JP2005517639A

JP2005517639A - vaccine

Info

Publication number: JP2005517639A
Application number: JP2003548872A
Authority: JP
Inventors: ステファンレドロウ; マイクスキンナー; アドリアンヒル; サラギルバート; リチャードアンダーソン
Original assignee: イシスイノベーションリミテッド
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2005-06-16
Also published as: GB2396814B; WO2003047617A3; US7273605B2; EP1450854A2; AU2002347317B2; GB0407935D0; CN1596126A; GB2396814A; CA2467486A1; US20050025747A1; AU2002347317A1; WO2003047617A2

Abstract

本発明は、１種又は複数の野生型ＦＰＶ遺伝子に改変を有する鶏痘ウイルスゲノムに関する。本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子及び目的とするヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞に送達するためのその使用に関する。本発明はまた、ワクチン接種法、詳しくは、疾病を治療及び／又は予防するために、初回抗原刺激組成物（第１の非複製ウイルスベクターを含む）と追加免疫組成物（第２の非複製ウイルスベクターを含む）とを患者に投与することを含む方法に関する。The present invention relates to a fowlpox virus genome having a modification in one or more wild-type FPV genes. The invention also relates to a viral particle comprising such a genome and its use for delivering a nucleotide of interest (NOI) to a target cell. The present invention also provides priming compositions (including a first non-replicating viral vector) and booster compositions (second non-replicating) for vaccination methods, particularly for treating and / or preventing disease. And a viral vector) to a patient.

Description

本発明はポックスウイルスに関する。詳しくは、本発明は、１種又は複数の野生型ＦＰＶ遺伝子に改変を有する、鶏痘ウイルスゲノム、かかるゲノムを含むウイルス粒子、及び目的とするヌクレオチド（「ＮＯＩ」）を標的細胞に送達するためのその使用に関する。 The present invention relates to poxviruses. Specifically, the present invention is for delivering fowlpox virus genomes, viral particles containing such genomes, and nucleotides of interest ("NOI") having modifications in one or more wild-type FPV genes to target cells. Relating to its use.

本発明はまた、ウイルスベクターを用いるワクチン接種法、詳しくは、２種の異なる非複製ウイルスベクター組成物を用いる異種プライム−ブーストワクチン接種レジメンに関する。 The present invention also relates to vaccination methods using viral vectors, and in particular to heterologous prime-boost vaccination regimes using two different non-replicating viral vector compositions.

ポックスウイルス
ポックスウイルスは、これまで外来タンパク質の異種発現用組換えベクターとして利用されてきた。詳しくは、組換えワクシニアウイルスが、哺乳類細胞において遺伝子を一過的に発現させるためのツール及び実験用組換えワクチンベクターとして研究されている（Ｍｏｓｓ、１９９１、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４１〜８頁及びＭｏｓｓ、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４１〜８頁に概説されている）。 Poxviruses Poxviruses have been used as recombinant vectors for heterologous expression of foreign proteins. Specifically, recombinant vaccinia virus has been studied as a tool for transient expression of genes in mammalian cells and an experimental recombinant vaccine vector (Moss, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11341-8. Page and Moss, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11341-8).

その他のポックスウイルスと共通して、ワクシニアウイルスは細胞の細胞質内に存在し、そこでウイルス複製に必要なタンパク質を発現する。したがって、組換えワクシニアは、外来抗原を哺乳類細胞の細胞質に送達することができ、それによって、抗原処理経路への直接アクセスが可能となり、この結果、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子と関連して、細胞表面に抗原由来ペプチドが提示される（Ｍｏｓｓ、１９９１、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４１〜８頁）。この性質のためにワクシニアは、特に、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を刺激するための組換えワクチンとして有用である。 In common with other poxviruses, vaccinia virus is present in the cytoplasm of the cell where it expresses proteins necessary for viral replication. Thus, recombinant vaccinia can deliver foreign antigens to the cytoplasm of mammalian cells, thereby allowing direct access to antigen processing pathways, resulting in cellular association with MHC class I and class II molecules. An antigen-derived peptide is presented on the surface (Moss, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11341-8). Because of this property, vaccinia is particularly useful as a recombinant vaccine for stimulating CD8 + and CD4 + T cell immune responses.

ワクシニアウイルスの、哺乳類細胞において複製する能力に関して懸念があるため、その臨床使用は制限されており、より安全な代替物が探索されることとなった。これらとしては、ヒト細胞における複製が制限された（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９８、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７９、１１５９〜６７頁）、弱毒ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）（Ｍｅｙｅｒら、１９９１、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７２、１０３１〜８頁、Ｓｕｔｔｅｒ及びＭｏｓｓ、１９９２、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９、１０８４７〜５１頁、Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ１２、１０３２〜４０頁）、哺乳類細胞では増殖しない（Ｓｏｍｏｇｙｉら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９７、４３９〜４４頁）、アビポックスウイルス、例えば、鶏痘が挙げられる。 Concerns regarding the ability of vaccinia virus to replicate in mammalian cells have limited its clinical use and have sought safer alternatives. These include limited replication in human cells (Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, pp. 1159-67), attenuated vaccinia viruses such as modified vaccinia Ankara (MVA) (Meyer et al., 1991, J Gen Virol 72, 1031-8, Sutter and Moss, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89, 10847-51, Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-40), does not grow in mammalian cells (Somogyi et al. 1993, Virology 197, pages 439-44), avipox viruses such as fowlpox.

トリでは稀に致死性となる、増殖性皮膚病変を引き起こす野生型鶏痘ウイルスは、家畜産業では、商業上の懸念事項である。鶏痘ウイルスに対する弱毒生ワクチンが、トリ細胞でウイルスを複数回継代することによって得られている。家畜病原由来の抗原を発現するこのような弱毒鶏痘ウイルスが、トリに使用するための組換えワクチンとして広く利用されてきた（Ｂｏｙｌｅ及びＨｅｉｎｅ、１９９３、ＩｍｍｕｎｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ７１、３９１〜７頁、Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４９〜５３頁に概説されている）。実際、米国では、獣医学で使用するための、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原を発現する２種の組換え鶏痘ウイルスが市販されている（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４９〜５３頁）。 Wild fowlpox virus that causes proliferative skin lesions, which are rarely fatal in birds, is a commercial concern in the livestock industry. Live attenuated vaccines against fowlpox virus have been obtained by multiple passages of the virus in avian cells. Such attenuated fowlpox viruses expressing antigens derived from livestock pathogens have been widely used as recombinant vaccines for use in birds (Boyle and Heine, 1993, Immunol Cell Biol 71, 391-7, Paoletti 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, pages 11349-53). In fact, in the United States, two recombinant fowlpox viruses that express antigens from Newcastle disease virus for use in veterinary medicine are commercially available (Paoletti, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11349-53). page).

アビポックスウイルスは、哺乳類細胞において抗原を発現でき、哺乳類病原に対する保護的免疫応答を誘導できるという知見（Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ６、４６６〜８頁、Ｔａｙｌｏｒら、１９９８ａ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、５０４〜８、Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ｂ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、４９７〜５０３頁）から、哺乳類において使用するワクチンとして、組換え鶏痘ウイルスが開発されることとなった。最も重要なことに、ＨＩＶ由来抗原を発現する組換え鶏痘が、非ヒト霊長類においてワクチンとして効果を発揮している（Ｄａｌｅら、２０００、ＪＭｅｄＰｒｉｍａｔｏｌ２９、２４０〜７頁、Ｋｅｎｔら、１９８８、ＪＶｉｒｏｌ７２、１０１８０〜８頁、Ｋｅｎｔら、２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ１８、２２５０〜６頁）。さらに、腫瘍関連抗原をコードする組換え鶏痘ワクチンが、動物において評価されており（Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈら、２００１、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６１、４４９７〜５０５頁、Ｉｒｖｉｎｅら、１９９７、ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８９、１５９５〜６０１頁、Ｗａｎｇら、１９９５、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５４、４６８５〜９２頁）、現在ヒト臨床試験を受けている。 Findings that avipoxvirus can express antigens in mammalian cells and induce a protective immune response against mammalian pathogens (Taylor and Paoletti, 1998, Vaccine 6, 466-8, Taylor et al., 1998a, Vaccine 6, 504- 8, Taylor et al., 1988b, Vaccine 6, 497-503), a recombinant fowlpox virus was developed as a vaccine for use in mammals. Most importantly, recombinant fowlpox expressing an HIV-derived antigen has been effective as a vaccine in non-human primates (Dale et al., 2000, J Med Primatol 29, 240-7, Kent et al., 1988, J Virol 72, 10180-8, Kent et al., 2000, Vaccine 18, 2250-6). In addition, recombinant fowlpox vaccines encoding tumor-associated antigens have been evaluated in animals (Grosenbach et al., 2001, Cancer Res 61, 4497-505, Irvine et al., 1997, J Natl Cancer Inst 89, 1595-601). Page, Wang et al., 1995, J Immunol 154, 4685-92), currently undergoing human clinical trials.

大部分の弱毒鶏痘ワクチン株は、そのゲノム組成及び正確な配列の点では十分に定義されていない。実際、いくつかのゲノムは、最近、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）のプロウイルスの感染コピーを保持していることがわかり（Ｈｅｒｔｉｇら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５、３６７〜７６頁）、これによって組換えベクターとしてのその使用が制限されることもある。 Most attenuated fowlpox vaccine strains are not well defined in terms of their genomic composition and precise sequence. In fact, several genomes have recently been found to carry an infectious copy of the avian reticuloendotheliosis virus (REV) provirus (Hertig et al., 1997, Virology 235, pp. 367-76), thereby Its use as a recombinant vector may be limited.

ポックスウイルス由来ベクターのゲノムの大きさには上限がある。ワクシニアに関しては、効率的にパッケージングされ、送達され得る異種配列の最大の大きさは、ゲノムの大きさの１０％であると考えられている。 There is an upper limit to the size of the genome of a poxvirus-derived vector. For vaccinia, the largest size of heterologous sequences that can be efficiently packaged and delivered is believed to be 10% of the size of the genome.

したがって、哺乳類細胞において複製する能力を欠くが、より特性決定され、Ｔ細胞免疫応答の生起の点でより良好であり、異種ＤＮＡに適応し、送達する能力が改善され、且つ／又は既知の弱毒鶏痘ワクチン株よりも安全性が改善された、改良ベクター系が必要である。 Thus, it lacks the ability to replicate in mammalian cells, but is better characterized, better in terms of generating a T cell immune response, improved in its ability to adapt and deliver to heterologous DNA, and / or known attenuated There is a need for an improved vector system with improved safety over fowlpox vaccine strains.

ワクチン接種法
被験体において、疾病を予防及び／又は治療するために免疫応答を刺激するには、当技術分野で公知の多数の方法がある。ワクチンとして用いられる抗原性製剤の例を以下の表（表１）に示す。 Vaccination Methods There are numerous methods known in the art for stimulating an immune response in a subject to prevent and / or treat a disease. Examples of antigenic preparations used as vaccines are shown in the following table (Table 1).

その他の種類の抗原をベースとしない免疫化もあり、これには、受動的免疫化（抗体の直接投与）及び非特異的免疫化（サイトカイン又はサイトカイン阻害剤の投与によるなど）が挙げられる。 There are other types of immunizations that are not based on antigens, including passive immunization (direct administration of antibodies) and non-specific immunization (such as by administration of cytokines or cytokine inhibitors).

これらのアプローチの多くに関する問題は、免疫応答が経時的に弱くなり、その結果、例えば、感染を制御又は根絶するにはもはや有効でなくなることである。 The problem with many of these approaches is that the immune response becomes weaker over time, so that it is no longer effective, for example, in controlling or eradicating infection.

ワクチンが、疾病に対して正しい種類の免疫応答を誘導することが重要である。多数の既知のワクチンは、抗体を作製するのに有用であるが、大きな細胞媒介性免疫応答は誘導しない。いくつかの疾病は、Ｔ細胞免疫応答による予防及び／又は治療に対して特に感受性がある。例えば、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染から保護するか、それを排除するのに役立ち得る。また、結核、マラリア及びＨ．ピロリ（ｐｙｌｏｒｉ）感染などの疾病の場合には、ＩＦＮγを分泌し得るＣＤ４＋Ｔ細胞の保護的役割に関する証拠がある。 It is important that the vaccine induces the right type of immune response against the disease. A number of known vaccines are useful for generating antibodies, but do not induce a large cell-mediated immune response. Some diseases are particularly sensitive to prevention and / or treatment by T cell immune responses. For example, cytolytic CD8 + T cells can help protect against or eliminate viral infection. Tuberculosis, malaria and H. pneumoniae. In the case of diseases such as pylori infection, there is evidence for a protective role for CD4 + T cells that can secrete IFNγ.

既知のウイルスワクチン接種法では、いくつかの合併症及び副作用を伴うこともある。例えば、天然痘ワクチン接種は、汎発性痘疹、種痘性湿疹、進行性種痘疹並びに神経系及び心臓系の合併症を引き起こすことがある（Ｆｅｅｒｙ（１９７７）ＭｅｄＪ．Ａｕｓｔ６１８０〜１８３頁、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ５５３４２〜７頁）。 Known viral vaccination methods may involve several complications and side effects. For example, smallpox vaccination can cause generalized urticaria, vaginal eczema, progressive vaginal rash, and nervous and cardiac complications (Feery (1977) Med J. Aust 6 pages 180-183. Goldstein et al. (1975) Pediatrics 55 342-7).

したがって、改良ワクチン接種法、特に、最小の副作用しか引き起こさない、免疫系のＴ細胞部門を刺激又は追加免疫可能なものが必要である。 Accordingly, there is a need for improved vaccination methods, particularly those that can stimulate or boost the T cell division of the immune system, causing minimal side effects.

ＷＯ０２／０６８６５４WO02 / 068654 Ｍｏｓｓ、１９９１、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４１〜８頁Moss, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11341-8. Ｍｏｓｓ、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４１〜８頁Moss, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11341-8. Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９８、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７９、１１５９〜６７頁Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159-67. Ｍｅｙｅｒら、１９９１、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７２、１０３１〜８頁Meyer et al., 1991, J Gen Virol 72, 1031-8. Ｓｕｔｔｅｒ及びＭｏｓｓ、１９９２、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８９、１０８４７〜５１頁Sutter and Moss, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89, 10847-51. Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ１２、１０３２〜４０頁Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-40 Ｓｏｍｏｇｙｉら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９７、４３９〜４４頁Somogyi et al., 1993, Virology 197, pages 439-44. Ｂｏｙｌｅ及びＨｅｉｎｅ、１９９３、ＩｍｍｕｎｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ７１、３９１〜７頁Boyle and Heine, 1993, Immunol Cell Biol 71, pages 391-7 Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９３、１１３４９〜５３頁Pauletti, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, 11349-53. Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ６、４６６〜８頁Taylor and Paoletti, 1998, Vaccine 6, 466-8. Ｔａｙｌｏｒら、１９９８ａ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、５０４〜８頁Taylor et al., 1998a, Vaccine 6, pages 504-8. Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ｂ、Ｖａｃｃｉｎｅ６、４９７〜５０３頁Taylor et al., 1988b, Vaccine 6, 497-503. Ｄａｌｅら、２０００、ＪＭｅｄＰｒｉｍａｔｏｌ２９、２４０〜７頁Dale et al., 2000, J Med Primatol 29, 240-7 Ｋｅｎｔら、１９８８、ＪＶｉｒｏｌ７２、１０１８０〜８頁Kent et al., 1988, J Virol 72, 10180-8. Ｋｅｎｔら、２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ１８、２２５０〜６頁Kent et al., 2000, Vaccine 18, 2250-6 Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈら、２００１、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ６１、４４９７〜５０５頁Grosenbach et al., 2001, Cancer Res 61, 4497-505. Ｉｒｖｉｎｅら、１９９７、ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ８９、１５９５〜６０１頁Irvine et al., 1997, J Natl Cancer Inst 89, pages 1595-601. Ｗａｎｇら、１９９５、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５４、４６８５〜９２頁Wang et al., 1995, J Immunol 154, 4685-92. Ｈｅｒｔｉｇら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５、３６７〜７６頁Hertig et al., 1997, Virology 235, pp. 367-76. Ｆｅｅｒｙ（１９７７）ＭｅｄＪ．Ａｕｓｔ６１８０〜１８３頁Feery (1977) Med J. et al. Aust 6 pages 180-183 Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ５５３４２〜７頁Goldstein et al. (1975) Pediatrics 55 342-7. Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７９１５９〜１６７頁Coupar et al. (1990) Virology 179 159-167. Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４３８１５〜３８３１頁Afonso et al. (2000) J. MoI. Virol 74 3815-3831 pages Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ４（４）３９７〜４０２頁Schneider et al. (1998) Nature Medicine 4 (4) pages 397-402. Ｋｅｎｔら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ７２（１２）１０１８０〜８頁Kent et al. (1998) J. MoI. Gen. Virol 72 (12) 10180-8 pages Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ５（５）：５２６〜５３４頁Robinson et al. (1999) Nature Medicine 5 (5): 526-534. Ｋｅｓｔｌｅｒら１９９９ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ１０（１０）；１６１９〜３２頁Kestler et al. 1999 Human Gene Ther 10 (10); 1619-32 Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ編：ＪＭＣｏｆｆｉｎ、ＳＭＨｕｇｈｅｓ、ＨＥＶａｒｍｕｓ７５８〜７６３頁Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press edition: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus 758-763. Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）ＶｉｒｕｓＴａｘｏｎｏｍｙＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ７９〜８７頁Murphy et al. (1995) Virus Taxonomic Springer Verlag, Vienna 79-87. Ｂｏｙｌｅら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：７３７〜７４８頁Boyle et al. (1997) Arch. Virol. 142: 737-748 Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８）３８１５〜３８３１頁Afonso et al. (2000) J. MoI. Gen. Virol. 74 (8) 3815-3831 Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387. Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ｉｂｉｄ−第１８章Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18 Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０頁Atschul et al., 1990, J. MoI. Mol. . Biol. 403-410 Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ｉｂｉｄ、７−５８〜７−６０頁Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60. ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７４（２）：２４７〜５０頁FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50 ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７７（１）：１８７〜８頁FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 ｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖtatiana @ ncbi. nlm. nih. gov Ｐｏｌｌｉｔｔら（１９９８）１７：５〜９頁Pollitt et al. (1998) 17: 5-9. Ｌａｉｄｌａｗら１９９８ＪＶｉｒｏｌ７２６７４２頁Laidlaw et al. 1998 J Virol 72 6742 ＫａｔａｋｕｒａＹら（１９９８）ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．５７：６９〜９１頁Katakura Y et al. (1998) Methods Cell Biol. 57: 69-91 「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ編ＪＭＣｏｆｆｉｎ、ＳＭＨｕｇｈｅｓ、ＨＥＶａｒｍｕｓ４４４頁"Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, page 444) ＤａｒｊｉＡら１９９７Ｃｅｌｌ９１：７６５〜７７５頁Darji A et al. 1997 Cell 91: 765-775. ＳｔｏｕｔｅＪＡら１９９７ＮＥｎｇｌＪＭｅｄｉｃｉｎｅ２２６：８６９１頁Route JA et al. 1997 N Engl J Medicine 226: 8691 Ｍａｙｒ及びＭａｌｉｃｋｉ（１９６６）ＺｅｎｔｒａｌｂｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ１３１〜３頁Mayr and Malicki (1966) Zentralbl Veterinarmed 13 1-3. Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ａ、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７１、６２１〜８頁Boursnell et al., 1990a, J Gen Virol 71, 621-8. Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ｂ、ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２３、３０５〜１６頁Boursnell et al., 1990b, Vet Microbiol 23, pages 305-16. Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８９、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７０、１４５〜５４頁Campbell et al., 1989, J Gen Virol 70, pages 145-54. Ｑｕｉｎｇｚｈｏｎｇら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ１２、５６９〜７３頁Quingzhong et al., 1994, Vaccine 12, pp. 569-73. Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら、１９９８、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２８、４３４５〜５５頁Plebanski et al., 1998, Eur J Immunol 28, 4345-55. Ｒｏｂｓｏｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３５、７９〜８２頁Robson et al., 1988, Nature 335, 79-82. Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９７ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５、１２８０〜４頁Gilbert et al., 1997 Nat Biotechnol 15, pages 1280-4. Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中Gilbert et al., Vaccine, printing 非公開の知見、ＥｒｉｃＧ．ＳｈｅｕUndisclosed knowledge, Eric G. Sheu Ｂｒｏｏｋｓら、２００１ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６９、２７１４〜７頁Brooks et al., 2001 Infect Immuno 69, pages 2714-7. Ｔａｎｇｈｅら、２００１ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６９、３０４１〜７頁Tanghe et al., 2001 Infect Immuno 69, pages 3041-7. Ａｆｏｎｓｏら、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３８１５〜３８３１頁Afonso et al. (2000) J. MoI. Virol. 74: 3815-3831

本発明者らは、弱毒鶏痘ウイルス株（ＦＰ９）の全ゲノム配列を得た。 The inventors obtained the entire genome sequence of the attenuated fowlpox virus strain (FP9).

ＦＰ９は、野生型鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）に存在するいくつかの遺伝子を欠く（又はこれらに改変を有する）。ＦＰ９のゲノムは２６６ｋｂｐであり、これまでにベクター系として記載されているＦＰＶ−Ｍ、鶏痘ワクチン株のゲノムよりも小さい（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７９１５９〜１６７頁）。本発明者らは、ＦＰ９は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生起するその能力がＦＰＶ−Ｍよりも優れていることを示した。 FP9 lacks (or has modifications to) some genes present in wild-type fowlpox virus (FPV). The genome of FP9 is 266 kbp, which is smaller than the genome of FPV-M, a fowlpox vaccine strain previously described as a vector system (Coupar et al. (1990) Virology 179 159-167). The inventors have shown that FP9 is superior to FPV-M in its ability to generate a CD8 + T cell immune response.

したがって、本発明は、１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４３８１５〜３８３１頁による遺伝子命名法）の改変型を含む弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７／０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。 Accordingly, the present invention provides an attenuated fowlpox virus genome comprising a modified form of one or more of the following wild type FPV genes (gene nomenclature according to Afonso et al. (2000) J. Virol 74 3815-3831):
FPV001, FPV018, FPV054, FPV063, FPV066, FPV070, FPV071, FPV093, FPV097 / 098, FPV115, FPV124, FPV125, FPV127, FPV158, FPV159, FPV160, FPV190, FPV191, FPV207, PV2219 FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260.

本発明はまた、１種又は複数の前記遺伝子を改変することを含む、鶏痘を弱毒化する方法を提供する。前記遺伝子は、以下に、より詳細に記載されたように改変されることが好ましい。 The present invention also provides a method for attenuating fowlpox, comprising modifying one or more of said genes. The gene is preferably modified as described in more detail below.

本発明はまた、大きさが２７５ｋｂｐ未満である弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する。ウイルスによって効率的にパッケージングされ得るゲノムの全長には上限がある。ゲノム自身が小さい場合には、より多量の異種配列を保持できる。 The present invention also provides an attenuated fowlpox virus genome that is less than 275 kbp in size. There is an upper limit to the total length of the genome that can be efficiently packaged by the virus. If the genome itself is small, it can hold a larger amount of heterologous sequences.

好ましい一実施形態では、弱毒鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号１に示された配列を含む。 In a preferred embodiment, the attenuated fowlpox virus genome comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

本発明の弱毒鶏痘ゲノムはまた、目的とするヌクレオチド「ＮＯＩ」を含む。「ＮＯＩ」は治療用遺伝子であり得る。 The attenuated fowlpox genome of the present invention also contains the nucleotide of interest “NOI”. “NOI” may be a therapeutic gene.

本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子を提供する。ゲノムがＮＯＩを含む場合には、ウイルス粒子がＮＯＩを標的細胞へ送達できることが好ましい。あるいは（又は、さらに）、ウイルス粒子は予め発現されたタンパク質を標的細胞へ到達可能なものであり得る。 The invention also provides a viral particle comprising such a genome. If the genome contains NOI, it is preferred that the viral particle can deliver NOI to the target cells. Alternatively (or additionally), the viral particle may be capable of reaching a target cell with a pre-expressed protein.

本発明はまた、かかるゲノム又はウイルス粒子を含むワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤を提供する。 The invention also provides a vaccine, priming or boosting agent comprising such genomic or viral particles.

本発明はまた、非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。好ましい一実施形態では、組成物は、霊長類において、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧによって初回免疫刺激された免疫応答を追加免疫可能である。 The invention also provides a booster composition comprising a non-replicating viral vector. In a preferred embodiment, the composition is capable of boosting an immune response in a primate that has been primed with M. bovis BCG.

ワクチン接種（及び治療）目的では、免疫応答の発生時には、ワクチンの単回投与よりも複数回投与法がより効果的であることが多い。プライム−ブーストレジメンは同種（同一組成物を２回又は複数回投与する場合）であっても異種であってもよい。 For vaccination (and treatment) purposes, multiple dose regimens are often more effective than a single dose of vaccine when an immune response occurs. The prime-boost regimen may be the same (when the same composition is administered twice or multiple times) or heterogeneous.

本発明はまた、
（ｉ）ＦＰ９鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物
とを含むワクチンキットを提供する。 The present invention also provides
(I) a first composition comprising FP9 fowlpox virus particles;
(Ii) providing a vaccine kit comprising a second composition for simultaneous, separate or sequential administration.

初回抗原刺激剤又は追加免疫剤のいずれかがＤＮＡワクチンである異種ワクチン接種レジメンにおけるウイルスベクターの使用は、これまでに認められている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ４（４）３９７〜４０２頁、Ｋｅｎｔら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ７２（１２）１０１８０〜８頁、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ５（５）：５２６〜５３４頁）。 The use of viral vectors in heterologous vaccination regimens where either the prime or booster is a DNA vaccine has been previously recognized (Schneider et al. (1998) Nature Medicine 4 (4) pages 397-402. Kent et al. (1998) J. Gen. Virol 72 (12) 10180-8, Robinson et al. (1999) Nature Medicine 5 (5): 526-534).

しかし、本発明者らは、まず、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライムブーストレジメンが、霊長類におけるＴ細胞免疫応答の誘導で驚くべきほどに効果的であることを示した。非複製ベクターの使用により、ウイルスの複製に付随して起こる副作用（天然痘など、前記参照）が避けられる。 However, the inventors first showed that a heterologous prime boost regimen using two different non-replicating viral vectors was surprisingly effective in inducing a T cell immune response in primates. The use of non-replicating vectors avoids side effects (such as smallpox, see above) that accompany viral replication.

したがって、本発明はまた、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、ワクチン接種キットを提供する。 Accordingly, the present invention also provides (i) a first composition comprising a first non-replicating viral vector for sequential administration in any order;
(Ii) providing a vaccination kit comprising a second composition comprising a second non-replicating viral vector.

好ましい一実施形態では、ワクチン接種キットは、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む。 In a preferred embodiment, the vaccination kit comprises (i) a first composition comprising a first non-replicating poxvirus vector for sequential administration in any order;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating poxvirus vector.

このキットは、疾病を治療及び／又は予防するための霊長類被験体への投与に適したものであり得る。 The kit may be suitable for administration to a primate subject for treating and / or preventing a disease.

本発明のキットでは、第１及び第２の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。 In the kit of the present invention, the first and second compositions are preferably capable of expressing the same antigen.

本発明はまた、被験体にかかるワクチン、初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又はキットを投与するステップを含むワクチン接種法を提供する。かかる投与は被験体においてＴ細胞免疫応答を生起するはずである。 The present invention also provides a vaccination method comprising administering to a subject a vaccine, priming or boosting composition or kit. Such administration should generate a T cell immune response in the subject.

ワクチン接種法は、例えば、慢性感染によって、又はそのために起きた疾病、例えば、ＨＩＶ、マラリア、結核及び東海岸熱を治療又は予防するために使用できる。 Vaccination methods can be used, for example, to treat or prevent diseases caused by or due to chronic infection, such as HIV, malaria, tuberculosis and East Coast fever.

本発明の１種又は複数のゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤／組成物、追加免疫剤／組成物、構築物又はキットは、ＨＩＶに関係しているか、又は少なくとも一部はＨＩＶ由来のものであり、したがって、前記ゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤／組成物、追加免疫剤／組成物、構築物又はキットは、ＷＯ０２／０６８６５４（ＰＣＴ／ＣＵ０２／００００１に相当する）に開示されたものではない。詳しくは、本発明は、ＷＯ０２／０６８６５４の実施例１などのＷＯ０２／０６８６５４に記載されたような組換えＣＲ３遺伝子を含まない。 One or more genomes, viral particles, vaccines, priming agents / compositions, boosters / compositions, constructs or kits of the invention are related to HIV or at least partially derived from HIV Therefore, the genome, virus particle, vaccine, priming agent / composition, booster agent / composition, construct or kit is disclosed in WO 02/068654 (corresponding to PCT / CU02 / 00001) Not a thing. Specifically, the present invention does not include a recombinant CR3 gene as described in WO 02/068654, such as Example 1 of WO 02/068654.

ウイルス及びウイルスベクター
本発明は、非複製ウイルスベクターを用いるワクチン接種レジメンに関する。 The present invention relates to vaccination regimens using non-replicating viral vectors.

