JP2005518188A - 鳥類の卵に注入する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする2001年8月13日出願の米国特許仮出願第60/312,015号の利益を主張する。
本発明は、胚を含有する卵を操作する方法、および特に、鳥類の胚を含有する卵の中へ物質を導入する方法、またはそのような卵から物質を取り出す方法に関する。
1.100%のエタノールを用いて拭うことによりE0日齢の卵の表面全体を殺菌する。
2.気室の位置を確認するために卵を明かりに透かして見る。鉛筆で気室の位置を殻上にマークする。
3.殻に穴を開けることによって、窓(小開口部)を卵の鈍端(気室の中心)に作成する。外殻膜を無傷で維持するために細心の注意を払う。
4.殻における窓を通して外殻膜が露出している場所である卵の鈍端、および周囲領域は、再び70%のエタノールを使用して表面を殺菌する。
5.膜にギザギザの縁が残らないように注意しながら、鉗子およびメス(#11ブレード、ペルソナメディカル(Personna Medical)製)を用いて外殻膜を注意深く取り除く。
6.胚盤葉は、ドーナツ形構造として気室膜(すなわち、内殻膜)の下方で視認される。
7.ガラス製のマイクロピペット(もしくはニードル)を使用して気室膜を穿刺し、胚盤葉の胚下腔液内へ注入する。約3〜5μLの液体(100g/mLのペニシリン−ストレプトマイシンを含有する)を注入する。マイクロピペットは、サッター(Sutter)製P−30プラー、温度−800、引張力−950を使用して引っ張った。
8.注入後、窓に適合するように切断した耐水テープ(ジョンソン・エンド・ジョンソン(Johnson & Johnson)製、幅1インチ)を貼付し、所定の位置に押し付ける。
9.その後、テープの辺縁をシールすることに重点を置いて、テープの全面を覆うようにシリコン(GE製Silicone II、透明)シールを広げる。
10.卵を培養器へ移す前に、シリコンを約30〜45分間にわたり乾燥させる。
1.卵は、胚盤葉を卵の側方の中心に向けて導くために、それらの長軸上で、0〜7日間にわたり60°F、湿度75%で貯蔵した。
2.上に向いている位置をサインペンでマークした。
3.貯蔵後、卵の側方にペンマークの位置で7mm径の穴を穿孔した。
4.卵殻を取り除いた。通例、内殻膜および外殻膜は無傷で残ったが、それらもまた取り除いた。
5.胚盤葉は、卵殻に作成した開口部の近く、またはすぐ下方で同定された。この特別の実験のため、UV光線のような様々な傷害処理の適用を許容するように、胚盤葉が前記開口部のすぐ下方にある卵だけを使用した。
6.穴は、5〜10分間は開いたままにした。
7.この穴は、GE製シリコンIIおよびJ&J製耐水テープを用いてシールした。
8.シリコンは約30分間かけて乾燥させた。
9.卵は鈍端を上に、穴を側方に向けて培養器内に配置し、2日間にわたり、3時間毎に回転させながら99°Fで培養した。
10.写真撮影のために卵から胚を収集した。
1.横向き(ボバンスおよびハイラインW−36)に貯蔵し、そして横向きで測定した。
2.上下を逆さまに(すなわち、鈍端を下に)して3日間(ハイラインW−36)にわたり、その後は鈍端を上に向け3〜4日間にわたり貯蔵し、そして鈍端を上にして測定した。
3.上下を逆さまに(すなわち、鈍端を下に)して6〜7日間にわたり貯蔵し、鈍端で測定した(ボバンス)。
4.上下を逆さまに(すなわち、鈍端を下に)して6〜7日間にわたり貯蔵し、鈍端で測定した(ハイラインW−36)。
1.標準温度(60°F)で、相対湿度を75%から50%に下げた(ハイラインW−36卵)。
2.最初の5日間は、標準温度(60°F)および相対湿度(75%)、その後の最終2日間の貯蔵期間中は温度を、80°Fに上昇させた(75%RH)。
3.標準温度(60°F)だが相対湿度は90%に設定した(ハイラインW−36)。
4.温度を70°Fに、そして相対湿度は50%に設定した(ハイラインW−36)。
5.温度を70°Fに、そして標準相対湿度へ設定した(ハイラインW−36)。
6.温度を70°Fに、そして相対湿度は90%に設定した(ボバンスおよびハイラインW−36)。
7.温度を80°Fに、そして標準相対湿度へ設定した(ハイラインW−36)。
重力は、卵の中で胚盤葉を最上の位置に方向付ける際に重要な役割を果たすと考えられる。遠心分離は、人工重力を作り出す、または重力の実質的に働く力(body force)を増大させるための一つの方法である。遠心分離に起因するより大きな力が胚盤葉の位置を改善するかどうかを決定するために試験を実施した。
貯蔵中に卵を回転させることが卵の上心に向かう胚盤葉の方向性に及ぼす作用を評価した。卵は60°Fおよび75%RHのホバベータ(Hovabator)回転装置に6〜7日間配置した。この回転装置は、卵を垂直からプラスおよびマイナス45度移動させ、0度〜+45度から0度〜−45度および0に戻る1完全サイクルは4時間を要した。未処理の卵は、比較のため(回転装置内の卵と適合させるため)にフラット(段ボール紙製)内に貯蔵した。結果は下記の表11に示した。
貯蔵中に卵を旋回させることが卵の上心に向かう胚盤葉の方向性に及ぼす作用を評価した。卵は実施例7に記載した通りフィクスチャー内に貯蔵し、旋回させなかったが同様にフィクスチャー内に貯蔵した卵と比較した。この試験では、卵を5日間貯蔵し、300rpmで30分間旋回させ、さらに1日間貯蔵して胚盤葉の位置を測定した。旋回群は中心からわずかに大きい胚盤葉の位置を有したが、極端な偏心が所見された胚盤葉のパーセンテージはわずかに改善された。結果は下記の表12に示した。
貯蔵中に卵を振とうさせることが卵の上死点に向けて胚盤葉を方向付けることを評価した。卵は実施例6に記載した通りフィクスチャー内に貯蔵し、振とうしなかったが同様にフィクスチャー内に貯蔵した卵と比較した。
Claims (65)
- 鳥類の卵に注入する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
卵殻における該小開口部を通して装置を伸長させるステップと、
該装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該装置を挿入する前は本質的に無傷でなければならず、
