JP2005524090A - 生物学的試料のための光線画像分析 - Google Patents

Abstract

画像取得及び分析システム及び方法が提供される。光線法を用いて、細胞系アッセイの画像を処理することができる。このような細胞系アッセイを用いて、薬物又は他の化合物を評価することもでき、又は他の生物学的研究を行うこともできる。走査型レーザ顕微鏡又は他の機器を用いて、蛍光マーカ細胞（４２）又は他の適切な試料から画像データを集めることができる。光線（４０）は、細胞核（４４）に関して半径方向である。核内のシード点（４８）を識別することができる。光線（４０）は、シード点（４８）又は他の適切な光線起点から、光線終端基準により光線（４０）が終端するまで外向きに延びることができる。各光線（４０）に関連する画像データの強度を分析し、種々のパラメータを生成することができる。例えば、各光線に沿う画像データのピーク強度を識別することができる。統計的な計算も行うこともできる。

Description

本発明は、画像解析に関し、より詳細には、生物学的試料の光線画像解析に関する。

薬物スクリーニング及び他の研究活動のための生物学的試料に対する種々の化合物の作用を評価する方法は、一般に、多くの労働力を要する。比較的小規模な細胞系アッセイでも、数百又は数千の異なる組み合わせの化合物及び濃度を調べる場合もある。このような大量のデータを収集して解析するための１つの方法には、細胞系生物学的試料を異なる条件に暴露するための高度に自動化された機器を用いることが含まれる。自動顕微鏡設備及びデジタル画像処理ソフトウェアを用いて、各試料のデジタル画像を取得し、試料を暴露した様々な条件の影響を評価することができる。
特開平０８−２７２９６１号公報 特開平１０−１０５６７８号公報

本発明の目的は、生物学的試料の画像を評価するための改良されたシステム及び方法を提供することである。

本発明の別の目的は、細胞系アッセイを行う際に用いることができる改良された画像処理装置を提供することである。

本発明のこれら及び他の目的は、本発明の原理に従って生物学的試料の画像を評価するのに好適な画像処理機器及び方法を用いることにより達成される。該システムのユーザは、薬物スクリーニング又は一般的な生物学的研究のために細胞系アッセイを行うことができる。細胞培養は、マイクロタイタプレートの多数の個々のウェル内で行うこともでき、他の適切な生物学的試料マウント装置を用いることもできる。例えば、各ウェル内の細胞は、ペプチド、酵素、核酸又は他の適切な有機又は無機化合物などの様々な生化学的薬剤に暴露することができる。

自動化機器を用いて、細胞のデジタル画像を收集することができる。自動化機器は、例えば、各マイクロタイタウェル内の細胞に対応する画像を取得することができる。所望の場合には、細胞に蛍光マーカでマーク付けすることができ、単波長又は多波長走査型レーザ顕微鏡及びデジタル画像センサを用いて、画像を取得することができる。また、他の適切な顕微鏡（例えば光学顕微鏡）又は他の画像取得機器で画像を取得することもできる。

細胞のデジタル画像を処理して細胞核の位置を決定することができる。各核内のシード点を識別することもできる。各細胞核は、半径方向の光線の組に関連付けることができる。任意の細胞に関連付けた光線は、シード点に位置する共通の起点を有することができる。所望の場合には、各光線は、異なる起点を有することもできる。実施例として、各光線は、核の境界の異なる位置に起点を有することもできる。各光線は、細胞内部から外側細胞境界に向かって半径方向外向きに延び、外側終点で終端することができる。

光線は、予め定めた最大限界を超えて延びず、且つ光線の起点がある細胞以外の細胞の核と重ならないことが好ましい。該システムのユーザは、システムが各光線の外側終点をどのように決定するかを指定する光線終端基準などの画像取得及び解析パラメータを調製することができる。ユーザ指定の適切な終端基準には、閾値に基づく基準及び最大長さ基準が含まれる。

画像内の各シード点に対応する光線の位置が決定されると、その光線に沿って存在する画像データを用いて、種々の光線画像解析段階を行うことができる。例えば、平均ピクセル強度レベルは、光線又は光線の一部に沿って決定することができる。また、最小及び最大ピクセル強度レベル、統計的強度レベル配分、及びこのような値のいずれかの比率を決定することもできる。

多波長蛍光顕微鏡装置を用いる場合には、各々が異なる蛍光マーカ色に対応する異なるデータチャネルを用いて画像を取得することができる。例えば、１つのデータチャネルを用いて、青い波長の画像データを取り込むことができる。別のデータチャネルを用いて赤いデータを取り込むことができ、更に別のデータチャネルを用いて緑のデータを取り込むことができる。この種の方法では、細胞核内のＤＮＡは、ＤＮＡを結合する（例えば）青いマーカでマーク付けすることができる。青いチャネルデータを処理し、核及びシード点の位置を識別することができる。（例えば）緑色のマーカを用いて、関心のあるタンパク質をラベルすることができる。細胞を試験化合物に暴露すると、緑でラベルされたタンパク質は、細胞内で転位する場合もあれば、転位しない場合もある。実施例として、緑色でラベルされたタンパク質は、最初に外側細胞壁に位置することができる。特定の化合物に暴露した後には、この緑色でラベルされたタンパク質は、細胞質全体に再配分することができる。この緑色でラベルされたタンパク質の動きは、光線解析法を用いて解析することができる。

本発明の別の特徴、特質、並びに種々の利点は、添付図面及び以下の詳細な説明からより明らかになろう。

本発明による例示的なシステム１０を図１に示す。システム１０を用いて、試料１２のような生物学的試料の画像を取得して処理することができる。試料１２は、どのような適切な生物学的試料であってもよい。実施例として、試料１２は、多ウェルマイクロタイタプレートのウェル内に備えられた細胞サンプルとすることができる。システム１０は、画像取得に適切な位置にマイクロタイタプレートの連続するウェルを位置決めするための自動ステージを含む。これは、単に例示的な装置である。所望であれば、生物学的画像を準備してシステム１０に表示するどのような適切な装置を用いることもできる。

画像取得機器１４を用いて、試料１２の画像を取得することができる。画像取得機器１４は、例えば、走査型レーザ顕微鏡、光学顕微鏡、又は他の何らかの顕微鏡又はイメージング機器とすることができる。画像取得機器１４は、細胞構造を解像することが可能であるのが好ましく、これにより細胞系アッセイを行うときにシステム１０を用いることができる。

画像取得機器１４により取得される画像は、プロセッサ１６により処理することができる。ユーザは、画像分析の結果を観察することができ、ユーザインタフェース１８を用いてシステム１０に入力することもできる。好適な１つの装置において、画像取得機器１４、プロセッサ１６、及びユーザインタフェース１８は、単一の顕微鏡システムの一部とすることができる。別の適切な装置において、画像取得機器１４は顕微鏡システムに基づくものとすることができ、プロセッサ１６及びユーザインタフェース１８は、スタンドアロンのコンピュータ又はコンピュータのネットワークの一部とすることができる。画像取得システムは、純粋なデジタル（画像データを取り込むのにデジタルセンサを用いる）とすることもでき、或いは、最初にフィルムのような感光性媒体上に画像が取り込まれ、続いてスキャナを用いてデジタル画像データに変換されるアナログ−デジタルのハイブリッド型システムとすることもできる。