当技術分野では、標的細胞の感染を介してＮＯＩを送達できる多数のウイルスベクターが知られている。適した組換えウイルスベクターとしては、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又はパルボウイルスベクターが挙げられる（Ｋｅｓｔｌｅｒら１９９９ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ１０（１０）：１６１９〜３２頁）。 Numerous viral vectors are known in the art that can deliver NOI through infection of target cells. Suitable recombinant viral vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, herpes virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, baculovirus vectors, poxvirus vectors or parvovirus vectors. (Kestler et al. 1999 Human Gene Ther 10 (10): 1619-32).

レトロウイルスの例としては、それだけには限らないが、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリミエロサイトマトシス（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ）ウイルス２９（ＭＣ２９）及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。 Examples of retroviruses include, but are not limited to, mouse leukemia virus (MLV), human immunodeficiency virus (HIV), equine infectious anemia virus (EIAV), mouse mammary tumor virus (MMTV), rous sarcoma virus (RSV) Fujinami sarcoma virus (FuSV), Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV), FBR murine osteosarcoma virus (FBR MSV), Moloney murine sarcoma virus (Mo-MSV), Abelson murine leukemia virus (A-MLV) And myelocytomatosis virus 29 (MC29) and avian erythroblastosis virus (AEV).

レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ編：ＪＭＣｏｆｆｉｎ、ＳＭＨｕｇｈｅｓ、ＨＥＶａｒｍｕｓ７５８〜７６３頁）に見ることができる。 A detailed list of retroviruses can be found in Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press edited by JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus 758-763).

ポックスウイルス
好ましい一実施形態では、本発明は、非複製ポックスウイルスベクターを含むワクチン、初回抗原刺激又は追加免疫組成物を提供する。 In one preferred embodiment, the present invention provides a vaccine, priming or booster composition comprising a non-replicating poxvirus vector.

ポックスウイルスファミリーは２つのサブファミリー、すなわちコードポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）とエントモポックスウイルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎｉａｅ）に分けられる。コードポックスウイルス亜科（脊椎動物のポックスウイルス）としては、オルトポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、パラポックスウイルス（ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、カリポックスウイルス（ｃａｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、レポリポックスウイルス（ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、スイポックスウイルス（ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、モラシポックスウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）及びヤタポックスウイルス（ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）が挙げられる。ポックスウイルス、その構造及び組成、生物学的特性及び抗原性についての総説は、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）ＶｉｒｕｓＴａｘｏｎｏｍｙＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ７９〜８７頁に示されている。以下の表（表２）は、ポックスウイルスファミリーの各属内の種のいくつかの例を示す。 The poxvirus family is divided into two subfamilies, the Codepoxvirinae and the Entomopoxvirinae. Codepoxviridae (vertebrate poxviruses) include orthopoxviruses, parapoxviruses, avipoxviruses, calipoxviruses, repoliporus virus p , Suipoxviruses, molluspoxviruses and yatapoxviruses. A review of poxviruses, their structure and composition, biological properties and antigenicity is given in Murphy et al. (1995) Virus Taxonomic Springer Verlag, Vienna 79-87. The following table (Table 2) shows some examples of species within each genus of the poxvirus family.

本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含むワクチン接種キットを提供する。 The invention comprises: (i) a first composition comprising a first non-replicating viral vector for sequential administration in any order;
(Ii) a vaccination kit comprising a second composition comprising a second non-replicating viral vector.

第１及び／又は第２のウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであり得る。 The first and / or second viral vector can be a poxvirus vector.

好ましい一実施形態では、本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
を含む、ワクチン接種キットを提供する。 In a preferred embodiment, the present invention provides (i) a first composition comprising a first non-replicating poxvirus vector for sequential administration in any order;
(Ii) providing a vaccination kit comprising a second composition comprising a second non-replicating poxvirus vector;

組成物の一方が、最初に投与される「初回抗原刺激」組成物として作用し、もう一方の組成物が、適当な時間間隔（３週間など）後に投与される「追加免疫」組成物として作用し得る。 One of the compositions acts as the “priming” composition administered first, and the other as the “boost” composition administered after an appropriate time interval (eg, 3 weeks). Can do.

第１及び第２の非複製ウイルスベクターは、有意な交差反応が起こらないほど十分に異なっているべきである。 The first and second non-replicating viral vectors should be sufficiently different so that no significant cross-reaction occurs.

２種のウイルスベクターは、異なるファミリーに属するウイルス、例えば、ポックスウイルスベクターとアデノウイルスベクター由来のものであってもよい。あるいは、２種のウイルスベクターは、同一ファミリー（ポックスウイルスなど）に属するが、異なる属（ｇｅｎｉ）であるウイルス由来のものであってもよい。例えば、第１の非複製ポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第２の非複製ポックスウイルスベクターがオルトポックウイルスベクターであってもよい。 The two viral vectors may be derived from viruses belonging to different families, such as poxvirus vectors and adenovirus vectors. Alternatively, the two types of viral vectors may be derived from viruses belonging to the same family (such as poxvirus) but different genies. For example, the first non-replicating pox virus vector may be an avipox virus vector and the second non-replicating pox virus vector may be an orthopoc virus vector.

２種の非複製ウイルスベクターは、種が十分に異なっていれば、同一属内の異なる種由来のものでさえあってもよい。 Two non-replicating viral vectors may even be from different species within the same genus, provided that the species are sufficiently different.

各ポックスウイルス属の際立った特徴は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５前記）参照。 The distinguishing features of each poxvirus genus are known in the art, see, for example, Murphy et al. (1995 supra).

好ましい一実施形態では、２種の非複製ポックスウイルスベクターのうち一方は鶏痘ウイルスベクター（すなわち、鶏痘（ｆｏｗｌ−ｐｏｘ）由来のもの）である。例えば、鶏痘ウイルスベクターは、本発明のゲノムを含み得る。 In a preferred embodiment, one of the two non-replicating poxvirus vectors is a fowlpox virus vector (ie, derived from a fowl-pox). For example, a fowlpox virus vector can comprise the genome of the present invention.

非複製性
本発明に用いるウイルスベクターは、被験体の細胞において（例えば、ヒト細胞において）非複製性でなければならない。本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、正常な被験体の細胞の大部分において十分な程度までは複製できないことを意味する。非複製性であるか又は複製障害のあるウイルスは、自然にそのようになった場合もあり（すなわち、天然からそのようなものとして単離することができる）、又は人工的に、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでの育種によって、又は遺伝子操作、例えば、複製にとって重要な遺伝子の欠失によってそのようになった場合もある。一般に、このようなウイルスが増殖できる、１種又は少数の細胞種がある、例えば、ＣＥＦ細胞である。 Non-replicating The viral vector used in the present invention must be non-replicating in the subject's cells (eg, in human cells). As used herein, the term “non-replicating” or “replication disorder” means that the majority of cells in a normal subject cannot replicate to a sufficient extent. A non-replicating or replication-impaired virus may have become so naturally (ie, can be isolated as such from nature) or artificially, eg, in This may have been the case by in vitro breeding or by genetic manipulation, eg deletion of genes important for replication. In general, there are one or a few cell types in which such viruses can grow, for example CEF cells.

一般に、ウイルスの複製は２つの方法で測定する：１）ＤＮＡ合成及び２）ウイルス力価。より正確には、本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、ポックスウイルスに適用する場合には、以下の基準のいずれか又は双方を満たすウイルスを意味する：
１）ＭＲＣ−５細胞（ヒト細胞株）において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株と比較して、ＤＮＡ合成の１ｌｏｇ（１０倍）減少を示す、
２）ＨＥＬＡ細胞（ヒト細胞株）において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較して、ウイルス力価の２ｌｏｇ減少を示す。 In general, virus replication is measured in two ways: 1) DNA synthesis and 2) virus titer. More precisely, the term “non-replicating” or “replication failure” as used herein means a virus that, when applied to a poxvirus, meets one or both of the following criteria:
1) shows 1 log (10-fold) reduction in DNA synthesis in MRC-5 cells (human cell line) compared to the Copenhagen strain of vaccinia virus,
2) In HELA cells (human cell line), it shows a 2 log reduction in virus titer compared to the Copenhagen strain of vaccinia virus.

鶏痘ウイルス
前記のように、野生型鶏痘ウイルスは、トリでは増殖性皮膚病変を引き起こす。家畜感染部から集めたかさぶた材料からＦＰＶの屋外単離物を得ることができる（Ｂｏｙｌｅら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：７３７〜７４８頁）。病原性鶏痘ウイルスのゲノム配列は入手可能である（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８）３８１５〜３８３１頁）。 Fowlpox virus As mentioned above, wild-type fowlpox virus causes proliferative skin lesions in birds. FPV outdoor isolates can be obtained from scab material collected from livestock infection sites (Boyle et al. (1997) Arch. Virol. 142: 737-748). The genomic sequence of pathogenic fowlpox virus is available (Afonso et al. (2000) J. Gen. Virol. 74 (8) 3815-3831).

弱毒生ウイルス株は、トリ細胞においてウイルスを複数回継代することによって得ることができる。Ｃｙａｎａｍｉｄ−ＷｅｂｓｔｅｒｓＰｔＹ、ＬｔｄＡｕｓｔｒａｌｉａから入手可能な、ＦＰＶＭ（穏やかなワクチン株）及びＦＰＶＳ（標準ワクチン株）など、鶏痘ウイルスの種々の弱毒ウイルス株が知られている。 Live attenuated virus strains can be obtained by multiple passages of the virus in avian cells. Various attenuated virus strains of fowlpox virus are known, such as FPV M (mild vaccine strain) and FPV S (standard vaccine strain) available from Cyanamid-Websters PtY, LtdAustralia.

ポックスウイルスは、宿主免疫応答から逃れるための進化した戦略を持っており、これには腫瘍壊死因子、ＩＬ−Ｉｐ、インターフェロン（ＩＦＮ）−ｏｃ／及びＩＦＮ−γの可溶性受容体として機能する分泌タンパク質の産生が含まれており、これらは、通常、細胞性サイトカイン受容体（ケモカイン受容体など）の細胞外ドメインと同様の配列を有する。これらのウイルス受容体は、一般に、適切な宿主免疫応答を阻害又は妨害し、その存在は病原性の増加を伴う。 Poxviruses have an evolved strategy to escape the host immune response, including secreted proteins that function as soluble receptors for tumor necrosis factor, IL-Ip, interferon (IFN) -oc /, and IFN-γ Which usually have a sequence similar to the extracellular domain of a cellular cytokine receptor (such as a chemokine receptor). These viral receptors generally inhibit or interfere with the appropriate host immune response, the presence of which is accompanied by increased pathogenicity.

ＦＰＶ遺伝子
鶏痘ウイルスのゲノムは、共有結合された末端ヘアピンを含む単一の二本鎖ＤＮＡ分子からなる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位についての基本情報は入手可能である（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）前記）。 FPV gene The fowlpox virus genome consists of a single double-stranded DNA molecule containing covalently linked terminal hairpins. Basic information about restriction endonuclease cleavage sites is available (Coupar et al. (1990) supra).

米国農務省スタンダードチャレンジ（ＳｔａｎｄａｒｄＣｈａｌｌｅｎｇｅ）（病原性）鶏痘株のゲノムは、配列決定されており、本明細書ではこの株に用いた命名法に従っている（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４３８１５〜３８３１頁）。この総説にはまた、この鶏痘株の２６０のＯＲＦ（表１）が、その推定構造及び／又は機能及びアクセッション番号とともに列挙されている。 The genome of the US Department of Agriculture Standard Challenge (pathogenic) fowlpox strain has been sequenced and follows the nomenclature used for this strain (Afonso et al. (2000) J. Virol. 74). 3815-3831). This review also lists the 260 ORFs (Table 1) of this fowlpox strain, along with its putative structure and / or function and accession number.

本発明者らは、ＦＰ９（ＨＰ１）の病原性前駆体を、ＦＰ９の配列がこの配列と異なっているすべての位置で配列決定した。この方法により、系統変動に起因する相違及び組織培養継代、適応の間に許容したもの、及び付随する弱毒化が示される。ＦＰ１中の、ＣＥＦ組織培養での継代の間に、ＨＰ１から改変された遺伝子を図２に示す。 We sequenced the pathogenic precursor of FP9 (HP1) at all positions where the sequence of FP9 differs from this sequence. This method shows differences due to lineage variation and tissue culture passages, tolerated during adaptation, and concomitant attenuation. The genes modified from HP1 during passage in CEF tissue culture in FP1 are shown in FIG.

本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、１種又は複数の以下の野生型遺伝子に改変を含み得る：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７／０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。 The fowlpox virus genome of the present invention may include modifications to one or more of the following wild type genes:
FPV001, FPV018, FPV054, FPV063, FPV066, FPV070, FPV071, FPV093, FPV097 / 098, FPV115, FPV124, FPV125, FPV127, FPV158, FPV159, FPV160, FPV190, FPV191, FPV207, PV2219 FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260.

用語「改変」とは、野生型配列からの変化（欠失、置換又は付加など）を意味するものとする。 The term “modification” is intended to mean a change (deletion, substitution or addition, etc.) from the wild type sequence.

遺伝子がタンパク質をコードする場合には、改変された遺伝子配列は、異なるアミノ酸配列のタンパク質をコードし得る。例えば、このアミノ酸配列は、野生型配列と比較すると、１個又は複数個のアミノ酸欠失、付加又は置換を含み得る。 If the gene encodes a protein, the modified gene sequence may encode a protein with a different amino acid sequence. For example, the amino acid sequence can include one or more amino acid deletions, additions or substitutions compared to the wild type sequence.

好ましい一実施形態では、本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に非保存的アミノ酸置換をもたらす改変を含む：
ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７。 In a preferred embodiment, the fowlpox virus genome of the invention comprises modifications that result in non-conservative amino acid substitutions in one or more of the following genes:
FPV018, FPV063, FPV066, FPV093, FPV127, FPV191, FPV207.

あるいは（又は、さらに）、本ゲノムは、１種又は複数の野生型遺伝子にかなりの改変を含み得る。用語「かなりの改変」とは、遺伝子がもはや野生型遺伝子としては機能しないような方法で改変されていることを意味するものとする。例えば、野生型遺伝子がタンパク質をコードする場合には、かなり改変された遺伝子はタンパク質をコードすることができないこともあり、又は野生型タンパク質としては機能することができないタンパク質又は野生型タンパク質として機能する能力が大幅に低下したタンパク質をコードすることもある。 Alternatively (or in addition) the genome may contain significant modifications in one or more wild type genes. The term “substantial modification” is intended to mean that the gene has been modified in such a way that it no longer functions as a wild-type gene. For example, if a wild-type gene encodes a protein, a highly modified gene may not be able to encode the protein, or may not function as a wild-type protein or function as a wild-type protein It may also encode proteins that have a greatly reduced ability.

この改変は欠失であり得る。例えば、全遺伝子が欠失されている場合もある。あるいは、改変遺伝子が、その遺伝子の機能をなくすか又は大幅に低下させるのに十分な１種又は複数の部分欠失を含む場合もある。 This modification can be a deletion. For example, the entire gene may be deleted. Alternatively, the modified gene may contain one or more partial deletions sufficient to eliminate or greatly reduce the function of the gene.

あるいは、この改変は置換又は付加であり得る。例えば、組換え事象が起こり、ゲノムのどこかの配列部分が遺伝子に組み込まれる（場合によっては、野生型配列がそれに対応して喪失する）よう働く場合もある。 Alternatively, the modification can be a substitution or addition. For example, a recombination event may occur and work to cause some sequence portion of the genome to be integrated into the gene (in some cases, the wild-type sequence is correspondingly lost).

部分欠失、置換又は付加は、「フレームシフト」突然変異を引き起こし、その結果、下流配列の不適当な読み取りをもたらすことがある。あるいは（又は、さらに）、突然変異が停止コドンの生成をもたらし（「終結突然変異」）、その結果、下流配列が無視される場合もある。 Partial deletions, substitutions or additions can cause “frameshift” mutations, resulting in inappropriate reading of downstream sequences. Alternatively (or in addition), the mutation may result in the generation of a stop codon (a “termination mutation”) so that downstream sequences are ignored.

突然変異が、停止コドンの除去をもたらし、その結果、２つの遺伝子が融合されることとなりキメラ遺伝子を形成することもある。 Mutations can result in removal of stop codons, resulting in the fusion of two genes and the formation of a chimeric gene.

好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２。 In a preferred embodiment, the genome comprises partial deletions in one or more of the following genes:
FPV158, FPV219, FPV222.

もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子を完全に欠いている：
ＦＰＶＯＯ１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。 In another preferred embodiment, the genome is completely devoid of one or more of the following genes:
FPVOO1, FPV124, FPV125, FPV159, FPV160, FPV220, FPV221, FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260.

もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７。 In another preferred embodiment, the genome comprises a frameshift mutation in one or more of the following genes:
FPV054, FPV070, FPV071, FPV115, FPV190, FPV207.

もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９。 In another preferred embodiment, the genome comprises termination mutations in one or more of the following genes:
FPV071, FPV239.

もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、遺伝子ＦＰＶ０９７とＦＰＶ０９８の融合に（欠失に）起因するキメラ遺伝子を含む。 In another preferred embodiment, the genome comprises a chimeric gene resulting from (by deletion) a fusion of the genes FPV097 and FPV098.

ゲノムの大きさ
ＦＰＶ−Ｍのゲノムは、３０８ｋｂの領域であると推定されている（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）前記）。ウイルスゲノムが小さいほど、多くの異種ＤＮＡを含むことができる。 Genomic size The genome of FPV-M is estimated to be a 308 kb region (Coupar et al. (1990) supra). The smaller the viral genome, the more heterologous DNA can be included.

本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、大きさが２７５ｋｂ未満であることが好ましい。本ゲノムは約２６６ｋｂｐであることがより好ましい。ゲノムの大きさは、異種配列（例えば、「目的とするヌクレオチド」（ＮＯＩ）以下参照）を含まずに考慮される。鶏痘ウイルスをベクター系として使用するために、相同組換えによって、送達する異種配列を鶏痘ゲノムに組み込むことができる。大きさ決定の目的上、かかる組換え事象の前にゲノムの大きさを考慮する。 The fowlpox virus genome of the present invention preferably has a size of less than 275 kb. More preferably, the genome is about 266 kbp. The size of the genome is taken into account without including heterologous sequences (see, eg, “nucleotide of interest” (NOI) below). In order to use fowlpox virus as a vector system, the heterologous sequence to be delivered can be integrated into the fowlpox genome by homologous recombination. For sizing purposes, consider the size of the genome before such recombination events.

請求項１に記載の鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号１に示された配列を含むことが好ましい。この「配列」は、鶏痘ゲノムが全体として、ベクター系として作用し得る（すなわち、相同組換えによって異種遺伝子を受けとり、ウイルス粒子に組み込まれると、異種遺伝子を標的細胞に送達する）限りは、この配列の相同体を包含するものとする。 The fowlpox virus genome according to claim 1 preferably includes the sequence shown in SEQ ID NO: 1. This “sequence” is as long as the fowlpox genome can act as a vector system as a whole (ie, accepting a heterologous gene by homologous recombination and delivering the heterologous gene to the target cell when incorporated into a viral particle). It is intended to include homologues of this sequence.

相同体
本明細書において用語「相同体」とは、配列番号１に示された配列と、ある程度の相同性を有する核酸配列を意味する。本明細書において用語「相同性」とは、「同一性」と同等と見なすことができる。 Homologue As used herein, the term “homologue” means a nucleic acid sequence having a certain degree of homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 1. As used herein, the term “homology” can be considered equivalent to “identity”.

これに関連して、相同配列は、主題配列と、少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは、少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むととられる。一般に、相同体は、コードされたタンパク質の機能的部分（活性部位など）をコードする配列を含み、これは主題配列と同一であるが、他の領域では異なり得る。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）という用語でも考えることができるが、本発明の範囲では、配列同一性という用語で相同性を表現することが好ましい。 In this context, homologous sequences are taken to include nucleotide sequences that may be at least 75, 85 or 90% identical, preferably at least 95 or 98% identical to the subject sequence. In general, a homologue includes a sequence that encodes a functional portion (such as an active site) of the encoded protein, which is identical to the subject sequence, but may be different in other regions. Homology can also be considered in terms of similarity (ie, amino acid residues having similar chemical properties / functional groups), but within the scope of the present invention, homology can be expressed in terms of sequence identity. preferable.

相同性比較は、目測で、より通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ又は複数の配列間の相同性％を計算することができる。 Homology comparison can be performed by visual measurement and more usually using readily available sequence comparison programs. These commercially available computer programs can calculate% homology between two or more sequences.

相同性％は、連続配列にわたって計算することができる、すなわち、一方の配列をもう一方の配列とアラインし、一方の配列中の各塩基を、一残基ずつ、もう一方の配列中の対応する塩基と直接比較する。これは「ギャップを入れない」アラインメントと呼ばれている。通常、このようなギャップを入れないアラインメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ実施する。 % Homology can be calculated over a contiguous sequence, i.e., one sequence is aligned with the other sequence and each base in one sequence is matched by one residue in the other sequence. Compare directly with base. This is called a “no gap” alignment. Usually, such non-gapped alignments are performed only over a relatively short number of residues.

これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、別の同一の配列対において、ある挿入又は欠失が、続く核酸残基をアラインメントから外させ、そのために、全アラインメントを実施する場合に、相同性％の大きな低下をもたらす可能性を考慮できない。このために、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体には過度のペナルティーを科さずに、可能性ある挿入及び欠失を考慮する最適アラインメントが得られるように設計されている。これは、局所相同性を最大にしようとして、配列アラインメントに「ギャップ（ｇａｐｓ）」を挿入することによって達成される。 This is a very simple and consistent method, but, for example, in another identical sequence pair, if an insertion or deletion causes a subsequent nucleic acid residue to be removed from the alignment, thus performing a full alignment. The possibility of a large reduction in% homology cannot be considered. For this reason, most sequence comparison methods are designed to provide an optimal alignment that takes into account possible insertions and deletions without penalizing the overall homology score. This is accomplished by inserting “gaps” in the sequence alignment in an attempt to maximize local homology.

しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー（ｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当て、その結果、同数の同一塩基に対して、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する、できるだけ少ないギャップを含む配列アラインメントが、多数のギャップを含むものよりも高いスコアを達成する。通常、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ中の各後続残基に対してはより小さなペナルティーを課す、「アファインギャップコスト」を用いる。これが、最も普通に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーによって、当然、より少ないギャップを含む最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを改変することができる。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを用いる場合にはデフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合には、核酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、各伸長に対しては−４である。 However, these more complex methods assign a “gap penalty” to each gap that occurs during the alignment, so that for the same number of identical bases, a higher association between the two compared sequences. A sequence alignment that reflects gender and that contains as few gaps as possible achieves a higher score than one that contains many gaps. “Affine gap costs” are typically used that charge a relatively high cost for the existence of a gap and a smaller penalty for each subsequent residue in the gap. This is the most commonly used gap scoring system. High gap penalties naturally result in optimized alignments with fewer gaps. For most alignment programs, the gap penalty can be modified. However, it is preferred to use the default values when using such software for sequence comparisons. For example, when using the GCG Wisconsin Bestfit package, the default gap penalty for nucleic acid sequences is -12 for a gap and -4 for each extension.

したがって、最大相同性％の計算には、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適アラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムには、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、それだけには限らないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ｉｂｉｄ−第１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０頁）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールパッケージソフトが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは双方とも、オフライン及びオンライン検索に使用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ｉｂｉｄ、７−５８〜７−６０頁参照）。しかし、いくつかの適用には、ＧＣＧＢｅｓｔｆｉｔプログラムを用いることが好ましい。ＢＬＡＳＴ２シークエンスと呼ばれる新しいツールはまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に使用可能である（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７４（２）：２４７〜５０頁、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ１９９９１７７（１）：１８７〜８頁及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。 Therefore, in order to calculate the maximum homology%, it is first necessary to create an optimal alignment in consideration of the gap penalty. A suitable computer program for performing such an alignment is the GCG Wisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Examples of other software that can perform sequence comparison include, but are not limited to, the BLAST package (Ausubel et al., 1999 ibid—see Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403- 410) and GENEWORKS comparison tool package software. Both BLAST and FASTA can be used for offline and online searching (see Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60). However, for some applications it is preferred to use the GCG Bestfit program. A new tool called BLAST2 sequence is also available for comparison of protein and nucleotide sequences (FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50, FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8 and tatianana. @ Ncbi.nlm.nih.gov).

同一性という点では、最終相同性％を求めることができるが、アラインメント法自体は、通常、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。代わりに、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて、スコアを各対比較に割り当てるスケール付き類似性スコアマトリックスを用いる。このような通常用いられるマトリックスの例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラムパッケージソフトのデフォルトマトリックスがある。ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般に、公開デフォルト値か提供されていればカスタム記号比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照）。いくつかのアプリケーションには、ＧＣＧパッケージに公開デフォルト値を、その他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を用いることが好ましい。 In terms of identity, the final% homology can be determined, but the alignment method itself is usually not based on an all-or-nothing pair comparison. Instead, we typically use a scaled similarity score matrix that assigns scores to each pairwise comparison based on chemical similarity or evolutionary distance. An example of such a commonly used matrix is the BLOSUM62 matrix-BLAST program package software default matrix. The GCG Wisconsin program generally uses either public default values or a custom symbol comparison table if provided (see user manual for further details). For some applications, it is preferable to use the public default values in the GCG package, and in the case of other software, the default matrix, eg, BLOSUM62.

ソフトウェアによって最適アラインメントを得れば、相同性％を、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。通常、ソフトウェアはこれを配列比較の一環として行い、数的結果が得られる。 Given optimal alignment by software, it is possible to calculate% homology, preferably% sequence identity. Usually the software does this as part of the sequence comparison and produces a numerical result.

配列はまた、サイレント変化をもたらし、その結果、機能的に同等な物質をもたらす、核酸残基の欠失、挿入又は置換を含み得る。遺伝子がタンパク質をコードする場合には、相同体によってコードされたタンパク質は同一であるか（遺伝暗号の縮重のために）、又は機能的に同等であり得る（例えば、保存的突然変異が配列に現れることがある）。相同体は、配列番号１の遺伝子によってコードされるタンパク質と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。 The sequence may also include deletions, insertions or substitutions of nucleic acid residues that result in silent changes, resulting in functionally equivalent material. If the gene encodes a protein, the proteins encoded by the homologues may be identical (due to the degeneracy of the genetic code) or functionally equivalent (eg, conservative mutations in the sequence May appear). The homologue preferably encodes a protein having at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98% homology with the protein encoded by the gene of SEQ ID NO: 1.

保存的置換は、例えば、以下の表に従って行うことができる。第２列の同一ブロック内の、好ましくは第３列の同一行内のアミノ酸を互いに置換することができる。 Conservative substitutions can be made, for example, according to the following table. Amino acids in the same block of the second column, preferably in the same row of the third column, can be substituted for each other.

鶏痘ウイルスベクター
本発明はまた、このような鶏痘ウイルスゲノムを含むウイルス粒子に関する。 The fowlpox virus vector The present invention also relates to a viral particle comprising such a fowlpox virus genome.

ウイルス粒子（又はその一部）は、目的とするヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞に送達するためのベクター系として使用できる。この意味では、本明細書において用語「ウイルス粒子」は、ＮＯＩ又は予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達可能な粒子（又はその一部）を含むウイルスベクターを含む。ＮＯＩは、当技術分野で公知の方法を用いて相同組換えによってウイルスゲノムに挿入することができる（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ４（４）３９７〜４０２頁参照）。 Viral particles (or portions thereof) can be used as a vector system to deliver the nucleotide of interest (NOI) to target cells. In this sense, the term “viral particle” as used herein includes a viral vector comprising a particle (or part thereof) capable of delivering NOI or a pre-expressed protein to a target cell. NOI can be inserted into the viral genome by homologous recombination using methods known in the art (see, eg, Schneider et al. (1998) Nature Medicine 4 (4) pages 397-402).

ＮＯＩを発現する組換えポックスウイルスの構築には、ＮＯＩの挿入を、ウイルスゲノムの複製に必須でない部位で行うことが必要である。ＦＰ９の適した挿入部位は記載されている（Ｐｏｌｌｉｔｔら（１９９８）１７：５〜９頁；Ｌａｉｄｌａｗら１９９８ＪＶｉｒｏｌ７２６７４２頁）。 Construction of a recombinant poxvirus that expresses NOI requires that the insertion of NOI be made at a site that is not essential for replication of the viral genome. Suitable insertion sites for FP9 have been described (Pollitt et al. (1998) 17: 5-9; Laidlaw et al. 1998 J Virol 72 6742).

予め発現されたタンパク質
本発明の鶏痘ウイルス（又はその一部）を用いて、予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達することができる。「予め発現されたタンパク質」とは、標的細胞に到達する前に翻訳されているタンパク質である。例えば、ウイルス粒子が増殖する細胞がタンパク質を発現し、次いでそれがウイルス粒子に組み込まれ得る。 Pre-expressed protein The fowlpox virus (or part thereof) of the present invention can be used to deliver a pre-expressed protein to target cells. A “pre-expressed protein” is a protein that has been translated before reaching the target cell. For example, a cell in which the viral particle is growing can express the protein, which can then be incorporated into the viral particle.

