well filter plate is washed with lysis buffer (3 times 150 μL / well, manual) and wash buffer (3 times 150 μL / well, manual or BioTek # G4). CDNA synthesis buffer is then added to the multiwell filter plate (40 μL / well, manual or I & J # 6). Axymat (Amgen AM-96-PC
R-RD) may be placed on a multiwell filter plate, which is then placed on a heat block (37C, VWR) and incubated (> 90 minutes). The multiwell filter plate may then be centrifuged (2000 rpm, 4C for 1 minute). PCR primers are added to the 384 well PCR plate and the cDNA is transferred from the multiwell filter plate to the 384 well PCR plate. The PCR plate is centrifuged (2000 rpm, 4C for 1 minute) and real-time PCR is started (TaqMan / SYBER).
本発明の別の好ましい実施態様は、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置を含む。該装置は、多数のサンプルデリバリーウェル、サンプルデリバリーウェルの下部の白血球捕捉フィルター、および該フィルターの下部のｍＲＮＡ捕捉ゾーン（ｍＲＮＡ捕捉ゾーンは、ウェル内のｍＲＮＡ捕捉ゾーンに固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含む）を備えるマルチウェルフィルタープレートを含む。白血球回収効率を高めるため、いくつかのフィルターメンブレンを重ね合わせてもよい。マルチウェルプレートは真空ボックス上に取り付けられるが、真空ボックスはマルチウェルプレートを受容し、マルチウェルプレートにより密封部が形成される。該装置の好ましい一実施態様では、真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源を受容する。別の好ましい態様では、マルチウェルサポーターを、真空ボックス内のマルチウェルフィルタープレートの下方に配置する。該装置の別の好ましい実施態様では、シリコン系ゴムなどの軟質プラスチック製であり得る密封ガスケットがマルチウェルサポーターとマルチウェルフィルタープレートとの間に挟持される。 Another preferred embodiment of the invention includes an apparatus for high-throughput quantification of mRNA from whole blood. The apparatus includes a number of sample delivery wells, a leukocyte capture filter below the sample delivery well, and an mRNA capture zone below the filter (the mRNA capture zone is an oligo (dT) immobilized on the mRNA capture zone in the well) A multiwell filter plate. Several filter membranes may be overlaid in order to increase leukocyte collection efficiency. The multi-well plate is mounted on a vacuum box, but the vacuum box receives the multi-well plate, and a seal is formed by the multi-well plate. In a preferred embodiment of the apparatus, the vacuum box receives a vacuum source for performing vacuum suction. In another preferred embodiment, a multiwell supporter is placed below the multiwell filter plate in the vacuum box. In another preferred embodiment of the device, a sealing gasket, which can be made of a soft plastic such as silicone rubber, is sandwiched between the multiwell supporter and the multiwell filter plate.
別の好ましい実施態様は、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するためのキットを含む。該キットは、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置、ヘパリン含有血液回収用チューブ、低張緩衝液および溶解緩衝液を含む。 Another preferred embodiment includes a kit for high-throughput quantification of mRNA from whole blood. The kit includes a device for high-throughput quantification of mRNA from whole blood, a heparin-containing blood collection tube, a hypotonic buffer and a lysis buffer.
別の好ましい実施態様は、血液サンプル、低張緩衝液および溶解緩衝液を装置に適用するためのロボット、自動真空吸引装置および遠心分離機、ならびに自動ＰＣＲ機を備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための完全自動化システムを含む。 Another preferred embodiment is for high-level mRNA in whole blood comprising a robot for applying blood samples, hypotonic buffer and lysis buffer to the device, an automatic vacuum aspirator and centrifuge, and an automatic PCR machine. Includes a fully automated system for quantifying throughput.
本発明の方法の種々のプロトコルを試験し、全血からβ−アクチンｍＲＮＡおよびＣＤ４ ｍＲＮＡを定量するために使用した。 Various protocols of the method of the invention were tested and used to quantify β-actin mRNA and CD4 mRNA from whole blood.
