【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨シアロプロテイン(sialoprotein)遺伝子、マトリックスｇｌａタンパク質(matrix gla protein)遺伝子、オステオポンチン(osteopontin)遺伝子及び/又はオステオプロテジェリン(osteoprotegerin=OPG)／破骨細胞生成阻害因子(osteoclastogenesis inhibitory factor=OCIF)遺伝子における多形に基ずいた種々の病状に対する疾病素因を評価判定する方法に係わる。更に具体的には、これらの多形の検索することによって骨粗しょう症やアテローム性動脈硬化症を含む種々の病理的石灰化又はカルシウム沈着症状に対する個人の疾病素因を評価判定する方法に係わる。本発明の方法は、ヒト骨シアロプロテイン遺伝子、ヒトマトリックスｇｌａタンパク質遺伝子、ヒトオステオポンチン遺伝子及び/又はオステオプロテジェリン／破骨細胞生成阻害因子(ＯＣＩＦ)遺伝子における対立遺伝子変異を決定して、かくして骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の大小に対する疾病素因を予測するのに特に有用である。本発明はまた、該多形を含有する種々の骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）遺伝子、マトリックスｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）遺伝子、オステオポンチン（ＯＰＮ）遺伝子及び/又はＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子並びにこれらに対するプローブ及びプライマーにも係わる。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗しょう症は、今日においては年齢が６０才以上の人において最もよく見られる疾病の一つであり、アメリカだけでもすいて２５００万人が罹患しており、その女対男の比率は５：１である。このことは、年齢６０才以上のほぼ２５ないし３０％に相当する。ヨーロッパにおいては、この疾病に罹患した人の比率は、ほぼ同じである。
【０００３】
目下のところ、骨粗しょう症には治療法は全くない。しかしながら、ホルモン代替療法及びビスホスホネ―トによる治療によれば、骨損失を停止するか又は遅延させることが出来る。従って、かかる骨損失診断の可能性が早くなればなるほど、それだけ治療の効果も一層良くなのであって、可能な限り早期に骨粗しょう症に対する疾病素因を有する人を同定することが出来るならば、特に有利となるはずである。骨粗しょう症の発症に関連した強力な遺伝子成分が存在しているので（以下を参照のこと）、ピーク骨質量及び/又は骨損失速度に影響を及ぼす遺伝子を特定することは、骨粗しょう症の疾病素因を有する遺伝子型の人を若い時期に特定することが出来、それだけ多くの時間を予防方策を講じるために割くことが出来ることになり、大いに役立つであろう。
【０００４】
このような観点から、ピーク骨質量、即ち骨ミネラル密度が相対的に低いか又は骨質量、即ち骨ミネラル密度の損失速度が相対的に速い素因を有する個人又はグループを特定することが、関連し該当することになる。
【０００５】
骨ミネラル密度に対する、従って恐らくは骨粗しょう症に対する遺伝子寄与の程度は、双生児に関する研究から２０年以上も前から明らかとなっている(Smith et al,1973)。ＢＤＭ及び骨幅の分散が、一卵性双生児におけるよりも二卵性双生児において大きいことが見出され、骨質量の調節に対して遺伝子影響が相当大きいことが示された(Smith et al,1973)。また別の双生児に関する研究の結果、種々の遺伝要因が、ＢＭＤ変化に及ぼす統計的に有意な影響が報告された(Kelly et al,1993)。その他のいくつかの研究の結果から、ピーク骨質量の獲得に対して強い遺伝子の影響があることが明らかとなっている(Gueguen et al,1995;Lutz & Tesar,1990)。従って、当該遺伝子成分が、ピーク骨質量及び骨損失速度の双方に一定の影響を及ぼすように思われる。遺伝子隔離解析の結果から、骨質量は何れも中程度の影響であるがいくつかの遺伝子によって制御されることが強く示唆されている(Gueguen et al,1995)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる分子機構及び遺伝学については、骨形成及び骨吸収に影響を及ぼす遺伝子の探索が強力に行われてきたにも拘わらず、殆ど知られていないのである。ここ5年以内において、主として調節タンパク質をコードする遺伝子において同定された多形のうち、ＢＭＤに関連したものは以下のようである：
１）Morrison及び共同研究者(Morrison et al,1994; WO94/03633)によって同定されたビタミンＤレセプター遺伝子多形は、多くの研究報告の主題となっているが、ほぼ半分においてしか、有意であるものの弱い相関性が見出された過ぎず、またかかる相関性も、Riggs(Riggs,1997)によって示唆されているように、骨損失速度に対するよりもピーク骨質量に対して強い関連する可能性がある。
【０００７】
２）Kobayashi及び共同研究者によって同定されたエストロゲンレセプター遺伝子多形は、低いＢＭＤに関連している(Kobayashi et al.,1996, US58 34200)。
【０００８】
３）Grant及び共同研究者によって同定されたＩα１型コラーゲン遺伝子における多形(Grant et al,1996;WO9732041)は、ピーク骨質量よりも骨損失速度に関連している(Uitterliden et al,1998)。
【０００９】
４）インターロイキンー６遺伝子―破骨細胞系の細胞に対して刺激効果を有するインターロイキンーの３‘周辺におけるＡＴリッチなミニサテライト重複における二種の多形が、低いＢＭＤと関連していることが見出されている(Murray et al,1997-WO9743446)。これらの多形は、ピーク骨質量に影響するように思われる。
【００１０】
５）インターロイキンー１レセプターアンタゴニスト遺伝子において最近見出された二つのタンデム重複多形が、骨損失速度に関連している(Keen et al,1998; WO9844150)。この遺伝子に注目する理由は、インターロイキン−１は、破骨細胞による骨吸収の強力な刺激物質であることである。
【００１１】
エストロゲン欠乏状態では、インターロイキンー１は刺激されるが、インターロイキンー1レセプターアンタゴニストは、阻害されるのであって、これに関連した骨損失は、インターロイキンー1レセプターアンタゴニストを用いた治療によって阻止することが可能であり、かかるアンタゴニストは、閉経後骨損失を調節するための優れた候補遺伝子となるものと思われていた(Keen et al,1998)。
【００１２】
６）オステオカルシン遺伝子における多形が最近報告されている(Dohi et al,1998)。しかしこの多形によって、異所対立遺伝子を持つ人達について測定されたＢＭＤを野生型遺伝子型を有する人達について測定したＢＭＤとから充分有意に区別することが出来なかった。
【００１３】
７）低いＢＭＤ、即ち骨粗しょう症に関連した多形は、ＴＧＦ−β１遺伝子において報告されているが、そのタンパク質産生物は、骨中には豊富に存在し、骨吸収と骨形成との重要な調節因子である(Langdahl et al,1997;Yamada et al., 1998; WO97/28280)。
【００１４】
８）アポリポプロテインＥにおける多形が、閉経後の日本人婦人における低いＢＭＤに相関関係を有するものと報告されている(Shiraki et al,1997)。この遺伝子に注目する理由は、γーグルタミルカルボキシラーゼを介してオステオカルシンを活性化するビタミンＫの濃度が、アポリポプロテインＥ表現型に相関ずけられた旨の報告があったからである(Saupe et al,1993)。
【００１５】
９）ＷＯ９７０５２７５は、レチノイン酸レセプター遺伝子における対立遺伝子変異体を解析することによって骨密度を予見する用途を開示している。
【００１６】
ビタミンＤレセプター遺伝子及びＩ型１コラーゲン遺伝子多形だけが、検査したコホートの一部分におけるＢＭＤと相関するように思われた（その他の遺伝子多形は、小規模な、国民的コホートについて検定されているに過ぎず、その大半は、骨代謝にとってはむしろ瑣末である）。骨粗しょう症発症に及ぼす遺伝子の影響は、複数遺伝子の不十分な作用によって惹起されるため、このことは、驚くべきことでもない。一層広大な地理学的エリア内で有効な、より優れた予見能力を獲得・入手するためには、骨形成／吸収に対して影響を持つ更なる遺伝子多形を同定しなければならないことは、明らかである。この点については、骨内に存在する種々のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に傾注・集中することが重要であると信じるが、その理由は下記のようである：即ち、骨粗しょう症の素因となる突然変異は、50年以上物理的な検出を拒絶してきたものであるか、自然界においては捕らえ難い微妙なものであるからである。ある遺伝子産生物の機能ではなく、その発現に影響を及ぼす突然変異は、このように微妙な効果を示すものと期待されるであろう。遺伝子発現は、遺伝子のコード領域の上流に位置するプロモーターによって制御されるのであり、この領域における突然変異が、変容した遺伝子発現を惹起するはずである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明は、選択された一定の石灰化状態に対する個人の疾病素因を評価判定する方法であって、骨シアロプロテイン遺伝子のプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子のプロモーター、オステオポンチン遺伝子のプロモーター、若しくはＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子のプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターの遺伝子型を決定することを含んで成る該評価判定方法を提供するものである。
【００１８】
本発明に従って評価判定される疾病素因の対象である石灰化状態は、骨質量ピークに高低があること（将来、現在又は過去の状態として）又は骨損失速度に大小があること（将来、現在又は過去の状態として）である。即ち、本発明は、骨粗しょう症に対する疾病素因を評価判定するために使用することも可能である。
【００１９】