ウイルス粒子が増殖する細胞は、１種又は複数の目的とするタンパク質（ＰＯＩ）を発現するよう操作することができる。細胞が霊長類の細胞（ＣＥＦ細胞など）である場合には、かかるＰＯＩをコードするヌクレオチドを用いて一過的にトランスフェクトすることができる。あるいは、安定にトランスフェクトされた細胞株、例えば、ウズラ細胞株ＱＴ３５を増殖に用いてもよい。 Cells in which the viral particles are growing can be engineered to express one or more proteins of interest (POI). If the cell is a primate cell (such as a CEF cell), it can be transiently transfected with a nucleotide encoding such POI. Alternatively, a stably transfected cell line such as quail cell line QT35 may be used for growth.

予め発現されたタンパク質はウイルス粒子に組み込まれるよう標的とされることが好ましい。 Preferably the pre-expressed protein is targeted for incorporation into the viral particle.

ＮＯＩ
本発明では、用語ＮＯＩは、適したヌクレオチド配列であればいずれも、例えば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製した）、ｃＤＮＡ配列又は部分ゲノムＤＮＡ配列を、それらの組合せも含めて含む。配列はコード配列である必要はない。コード領域である場合には、全コード領域である必要はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列はセンス方向である場合も、アンチセンス方向である場合もある。センス方向であることが好ましい。配列はｃＤＮＡを含むか、又はそれから転写されることが好ましい。 NOI
In the present invention, the term NOI is any suitable nucleotide sequence, for example, a synthetic RNA / DNA sequence, a recombinant RNA / DNA sequence (ie, prepared using recombinant DNA technology), a cDNA sequence or portion. Genomic DNA sequences are included, including combinations thereof. The sequence need not be a coding sequence. If it is a code area, it is not necessary to be the entire code area. Furthermore, the RNA / DNA sequence can be in the sense direction or in the antisense direction. The sense direction is preferred. Preferably the sequence comprises or is transcribed from cDNA.

ＮＯＩは、目的とするタンパク質（「ＰＯＩ」）をコードし得る。このようにして、ベクター系を用いて、標的細胞に対する外来遺伝子発現の作用を調べられる可能性がある。例えば、鶏痘ウイルス送達系を用いて、標的細胞への特定の作用についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる可能性がある。 The NOI may encode the protein of interest (“POI”). In this way, it is possible to examine the effect of foreign gene expression on target cells using a vector system. For example, a fowlpox virus delivery system may be used to screen a cDNA library for specific effects on target cells.

ＮＯＩは、標的細胞における遺伝子の発現をブロック又は阻害可能なものであり得る。例えば、ＮＯＩはアンチセンス配列であり得る。アンチセンス技術を用いる遺伝子発現の阻害は十分に公知である。 The NOI may be capable of blocking or inhibiting gene expression in the target cell. For example, the NOI can be an antisense sequence. Inhibition of gene expression using antisense technology is well known.

ＮＯＩ又はＮＯＩ由来の配列は、標的細胞において特定の遺伝子の発現を「ノックアウト」可能なものであり得る。当技術分野では、いくつかの「ノックアウト」戦略が知られている。例えば、ＮＯＩは、特定の遺伝子の発現を破壊するよう標的細胞のゲノムに組み込み可能なものであり得る。ＮＯＩは、例えば、中途での停止コドンを導入することによって、下流コード配列をフレームから外すことによって、又はコードされたタンパク質の折り畳み能に影響を及ぼすことによって、発現を破壊し得る。 A NOI or NOI-derived sequence may be capable of “knocking out” the expression of a particular gene in a target cell. Several “knockout” strategies are known in the art. For example, the NOI can be one that can be integrated into the genome of a target cell to disrupt the expression of a particular gene. The NOI can disrupt expression, for example, by introducing a premature stop codon, by moving the downstream coding sequence out of frame, or by affecting the folding ability of the encoded protein.

あるいは、ＮＯＩは、標的細胞における遺伝子の異所性発現を増強又は誘導可能なものであり得る。ＮＯＩ又はそれから導かれる配列は、特定の遺伝子の発現を「ノックイン」可能なものであり得る。 Alternatively, the NOI may be capable of enhancing or inducing ectopic expression of the gene in the target cell. The NOI or sequence derived therefrom may be capable of “knocking in” the expression of a particular gene.

ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、標的細胞を不死化し得るものであり得る。当技術分野では、いくつかの不死化技術知られている（例えば、ＫａｔａｋｕｒａＹら（１９９８）ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．５７：６９〜９１頁参照）。 The NOI delivered by the vector delivery system can be one that can immortalize the target cells. Several immortalization techniques are known in the art (see, eg, Katakura Y et al. (1998) Methods Cell Biol. 57: 69-91).

ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、選抜のために又はマーカー目的で使用できる。例えば、ＮＯＩは選抜遺伝子、又はマーカー遺伝子であり得る。レトロウイルスベクターでは、多数の種々の選択マーカーが上手く用いられている。これらは「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ編ＪＭＣｏｆｆｉｎ、ＳＭＨｕｇｈｅｓ、ＨＥＶａｒｍｕｓ４４４頁）に概説されており、それだけには限らないが、それぞれＧ４１８及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌のネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、メトトレキセートに対する耐性を付与する突然変異マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、細胞をマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ）、キサンチンを含有する培地で増殖可能にする細菌のｇｐｔ遺伝子、細胞をヒスチジンを含まないがヒスチジノールを含有する培地で増殖可能にする細菌ｈｉｓＤ遺伝子、種々の薬物に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）及びピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）又はフレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性を付与する、細菌の遺伝子が挙げられる。これらのマーカーのすべては、優性選抜可能であり、これらの遺伝子を発現するほとんどの細胞の化学選抜が可能となる。 The NOI delivered by the vector delivery system can be used for selection or for marker purposes. For example, the NOI can be a selection gene or a marker gene. Many different selectable markers have been successfully used in retroviral vectors. These are reviewed in "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbor Press, JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, page 444), but are not limited to the bacterial neomycins that confer resistance to G418 and hygromycin, respectively. Hygromycin phosphotransferase gene, mutant mouse dihydrofolate reductase gene that confers resistance to methotrexate, bacterial gpt gene that allows cells to grow in a medium containing mycophenolic acid, xanthine, histidine Bacterial hisD gene that allows growth on medium without but containing histidinol, against various drugs A multidrug resistance gene (mdr) that confers resistance, and bacterial genes that confer resistance to puromycin or phleomycin. All of these markers can be dominantly selected, allowing chemical selection of most cells that express these genes.

しかし、好ましい一実施形態では、ＮＯＩは、治療作用を有するタンパク質を有するか、又はそれをコードし得る。例えば、ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、遺伝子自身が治療作用を惹起可能なものであり得る、又は治療作用を惹起可能である産物をコードすることができるという意味で、治療用遺伝子であり得る。 However, in a preferred embodiment, the NOI may have or encode a protein having a therapeutic effect. For example, NOI delivered by a vector delivery system is a therapeutic gene in the sense that the gene itself may be capable of inducing a therapeutic action or may encode a product that is capable of inducing a therapeutic action. obtain.

ＮＯＩは、例えば、以下のもののうちの１種であるか、又はコードすることができる：サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、人工的に作り出された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激分子、免疫調節性分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質及び増殖タンパク質、膜タンパク質、血管作動性タンパク質及びペプチド、抗ウイルス性タンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（関連レポーター群を含むものなど）。 The NOI can be, for example, one of the following or can be encoded: cytokines, chemokines, hormones, antibodies, antioxidant molecules, artificially produced immunoglobulin-like molecules, single chain antibodies , Fusion proteins, enzymes, immune costimulatory molecules, immunoregulatory molecules, antisense RNA, transdominant negative mutants of target proteins, toxins, conditional toxins, antigens, tumor suppressor proteins and growth proteins, membrane proteins, vasoactive Proteins and peptides, antiviral proteins and ribozymes, and derivatives thereof (such as those containing related reporter groups).

好ましい一実施形態では、ＮＯＩは、疾病関連抗原をコード可能なものである。鶏痘ベクターに関しては、抗原に対する曝露によって、抗原に対する免疫応答を誘発又は追加免疫でき、その結果、既存の又はその後のチャレンジがより効果的に扱われる。 In a preferred embodiment, the NOI is capable of encoding a disease associated antigen. For fowlpox vectors, exposure to the antigen can elicit or boost an immune response to the antigen, so that existing or subsequent challenges are treated more effectively.

抗原の性質は疾病に応じて変わる。疾病が生物又は感染性病原体（細菌、ウイルス、原生動物、プリオン）によって起こる場合には、抗原はこの生物又は病原体から誘導可能であり得る。疾病が腫瘍によって起こる場合には、抗原はＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ０１、癌精巣抗原又はオンコジーン若しくは産物などの腫瘍関連抗原であることが好ましい。 The nature of the antigen varies depending on the disease. If the disease is caused by an organism or an infectious pathogen (bacteria, virus, protozoan, prion), the antigen may be derivable from this organism or pathogen. Where the disease is caused by a tumor, the antigen is preferably a tumor associated antigen such as HER-2 / neu, MUC01, cancer testis antigen or an oncogene or product.

疾病関連抗原は、１種又は複数のＴ細胞エピトープを含むことが好ましい。抗原は、疾病を引き起こす生物由来の完全タンパク質（結核菌由来のＡｎｔｉｇｅｎ８５Ａなど）を含むことができる。あるいは、抗原は、疾病を引き起こす生物由来の１種又は複数のタンパク質由来のＴ細胞エピトープの鎖を含むこともある。この例として、熱帯熱マラリア原虫由来のＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドがあり、これは熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ遺伝子と融合している、熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰとＰｂ９エピトープ由来のＴ細胞エピトープの鎖を含む。 The disease associated antigen preferably comprises one or more T cell epitopes. Antigens can include complete proteins from disease-causing organisms (such as Antigen 85A from Mycobacterium tuberculosis). Alternatively, the antigen may comprise a chain of T cell epitopes from one or more proteins from the organism causing the disease. An example of this is the MEPfTrap polypeptide from P. falciparum, which contains a chain of P. falciparum CSP and T cell epitopes derived from the Pb9 epitope fused to the P. falciparum TRAP gene.

本発明に従って鶏痘構築物を作製するには、プラスミドｐＥＦＬ又はその誘導体、好ましくはプラスミドｐＥＦＬ２９を用いることが好ましい。ｐＥＦＬ２９は、相同な領域を含み、これによってＯＲＦ１でＦＰ９に組み込むことができる。これによってＯＲＦ−１は破壊されるが、欠失させるわけではない。プラスミドは３個の遺伝子ｌａｃＡ、ｌａｃＹ及びｌａｃＺをゲノムに付加する。この破壊は挿入であり、いくつかのヌクレオチドが欠失する。ｐＥＦＬ２９から欠失される鶏痘Ｏｒｆ１遺伝子塩基は以下の通りである（大文字）：
ＡｇａｇａｔｃｃｃｇｃｃａｇａｃｇｇｇｇａａｃｃｔｇｇｇｔｃａａｃｇＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣｔｇｃｇｔａｔｇｇａｔａｔｇｇｔｃｔｃｃｇ
ｔｇｔｔｇｔｔａｃｇｔｃａａｇａｇａｔｇｔａｔｔｃｇ
ワクチン
本発明のゲノム及び／又は粒子は、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法に使用できる。 In order to produce fowlpox constructs according to the invention, it is preferred to use plasmid pEFL or a derivative thereof, preferably plasmid pEFL29. pEFL29 contains a region of homology that can be incorporated into FP9 at ORF1. This destroys ORF-1, but does not delete it. The plasmid adds three genes lacA, lacY and lacZ to the genome. This disruption is an insertion and several nucleotides are deleted. The fowlpox Orf1 gene base deleted from pEFL29 is as follows (upper case):
AgagaccccccgccagacgggggaacctggggtcaacgACTGGGTGCGAAGATCTTCtgcgttatggatatgggtctccg
tgtttgttacgtcaagagagtgtttagg
Vaccines The genomes and / or particles of the present invention can be used in methods of treating and / or preventing disease in a subject.

例えば、ゲノム及び／又は粒子は、予防又は治療目的で被験体に投与するワクチンに使用できる。ワクチンはまたアジュバントも含むことができる（以下参照）。 For example, the genome and / or particles can be used in a vaccine that is administered to a subject for prophylactic or therapeutic purposes. The vaccine can also include an adjuvant (see below).

複数回投与ワクチン接種（治療又は疾病予防のための）は、単回投与よりも効果的であることが多いことがわかっている。複数回投与ワクチン接種プログラムは、同一組成物の反復投与又は２種若しくは複数の異なる組成物の１回若しくは複数の投与を含み得る。 Multiple dose vaccination (for treatment or disease prevention) has proven to be more effective than single dose. A multi-dose vaccination program may include repeated administration of the same composition or one or more administrations of two or more different compositions.

同種ワクチン接種プログラム用に、本発明は、反復投与を容易にする方法で提供されるワクチンを含むワクチンパックを提供する。例えば、パックには、患者に注射されるよう準備ができている適切な用量のワクチンを含む複数のバイアルを含めることができる。ワクチンが経口投与される場合には、用量は丸剤又はカプセル剤として存在することができる。 For allogeneic vaccination programs, the present invention provides a vaccine pack comprising a vaccine provided in a manner that facilitates repeated administration. For example, the pack can include a plurality of vials containing appropriate doses of vaccine ready to be injected into a patient. When the vaccine is administered orally, the dose can be present as a pill or capsule.

異種ワクチン接種プログラム用には、通常、患者に最初に投与される「初回抗原投与」組成物と、いくらか後に投与される「追加免疫」組成物がある。本発明のゲノム及び／又はウイルス粒子は、初回抗原投与組成物及び／又は追加免疫組成物に使用できる。 For heterologous vaccination programs, there are usually “primary challenge” compositions that are first administered to patients and “boost” compositions that are administered sometime later. The genomes and / or virus particles of the present invention can be used in primary challenge compositions and / or booster compositions.

いくつかの他の組成物を、異種ワクチン接種プログラムに使用できる。本発明のゲノム／粒子がＮＯＩ（場合によって、ＰＯＩをコード可能である）を含む場合には、他の組成物は、同一のＮＯＩ又はＰＯＩを含むことが好ましい。他の組成物としては、「裸のＤＮＡ」、非ウイルスベクター系及び他のウイルスベクター系が挙げられる。 Several other compositions can be used for xenogeneic vaccination programs. If the genome / particle of the present invention comprises a NOI (which can optionally encode a POI), the other composition preferably comprises the same NOI or POI. Other compositions include “naked DNA”, non-viral vector systems and other viral vector systems.

裸のＤＮＡ（又はＲＮＡ）は、線状であっても環状（例えば、プラスミド）であってもよい。リポソームなどの担体中で、又は遊離型で提供される場合もある。 Naked DNA (or RNA) may be linear or circular (eg, a plasmid). It may be provided in a carrier such as a liposome or in free form.

初回抗原刺激組成物に使用するための、適した非ウイルスベクターとしては、リポペプチドとして知られる脂質が末端に付加されたペプチド、融合タンパク質としてか化学結合によってのいずれかでＫＬＨなどの担体タンパク質と融合しているペプチド、アジュバントを含む完全抗原、及びその他の類似の系が挙げられる。 Suitable non-viral vectors for use in priming compositions include peptides endowed with lipids known as lipopeptides, carrier proteins such as KLH, either as fusion proteins or by chemical linkage. Peptides that are fused, complete antigens including adjuvants, and other similar systems.

ウイルスベクター系を用いる場合には、異なるウイルス由来のもの（すなわち、鶏痘ではない）であれば交差反応を最小にするのに有利であり得る。ベクターは別のアビポックスウイルス由来のもの、又は異なる属のポックスウイルス由来のもの（表２に示されるような）であってもよい。ＭＶＡ又はＮＶＹＡＣなどの弱毒ワクチンベクター系が特に好ましい。その他の適したウイルスベクターとしては、非ポックスウイルスに基づいたベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）がある。適した細菌ベクターとしては、組換えＢＣＧ及び組換えサルモネラ及びプラスミドＤＮＡで形質転換されたサルモネラが挙げられる（ＤａｒｊｉＡら１９９７Ｃｅｌｌ９１：７６５〜７７５頁）。 If a viral vector system is used, it may be advantageous to minimize cross-reactions if they are from different viruses (ie not chicken fowl). The vector may be from another avipox virus or from a different genus of poxviruses (as shown in Table 2). Particularly preferred are attenuated vaccine vector systems such as MVA or NVYAC. Other suitable viral vectors include non-poxvirus based vectors such as adenovirus, herpes virus and Venezuelan equine encephalitis virus (VEE). Suitable bacterial vectors include recombinant BCG and recombinant Salmonella and Salmonella transformed with plasmid DNA (Darji A et al. 1997 Cell 91: 765-775).

異種ワクチンプログラムには、本発明は、
（ｉ）鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物。
とを含むワクチン接種キットを提供する。 For heterologous vaccine programs, the present invention provides:
(I) a first composition comprising fowlpox virus particles;
(Ii) A second composition for simultaneous, separate or sequential administration.
A vaccination kit is provided.

異種ワクチン接種レジメン
本発明はまた、概ね、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種ワクチン接種レジメンに関する。 The heterologous vaccination regimen The present invention also generally relates to a heterologous vaccination regimen using two different non-replicating viral vectors.

本発明者らは、まず、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライム−ブーストレジメンが、霊長類被験体において免疫応答を生じさせるのに効率的であることを示した。 The inventors have first shown that a heterogeneous prime-boost regimen using two different non-replicating viral vectors is efficient in generating an immune response in primate subjects.

詳しくは、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを、いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 Specifically, the present invention
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) providing a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject in any order a second composition comprising a second non-replicating viral vector.

被験体が哺乳類であることが好ましく、被験体が霊長類であることがより好ましく、被験体がヒトであることが最も好ましい。 The subject is preferably a mammal, more preferably the subject is a primate, and most preferably the subject is a human.

好ましい一実施形態では、第１及び／又は第２の組成物はポックスウイルスベクターである。 In a preferred embodiment, the first and / or second composition is a poxvirus vector.

したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 Thus, in a preferred embodiment, the present invention provides
(I) a first composition comprising a first non-replicating poxvirus vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating poxvirus vector;
Provided is a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject in any order.

もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法に関する。 In another aspect, the present invention provides:
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating viral vector;
It relates to a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising the step of administering to the subject in any order.

もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 In another aspect, the present invention provides:
(I) a first composition comprising a DNA vaccine;
(Ii) a second composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Iii) providing a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject a third composition comprising a second non-replicating viral vector.

もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物
とを被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 In another aspect, the present invention provides:
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating viral vector;
(Iii) providing a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject a third composition comprising a third non-replicating viral vector.

もう１つの態様では、本発明は、組成物のうちの少なくとも１つがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein at least one of the compositions comprises a poxvirus vector.

もう１つの態様では、本発明は、前記非複製ウイルスベクターがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein said non-replicating viral vector comprises a poxvirus vector.

もう１つの態様では、本発明は、少なくとも２種のポックスウイルスベクターが、異なる属のポックスウイルスベクターから誘導可能である前記の方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method as described above, wherein at least two poxvirus vectors are derivable from poxvirus vectors of different genera.

もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein at least one poxvirus vector is derivable from an avipoxvirus and at least one poxvirus vector is derivable from an orthopoxvirus.

もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のベクターが鶏痘ウイルスから誘導可能である前記の方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method as described above wherein at least one vector is derivable from fowlpox virus.

もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のベクターがＦＰ９であるか、それから誘導可能である、前記の方法に関する。 In another aspect, the invention relates to the aforementioned method, wherein the at least one vector is FP9 or derivable therefrom.

もう１つの態様では、本発明は、ベクターのうちの１種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、前記の方法に関する：
（ｉ）１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を含む鶏痘ゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２、
（ｉｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子を欠く鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｖ）１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７、
（ｖ）１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９、
（ｖｉ）遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じたキメラ遺伝子を含む鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉ）大きさが２７５ｋｂｐ未満である鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉｉ）配列番号１に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム、
（ｉｘ）ＯＲＦ１からＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣが欠失した配列番号１に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein one of the vectors comprises a fowlpox virus genome selected from:
(I) A fowlpox genome comprising one or more of the following modified forms of the wild-type FPV gene:
FPV001, FPV018, FPV054, FPV063, FPV066, FPV070, FPV071, FPV093, FPV097, FPV098, FPV115, FPV124, FPV125, FPV127, FPV158, FPV159, FPV160, FPV190, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191 FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260,
(Ii) A fowlpox virus genome comprising a partial deletion in one or more of the following genes:
FPV158, FPV219, FPV222,
(Iii) Fowlpox virus genome lacking one or more of the following genes:
FPV001, FPV124, FPV125, FPV159, FPV160, FPV220, FPV221, FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260,
(Iv) A fowlpox virus genome comprising a frameshift mutation in one or more of the following genes:
FPV054, FPV070, FPV071, FPV115, FPV190, FPV207,
(V) A fowlpox virus genome comprising a termination mutation in one or more of the following genes:
FPV071, FPV239,
(Vi) a fowlpox virus genome comprising a chimeric gene produced (by deletion) by the fusion of genes FPV097 and FPV098,
(Vii) a fowlpox virus genome having a size of less than 275 kbp,
(Viii) a fowlpox virus genome comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(Ix) A fowlpox virus genome comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which ACTGGTGCGAAGATCTC is deleted from ORF1.

もう１つの態様では、本発明は、鶏痘ウイルスゲノムがまたＮＯＩも含む、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein the fowlpox virus genome also comprises a NOI.

もう１つの態様では、本発明は、ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein the NOI is under the control of a poxvirus promoter.

もう１つの態様では、本発明は、ＮＯＩがネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、Ｐ．シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はＴ．パルバ由来の抗原をコードする、前記の方法に関する。 In another aspect, the invention provides that the NOI is a murine malaria parasite, a falciparum malaria parasite, Cynomolgi, Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis or T. It relates to a method as described above, which encodes an antigen derived from Parva.

もう１つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を追加免疫組成物として投与する、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein a composition comprising a viral vector derived from an avipoxvirus is administered as a booster composition.

もう１つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を初回抗原刺激組成物として投与する、前記の方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method as described above, wherein a composition comprising a viral vector derived from an avipox virus is administered as a priming composition.

もう１つの態様では、本発明は被験体が霊長類である、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein the subject is a primate.

もう１つの態様では、本発明は被験体がヒトである、前記の方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to the aforementioned method, wherein the subject is a human.

もう１つの態様では、本発明は動物用ワクチンにおける、ＦＰ９であるか、それから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。 In another aspect, the invention relates to the use of a non-replicating viral vector that is or is derivable from FP9 in an animal vaccine.

もう１つの態様では、本発明は前記動物が哺乳類である、前記のような使用に関する。 In another aspect, the invention relates to a use as described above, wherein said animal is a mammal.

もう１つの態様では、本発明は前記哺乳類が霊長類である、前記のような使用に関する。 In another aspect, the invention relates to a use as described above, wherein said mammal is a primate.

もう１つの態様では、本発明は、前記霊長類がヒトである、前記のような使用に関する。 In another aspect, the invention relates to a use as described above, wherein said primate is a human.

もう１つの態様では、本発明は、医薬における、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。 In another aspect, the invention relates to the use of a non-replicating viral vector that is or is derivable from FP9 in medicine.

もう１つの態様では、本発明は、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を生起する方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method of generating an immune response in a subject comprising administering to the subject a composition comprising a non-replicating viral vector that is FP9 or derivable therefrom.

もう１つの態様では、本発明は、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において既存の免疫応答を追加免疫する方法に関する。 In another aspect, the invention boosts an existing immune response in a subject comprising administering to the subject a composition comprising a non-replicating viral vector that is or is derivable from FP9. Regarding the method.

被験体は霊長類、特に、ヒトであることが好ましい。 The subject is preferably a primate, especially a human.

ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、一方はアビポックスウイルスから、他方はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る（表２参照）。 The vector is preferably derivable from poxviruses of different genera. Specifically, one can be derived from an avipox virus and the other from an orthopox virus (see Table 2).

組成物の一方が、アビポックスウイルスから誘導可能なベクターを含む場合には、この組成物は追加免疫組成物として投与することが好ましい。 Where one of the compositions comprises a vector derivable from avipoxvirus, this composition is preferably administered as a booster composition.

好ましい一実施形態では、ベクターのうちの１種が、鶏痘ウイルスから誘導可能である。ベクターのうちの１種がＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能であることがより好ましい。例えば、ベクターのうちの１種は、本発明の第１の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは配列番号１に示される配列を含むゲノムを含む。 In a preferred embodiment, one of the vectors is derivable from fowlpox virus. More preferably, one of the vectors is FP9 or derivable therefrom. For example, one of the vectors may comprise the fowlpox virus genome of the first aspect of the invention. In one highly preferred embodiment, the vector comprises a genome comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

疾病がマラリアである場合には、ＦＰ９又はＦＰ９由来ベクターを、初回抗原刺激として用いることが好ましい。 When the disease is malaria, FP9 or an FP9-derived vector is preferably used as the initial antigen stimulation.

疾病が結核である場合には、ＦＰ９又はＦＰ９由来ベクターを、追加免疫として用いることが好ましい。 When the disease is tuberculosis, it is preferable to use FP9 or an FP9-derived vector as a booster.

第１及び第２の組成物が、同一抗原を発現可能であることが好ましい。 It is preferred that the first and second compositions are capable of expressing the same antigen.

第１及び第２の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別に詰められていてもよい。 The first and second compositions may be packaged individually for sale together or separately.

キットは、投与前に組成物の一方又は双方と混合するための他の成分（希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照）を含み得る。 The kit may contain other components (diluents, carriers, adjuvants, etc.—see below) for mixing with one or both of the compositions prior to administration.

キットはまた、ワクチン接種プロトコールに関する取扱説明書を含み得る。 The kit can also include instructions for vaccination protocols.

追加免疫組成物
本発明者らは、本発明の非複製ウイルスベクターは、抗原に対する既存の免疫応答の追加免疫で有効であることを示した。詳しくは、本発明者らは、まず、非複製ウイルスを用いて、マウスにおいて及び霊長類においてウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧによって、並びにヒトなどの霊長類のメラノーマによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できることを示した。 Booster Compositions We have shown that the non-replicating viral vectors of the invention are effective in boosting an existing immune response against an antigen. Specifically, we were first primed with M. bovis BCG in mice and in primates with non-replicating viruses, and with melanoma from primates such as humans. It was shown that the immune response can be boosted.

既存の免疫応答は、ワクチンによって生じたものであり得る。いくつかの異なる種類のワクチンが開発されており、当技術分野では公知であり、これらとしては、生存生物、無傷の非生存生物、細胞成分断片、トキソイド、ＤＮＡをベースにしたワクチン及び抗イディオタイプが挙げられる（表１参照）。高度に好ましい一実施形態では、既存の応答は弱毒生存病原体、例えば、ＢＣＧによって生じたものである。 An existing immune response may have been generated by a vaccine. Several different types of vaccines have been developed and are known in the art, including live organisms, intact non-viable organisms, cell component fragments, toxoids, DNA-based vaccines and anti-idiotypes (See Table 1). In one highly preferred embodiment, the existing response is caused by an attenuated live pathogen, such as BCG.

本発明は、被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。 The present invention provides a booster composition comprising a non-replicating viral vector capable of boosting an existing immune response in a subject.

被験体は霊長類であることが好ましい。 The subject is preferably a primate.

ウイルスベクターはポックスウイルスベクターであることが好ましい。例えば、ウイルスベクターは本発明の第１の態様のゲノムを含み得る。 The viral vector is preferably a poxvirus vector. For example, a viral vector can comprise the genome of the first aspect of the invention.

３重及び多重レジメン
本発明はまた、一般に、異なる非複製ウイルスベクターを用いる、多重異種ワクチン接種レジメン、例えば、３重異種レジメンに関する。 Triple and multiple regimens The present invention also generally relates to multiple heterologous vaccination regimes, eg, triple heterologous regimens, using different non-replicating viral vectors.

したがって、本発明は、被験体に３種の異種組成物を投与することを含む３重レジメンを提供する。前記の３種の組成物は、各々がその近接する組成物とは異なることが好ましい。例えば、第１の組成物がＸを含む場合には、第２の組成物はＸとは異なることが好ましい。この実施形態では、第３の組成物が第１の組成物と類似又は同一であり得ることが可能であることは明らかである。３種の組成物すべてが互いに異なっていることが好ましい。 Accordingly, the present invention provides a triple regimen comprising administering three different compositions to a subject. Each of the three types of compositions is preferably different from the adjacent composition. For example, when the first composition contains X, the second composition is preferably different from X. In this embodiment, it is clear that the third composition can be similar or identical to the first composition. It is preferred that all three compositions are different from one another.

一実施形態では、組成物のうちの１種は、ＤＮＡワクチンなどのＤＮＡをベースとする組成物であり得る。少なくとも第２の及び第３の組成物が、非複製ウイルスベクターを含むことが好ましい。 In one embodiment, one of the compositions can be a DNA-based composition, such as a DNA vaccine. It is preferred that at least the second and third compositions comprise non-replicating viral vectors.

したがって、本発明は、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 Therefore, the present invention
(I) a first composition comprising a DNA vaccine;
(Ii) a second composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Iii) providing a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject a third composition comprising a second non-replicating viral vector.

好ましい一実施形態では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。 In a preferred embodiment, the present invention provides:
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating viral vector;
(Iii) providing a method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising administering to the subject a third composition comprising a third non-replicating viral vector.