所望の場合には、画像取得及び処理作業は、１つ又はそれ以上のプラットフォームにわたって分割することもできる。例えば、顕微鏡を用いて生のデジタル画像を取得することができ、内部プロセッサを用いて、これらの生のデジタル画像を処理することができる。画像は、外部コンピュータ又はコンピュータのネットワークに移されて、引き続き画像処理することができる。顕微鏡及びコンピュータの１人又は複数のユーザは、ユーザ入力を行って画像処理設定を調整することができる。このようなユーザ入力は、コンピュータキーボード、マウス等のようなユーザインタフェース１８を用いて行うことができる。ユーザは画像及び他のデータをプリンタ又はユーザインタフェース１８内の他の出力デバイスを用いて表示及び印刷することができる。

走査型レーザ顕微鏡装置に基づく例示的な画像取得及び処理システムが図２のシステム１０として示される。図２の顕微鏡装置は、光源２０、２２、及び２４などの１つ又はそれ以上の光源を有することができる。これらの光源は、例えば、ガスレーザなどのレーザとすることができる。複数の光源を用いる場合には、各光源は、関連する異なる波長を有することができる。図２の実施例では、３つの関連する波長λ_１、λ_２、及びλ_３を有する３つの光源がある。これらの波長は、（実施例として）可視光スペクトルの赤、青、緑部分の波長に対応することができる。

光源２０、２２、及び２４からの光は、部分反射又は全反射鏡２６及び単一又は複数のレンズ２８を用いて視準し、試料の表面全体をコリメートし走査することができる。走査は、例えば、鏡２６、レンズ２８、又は他の適切な光学走査部品の１つ又はそれ以上を移動させることにより実行することができる。光源２０、２２、及び２４からの走査レーザビーム又は他の光は、２次元パターンで試料１２の表面全体にわたって走査することができる。別の好適な方法では、試料１２を可動ステージに載せることができる。固定レーザビームに対してステージを並進させることができる。所望の場合には、走査ビームと走査ステージを組み合わせた方法を用いることもできる。このような種々の方法により、試料１２の２次元デジタル画像を取得することができる。

試料１２が蛍光マーカでラベルされた細胞又は他の生物学的薬剤を含む場合には、走査光による照射に反応して蛍光を発するようになる。例えば、青の蛍光マーカでマーク付けされた試料の領域は、青の波長で蛍光を発することになる。赤又は緑の蛍光マーカでラベルされた試料の領域は、スペクトルの赤又は緑の部分で画像の光を発する。

試料１２から生じる画像の光は、センサ３０を用いてデジタル化することができる。センサ３０は、例えば、２次元の電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補形金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサとすることができる。また、センサ３０は、１次元センサ（例えば光検知器）であってもよい。１次元センサを用いる場合には、試料表面上の走査照射光の既知の位置を用いて（即ち、走査ビームの既知の位置、試料を保持する並進ステージの既知の位置、又はその両方から得られるビーム位置に関する情報を用いて）２次元画像データを収集することができる。

カラー画像情報は、感色性検出器を用いて収集することができる。例えば、赤、緑、及び青の波長を感知するセンサを用いて、赤、緑、及び青のチャネルの画像データを收集することができる。所望の場合には、各々が異なる色の光を通過させる光学帯域通過フィルタを有する多数のセンサを用いて、異なるチャネルに対するカラー情報を集めることができる。また、画像取得プロセスの間にどの光源を用いたかに関する情報を記録することにより、異なるチャネルに対するカラー画像情報を集めることができる。試料１２が光源２０で照射されるときに集められるデータは第１のチャネルに関連付けることができ、試料１２が光源２２で照射されるときに集められるデータは第２のチャネルに関連付けることができ、試料１２が光源２４で照射されるときに集められるデータは第３のチャネルに関連付けることができる。

図２の顕微鏡装置では、３つのレーザ系の光源を用いて試料１２を照射しているが、これは単に例証に過ぎない。何らかの適切な光源及び画像センサ装置を用いて照射して試料１２から画像データを集めることもできる。画像データは、単色画像取得方式を用いて集めることもでき、或いは、各々が異なる関連波長を有する何らかの適切な数のチャネル（例えば２チャネル、３チャネル、４チャネル、又はそれ以上）で集めてもよい。

更に、図２の光学装置は、単に例証に過ぎない。（図２に示すような反射型装置ではなく）透過型装置に基づく顕微鏡を用いることもでき、或いは照射して画像センサデータを集めるために他の装置を用いる顕微鏡を用いてもよい。

プロセッサ１６及びユーザインタフェース１８は、光学部品として同じ機器内に一体化することができるが、必ずしもそうでなくてもよい。また、プロセッサ１６及びユーザインタフェース１８は、別個のスタンドアロンのコンピュータ又はコンピュータネットワークと併せて用いることもできる。例えば、図２の機器を用いて、多波長多チャネルの２次元画像データを集め、これを図２の機器の一部又は外部にある機器を用いて更に処理することができる。

試料１２は、何らかの適切な生物学的試料とすることができ、該当する場合には、非生物学的試料とすることもできる。理解し易いように、本説明では、細胞系のアッセイを行う例示的な実施例に対して主として焦点をあわせる。これに関連して、生物学的試料１２は、典型的にはマイクロタイタプレートの底部表面上に増殖させた単層の細胞である。細胞は、適切な染色液又はマーカでラベルし、画像取得機器により細胞の異なる部分を容易に区別できるようにすることができる。

通常、細胞サンプルの画像分析を行うときには、細胞核を識別することが望ましい。何らかの適切な染色又はマーク付けプロセスを用いて細胞核をラベルすることもできる。例えば、細胞核内のＤＮＡに結合するＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色液を用いることができる。この青色蛍光マーカは、システム１０の青色チャネルを用いて画像化することができる。細胞核の位置は、何らかの適切な画像閾値処理及びフィルタリング技術を用いて識別することができる。実施例として、青色チャネル中のユーザ指定又はシステム初期設定閾値ピクセル強度値を用いて、どのピクセルが核に関連する可能性が最も高いかを識別することができる。ピクセルの十分に大きなクラスタに隣接しないピクセルを除去することにより、バックグラウンドノイズを減少させることができる。

蛍光ラベルされた細胞核の例示的なデジタル画像３２を図３に示す。図３の画像３２は、ピクセル強度レベル閾値を適用した後で且つ後続の画像フィルタリングを行う前の青色チャネルデータに対応する。図３に示すように、画像３２は、ピクセル３４の主要クラスタを含む。このクラスタは、境界ピクセル３４及び内部ピクセル３６を含む。また、画像３２には、境界外のピクセル３８も含まれるが、これは、ノイズによるものである。