３種類の抗凝血剤：ＡＣＤ、ＥＤＴＡおよびヘパリンを試験した結果、ヘパリンが最も高い白血球保持率をもたらした。ＡＣＤ血を移入する際にＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜が使用されたが、４層の膜を同時に使用しても、およそ１５〜４０％の白血球が通り抜けた。ＥＤ
ＴＡ血について試験したが、吸着容量および白血球保持についてはＡＣＤ血の場合と同様であることがわかった。しかしながら、もっとも注目すべきは、ヘパリン血中の白血球の１００％がＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉されたことである。ヘパリン血由来の白血球を１００％捕捉したことは、本発明を用いたｍＲＮＡの定量の信頼性を示す。これらのデータは、ｍＲＮＡを正確に定量するにはヘパリン血を使用することが非常に適しているのに対し、大容量の血液を要し、さほど定量的な結果が必要とされない場合にはＡＣＤ血が有用であることを示す。
Three anticoagulants were tested: ACD, EDTA and heparin, and heparin produced the highest leukocyte retention. A Leukosorb membrane was used to transfer ACD blood, but approximately 15-40% of the leukocytes passed through even when four layers of membrane were used simultaneously. ED
Although TA blood was tested, it was found that the adsorption capacity and leukocyte retention were the same as for ACD blood. Most notably, however, 100% of the white blood cells in heparinized blood have been trapped on the Leukosorb membrane. Capturing 100% of heparinized white blood cells indicates the reliability of mRNA quantification using the present invention. These data indicate that using heparinized blood is very suitable for accurate quantification of mRNA, whereas ACD is required when large volumes of blood are required and less quantitative results are required. Show that blood is useful.
凍結血サンプルと新鮮血サンプルを用いた結果を比較した。図３に示されるように、凍結サンプルの漏出細胞（leaked cell）からよりも新鮮血の漏出細胞からのほうが、より
多くのＣＤ４ ｍＲＮＡが回収された。
The results using frozen blood samples and fresh blood samples were compared. As shown in FIG. 3, more CD4 mRNA was recovered from fresh blood leaked cells than from frozen sample leaked cells.
また、ガラス繊維フィルターの全血保持の有効性を、ＰＢＴ系フィルターメンブレンの保持値と比較して調べた。表ＩＩに示されるように、ガラス繊維膜は、膜を低張緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄して赤血球を破壊した場合でさえ、４０μＬの全血しか受容しなかった。しかしながら、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂフィルターは、表ＩＩに示されるように、ガラス繊維フィルターよりも有意に多くの量の全血を受容した。 In addition, the effectiveness of the glass fiber filter for holding whole blood was examined by comparing with the holding value of the PBT filter membrane. As shown in Table II, the glass fiber membranes received only 40 μL of whole blood even when the membranes were washed with hypotonic buffer (50 mM Tris, pH 7.4) to destroy erythrocytes. However, Leukosorb filters received significantly higher amounts of whole blood than glass fiber filters, as shown in Table II.
様々な回数の低張緩衝液による洗浄を施して、赤血球および他の血液成分を除去した。図４に示されるように、サンプルを低張緩衝液で少なくとも３回洗浄すると、洗浄しない場合と比べて、捕捉されたＣＤ４ ｍＲＮＡの量が２倍以上になった。また、図４は、血液を低張緩衝液で１２回洗浄したときに、最も多くのｍＲＮＡが捕捉されたことを示す。
さらに最終ＣＤ４ ｍＲＮＡ定量に関して、白血球を回収するための種々の方法、すなわち血液サンプルの真空吸引による方法、遠心分離による方法、ならびにエタノール洗浄に続いて真空吸引による方法を比較した。図５は、真空吸引による方法が遠心分離による方法よりも良好なＣＤ４ ｍＲＮＡ定量をもたらすことを示し、かつ真空吸引前にエタノールで血液サンプルを洗浄する方法によると、最も多くのｍＲＮＡが得られることを示す。
Various times of washing with hypotonic buffer were applied to remove red blood cells and other blood components. As shown in FIG. 4, when the sample was washed at least three times with a hypotonic buffer, the amount of captured CD4 mRNA was more than doubled compared to the case where the sample was not washed. FIG. 4 also shows that the most mRNA was captured when the blood was washed 12 times with hypotonic buffer.