本発明は第二の局面において、前記プロモーターの一種又はその任意の組合せに対立遺伝子変異に関連したあらゆる状態・症状に対して個人が有する疾病素因を評価判定する方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は典型的には、ある個人が、骨シアロプロテインプロモーター（ＢＳＰ）、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター（ＭＧＰ）、オステオポンチンプロモーター（ＯＰＮ）、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターに対してホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかを決定することを含んで成るものである。本方法は、好便には、骨シアロプロテイン、マトリックスｇｌａタンパク質、オステオポンチン若しくはＯＰＧ／ＯＣＩＦ又ははこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の異常産生の相関関係を有する症状又は疾病、例えば骨粗しょう症又はアテローム性動脈硬化症などのリスクに曝されている個人を検査探索するために使用される。
【００２１】
ヒトシアロプロテインプロモーターのＤＮＡは既知であり、Matrix Biol.14:31-40(1994)においてKim, R.H.et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｌ２４７５６号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトマトリックスｇｌａタンパク質プロモーターのＤＮＡは既知であり、J.Biol. Chem.265 (25):15040-15048(1990)においてCancel, L. et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｍ５５２７０号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトオステオポンチンプロモーターのＤＮＡは既知であり Biochem. J. ,303:255-262 (1994)においてHijiya et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｄ１４８１３号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーターのＤＮＡは既知であり、Eur. J. Biochem.254(3): 658-691(1998)においてMorinaga et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＢ００８８２１号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。かかる用語は、これらの報告済み配列の如何なる配列も、当該母集団においてこれらの変異型よりも優勢であること又はかかる配列のそれぞれの配列若しくは如何なる配列もが病理学上のリスクが最低であることに関連するものであることを意味するものではない。本発明の方法には、検査を受ける個人が、報告済み配列と同一である（又は前記配列の選択された領域と同一である）、骨シアロプロテインプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター、オステオポンチンプロモーター、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターを有しているか否か、又は当該個人が、報告済み配列とは異なる（又は前記した選択個所において異なる）、骨シアロプロテインプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター、オステオポンチンプロモーター、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターを有しているか否かを、ホモ接合であるかヘテロ接合であるかに係らず決定することを包含するものである。
【００２２】
本発明は、上記した方法において、当該ＢＳＰの塩基対１４９６なる位置における配列、具体的にはこの位置における配列がＡ（報告済み）であるかＧであるかを決定するか、又は塩基対１８６９なる位置における配列、具体的には前記位置における配列がＧ（報告済み）であるか又はＡであるかを決定する方法を包含する。上記において特定した位置は、報告済み配列の開始点から番号を付けたものである。また別の番号付けスキームでは、これらの位置は、当該遺伝子の転写配列の開始点から塩基対−６８３及び塩基対ー３１０である。これ以降は、このような特異的な対立遺伝子変異は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａなる用語を用いて表示することとする。
【００２３】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＭＧＰの塩基対２４２なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合で又は転写配列の開始点から塩基対―３１５７なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＣであるか（報告済み）又はＡであるかーこれ以後ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａと称するーを決定する方法を包含する。
【００２４】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＯＰＮの塩基対５２０なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合又は転写配列の開始点から塩基対―１７４８なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＧであるか（報告済み）又はＡであるかーこれ以後ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａと称するーを決定する方法を包含する。
【００２５】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＯＰＮの塩基対１８２５なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合又は転写配列の開始点から塩基対―４４３なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＴであるか（報告済み）又はＣであるかーこれ以後ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃと称するーを決定する方法を包含する。
【００２６】
本発明は、上記した方法において、当該ＯＰＧ／ＯＣＩＦの塩基対１６３なる位置における配列、具体的にはこの位置における配列がＡ（報告済み）であるかＧであるかを決定する方法を包含する。上記において特定した位置は、報告済み配列の開始点から番号を付けたものである。また別の番号付けスキームでは、これらの位置は、当該遺伝子の転写配列の開始点から塩基対−９４３である。これ以降は、このような特異的な対立遺伝子変異は、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇなる用語を用いて表示することとする。
【００２７】
本発明者らは、当該個人のＢＳＰ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、１４９６なる位置においてＡではなくむしろＧを有しているか又は１８６９なる位置においてＧではなくむしろＡを有している場合、かかる事実は、ピーク骨質量がより大きくなることに関連ずけられる、ということを見出したのである。
【００２８】
同様に、本発明者らは、当該個人のＭＧＰ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、２４２なる位置においてＣではなくむしろＡを有している場合、かかる事実は、ピーク骨質量損失速度がより大きくなることに関連ずけられる、ということを見出したのである。
【００２９】
本発明者らは更に、ＯＰＮの塩基対５２０なる位置においてＧではなくＡが存在する少なくとも一つのコピーを有することが、骨質量損失速度がより大きくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３０】
本発明者らは更に、ＯＰＮの塩基対１８２５なる位置においてＣではなくＴが存在する少なくとも一つのコピーを有することが、骨質量がより少なくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３１】
本発明者らは、個人のＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、塩基対１６３なる位置においてＧではなくむしろＡを有する場合、かかる事実は骨質量がより大きくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３２】
遺伝子プロモーター配列に係る関連した測定は、一般的に前記個人の前記遺伝子プロモーターのうち関連した部分を増幅することを含む、広範に知られている方法で実施される。前記増幅済みの部分配列は、ハイブリダイゼーション測定法又は制限酵素切断断片長分析によって決定することが可能である。
【００３３】
具体的には、増幅は、選別したプロモーターを用いて行えばよいのであるが、かかるプロモーターの選別は、報告済み配列のうちのから選択した配列又は報告済み配列の変異が存在する場合、増幅によって増幅遺伝子において一種の制限酵素によって切断される新たな個所が生じるように行うのである。即ち、当該増幅遺伝子の酵素処理によって、複数の異なる制限酵素切断断片が生成されるのである。本発明は、前記遺伝子プロモーターのうち該当する部分の増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライマーを包含する。具体的には、本発明は、選別した変異の有無に依存して異なる制限酵素切断パターンを生成するように選択したプロモーターを包含するのである。本発明に従った適当なプロモーターは、下記する実施例において記載する。
【００３４】
本発明は、前記した疾病素因の一つを決定し、次いで当該個人に医薬品を投与して、かくして骨粗しょう症を予防若しくは治療するか又は当該個人が低いピーク骨質量又は大きい骨質量損失速度の素因がある場合は骨粗しょう症の発症を遅延せしめることを含んで成る、骨粗しょう症を治療する方法を包含する。
【００３５】