該装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。 - 前記装置が送達装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を卵の中へ配置するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記装置がサンプリング装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、卵からサンプルを取り出すステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記装置が検出装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、該検出装置を用いて卵の内部から情報を検出するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記装置が卵殻における小開口部を通して所定の位置へ伸長される、請求項1の方法。
- 前記装置が卵殻における小開口部を通して胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接する位置へ伸長される、請求項1の方法。
- 前記装置が卵殻における小開口部を通して、
(a)胚下腔と、
(b)暗域と卵黄膜との間と、
(c)明域と卵黄膜との間と、
(d)暗域と明域との間と、
(e)明域内と、
(f)暗域内と、
(g)上記の(a)〜(f)のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項6の方法。 - 前記胚盤葉を傷つけるステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記卵が概して水平位置に方向付けられ、前記卵殻における小開口部が卵の上に面する側に導入される、請求項1の方法。
- 前記卵が処理前に貯蔵されている、請求項1の方法。
- 前記卵殻内へ小開口部を導入するステップの前に、該卵殻へシーラントを適用するステップをさらに備え、前記小開口部はシーラントが塗布される部位で卵殻内に導入される、請求項1の方法。
- 前記胚盤葉がステージXIII(EG&K)またはそれより早期の胚盤葉である、請求項1の方法。
- 前記胚盤葉がステージVIIIからステージXIII(EG&K)の胚盤葉である、請求項12の方法。
- 前記胚盤葉がステージX(EG&K)の胚盤葉である、請求項12の方法。
- 前記卵がニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウおよびエミューの卵からなる群から選択される、請求項1の方法。
- 前記卵がニワトリの卵である、請求項15の方法。
- 前記卵がシチメンチョウの卵である、請求項15の方法。
- 前記胚盤葉が異種核酸を含む、請求項1の方法。
- 前記胚盤葉を所望の位置へ導くステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記導くステップが、
(a)卵を撹拌するステップと、
(b)卵を加熱するステップと、
(c)卵を一定位置に保持するステップと、
(d)卵の化学処理と、
(e)上記の(a)〜(d)のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される方法を含む、請求項19の方法。 - 前記胚盤葉またはその中の区画の位置を決定するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記決定するステップが前記胚盤葉を視認するステップを含む、請求項21の方法。
- 前記決定するステップが検出装置を用いて前記胚盤葉またはその中の区画の位置を決定するステップを含む、請求項21の方法。
- 前記卵殻における小開口部をシールするステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記外殻膜における小開口部を導入するステップをさらに備え、前記伸長させるステップが卵殻および外殻膜における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップを含む、請求項1の方法。
- 孵化するまで前記卵を培養するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- 前記装置が多重注入送達装置である、請求項2の方法。
- 前記卵の中に配置される物質がポリペプチドを含む、請求項2の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体、ホルモン、成長因子、酵素およびサイトカインからなる群から選択される、請求項28の方法。
- 前記卵の中に配置される物質がヌクレオチド配列を含む、請求項2の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、ウイルスベクター、リポソームおよびエレクトロポレーションからなる群から選択される方法を使用して胚盤葉内へ導入される、請求項30の方法。
- 前記ヌクレオチド配列が、ポリペプチドもしくはアンチセンス核酸をコードする、請求項30の方法。
- 前記卵の中に配置される物質が抗生物質を含む、請求項2の方法。
- 前記卵の中に配置される物質がドナー細胞を含む、請求項2の方法。
- 前記ドナー細胞が鳥類の卵である、請求項34の方法。
- 前記ドナー細胞が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウおよびエミュー細胞からなる群から選択される、請求項35の方法。
- 前記ドナー細胞が前記胚盤葉の種以外の鳥類種由来である、請求項35の方法。
- 前記ドナー細胞がトランスジェニック細胞である、請求項34の方法。
- 前記ドナー細胞が、胚盤葉細胞、幹細胞、培養幹細胞、胚幹細胞、始原生殖細胞、胚生殖細胞、および上記のいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項34の方法。
- 前記胚盤葉がニワトリ胚盤葉であり、前記ドナー細胞がニワトリ細胞である、請求項34の方法。
- 前記胚盤葉および前記ドナー細胞がニワトリの相違する系統または品種からである、請求項40の方法。
- 前記卵から取り出されたサンプルが胚下腔液を含む、請求項3の方法。
- 前記卵から取り出されたサンプルが胚盤葉細胞を含む、請求項3の方法。
- 前記検出装置が電気センサーである、請求項4の方法。
- 前記検出装置が光センサーである、請求項4の方法。
- 前記検出装置が化学センサーである、請求項4の方法。
- 前記検出装置が温度センサーである、請求項4の方法。
- 前記検出装置が音響センサーである、請求項4の方法。
- 前記検出装置が圧力センサーである、請求項4の方法。