Furthermore, for final CD4 mRNA quantification, various methods for recovering leukocytes were compared, ie, a method by vacuum suction of blood samples, a method by centrifugation, and a method by vacuum suction following ethanol washing. FIG. 5 shows that the vacuum aspiration method yields better CD4 mRNA quantification than the centrifugation method, and the method of washing blood samples with ethanol prior to vacuum aspiration yields the most mRNA. Indicates.
白血球をガラス繊維膜またはＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉し、様々な回数の低張緩衝液による洗浄を施して、赤血球および他の血液成分を除去した。捕捉された白血球からｍＲＮＡを遊離させるため、溶解緩衝液（ＲＮＡｔｕｒｅ）をフィルタープレートに添加し（４０μＬ／ウェル）、プレートを室温で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液中に増幅プライマーを含有させることが好ましい。図６は、溶解緩衝液がＲＮアーゼ阻害に重要な役割を果たし、溶解緩衝液により失活したＲＮアーゼが好酸球に充満していることを示す。次いで、マルチウェルフィルタープレートをプラスチック製バッグ内に密封し、遠心分離機にかけた（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。次いで、溶解緩衝液を再度添加し（２０μＬ／ウェル）、続いて遠心分離機にかけた（ＩＥＣ ＭｕｌｔｉＲＦ、３０００ｒｐｍ、４Ｃで５分間）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、室温で２時間インキュベートして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡテイルと固定化オリゴ（ｄＴ）とをハイブリダイゼーションさせた。次いで、マルチウェルフィルタープレートを１５０μＬの溶解緩衝液で３回洗浄して、残留リボヌクレアーゼを除去し、続いて１５０μＬの洗浄緩衝液（ＢｉｏＴｅｋ＃Ｇ４）で３回洗浄して、ｃＤＮＡ合成のインヒビターをいくらか含有する溶解緩衝液を除去した。 Leukocytes were captured on glass fiber membranes or Leukosorb membranes and subjected to various times of washing with hypotonic buffer to remove red blood cells and other blood components. To release mRNA from the captured leukocytes, lysis buffer (RNAture) was added to the filter plate (40 μL / well) and the plate was incubated at room temperature for 20 minutes. It is preferable to include an amplification primer in the lysis buffer. FIG. 6 shows that lysis buffer plays an important role in RNase inhibition, and eosinophils are filled with RNase inactivated by lysis buffer. The multiwell filter plate was then sealed in a plastic bag and centrifuged (IEC MultiRF, 2000 rpm, 4C for 1 minute). Lysis buffer was then added again (20 μL / well) followed by centrifugation (IEC MultiRF, 3000 rpm, 4C for 5 minutes). The multiwell filter plate was then removed from the centrifuge and incubated at room temperature for 2 hours to hybridize the poly (A) + RNA tail and the immobilized oligo (dT). The multiwell filter plate is then washed 3 times with 150 μL lysis buffer to remove residual ribonuclease, followed by 3 washes with 150 μL wash buffer (BioTek # G4) to obtain some inhibitor of cDNA synthesis. The containing lysis buffer was removed.
前述した最後の洗浄により、洗浄緩衝液はマルチウェルフィルタープレートから完全に除去され、予備混合したｃＤＮＡ緩衝液４０μＬを添加することにより各ウェル内でｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ緩衝液は、５×第１鎖緩衝液（Promega Ｍ５３１Ａ、１０ｍＭ
ｄＮＴＰ（Promega stock、２０×））、プライマー（５μＭ、＃２４）、ＲＮａｓｉ
ｎ（Promega Ｎ２１１Ａ、４００Ｕ／μＬ）、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Promega Ｍ１７０Ａ、２００Ｕ／μＬ）およびＤＥＰＣ水から構成される。図７は、ｍＲＮＡを定量するための最適ＭＭＬＶ濃度が０．２５ユニット／ウェルであることを示す。
The washing buffer was completely removed from the multiwell filter plate by the last wash described above, and cDNA was synthesized in each well by adding 40 μL of premixed cDNA buffer. The cDNA buffer is 5x first strand buffer (Promega M531A, 10 mM
dNTP (Promega stock, 20 ×)), primer (5 μM, # 24), RNasi
n (Promega N211A, 400 U / μL), M-MLV reverse transcriptase (Promega M170A, 200 U / μL) and DEPC water. FIG. 7 shows that the optimal MMLV concentration for quantifying mRNA is 0.25 units / well.