好ましい一実施形態では、第１と第２の組成物は異種であり、第２と第３の組成物が異種である。第１及び第２及び第３の組成物が異種であることがより好ましい。前記組成物が、前記組成物のウイルスベクター成分に関して異種であることが最も好ましい。例えば、一治療レジメンは、ｐＤＮＡ初回抗原刺激とそれに続く組換えＭＶＡ追加免疫とそれに続く組換えＦＰ９追加免疫とそれに続く組換えアデノウイルス追加免疫などを含み得る。これらの治療／免疫化サイクルは、治療的設定において治療的Ｔ細胞応答を持続するために反復することができることが有利である。 In a preferred embodiment, the first and second compositions are heterogeneous and the second and third compositions are heterogeneous. More preferably, the first, second and third compositions are different. Most preferably, the composition is heterogeneous with respect to the viral vector components of the composition. For example, one treatment regimen may include pDNA prime challenge followed by recombinant MVA boost followed by recombinant FP9 boost followed by recombinant adenovirus boost. These treatment / immunization cycles can advantageously be repeated to sustain a therapeutic T cell response in a therapeutic setting.

本発明の３重異種レジメンには、３種又は複数の異なるウイルスベクターを用いることが好ましい。 The triple heterogeneous regimen of the present invention preferably uses three or more different viral vectors.

高度に好ましい一実施形態では、免疫化は以下のベクター：ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ−アデノウイルス−組換えヘルペスをいずれかの順序で用いて実施する。各ベクターが同一抗原を発現することが好ましい。ベクターは、ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ−アデノウイルス−組換えヘルペスの順序で投与することが好ましい。 In one highly preferred embodiment, immunization is performed using the following vector: DNA-FP9-MVA-adenovirus-recombinant herpes in any order. Preferably each vector expresses the same antigen. The vectors are preferably administered in the order DNA-FP9-MVA-adenovirus-recombinant herpes.

さらに好ましい免疫化順序及び免疫化レジメンとしては、ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ及びＤＮＡ−ＭＶＡ−ＦＰ９がある。 Further preferred immunization sequences and immunization regimes include DNA-FP9-MVA and DNA-MVA-FP9.

ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、１種はアビポックスウイルスから誘導可能であり、もう１種はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る（表２参照）。 The vector is preferably derivable from poxviruses of different genera. Specifically, one can be derived from an avipox virus and the other can be derived from an orthopox virus (see Table 2).

好ましい一実施形態では、ベクターのうちの１種は鶏痘ウイルスから誘導可能である。例えば、ベクターのうちの１種は、本発明の第１の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは、配列番号１に示される配列を含むゲノムを含む。 In a preferred embodiment, one of the vectors is derivable from fowlpox virus. For example, one of the vectors may comprise the fowlpox virus genome of the first aspect of the invention. In one highly preferred embodiment, the vector comprises a genome comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

第１及び第２及び第３の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。 It is preferred that the first, second and third compositions are capable of expressing the same antigen.

実施例１２（例えば、図１１−ＤＤＦＭ）は、３重レジメンの有効性を実証する。 Example 12 (eg, FIG. 11-DDFM) demonstrates the effectiveness of the triple regimen.

第１及び第２及び第３の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別にパッケージされていてもよい。 The first and second and third compositions may be packaged separately for sale together or separately.

キットは、投与前に１種又は複数の組成物と混合するための他の成分（希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照）を含み得る。 The kit may contain other components (diluents, carriers, adjuvants, etc.—see below) for mixing with one or more compositions prior to administration.

Ｔ細胞応答
本ワクチン接種法又はプログラムは、被験体においてＴ細胞免疫応答を生起するはずである。 T cell response The vaccination method or program should generate a T cell immune response in the subject.

Ｔ細胞免疫応答の性質は、細胞上の細胞表面マーカーの発現に基づいて特性決定することができる。一般に、Ｔ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ５又はＣＤ７（ヒトのみ）の存在によって検出することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は、その補助受容体発現によって区別することができる（例えば、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体によって）。 The nature of the T cell immune response can be characterized based on the expression of cell surface markers on the cells. In general, T cells can be detected by the presence of TCR, CD3, CD2, CD28, CD5 or CD7 (human only). CD4 + T cells and CD8 + T cells can be distinguished by their co-receptor expression (eg, by anti-CD4 or anti-CD8 monoclonal antibodies).

ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される場合に抗原を認識し、ＣＤ８＋はＭＨＣクラスＩ分子によって提示される場合に認識するので、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、それらが反応する抗原提示細胞に基づいて区別することもできる。 Since CD4 + T cells recognize antigens when presented by MHC class II molecules and CD8 + recognizes when presented by MHC class I molecules, CD4 + and CD8 + T cells also become antigen-presenting cells to which they react. A distinction can also be made based on this.

特定の標的抗原内に、１種又は複数のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと１種又は複数のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがある場合もある。特定のエピトープがすでに特性決定されている場合には、これを用いて、例えば、特定のエピトープを認識するＴ細胞サブセットの特異的刺激に基づいてＴ細胞の２種のサブタイプ間を区別することができる。 Within a particular target antigen there may be one or more CD4 + T cell epitopes and one or more CD8 + T cell epitopes. If a specific epitope has already been characterized, this can be used, for example, to distinguish between two T cell subtypes based on specific stimulation of T cell subsets that recognize the specific epitope. Can do.

ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、そのサイトカイン分泌プロフィールに基づいて細分することもできる。Ｔ_Ｈ１サブセット（「炎症性ＣＤ４Ｔ細胞」として知られることもある）は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを特徴的に分泌し、細胞傷害性及び局所炎症反応と関連しているいくつかの機能を媒介する。Ｔ_Ｈ１細胞は、マクロファージを活性化することができ、細胞媒介性免疫を導く。Ｔ_Ｈ２サブセット（「ヘルパーＣＤ４Ｔ細胞」として知られることもある）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０を特徴的に分泌し、Ｂ細胞を増殖し、抗体を産生するよう（体液性免疫）刺激することにおいて役割を有すると考えられている。 CD4 + T cells can also be subdivided based on their cytokine secretion profile. The T _H 1 subset (sometimes known as “inflammatory CD4 T cells”) secretes IL-2 and IFNγ and mediates several functions associated with cytotoxic and local inflammatory responses To do. T _H 1 cells can activate macrophages, leading to cell-mediated immunity. The T _H 2 subset (sometimes known as “helper CD4 T cells”) characteristically secretes IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10, proliferates B cells and produces antibodies It is thought to have a role in stimulating (humoral immunity).

Ｔ_Ｈ１及びＴ_Ｈ２細胞はまた、エフェクター分子を特徴的に発現する。Ｔ_Ｈ１細胞は膜結合型ＴＮＦを発現し、Ｔ_Ｈ２細胞はＢ細胞上にＣＤ４０と結合するＣＤ４０リガンドを発現する。 T _H 1 and T _H 2 cells also characteristically express effector molecules. T _H 1 cells express membrane-bound TNF, and T _H 2 cells express CD40 ligand that binds to CD40 on B cells.

したがって、細胞免疫応答の種類は、例えば、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳｃａｎ）を用いて容易に決定することができる。 Thus, the type of cellular immune response can be readily determined using, for example, fluorescence activated cell scanning (FACScan).

標的抗原
標的抗原は、標的疾病に特有のものであり得る。疾病が、感染性病原体によって起こる感染性疾病である場合には、標的抗原は感染性病原体から誘導可能なものであり得る。 Target antigen The target antigen may be specific to the target disease. If the disease is an infectious disease caused by an infectious pathogen, the target antigen can be derivable from the infectious pathogen.

標的抗原は、疾病の感染後に免疫系によって認識される抗原であり得る。あるいは、抗原は、通常は、免疫系には「見えない」ものであり、その結果、本方法が非生理学的Ｔ細胞応答を誘導する場合もある。これは、別の攻撃路を開くことができるために、疾病によって誘発された免疫応答が有効でない（例えば、感染の排除に成功しない）疾病では有用であり得る。 The target antigen may be an antigen that is recognized by the immune system after infection of the disease. Alternatively, the antigen is usually “invisible” to the immune system, so that the method may induce a non-physiological T cell response. This can be useful in diseases where the immune response elicited by the disease is not effective (eg, does not succeed in eliminating infection) because it can open another path of attack.

好ましい乳癌抗原には、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、ＣＥＡがある。 Preferred breast cancer antigens include MUC-1, HER2, CEA.

好ましい結腸癌抗原：ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１２、突然変異体Ｐ５３。 Preferred colon cancer antigens: CEA, MUC-1, MAGE-12, mutant P53.

好ましい脳癌抗原：ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７。 Preferred brain cancer antigens: human papillomavirus proteins E6 and E7.

好ましいＥＢＶ誘導性Ｂ及びＴ細胞リンパ腫抗原：ＢＢＮＡ１及び２、ＬＭＰ１。 Preferred EBV-induced B and T cell lymphoma antigens: BBNA1 and 2, LMP1.

好ましい腎臓癌抗原：ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＲＡＧＥ、ＭＵＣ−１。 Preferred kidney cancer antigens: HER-2neu, RAGE, MUC-1.

好ましいＨＰＶ抗原には、ウイルスタンパク質Ｅ１−８、Ｌ１及びＬ２がある。 Preferred HPV antigens include viral proteins E1-8, L1 and L2.

好ましいＨＳＶ抗原には、ウイルスタンパク質ｇＭ、ｇＨ、ｇＫ、ＧＧ、ｇＤがある。 Preferred HSV antigens include the viral proteins gM, gH, gK, GG, gD.

好ましいＨＢＶ抗原には、ウイルスタンパク質小、中及び大表面抗原、コア抗原、ポリメラーゼがある。 Preferred HBV antigens include viral protein small, medium and large surface antigens, core antigen, polymerase.

好ましいＨＣＶタンパク質には、ウイルスタンパク質コアタンパク質、エンベロープタンパク質、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域がある。 Preferred HCV proteins include viral protein core protein, envelope protein, NS2, NS3, NS4 and NS5 regions.

抗原は、腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３又はＮＹ−ＥＳＯであり得る。 The antigen can be a tumor antigen such as HER2 / neu, MUC-1, MAGE-1, MAGE-3 or NY-ESO.

抗原は、自己抗原、例えば、チロシナーゼであり得る。 The antigen can be a self-antigen, such as tyrosinase.

本発明の好ましい一実施形態では、抗原は結核菌から誘導可能である。例えば、抗原はＥＳＡＴ６又はＭＰＴ６３であり得る。 In a preferred embodiment of the invention, the antigen is derivable from Mycobacterium tuberculosis. For example, the antigen can be ESAT6 or MPT63.

本発明のもう１つの好ましい実施形態では、抗原は、マラリア関連病原体熱帯熱マラリア原虫から誘導可能である。 In another preferred embodiment of the invention, the antigen is derivable from the malaria-associated pathogen P. falciparum.

本発明の組成物は、２種以上の抗原由来のＴ細胞エピトープを含み得る。例えば、本組成物は、同一の疾病と関連している２種又は複数の抗原由来の１種又は複数のＴ細胞エピトープを含み得る。２種又は複数の抗原は、同一の病原性生物から誘導可能であり得る。 The composition of the invention may comprise T cell epitopes derived from more than one antigen. For example, the composition can include one or more T cell epitopes from two or more antigens associated with the same disease. Two or more antigens may be derivable from the same pathogenic organism.

あるいは、本組成物は、種々の供給源由来のエピトープを含み得る。例えば、実施例に記載したＭＥ−ＴＲＡＰインサートは、熱帯熱マラリア原虫、破傷風トキソイド、結核菌及びウシ型結核菌由来のＴ細胞エピトープを含む。 Alternatively, the composition can include epitopes from various sources. For example, the ME-TRAP insert described in the Examples contains T cell epitopes from P. falciparum, tetanus toxoid, M. tuberculosis and M. bovis.

標的疾病
本発明の方法は、いくつかの疾病、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答に感受性のあるものの治療及び／又は予防に有用である。 Target Diseases The methods of the invention are useful for the treatment and / or prevention of several diseases, particularly those sensitive to T cell mediated immune responses.

詳しくは、本発明の方法は、慢性感染症、特に、持続性潜在性感染症であるか、又はそれから起こる疾病の治療及び／又は予防に有用である。 Specifically, the methods of the present invention are useful for the treatment and / or prevention of diseases that are or arise from chronic infections, particularly persistent latent infections.

適した疾病の網羅するものではないリストとして、結核、ＨＩＶ、マラリア、Ｈ．ピロリ、インフルエンザ、肝炎、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘルペスウイルス誘導性疾病及び他のウイルス感染、ライ病、トキソプラズマなどの非マラリア原虫寄生虫、並びに腫瘍及び／又は癌などの種々の悪性のもの、原虫：マラリア、特に、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ、タイレリアパルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａｐａｒｖａ）、トリパノソマスクルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓｃｒｕｚｉ）によって起こる感染症、結核及びライ病などの放線菌によって起こる感染症、肺炎クラミジア及びヘリコバクターピロリなどの細菌によって起こる感染症、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、インフルエンザウイルスなどのウイルスによって起こる感染症並びに腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、皮膚癌（メラノーマ）、肝臓癌、卵巣癌、精巣癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、頸部癌、乳癌及び種々のリンパ腫などの種々の悪性のもの、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、マラリア、結核、ＨＰＶ感染及び疾病、ＨＳＶ感染及び疾病、ＣＭＶ感染及び疾病、ＥＢｖ感染及び疾病、レーシュマニア症、リステリア症、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、ＨＴＬＶ感染及び疾病、肺炎球菌病、ブドウ球菌病、肺癌、乳癌、結腸癌、メラノーマ、骨髄腫、リンパ腫、腎細胞癌腫が挙げられる。 A non-exhaustive list of suitable diseases includes tuberculosis, HIV, malaria, H. Non-malarial parasite parasites such as H. pylori, influenza, hepatitis, CMV, human papillomavirus (HPV), herpesvirus-induced diseases and other viral infections, lei disease, toxoplasmas, and various malignant ones such as tumors and / or cancers , Protozoa: caused by actinomycetes such as infections caused by malaria, especially Plasmodium falciparum and Plasmodium falciparum, Toxoplasma, Theileria parva, Trypanosoma cruzi, tuberculosis and leprosy Infections, infections caused by bacteria such as Chlamydia pneumonia and Helicobacter pylori, infections caused by viruses such as HIV, EBV, CMV, HBV, HCV, HPV, HSV, RSV, influenza virus Kidney cancer, colorectal cancer, lung cancer, skin cancer (melanoma), liver cancer, ovarian cancer, testicular cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, head and neck cancer, cervical cancer, breast cancer and various lymphomas, etc. Of various malignancies and HIV / AIDS, hepatitis B, hepatitis C, malaria, tuberculosis, HPV infection and disease, HSV infection and disease, CMV infection and disease, EBv infection and disease, leishmaniasis, listeria Disease, Theileria, HTLV infection and disease, pneumococcal disease, staphylococcal disease, lung cancer, breast cancer, colon cancer, melanoma, myeloma, lymphoma, renal cell carcinoma.

本発明の方法は、結核、マラリア及び東海岸熱から保護するためのワクチン接種法において特に有用である。 The method of the invention is particularly useful in vaccination methods to protect against tuberculosis, malaria and east coast fever.

本明細書に記載した組成物は、治療用又は予防用ワクチンとして使用できる。予防的免疫化と治療的免疫化のどちらがより適当であるかは、通常、疾病の性質に応じて変わる。例えば、癌は、診断される前よりもむしろ治療的に免疫化され、抗マラリアワクチンは、必ずしもそうではないが、予防薬として用いられることが好ましいと予想される。 The compositions described herein can be used as therapeutic or prophylactic vaccines. Whether prophylaxis or therapeutic immunization is more appropriate usually depends on the nature of the disease. For example, it is expected that cancer is immunized therapeutically rather than before diagnosis, and antimalarial vaccines are preferably, but not necessarily, used as prophylactic agents.

医薬組成物／ワクチン
本発明はまた、ワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤などの医薬組成物に関する。 Pharmaceutical Composition / Vaccine The present invention also relates to a pharmaceutical composition such as a vaccine, priming or boosting agent.

医薬組成物はまた、例えば、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含むことができる。製薬上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬務に関連して選択することができる。 The pharmaceutical composition can also include, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient or adjuvant. The choice of pharmaceutical carrier, excipient or diluent can be selected with regard to the intended route of administration and standard pharmaceutical practice.

詳しくは、ＤＮＡプラスミドベクターを含む組成物は、アジュバントとして作用するよう、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はそれをコードするプラスミドを含むことができ、ポリペプチドの形でＧＭ−ＣＳＦを用いると有益な作用が見られる。ＱＳ２１又はＳＢＡＳ２などのアジュバント（ＳｔｏｕｔｅＪＡら１９９７ＮＥｎｇｌＪＭｅｄｉｃｉｎｅ２２６：８６９１頁）は、タンパク質、ペプチド又は核酸とともに使用してＴ細胞応答の誘導を増強することができる。 Specifically, a composition comprising a DNA plasmid vector can comprise granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), or a plasmid encoding it, to act as an adjuvant, and in the form of a polypeptide, GM-CSF. Useful to see beneficial effects. Adjuvants such as QS21 or SBAS2 (Route JA et al. 1997 N Engl J Medicine 226: 8691) can be used with proteins, peptides or nucleic acids to enhance the induction of T cell responses.

本発明の医薬組成物では、組成物は、何らかの適した結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、被覆剤又は可溶化剤と混合することもできる。 In the pharmaceutical composition of the present invention, the composition can also be mixed with any suitable binder, lubricant, suspending agent, coating agent or solubilizer.

医薬組成物は獣医学（すなわち、動物）利用のためのであっても、ヒト利用のためのものであってもよい。獣医学利用としては、組成物は、例えば、哺乳類（特に、ウシ）又はトリを治療するために使用できる。 The pharmaceutical composition may be for veterinary (ie, animal) use or for human use. For veterinary applications, the composition can be used, for example, to treat mammals (particularly cattle) or birds.

被験体は哺乳類被験体、特に、霊長類（例えば、ヒト）又は有蹄動物（例えば、ウシ）被験体であることが好ましい。 The subject is preferably a mammalian subject, particularly a primate (eg, human) or ungulate (eg, bovine) subject.

投与
一般に、本発明の組成物の治療上有効な皮内又は筋内日用量は、１０^５〜１０^１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）に及ぶことが多い。 Administration In general, therapeutically effective intradermal or intramuscular daily doses of the compositions of the invention often range from 10 ⁵ to 10 ¹⁰ plaque forming units (pfu).

通常、医師又は獣医が、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、これは特定の患者の年齢、体重及び応答によって変わる。前記投与量は平均的な場合の典型的なものである。もちろん、より高い又はより低い投与量がふさわしい個々の例があり得、そのようなものも本発明の範囲内にある。 Usually, a physician or veterinarian will determine the actual dosage that is most appropriate for an individual patient, and will vary with the age, weight and response of the particular patient. The dosage is typical of the average case. There can, of course, be individual instances where higher or lower dosages are merited, and such are within the scope of this invention.

コードポックスウイルス亜科のメンバーの伝染は、エアゾールによって起こり得る（Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）前記）。本発明の組成物はまた、被験体が吸入するためのエアゾールによって投与することができる。本発明の組成物はまた、注射、例えば、皮内及び／又は筋内注射によって投与できることが好都合である。さらに、組成物は、適したデバイン（ｄｅｖｉｎｅ）を用いて皮膚又はその他の組織に投与できる（例えば、「遺伝子銃」又は類似物を用いて）。 Transmission of members of the Codepoxviridae can occur by aerosol (Murphy et al. (1995) supra). The compositions of the invention can also be administered by aerosol for inhalation by a subject. Conveniently, the composition of the invention can also be administered by injection, for example by intradermal and / or intramuscular injection. Further, the composition can be administered to the skin or other tissue using a suitable device (eg, using a “gene gun” or the like).

必要に応じて、本医薬組成物はまた、座剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを用いて、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤、又はカプセル剤若しくは卵型剤の形で、単独又は賦形剤と混合して経口的に、又は矯味矯臭剤若しくは着色剤を含有するエリキシル、溶液又は懸濁液の形で投与でき、あるいはそれらは非経口的に、例えば、海綿体内に、静脈内若しくは皮下注射することもできる。非経口投与には、本組成物は、その他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる滅菌水溶液の形で用いることが最良であり得る。頬側又は舌下投与には、本組成物は、従来法で製剤できる錠剤又はトローチ剤の形で投与できる。 If desired, the pharmaceutical composition may also be formulated in the form of suppositories or pessaries, topically in the form of lotions, solutions, creams, ointments or sprays, using skin patches, such as starch or lactose. In the form of tablets, or capsules or eggs, containing the agent, orally or in admixture with excipients, or in the form of elixirs, solutions or suspensions containing flavoring or coloring agents. They can be administered or they can be injected parenterally, for example, intracavernosally, intravenously or subcutaneously. For parenteral administration, the composition may be best used in the form of a sterile aqueous solution which may contain other substances, for example, enough salts or monosaccharides to make the solution isotonic with blood. . For buccal or sublingual administration, the compositions can be administered in the form of tablets or lozenges that can be formulated in conventional manner.

本発明の組成物を徐放性製剤で投与することも可能である。 It is also possible to administer the composition of the present invention in a sustained release formulation.

ポックスウイルス増殖法
野生型及び組換えポックスウイルスを培養ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でｉｎｖｉｔｒｏで増殖させることは公知である。驚くべきことに、本発明者らは、非培養ＣＥＦを用いることによって、アビポックスウイルスについて、プラーク形成及びウイルス収率の大幅な改善を得ることができるということを見出した。 Poxvirus propagation method It is known to propagate wild-type and recombinant poxviruses in vitro in cultured chicken embryo fibroblasts (CEF). Surprisingly, the inventors have found that a significant improvement in plaque formation and virus yield can be obtained for avipoxviruses by using uncultured CEF.

本発明は、アビポックスウウイルスを増殖させるための非培養ＣＥＦ細胞の使用を提供する。 The present invention provides the use of uncultured CEF cells to propagate avipox virus.

アビポックスウイルスは鶏痘ウイルス、特に、本発明の第１の態様の鶏痘ゲノムを含むものであることが好ましい。 The avipox virus is preferably a fowlpox virus, particularly one containing the fowlpox genome of the first aspect of the present invention.

用語「非培養」とは、細胞が培養において何らかの有意な程度まで増殖する前に用いられることを示すよう用いられる。細胞が集団中の細胞数が二倍になるには不十分な時間の間培養されていることが好ましい。 The term “uncultured” is used to indicate that the cells are used before they grow to some significant degree in culture. It is preferred that the cells have been cultured for a time that is insufficient to double the number of cells in the population.

定期的に継代し増殖培地を補充することによって、一次培養ＣＥＦ細胞を最大１ヶ月間維持することは通常の手順である。本発明の非培養ＣＥＦ細胞は継代せずに用いられなければならない。 It is normal procedure to maintain primary cultured CEF cells for up to 1 month by periodically passaged and supplemented with growth medium. The uncultured CEF cells of the present invention must be used without passage.

一次非培養ＣＥＦは、新しく調製したＣＥＦを、増殖させずにコンフルエント単層とするのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって得ることができる。次いで、プレートを、プレーティングしてから２４時間以内に用いることが好ましい。 Primary uncultured CEF can be obtained by placing freshly prepared CEF in a tissue culture dish at a concentration sufficient to produce a confluent monolayer without growth. The plate is then preferably used within 24 hours of plating.

本発明を、単に例示目的で、以下の実施例でさらに記載する。 The invention will be further described in the following examples, for purposes of illustration only.

鶏痘株ＦＰ９の産生及び特性決定
鶏痘ＦＰ９は、病原性野生型鶏痘ＨＰ−１株から、組織培養でニワトリ胚線維芽細胞によって４３８回継代することによって得（Ｍａｙｒ及びＭａｌｉｃｋｉ（１９６６）ＺｅｎｔｒａｌｂｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ１３１〜３頁）、次いで、プラーク精製した。 Production and characterization of fowlpox strain FP9 Fowlpox FP9 was obtained from pathogenic wild type fowlpox HP-1 strain by passage 438 times with chicken embryo fibroblasts in tissue culture (Mayr and Malicki (1966)). Zentralbl Veterinarmed 13 pages 1-3) and then plaque purified.

Ｆｐ９のゲノムは十分に配列決定されており（配列番号１）、注解されている（図１）。ＦＰ９は、ＲＥＶプロウイルスを含まない。ＦＰ９のゲノムは２６６ｋｂｐで、ＦＰＶ−Ｍの推定される大きさ（３００ｋｂｐより大きい）よりも幾分か小さい。 The genome of Fp9 has been well sequenced (SEQ ID NO: 1) and has been commented (FIG. 1). FP9 does not contain the REV provirus. The genome of FP9 is 266 kbp, somewhat smaller than the estimated size of FPV-M (greater than 300 kbp).

組換えＦＰ９及びＦＰＶ−Ｍによって生起される免疫応答の比較
組換えＦＰ９が、組換え抗原に対するＴ細胞応答を生起するその能力においてＦＰＶ−Ｍに対して優れているかどうかを調べるために、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲の表面タンパク質（ＰｂＣＳＰ）を、相同組換えによって、両ウイルスのゲノムの末端６．８ｋｂｐＢａｍＨＩ断片（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ａ、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７１、６２１〜８頁、Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ｂ、ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２３、３０５〜１６頁、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８９、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ７０、１４５〜５４頁）に挿入した（Ｑｕｉｎｇｚｈｏｎｇら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ１２、５６９〜７３頁）。両組換えウイルスでは、ワクシニアｐ７．５初期−後期プロモーターを用いて挿入した遺伝子を発現させた。ＰｂＣＳＰタンパク質は、Ｈ−２Ｋ^ｄ拘束性９アミノ酸ペプチドのエピトープを含み、これはＢａｌｂ／ｃマウスでは肝臓段階のネズミマラリア原虫感染に対して保護的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導できる（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら、１９９８、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２８、４３４５〜５５頁、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８、ＮａｔＭｅｄ４、３９７〜４０２頁）。驚くべきことに、ＰｂＣＳＰ遺伝子をコードするＦＰ９（ＦＰ９ＰｂＣＳＰ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＣＳＰ遺伝子をコードするＦＰＶ−Ｍ（ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ）によって生起されたものよりもかなり高いＣＤ８＋媒介性Ｔ細胞応答を生起した。ただし、両ウイルスともウイルス抗原に対してかなりのＴ細胞応答を誘導した。（図３）。 Comparison of immune responses generated by recombinant FP9 and FPV-M To investigate whether recombinant FP9 is superior to FPV-M in its ability to generate T cell responses to recombinant antigens, murine malaria The surface protein around the protozoan sporozoite (PbCSP) was subjected to homologous recombination by terminal 6.8 kbp BamHI fragments of both viruses (Boursnell et al., 1990a, J Gen Virol 71, 621-8, Boursnell et al., 1990b, Vet Microbiol 23 305-16, Campbell et al., 1989, J Gen Virol 70, pages 145-54) (Quingzhong et al., 1994, Vaccine 12, pages 569-73). In both recombinant viruses, the inserted gene was expressed using the vaccinia p7.5 early-late promoter. The PbCSP protein contains an epitope of an H-2K ^d- restricted 9 amino acid peptide that can induce a protective CD8 + T cell response against liver stage murine malaria parasite infection in Balb / c mice (Plebanski et al., 1998, Eur J Immunol 28, 4345-55, Schneider et al., 1998, Nat Med 4, 397-402). Surprisingly, FP9 encoding the PbCSP gene (FP9PbCSP) is significantly higher in Balb / c mice than the CD8 + -mediated T cell response generated by FPV-M encoding the CSP gene (FPV-MPbCSP). Was born. However, both viruses induced a significant T cell response to the viral antigen. (Figure 3).

方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０^６ＰＦＵのＦＰ９又はＦＰＶ−Ｍ単独又はネズミマラリア原虫ＣＳＰ（ＰｂＣＳＰ）を発現するものを用いて静脈内注射により免疫化した。免疫化の７日後、脾細胞において生起されたＴ細胞免疫応答を、ＩＦＮγＥＬＳＰＯＴアッセイを用いて測定した。組換え抗原、ＰｂＣＳＰに対する応答を、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐｂ９エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）を用いて測定した。陽性対照として、全ウイルスに対するＴ細胞応答を、免疫脾細胞を鶏痘ウイルスに感染したものに曝露することによって測定した。図１のカラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり４個体のマウスの平均の標準誤差を表す。 Methods Female Balb / c mice were immunized by intravenous injection with 1 × 10 ⁶ PFU of FP9 or FPV-M alone or those expressing murine malaria parasite CSP (PbCSP). Seven days after immunization, T cell immune responses elicited in splenocytes were measured using the IFNγ ELSPOT assay. Response to the recombinant antigen, PbCSP, was measured using the MHC class I restricted Pb9 epitope (recognized by CD8 + T cells). As a positive control, T cell responses to whole virus were measured by exposing immune splenocytes to those infected with fowlpox virus. The column in FIG. 1 represents the average standard error of 4 mice / mean IFN-γ spot forming cells (SFC) ± group per million splenocytes.

ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いるプライム−ブースト免疫化レジメン及びネズミマラリア原虫に対する保護的免疫応答の誘導
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＦＰ９ＰｂＣＳＰによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ＤＮＡワクチン及びＰｂＣＳＰ抗原をコードするＭＶＡによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答との比較（図４）により、組換えＦＰ９によって生起された応答は、組換えＭＶＡによって生起されたものよりも低いが、ＤＮＡワクチンによって生起されたものよりもかなり高いということが示された。それにもかかわらず、ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、ＤＮＡワクチンによって初回抗原刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を追加免疫し、並びに、ＭＶＡＰｂＣＳＰと組合せて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として作用した（図５）。注目に値すべきことに、ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いる初回抗原刺激と、それに続くＭＶＡＰｂＣＳＰを用いる追加免疫は、その他の同種又は異種プライム−ブースト免疫化レジメンよりも相当に高レベルの、ネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いたチャレンジからの保護を誘導した。 Induction of a prime-boost immunization regimen using FP9PbCSP and a protective immune response against murine malaria parasites CD8 + T cell responses generated by FP9PbCSP and CD8 + T generated by MVA encoding DNA vaccine and PbCSP antigen in Balb / c mice Comparison with the cellular response (Figure 4) shows that the response produced by recombinant FP9 is lower than that produced by recombinant MVA, but significantly higher than that produced by DNA vaccines. It was. Nevertheless, FP9PbCSP boosted the CD8 + T cell response primed with the DNA vaccine and acted as a prime or booster in combination with MVAPbCSP (FIG. 5). Notably, priming with FP9PbCSP followed by booster with MVAPbCSP uses a much higher level of murine malaria parasite sporozoites than other homologous or heterologous prime-boost immunization regimens. Induced protection from the challenge.

方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０^６ＰＦＵのＦＰ９ＰｂＣＳＰ（ＦＰ９）又はＭＶＡＰｂＣＳＰ（ＭＶＡ）を用いて静脈内注射により、又は５０μｇのｐＳＧ２ＰｂＣＳＰ（ＤＮＡ）を用いて筋内注射により免疫化し、２週間後、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ又はＭＶＡＰｂＣＳＰのいずれかを用いて追加免疫した。ＰｂＣＳＰに対する応答を、追加免疫の１４日後にＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐｂ９エピトープを用いて測定した。カラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。 Methods Female Balb / c mice are immunized by intravenous injection with 1 × 10 ⁶ PFU of FP9PbCSP (FP9) or MVAPbCSP (MVA) or by intramuscular injection with 50 μg of pSG2PbCSP (DNA) for 2 weeks Later, booster immunization was performed using either FP9PbCSP or MVAPbCSP. Responses to PbCSP were measured in the IFNγ ELISPOT assay 14 days after boost using the MHC class I restricted Pb9 epitope. Columns represent mean standard error of mean IFNγ spot forming cells per million splenocytes (SFC) ± 3 mice per group.

追加免疫の２週間後、動物を２０００個のネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いて静脈注射によってチャレンジし、続いて、チャレンジ後６〜１４日、血液段階感染の間モニターした（表２）。結果は４実験を累積したものである。 Two weeks after booster, animals were challenged intravenously with 2000 murine malaria parasite sporozoites, followed by monitoring during blood stage infection 6-14 days after challenge (Table 2). Results are cumulative from 4 experiments.

種々の外来組換え抗原及びエピトープの鎖をコードするＦＰ９ウイルスの構築
ＦＰ９を組換え抗原を送達するための一般的な系として使用できることを証明するために、原核生物及び真核生物双方を起源とする全抗原をコードする遺伝子並びにポリエピトープ及びポリタンパク質融合物をコードする合成遺伝子を、相同組換えによってＦＰ９のゲノムに挿入した（表４）。これらの遺伝子は、構造が大きく異なり、種々の異なる病原体に由来する抗原をコードする。表４に列挙した各組換えＦＰ９誘導体は、高濃度までニワトリ胚線維芽細胞でｉｎｖｉｔｒｏ増殖させてあり、このことはそれらが生存可能であり、且つ、安定していることを示す。組換えウイルスのすべてで、ワクシニアｐ７．５初期−後期プロモーターを用いてコードされた抗原を発現させた。コードされた抗原は、これを調べたすべての場合で発現されることがわかった（表４）。これにはこれらの構築物のうち最大のもの、６種の融合マラリア抗原として発現されるポリタンパク質をコードする９．９ｋｂｐの合成遺伝子を含むＦＰ９Ｌ_３ＳＥＰＴＬが含まれる。 Construction of FP9 viruses encoding a variety of foreign recombinant antigens and epitope chains. To demonstrate that FP9 can be used as a general system for delivering recombinant antigens, both prokaryotic and eukaryotic sources originated. A gene encoding the entire antigen and a synthetic gene encoding a polyepitope and polyprotein fusion were inserted into the genome of FP9 by homologous recombination (Table 4). These genes vary greatly in structure and encode antigens derived from a variety of different pathogens. Each recombinant FP9 derivative listed in Table 4 has been grown in vitro in chicken embryo fibroblasts to a high concentration, indicating that they are viable and stable. All of the recombinant viruses expressed the encoded antigen using the vaccinia p7.5 early-late promoter. The encoded antigen was found to be expressed in all cases examined (Table 4). This includes the largest of these constructs, FP9L ₃ SEPTL, which contains a 9.9 kbp synthetic gene encoding a polyprotein expressed as six fusion malaria antigens.

ＦＰ９による熱帯熱マラリア原虫抗原に対するＴ細胞免疫応答の誘導
熱帯熱ＴＲＡＰ遺伝子（Ｒｏｂｓｏｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３５、７９〜８２頁）と融合している熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ由来のＴ細胞エピトープ及びＰｂ９エピトープの鎖（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９７ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５、１２８０〜４頁）を含むＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドを、ヒトにおける熱帯熱マラリアに対するワクチン接種用抗原として開発した。ＭＥＰｆＴｒａｐをコードするＦＰ９を構築し（表４）、Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施した力価試験でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生起することを示した（１０７±２０個ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個脾細胞）。 Induction of T cell immune response against P. falciparum antigen by FP9 T cell epitope and Pb9 epitope from P. falciparum CSP fused with P. falcipa TRAP gene (Robson et al., 1988, Nature 335, pages 79-82) A MEPfTrap polypeptide containing a chain of (Gilbert et al., 1997 Nat Biotechnol 15, 1280-4) was developed as a vaccination antigen against P. falciparum malaria in humans. FP9 encoding MEPfTrap was constructed (Table 4) and shown to generate a CD8 + T cell response in a titer test performed in Balb / c mice (107 ± 20 IFNγ spot forming cells / million splenocytes) .

ＦＰ９による、結核菌の抗原８５Ａに対するＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ誘導免疫応答の誘導
抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）は、結核菌由来の主要な分泌及び保護抗原である。まず、結核菌由来のＡｇ８５ＡをコードするＦＰ９によって生起された免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウスで測定した（図６）。抗原８５Ａは、２０個のアミノ酸のＨ−２^ｄＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドエピトープ（ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される）と９個のアミノ酸のＨ−２^ｄＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）とを含む（Ｈｕｙｇｅｎら、１９９４）。ＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いる免疫化によって、Ａｇ８５Ａに対するＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方が誘導され、このことは、ＦＰ９がマウスにおいて、コードされた抗原に対するＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。さらなる実験では、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓｍａｃａｑｕｅ）において、ＦＰ９Ａｇ８５Ａが、ＭＶＡ８５Ａを用いる免疫化によって誘導されたＴ細胞応答の相当な追加免疫を誘導することがわかった（図７）。 Induction of CD8 + and CD4 + T induced immune responses against Mycobacterium tuberculosis antigen 85A by FP9 Antigen 85A (Ag85A) is a major secreted and protective antigen from Mycobacterium tuberculosis. First, the immune response generated by FP9 encoding Ag85A derived from Mycobacterium tuberculosis was measured in Balb / c mice (FIG. 6). Antigen 85A is recognized by a 20 amino acid H-2 ^d MHC class II restricted peptide epitope (recognized by CD4 + T cells) and a 9 amino acid H-2 ^d MHC class I restricted epitope (CD8 + T cells). (Huygen et al., 1994). Immunization with FP9Ag85A induces both CD4 + and CD8 + T cell responses against Ag85A, indicating that FP9 induces CD4 + as well as CD8 + T cell responses against the encoded antigen in mice. In further experiments, it was found that in rhesus monkeys (Rhesus macaque) FP9Ag85A induces a significant boost of the T cell response induced by immunization with MVA85A (FIG. 7).

方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０^７ＰＦＵの結核菌由来の抗原８５Ａをコードする組換えＦＰ９（ＦＰ９Ａｇ８５Ａ）を用いて、又は比較用に、１×１０^６ＰＦＵの同一抗原をコードするＭＶＡを用いて静脈内免疫化を施した。８５Ａに対する応答を、免疫化の６日後にＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｐ１５エピトープ（ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される）及びＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐ１１エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）を用いて測定した。カラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。 Methods Female Balb / c mice were used with recombinant FP9 (FP9Ag85A) encoding antigen 85A from 1 × 10 ⁷ PFU of Mycobacterium tuberculosis (FP9Ag85A) or for comparison, MVA encoding the same antigen of 1 × 10 ⁶ PFU Was used for intravenous immunization. Responses to 85A were determined 6 days after immunization using an MHC class II restricted P15 epitope (recognized by CD4 + T cells) and an MHC class I restricted P11 epitope (recognized by CD8 + T cells) in an IFNγ ELISPOT assay. It was measured. Columns represent mean standard error of mean IFNγ spot forming cells per million splenocytes (SFC) ± 3 mice per group.

抗原８５Ａをコードする組換えＭＶＡ（ＭＶＡ８５Ａ）を用いて２回免疫化した雄のアカゲザルを、２１及び２６週後に５×１０^８ＰＦＵのＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いて追加免疫した（↓）。Ａｇ８５Ａに対する応答を、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、Ａｇ８５Ａポリペプチドのアミノ酸配列にわたるオーバーラップペプチドのプールを用いて末梢血モノヌクレオサイト（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅｓ）（ＰＢＭＣ）で測定した。曲線は、４プールのペプチドの、１００万個のＰＢＭＣ当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）を表す。 Male rhesus monkeys immunized twice with recombinant MVA encoding antigen 85A (MVA85A) were boosted with 5 × 10 ⁸ PFU of FP9Ag85A after 21 and 26 weeks (↓). Response to Ag85A was measured in peripheral blood mononucleocytes (PBMC) using an IFNγ ELISPOT assay with a pool of overlapping peptides spanning the amino acid sequence of the Ag85A polypeptide. The curve represents the mean IFNγ spot forming cells (SFC) per million PBMCs of 4 pools of peptides.

ＦＰ９及びＭＶＡは、ウイルス抗原に対する交差反応性Ｔ細胞を生起しない
様々であるが同一でないウイルスベクターを用いるプライム−ブースト免疫化が、組換え抗原に対するＴ細胞応答の増強を生起することを示唆する証拠がある（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中）。最近の証拠により、ウイルスベクターに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、初回抗原刺激剤及び追加免疫剤として同一組換えウイルスを用いる場合には、追加免疫を阻害することが示唆されている（非公開の知見、ＥｒｉｃＧ．Ｓｈｅｕ）。ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いて免疫化されたマウス由来の免疫脾細胞は、ＭＶＡに感染したナイーブ細胞に曝露した場合にはＩＦＮγを産生しないが、ＦＰ９に感染した細胞に曝露した場合には産生する（図８）。逆に、ＭＶＡＰｂＣＳＰ免疫脾細胞は、ＭＶＡに感染したナイーブ細胞を認識するがＦＰ９ではそうではない（図８）。これにもかかわらず、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ免疫脾細胞をＭＶＡＰｂＣＳＰに感染した脾細胞に曝露すると、又はその逆、ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞応答を観察することができる（図８）。合わせて考えると、これらの結果は、組換えＦＰ９及び組換えＭＶＡが、両ウイルス由来の抗原と交差反応するＴ細胞を生起することなく、コードされた抗原に対するＴ細胞応答を生起することを示す。 FP9 and MVA do not give rise to cross-reactive T cells against viral antigens Evidence suggests that prime-boost immunization with different but not identical viral vectors results in enhanced T cell responses to recombinant antigens (Gilbert et al., Vaccine, printing). Recent evidence suggests that CD8 + T cell responses to viral vectors inhibit booster immunity when using the same recombinant virus as priming and booster (unpublished findings, Eric G. Sheu). Immune splenocytes from mice immunized with FP9PbCSP do not produce IFNγ when exposed to naive cells infected with MVA, but do produce when exposed to cells infected with FP9 (FIG. 8). ). Conversely, MVAPbCSP immunized splenocytes recognize naïve cells infected with MVA but not with FP9 (FIG. 8). Nevertheless, exposure of FP9PbCSP immune splenocytes to MVAPbCSP infected splenocytes, or vice versa, an IFNγ secreting T cell response can be observed (FIG. 8). Taken together, these results indicate that recombinant FP9 and recombinant MVA generate T cell responses to the encoded antigen without generating T cells that cross-react with antigens from both viruses. .

さらなる予備的結果も、非複製カナリア痘ウイルスも、ＭＶＡと交差反応しないことが示す。したがって、一般に、アビポックスウイルス及びオルトポックスウイルスは、交差反応性Ｔ細胞を生起しない可能性があり、これにより、これらは同一のワクチン接種レジメンにおいて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として適したものとなる。 Further preliminary results indicate that neither the non-replicating canarypox virus cross-reacts with MVA. Thus, in general, avipoxviruses and orthopoxviruses may not give rise to cross-reactive T cells, which makes them suitable as priming or boosting agents in the same vaccination regimen. Become.

方法
ＥｘｖｉｖｏＩＦＮγ ｅｌｉｓｐｏｔは、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ又はＭＶＡＰｂＣＳＰのいずれかを用いる静脈内免疫化の１４日後にマウスから単離した脾細胞において、ＰｂＣＳＰ及びウイルス抗原に対して応答する。ＩＦＮγ応答は、免疫化した動物から単離した脾細胞を、Ｐｂ９ペプチドを用いてパルスしたナイーブな脾細胞又はＦＰ９、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ、ＭＶＡ又はＭＶＡＰｂＣＳＰに感染したものに曝露することによって測定した。カラム（図８）は、群当たり３個体のマウスの、１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｆｃ）の平均数±標準誤差を表す。 Methods Ex vivo IFNγ elispot responds to PbCSP and viral antigens in splenocytes isolated from mice 14 days after intravenous immunization with either FP9PbCSP or MVAPbCSP. IFNγ responses were measured by exposing splenocytes isolated from immunized animals to naive splenocytes pulsed with Pb9 peptide or infected with FP9, FP9PbCSP, MVA or MVAPbCSP. The column (FIG. 8) represents the mean number of IFNγ spot-forming cells (sfc) per million splenocytes ± standard error of 3 mice per group.

アビポックスウイルスのｉｎｖｉｔｒｏ増殖
野生型及び組換えポックスウイルスは、通常、培養ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でｉｎｖｉｔｒｏ増殖させる。本発明者らの研究室での、培養ＣＥＦ単層に感染させることによって組換えＦＰ９を増殖させる最初の試みでは、一貫性のないウイルスプラーク形成及び低いウイルス収率が認められた（表５）。対照的に、同様の培養ＣＥＦの感染後に、ＭＶＡの良好なプラーク形成及び一貫した高収率が認められた（表５）。新たに調製したＣＥＦを、増殖させずにコンフルエント単層を得るのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって、一次「非培養」ＣＥＦを得ることができる。本発明者らは、ＦＰ９及び組換えＦＰ９が、一次「非培養」ＣＥＦの単層の感染後に目に見えるウイルスプラークを形成し、ウイルスの良好な収率が得られることを見出した（表５）。同様に、本発明者らによって、一次「非培養」ＣＥＦを用いて、弱毒化カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣのプラーク形成及び高収率が得られている。 In Vitro Growth of Avipoxvirus Wild-type and recombinant poxviruses are usually grown in vitro in cultured chicken embryo fibroblasts (CEF). In our laboratory, initial attempts to propagate recombinant FP9 by infecting cultured CEF monolayers showed inconsistent virus plaque formation and low virus yield (Table 5). . In contrast, good plaque formation and consistently high yields of MVA were observed after infection with similar cultured CEF (Table 5). Primary “uncultured” CEF can be obtained by placing freshly prepared CEF in a tissue culture dish at a concentration sufficient to obtain a confluent monolayer without growth. We have found that FP9 and recombinant FP9 form visible viral plaques after infection of monolayers of primary “uncultured” CEF, resulting in good virus yields (Table 5). ). Similarly, plaque formation and high yields of attenuated canarypox virus, ALVAC have been obtained by the inventors using primary “uncultured” CEF.

これらの研究をまとめると、アビポックスウイルスは、増殖必要条件の点では、ＭＶＡ及びおそらくはその他のオルトポックスウイルスよりも選好性であるということが示唆される。理論に拘束されようとは思わないが、本発明者らは、ＣＥＦ内でのアビポックスウイルスの複製には、ＣＥＦがｉｎｖｉｔｒｏ培養されると失われる特定の宿主分子が必要であると考えている。対照的に、一般に、ＭＶＡ及びおそらくはオルトポックスウイルスは、この宿主分子を複製に必要としない。この知見の主な結果は、一次非培養ＣＥＦが、多量の組換えアビポックスウイルスの生産に必要とされることが多いということである。したがって、実際、第１相臨床試験用の組換えＦＰ９の大規模生産は、「非培養」ＣＥＦを用いてのみ達成されている。 Taken together these studies suggest that avipoxviruses are more preferential than MVA and possibly other orthopoxviruses in terms of growth requirements. Without wishing to be bound by theory, the inventors believe that avipoxvirus replication within CEF requires specific host molecules that are lost when CEF is cultured in vitro. Yes. In contrast, in general, MVA and possibly orthopoxvirus do not require this host molecule for replication. The main result of this finding is that primary uncultured CEF is often required for the production of large amounts of recombinant avipoxvirus. Thus, in fact, large-scale production of recombinant FP9 for Phase 1 clinical trials has only been achieved using “uncultured” CEF.

ヒトボランティアにおけるＦＰ９による熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する保護的免疫応答の誘導
ＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐの第１相臨床試験（実施例５参照）：
健常な成人のボランティアを、３×１０^７ＰＦＵを上回るＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐを用いて２回免疫化し、続いて、同容量のＭＶＡＭＥＰｆＴｒａｐを用いて追加免疫した。５人の免疫化したボランティアのうち２人が、病原性熱帯熱マラリア原虫マラリアに感染した雌のハマダラカ（ａｎｏｐｈｅｌｅｓｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ）に刺されることによるチャレンジから保護された。 Induction of a protective immune response against Plasmodium falciparum malaria by FP9 in human volunteers Phase 1 clinical trial of FP9MEPfTrap (see Example 5):
Healthy adult volunteers were immunized twice with more than 3 × 10 ⁷ PFU of FP9MEPfTrap, followed by boosting with the same volume of MVAMEPfTrap. Two of the five immunized volunteers were protected from the challenge of being stabbed by female anopheles stephensi mosquitoes infected with the pathogenic Plasmodium falciparum malaria.

対照的に、同一実験で、５人のマラリアナイーブなボランティアのうち４人は、熱帯熱マラリア原虫マラリアに屈した。したがって、まず、ヒトボランティアの組換え非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化により、感染性疾病に対する保護的免疫応答を生起できることを証明すること。 In contrast, in the same experiment, 4 out of 5 malaria naive volunteers succumbed to P. falciparum malaria. Therefore, first prove that heterogeneous prime-boost immunization with recombinant non-replicating virus in human volunteers can generate a protective immune response against infectious diseases.

保護は、ポックスウイルス免疫化が肝臓における熱帯熱マラリア原虫感染を防ぐことを証明する、ボランティアが血液段階マラリアを発症しないことによって測定した。 Protection was measured by volunteers not developing blood stage malaria, demonstrating that poxvirus immunization prevents P. falciparum infection in the liver.

実験ではまた、ＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドに対して生起されたＴ細胞応答によって媒介されると思われるが、保護の機序も調べている。 The experiment is also examining the mechanism of protection, which appears to be mediated by the T cell response generated against the MEPfTrap polypeptide.

マラリアが風土病である領域における臨床試験
第１相試験
組換えＦＰ９とＭＶＡとを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメンが、マラリアに曝露された集団において免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べるために、ＭＥＰｆＴｒａｐ分子をコードする構築物を用いる第１相臨床試験をガンビアで実施した。 Clinical trials in areas where malaria is endemic Phase 1 trials To determine whether a heterogeneous prime-boost immunization regimen using recombinant FP9 and MVA can boost immune responses in a population exposed to malaria A phase I clinical trial with a construct encoding a MEPfTrap molecule was conducted in Gambia.

成人ボランティア（約１２人）を、ＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐ構築物を用いて２回免疫化し、単回用量のＭＶＡＭＥＰｆＴｒａｐを用いて追加免疫した。血中Ｔ細胞及び抗体免疫応答を測定し、この研究の主な目的は、組換え非複製ポックスウイルスを用いる免疫化が、自然感染によって初回抗原刺激された既存の抗マラリア応答を追加免疫するかどうかを調べることである。 Adult volunteers (about 12) were immunized twice with the FP9MEPfTrap construct and boosted with a single dose of MVAMEPfTrap. Measure blood T cell and antibody immune responses, and the main objective of this study is whether immunization with recombinant non-replicating poxvirus boosts existing antimalarial responses primed by natural infection It is to check whether.

第２ｂ相試験
第２ｂ相試験はガンビア人の成人で、同一免疫化レジメンを用いて実施されている。 Phase 2b study The Phase 2b study is conducted in Gambian adults using the same immunization regimen.

ボランティアは、マラリアシーズン（６月〜１２月）にわたって実施される試験の過程のあいだ、免疫応答の増強及び血液段階感染の証拠についてモニターされている。 Volunteers are monitored for enhanced immune response and evidence of blood stage infection during the course of the trial conducted over the malaria season (June-December).

さらなる試験
さらなる第１相試験も、結核菌及びＨＩＶに対してワクチン接種するために適当な組換えＦＰ９及びＭＶＡを用いて、ガンビアで２００２年の間実施されている。両試験は、それぞれの病原体に感染しているボランティアを用いて実施され、ＦＰ９及び２種の非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメン双方の、治療用ワクチンとして働く能力を評価している。 Further trials Further phase I trials have also been carried out in Gambia for 2002 using appropriate recombinant FP9 and MVA to vaccinate against M. tuberculosis and HIV. Both studies are conducted with volunteers infected with their respective pathogens and assess the ability of both FP9 and heterologous prime-boost immunization regimens using two non-replicating viruses to serve as therapeutic vaccines. .

このようにして、本発明のワクチン接種が保護的応答を生じさせ、且つ／又は増強することが証明される。 In this way it is demonstrated that the vaccination according to the invention produces and / or enhances a protective response.

非複製組換えポックスウイルスを用いる、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激されたＡｇ８５Ａに対するＴ細胞応答の追加免疫
ウシ結核菌ＢＣＧは、結核菌によって起こる結核に対するワクチンとして発展途上国中で子供に広く投与されている。重症幼児期型の結核に対して有効であるが、成人型の疾病に対するウシ結核菌ＢＣＧの保護的効力はかなり可変性であり、時間が経つと薄れると考えられている。Ａｇ８５Ａはウシ結核菌ＢＣＧ及び結核菌双方の主要な分泌抗原であるので、ウシ結核菌ＢＣＧ免疫化によってＡｇ８５Ａに対して生起された免疫応答を追加免疫することは、このワクチンの成人結核に対する保護的効力を増強するための確かな戦略である。この戦略は、他者によってマウスモデルにおいて、組換えＡｇ８５Ａタンパク質を用いて（Ｂｒｏｏｋｓら、２００１ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６９、２７１４〜７頁）又はこの抗原をコードするＤＮＡワクチンを用いて（Ｔａｎｇｈｅら、２００１ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６９、３０４１〜７頁）追加免疫することによって実施されている。 Booster T-cell response to Ag85A primed with Mycobacterium bovis BCG using non-replicating recombinant poxvirus. Mycobacterium bovine BCG is widely administered to children in developing countries as a vaccine against tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis. Has been. Although effective against severe infantile tuberculosis, the protective efficacy of Mycobacterium bovis BCG against adult-type disease is quite variable and is thought to fade over time. Since Ag85A is the major secreted antigen of both Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium tuberculosis, boosting the immune response raised against Ag85A by Mycobacterium bovis BCG immunization is protective against adult tuberculosis of this vaccine. It is a solid strategy to increase efficacy. This strategy is used by others in the mouse model using recombinant Ag85A protein (Brooks et al., 2001 Infect Immun 69, pages 2714-7) or using a DNA vaccine encoding this antigen (Tanghe et al., 2001 Infect Immun. 69, pages 3041 to 7).

ＦＰ９Ａｇ８５Ａは、ＭＶＡ８５Ａを用いた免疫化によって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるという知見に基づいて、本発明らは、ポックスウイルス構築物が、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べようとした。Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施した予備実験では、ウシ結核菌ＢＣＧを用いた免疫化によって初回抗原刺激されたＡｇ８５ＡＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方とも追加免疫できることが示された（図９）。アカゲザルを用いて実施したさらなる実験によって、皮内又はエアゾール経路のいずれかによるウシ結核菌ＢＣＧを用いた免疫化が、Ａｇ８５Ａに対するＴ細胞応答を誘導することが示された。ウシ結核菌ＢＣＧの投与後早期にＭＶＡ８５Ａを用いて追加免疫することにより、ＰＰＤ及びＡｇ８５Ａタンパク質に対する免疫応答の、可変性で短命の増強が生起された。しかし、ＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いたその後の追加免疫は、これらのタンパク質に対する（図１０）、並びにＡｇ８５Ａタンパク質配列にわたるペプチドプールに対するＴ細胞免疫応答を大きく増強した。さらなる実験は、免疫化された動物において生起されたＴ細胞応答の性質及び位置を測定する。 Based on the finding that FP9Ag85A can be boosted with an immune response primed by immunization with MVA85A, the present inventors have developed An attempt was made to determine whether booster immunization was possible. Preliminary experiments conducted in Balb / c mice showed that both Ag85A CD4 + and CD8 + T cell responses primed by immunization with Mycobacterium bovis BCG can be boosted (FIG. 9). Further experiments conducted with rhesus monkeys showed that immunization with M. bovine BCG by either intradermal or aerosol routes induced a T cell response to Ag85A. Boosting with MVA85A early after administration of Mycobacterium bovis BCG resulted in a variable and short-lived enhancement of the immune response to PPD and Ag85A proteins. However, subsequent boosts with FP9Ag85A greatly enhanced the T cell immune response against these proteins (FIG. 10) as well as against the peptide pool across the Ag85A protein sequence. Further experiments measure the nature and location of T cell responses generated in immunized animals.

これらの実験は、マウスにおいて及び霊長類において、非複製ウイルスを、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫するために使用できるという第１の例を提供する。さらに、それらにより、非複製ポックスウイルスは、ヒトにおいて結核筋による持続性潜在性感染症に対する治療用ワクチンとして有効であり得るという概念が確立される。 These experiments provide a first example that non-replicating viruses can be used in mice and in primates to boost an immune response primed with Mycobacterium bovis BCG. Furthermore, they establish the concept that non-replicating poxviruses can be effective as therapeutic vaccines for persistent latent infections caused by tuberculosis muscle in humans.

方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスをウシ結核菌ＢＣＧを用いて皮内（ｉ．ｄ．）で免疫化し、１２週後に１×１０^６ＰＦＵのＭＶＡ８５Ａを用いて皮内で追加免疫した。対照動物はウシ結核菌ＢＣＧ又はＭＶＡ８５Ａ単独を用いて免疫化した。Ｔ細胞免疫応答は、免疫化の１２日後にＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＰ１５（ＣＤ４＋）及びＰ１１（ＣＤ８＋）エピトープを用いて、ＰＰＤ及びＡｇ８５Ａに対して測定した。カラム（図９）は、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。 Methods Balb / c mice were immunized intradermally (id) with Mycobacterium bovis BCG and boosted intradermally with 1 × 10 ⁶ PFU of MVA85A 12 weeks later. Control animals were immunized with M. bovine BCG or MVA85A alone. T cell immune responses were measured against PPD and Ag85A 12 days after immunization using P15 (CD4 +) and P11 (CD8 +) epitopes in an IFNγ ELISPOT assay. The column (FIG. 9) represents the mean standard error of the mean IFNγ spot forming cells (SFC) per million splenocytes ± 3 mice per group.

雄のアカゲザルを、ＢＣＧを用いて皮内又はエアゾール送達のいずれかで免疫化し、５×１０^８ＰＦＵの組換えＭＶＡ８５Ａを用いて２回及び５×１０^８ＰＦＵのＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いて２回追加免疫した。Ａｇ８５Ａに対する応答を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、精製Ａｇ８５Ａ、組換えＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ａと約８０％の相同性を共有する）又は結核菌由来の精製タンパク質（ＰＰＤ）を用いて末梢血モノヌクレオサイト（ＰＢＭＣ）で測定した。曲線（図１０）は、単一の動物の１００万個のＰＢＭＣ当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）を表す。 Male rhesus monkeys are immunized with either BCG, either intradermally or by aerosol delivery, and boosted twice with 5 × 10 ⁸ PFU of recombinant MVA85A and twice with 5 × 10 ⁸ PFU of FP9Ag85A. did. Responses to Ag85A were measured in peripheral blood mononucleocytes (PBMC) using purified Ag85A, recombinant Ag85B (which shares about 80% homology with Ag85A) or purified protein from Mycobacterium tuberculosis (PPD) in an IFNγ ELISPOT assay. It was measured. The curve (FIG. 10) represents IFNγ spot-forming cells (SFC) per million PBMC of a single animal.