フィルタリング及び核画像認識プロセスの間、クラスタ３４は、細胞核に対応するものとして識別することができる。実施例として、クラスタ３４の横方向寸法が、ユーザ指定又はシステム初期設定のピクセル寸法（図３の例ではＳで示す）を超えるため、クラスタ３４を核として識別することができる。また、クラスタ３４は、ユーザ指定又はシステム初期設定の数より多い近接又は連続するピクセルを含むことにより、核として識別することができる。ピクセル３８は、クラスタ３４に近接せず、それ自体で核クラスタとするほど大きくもないことから、ノイズとして排除することができる。また、大きすぎるクラスタを形成するピクセル（例えば、クラスタ内にユーザ指定又は初期設定の数のより多い近接ピクセルが存在するか、クラスタの寸法が、ユーザ指定又は初期設定の大きさより大きいことによる）も、核識別処理のフィルタリング部分の間に除去することができる。このようなクラスタは、強く重なる細胞、即ち、分割処理で良好なデータを得るのが困難である可能性がある細胞に相当する可能性が高い。

これらは、画像取得機器１４から得られる画像データを処理して細胞核を識別するための単に例示的な技術である。所望であれば、何らかの適切な画像取得及び画像処理技術を用いて核を識別することもできる。

細胞核が識別されると、システム１０は、各核に対して適切なシード点の位置を決定することができる。シード点は、各核に関連する光線を発生する後続の処理中に用いることができる。

シード点は、核ピクセルの中心の近傍に位置付けることができる。核のピクセル画像データに基づき適切なシード点の位置を決定するために、何らかの適切な技術を用いることができる。例えば、適切なシード点は、「ピクセル位置重み付け」法を用いて選択することができる。この方法を用いると、当初取得された画像の各ピクセルが全て同じ値でなくても（典型的な場合）、核に関連すると識別される各ピクセルには同じピクセル強度レベルが割り当てられる。次に、得られた同じ強度のピクセルの位置を平均して、同じ強度のピクセルの位置（及びその数）に基づいて重み付けされたシード点位置を定めることができる。この技術を用いて選択したシード点位置は、典型的には核画像の視覚的中心の近傍になる。

また、適切なシード点位置は、「ピクセル強度重み付け」法を用いて選択することもできる。この方法では、ピクセルの強度レベル並びにピクセル位置が考慮される。選択するシード点は、上述の「ピクセル位置重み付け」法を用いて選択した中心ピクセルの近傍とすることができるが、「ピクセル強度重み付け」法を用いて選択したシード点は、最も明るい（最も強度が高い）ピクセルに向かって歪む傾向になる。

これらは、核に関するシード点がどこに位置するはずであるかを決定するための単なる例示的な技術である。所望であれば、どのような適切な技術を用いてもよい。

適切なシード点が生成されると、１組の光線を各核に関連付けることができる。光線は、シード点から細胞境界に向かって外向きに放射することができ、即ち、光線の起点がシード点になる。光線は、適切な光線終端基準を用いて決定した位置で終端させることができる。光線が定められると、各組の光線に対して光線に伴うデータを調べることにより、試料の画像を分析することができる。この種の光線画像分析装置を用いる利点は、画像を個々の細胞まで完全に分割する必要がないことである。画像分析を行うために、画像内の個々の細胞境界を識別することは必ずしも必要でない。このことにより、特に、重なり合った細胞を含む試料、又は識別が困難な細胞境界を有する細胞構造を含む試料を分析する場合に、細胞系アッセイの実行に伴う自動画像処理タスクをかなり簡略化することができる。

何らかの適切な方法を用いて、光線を核及び核を含む対応する細胞と関連付けることもできる。実施例として、ユーザ指定又はシステム初期設定の数の光線を各細胞及び核に関連付けることができる。この方法を図４に示す。図４の実施例に示すように、８つの光線４０は細胞４２及び核４４に関連付けられている。図４には８つの光線が示されているが、これは単に例証に過ぎない。１つの細胞及び核当たりに適切な任意の数の光線４０を用いることができる。例えば、１つの細胞及び核当たりに、単一光線のみ、２つの光線、４つの光線、８つの光線、１６の光線、３２の光線、又は３２より多い光線とすることができる。図４の光線４０は、細胞４２及び核４４の周りに均等に配分され、各光線が隣接する光線から同じ角度Ａ（この実施例では４５°）だけ分離されるようにする。所望であれば、不均一な角度配分を用いることもできる。

細胞及び核に関連付けられた光線を配分する別の適切な方法を図５に示す。図５に示す方法では、核４４の境界に関連付けられたピクセル４６を用いて光線位置を定める。各光線４４は、核境界上又はその近傍の対応する境界ピクセルに交差することができる。光線４４とピクセル４６との間は１対１対応とすることもでき、或いは適切な比率を用いることもできる。例えば、各ピクセルに２つ又はそれ以上（又は非整数）の光線を関連付けることもでき、各光線に２つ又はそれ以上（又は非整数）のピクセルを関連付けることもできる。

図４の例示的な角度に基づく光線分配法及び図５の例示的な境界−ピクセルに基づく光線分配法では、光線４０がシード点４８から発生するように示されている。これは単に例証に過ぎない。任意の適切な位置（好ましくは細胞４２の核４４内部又はその近傍）を光線の起点に用いることもできる。例えば、各光線４０の起点は、図４の交差点５０とすることもでき、或いは核の境界上（例えば、図５のピクセル４６）とすることもできる。このような場合には、光線は、図４及び図５に示す光線と同じ半径方向を有することができる。

核をラベルするのに用いるマーカとは異なる波長又は色で蛍光を発する蛍光マーカにより核以外の細胞４４の部分をラベルすることが望ましいとすることができる。何らかの適切な蛍光マーカ及びマーク付け技術を用いることができる。例えば、蛍光赤色マーカとして公知のヨウ化プロピジウムマーカを用いることもできる。ラベルされたタンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質及びホスホリパーゼＣの融合タンパク質「ＧＦＰ−ＰＬＣ」のような緑色蛍光タンパク構築物）をマーカとして用いることもできる。関心のあるタンパク質に結合する蛍光ラベル抗体を用いることもできる。

細胞系アッセイに用いられる細胞は、典型的には、改変細胞株に基づくものである。このような細胞株の細胞は、例えば、細胞培養環境内で容易に維持することができるように不死化することもできる。また、このような細胞は、ラベル付けを容易にするように修飾することもできる。実施例として、細胞株は、マーカで容易にラベルすることができる特定のタンパク質を細胞が含むように修飾することができる。

ラベルされた細胞を用いて、種々の研究を行うことができる。この研究は、細胞構成要素の動き及び細胞形態を調べるのに用いることができる。実施例として、細胞核の周りのラベルされた部分の局在化を研究することができる。刺激に反応して細胞膜から細胞の細胞質内に放出された融合タンパク質の動きを研究することもできる。同様に、細胞質から細胞膜へのラベル付け部分の動きを研究することもできる。一般に、光線法を用いて、ラベル付け部分のあらゆる望ましい再配分又は局在化を観察することができる。別の実施例として、核周囲領域に位置することが多いミトコンドリアからの蛍光の局在化又は放出を観察することもできる。光線法の利点は、分析を行うのに特定の細胞小器官マーカを必要としないことである。