骨シアロプロテインとは、骨組織に特異的な３３−３４ｋＤの新生タンパク質であって、グリコシル化、リン酸化及び硫酸化によって広範に翻訳後修飾されてその結果最終分子量が５７ｋＤとなったものである(Oldberg et al.,1988; Ecarot-Charrier et al.,1989;Fisher et al.,1990; Zhang et al.,1991)。オステオポンチンと共に、ＢＳＰは、骨マトリックスにおいて最も多量に存在する非コラーゲン質タンパク質であり(Nagata et al.,1991)、破骨細胞に見出されたαVβ3インテグリン型の細胞表面レセプターを経由した細胞付着を媒介するＲＧＤモチーフを含有している(Oldberg et al., 1988; Flores et al.1992;Ross et al.,1993)。また、強力なヒドロキシアパタイト核形成領域を創生するポリグルタミン酸からなるセグメントを幾つか有している(Hunter & Goldberg,1993)。ラットを用いた(Chen et al.,1991; Chen et al.,1992)またトランスジェニックマウスを用いた(Chen et al.,1996)内因性ＢＳＰの局在化に関する研究の結果、ＢＳＰの最も高い発現は、新生児骨において生起し、それ以降の成長と発育に伴なって発現は顕著に低下することが判明している。ＢＳＰは、免疫組織化学的手法を用いて、無機化前線より前において局在化させたところ、ＢＳＰが骨無機化の開始に必要であることが示唆されている(Roach,1994)。従って、ｍＲＮＡは、デノーボで無機質化した組織形成部位において分化した骨芽細胞、ぞうげ細胞及びセメント芽細胞において検出されたに過ぎない(Chen et al.,1991;Chen et al.,1992)。導入遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子にラットＢＳＰから得たほぼ２．７ｋｂプロモーター領域を融合させたもである、トランスジェニックマウスにおいて、同一の発現パターンが認められ、その結果ラットプロモーターのほぼ２．７ｋｂ領域が骨組織に特異的な転写を仲介するのに充分であることが明らかとなっている(Chen et al.,1996)。
【００３６】
マトリックスｇｌａタンパク質は、五つのγ―カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）残基を含んだ、分子量がほぼ１４ｋＤａである７９個のアミノ酸残基から成る小型のタンパク質である(Price & Williamson; Loeser & Wallin,1992)。このｇｌａ残基は、恐らくはビタミンＫ依存性酵素であるγ―カルボキシラーゼによる翻訳後修飾の産物であるのであろう。ＭＧＰは、ｇｌａ依存態様でヒドロキシアパタイトに強力に結合する(Dowd et al.,1995)。高濃度のＭＧＰが、骨、ぞうげ質及び軟骨からなる細胞外マトリックス中に見出されている(Hail et al.,1988)。しかしながら、ＭＧＰは多くの組織において発現しており、最も高い濃度のｍＲＮＡが、肺、心臓、腎臓及び軟骨において認められている(Fraser & Price,1988)。骨内部におけるＭＧＰの機能に関する最初の徴候は、γ―カルボキシラーゼ阻害剤であるワーファリンで処置されたラットを用いた実験から得られた。用いた動物は、成長層板が過剰に無機質化しており、骨内におけるＭＧＰの一つの機能は、ヒドロキシアパタイト生成の阻害であり得ることが示された(Price et al.,1982)。このような機能に対する最終的な証拠が、ＭＧＰノックアウトマウスに関する研究から得られている。なおこのノックアウトマウスは、動脈石灰化・カルシウム沈着により血管破裂を起こして生後2ヶ月以内に死亡する。ＭＧＰ欠乏マウスもまた、成長層板の石灰化が不十分となり得るが、この場合石灰化は、健常動物において認められる下部肥厚部位に制限されるのではなく、むしろ増殖している軟骨細胞部にまで拡大するのである。健常な石灰化は、軟骨細胞柱の解体・崩壊に連なり、最終的に短伸長、骨減少症や骨折を起こす原因となる(Luo et al.,1997)。これらの結果から、ＭＧＰは、軟組織において石灰化を阻害し且つ成長板軟骨内部での無機質化を下部肥厚部にのみ限定する機能を果たすものと強く示唆される。なお、後者は恐らくは増殖中の軟骨細胞の基底領域における石灰化を阻害することによるものであろう。
【００３７】
オステオポンチンは、４４ｋＤａのリン酸化され且つグリコシル化されたタンパク質であって(Price et al.,1987)、ＢＳＰと共に、ＯＰＮは、骨マトリックスにおいて最も多量に存在する非コラーゲン質タンパク質であるが(Nagata et al.,1991)、ＢＳＰとは異なって他のいくつかの組織においても発現される(Denhardt & Guo,1993)。オステオポンチンとＢＳＰとは、明らかに関連がある：即ち、１）これらは何れも、αVβ3インテグリン型の細胞表面レセプターを介した細胞付着を媒介するＲＧＤ領域を有している(Ross et al.,1993; Wong et al.,1996);2)これらは何れも、酸性アミノ酸（ＯＰＮは、ポリアスパラギン酸セグメントを有し、またＢＳＰは、ポリグルタミン酸セグメントを有する）及びシアル酸の含有量が高い(Franzen & Heinegard)。
【００３８】
リン酸化オステオポンチンは、強力なヒドロキシアパタイト形成阻害剤であり、他方その脱リン酸化型は、阻害作用は遥かに弱い媒介するＲＧＤモチーフを含有している(Hunter et al., 199)。骨内においては、オステオポンチンは、骨ライニング細胞の基底となる境界板(lamina limitans)において高濃度で見出され、また逆転（セメント）線内では、骨沈着が骨吸収減少に遅れるマトリックス−マトリックス界面で認められる(McKee & Nanci 1996;McKee et al.,1993)。これらの知見は、オステオポンチンの持つヒドロキシアパタイト阻害活性と併せて、オステオポンチンは、Hunter et al.,1994が考察したように、一旦活発な骨形成が終焉すると、成長中のヒドロキシアパタイト表面を密閉・包囲する作用を発揮する可能性があることを示唆するものである。最近、オステオポンチンノックアウトマウスが、健常な発育と骨構造を示すが、破骨細胞形成はインビトロで増進され(Rittling et al.,1998)また破骨細胞の数は、野生型マウスにおけるよりもＯＰＮ−／−において骨端領域において多いことが明らかにされている(Yoshitake et al.,1998)。興味深いことに、Yoshitakeとその共同研究者らもまた、野生型動物の大たい骨で骨髄切除後における新たに形成された過剰骨は、２週間後に吸収されたが、他方ＯＰＮ−／−マウスでの同様の実験においては骨吸収は一切認められなかったことを明らかにしている(Yoshitake et al.,1998)。従って、ＯＰＮ−／−マウスにおける破骨細胞数の増加は、骨吸収能力が低下したことの補償である可能性がある。このことは、上記したHunterとその共同研究者らが提出した、オステオポンチンは、骨形成後における成長ヒドロキシアパタイト表面を制限する作用を有する、という概念を実体化するものである。
【００３９】
マトリックスｇｌａタンパク質及びオステオポンチンとによって促進されることが示唆されてきたもう一つの症状は、アテローム性動脈硬化症である(Shanahan et al.,1994;Sohnma et al.,1994)。Watanabe遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギの大動脈から誘導したｃＤＮＡライブラリーを検索するために差次ハイブリダイゼーション技法を使用して、Ｓｏｈｍａと共同研究者らは、マトリックスｇｌａタンパク質をコードするクローンを一つ見出した(Sohma et al., 1994)。年齢の異なるＷＨＨＬと健常ウサギの大動脈から作成したＲＮＡのノーザンブロット分析の結果、マトリックスｇｌａタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ＷＨＨＬウサギにおけるアテローム性動脈硬化症への進行と比例して増大したことが明らかとなった(Sohma et al.,1994)。さらには、マトリックスｇｌａタンパク質を欠損したマウスは、大動脈石灰化が原因で死亡している(Luo et al., 1997)。これらのマウスにおいてはアテローム性動脈硬化性プラクが一切認められなかったため、マトリックスｇｌａタンパク質は、一旦プラクが形成されると石灰化に影響を及ぼす可能性があるものと示唆される。しかしながら、高濃度のマトリックスｇｌａタンパク質が、アテローム性動脈硬化性プラクの脂質含量の多い部位に局在していた(Shanahan et al.,1994)。また、高濃度のオステオポンチンｍＲＮＡとタンパク質が、ヒトアテロームプラクにおいて壊死性脂質コア―と石灰化領域において認められている(Shanahan et al.,1994)。
【００４０】
オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）／破骨細胞形成阻害因子（ＯＣＩＦ）は、最近独立して二つのグループによって、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリに関連した、分子量がほぼ５５ｋＤａで、長さが３８０個のアミノ酸残基である糖タンパク質であると同定された(Simonet et al.,1997: Yasuda et al.,1997)。他のＴＮＦ−Ｒ様分子とは異なって、このサイトカインレセプターは、膜貫通領域を欠落しており(Simonet et al.,1997)、従ってＯＰＧ／ＯＣＩＦは、分子量がほぼ１１０ｋＤａのダイサルファイド結合ホモダイマーとして現出する分泌型タンパク質である(Simonet et al.,1997)。
【００４１】
当初、ラットＯＰＧ／ＯＣＩＦに対してトランスジェニックであるマウスは、骨粗しょう症を発症することが見出され、その結果ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、骨芽細胞―介在骨形成を増大させるか又は破骨細胞―介在骨形成を減少させるか機能を発揮する可能性が明らかとなった(Simonet et al.,1997)インビトロでの破骨細胞形成測定試験において、組換え型のＯＰＧ／ＯＣＩＦが、強力な破骨細胞形成阻害剤であることが見出された(Simonet et al.,1997)。かかる知見と一致して、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスが、骨粗しょう症を発症し、ＯＰＧ／ＯＣＩＦが生後の骨質量の重要な調節因子であることが強調されることとなった(Bucay et al.,1998)。
【００４２】
マウスの胚形成過程において、ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、発達中の骨の軟骨においてまたいくつかの主要な動脈、胃腸管や皮膚において高度に発現されている(Simonet et al.,1997)。成体動物において、ＯＰＧ／ＯＣＩＦ発現は、心臓、脳、肺や肝臓を含むいくつかの組織において見出されており、このことは、ヒト組織ではＯＰＧ／ＯＣＩＦ発現は脳や肝臓では認められず、腎臓において高度に発現され且つ種々の造血器官や免疫器官において検出可能であるのと異なる(Simonet et al.,1997)。このような異なる観察結果に関しては、真の種特異的発現相異によるものであり得るとする以外、一切説明がなされていない。