鶏痘は有効なブーストである
３人の健常なマラリアナイーブなヒトボランティアを以下の通りに免疫化した：
０週に２ｍｇのＤＮＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ筋内、
３週（２１日目）に再度２ｍｇの同一ワクチン筋内、
７週に１×１０^８ｐｆｕのＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰ皮内、及び
１１週に１．５×１０^８ｐｆｕのＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ皮内。 Fowlpox is an effective boost Three healthy malaria naive human volunteers were immunized as follows:
2 mg DNA-ME. TRAP muscle,
Again in 3 weeks (day 21) 2 mg of the same vaccine muscle,
1 × 10 ⁸ pfu of FP9-ME. TRAP intradermally and 1.5 × 10 ⁸ pfu of MVA-ME. TRAP intradermal.

ＰＢＭＣにおいてＥＬＩＳＰＯＴによって測定された平均応答を図１１に示す。 The average response measured by ELISPOT in PBMC is shown in FIG.

ＭＥ応答は、大部分はＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対するものである。Ｔ９９６応答はＴＲＡＰの同種株に対するものであり、３Ｄ７応答はＴＲＡＰの異種株に対するものである。 The ME response is largely to CD8 T cell epitopes. The T996 response is for a homologous strain of TRAP and the 3D7 response is for a heterologous strain of TRAP.

ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰがＤＮＡによって初回抗原刺激されたＴ細胞応答を追加免疫することは明らかである。ＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰを用いたさらなる免疫化が、ＤＤＦレジメンによって誘導された応答を増強することも明らかである。 FP9-ME. It is clear that TRAP boosts T cell responses primed with DNA. MVA-ME. It is also clear that further immunization with TRAP enhances the response induced by the DDF regimen.

ＦＰ９が、ヒト霊長類においてＴ細胞応答に対する有効なブーストを提供することもさらに証明される。 It is further demonstrated that FP9 provides an effective boost to T cell responses in human primates.

ヒト霊長類におけるＤＮＡ、次いでＦＰ９、次いでＭＶＡを用いる三重免疫化レジメン（ＤＤＦＭ）の有効性もまた証明される。 The effectiveness of triple immunization regimes (DDFM) using DNA, then FP9, then MVA in human primates is also demonstrated.

鶏痘は有効なプライムである
マラリアナイーブなヒトボランティアを、ＦＰ９−ＭＶＡプライム−ブーストレジメンを用いて以下の通りに免疫化した：
この実施例では、２つのコホートがあり、一方は５人のワクチン接種された人であり、もう一方は１２人のワクチン接種された人である。 Fowlpox is an effective prime Malaria naive human volunteers were immunized with the FP9-MVA prime-boost regimen as follows:
In this example, there are two cohorts, one is 5 vaccinated people and the other is 12 vaccinated people.

ＦＦＭレジメン
０日目に、ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰを１×１０^８ｐｆｕで皮内投与した
２１日目に、ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰを１×１０^８ｐｆｕで皮内投与した
４９日目に、ＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰを１．５×１０^８ｐｆｕの用量で皮内投与した。 FFM regimen On day 0, FP9-ME. On day 21 after intradermal administration of TRAP at 1 × 10 ⁸ pfu, FP9-ME. On day 49 when TRAP was administered intradermally at 1 × 10 ⁸ pfu, MVA-ME. TRAP was administered intradermally at a dose of 1.5 × 10 ⁸ pfu.

すべてのボランティア及び非ワクチン接種対照を、感染性蚊が刺すことによって３Ｄ７株熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを投与してチャレンジした。 All volunteers and non-vaccinated controls were challenged with 3D7 strain P. falciparum sporozoite by biting infectious mosquitoes.

第１のコホートでは、２／５のＦＦＭワクチン接種された人が感染から十分に保護された。このレベルの保護は、種々の時点で同様にチャレンジされた２４プールの非ワクチン接種対照とは有意に異なり（Ｐ＜０．０５、カイ二乗検定）、すべての対照が感染した。 In the first cohort, 2/5 FFM vaccinated people were well protected from infection. This level of protection was significantly different from 24 pools of non-vaccinated controls that were similarly challenged at various time points (P <0.05, chi-square test) and all controls were infected.

保護された、２人のワクチン接種された人が６ヶ月後に再チャレンジされたが、１人は依然として十分に保護されていた。 Two protected, vaccinated people were re-challenge after six months, but one was still well protected.

第２のコホートでは１１人のボランティアが同じようにチャレンジされたが、これらのワクチンにより、パテントマラリア寄生虫血症が対照ワクチンよりもかなり遅くに発生した（Ｐ＜０．０５）。 In the second cohort, 11 volunteers were similarly challenged, but with these vaccines, patent malaria parasitemia occurred significantly later than the control vaccine (P <0.05).

図１２は、寄生虫は末梢血中では４８時間毎に８倍に増殖すると仮定して算出した、ワクチン接種に起因する肝臓段階寄生虫の減少を示す。「後期ＦＦＭ」群は、２人の再チャレンジを受けた人（前記参照）を表し、さらなるボランティアはまず、ワクチン接種の５ヶ月後にチャレンジされた（ＦＦＭ群は最後のワクチン接種の１３〜５０日後にチャレンジされた）。 FIG. 12 shows the reduction in liver stage parasites due to vaccination, calculated assuming that the parasites grow 8 times in the peripheral blood every 48 hours. The “late FFM” group represents 2 re-challenges (see above), with additional volunteers first challenged 5 months after vaccination (FFM group 13-50 days after last vaccination). Later challenged).

ＦＰ９を用いる単回の初回抗原刺激免疫化のみを投与された４人のワクチン接種を受けた人（「ＦＭ」）の結果も示す。ワクチン及び非ワクチン接種チャレンジ対照における、寄生虫血症に対する時間のログランク検定カプランマイヤー解析から危険率有意水準を算出する。 Also shown are the results of 4 vaccinated people (“FM”) who received only a single priming immunization with FP9. Risk level significance level is calculated from Kaplan-Meier analysis of log rank test of time for parasitemia in vaccine and non-vaccinated challenge controls.

全体として、ＦＦＭワクチンでは、対照と比べて高度に有意な保護が認められた（Ｐ＜０．０１）。 Overall, the FFM vaccine showed a highly significant protection compared to the control (P <0.01).

ＤＤＭＦレジメン（４週間間隔で２ｍｇ筋内の２回のＤＮＡ投与と、それに続く３〜４週間後の１．５×１０^８ＭＶＡＭＥ．ＴＲＡＰと、それに続く３〜４週間後の１．０×１０^８ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰ）を用いて免疫化した４人の個人もまた、有意に保護された（Ｐ＜０．０５）。 DDMF regimen (2 weeks intramuscular DNA administration at 4 week intervals followed by 1.5 × 10 ⁸ MVA ME.TRAP after 3-4 weeks followed by 1.0 × after 3-4 weeks Four individuals immunized with 10 ⁸ FP9-ME.TRAP) were also significantly protected (P <0.05).

したがって、ＦＰ９などの鶏痘は、本発明の方法において有効なプライム並びに有効なブーストであるということが証明される。 Thus, fowlpox such as FP9 proves to be an effective prime as well as an effective boost in the method of the present invention.

高用量免疫化レジメンの臨床試験
高用量プライム−ブーストレジメンを、マラリア感染に長期間曝露されていた地方のガンビア人の成人男性で調べた。 High-dose immunization regimen clinical trial A high-dose prime-boost regimen was examined in a local Gambian adult male who had been exposed to malaria infection for a long time.

２８人の被験者をＭＥ．ＴＲＡＰワクチンを用いて、以下に示したレジメンの一方に従って免疫化した（群当たり１４人の被験者／レジメン）：
１）ＤＤＭレジメン
３〜４週間隔で２回（ＤＤＭ）又は３回（ＤＤＤＭ）投与するＤＮＡ（２ｍｇ筋内）と、それに続くＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ１．５×１０^８皮内（ＤＤＭ群−図１３ではＤＤＭ及びＤＤＤＭワクチン亜群は、これらの間に有意差がないのでまとめられている） 28 subjects were treated with ME. The TRAP vaccine was used to immunize according to one of the regimes shown below (14 subjects / regime per group):
1) DDM regimen DNA (2 mg intramuscularly) administered twice (DDM) or 3 times (DDDM) at 3-4 week intervals, followed by MVA-ME. TRAP1.5 × 10 ⁸ intradermal (DDM group—in FIG. 13, DDM and DDDM vaccine subgroups are grouped together because there is no significant difference between them)

２）ＦＦＭレジメン
３週間隔で２回投与するＦＰ９（１×１０^８皮内）と、それに続くＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ１．５×１０^８皮内（ＦＦＭ群）。 2) FFM regimen FP9 (1 × 10 ⁸ intradermal) administered twice at 3-week intervals, followed by MVA-ME. TRAP1.5 × 10 ⁸ intradermal (FFM group).

データは図１３に示されている。 The data is shown in FIG.

両群とも、ワクチン接種の前にマラリアＭＥ．ＴＲＡＰインサートに対してＴ細胞応答を示した。これらの応答は、ＤＮＡ免疫化よりもＦＰ９免疫化によって追加免疫され（ＤＤ＋７日とＦＦ＋７日を比較）、このことは、ＦＰ９免疫化がヒト霊長類において自然に初回抗原刺激されたＴ細胞応答を追加免疫することを示す。 In both groups, malaria ME. A T cell response was shown to the TRAP insert. These responses were boosted by FP9 immunization rather than DNA immunization (compare DD + 7 and FF + 7), which suggests that FP9 immunization is a naturally primed T cell response in human primates. Indicates boosting.

ＤＤＭとＦＦＭレジメンは双方とも、マラリアに自然に曝露されているこれらのボランティア被験体において高レベル（＞２５０／１００万個）Ｔ細胞応答を誘導した。 Both DDM and FFM regimens induced high levels (> 250/1 million) T cell responses in these volunteer subjects that were naturally exposed to malaria.

プライム−ブーストレジメン（ＤＤＭ及びＦＦＭ）は、これらの個体におけるＴ細胞応答が自然マラリア感染によって初回抗原刺激されていても、ＦＰ９単独及びＭＶＡ単独よりも免疫原性であるということが証明される。 Prime-boost regimens (DDM and FFM) prove to be more immunogenic than FP9 alone and MVA alone, even though the T cell response in these individuals is primed by spontaneous malaria infection.

誘導された応答は、良好なマラリア株交差反応性を示す−ＴＲＡＰのワクチン株（Ｔ９９６）と３Ｄ７非ワクチン株に対する応答の大きさは同等であることも証明される。 The induced response shows good malaria strain cross-reactivity—it is also demonstrated that the magnitude of the response to the TRAP vaccine strain (T996) and the 3D7 non-vaccine strain are comparable.

同一ＦＦＭレジメンを用いて免疫化した１１人のヒト霊長類ボランティアにおいて同程度の免疫原性が認められた（図１４参照）。 Similar immunogenicity was observed in 11 human primate volunteers immunized with the same FFM regimen (see FIG. 14).

したがって、本発明による被験者の処置によって、被験者に保護的免疫応答が生じることが証明される。 Thus, treatment of a subject according to the present invention demonstrates that a protective immune response is produced in the subject.

霊長類におけるＴＢ抗原に対する免疫化
結核に対するプライム−ブースト免疫化の潜在的に可能な保護効力を評価するために、以下の研究では、霊長類において組換えＦＰ９を追加免疫剤として使用することを実施した。 Immunization against TB antigen in primates To assess the potential protective efficacy of prime-boost immunization against tuberculosis, the following study conducted the use of recombinant FP9 as a booster in primates did.

この実施例では、霊長類は、マカク属のサル、天然に結核菌に対して感受性のある動物である。 In this example, the primate is a macaque monkey, an animal that is naturally sensitive to Mycobacterium tuberculosis.

オランダの生物医学霊長類センター（ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｐｒｉｍａｔｅｃｅｎｔｒｅ）（ＢＰＲＣ）で３個体のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓｍａｃａｑｕｅｓ）を、ＢＣＧを用いて皮内で免疫化し、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａを８週間後に皮内投与し、さらに４週間後にＦＰ９−Ａｇ８５Ａを皮内投与した。対応する３個体の他のマカク属のサルは、ＢＣＧ単独を用いて免疫化した。最終免疫化の４週間後、これらすべてのマカク属のサル及び免疫化していないマカク属のサルを、結核菌の多量気管内投与（１０００ＣＦＵ）でチャレンジした。動物は２８週間観察し、イムノアッセイを実施し、動物をチャレンジ後２８週で犠牲にし、剖検を実施した。 Three cynomolgus macaques were immunized intradermally using BCG at the biomedical primate center (BPRC) in the Netherlands, and MVA-Ag85A was administered intradermally after 8 weeks. Weekly, FP9-Ag85A was administered intradermally. The corresponding three other macaque monkeys were immunized with BCG alone. Four weeks after the final immunization, all these macaque monkeys and non-immunized macaque monkeys were challenged with a multitracheal dose of Mycobacterium tuberculosis (1000 CFU). Animals were observed for 28 weeks, immunoassays were performed, animals were sacrificed 28 weeks after challenge, and necropsy was performed.

剖検時に、免疫化していないマカク属のサルはすべて、結核の巨視的証拠があり、１／３のＢＣＧを用いて免疫化したマカク属のサルには結核の巨視的証拠がなく、２／３のＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化したマカク属のサルには結核の証拠がなかった。 All macaque monkeys that were not immunized at necropsy had macroscopic evidence of tuberculosis, and macaque monkeys immunized with 1/3 BCG had no macroscopic evidence of tuberculosis. There was no evidence of tuberculosis in macaque monkeys immunized with BCG-MVA-FP9.

ＰＰＤ及びＥＳＡＴ−６を放線菌抗原として用いるチャレンジ後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化した動物において、チャレンジ対照よりもかなり低い応答が示された。 A post-challenge ELISPOT assay using PPD and ESAT-6 as actinomycete antigens showed a significantly lower response in animals immunized with BCG-MVA-FP9 than challenge controls.

ＰＰＤを放線菌抗原として用いるチャレンジ後インターフェロンγＥＬＩＳＡアッセイにより、ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化した動物において、ＢＣＧ単独で、又はアジュバント単独（対照動物）で免疫化したチャレンジ対照よりもかなり低い応答が示され、このことは、これらのＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９プライム−ブーストされたマカク属のサルは、結核から極めて大きく保護されたという考えをサポートするものである（図１８）。図は、カニクイザルの気管内結核菌チャレンジ後種々の週でのＰＰＤに対する平均インターフェロンγ応答を示す。ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９動物は、ＰＰＤに対して最低の免疫応答を有し、このことにより、チャレンジ後の最小の結核菌複製、ひいては最大度の保護が示される。ＥＳＡＴ６を抗原として同様のデータを得た。 Responses in animals immunized with BCG-MVA-FP9 by post-challenge interferon γ ELISA assay using PPD as actinomycete antigen are much lower than challenge controls immunized with BCG alone or adjuvant alone (control animals) This supports the idea that these BCG-MVA-FP9 prime-boosted macaque monkeys were greatly protected from tuberculosis (FIG. 18). The figure shows the mean interferon gamma response to PPD at various weeks after cynomolgus monkey endotracheal tuberculosis challenge. BCG-MVA-FP9 animals have the lowest immune response to PPD, which indicates minimal Mycobacterium tuberculosis replication and thus the greatest protection after challenge. Similar data were obtained with ESAT6 as the antigen.

したがって、本発明に従ってプライム−ブースト免疫化されたマカク属のサルなどの霊長類は、結核から極めて大きく保護されていることが証明される。 Thus, primates such as macaque monkeys prime-boost immunized according to the present invention prove to be extremely protected from tuberculosis.

ＦＰ９株は、ＣＤ８Ｔ細胞応答の初回抗原刺激及び追加免疫では、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）のＦＰＶ−Ｍより強力である。 The FP9 strain is more potent than Webster's FPV-M in priming and boosting CD8 T cell responses.

目的：ＦＰ９ＰｂＣＳＰが、ＭＶＡＰｂＣＳＰと臨床上関連のある経路によって、プライム／ブーストレジメンで投与された場合に、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰと比べて抗原特異的Ｔ細胞応答の増強を生起するかどうかを調べること。 Objective: To investigate whether FP9PbCSP causes enhanced antigen-specific T cell responses compared to FPV-MPbCSP when administered in a prime / boost regimen by a route clinically relevant to MVAPbCSP.

方法
雌のＢＡＬＢ／ｃ（６〜８週齢）を、ＦＰＰｂＣＳＰ、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ又はＭＶＡＰｂＣＳＰを用いて皮内で免疫化し、２週間後に同様の方法で追加免疫した。ウイルスは発熱物質を含まないＰＢＳで２×１０^７ＰＦＵ／ｍｌに希釈し、本願の実施例１及び２に記載したように特性決定し、２５ｕｌをマウスの各耳に両側注射することによって皮内投与した。免疫化の１４日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＰｂＣＳＰのＰｂ９エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、以下に記載したようにＩＦＮγアッセイを用いて測定した。 Methods Female BALB / c (6-8 weeks old) were immunized intradermally using FPPbCSP, FPV-MPbCSP or MVA PbCSP and boosted in the same manner 2 weeks later. Virus was diluted to 2 × 10 ⁷ PFU / ml with PBS without pyrogen, characterized as described in Examples 1 and 2 of this application, and intradermally injected by bilateral injection of 25 ul into each ear of mice. Administered. Fourteen days after immunization, mice were sacrificed by cervical dislocation and T cell responses elicited against Pb9 epitopes of PbCSP and control epitopes derived from β-galactosidase were measured using the IFNγ assay as described below. did.

マウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴプロトコール
Ａ．材料
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔＡＬＰキットＭａｂｔｅｃｈ３３２１−２Ａ
６００μｇ抗ＩＦＮγ精製ＭａｂＡＮ１８
５０μｇ抗ＩＮＦγビオチン化ＭａｂＲ４６Ａ２
５０μｌストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ
完全αＭＥＭ培地
５００ｍｌＭＥＭα改変ＳｉｇｍａＭ−４５２６
５０ｍｌＦＣＳ［１０％］ＳｉｇｍａＦ−２４４２
５ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン［１００Ｕペニシリン１００μｇストレプトマイシン］ＳｉｇｍａＰ−０７８１
１０ｍｌＬ−グルタミン［４ｍＭ］ＳｉｇｍａＧ−７５１３
５００μｌ２−メルカプトエタノール［５０μｍ］ＧｉｂｃｏＢＲＬ３１３５０−０１０
ＡＣＫバッファー
８．２９ｇＮＨ_４Ｃｌ［０．１５Ｍ］（ＳｉｇｍａＡ−４５１４）
１ｇＫＨＣＯ_３［１ｍＭ］（ＳｉｇｍａＰ−９１４４）
３７．２ｍｇＮａ_２ＥＤＴＡ（ＳｉｇｍａＥＤ２ＳＳ）
８００ｍｌミリＱ水
ｐＨをＨＣｌ（ＳｉｇｍａＳ−７６５３）で７．２〜７．４に調製
水を加えて１０００ｍｌとし、オートクレーブ処理
呈色バッファー：
ＢｉｏＲａｄＡＰコンジュゲート基質キット（１７０−６４３２）
１プレートにつき：
５ｍｌ脱イオン水
２００μｌの２５×バッファー
５０μｌ試薬Ａ
５０μｌ試薬Ｂ
十分に混合し直ちに用いる
プロトコール
１．プレートの調製：
１．１プレートのコーティング：ＭＡＩＰマルチスクリーンプレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭＡＩＰＳ４５１０）をラット抗マウスＩＦＮγ（ＭａｂＡＮ１８）抗体でコーティングする。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ＳｉｇｍａＰ−３８１３）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルあたり５０μｌをＭＡＩＰプレートに加える。加湿されたチャンバー内で４℃で一晩インキュベートする。 Mouse IFNγ ELISPOT Protocol Materials IFNγ ELISpot ALP Kit Mabtech 3321-2A
600 μg anti-IFNγ purified Mab AN18
50 μg anti-INFγ biotinylated Mab R46A2
50 μl Streptavidin-Alkaline Phosphatase Complete αMEM Medium 500 ml MEMα Modified Sigma M-4526
50 ml FCS [10%] Sigma F-2442
5 ml penicillin / streptomycin [100 U penicillin 100 μg streptomycin] Sigma P-0781
10 ml L-glutamine [4 mM] Sigma G-7513
500 μl 2-mercaptoethanol [50 μm] Gibco BRL 31350-010
ACK buffer _{8.29g NH 4 Cl [0.15M] (} Sigma A-4514)
1 g KHCO ₃ [1 mM] (Sigma P-9144)
37.2 mg Na ₂ EDTA (Sigma ED2SS)
800 ml Milli-Q water Adjust pH to 7.2-7.4 with HCl (Sigma S-7653) Add water to 1000 ml, autoclave treatment Color buffer:
BioRad AP conjugate substrate kit (170-6432)
Per plate:
5 ml deionized water 200 μl 25 × buffer 50 μl Reagent A
50 μl Reagent B
Mix well and use immediately Protocols Plate preparation:
1.1 Plate coating: MAIP multiscreen plates (Millipore MAIPS4510) are coated with rat anti-mouse IFNγ (Mab AN18) antibody. Dilute to 10 μg / ml with phosphate buffered saline (PBS; Sigma P-3813) and add 50 μl per well to the MAIP plate. Incubate overnight at 4 ° C. in a humidified chamber.

１．２プレートのブロッキング：コーティング抗体を振り捨て、マルチチャンネルピペットを用いて、プレートをウェル当たり１５０μｌの滅菌ＰＢＳ（ＳｉｇｍａＰ−３８１３）で１回洗浄する。ＰＢＳを振り捨て、ウェル当たり１００μｌの完全α−ＭＥＭ培地を加え、室温で１＋時間インキュベートする。この段階ではプレートを滅菌状態で維持することが重要である。 1.2 Blocking of the plate: Shake off the coated antibody and wash the plate once with 150 μl of sterile PBS (Sigma P-3813) per well using a multichannel pipette. Shake off the PBS, add 100 μl of complete α-MEM medium per well and incubate at room temperature for 1+ hours. At this stage it is important to keep the plate sterile.

２．脾細胞調製：
２．１個々の脾臓を、２ｍｌのＰＢＳ中でペトリ皿に入れた細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ３５２３５０）中の１０ｍｌシリンジのプランジャーで粉砕し、５ｍｌのＰＢＳを加え、ピペッティングすることによって脾細胞を懸濁し、５０ｍｌの試験管に移す。さらに１０ｍｌのＰＢＳで細胞濾過器及び皿をすすぎ、５０ｍｌの試験管に加える。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。 2. Spleen cell preparation:
2.1 Each spleen is suspended with a 10 ml syringe plunger in a cell strainer (Falcon 352350) placed in a Petri dish in 2 ml PBS, 5 ml PBS is added and the spleen cells are suspended by pipetting. Cloudy and transfer to a 50 ml test tube. Rinse the cell strainer and dish with an additional 10 ml of PBS and add to a 50 ml tube. Centrifuge for 5 minutes at 1500 rpm.

２．２上清を除去し、試験管をタッピングすることによって細胞を再懸濁し、５ｍｌのＡＣＫバッファーを加え、反転することによって混合する。室温でわずか５分間インキュベートする。２５ｍｌのＰＢＳを加え、反転することによって混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。 2.2 Remove supernatant and resuspend cells by tapping the tube, add 5 ml ACK buffer and mix by inversion. Incubate at room temperature for only 5 minutes. Add 25 ml PBS, mix by inversion, and centrifuge at 1500 rpm for 5 minutes.

２．３上清を除去し、試験管をタッピングすることによってペレットを再懸濁し、１０ｍｌのＰＢＳを加え、ボルテックス処理する。改良型ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計算器を用い、０．４％トリパンブルー溶液（ＳｉｇｍａＴ−８１５４）で１：１０希釈することによって計数する。Ｅｌｉｓｐｏｔに必要な量をアリコートとし、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、適当な容量の完全αＭＥＭ培地中でボルテックス処理することによって再懸濁して１０００万個細胞／ｍｌの濃度とする。 2.3 Remove the supernatant and resuspend the pellet by tapping the tube, add 10 ml PBS and vortex. Count using a modified Neubauer cytometer by diluting 1:10 with 0.4% trypan blue solution (Sigma T-8154). Aliquots required for Elispot are centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes and resuspended by vortexing in an appropriate volume of complete αMEM medium to a concentration of 10 million cells / ml.

３．プレート配置：
3. Plate arrangement:

注意：プレートレイアウトは、特定の実験の必要に応じてオペレーターによって選択できる。 Note: The plate layout can be selected by the operator as needed for a particular experiment.

３．１ブロッキング培地をプレートから振り捨て、３、４、７、８、１１及び１２列に５０μｌの完全αＭＥＭ培地を加える。 3.1 Shake off blocking medium from plate and add 50 μl of complete αMEM medium to rows 3, 4, 7, 8, 11, and 12.

３．２２連で、１５０μｌの脾細胞を２、６及び１０列に加える（プレート当たり最大１２サンプル）。 3.2 In duplicate, add 150 μl of splenocytes in rows 2, 6 and 10 (up to 12 samples per plate).

３．３５０μｌの脾細胞を２、６及び１０列から採取し、１、５及び９列にそれぞれ移す：これらは負の対照ウェルである。 3.3 50 μl of splenocytes are taken from rows 2, 6 and 10 and transferred to rows 1, 5 and 9 respectively: these are negative control wells.

３．４５０μｌを２、６及び１０列から採取して３、７及び１１列に入れ、十分に混合し、５０μｌを４、９及び１２列に移すことによって各サンプルを段階希釈する。希釈の最終列をよく混合した後５０μｌ廃棄する。 3.4 Take 50 μl from 2, 6 and 10 rows into 3, 7 and 11 rows, mix well, serially dilute each sample by transferring 50 μl to 4, 9 and 12 rows. Discard 50 μl after thoroughly mixing the last column of dilution.

３．５試験ペプチド及び対照ペプチドを、所望の最終濃度の２倍に、１０００万個／完全α−ＭＥＭ培地１ｍｌで未処理の脾細胞に加える。５０μｌの対照ペプチド及び標的細胞を、１、５及び９列に加える。５０μｌの試験ペプチド及び標的細胞を残りの列に加える。 3.5 Test peptide and control peptide are added to untreated splenocytes in 10 ml / ml of complete α-MEM medium at twice the desired final concentration. 50 μl of control peptide and target cells are added to rows 1, 5 and 9. 50 μl of test peptide and target cells are added to the remaining rows.

３．６３７℃で１８〜２０時間インキュベートする。 3.6 Incubate at 37 ° C. for 18-20 hours.

４．アッセイの発現
４．１プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳｉｇｍａＰ１３７９）を含有するＰＢＳで２回、蒸留水で１回、及びＰＢＳＴで２回洗浄する。 4). Expression of the assay 4.1 Plates are washed twice with PBS containing 0.05% Tween 20 (Sigma P1379), once with distilled water and twice with PBST.

４．２ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌ／ウェルのビオチン化ラット抗マウスインターフェロンγを加える。室温で２時間インキュベートする。 4.2 Add 50 μl / well of biotinylated rat anti-mouse interferon γ diluted to 1 μg / ml with PBS. Incubate for 2 hours at room temperature.

４．３プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、次いで、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を加える。室温で１時間インキュベートする。 4.3 Wash plate 4 times with PBST, then add 50 μl streptavidin alkaline phosphatase (Mabtech) diluted to 1 μg / ml with PBS. Incubate for 1 hour at room temperature.

４．４プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの呈色バッファーを加える。 4.4 Wash plate 4 times with PBST and add 50 μl / well color buffer.

４．５室温で、スポットが発現するまで（約１０分）インキュベートする。プレートを水道水で十分に洗浄し、プラスチックの底部を剥がし、ペーパータオル上で一晩乾燥させる。 4.5 Incubate at room temperature until spots develop (approximately 10 minutes). Wash the plate thoroughly with tap water, peel off the bottom of the plastic and let it dry on a paper towel overnight.

結果
結果は抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）の数として算出した。マイクロソフトエクセル２０００を用いて、スチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）によって群間の相違を調べた。 Results The results were calculated as the number of antigen-specific IFNγ spot forming cells / million spleen cells (sfc / million). Using Microsoft Excel 2000, differences between groups were examined by Student's T-test (2 samples assuming equal variance).

ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、初回抗原刺激剤として（Ｐ＝０．００２）又は追加免疫剤として（Ｐ＝０．００４）ＭＶＡＰｂＣＳＰと併用した場合に、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰと比べて有意に増強されたＰｂＣＳＰに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を生起した（図１５）。興味深いことに、ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いて初回抗原刺激されており、ＭＶＡＰｂＣＳＰを用いて追加免疫された群とその逆の間に有意な相違はなかった。 FP9PbCSP is antigen-specific for PbCSP significantly enhanced compared to FPV-MPbCSP when used in combination with MVAPbCSP as a primary antigen stimulator (P = 0.002) or as a booster (P = 0.004) A T cell response occurred (Figure 15). Interestingly, there was no significant difference between the group primed with FP9PbCSP and boosted with MVAPbCSP and vice versa.