実施可能な別の種類の研究は、核に関連付けられた光線間の関係を調査して細胞の形状を決定する実験に関するものである。実施例として、細胞付着を調査するアッセイを行うことができる。このようなアッセイでは、非結合であり、そのためほぼ同じ長さの短光線４０を備えた球形となる傾向がある細胞を、試料プレートの底部に付着し、そのため光線が長くて関連する光線長さの分配が広い細胞と区別することができる。

これらは、光線法を用いて実施可能な研究の類の単なる例証である。所望であれば、光線法を用いてあらゆる適切な細胞アッセイ又は研究を行うことができる。

本発明の光線分析装置を用いて行うことができる研究の例示的な実施例を図６〜図９に示す。この実施例では、細胞核には、青色蛍光マーカでラベルしている。関心のあるタンパク質には、緑色の蛍光マーカでラベルしている。最初に、図６に示すように、主に細胞膜５２（場合によっては細胞壁又は細胞境界とも呼ばれる）上に緑色のマーカを位置付ける。試験化合物（例えば、この実施例ではＡＴＰ又は他の細胞刺激剤）に暴露した後、緑色マーカを付けたタンパク質は、図７に示すように、細胞体５４（場合によっては細胞質とも呼ばれる）内に移行する。（薄い層の細胞質が核４４を囲んでいるため、図７の核４４の領域でも小さな緑色の信号を検出することができる。）
図６の光線４０に沿って位置するピクセルに対応するピクセル強度レベルデータのグラフを図８に示す。図７の光線４０に沿って位置するピクセルに対応するピクセル強度レベルデータのグラフを図９に示す。これらの各グラフでは、青色チャネルの画像データを点線で示し、緑色のチャネルの画像データを実線で示す。ピクセル強度レベル（例えば、１２ビットのデジタル化方式を用いて測定される）を核４４内のシード点４８からの半径方向距離の関数としてプロットする。各光線に対する強度レベル情報は、画像取得機器１４により取り込まれる２次元画像から抽出することができる。

細胞及び核（及び対応するシード点）に関連する各光線４０に沿う距離の関数として画像強度データを集めることにより、図８及び図９に示す種類の多数のグラフに対応するデータを集めることができる。次に、このデータを集合的に分析し、特定のサンプルの各細胞に関連する光線の組及び細胞の各集合内の光線に対する平均及び統計的情報を含む結果を生成する。

図６〜図９の実施例では、光線４０（Ｒ＝０）の起点は、シード点の位置と同じとする。これは単なる例証に過ぎない。シード点位置及び光線の起点は異なるようにすることもできる。例えば、光線起点は、全て同じ点に位置する必要はなく、核の境界上（例えば図５の点４６又は図４の点５０）に位置することもできる。光線の起点をどこに置くかに関係なく、光線の半径方向を同じにすることもできる。

図８及び図９に示すように、青色信号の強度は、核境界の位置で減少する。核境界は、Ｒ＝０に位置するシード点から距離Ｒ_ＮＢのところに位置する。光線起点は、青色チャネル信号から求められるＲ＝０又はＲ_ＮＢに位置することもでき、或いは何らかの他の適切な点に位置することもできる。

図８のグラフは、緑色のマーカが、細胞境界に濃縮されている図６の状況に対応するものである。その結果、図８のピーク５６の強度Ｉ_Ｂにより示されるように、緑色のチャネルに強いピーク強度レベルが得られる。

光線４０は、細胞に関連するデータがその細胞に直接関係があるように細胞境界又はその近傍で終端する必要がある。光線終端基準としてユーザ指定又はシステム初期設定の強度閾値Ｉ_ＴＨを用いることができる。光線に関連する画像データの測定された強度レベルが、Ｉ_ＴＨより減少すると、光線を終端させることができる。図８に示すように、光線終端点は、細胞境界に関連するため、これをＲ_ＣＢと表示することができる。

同じ閾値に基づく光線終端方式を用いて、図９に示すように、細胞を試験条件に暴露した後に細胞境界を求めることができる。図６〜図９の分析中の画像データは、緑色のチャネルである。青色チャネルデータを用いて、核及びシード点を位置決めする。所望であれば、青色チャネルでは、閾値に基づく装置を用い、Ｒ_ＮＢでの核境界の位置を求めることができる。

所望であれば、多数の異なる光線終端基準を用いて、光線４０を終端させるときを決定することができる。例えば、光線は、上述のように、光線に沿う画像強度が、ユーザ指定又は初期設定の強度レベル閾値より減少する場合にいつでも終端させることができる。また、光線は、光線長さ（例えば、光線起点から測定したもの）がユーザ指定又はシステム初期設定の長さを超える場合にいつでも終端させることもできる。また、光線は、光線を延長すると、該光線が更に別のマーク付特徴（例えば別の細胞又は核）に侵入することになると判断される場合にいつでも終端させることもできる。これらの光線終端基準の組み合わせ又は１つ又は全てのこのような光線終端基準を用いて、画像分析の間に光線４０を終端させることができる。例えば、細胞体閾値Ｉ_ＴＨをゼロに設定し、平均細胞の最も長い部分に対応する光線長さを用いて最大光線長さを設定することもできる。この基準は、別のマーク付特徴に遭遇すると光線が終端することを指定する基準と組み合わせて用いることもできる。

図６〜図９の実施例では、細胞が試験条件に暴露された後に、元々は細胞境界に位置していた（図６及び図８）緑色のマーカが、図７及び図９に示すように、細胞質中に均一に配分される。図９のグラフに最も明確に示されるように、核４４と同じ半径位置には細胞質の薄い層があるため、Ｒ＝０とＲ＝Ｒ_ＮＢとの間には小さな緑色のチャネル画像データ信号が存在する。０とＲ_ＮＢとの間の緑色のチャネル信号は、所望であれば、（例えば、光線起点を核境界に位置決めした状態で光線法を用いることにより）除去される。また、図９のグラフは、図８のピーク５６をどのようにして図９の一様な領域５８に変形させたかを示しており、これは、図８の強度Ｉ_Ｂより幾分低い強度値Ｉ_Ａである。図８の光線画像データを図９の光線画像データと比較することにより、緑色のマーカが細胞境界（図８）から細胞質（図９）に移動したと判断することができる。

複数のチャネルに関する画像データを測定して分析する能力は、調査中に特定のチャネルに対するマーカが広範囲に移動又は再分配する場合に有利である可能性がある。例えば、特定のタンパク質に関連する緑色マーカは、最初は細胞膜（細胞境界）に関連するものとすることができる。研究の間に、緑色マーカは、細胞全体に再分配することができる。緑色マーカが再分配されることから、再分配した緑色マーカの画像から細胞境界の位置に関する有用な情報を抽出することは困難である可能性がある。しかしながら、赤色マーカを用いて細胞膜をラベルする場合、及びこの赤色マーカが研究の間に移動しない場合には、緑色チャネルデータを取得して分析するときに、赤色マーカを基準点として用いることができる。