【００４３】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦに対するリガンドもまた、ＯＰＧ／ＯＣＩＦを同定した同じ二つのグループによって独立して同定された。このリガンドは、ＯＰＧリガンド（ＯＰＧＬ）(Lacey et al.,1998)又は破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）(Yasuda et al.,1998)とも称されるが、TNF―関連サイトカインであって、これは、破骨細胞系統にコミットした造血祖先細胞に結合する(Lacey et al.,1998)。インビトロＯＰＧＬ／ＯＤＦもまた、骨吸収を行うよう破骨細胞を刺激し、また皮下注入した組換え型ＯＰＧＬ／ＯＤＦは、マウスにおいて骨吸収を刺激する(Lacey et al.,1998)。ＯＰＧＬ／ＯＤＦは，４５ｋDaの膜結合タンパク質としてか又は３１ｋＤａの可溶性分泌型C―末端断片として産生される(Lacey et al.,1998)。
OPGL／ODFは、以前に同定された二種のサイトカイン、即ちT細胞活性化に必須であるTNF-関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）(Wing et al.,1997)及び樹状細胞活性化に必須であるNF−ｋBリガンドのレセプター活性化因子（ＲＡＮＫＬ）(Anderson et al.,1997)と同一であり、リンパ組織及び海綿質において高度に発現される(Lacey et al.,1998;Yasuda et al.,1998)。
【００４４】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、ＯＰＧＬ／ＯＤＦに結合し且つその作用を阻害するものであるので、これら二種のタンパク質は、破骨細胞発達、従って最終的には骨吸収の重要な細胞外調節因子であるようである。
【００４５】
骨粗しょう症の表現型は別にして、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスもまた、２月齢までに大動脈と腎臓動脈の石灰化が顕著であった(Bucay et al., 1998)。即ち、ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、骨格の脱石灰化を阻害しまた同時にいくつかの血管石灰化を阻害するのである。同様の減少が、マトリックスｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）ノックアウト動物(Luo et al.,1997)において以前に観察されていた。しかしながら、このような動脈石灰化は、ＭＧＰノックアウト動物においては、更に広く散在し且つ明白となっており、他方骨損失は、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウト動物では重篤である。血管の石灰化を予防・防止するのに関与するタンパク質類の異常発現は、理論的にはアテローム性動脈硬化症プラクの生成に関連したものであり得るであろう。しかしながら、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスにおいては(Bucay et al.,1998)、アテローム性動脈硬化症発症における直接的な役割を除いては、アテローム性動脈硬化性プラクは一切認められなかった。尤もこうであるとっても、ＯＰＧ／ＯＣＩＦの異常発現は、始原病変が一旦生起すると、アテローム性動脈硬化プラクの形成を促進する二次的な要因となり得る、ということを排斥するものではないであろう。
【００４６】
上記したような骨粗しょう症又はその他の石灰化状態に関連した疾病に対する個人の疾病素因を判定評価する方法は、全身又は選定した身体部位を基準としたの骨質量測定方法と組み合わせてもよい。これら測定方法としては、Ｘ線又は超音波ＢＭＤ測定法が挙げられる。本明細書において記載する方法はまた、血清や血液など体液中の化学的骨吸収マーカーの測定、例えばＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド断片のＣｒｏｓｓｌａｐｓTMによる測定又はＩ型コラーゲンのＮ−テロペプチドの測定などと組み合わせてもよい。
【００４７】
これら異なる種類の測定法はそれぞれ、リスクファクターとして取り扱い、加重態様でその他の方法（一つは当然ながら、本発明に従った遺伝子疾病素因測定法である）の一つ以上と組み合わせてもよい。
【００４８】
【実施例】
本発明の本質を更に明瞭に理解してもらうために、以下に添付した図面に示す図を参照して、実施例を記載する。
【００４９】
実施例１（18年間の研究）
方法
被験者―百三十三人の女性をＢＭＤ、生化学的マーカー、身長及び体重について18年間（１９７７−１９９５年）追跡し、これを本研究に用いた。このコホート二間する詳細な記載は、以前に報告済みである(Joergensen et al.,1996)。
ＤＮＡ分析。ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＡとＯＰＧ−Ｇ１８６９Ａ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第Ｍ５５２７０号として寄託済みであるＢＳＰプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号代Ｌ２４７５６号として寄託済みであるＭＧＰプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）及びＯＰＮ−Ｇ５２０ＡとＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号代Ｄ１４８１３号として寄託済みであるオステオポンチンプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）についての検索を以下のように行った：
【００５０】
ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を使用して、ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形性塩基対を含むＢＳＰ，ＭＧＰ及びＯＰＮプロモーターから得たほぼ２５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ技法は、当該技術分野では充分公知であり、ＢＳＰプロモーター内の１４９６ｂｐとｐ１８６９ｂｐなる位置、ＭＧＰプロモーター内の２４２ｂｐ及びオステオポンチンプロモーター内の５２０ｂｐと１８２５ｂｐなる位置を包含するＢＳＰ、ＭＧＰ及びＯＰＮ遺伝子の適当なセクションを増幅するために必要なプライマーを特定することは、当該技術分野で通常の技術知識を有する者の範囲に属するものであろう。ＰＣＲ技法は、例えば特許公報ＵＳ４６８３２０２号やＥＰ０２００３６２号において記述されている。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを１．５ｍＭＭｇＣｌ2の１ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液(Perkin Elmer)、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの前向き及び逆向きプライマー及び１．２５ｕｎｉｔｓのAmpliTaq Gold(Perkin Elmer)を含む２５μｌの反応液に添加した。この反応液を9分間で９５℃にまで加熱し、続いて９５℃で３０秒間、４６℃（ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形）若しくは４９℃（ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形）若しくは４６℃（ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形）又は4８℃（ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ）で３０秒間及び７２度で３０秒間から成るサイクルを３５回行ったが、最後のインキュベーションは各サイクルに付き５秒時間延長して行った。この反応液を最終的に７２℃で７分間インキュベートして鎖延長反応を完了した。ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形性配列を含むＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅を行うためのライマーは、以下の通りであった：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＣＡＡ Ｇ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１)
逆向きプライマー：５‘−ＴＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＴＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＣＴ Ｇ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２)
ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＧＡ ＣＡＴ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＣＧ Ｔ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３)
逆向きプライマー：５‘−ＣＧＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４)
ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＣＴＴ ＧＧＴ Ｃ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５)
逆向きプライマー：５‘−ＡＴＴ ＣＴＣ ＣＣＡ ＴＣＣ ＡＴＣ ＣＡＴ ＣＣＡ ＴＧＣ Ａ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６)
ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＴＡＧ Ａ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７)
逆向きプライマー：５‘−ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＡＴ Ｃ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８)
ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｄ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＡＡ ＡＧＧ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＧＣ Ｔ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９)
逆向きプライマー：５‘−ＣＴＡ ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＣＧ ＧＧＡ ＴＧＧ Ｇ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０)
【００５１】
上記したＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の多形性遺伝子型の有無を決定するために、制限酵素分析を以下のように行った：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒ Ｈ (Amersham Pharmacia)、４単位のＥｃｏ Ｔ１４ Ｉ (Amersham Pharmacia)と５μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液を含む２０μｌの反応液中でＥｃｏ Ｔ１４ Ｉを用いて制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏ Ｔ１４ Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対してホモ接合体である場合は、２７０ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対して異型接合体であれば、２７０ｂｐ及び２４５ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。
【００５２】
ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｕｆｆｅｒ (Straragene)、４単位のEco 72 I (Stratagene)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＥｃｏ 72 Ｉで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏ ７２ Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対して異型接合体である場合は、２５３ｂｐ及び２３０ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体であれば、２３０ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００５３】
ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒ Ｈ (Amersham Pharmacia)、４単位のＥｃｏ Ｔ２２ Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＥｃｏ Ｔ２2 Ｉで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏ Ｔ２２ Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＭＧＰ配列に対して異型接合体である場合は、２６６ｂｐ及び２４１ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体であれば、２４１ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００５４】
ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒ Ｈ(Amersham Pharmacia)、４単位のＢｇｌ ＩＩ(Amersham Pharmacia)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＢｇｌ ＩＩで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＢｇｌ ＩＩ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＯＰＮ配列に対してホモ接合体である場合は、２７８ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。ＤＮＡ試料が、異型接合体であれば、２７８ｂｐ及び２５７ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体である場合は、２５７ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。
【００５５】
ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒ Ｈ(Amersham Pharmacia)、４単位のＳａｃ Ｉ(Amersham Pharmacia)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＳａｃ Ｉで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＳａｃ Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＯＰＮ配列に対してホモ接合体である場合は、２５６ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、異型接合体であれば、２５６ｂｐ及び２３５ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体である場合は、２３５ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。
【００５６】
統計的方法。二つの遺伝子型の平均ＢＭＤｓの間における差異が統計的に有意であるか否かを決定するために、二元配置不対ｔ−検定を適用した。
【００５７】
結果
健康な女性から採取した40個のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行った後、ヒトＢＳＰ遺伝子プロモーター、ヒトＭＧＰ遺伝子プロモーター及びヒトＯＰＮ遺伝子プロモーターから特異的プロモーター領域について配列決定を行うことによって、従来知られていなかった五つの多形を同定した。ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形を、それぞれＸｘ、Ｙｙ、Ｚｚ、Ｂｂ及びＳｓと符号化することとしたが、ここにおいて大文字は、特定の多形位置における野生型塩基対の存在を意味し、また小文字は、特定の多形位置における野生型塩基対とは異なる塩基対の存在を意味するものである。
【００５８】
１8年間の本研究から得た１３３のＤＮＡ試料を検索し、これら五つの多形の内の何れかの存在を調べた。
【００５９】
表1は、同定した全ての多形部位、即ちＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃに関して18年間の本研究で採取したDNA試料に係る遺伝子型分布を示す。左の表は、三つの同定多形部位に関して三つの遺伝子型に分類した試料の実数を示し、また右の表には、左の表と同じ分析結果を示す。但し数字は、各多形部位に関して分析した試料全ての百分率を表す。
ｗｔ＝ＸＸ、ＹＹ、ＺＺ、ＢＢ又はＳＳ
ｈｚ＝Ｘｘ、Ｙｙ、Ｚｚ、Ｂｂ又はＳｓ
ｐｍ＝ｘｘ、ｙｙ、ｚｚ、ｂｂ又はｓｓ
【００６０】
【表１】
【００６１】
５つの多形に対する遺伝子型分布を表１に示す。ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形については、ホモ接合体野生型遺伝子型が、最も存在度が高く、次いでヘテロ接合とホモ接合体多形遺伝子型の順番で続くが、ホモ接合体多形群は極めて少数である。ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの場合は、野生型遺伝子型は、ＧｅｎＢａｎｋから入手したＢＳＰ遺伝子プロモーター配列で定義されているように、極めて稀であり、ヘテロ接合体多形遺伝子型は、10倍以上頻度が高く、またホモ接合体多形遺伝子型は、ヘテロ接合体より二倍頻度が高い。ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形については、ヘテロ接合体遺伝子型が、最も存在度が高く、次いでホモ接合体野生型とホモ接合体多形遺伝子型の順番で続く。ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形の場合、ホモ接合体多形遺伝子型が、最も存在度が高く、ヘテロ接合体遺伝子型と野生型ホモ接合体遺伝子型が続く。ＯＰＮ−Ｇ１８２５Ａ武井の遺伝子型分布は、全体的にＭＧＰ−２４２Ａ多形の場合と同一であった。
【００６２】
同定された5つの多形部位が、遠位腕におけるＢＭＣ及びＢＭＤ測定値及び経時的なＢＭＣ／ＢＭＤ変化で代表される骨質量に及ぼす影響について解析を行った。
【００６３】
表2は、18年間の本研究により得たＤＮＡ試料を5つの同定多形のいずれかの有無につき検索して得られた結果の統計学的解析結果をまとめたもので示す。表Ａ：数字は、異なる遺伝子型（ホモ接合体野生型又はヘテロ接合体／ホモ接合体多形性遺伝子型）群の間における平均ＢＭＤの差異が同一である可能性・蓋然性を示す。検定は、遠位腕において測定したＢＭＣ（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ＝骨ミネラル含量）及びＢＭＤを含むものである。括弧内の数字は、ＢＭＣ／ＢＭＤ測定した年を表す。表Ｂ：二つの遺伝子型（ホモ接合体野生型群から抽出したヘテロ接合体／ホモ接合体多形性群）の平均ＢＭＤ値における差異を当該多形部位についての最大ＢＭＤ値のパーセントとして示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】
この表から明らかなように、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位は、特にこれらを合体させた場合、ある個人がＢＭＣ／ＢＭＤの高低に対して遺伝学的に素因を有するか否かを予測するうえで良好な部位となるのである。しかしながら、ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形をＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形とを合体させた場合、遺伝子型のパーセント分離は、何れかの多形単独の場合よりもより良好となる（表2）。他方、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形は、一見するとこのような予見を行うには適した部位では無いように見える。これら同定された多形の何れも、経時的骨質量変化に対して統計学的に有意な影響を及ぼさないように思われていた（データは示さない）。18年間の本研究に参加した個人の年齢、伸長及び体重は、遺伝子型群の何れの間においても有意に相異することはなかった（データは示さない）。