したがって、ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、初回抗原刺激剤及び／又は追加免疫剤としてＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰよりも強力であり、組換えＭＶＡと併用した初回抗原刺激剤又は追加免疫剤としては同程度に強力であることを証明した。 Thus, FP9PbCSP proves to be more potent than FPV-MPbCSP as a prime and / or booster and as potent as a prime or boost in combination with recombinant MVA. did.

組換えＦＰ９はウイルス疾病から保護する
目的
組換えＦＰ９を単独で又はプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を生起するかどうかを調べること。 Recombinant FP9 protects against viral disease Objective To determine whether immunization with recombinant FP9 alone or in a prime / boost regimen will produce T cell responses against CD4 + and CD8 + T cell epitopes derived from viral and tumor antigens about.

方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原及びマウス腫瘍（Ｐ８１５及びＣＴ２６）抗原由来の、特性決定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋拘束性エピトープからなる新規ポリペプチドをコードする４４０ｂｐの合成遺伝子（ＭＥ１）を、以下の通りに合成した：
ＭＥ１モデルエピトープ鎖：
慢性感染（ＬＣＭＶ）及び癌（Ｐ８１５／ＣＴ２６）のマウスモデルにおいて関連のある、腫瘍及びウイルスエピトープをコードするＴ細胞エピトープ鎖を以下に示すように作製した。 Methods A 440 bp synthetic gene (ME1) encoding a novel polypeptide consisting of the characterized CD8 + and CD4 + restricted epitopes derived from lymphoid choroid meningitis virus (LCMV) antigen and mouse tumor (P815 and CT26) antigen. Was synthesized as follows:
ME1 model epitope chain:
Relevant T cell epitope chains encoding tumor and viral epitopes in mouse models of chronic infection (LCMV) and cancer (P815 / CT26) were generated as shown below.

潜在的に可能な免疫競合を避けるために、ＬＣＭＶ由来エピトープはＨ−２^ｂ拘束性とし、癌エピトープはＨ−２^ｄ拘束性とする。エピトープの順序はＨ−２^ｄとＨ−２^ｂ間で交代にする。 To avoid potentially immune competition, LCMV derived epitopes and H-2 ^b restricted, cancer epitopes and H-2 ^d restricted. The epitope order is alternated between H- ^2d and H- ^2b .

エピトープ鎖配列
エピトープを示すもの：
クローニング部位ＫｏｚａｋＭ［ＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤ］［ＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩ］［ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ］［ＦＱＰＱＮＧＱＦＩ］［ＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶ］［ＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬ］［ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ］［ＹＴＶＫＹＰＮＬ］［ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ］［ＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩ］［ＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥ］［ＤＡＰＩＹＴＮＶ］［ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ］ＡＡ（停止シグナル）
アミノ酸鎖：
ＭＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩＬＰＹＬＧＷＬＶＦＦＱＰＱＮＧＱＦＩＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＳＰＳＹＡＹＨＱＦＹＴＶＫＹＰＮＬＴＰＨＰＡＲＩＧＬＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥＤＡＰＩＹＴＮＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡ
フランキングヌクレオチド及びアミノ酸
ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ．．．
ＭＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩＬ
ＰＹＬＧＷＬＶＦＦＱＰＱＮＧＱＦＩＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＳＰＳＹＡＹＨＱＦＹＴＶＫＹＰＮＬＴＰ
ＨＰＡＲＩＧＬＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥＤＡＰＩ
．．．ＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣ
ＹＴＮＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡ
エピトープ鎖はＡｐａＩもＡｓｃＩ標的配列も含まない。 Epitope chain sequence Indicates epitope:
Cloning site Kozak M [GLNGPDIYKGVYQFKSVEFD] [KAVYNFATCGI] [LPYLGWLVF] [FQPQNGQFI] [GYCGLRGTGV] [SGVENPGGYCL] [SPSYAYHQF] [YTVKYPNL] [TPHPARIGL] [CSANNSHHYI] [SGEGWPYIACRTSIVGRAWE] [DAPIYTNV] [YPYDVPDYA] AA (stop signal)
Amino acid chain:
MGLGNPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGGILPYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGGYCLSPSYAYYQ
Flanking nucleotides and amino acids GGGCCCGCCGCCACC ATG G. . .
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGIL
PYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSVVENPGGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTP
HPARIGLCSANNSHHYISGEGWWPYIACRTSIVGRAWEDAPI
. . . TAAGGCCGCGCC
YTNVYPYDVPDYAAA
The epitope chain does not contain ApaI or AscI target sequences.

エピトープ鎖は、ポックスウイルス初期遺伝子転写終結配列、ＴＴＴＴＴＮＴを含まない。 The epitope chain does not contain the poxvirus early gene transcription termination sequence, TTTTTTNT.

ベクター製造
ＭＥ１エピトープ鎖をＤＮＡワクチンベクター（ＰＳＧ２）及び鶏痘シャトルベクターｐＥＦＬ２９に連結した。次いで、プラスミドｐＥＦＬ２９．ＭＥ１を、確立された方法に従ってＦＰ９の染色体に組換え、ＦＰ９．ＭＥ１を構築した。 Vector production The ME1 epitope chain was ligated to the DNA vaccine vector (PSG2) and the fowlpox shuttle vector pEFL29. The plasmid pEFL29. Recombining ME1 to the chromosome of FP9 according to established methods, FP9. ME1 was constructed.

次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させ、３０％ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価を、確立された方法にしたがって、ＣＥＦで滴定し、Ｘ−ｇａｌで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないＰＢＳに１×１０^７ＰＦＵ／ｍｌに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドＰＳＧ２．ＭＥ１は、ＱｉａｇｅｎＧｉｇａカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。 The virus was then propagated in chick embryo fibroblasts (CEF) and purified in bulk by centrifugation through a 30% sucrose cushion. Viral titers were confirmed by titrating with CEF and staining with X-gal according to established methods. Virus was prepared for immunization by suspending in pyrogen-free PBS at 1 × 10 ⁷ PFU / ml. Plasmid PSG2. ME1 was purified in large quantities using a Qiagen Giga column and resuspended at 1 mg / ml in PBS containing no pyrogen.

雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）マウス（６〜８週齢）を、ＰＳＧ２．ＭＥ１又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドｐＳＧ２．Ｍｅｌ３を用いて筋内（ｉｍ．）で免疫化した。ウイルスＦＰ９．ＭＥ１及び空の対照ウイルスＦＰ９．ＥＦＬ２９を、尾の静脈に１×１０^６ＰＦＵの用量で静脈内（ｉｖ．）投与した。動物を、免疫化の２週間後に追加免疫した。追加免疫の１４日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＬＣＭＶ、Ｐ８１５、ＣＴ２６及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、実施例１６に記載したようなＩＦＮγアッセイを用いて測定した。 Female ^{BALB / c (H-2 d} ) C57BL / 6 (H-2 b) mice (6-8 weeks old), PSG2. Control plasmid pSG2 containing ME1 or an irrelevant epitope chain. Immunization was performed intramuscularly (im.) With Mel3. Virus FP9. ME1 and empty control virus FP9. EFL29 was administered intravenously (iv.) Into the tail vein at a dose of 1 × 10 ⁶ PFU. Animals were boosted 2 weeks after immunization. Fourteen days after booster immunization, mice were sacrificed by cervical dislocation and T cell responses generated against control epitopes derived from LCMV, P815, CT26 and β-galactosidase were subjected to IFNγ assay as described in Example 16. And measured.

結果は、抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個の脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル２０００を用いてスチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）及びＡＮＯＶＡによって調べた。 The results were calculated as antigen-specific IFNγ spot forming cells / million spleen cells (sfc / million). Differences between groups were examined by Student's T-test (2 samples assuming equal variance) and ANOVA using Microsoft Excel 2000.

実験設計及び結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ＭＥ１は、Ｈ−２^ｂハプロタイプマウスに特徴的なＬＣＭＶ抗原由来のエピトープと、Ｈ−２^ｄハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする。したがって、ＦＰ９．ＭＥ１の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを生起する能力を、表６に記載したようにＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｄ）マウス双方で調べた。これらの実験の結果を表６に示す。 To avoid experimental design and results competition between viral and tumor epitopes, ME1 includes epitope from characteristic LCMV antigen H-2 ^b haplotype mice, the characteristic derived from tumor antigens in ^{H-2 d} haplotype mice Code things. Therefore, FP9. The ability of ME1 to generate CD4 + and CD8 + T cell epitopes was examined in both BALB / c (H-2 ^d ) C57BL / 6 (H-2 ^d ) mice as described in Table 6. The results of these experiments are shown in Table 6.

実験１及び２を平行して実施した。各群には４個体の６〜８週齢の雌のマウスを含めた。ワクチンは、方法に記載した通りに投与し、初回抗原刺激と追加免疫は１４〜１６日離れている。Ｔ細胞応答は、実施例１６におけるようなＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＬＣＭＶ、腫瘍及び前記のモデルエピトープを用いて測定した。結果は、ＬＣＭＶ及び腫瘍由来エピトープに対する累積応答に関し、これはマウスマラリア及び結核モデルを用いた知見に基づいている。 Experiments 1 and 2 were performed in parallel. Each group included four 6-8 week old female mice. The vaccine is administered as described in the method, with priming and boosting 14-14 days apart. T cell responses were measured by LCFN, tumors and the above model epitopes by IFNγ ELISPOT assay as in Example 16. The results relate to cumulative responses to LCMV and tumor-derived epitopes, which are based on findings using mouse malaria and tuberculosis models.

組換え体ＦＰ９は癌から保護する
目的
マウスにおいて、ＦＰ９．ＭＥ１を単独で又はｐＳＧ２．ＭＥ１とともにプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ＣＴ２６腫瘍チャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。したがって、組換えＦＰ９が、癌から保護する抗原特異的Ｔ細胞応答を生起できることを概ね証明すること。 Recombinant FP9 protects against cancer Objective In mice, FP9. ME1 alone or pSG2. To determine if immunization used in a prime / boost regimen with ME1 will generate a protective immune response to the CT26 tumor challenge. Thus, generally demonstrate that recombinant FP9 can generate an antigen-specific T cell response that protects against cancer.

方法
雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）マウス（６〜８週齢）に、ｐＳＧ２．ＭＥ１、ＦＰ９．ＭＥ１又は前記のような対照構築物ｐＳＧ．Ｍｅｌ３及びＦＰ９．ＥＦＬ２９を用いて注射する。動物に免疫化の２週間後に追加免疫を行う。追加免疫の１４日後、マウスの左脇腹に、以下の通りに５×１０^５個ＣＴ２６腫瘍細胞を用いて皮下（ｓｃ．）注射することによってチャレンジする。 Methods Female BALB / c (H-2 ^d ) mice (6-8 weeks old) were treated with pSG2. ME1, FP9. ME1 or a control construct pSG. Mel3 and FP9. Inject using EFL29. Animals are boosted 2 weeks after immunization. Fourteen days after booster immunization, mice are challenged by injecting subcutaneously (sc.) Into the left flank with 5 × 10 ⁵ CT26 tumor cells as follows.

ＣＴ２６腫瘍の皮下増殖
いくつかの実験上の問題は、皮下に移植した測定可能な充実腫瘍塊を用いることで最良に対処される。ＣＴ２６細胞はこの実験アプローチを受け入れられる。従来の野生型ＣＴ２６細胞は、皮下空間では横方向拡大様式で増殖するが、高度にトランスフェクト可能な変異体、ＣＴ２６は、おそらくは接着性の増加と関連して、より緻密な腫瘍塊として良好に増殖し、これによって測定値がより再現性のあるものとなる。 Subcutaneous growth of CT26 tumors Some experimental problems are best addressed by using measurable solid tumor mass implanted subcutaneously. CT26 cells are amenable to this experimental approach. Conventional wild-type CT26 cells grow in a laterally expanded manner in the subcutaneous space, but the highly transfectable variant, CT26, is better as a denser tumor mass, possibly associated with increased adhesion. Proliferate, which makes the measurements more reproducible.

材料
ＣＴ２６細胞
１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳを含む完全ＤＭＥＭ培地
滅菌ＰＢＳ
ＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢

１ｍｌ滅菌使い捨てシリンジ
１６−Ｇ及び２５−Ｇのニードル
ノギス

細胞を計数するためのさらなる試薬及び装置。 Materials CT26 cells Complete DMEM medium with 10% (w / v) FCS Sterile PBS
BALB / c mice, 6-8 weeks old

1 ml sterile disposable syringe 16-G and 25-G needle calipers

Additional reagents and equipment for counting cells.

１．１０％ＦＣＳを含む完全ＤＭＥＭ培地でＣＴ２６細胞を培養する。 1. Culture CT26 cells in complete DMEM medium containing 10% FCS.

２．細胞を回収し、２００×ｇ、室温で５分間遠心分離することによってＰＢＳで２回すすぐ。 2. Cells are harvested and rinsed twice with PBS by centrifuging at 200 xg for 5 minutes at room temperature.

３．細胞を計数し、ＰＢＳに２×１０^７個細胞／ｍｌで再懸濁する。懸濁液を１ｍｌシリンジに移し、次いで１６−Ｇニードルを２５−Ｇニードルに変更する。 3. Cells are counted and resuspended in PBS at 2 × 10 ⁷ cells / ml. The suspension is transferred to a 1 ml syringe and then the 16-G needle is changed to a 25-G needle.

４．５０μｌ／マウスを皮下注射することによってＢＡＬＢ／ｃマウスに播種する。 BALB / c mice are seeded by subcutaneous injection of 4.50 μl / mouse.

穏やかにタッピングし、反転することによって、注射の直前にシリンジ中で細胞が確実に均一に再懸濁されるようにする。 Tapping gently and reversing ensures that the cells are uniformly resuspended in the syringe just prior to injection.

所与の条件により１０^６個の腫瘍細胞が移植されることとなる。２×１０^５〜１×１０^７個細胞の細胞濃度を用いることに成功した。 Depending on the given conditions, 10 ⁶ tumor cells will be transplanted. Successful use of cell concentrations of 2 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁷ cells.

５．手順は１人のオペレーターによって迅速に達成することができる。マウスを左手に持ち、首筋を最初の２本の指の間に入れ、尾を掌と４番目の指で挟む。右手は、シリンジを持ち、ニードルをマウスの左脇腹の皮膚のみを通して挿入する。手段としてのシリンジとニードルを用いながら、皮膚をマウスの体から離して穏やかに持ち上げ、確実にニードルの先が皮下空間にあるようにしなければならない。その時に初めて５０μｌ容量を押し出す。 5). The procedure can be accomplished quickly by one operator. Hold the mouse in the left hand, put the scruff between the first two fingers, and pinch the tail between the palm and the fourth finger. The right hand holds the syringe and inserts the needle only through the skin on the left flank of the mouse. Using the syringe and needle as a means, the skin must be gently lifted away from the mouse body to ensure that the needle tip is in the subcutaneous space. Extrude a 50 μl volume for the first time.

マウスを、少なくとも週に２回、腫瘍増殖について調べるために、及び全身の健康状態を評価するために調査する。腫瘍が現れれば、ノギスを用いて最長及び最短寸法を測定及び記録する。 Mice are examined at least twice a week for tumor growth and to assess general health. If a tumor appears, measure and record the longest and shortest dimensions using calipers.

これらの２つの測定値の平均により、そのマウスのその時点での平均腫瘍直径が得られる。 The average of these two measurements gives the average tumor diameter at that point in time for that mouse.

腫瘍はまず、移植の１週間後には触診できる。測定値は０．５ｍｍ近くになっているはずである。 Tumors can be palpated first week after transplantation. The measured value should be close to 0.5 mm.

マウスは、腫瘍発達の証拠についてチャレンジ後２週間観察し、その後犠牲にし、解剖する。腫瘍の大きさは、腫瘍の長さと幅を測定し、次いで、これらの測定値の平均をとることによって求める。ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍＩｎｓｔａｔを用いて、フィッシャーの精密検定によって求められる腫瘍発生率の相違について、及びスチューデントのＴ検定（等しくない分散を仮定する２サンプル）を用いて腫瘍の大きさの相違について統計解析を実施する。 Mice are observed for 2 weeks after challenge for evidence of tumor development and then sacrificed and dissected. Tumor size is determined by measuring the length and width of the tumor and then taking the average of these measurements. Statistical analysis is performed for differences in tumor incidence determined by Fisher's exact test using GraphPrism Instat and for differences in tumor size using Student's T test (two samples assuming unequal variance) .

実験設計及び予想される結果
ＣＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の結腸癌腫細胞株である。ＤＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、皮下注射の約１週間後に充実腫瘍を形成する。ＭＥ１エピトープ鎖は、ＣＴ２６腫瘍によって発現される（前記参照）、ＭｕＬＶｇｐ７０エンベロープタンパク質由来の保護的ＣＤ８＋拘束性エピトープを含む。ｐＳＧ２．ＭＥ１とそれに続いてＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化レジメンは、このエピロープに対して増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生起するので（前記参照）、本発明者らは、この免疫化レジメンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにいおてＣＴ２６チャレンジからの保護を生起するということを示した。表７は結果を示す。 Experimental design and expected results CT26 is a colon carcinoma cell line derived from BALB / c mice. DT26 forms solid tumors about 1 week after subcutaneous injection in BALB / c mice. The ME1 epitope chain contains a protective CD8 + restricted epitope derived from the MuLV gp70 envelope protein expressed by CT26 tumor (see above). pSG2. ME1 followed by FP9. Since the prime / boost immunization regimen using ME1 produces an enhanced CD8 + T cell immune response against this epilope (see above), we have found that this immunization regimen is in BALB / c mice. It has been shown to cause protection from the CT26 challenge. Table 7 shows the results.

１２ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１４日離して、示したように初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の１４日後、動物をＣＴ２６細胞を用いて左脇腹に皮下注射することによってチャレンジする。動物は２週間観察し、次いで、解剖し、腫瘍の存在及び大きさを方法に記載したように測定する。 Groups of 12 BALB / c mice are primed and boosted as indicated, separated by 14 days. Fourteen days after boost, animals are challenged by subcutaneous injection in the left flank with CT26 cells. The animals are observed for 2 weeks, then dissected and the presence and size of the tumor is measured as described in the method.

表は１６で示された免疫原性データに基づいた腫瘍発生率を示す。各群の平均の腫瘍の大きさの相違も予測されるが、表には示していない。 The table shows tumor incidence based on the immunogenicity data shown at 16. Differences in the average tumor size for each group are also expected but are not shown in the table.

組換えＦＰ９は、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から保護する
目的：マウスにおいて、ＦＰ９．ＭＥ１を単独で又はＰＳＧ２．ＭＥ１とともにプライムブーストレジメンで用いた免疫化が、ＬＣＭＶチャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。 Recombinant FP9 protects against lymphoid choroid meningitis virus (LCMV) Purpose: In mice, FP9. ME1 alone or PSG2. To determine if immunization used in a prime boost regimen with ME1 will produce a protective immune response to LCMV challenge.

これにより、組換えＦＰ９が、本発明に従って用いた場合に、ウイルス感染から保護する抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生起できることが証明される。 This demonstrates that recombinant FP9 can generate antigen-specific CD4 + and CD8 + T cell responses that protect against viral infection when used in accordance with the present invention.

方法
雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）マウス（６〜８週齢）に、ＰＳＧ２．ＭＥ１、ＦＰ９．ＭＥ１又は前記のような対照構築物ｐＳＧ２．Ｍｅｌ３及びＦＰ９．ＥＦＬ２９を用いて注射した。動物には免疫化の２週間後に追加免疫を行った。追加免疫の１４日後、群当たり６個体の動物を２×１０^５ＰＦＵＬＣＭＶＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（穏やかな感染）を用いて腹腔内（ｉｐ．）注射することによって、また６個体の動物を２×１０^６ＰＦＵＬＣＭＶクローン１３（重症感染）を用いてｉｖ．でチャレンジした。 The method Female ^{C57BL / 6 (H-2 b} ) mice (6-8 weeks old), PSG2. ME1, FP9. ME1 or a control construct pSG2. Mel3 and FP9. EFL29 was used for injection. Animals were boosted 2 weeks after immunization. 14 days after the booster, 6 animals per group were injected intraperitoneally (ip.) With 2 × 10 ⁵ PFU LCMV Armstrong (mild infection) and 6 animals were 2 × 10 ⁶ PFU. Using LCMV clone 13 (severe infection) iv. I challenged.

ＬＣＭＶＡｒｍｓｔｒｏｎｇを用いてチャレンジした動物は、チャレンジの３日後に犠牲にし、ＬＣＭＶクローン１３を用いてチャレンジしたものはチャレンジの７日後に犠牲にした。 Animals challenged with LCMV Armstrong were sacrificed 3 days after challenge and those challenged with LCMV clone 13 were sacrificed 7 days after challenge.

チャレンジされた動物の脾臓中のウイルス含量を以下の通りに測定する：
ＬＣＭＶの滴定のためのプラークアッセイ
１．３ｍｌの培地中の３×１０^５個のベロ細胞をアリコートとし、６ウェルプレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ_２下、コンフルエント単層を形成するまで３７℃で一晩培養する。 The virus content in the spleen of the challenged animal is measured as follows:
Plaque assay for titration of LCMV Aliquot 3 × 10 ⁵ Vero cells in 3 ml medium and place in each well of a 6-well plate and incubate at 37 ° C. overnight under 5% CO ₂ until a confluent monolayer is formed.

２．１：１００（１０μｌサンプル＋１ｍｌ培地）で出発して、その後１０倍希釈（１００μｌ＋９００μｌ培地）を作製し、氷上で試験サンプルの段階希釈を作製する。 2. Start with 1: 100 (10 μl sample + 1 ml medium), then make a 10-fold dilution (100 μl + 900 μl medium) and make serial dilutions of the test sample on ice.

３．ベロ細胞から培地を除去し（単層を破損しないよう注意しながら）、ウェル当たり５００μｌの希釈した試験サンプルを加える。培地のみを加えたウェルを負の対照として、アッセイ当たり少なくとも１つ含める。プレートを、５％ＣＯ_２下３７℃で１時間インキュベートしてウイルス感染させる。 3. Remove media from Vero cells (care not to break the monolayer) and add 500 μl of diluted test sample per well. At least one well per assay is included as a negative control. Plates are incubated for 1 hour at 37 ° C. with 5% CO ₂ for virus infection.

４．各ウェルを３〜４ｍｌの、１％アガロース水溶液と１０％ＦＢＳを含有する２×１９９培地の１：１混合物で覆う。プレートをホイルに包み、５％ＣＯ２インキュベーター下３７℃で６日間培養する。 4). Each well is covered with 3-4 ml of a 1: 1 mixture of 2 × 199 medium containing 1% agarose aqueous solution and 10% FBS. The plate is wrapped in foil and incubated for 6 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.

５．固定及び染色する。 5). Fix and stain.

エクセル２０００を用いて、カイ二乗検定によって求められる感染の発生率の相違について、及びスチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）を用いて求められるウイルス含量の相違について統計解析を実施した。両側Ｐ値をすべての場合に求めた。 Statistical analysis was performed using Excel 2000 for differences in the incidence of infection as determined by chi-square test and for differences in virus content as determined using Student's T test (two samples assuming equal variance). Two-sided P values were determined in all cases.

結果
ＬＣＭＶは十分に特性決定されたウイルスであり、マウスにおいて慢性及び急性感染を引き起こす。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株は、穏やかな、自己回復性感染を引き起こし、他方、クローン１３株は、慢性感染に発達し得る重症感染を引き起こす。ＭＥ１エピトープ株は、ＬＣＭＶ由来の２種のＣＤ４＋エピトープといくつかのＣＤ８＋拘束性エピトープ（前記参照）を含むよう設計し、それらのうちのいくつかはＬＣＭＶ感染に対して保護的であると特性決定されている。ＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化は、ＭＥ１中のＬＣＭＶエピトープに対する有意に増強されたＴ細胞応答を生起するので（図１７）、この免疫化レジメンは、ＬＣＭＶのＡｒｍｓｔｒｏｎｇ及びクローン１３株の双方を用いるチャレンジに対して保護的効力を示す。表８は結果を示す。 Results LCMV is a well-characterized virus that causes chronic and acute infections in mice. Armstrong strains cause mild, self-healing infections, while clone 13 strains cause severe infections that can develop into chronic infections. The ME1 epitope strain is designed to contain two CD4 + epitopes from LCMV and several CD8 + restricted epitopes (see above), some of which are characterized as protective against LCMV infection Has been. FP9. Since prime / boost immunization with ME1 results in a significantly enhanced T cell response to the LCMV epitope in ME1 (FIG. 17), this immunization regimen uses both LCMV Armstrong and clone 13 strains. Shows protective efficacy against the challenge. Table 8 shows the results.

１２個体のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、１４日間離して、示した通りに初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の１４日後、群当たり６個体の動物を、ＬＣＭＶＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（穏やかな感染）及びＬＣＭＶクローン１３（重症感染）を用いて方法に記載した通りにチャレンジする。このアッセイの検出限界は１０００ｐｆｕ／器官（ｌｏｇ_１０３．００）である。 Groups of 12 C57BL / 6 mice are separated for 14 days and primed and boosted as indicated. Fourteen days after boost, 6 animals per group are challenged with LCMV Armstrong (mild infection) and LCMV clone 13 (severe infection) as described in the method. The detection limit for this assay is 1000 pfu / organ (log ₁₀ 3.00).

群Ａ、Ｂ及びＣのウイルス含量は、群当たり６個体を用いる結果に基づいている。Ｄ、Ｅ及びＦのウイルス含量は、図１７に示される免疫原性結果に基づいている。 The virus content of groups A, B and C is based on results using 6 individuals per group. The virus content of D, E and F is based on the immunogenicity results shown in FIG.

図１５は、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ及びＭＶＡＰｂＣＳＰを用いる異種プライム／ブースト免疫化後の抗原特異的免疫応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ（ＦＰ９）、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ（ＦＰＶ−Ｍ）又はＭＶＡＰｂＣＳＰを用いて両側の耳に皮内で免疫化し、１４日後同様の方法で異種追加免疫した。ブースター免疫化の１４日後、ＰｂＣＳＰのＰｂ９エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて測定した。カラムは、平均抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／１００万個脾細胞±群当たり４個体のマウスの１標準偏差を表す。Ｐ値は、マイクロソフトエクセル２０００を用いて、等しい分散を仮定するスチューデントのＴ検定によって求めた。 FIG. 15 shows the antigen-specific immune response after heterologous prime / boost immunization with FP9PbCSP, FPV-MPbCSP and MVAPbCSP. BALB / c mice were immunized intradermally in both ears with FP9PbCSP (FP9), FPV-MPbCSP (FPV-M) or MVAPbCSP, and 14 days later heterologous boosted in the same manner. Fourteen days after booster immunization, T cell responses elicited against the Pb9 epitope of PbCSP and a control epitope derived from β-galactosidase were measured in splenocytes using the IFNγ ELISPOT assay. Columns represent mean antigen specific IFNγsfc / million splenocytes ± one standard deviation of 4 mice per group. P values were determined by Student's T test using Microsoft Excel 2000 assuming equal variance.

ウェブスターの弱毒鶏痘はＦＰ９とは異なっている
この実施例では、既存の鶏痘ベクターと比較したＦＰ９の独特の特性が証明される。ＦＰ９の遺伝子組成を前記のように調べ、既存のポックスベクター「ウェブスター」と比較する。データを表９に示す。 Webster's attenuated fowlpox is different from FP9. This example demonstrates the unique properties of FP9 compared to existing fowlpox vectors. The gene composition of FP9 is examined as described above and compared with the existing pox vector “Webster”. The data is shown in Table 9.

欠失
ＦＰ９には、病原性ＵＳＦＰＶ配列（ＦＰＶＵＳ；Ａｆｏｎｓｏら、２０００）と比べて２５の欠失が認められた。これらのうち６はＵＳとヨーロッパ系統間の相違であり、１９は継代（及び付随する弱毒化）の間に生じ、これが最終的にＦＰ９をもたらした。 Deletions FP9 had 25 deletions compared to the pathogenic US FPV sequence (FPV US; Afonso et al., 2000). Of these, 6 were differences between the US and European strains, and 19 occurred during passage (and concomitant attenuation), which ultimately resulted in FP9.

１９の継代特異的欠失遺伝子座のうち、１５をウェブスター（ＦＰＶ−Ｍ）で調べたところ、すべてがＦＰＶＵＳと同一であるがＦＰ９のものとは異なる配列を示す。 Of the 19 passage-specific deletion loci, 15 were examined with Webster (FPV-M), all showing the same sequence as FPVUS but different from that of FP9.

挿入
同様に、１５の挿入がＦＰ９とＦＰＶＵＳを区別する。これらのうち、５は継代及び弱毒化の間に生じた。 Insertion Similarly, 15 insertions distinguish between FP9 and FPV US. Of these, 5 occurred during passage and attenuation.