実施例として、赤色マーカを用いて細胞膜をラベルし、緑色のマーカを用いて、任意の研究での関心のある細胞の一部をラベルする場合を考える。主要データチャネル計算は、緑色チャネルで取得された画像データに対して行うことができる。しかしながら、赤色チャネルデータを用いて、緑色チャネル処理作業の間に用いる情報を集めることができる。例えば、ピーク強度ピクセル（又は複数のピクセル）の光線に沿う位置を用いて、細胞膜の位置を求めることができる。また、光線に沿うピクセルの群のピーク強度を用いて、光線に沿う異常に明るいピクセルの影響を低減することもできる。例えば、光線に沿うか、光線伝播方向に直交するか、又は光線の近傍にある幾つかのピクセル（１、３、５、１０又は他の適切な数）を平均し、光線に沿う位置をピーク強度と結びつけることができる。赤色マーカは、この実施例の研究の間に移動しないため、赤色マーカピーク強度の位置は、細胞膜位置の良好な指標である。

次に、光線に沿う赤色チャネルのピーク強度を求めることから得られる位置情報を用いて、緑色チャネル内のどのデータが関心があるものかを識別することができる。実施例として、どの緑色チャネルのピクセル情報を集めて分析する必要があるか（例えば、平均して比率を計算するのに用いる等）を決定するときに、ピーク赤色ピクセルのピクセル位置を用いることができる。識別した赤色チャネルピーク強度の位置で行うことができる緑色チャネルデータの計算には、識別されたピーク強度位置での強度と平均光線ピクセル強度との比率を求めること、及び識別されたピーク強度位置での強度と光線起点強度との比率を求めることなどが含まれる。これらの計算は、赤色ピークデータにより指定された正確なピクセル位置で行うこともでき、或いは赤色ピークピクセル位置の近傍で行うこともできる。赤色ピークピクセルの近傍のピクセルには、正確なピークピクセルの位置をちょうど取り囲む領域（例えば、正確なピクセルの位置＋／−０％、１％、１％〜５％又は全光線長さの何らかの適切な割合）のピクセルを含むことができる。

赤色チャネルデータを用いて、緑色チャネル内のデータの処理を支援する場合でも、緑色チャネル画像データを用いて、試料中の生物学的特徴の位置及び範囲を求めることができる。例えば、赤色チャネルデータを用いて細胞膜の位置を見つける場合でも、緑色チャネルデータ（主データチャネルとしての同じ緑色チャネル内又は異なる緑色波長に対応する緑色チャネル内の）を用いて、細胞体に関する情報を生成することができる。実施例として、この付加的な緑色チャネルデータを閾値と比較し、この比較した結果（ピクセル強度が閾値の上か下か）を用いて、細胞境界の位置（例えば、閾値レベルを超えなくなる位置）に関する情報を得ることができる。

更に、これら３つ全てのデータ取り込みチャネル（赤色、緑色１、緑色２、又は他の適切な色又は波長）は、別の目的（例えば、細胞核及びシード点の位置を見つけるため）に用いられる別のチャネル（例えば、青色チャネル又は別の色又は波長に関連するチャネル）に対するデータと組み合わせて用いることもできる。

異なる波長で種々のチャネルに対して取得された画像データは、どの核を光線法で分析する必要があるかを決定するための他の方法で用いることもできる。例えば、細胞株が、細胞内に含まれる関心のある特定のタンパク質の量を示すために、発現するか又は蛍光マーカでラベルすることができる場合には、十分な量のタンパク質を発現する（或いは、発現しない）細胞だけを分析することができる。例えば、青色核マーカを用いる場合には、細胞核をラベルし、青色チャネル内で識別することができる。発現を測定するタンパク質が緑色波長でラベルされる（又は蛍光を発するように変えられる）場合には、青色チャネル内で識別された核ピクセルの近傍の緑色チャネル内のピクセルの強度を調べることができる。緑色チャネル内で十分な強度を有する細胞は、関心のあるタンパク質の発現が十分であることを示しており、この細胞のみを光線法で分析することになる。この実施例では、赤色の膜のマーカを含み、上述のように、赤色チャネル内の光線に沿うピーク強度ピクセル（又は複数のピクセル）を識別して分析に用いることができるようにすることが可能である。

また、核近傍のピクセル又はカラーチャネル内の光線に沿うピクセルの平均強度を用いて、別個のデータチャネルに対して計算したピーク強度値を正規化することができる。例えば、関心のあるタンパク質の発現を緑色チャネル内で監視することができ、細胞内から細胞表面（ここで、赤色マーカでラベルすることができる）へのタンパク質の小さな分画の活性化を監視するようにアッセイを設計することができる。（一般に、適切な化学物質又は生物学的実体を用いて、化学化合物又は生物学的薬剤などの試料を活性化することができる。画像データを処理することにより、活性化による画像データの変化を研究することができる。）この実施例では、赤色チャネル内の光線のピーク強度が、細胞表面の（活性化された）ラベルされたタンパク質の位置に対応することになり、赤色チャネル内のピーク強度が活性化タンパク質の量に比例することになる。この場合には、赤色ピーク強度を緑色（発現）信号に対して正規化すると有利である可能性がある。正規化しなければ、強く活性化されて弱く発現した細胞と弱く活性化されて強く発現した細胞とは、各々、細胞表面に関心のある赤色にラベルされたタンパク質のコピーの数が同じである場合があり、これらを区別できない可能性がある。緑色チャネルに対応させるための赤色チャネル画像データの（緑色チャネル画像データピクセル強度計算の結果を用いる）正規化は、青色チャネル画像データを用いて細胞核の位置を識別すると容易になる可能性がある。

光線法で光線パラメータを計算するための付加的な分類基準は、核に引き付けられる有効光線の数を求めることに基づく。光線終端基準には、強度がユーザ指定の閾値より低い隣接する細胞の核又は光線に沿うピクセルのいずれかに遭遇することなどの幾つかの基準がある。ユーザは、有効光線としてみなされる光線に必要な光線中のピクセルの数（即ち、起点から終端点までの光線のピクセルの長さ）を指定することができる。また、ユーザは、個々の光線データから光線パラメータを計算するために細胞が有する必要があると認められる光線の数を指定することもできる。

光線画像分析法に含まれる例示的な段階を図１０に示す。最初に、実行されることになる所望の細胞系アッセイに適切なマーカ方式を選択する必要がある。どのような適切な数のマーカ及び関連画像チャネルを用いてもよい。実施例として、１つのマーカ（例えば、青色マーカ）を用いて細胞核をラベルすることができる。別のマーカ（例えば、緑色マーカ）を用いて、細胞体を識別することができる。別のマーカ（例えば、赤色又は緑色マーカ）は、図８のピーク強度５６などのピーク強度の位置を特定することを望むチャネル内で蛍光を発することができる。更に、（例えばラベルされたタンパク質の動きを監視するために）主要データ分析が行われているチャネルに対応する更に別のマーカ（例えば緑色マーカ）を用いることもできる。これらのマーカは各々、異なる波長（色）で蛍光を発することもでき、全て又は一部は、同じ波長（色）で蛍光を発することもできる。また、（例えば、可視光顕微鏡により）画像取得機器１４を用いてこれらのマーカを検出することができる限りは、蛍光を発しないマーカを用いてもよい。