【００６６】
これらの観察結果から、ＢＳＰ多形は、骨損失速度に対するよりもピーク骨質量に対して影響を及ぼす、ということが強く示された。このことを実体化するために、1977年から１９９５年に渉って異なる遺伝子型毎に同一個人について4回測定したＢＭＤの変動を解析してみた。1977年には、この18年間の研究に参加した個人の平均年齢は、５１．１才であったが、１９９５年には６９．１才で終了した。これら二つのＢＳＰ多形のうちの一つについて得られたＢＭＤ平均値を時間に対してプロットして得られる曲線に対して期待された結果は、二つの平行曲線であるはずであって、各々の曲線が、野生型遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値と多形遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値を表すものである。図２及び図３から判るように、このことは現実にＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位について当てはまる。更には、これら二つのプロモーター多形は、協働してピーク骨質量に作用して、遺伝子型間の平均ＢＭＤ相異をそれぞれの多形が孤立して寄与する場合よりもさらに大きく増大させるのである（図4）。
【００６７】
ＭＧＰ及びＯＰＮプロモーターにおけるＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形が骨代謝に及ぼす影響・役割は、―仮にあったとしても―表2にまとめた第一回目の解析からは明瞭とはならなかった。しかしながら、遺伝子型に従って分類したＢＭＣ値を時間に対してプロットしたところ、一群の曲線が現れ、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ（図５）及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ（図６）多形部位の双方とも、骨損失速度の決定因子であることが示唆された。特に注目すべきことは、ＺＺ及びＺｚ＋ｚｚ曲線並びにＢＢ＋Ｂｂ及びｂｂ曲線が、平均年齢が５３．１才及び６３．１才であるのに従って１９７９年と１９９５年との間で分離し、その結果一定の遺伝学的減少が閉経に関連することが示されたことである。ＢＳＰ多形と同様に、これらＭＧＰ−Ｃ２４２ＡとＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形との作用が合体した結果、やはり遺伝子型間での相異が単独の場合よりも大きくなるのである（図7）。
【００６８】
表２にまとめた結果によれば、ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形がＢＭＣ／ＢＭＤに及ぼす影響は、この多形をＢＳＰ−１８６９Ａ多形と合体させて初めて認められたに過ぎない。ＢＭＣ値を遺伝子型に従って分類し、時間に対してプロットして得られたグラフからは、二本の曲線が近接しているため、かかる多形が、骨損失速度又はピーク骨質量に対して影響を及ぼすか否かを見極めることは困難である。しかしながら、この多形をＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と合体させることによって、一群の経時的曲線が得られ、その結果これら二つの多形が加成的に協働すること及びそのためにＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形が、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と同じように骨損失速度に対してよりもむしろピーク骨質量に対して影響を及ぼす可能性があることとが明瞭に示された（図９）。
【００６９】
最後に、遺伝子型と尿中オステオカルシン値（Ｎ−ＭＩＤR、Osteometer Biotech A/S）及び異なる尿中Ｉ型コラーゲンＣ−末端架橋値（CrossLaps(R)、Osteometer Biotech A/S）との関連性を調べた。期待したように、ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＧとＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの多形部位について得られた何れの生化学的骨代謝マーカーの平均値の間においても有意の差異は一切なかった（データは示さない）。また、ＭＧＰ−Ｃ２４２ＡとＯＰＮ−Ｇ５２０Ａの多形部位について得られた生化学的骨代謝マーカーの何れの平均値の間においても有意の差異は一切認められなかった。このことは、図５及び図６によってＮ−ＭＩＤRとCrosslaps(R)測定時において（１９９５）ＺＺ及びＺｚ＋ｚｚ遺伝子型群並びにＢＢ＋Ｂｂ及びｂｂ遺伝子型群との骨損失の速度が等しかったことによる可能性がある。
【００７０】
実施例２(18年間の研究)
方法
被験者―百三十三人の女性を骨ミネラル含量（ＢＭＣ）又は骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、生化学的マーカー、身長及び体重について18年間（１９７７−１９９５年）追跡し、これを本研究に用いた。このコホート二間する詳細な記載は、以前に報告済みである(Joergensen et al.,1996)。
【００７１】
ＤＮＡ分析。ＯＰＧ−Ｇ１６３Ｇ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第ＡＢ００８８２１号として寄託済みであるＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）についての検索を以下のように行った：
ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を使用して、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形性塩基対を含むＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーターから得たほぼ２５３ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを１ｘＰＣＲ Ｇｏｌｄ ｂｕｆｆｅｒ(Perkin Elmer)、１．５ｍＭＭｇＣｌ2、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの前向き及び逆向きプライマー及び１．２５ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ(Perkin Elmer)を含む２５μｌの反応液に添加した。この反応液を9分間で９５℃にまで加熱し、続いて９５℃で３０秒間、４６℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間から成るサイクルを３５回行ったが、最後のインキュベーションは各サイクルに付き５秒間延長して行った。この反応液を最終的に７２℃で７分間インキュベートして鎖延長反応を完了した。このＰＣＲによる増幅を行うためのライマー配列は、以下の通りであった：
ＯＰＧ―Ａ１６３Ｇ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＡＧＴ ＣＴＡ ＡＣＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＡＴ Ｔ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１)
逆向きプライマー：５‘−ＡＧＴ ＴＡＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＣＴ Ｇ−３’(ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２)
【００７２】
上記したＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の多形性遺伝子型の有無を決定するために制限酵素分析を以下のように行った：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ ４(New England Biolabs)、４単位のＭｆｅ Ｉ(New England Biolabs)と５μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液を含む２０μｌの反応液中でＭｆｅ Ｉを用いて制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＭｆｅ Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対してホモ接合体である場合は、２５３ｂｐと２３２ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対して異型接合体であれば、２３２ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００７３】
統計的方法。二つの遺伝子型の平均ＢＭＤ値の間における差異が統計的に有意であるか否かを決定するために、二元配置不対ｔ−検定を適用した。
【００７４】
結果
健康な女性から採取した40個のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行った後、ヒトＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子プロモーターから特異的プロモーター領域について配列決定を行うことによって、従来知られていなかった一つの多形、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ、を同定した。このＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形をＭｍと符号化することとしたが、ここにおいて大文字は、特定の多形位置における野生型塩基対の存在を意味し、また小文字は、特定の多形位置における野生型塩基対とは異なる塩基対の存在を意味するものである。この多形の位置を図１０に示す。
【００７５】
１8年間の本研究から得た１３３のＤＮＡ試料を検索し、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇなるの多形の存在を調べた。
【００７６】
18年間の本研究で採取したDNA試料に係る遺伝子型分布は、以下の通りであった：ホモ接合体野生型（ＭＭ）＝７１．３％（ｎ＝９２）、ヘテロ接合体（Ｍｍ）＝２５．６％（ｎ＝３３）、及びホモ接合体多形（ｍｍ）＝３．１％（ｎ＝４）。遺伝子型は、１３３個のＤＮＡ試料のうち４個の試料において決定することが出来なかった。