これら５つのうち１つの継代特異的挿入遺伝子座をウェブスターで調べたところ、ＦＰＶＵＳと同一であるが、ＦＰ９とは異なる配列を示す。 When one of these five passage-specific insertion loci was examined with Webster, it showed the same sequence as FPV US but different from FP9.

塩基置換
７７の一塩基置換によって、ＦＰ９はＦＰＶＵＳと区別される。これらのうち、２５は継代及び弱毒化の間に生じた。 Base substitution 77 one base substitution distinguishes FP9 from FPV US. Of these, 25 occurred during passage and attenuation.

これら２５のうち１１の継代特異的置換部位をウェブスターで調べたところ、すべての場合で、ＦＰＶＵＳと同一であるが、ＦＰ９とは異なる配列を有している。したがって、ＨＰ１にも認められる別のＦＰ９突然変異は系統特異的突然変異であり、ウェブスターではＦＰＶＵＳと同一である。 Eleven of these 25 passage-specific substitution sites were examined with Webster and in all cases had the same sequence as FPV US but different from FP9. Thus, another FP9 mutation also found in HP1 is a lineage-specific mutation and is identical to FPV US in Webster.

したがって、ウェブスター弱毒化ワクチンは、ＦＰ９とは明らかに遺伝的に区別される。 Thus, Webster attenuated vaccine is clearly genetically distinguished from FP9.

組換えＦＰ９は、ウイルス及び腫瘍由来エピトープに対するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答を生起する
目的
実施例１７に加え、この実施例では、組換えＦＰ９を単独で又はプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を生起するかどうかをさらに調べる。 Recombinant FP9 generates CD4 and CD8 T cell responses to viral and tumor-derived epitopes Objective In addition to Example 17, in this example, immunization with recombinant FP9 alone or in a prime / boost regimen And further investigate whether it produces a T cell response against CD4 + and CD8 + T cell epitopes derived from tumor antigens.

方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原及びマウス腫瘍（Ｐ８１５及びＣＴ２６）抗原由来の、特性決定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋拘束性エピトープからなる新規ポリペプチド（ＭＥ１）をコードする４４０ｂｐの合成遺伝子を合成した（前記参照）。ＭＥ１をＤＮＡワクチンベクター（ＰＳＧ２）及び鶏痘シャトルベクターｐＥＦＬ２９に連結した。次いで、プラスミドｐＥＦＬ２９．ＭＥ１を、確立された方法に従ってＦＰ９の染色体に組換え、ＦＰ９．ＭＥ１を構築した。次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させ、３０％ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価は、確立された方法にしたがって、ＣＥＦで滴定し、Ｘ−ｇａｌで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないＰＢＳに１×１０^７ＰＦＵ／ｍｌに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドｐＳＧ２．ＭＥ１は、ＱｉａｇｅｎＧｉｇａカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。 Methods A 440 bp synthetic gene encoding a novel polypeptide (ME1) consisting of the characterized CD8 + and CD4 + restricted epitopes derived from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and mouse tumor (P815 and CT26) antigens. Synthesized (see above). ME1 was ligated with DNA vaccine vector (PSG2) and fowlpox shuttle vector pEFL29. The plasmid pEFL29. Recombining ME1 to the chromosome of FP9 according to established methods, FP9. ME1 was constructed. The virus was then propagated in chick embryo fibroblasts (CEF) and purified in bulk by centrifugation through a 30% sucrose cushion. Viral titer was confirmed by titrating with CEF and staining with X-gal according to established methods. Virus was prepared for immunization by suspending in pyrogen-free PBS at 1 × 10 ⁷ PFU / ml. Plasmid pSG2. ME1 was purified in large quantities using a Qiagen Giga column and resuspended at 1 mg / ml in PBS containing no pyrogen.

雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）又はＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）マウス（６〜８週齢）を、５０μｇのｐＳＧ２．ＭＥ１又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドｐＳＧ２．Ｍｅｌ３を用いて筋内（ｉｍ．）で免疫化した。ウイルスＦＰ９．ＭＥ１及び空の対照ウイルスＦＰ９．ＥＦＬ２９を、尾の静脈に１×１０^６ＰＦＵの用量で静脈内（ｉｖ．）投与した。動物は免疫化の１４〜１５日後に追加免疫した。追加免疫の１４〜１５日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＬＣＭＶ、Ｐ８１５、ＣＴ２６及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、前記のようにＩＦＮγアッセイを用いて測定した。結果は、抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個の脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル２０００を用い、スチューデントのＴ検定（等しくない分散を仮定する２サンプル）によって調べた。片側Ｐ値をすべての場合で得る。 Female BALB / c (H-2 ^d ) or C57BL / 6 (H-2 ^b ) mice (6-8 weeks old) were treated with 50 μg pSG2. Control plasmid pSG2 containing ME1 or an irrelevant epitope chain. Immunization was performed intramuscularly (im.) With Mel3. Virus FP9. ME1 and empty control virus FP9. EFL29 was administered intravenously (iv.) Into the tail vein at a dose of 1 × 10 ⁶ PFU. Animals were boosted 14-15 days after immunization. 14-15 days after boost, mice were sacrificed by cervical dislocation and T cell responses generated against control epitopes derived from LCMV, P815, CT26 and β-galactosidase were analyzed using the IFNγ assay as described above. It was measured. The results were calculated as antigen-specific IFNγ spot forming cells / million spleen cells (sfc / million). Differences between groups were examined using Microsoft Excel 2000 by Student's T test (2 samples assuming unequal variance). A one-sided P value is obtained in all cases.

結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ＭＥ１は、Ｈ−２^ｂハプロタイプマウスに特徴的なＬＣＭＶ抗原由来のエピトープと、Ｈ−２^ｄハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする（別表ＩＩ）。したがって、ＦＰ９．ＭＥ１の、免疫応答を生起する能力を、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｄ）マウスで調べた。 Results In order to avoid conflicts between viral and tumor epitopes, ME1 includes epitope from characteristic LCMV antigen H-2 ^b haplotype mice, and those derived from characteristic tumor antigens to ^{H-2 d} haplotype mice Code (Appendix II). Therefore, FP9. The ability of ME1 to generate an immune response was examined in BALB / c (H-2 ^d ) and C57BL / 6 (H-2 ^d ) mice.

ｐＳＧ２．ＭＥ１及び／又はＦＰ９．ＭＥ１を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、腫瘍エピトープ（Ｈ−２^ｄ）に対してＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞を生起した（図１６）が、ＬＣＭＶエピトープ（Ｈ−２^ｂ）に対しては生起しなかった。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いた異種プライム／ブースト免疫化後に、腫瘍エピトープに対して生起されたＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞の総度数は、他の異種又は同種免疫化レジメンよりも有意に高かった（Ｐ＜０．００４）（図１６）。その他のレジメンを用いた免疫化は、対照構築物を用いた免疫化よりも有意に高いＴ細胞応答を生起したが、互いには有意に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化が、ＣＴ２６由来のイムノドミナントエピトープ、Ｐ８１５由来のＭＳＲエピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来のモデルＬ^ｄ−拘束性エピトープに対して相当なＴ細胞応答を生起したことが重要である。これらのエピトープの中で、ＣＴ２６エピトープに対する応答が最も大きく、この実験に用いたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイの検出限界（２０００ｓｆｃ／１００万個）を超えていた。これらの結果は、ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＴ２６結腸癌腫に対する保護的免疫応答を生起すると思われるということを示す（前記参照）。 pSG2. ME1 and / or FP9. Immunization of BALB / c mice with ME1 generated IFNγ secreting T cells against the tumor epitope (H-2 ^d ) (FIG. 16), but against the LCMV epitope (H-2 ^b ) Did not happen. pSG2. ME1 / FP9. After heterologous prime / boost immunization with ME1, the total frequency of IFNγ secreting T cells raised against tumor epitopes was significantly higher than other xenogeneic or allogeneic immunization regimens (P <0.004). (FIG. 16). Immunization with other regimens produced significantly higher T cell responses than immunization with the control construct, but not significantly different from each other (P> 0.05). pSG2. ME1 / FP9. Importantly, prime / boost immunization with ME1 generated substantial T cell responses against CT26-derived immunodominant epitopes, P815-derived MSR epitopes and β-galactosidase-derived model L ^d -restricted epitopes. It is. Among these epitopes, the response to the CT26 epitope was the largest, exceeding the detection limit (2000 sfc / million) of the IFNγ ELISPOT assay used in this experiment. These results indicate that pSG2. ME1 / FP9. We show that prime / boost immunization with ME1 appears to generate a protective immune response against CT26 colon carcinoma in BALB / c mice (see above).

ｐＳＧ２．ＭＥ１及び／又はＦＰ９．ＭＥ１を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化は、ＬＣＭＶエピトープ（Ｈ−２^ｂ）に対してＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞を生起したが、腫瘍エピトープ（Ｈ−２^ｂ）に対しては生起しなかった（図１７）。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化によって、ＬＣＭＶエピトープに対して生起されたＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞の総度数は、ＦＰ９．ＭＥ１単独又はｐＳＧ２．ＭＥ１単独を用いた同種免疫化によって生起されたものよりも有意に高かった（Ｐ＝０．００３）。興味深いことに。ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いる異種プライム／ブースト免疫化レジメンは、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を単独で用いる同種免疫化レジメンと比べて、ドミナント及びサブドミナントとして特性決定されたＣＤ８＋エピトープに対する、及びＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるものに対する大幅に増強された免疫応答を生起した。したがって、このプライム／ブースト免疫化レジメンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＬＣＭＶ感染に対して、同種プライム／ブースト免疫化レジメンよりも有効であると思われる（前記参照）。 pSG2. ME1 and / or FP9. Immunization of C57BL / 6 mice with ME1 resulted in IFNγ secreting T cells against the LCMV epitope (H-2 ^b ) but not against the tumor epitope (H-2 ^b ). (FIG. 17). pSG2. ME1 / FP9. The total number of IFNγ secreting T cells raised against LCMV epitopes by prime / boost immunization with ME1 was FP9. ME1 alone or pSG2. Significantly higher than that generated by allogeneic immunization with ME1 alone (P = 0.003). Interestingly. pSG2. ME1 and FP9. A heterologous prime / boost immunization regimen using ME1 is pSG2. ME1 and FP9. Compared to the allogeneic immunization regimen using ME1 alone, it generated a significantly enhanced immune response against CD8 + epitopes characterized as dominant and subdominant and against those recognized by CD4 + T cells. Therefore, this prime / boost immunization regime appears to be more effective than the allogeneic prime / boost immunization regimen against LCMV infection in C57BL / 6 mice (see above).

前記の明細書に記載したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することのない、本発明の記載した方法及び系の種々の改変及び変法は明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、化学、生物学又は関連分野の当業者には自明である、記載した本発明の実施様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にある。 All publications mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Various modifications and variations of the described methods and system of the present invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although the invention has been described in connection with specific preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in chemistry, biology or related fields are within the scope of the following claims.

注釈をつけたＦＰ９のゲノム。Annotated FP9 genome. ＨＰ１由来のＣＥＦ組織培養の継代中に、ＦＰ９において改変された遺伝子を示す表である。FIG. 5 is a table showing genes modified in FP9 during passage of HP1-derived CEF tissue culture. 組換えＦＰ９及びＦＰＶ−Ｍによって生起されたＴ細胞免疫応答の比較を示す図である。FIG. 2 shows a comparison of T cell immune responses generated by recombinant FP9 and FPV-M. 組換えＦＰ９、ＭＶＡ及びＰｂＳＣＰをコードするＤＮＡワクチンによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の比較を示す図である。FIG. 6 shows a comparison of CD8 + T cell immune responses generated by DNA vaccines encoding recombinant FP9, MVA and PbSCP. 鶏痘ＦＰ９を、異種プライム−ブースト免疫化レジメンにおいて初回抗原刺激剤及び追加免疫剤の双方として使用できることを示す図である。FIG. 5 shows that fowlpox FP9 can be used as both a prime and booster in a heterogeneous prime-boost immunization regimen. 鶏痘ＦＰ９が、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて結核菌Ａｇ８５Ａに対するＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方を生起し得ることを示す図である。FIG. 5 shows that fowlpox FP9 can generate both CD4 + and CD8 + T cell responses against Mycobacterium tuberculosis Ag85A in Balb / c mice. 鶏痘ＦＰ９が、非ヒト霊長類において結核菌Ａｇ８５Ａに対するＴ細胞免疫応答を生起することを示す図である。FIG. 5 shows that fowlpox FP9 elicits a T cell immune response against M. tuberculosis Ag85A in non-human primates. ＦＰ９及びＭＶＡウイルス抗原に対するｅｘｖｉｖｏＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。FIG. 3 shows ex vivo IFNγ ELISPOT responses to FP9 and MVA virus antigens. Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ウシ結核菌ＢＣＧを用いたエアゾール又は粘膜初回抗原刺激及びＭＶＡ８５Ａを用いた追加免疫後のｅｘｖｉｖｏＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。FIG. 6 shows ex vivo IFNγ ELISPOT response after aerosol or mucosal priming with M. bovine BCG and booster with MVA85A in Balb / c mice. アカゲザルにおける、ウシ結核菌ＢＣＧを用いたエアゾール又は粘膜初回抗原刺激とＭＶＡ８５Ａ及びＦＰＡｇ８５Ａを用いた追加免疫後のｅｘｖｉｖｏＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。FIG. 4 shows ex vivo IFNγ ELISPOT responses after rhesus monkey aerosol or mucosal prime challenge with M. bovine BCG and booster immunization with MVA85A and FPAg85A. 棒グラフである。It is a bar graph. 棒グラフである。It is a bar graph. ２つの棒グラフである。Two bar graphs. グラフである。It is a graph. 棒グラフである。It is a bar graph. ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化後の特異的免疫応答を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｐＳＧ２．ＭＥ１（ＤＮＡ）を用いて筋内注射で、又はＦＰ９．ＭＥ１（ＦＰ９）を用いて静脈注射で免疫化し、１５日後に同様の方法で追加免疫した。対照動物は、無関係な抗原をコードする同一のベクターを用いて免疫化した。追加免疫による免疫化の１３日後、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて腫瘍エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を測定した。カラムは、各群につき４個体のマウスの抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／脾細胞１００万個±１標準偏差を表す。図Ａは、合計エピトープ特異的応答及び植物性血球凝集素（ＰＨＡ）に対して生起された応答を示し、図Ｂは、個々のエピトープに対する応答を示す。In the BALB / c mouse, pSG2. ME1 and FP9. FIG. 5 shows specific immune response after prime / boost immunization with ME1. BALB / c mice are pSG2. Intramuscular injection with ME1 (DNA) or FP9. Immunization with ME1 (FP9) was carried out by intravenous injection, and boosted in the same manner after 15 days. Control animals were immunized with the same vector encoding an irrelevant antigen. Thirteen days after immunization with booster immunity, T cell responses elicited against tumor epitopes were measured in splenocytes using the IFNγ ELISPOT assay. Columns represent antigen specific IFNγsfc / million spleen cells ± 1 standard deviation of 4 mice per group. Figure A shows the total epitope specific response and the response generated against phytohemagglutinin (PHA), and Figure B shows the response against individual epitopes. Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化後の特異的免疫応答を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｐＳＧ２．ＭＥ１（ＤＮＡ）を用いて筋肉注射で、又はＦＰ９．ＭＥ１を用いて静脈注射で免疫化し、１４日後に同様の方法で追加免疫した。対照動物は、無関係な抗原をコードする同一のベクターを用いて免疫化した。追加免疫による免疫化の１３日後、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて腫瘍エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を測定した。カラムは、各群につき４個体のマウスの抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／脾細胞１００万個±１標準偏差を表す。図Ａは、合計エピトープ特異的応答及び各群の陽性対照として植物性血球凝集素（ＰＨＡ）に対して生起された応答を示し、図Ｂは、個々のエピトープに対する応答を示す。Ｂの凡例は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるイムノドミナントな（ＤＯＭ）エピトープ及びサブドミナントな（ＳＵＢ）エピトープ、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４）によって認識されるものを示す。In C57BL / 6 mice, pSG2. ME1 and FP9. FIG. 5 shows specific immune response after prime / boost immunization with ME1. C57BL / 6 mice were treated with pSG2. By intramuscular injection with ME1 (DNA) or FP9. Immunization with ME1 was carried out intravenously, and booster was performed in the same manner after 14 days. Control animals were immunized with the same vector encoding an irrelevant antigen. Thirteen days after immunization with booster immunity, T cell responses elicited against tumor epitopes were measured in splenocytes using the IFNγ ELISPOT assay. Columns represent antigen specific IFNγsfc / million spleen cells ± 1 standard deviation of 4 mice per group. Figure A shows the total epitope specific response and the response generated against phytohemagglutinin (PHA) as a positive control for each group, and Figure B shows the response to individual epitopes. The legend for B shows immunodominant (DOM) and subdominant (SUB) epitopes recognized by CD8 + T cells and those recognized by CD4 + T cells (CD4). カニクイザルの、気管内結核菌投与後、種々の週でのＰＰＤの平均インターフェロンγ応答を示す図である。FIG. 2 is a graph showing average interferon γ responses of PPD at various weeks after administration of tuberculosis in the trachea in cynomolgus monkeys.

Claims

被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 A method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising:
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating viral vector;
Administering to the subject in any order, wherein at least one composition comprises a poxvirus vector derivable from fowlpox virus.

被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 A method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising:
(I) a first composition comprising a DNA vaccine;
(Ii) a second composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Iii) a third composition comprising a second non-replicating viral vector;
Administering to a subject, wherein at least one composition comprises a poxvirus vector derivable from fowlpox virus.

被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 A method of treating and / or preventing a disease in a subject comprising:
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a second composition comprising a second non-replicating viral vector;
(Iii) a third composition comprising a third non-replicating viral vector;
Administering to a subject, wherein at least one composition comprises a poxvirus vector derivable from fowlpox virus.

少なくとも１種のベクターがＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 4. A method according to any one of claims 1 to 3, wherein the at least one vector is FP9 or derivable therefrom.

前記非複製ウイルスベクターの各々がポックスウイルスベクターを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。 The method of any one of claims 1 to 4, wherein each of the non-replicating viral vectors comprises a poxvirus vector.

少なくとも２種のポックスウイルスベクターが異なる属のポックスウイルスから誘導可能である、請求項５に記載の方法。 6. The method of claim 5, wherein the at least two poxvirus vectors are derivable from poxviruses of different genera.

少なくとも１種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、請求項６に記載の方法。 7. The method of claim 6, wherein at least one poxvirus vector is derivable from an avipoxvirus and at least one poxvirus vector is derivable from an orthopoxvirus.

ベクターのうちの１種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法：
（ｉ）１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２、
（ｉｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子が欠損している、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｖ）１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７、
（ｖ）１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９、
（ｖｉ）遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じるキメラ遺伝子を有する、鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉ）大きさが２７５ｋｂｐ未満である鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉｉ）配列番号１に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム、
（ｉｘ）ＯＲＦ１からＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣが欠失している配列番号１に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム。 8. A method according to any of claims 1 to 7, wherein one of the vectors comprises a fowlpox virus genome selected from:
(I) A fowlpox virus genome having one or more modified types of the following wild-type FPV genes:
FPV001, FPV018, FPV054, FPV063, FPV066, FPV070, FPV071, FPV093, FPV097, FPV098, FPV115, FPV124, FPV125, FPV127, FPV158, FPV159, FPV160, FPV190, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191 FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260,
(Ii) a fowlpox virus genome having a partial deletion in one or more of the following genes:
FPV158, FPV219, FPV222,
(Iii) A fowlpox virus genome lacking one or more of the following genes:
FPV001, FPV124, FPV125, FPV159, FPV160, FPV220, FPV221, FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260,
(Iv) A fowlpox virus genome having a frameshift mutation in one or more of the following genes:
FPV054, FPV070, FPV071, FPV115, FPV190, FPV207,
(V) a fowlpox virus genome having a termination mutation in one or more of the following genes:
FPV071, FPV239,
(Vi) a fowlpox virus genome having a chimeric gene resulting from (by deletion) the fusion of genes FPV097 and FPV098;
(Vii) a fowlpox virus genome having a size of less than 275 kbp,
(Viii) a fowlpox virus genome comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(Ix) A fowlpox virus genome comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which ACTGGTGCGAAGATCTC is deleted from ORF1.

鶏痘ウイルスゲノムがＮＯＩも含む、請求項８に記載の方法。 9. The method of claim 8, wherein the fowlpox virus genome also includes NOI.

ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the NOI is under the control of a poxvirus promoter.

ＮＯＩが、ネズミマラリア原虫（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．シノモルギ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はＴ．パルバ（ｐａｒｖａ）由来の抗原をコードする、請求項９又は１０に記載の方法。 NOIs are found in P. berghei, P. falciparum, P. falciparum. Cynomolgi, P. vivax, M. tuberculosis or T. vivax 11. A method according to claim 9 or 10, which encodes an antigen derived from parva.

アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、追加免疫組成物として投与する、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein a composition comprising a viral vector derivable from an avipoxvirus is administered as a booster composition.

アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、初回抗原刺激組成物として投与する、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein a composition comprising a viral vector derivable from an avipoxvirus is administered as a priming composition.

被験体が霊長類である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。 14. The method according to any one of claims 1 to 13, wherein the subject is a primate.

被験体がヒトである、請求項１４に記載の方法。 15. A method according to claim 14, wherein the subject is a human.

動物用ワクチンにおける、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。 Use of a non-replicating viral vector that is or is derivable from FP9 in an animal vaccine.

前記動物が哺乳類である、請求項１６に記載の使用。 The use according to claim 16, wherein the animal is a mammal.

前記哺乳類が霊長類である、請求項１７に記載の使用。 18. Use according to claim 17, wherein the mammal is a primate.

前記霊長類がヒトである、請求項１８に記載の使用。 19. Use according to claim 18, wherein the primate is a human.

医薬における、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。 Use of a non-replicating viral vector that is or is derivable from FP9 in medicine.

被験体において免疫応答を生起する方法であって、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。 A method of generating an immune response in a subject, comprising administering to said subject a composition comprising a non-replicating viral vector that is FP9 or derivable therefrom.

被験体において既存の免疫応答に追加免疫する方法であって、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。 A method of boosting an existing immune response in a subject comprising administering to said subject a composition comprising a non-replicating viral vector that is FP9 or derivable therefrom.

１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。 A fowlpox virus genome having one or more modified forms of the following wild type FPV genes:
FPV001, FPV018, FPV054, FPV063, FPV066, FPV070, FPV071, FPV093, FPV097, FPV098, FPV115, FPV124, FPV125, FPV127, FPV158, FPV159, FPV160, FPV190, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191, FPV207, FPV191 FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260.

１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、請求項２３に記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２。 24. A fowlpox virus genome according to claim 23 having a partial deletion in one or more of the following genes:
FPV158, FPV219, FPV222.

１種又は複数の以下の遺伝子を欠失している、請求項２３又は２４に記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。 The fowlpox virus genome according to claim 23 or 24, wherein one or more of the following genes are deleted:
FPV001, FPV124, FPV125, FPV159, FPV160, FPV220, FPV221, FPV241, FPV242, FPV243, FPV244, FPV245, FPV246, FPV247, FPV260.

１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、請求項１から２５のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７。 26. A fowlpox virus genome according to any of claims 1 to 25 having a frameshift mutation in one or more of the following genes:
FPV054, FPV070, FPV071, FPV115, FPV190, FPV207.

１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、請求項１から２６のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９。 27. A fowlpox virus genome according to any of claims 1 to 26 having a termination mutation in one or more of the following genes:
FPV071, FPV239.

遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じるキメラ遺伝子を有する、請求項１から２７のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。 28. The fowlpox virus genome according to any of claims 1 to 27, having a chimeric gene that is generated (by deletion) by the fusion of the genes FPV097 and FPV098.

大きさが２７５ｋｂｐ未満である、鶏痘ウイルスゲノム。 A fowlpox virus genome having a size of less than 275 kbp.

配列番号１に示される配列を含む、請求項１から２９のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。 30. The fowlpox virus genome according to any one of claims 1 to 29, comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1.

ＮＯＩも含む、請求項１から３０のいずれかに記載のゲノム。 31. A genome according to any of claims 1 to 30, which also comprises NOI.

ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項３１に記載のゲノム。 32. The genome of claim 31, wherein the NOI is under the control of a poxvirus promoter.

ＮＯＩが、ネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、Ｐ．シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はＴ．パルバ由来の抗原をコードする、請求項３１又は３２に記載のゲノム。 NOI is a murine malaria parasite, P. falciparum parasite, Cynomolgi, Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis or T. The genome according to claim 31 or 32, which encodes an antigen derived from Parva.

請求項１から３３のいずれかに記載のゲノムを含むウイルス粒子。 A virus particle comprising the genome according to any one of claims 1 to 33.

請求項３１から３３のいずれかに記載のゲノムを含み、ＮＯＩを標的細胞へ送達可能なウイルス粒子。 34. A viral particle comprising the genome of any of claims 31 to 33 and capable of delivering NOI to target cells.

請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子を含むワクチン。 36. A vaccine comprising the viral particles of claim 34 or 35.

請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子を含む、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤。 36. An priming or boosting agent comprising the virus particle of claim 34 or 35.

（ｉ）請求項３４又は３５に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物
とを含むワクチン接種キット。 (I) a first composition comprising fowlpox virus particles according to claim 34 or 35;
(Ii) A vaccination kit comprising a second composition for simultaneous, separate or sequential administration.

（ｉ）請求項３４又は３５に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む初回抗原刺激組成物と、
（ｉｉ）ワクシニアウイルス粒子を含む追加免疫組成物
とを含む、請求項３８に記載のキット。 (I) an initial antigen stimulating composition comprising fowlpox virus particles according to claim 34 or 35;
39. The kit of claim 38, comprising (ii) a booster composition comprising vaccinia virus particles.

霊長類にいずれかの順序で逐次投与するための、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、ワクチン接種キット。 For sequential administration to primates in either order,
(I) a first composition comprising a first non-replicating viral vector;
(Ii) a vaccination kit comprising a second composition comprising a second non-replicating viral vector.

（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、請求項４０に記載のワクチン接種キット。 (I) a first composition comprising a first non-replicating poxvirus vector;
41. The vaccination kit of claim 40, comprising (ii) a second composition comprising a second non-replicating poxvirus vector.

第１の非複製ポックルウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第２の非複製ポックルウイルスベクターがオルトポックスウイルスベクターである、請求項４１に記載のキット。 42. The kit of claim 41, wherein the first non-replicating pockle virus vector is an avipox virus vector and the second non-replicating pockle virus vector is an orthopox virus vector.

第１の非複製ポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスベクターである、請求項４１又は４２に記載のキット。 43. The kit according to claim 41 or 42, wherein the first non-replicating poxvirus vector is a fowlpox virus vector.

第１の非複製ポックスウイルスベクターが請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項４３に記載のキット。 44. The kit of claim 43, wherein the first non-replicating poxvirus vector is or is derivable from a viral particle of claim 34 or 35.

第１及び第２の組成物が同一抗原を発現可能である、請求項３８から４４のいずれかに記載のキット。 45. A kit according to any of claims 38 to 44, wherein the first and second compositions are capable of expressing the same antigen.

霊長類被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物。 A booster composition comprising a non-replicating viral vector capable of boosting an existing immune response in a primate subject.

鶏痘ウイルスベクターを含む、請求項４６に記載の追加免疫組成物。 47. The booster composition of claim 46, comprising a fowlpox virus vector.

請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項４７に記載の追加免疫組成物。 48. A booster composition according to claim 47, which is or is derivable from a virus particle according to claim 34 or 35.

被験体に、請求項３６に記載のワクチン、請求項３７、４６、４７又は４８のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項３８から４５のいずれかに記載のキットを投与するステップを含む、ワクチン接種法。 A subject is administered a vaccine according to claim 36, a primed or boosted composition according to any of claims 37, 46, 47 or 48 or a kit according to any of claims 38 to 45. Vaccination method comprising the steps of:

請求項３６に記載のワクチン、請求項３７、４６、４７又は４８のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項３８から４５のいずれかに記載のキットの、被験体において疾病を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用。 45. A disease in a subject of the vaccine of claim 36, the priming or boosting composition of any of claims 37, 46, 47 or 48, or the kit of any of claims 38 to 45. Use in the manufacture of a medicament for treating and / or preventing.

被験体においてＴ細胞免疫応答を生起する、請求項４９に記載の方法、又は請求項５０に記載の使用。 51. The method of claim 49 or the use of claim 50, wherein said method produces a T cell immune response in a subject.

疾病が、マラリア、結核又は東海岸熱（ＥａｓｔＣｏａｓｔＦｅｖｅｒ）などの慢性感染であるか、又はそれに起因するものである、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法又は使用。 52. The method or use according to any of claims 49 to 51, wherein the disease is or is due to a chronic infection such as malaria, tuberculosis or East Coast Fever.

非培養ＣＥＦ細胞の、アビポックスウイルスを増殖させるための使用。 Use of uncultured CEF cells to propagate avipoxvirus.

アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項５３に記載の使用。 54. Use according to claim 53, wherein the avipox virus is fowlpox virus.

ポックスウイルスが請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子である、請求項５４に記載の使用。
56. Use according to claim 54, wherein the poxvirus is a viral particle according to claim 34 or 35.