実行すべき研究の種類を決定し、適切なマーカ方式を実施すると、システム１０を用いて、段階６０で試驗中の生物学的試料に対する画像データを取得することができる。この画像取得段階及び図１０の他の段階は、種々の試験条件に暴露する（例えば、実験化合物に暴露する）前後で繰り返すことができる。画像は、図２に関して説明したような多波長走査型レーザ顕微鏡を用いて取得することもでき、別の何らかの適切な画像取得方式を用いることもできる。

段階６２では、システム１０を用いて、１人又は複数のユーザにユーザ選択パラメータを入力する機会を与えることができる。例えば、コンピュータモニターを用いて、ユーザに選択メニューオプションを示し、適切な基準及び数字を記入するよう入力ボックスに入力することができる。この方法又は他の何らかの適切な方法を用いて、ユーザ入力を收集することができる。段階６２及び６４及び図１０の他の段階などは、所望であれば異なる順序で行うか又は同時に行うこともできる。

段階６４では、システム１０により、シード点を識別し、光線４０の組を構成するのに用いることができる。シード点は、何らかの適切な画像処理技術を用いて識別することができる。実施例として、核は、適切な閾値及びフィルタ技術（例えば図３に関して記載した技術）を用いて識別することができる。図３に関して説明したピクセル位置重み付け又はピクセル強度重み付け技術又は他の適切なシード点位置決め技術を用いて、識別した核の各々の内部にシード点位置を指定することができる。

段階６６では、光線４０の位置を規定することができる。何らかの適切な技術を用いて、光線４０の位置を決定することができる。例えば、各細胞及び核に関連する光線４０は、その細胞核内に位置決めされた単一のシード点を起点とすることができる。また、光線４０は、核境界を起点とすることもできる。

光線の数は、システム初期設定とすることもでき、或いはユーザが（例えば段階６２で）指定することができる。また、核の周りに光線を配分するのに用いる方法もユーザが指定することもでき、或いはシステム初期設定とすることもできる。光線は、図４に関して説明したように、均等な角度に配分する方法を用いて核の周りに配分することができる。また、光線は、図５に関して説明したように、核の境界に関連するピクセルの位置に従って核の周りに配分することもできる。

段階６８では、光線を定義する処理は、光線を起点から外向きに延長させながら、光線に沿う画像データを分析することにより完了することができる。光線は、ユーザ指定又はシステム初期設定の光線終端に従って終端するまで延長することができる。使用可能な適切な光線終端基準には、ユーザ指定又はシステム初期設定の最大長さ、又は（光線中のピクセル強度を満たさない場合には）細胞境界に到達したことを示すユーザ指定の強度レベル閾値が含まれる。また、光線は、更に光線を延長させると隣接するマーカ特徴（例えば、他の核又は細胞）に侵入することになると判断される場合にはいつでも終端させることもできる。

段階７０では、段階６０で取得された画像データは、規定された光線位置を用いて更に分析することができる。（データチャネルの１つ又はそれ以上の）各光線に関連するピクセル又は画像データの全てを処理することができる。１つの例示的な装置においては、（例えばシード点位置及び光線起点を規定するために）核の位置を識別するのに、１つのチャネル（例えば、青色チャネル）を用いることができる。別のチャネル（例えば緑色チャネル）を用いて、細胞体の特徴を測定することもできる。赤色チャネルを（実施例として）用いて、ピーク強度測定（例えば、光線に関連する絶対ピーク強度又はピークの直ぐ周辺の平均ピーク強度の測定）を行うことができる。別のチャネル（例えば、第２の緑色チャネル）を用いて、細胞特徴又は関心のある他の領域の転位を測定することができる。このチャネルは、場合によっては、「主要データチャネル」と呼ばれることもある。これらの異なる測定に対するマーカは全て、異なる波長を有することもでき、或いはこれらのマーカの一部又は全てを同じ波長とすることもできる。

段階７０でシステム１０により実施されるデータ分析を用いて、細胞系アッセイの結果を確認するのに役立つ情報が得られる傾向がある何らかの適切なパラメータの値を計算することができる。実施例として、各光線に対して（例えば、主データチャネル内又は特定のピーク強度チャネル内の）絶対ピーク強度を計算することにより、パラメータＩＰＥＡＫを計算することができる。このピーク強度（図８ではラベルされたＩ_Ｂ）は、特定の細胞境界の活動を調べる研究で関心がもたれる可能性がある。例えば、このような研究には、研究の特定の局面でタンパク質のコピーが幾つ細胞膜から「突出」しているか（従って、関連マーカで上手くマーカされているか）を判断する段階を含むことができる。

場合によっては、主要データチャネル（例えば、緑色チャネル）内の強度が、研究の一部を行う間に特定の光線位置で強度ピークを示し、研究の別の部分を行う間にはその位置で強度ピークを示さない場合がある。例えば、研究の一部を行う間には、緑色の主データチャネル内の各光線に対するピーク強度は、光線が細胞膜を交差する部分に位置する可能性がある。研究の他の部分を行う間には、緑色マーカは移動する可能性もある。この場合には、赤色（細胞膜マーカ）チャネルがピークである各光線に沿う位置を用いて、細胞膜の位置に関する情報を生成することができ、次に、この情報を用いて、緑色チャネルのデータを測定する適切な位置を定めることができる。ピーク強度ピクセルの位置（例えば、赤色チャネルが強度ピークである各光線に沿う位置）は、細胞境界での関心のある緑色ピクセルを識別するときに用いることができる。

段階７０で計算することができる別のパラメータは、パラメータＲＰＫＴＬであり、これは、平均ピーク値と光線起点でのピーク強度との比率を表す。平均ピーク値は、光線のピークピクセルを含む直前及び直後のピクセルを平均することにより、即ち、ピーク値ピクセルを囲む全てのピクセル＋／−０，１，２，５，１０又は任意の他の適切な数のピクセルを平均することにより計算することができる。光線起点でのピクセル強度は、シード点、又は核境界光線起点などの他の適切な光線起点でのピクセル強度とすることができる。パラメータＰＲＫＴＬは、ＩＰＥＡＫパラメータの正規化されたものとして機能することができる。平均ピーク値は、緑色チャネル内のピークピクセル位置に基づくか、又は別のチャネル内（例えば赤色チャネルのような特定のピークチャネル内）で測定したピークピクセル位置に基づき、この主データチャネル（例えば、緑色データチャネル）で測定することができる。