Ａｘｙｍａｔ（Amgen ＡＭ−９６−ＰＣＲ−ＲＤ）をマルチウェルフィルタープレート上に配置し、次いでこれをヒートブロック（３７Ｃ、ＶＷＲ）上に配置してインキュベートした（＞９０分）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機にかけた（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移した。図８は、ＰＣＲのための最適ｃＤＮＡ値がおよそ２μＬ／ウェルであることを示す。ＰＣＲプレートを遠心分離機にかけ（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始した（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。本発明の方法は高いｍＲＮＡ特異性を有し、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲでのＣＤ４ ｍＲＮＡの増幅では、ＤＮＡコンタミネーションは検出されなかった（＜１０コピー／ウェル）。 Axymat (Amgen AM-96-PCR-RD) was placed on a multiwell filter plate, which was then placed on a heat block (37C, VWR) and incubated (> 90 minutes). The multiwell filter plate was then centrifuged (2000 rpm, 4C for 1 minute). PCR primers were added to the 384 well PCR plate and the cDNA was transferred from the multiwell filter plate to the 384 well PCR plate. FIG. 8 shows that the optimal cDNA value for PCR is approximately 2 μL / well. The PCR plate was centrifuged (2000 rpm, 4C for 1 minute) to start real-time PCR (TaqMan / SYBER). The method of the present invention has high mRNA specificity, and no DNA contamination was detected in CD4 mRNA amplification with TaqMan qPCR (<10 copies / well).
図９に示されるように、本発明はｍＲＮＡ定量の変動係数が小さい。２時間のハイブリダイゼーションでは、これまでのｍＲＮＡ定量の変動係数がおよそ３００％であるのに対して、該変動係数が１３％未満であった。さらにまた、図１０に示される直線的な結果は
、捕捉されるｍＲＮＡの量が、１ウェルあたりに使用された全血の容量に正比例することを示し、本発明が信頼性および再現性のあるｍＲＮＡの定量法であることを示す。
As shown in FIG. 9, the present invention has a small coefficient of variation in mRNA quantification. In the hybridization for 2 hours, the coefficient of variation of the mRNA quantification so far was about 300%, whereas the coefficient of variation was less than 13%. Furthermore, the linear results shown in FIG. 10 show that the amount of mRNA captured is directly proportional to the volume of whole blood used per well, making the present invention reliable and reproducible. It shows that it is a quantitative method of mRNA.
Claims (42)
（ｂ）赤血球と白血球以外の血液成分とを該全血から濾過により除去し、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、
（ｃ）フィルターメンブレン上の該白血球を溶解し、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、
（ｄ）該溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移入し、該ｍＲＮＡを捕捉するステップ、および
（ｅ）該特異的ｍＲＮＡを定量するステップ
を含む、全血中の特異的ｍＲＮＡのハイスループット定量法。 (A) collecting whole blood;
(B) removing blood components other than red blood cells and white blood cells by filtration from the whole blood to obtain white blood cells on a filter membrane;
(C) lysing the leukocytes on the filter membrane to produce a lysate containing mRNA;
High throughput of specific mRNA in whole blood comprising: (d) transferring the lysate to an oligo (dT) immobilized plate and capturing the mRNA; and (e) quantifying the specific mRNA. Quantitative method.
ｉｉ）該ウェルの下部にある白血球捕捉フィルター、および
ｉｉｉ）該フィルターの下部にあって、その上面に固定化されたオリゴ（ｄＴ）を有するｍＲＮＡ捕捉ゾーン
を備えるマルチウェルプレート、ならびに
（ｂ）前記プレートを受容し、前記プレートとの間に密封部をつくるのに適合した真空ボックス
を備えるハイスループットｍＲＮＡ定量装置。 (A) i) Multiple sample delivery wells,
ii) a leukocyte capture filter at the bottom of the well; and iii) a multiwell plate at the bottom of the filter with an mRNA capture zone having oligo (dT) immobilized on the top surface thereof; and (b) said A high-throughput mRNA quantification device comprising a vacuum box adapted to receive a plate and create a seal between the plate.