- 鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が(i)胚盤葉および(ii)気室を含有し、
気室の上方の卵の鈍端で卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
卵殻における該小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
卵殻および外殻膜における該小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接する位置に配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。 - 前記方向付けるステップが卵の鈍端を概して上向き位置に配置するステップを含む、請求項50の方法。
- 前記卵殻の卵の鈍端に位置する小開口部が所定位置へ導入される、請求項50の方法。
- 前記所定位置が実質的に気室の中心にある、請求項52の方法。
- 前記卵殻および外殻膜における小開口部を導入するステップが、実質的に同時に実施される、請求項50の方法。
- 前記放出するステップの前に胚盤葉の位置を決定するステップをさらに含む、請求項50の方法。
- 前記送達装置が卵殻における小開口部を通して、
(a)胚下腔と、
(b)暗域と卵黄膜との間と、
(c)明域と卵黄膜との間と、
(d)暗域と明域との間と、
(e)明域内と、
(f)暗域内と、
(g)上記の(a)〜(f)のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項50の方法。 - 鳥類の複数の卵を注入する方法であって、
鳥類の複数の卵を所定位置へ方向付けるステップであって、このとき各卵が胚盤葉を含有し、
小開口部を各卵殻の中へ導入するステップと、
各卵殻における開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて各卵の内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷であり、
該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または各卵の胚盤葉に極めて近接する位置に配置するステップと、
該送達装置を各卵から引き抜くステップと
を含む方法。 - 孵化するまで複数の卵を培養するステップをさらに含む、請求項57の方法。
- 結果として生じる孵化率が少なくとも約50%である、請求項58の方法。
- 結果として生じる孵化率が少なくとも約65%である、請求項58の方法。
- キメラ鳥を産生する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
該卵殻における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
キメラ胚を生じさせるために十分な条件下で、該送達装置を通して鳥類ドナー細胞を放出して該ドナー細胞を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接させて配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと、
キメラ鳥を産生させるためのキメラ胚を孵化させるために培養するステップと
を含む方法。 - 前記送達装置が卵殻における小開口部を通して、
(a)胚下腔と、
(b)暗域と卵黄膜との間と、
(c)明域と卵黄膜との間と、
(d)暗域と明域との間と、
(e)明域内と、
(f)暗域内と、
(g)上記の(a)〜(f)のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項61の方法。 - トランスジェニック鳥を産生する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
該卵殻における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
トランスジェニック胚を生じさせるために十分な条件下で、該送達装置を通してヌクレオチド配列を含む物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接させて配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと、
トランスジェニック鳥を産生させる目的で孵化させるためにトランスジェニック胚を培養するステップと
を含む方法。 - 鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が(i)胚盤葉および(ii)気室を含有し、
該気室の上方の卵の鈍端で卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
該卵殻における小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
該卵殻および外殻膜における小開口部を通してサンプリング装置を伸長させるステップと、
該サンプリング装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該サンプリング装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該サンプリング装置を用いて胚盤葉からサンプルを取り出すステップと、
該サンプリング装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。 - 鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が(i)胚盤葉および(ii)気室を含有し、
該気室の上方の卵の鈍端に、卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
該卵殻における小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
該卵殻および外殻膜における小開口部を通して検出装置を伸長させるステップと、
該検出装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該検出装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該検出装置を用いて該卵の内側から情報を検出するステップと、
該卵から前記検出装置を引き抜くステップと
を含む方法。
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