計算することができる別のパラメータは、ＲＰＫＬＮパラメータである。このパラメータでは、平均ピーク値（例えば、緑色チャネルなどの主データチャネル又は赤色チャネルなどの特定のピーク強度チャネル内のピーク強度位置データに基づき主データチャネル内で測定したもの）を光線上の全てのピクセルに対する平均ピクセル強度（平均光線ピクセル強度）と比較することができる。光線上のピクセルに対する平均ピクセル強度は、光線起点（シード点起点、細胞境界起点、又は何らかの他の適切な位置）からピーク位置直前まで（実施例として）の間の光線に沿うピクセルの平均強度を求めることにより計算することができる。ピークピクセル強度位置がピクセルｎに位置する場合には、ピーク強度の「直前」の点の位置を、例えば、ピクセルｎ−１からｎ−１００（即ち、光線に沿って光線起点方向に近づく１〜１００ピクセル）又は何らかの他の適切な位置において見つけることができる。

ピークまでの平均距離（例えば、核に関連する光線４０の各々に沿ってピークまでの平均距離）を計算し、パラメータＤＰＥＡＫを得ることができる。ＤＰＥＡＫパラメータは、光線起点から、或いは（所望であれば）主データチャネルのデータを分析するために光線起点としてシード点を用いない場合でもシード点から測定開始することができる。パラメータＤＰＥＡＫの値は、（関連ピークマーカが細胞境界上に位置決めされる場合）細胞の大きさを示すこともでき、特定のタンパク質又は細胞成分が移動した距離を求めるのに用いることもできる。

また、段階７０では、統計的情報を集めることもできる。例えば、任意の核に関連する光線の組の各光線に対してピークピクセル強度値までの光線距離の平均標準偏差を表すパラメータＳＤＤＰＥＡＫを集めることができる。従って、ＳＤＤＰＥＡＫは、細胞形態の良好な指標となることができる。丸い細胞は、光線長さの標準偏差が小さく、丸くない細胞は光線長さの標準偏差が大きい可能性がある。

段階７０で計算することができる別のパラメータは、パラメータＤＷＧＨＴ（正規化半径パラメータ）である。パラメータＤＷＧＨＴは、光線上のピクセルの平均強度重み付け配分を求めることにより計算することができる。ＤＷＧＨＴの値は、値０（細胞に対するピクセル強度の全てが、シード点又は他の光線起点に位置する場合）から値１（ピクセル強度の全てが、光線の外側端部に位置する場合）までの範囲とすることができる。ピクセルの強度重み付け配分が、光線の外側端部よりも光線起点に向かってより重くされる場合は、ＤＷＧＨＴの値は、１から０に近づく。ピクセルの強度重み付け配分が、光線起点より光線の外側端部に向かってより重くされる場合には、ＤＷＧＨＴの値は０から１に近づく。ピクセル強度が光線に沿って完全に均等に配分される場合には、ＤＷＧＨＴの値は、０．５に等しくなる。ＤＷＧＨＴパラメータは、半径方向マーカ位置（核に近いか、細胞境界に近い）の良好な指標であり、細胞の大きさや形状には関係がない。

これらのパラメータは、単なる例証である。段階７０では、光線法を用いて、何らかの適切な統計パラメータ又は他の光線パラメータを計算することもできる。更に、分析する画像データは、段階７０の計算の間に、種々の方法で組織化することができる。例えば、平均の細胞の大きさを計算する場合には、得られる計算パラメータにより、各光線の長さ、任意の細胞、核、及びシード点に関連する光線の組の平均長さ、任意の試料画像内の全ての光線の平均長さ等を明らかにすることができる。

図１０の測定及び計算は、研究の過程で（例えば、試験化合物に暴露することのような試験条件に曝されるときに細胞アッセイの細胞はどのような挙動を示すかを評価するために）１回又は複数回繰り返すことができる。取り込まれた画像データ内の全体の細胞及び細胞境界を個々に識別することは通常重要でないので、上述の光線法は、画像測定を行うために完全に細胞を識別することが必要な方式に比べてかなりのロバスト性を有することができる。

以上のことは、本発明の原理の単なる例証に過ぎず、当業者であれば本発明の範囲及び精神から逸脱することなく種々の変更を行うことが可能であることは理解されるであろう。上述の明細書によりこのような変更形態の多くの実施例が得られる。

本発明による細胞系アッセイを行うための生物学的試料のデジタル画像を取得して処理するのに用いることができる例示的なシステムの概略図。 本発明による細胞系アッセイを行うための生物学的試料のデジタル画像を取得して処理するのに用いることができる例示的な操作顕微鏡システムの概略図。 本発明によりどのように核を識別することができるかを示す細胞核のデジタル画像の一部のピクセル図。 本発明による画像分析の間に等間隔で配置された角度の光線をどのように細胞に関連させることができるかを示す図。 本発明による画像分析の間に、光線をどのように細胞境界上のピクセルに関連させることができるかを示す図。 本発明による試験化合物に暴露する前の例示的な青色及び緑色の蛍光マーカを有する細胞及び画像分析に用いるための関連する光線の図。 本発明による試験化合物に暴露した後の図６の細胞の図。 本発明による図６の光線に沿って取った画像データ強度対距離の図。 本発明による図７の光線に沿って取った画像データ強度対距離の図。 本発明による細胞を含む試料などの生物学的試料のデジタル画像を取得して処理する際に含まれる例示的な段階のフローチャート。

符号の説明

４０ 光線
４２ 細胞
４４ 核
４８ シード点
５０ 交差点

Claims (33)