（ｂ）低張緩衝液、
（ｃ）エタノール、および
（ｄ）溶解緩衝液
を含むハイスループットｍＲＮＡ定量キット。 (A) The high-throughput mRNA quantification device according to claim 36,
(B) a hypotonic buffer,
A high-throughput mRNA quantification kit comprising (c) ethanol, and (d) a lysis buffer.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009538148A (en) * | 2006-05-24 | 2009-11-05 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | Probes and kits for determining the presence of a Mycobacterium tuberculosis complex organism in a test sample, and a method for amplifying Gram positive bacilli or fungi using a capture probe |
| JP2010534328A (en) * | 2007-07-23 | 2010-11-04 | クロンデイアグ・ゲーエムベーハー | Assay |
| JP2014508295A (en) * | 2011-02-17 | 2014-04-03 | ネステク ソシエテ アノニム | Apparatus and method for isolating leukocytes and tumor cells by filtration |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050208501A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-22 | Ambion, Inc. | Process and reagents for extraction of RNA from fractionated blood leukocytes |
| WO2006116721A1 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Hitachi Chemical Research Center, Inc. | Ex vivo gene expression in whole blood as a model of assessment of individual variation to dietary supplements |
| CN106190817B (en) * | 2016-07-19 | 2019-01-08 | 温州市高亿诺生物科技有限公司 | Nucleic acid cleavage liquid separating method and device based on porous plate |
| CN106119382B (en) * | 2016-07-19 | 2018-08-28 | 湖州高亿诺生物科技有限公司 | Automate microbial molecules detection method and its application |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US625229A (en) * | 1899-05-16 | Machine for forging horseshoe-nails or other articles | ||
| JPH0824583B2 (en) * | 1989-05-09 | 1996-03-13 | 株式会社ニッショー | DNA extraction method |
| GB9220773D0 (en) * | 1992-10-02 | 1992-11-18 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of antigens and nucleic acids |
| GB9314249D0 (en) * | 1993-07-09 | 1993-08-18 | Proofname Ltd | Purification method and apparatus |
| NO180658C (en) * | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Method and Device for Detecting Specific Target Cells in Specialized or Mixed Cell Populations and Solutions Containing Mixed Cell Populations |
| US5976797A (en) * | 1996-12-20 | 1999-11-02 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Method for quantifying total mRNA with poly(A)-complementary oligonucleotide-immobilized microtiter plate |
| ATE506449T1 (en) * | 1997-12-22 | 2011-05-15 | Hitachi Chemical Co Ltd | DIRECT RT-PCR ON OLIGONUCLEOTIDE-IMMOBILIZED PCR MICROPLATES |
| EP1119576B1 (en) * | 1998-10-09 | 2003-06-11 | Whatman Bioscience Limited | Isolation method for nucleic acid and apparatus |
| WO2000077253A1 (en) * | 1999-06-16 | 2000-12-21 | Hitachi, Ltd. | Apparatus and method for gene examination |
| AU2001286499A1 (en) * | 2000-08-16 | 2002-02-25 | Matthew Baker | Transfusion medicine leukodepletion filter devices as a source of genetic material for genotyping studies |
-
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Cited By (7)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009538148A (en) * | 2006-05-24 | 2009-11-05 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | Probes and kits for determining the presence of a Mycobacterium tuberculosis complex organism in a test sample, and a method for amplifying Gram positive bacilli or fungi using a capture probe |
| JP2013106617A (en) * | 2006-05-24 | 2013-06-06 | Gen-Probe Inc | Probe and kit for determining presence of mycobacterium tuberculosis complex organism in test sample and method of amplifying gram-positive bacterium and fungus employing capture probe |
| JP2010534328A (en) * | 2007-07-23 | 2010-11-04 | クロンデイアグ・ゲーエムベーハー | Assay |
| JP2014508295A (en) * | 2011-02-17 | 2014-04-03 | ネステク ソシエテ アノニム | Apparatus and method for isolating leukocytes and tumor cells by filtration |
| KR101511889B1 (en) * | 2011-02-17 | 2015-04-13 | 네스텍 소시에테아노님 | Apparatus and method for isolating leukocytes and tumor cells by filtration |
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