1. 細胞を含む試料のデジタル画像データを分析するための方法であって、前記細胞が核を含み、前記方法が、
   画像データを分析して核の少なくとも１つを識別する段階と、
   前記画像データの一部に関連付けられた、前記核に関連する複数の半径方向光線を定める段階と、
   前記光線に関連する前記画像データに関する計算を行う段階と、
   を含む方法。
2. 前記細胞が、異なる波長で蛍光を発する蛍光マーカでラベルされており、前記方法が更に、前記画像データを走査型レーザ顕微鏡で取得する段階を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記核に関連する前記光線を前記核内の共通の位置に起点を有するように定める段階を更に含む請求項１に記載の方法。
4. 前記核が境界を有し、前記方法が更に、前記光線の起点が前記核の境界にあるように該核に関連する前記光線を定める段階を更に含む請求項１に記載の方法。
5. ユーザに光線終端基準を指定する機会を提供する段階を更に含む請求項１に記載の方法。
6. 前記光線の長さが、ユーザ指定の長さにより決定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 別の細胞の核に交差する各光線が交差点で終端するよう前記光線が更に定められることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記各光線が、前記核から外向きに延び、光線に関連する画像データの強度レベルが任意の強度レベル閾値より低くなると終端するように、前記光線が更に定められることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記画像データが複数のチャネルのデータを含み、前記各データが異なる波長の光と関連し、前記画像データを分析して前記核を識別する段階が前記チャネルの１つの画像データを分析して前記核を識別する段階を含み、前記光線に関する前記画像データの計算を行う段階が前記別のチャネルの少なくとも１つに対する画像データの計算を行う段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、各光線に対して該光線に沿う前記画像データのピーク強度を計算する段階を含む請求項１に記載の方法。
11. 前記画像データが各々が関連ピクセル強度レベルを有する複数のピクセルを含み、計算を行う段階が各光線に対して該光線のピーク強度レベルを有する前記ピクセルの位置を識別する段階を含む請求項１に記載の方法。
12. 前記細胞が細胞境界を有し、前記方法が前記核内のシード点を識別する段階を更に含み、前記光線が前記シード点から前記細胞境界に向かって延びることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 前記光線に関連する画像データの計算を行う段階が、統計的計算を行う段階を含む請求項１に記載の方法。
14. 前記画像に対するピーク強度値が各光線に沿う特定の位置にあり、前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、少なくとも前記ピーク強度値の位置に基づく標準偏差を計算する段階を含む請求項１に記載の方法。
15. 前記光線が互いに等間隔の角度に配置される請求項１に記載の方法。
16. 前記核が境界を有し、前記光線が前記核内の起点から始まると共に外向き方向に放射して前記光線が前記核境界に位置する少なくとも１つのピクセルを通過するように定められることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記画像データが複数のピクセルを含み、前記核が境界を有し、各光線が、前記核境界のピクセルから始まって任意の核の全ての光線が前記核内の共通点に戻って投射されるような方向に前記核から離れて延びる請求項１に記載の方法。
18. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、前記チャネルの１つに対して画像データの計算を行う段階と、このチャネルに対する前記画像データに対する計算結果を用いて前記チャネルの別のチャネルの画像データの計算を行う段階とを含む請求項１に記載の方法。
19. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記光線に関連する画像データの計算を行う段階が、前記チャネルの１つに対して前記画像データの計算を行って前記光線に沿うピーク強度の位置を識別する段階と、前記識別されたピーク強度位置で前記チャネルの別のチャネルの画像データの計算を行う段階とを含む請求項１に記載の方法。
20. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、
    前記チャネルの１つに対する前記画像データの計算を行って前記光線に沿うピーク強度位置を識別する段階と、前記識別されたピーク強度位置で前記チャネルの少なくとも他の１つに対する前記画像データの計算を行い、前記識別されたピーク強度位置での強度と光線起点ピクセル強度との比率を求める段階を含む請求項１に記載の方法。
21. 前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、
    前記光線に関連する前記画像データの計算を行って各光線に沿うピーク強度位置を識別する段階と、
    各光線の前記識別されたピーク強度位置での強度と該光線に対する光線起点ピクセル強度との比率を求める段階と、
    を含む請求項１に記載の方法。
22. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、
    前記チャネルの１つに対して画像データの計算を行って前記光線に沿うピーク強度の位置を識別する段階と、
    前記識別されたピーク強度位置で前記チャネルの別の１つに対する画像データの計算を行い、前記識別されたピーク強度位置での強度と平均光線ピクセル強度との比率を求める段階と、
    を含む請求項１に記載の方法。
23. 前記光線に関連する画像データの計算を行う段階が、
    前記光線に関連する前記画像データの計算を行って前記光線に沿う前記ピーク強度位置を識別する段階と、
    前記識別されたピーク強度の位置での強度と平均光線ピクセル強度との比率を求める段階と、
    を含む請求項１に記載の方法。
24. 前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、
    化学又は生物学的実体で活性化される前に前記試料に対して前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階と、
    前記化学又は生物学的実体で活性化した後に、前記同じ試料に対して前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階と、
    前記画像データ内のどの変化が、前記試料を前記化学又は生物学的実体で活性化したことによるものかを計算する段階と、
    を含む請求項１に記載の方法。
25. 前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、前記核に関連する前記光線のどれが有効であるかを求める段階を含み、各有効な光線は起点と終端点との間にユーザ指定の数より多いピクセルを含み、前記計算を行う段階が更に、ユーザ指定の数より多い有効光線を有する核に対して前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階を含む請求項１に記載の方法。
26. 前記各光線が、一方の端部に光線起点を有し且つ他方の端部に外側端部を有し、前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階が、前記光線に関連するピクセルに対して平均強度重み付け配分を求めることによって、０〜１の範囲の値を有する正規化半径パラメータを計算する段階を含み、前記ピクセルの強度重み付け配分が前記光線の外側端部より前記光線起点に向かってより重くする場合には前記正規化半径パラメータの値が１より０に近づき、前記ピクセルの前記強度重み付け配分が前記光線起点より前記光線の外側端部に向かってより重くする場合には前記正規化半径パラメータの値が０より１に近くなるようにすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
27. 細胞を含む試料のデジタル画像データを分析するための方法であって、前記細胞が核を含み、前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記各核に関連する複数の半径方向の光線が存在し、前記画データの一部が前記光線に関連しており、前記方法が、
    前記チャネルのうちの第１のチャネルの前記画像データを解析して複数の核を識別する段階と、
    前記チャネルのうちの第２のチャネルの前記各識別した核に関連する複数のピクセルの強度を計算する段階と、
    前記第２のチャネル内の前記核に関連するピクセルの前記強度が、ユーザが定義した閾値より大きいか又は小さい細胞に対して前記光線に関連する前記画像データの計算を行う段階と、
    を含む方法。
28. 細胞を含む試料のデジタル画像データを分析するための方法であって、前記細胞が核を含み、前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記各核に関連する複数の半径方向の光線が存在し、前記画データの一部が前記光線に関連しており、前記方法が、
    前記チャネルのうちの第１のチャネルの前記画像データを解析して前記核の少なくとも任意の１つを識別する段階と、
    前記チャネルの第２のチャネルの前記任意の核に関連する複数のピクセルの強度を計算する段階と、
    前記第２のチャネルのピクセル強度の計算結果を用いて、前記チャネルの第３のチャネルの前記光線に関連する前記画像データに行った計算結果を正規化する段階と、
    を含む方法。
29. 核が含まれる細胞を含む試料のデジタル画像データを取得する画像取得機器と、
    前記画像を分析して前記核の少なくとも１つを識別し、前記核に関連する複数の半径方向の光線を定め、前記画像データの幾つかが前記光線に関連し、前記光線に関連する前記画像データの計算を行うように構成されたプロセッサと、
    を備えるシステム。
30. 前記細胞が異なる波長で蛍光を発する蛍光マーカでラベルされ、前記画像取得システムが多波長走査型レーザ顕微鏡を備えることを特徴とする請求項２９に記載のシステム。
31. 前記プロセッサは更に、前記光線が確実に他の核に侵入しないように構成されることを特徴とする請求項２９に記載のシステム。
32. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記プロセッサが更に、前記チャネルの１つに対する前記画像データを分析して前記核を識別し、前記チャネルの別の１つに対する前記画像データの計算を行うように構成されることを特徴とする請求項２９に記載のシステム。
33. 前記画像データが複数のチャネルに対するデータを含み、該データの各々が異なる波長の光に関連し、前記プロセッサが更に、前記チャネルの１つに対する前記画像データを分析して前記核を識別し、前記光線に関連するピクセル強度画像データの計算を行うことを含む、前記チャネルの別の１つに対する前記画像データの計算を行うように構成されることを特徴とする請求項２９に記載のシステム。

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