【００７７】
今回同定された多形部位が、それぞれ１９７７年及び１９９５年に行った遠位腕における骨ミネラル含量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）測定値で代表される骨質量に及ぼす影響について解析を行った（表３）。遺伝子型群の間におけるパーセント差異は、１９７７年から１９９５年に掛けては有意に変化しなかったが、このことは、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形が、ピーク骨質量に一定の影響を及ぼしたことを意味している。ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａと称される上記した二つの多形もまた、ペーク骨質量に影響を及ぼすのである。従って、ＯＰＧ多形と二つのＢＳＰ多形の何れかとの間において何らかの協働・協力が存在しているのか否かを検討することは、興味あることであった。ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ／ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ／ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａなる組合せ・合体を行ったところ、これらの多形が確実に、ゼロ仮説のｔ−検定ｐ−値（即ち、遺伝子型の間での差異は全くない）が、統計学的に有意な値にまで低下し、一方二つの遺伝子型群について平均ＢＭＣ／ＢＭＤ値が増加したという意味において、協働態様で作用することが明らかとなった（表３）。
【００７８】
【表３】
【００７９】
即ち、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形が、特にＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と合体・組合わせた場合、ある個人がＢＭＣ／ＢＭＤの高低に遺伝的に素因があるが否かを予見するための良好な部位であることは、明らかである。
【００８０】
18年間の本研究に参加した個人の年齢、伸長及び体重は、遺伝子型群の何れの間においても有意に相異することはなかった（データは示さない）。
【００８１】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦ多形がピーク骨質量に影響を及ぼすという、当初の観察結果を実体化するために、１９７７年から１９９５年に渉って異なる遺伝子型毎に同一個人について4回測定したＢＭＤの変動を解析してみた。1９７７年には、この18年間の研究に参加した個人の平均年齢は、５１．１才であったが、１９９５年には６９．１才で終了した。ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形について得られたＢＭＤ平均値を時間に対してプロットして得られる曲線ついて期待された結果は、二つの平行曲線であるはずであって、各々の曲線が、野生型遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値とヘテロ接合体又は多形ホモ接合体遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値をそれぞれ表すものである。図１１は、このことが間違いなく該当することを示している。更には、ＯＰＧ−Ａ１６３ＧとＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形を合体・組合わせることによって、これら二つの多形が、協働してピーク骨質量に作用して、遺伝子型間の平均ＢＭＤ差異をそれぞれの多形が孤立して寄与する場合よりもさらに大きく増大させることが判ったのである（図１２）。事実、このような協働は、完全に加成的である（表４）。表４におけるＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形の数は、図２及び図３に示した結果から抽出したものである。また、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形を合体・組合わせると、プラスの協働作用が得られるが（図１３）、この作用は殆ど加成的である（表４）。
【００８２】
【表４】
【００８３】
最後に、遺伝子型と尿中オステオカルシン値（Ｎ−ＭＩＤ(R)、Osteometer Biotech A/S）及び異なる尿中Ｉ型コラーゲンＣ−末端架橋値（Crosslaps(R)、Osteometer Biotech A/S）との関連性を調べた。ピーク骨質量に到達年齢を経過した後、尿試料を採取した。期待したように、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形について得られた何れの生化学的骨代謝マーカーの平均値の間においても有意の差異は一切なかった（データは示さない）。このような結果は、Ｎ−ＭＩＤ(R)とCrossLaps(R)測定時において（１９９５）ＭＭ及びＭｍ＋ｍｍ遺伝子型群の骨損失の速度が等しかったことによるものであって、ピーク骨質量に影響を及ぼす多形については驚くべきことではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 パネルＡは、骨シアロプロテイン遺伝子プロモーターにおける、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＰＳ−Ｇ１８６９Ａと称される二つの多形の位置を示す。パネルＢは、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子プロモーターにおける、ＭＧＰ−Ｃ２４２と称される多形の位置を示す．パネルＣは、オステオポンチン遺伝子プロモーターにおける、ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃと称される多形の位置を示す。前記した三種のプロモーターの全てに係る四つの多形部位を含む野生型配列を、太字で示された多形位置におけるヌクレオチド及び当該多形位置の上方に配置した置換配列―やはり太字で示されている−と共に示す。ヌクレオチドの全ての番号付けは、塩基配列１を基準としたものであるが、塩基配列１は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベースにおいて公表されているプロモーター配列の各々の５‘ヌクレオチドである。
【図２】 ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図３】 ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図４】ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ａへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ野生型位置とＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図５】 ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図６】 ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図７】 ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａの多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図８】 ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図９】 ＢＳＰ−Ｇ１８６９ＡとＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１０】 ＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子プロモーターにおけるＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形の位置を示す。前記したプロモーターの多形部位を含む野生型配列を、太字で示された多形位置におけるヌクレオチド及び当該多形位置の上方に配置した置換配列―やはり太字で示されているーと共の示す。ヌクレオチドの全ての番号付けは、塩基配列１を基準としたものであるが、塩基配列１は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベースにおいて公表されているプロモーター配列の各々の５‘ヌクレオチドである。
【図１１】 ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１２】 ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＧとＯＰＧ−Ａ１６３Ｇの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ野生型位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１３】 ＢＳＰ−Ｇ１８６９ＡとＯＰＧ−Ａ１６３Ｇの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＯＰＧ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
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53. Yamada Y, Miyauchi A, Goto J, Takagi Y, Okuizumi H, Kanematsu M, Hase M, Takai H, Harada A, Ikeda K, 1998. Association of a polymorphism of the transforming growth factor-betal gene with genetic susceptibility to osteoporosis in postmenopausal Japanese women. J Bone Miner Res, 13:1569-76.
54. Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Mochizuki SI, Yano K,Fujise N, Sato Y, Goto M, Yamaguchi K, Kuriyatfla M, Kanno T, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashid K, 1997. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogeflesis in vitro: Endocrinology,139:1329-37.
55. Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinoshaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa, N, Takahasi N, Suda T, 1998. Osteoclast differentiation factor is a S ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/PANKL. Proc Nati Acad Sci USA, 95:3597-602.
56. Yoshitake H, Rittling S, Tsuji K, Yamashita T, Wong B,Choi W, Denhardt D, Noda M, 1998. osteopontin-deficient mice reveal increase in osteoclast number, enhanced TPANCE/BANKL/ODF expression in bone but are resisitant to bone resorption that follows bone formation after bone marrow ablation. Bone, 23 (5) suppl. :S200, Abstr. #1214.
57. Zhang Q, Domenicucci C, Goldberg HA, Wrana JL, Sodek J, 1990. Characterization of fetal porcine bone sialoproteins, secreted phosphoprotein I (SPPI,osteopontin), bone sialoprotein, and a 23-kDa glycoprotein. Demonstration that the 23-kDa glycoprotein is derived from the carboxyl terminus of SPPI. J Biol Chem, 265:7583-9.
58. Patent application #: W09705275. Morrison NA, Eisman JA,1996. Method of predicting bone density.
59. Patent application #: WO97/28280. Grainger DJ, Spector TD, Heathcote K, 1997. Diagnostic method and apparatus.
60. Patent application #: WO9732041. Ralston SH, Grant SEA, 1997. Determination of collagen genotype.
61. Patent application #: WO9743446. Ralston SH, Grant SEA,1997. Diagnostic method and apparatus for detecting a predisposition to certain disease states, especially osteoporosis, based on polymorphism in an IL-6 gene.
62. Patent application #: W09844150. Keen RW, Spector TD,1998. Polymorphisms of an IL-l receptor antagonist gene.
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64. Patent 44: U54683202. Mullis KB, 1987. Process for amplifying nucleic acid sequences.
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【配列表】
[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to bone sialoprotein gene, matrix gla protein gene, osteopontin gene and / or osteoprotegerin (OPG) / osteoclastogenesis inhibitory factor = The present invention relates to a method for evaluating and determining the predisposition to various medical conditions based on polymorphisms in the OCIF gene. More specifically, the present invention relates to a method for evaluating and determining an individual's predisposition to various pathological calcification or calcification symptoms including osteoporosis and atherosclerosis by searching for these polymorphisms. The method of the present invention determines allelic variation in human bone sialoprotein gene, human matrix gla protein gene, human osteopontin gene and / or osteoprotegerin / osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) gene, and thus bone mineral It is particularly useful in predicting disease predisposition to density (BMD) magnitude. The present invention also relates to various bone sialoprotein (BSP) genes, matrix gla protein (MGP) genes, osteopontin (OPN) genes and / or OPG / OCIF genes, and probes and primers thereto, containing the polymorphism .
[0002]
[Prior art]
Osteoporosis is one of the most common illnesses in people over the age of 60 today, and affects 25 million people in the United States alone, with a female to male ratio of 5: 1. This corresponds to approximately 25 to 30% of people over 60 years of age. In Europe, the proportion of people with this disease is approximately the same.
[0003]
Currently, there is no cure for osteoporosis. However, hormone replacement therapy and treatment with bisphosphonates can stop or delay bone loss. Therefore, the sooner the possibility of such bone loss diagnosis is, the better the effect of the treatment, especially if a person with a predisposition to osteoporosis can be identified as early as possible. Should be advantageous. Because there are strong genetic components associated with the development of osteoporosis (see below), identifying genes that affect peak bone mass and / or bone loss rate is important for osteoporosis. A genotype with a predisposition to disease can be identified at a young age, and so much time can be devoted to taking preventive measures, which will be of great help.
[0004]
From this point of view, it is relevant to identify individuals or groups with a predisposition to a relatively low peak bone mass, i.e. bone mineral density, or a relatively high loss rate of bone mass, i.e. bone mineral density. That will be true.
[0005]
The degree of genetic contribution to bone mineral density and thus possibly to osteoporosis has been revealed for over 20 years from studies on twins (Smith et al, 1973). Dispersion of BDM and bone width was found to be greater in dizygotic twins than in monozygotic twins, indicating a significant genetic effect on bone mass regulation (Smith et al, 1973). ). A study on other twins reported statistically significant effects of various genetic factors on BMD changes (Kelly et al, 1993). The results of several other studies have revealed that there is a strong genetic influence on peak bone mass acquisition (Gueguen et al, 1995; Lutz & Tesar, 1990). Thus, the gene component appears to have a certain effect on both peak bone mass and bone loss rate. The results of gene sequestration analysis strongly suggest that bone mass is moderately affected but is controlled by several genes (Gueguen et al, 1995).
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Little is known about such molecular mechanisms and genetics, despite the powerful search for genes that affect bone formation and bone resorption. Within the last five years, among the polymorphisms identified primarily in genes encoding regulatory proteins, those associated with BMD are as follows:
1) Vitamin D receptor gene polymorphisms identified by Morrison and co-workers (Morrison et al, 1994; WO94 / 03633) have been the subject of many research reports but are only significant in nearly half Only a weak correlation was found, and such correlation could be more strongly related to peak bone mass than to bone loss rate, as suggested by Riggs (Riggs, 1997). is there.
[0007]
2) The estrogen receptor gene polymorphism identified by Kobayashi and collaborators is associated with low BMD (Kobayashi et al., 1996, US58 34200).
[0008]
3) Polymorphism in the type Iα1 collagen gene identified by Grant and co-workers (Grant et al, 1996; WO9732041) is associated with bone loss rate rather than peak bone mass (Uitterliden et al, 1998).
[0009]
4) Interleukin-6 gene—Two polymorphisms in the AT-rich minisatellite duplication around 3 ′ of interleukins that have stimulatory effects on osteoclast lineage cells are associated with low BMD Has been found (Murray et al, 1997-WO9743446). These polymorphs appear to affect peak bone mass.
[0010]
5) Two tandem overlapping polymorphisms recently found in the interleukin-1 receptor antagonist gene are associated with bone loss rate (Keen et al, 1998; WO9844150). The reason for noting this gene is that interleukin-1 is a potent stimulator of bone resorption by osteoclasts.
[0011]
In an estrogen-deficient state, interleukin-1 is stimulated, but interleukin-1 receptor antagonists are inhibited, and associated bone loss is prevented by treatment with interleukin-1 receptor antagonists. And such antagonists seemed to be excellent candidate genes for modulating postmenopausal bone loss (Keen et al, 1998).
[0012]
6) A polymorphism in the osteocalcin gene has recently been reported (Dohi et al, 1998). However, due to this polymorphism, BMD measured for people with ectopic alleles could not be distinguished significantly significantly from BMD measured for people with wild-type genotypes.
[0013]
7) Polymorphism associated with low BMD, ie osteoporosis, has been reported in the TGF-β1 gene, but its protein product is abundant in bone and is important for bone resorption and bone formation Regulator (Langdahl et al, 1997; Yamada et al., 1998; WO97 / 28280).
[0014]
8) Polymorphism in apolipoprotein E has been reported to correlate with low BMD in postmenopausal Japanese women (Shiraki et al, 1997). The reason for paying attention to this gene is that there was a report that the concentration of vitamin K that activates osteocalcin via γ-glutamyl carboxylase was correlated with the apolipoprotein E phenotype (Saupe et al, 1993).
[0015]
9) WO 9705275 discloses the use of predicting bone density by analyzing allelic variants in the retinoic acid receptor gene.
[0016]
Only the vitamin D receptor gene and type I 1 collagen gene polymorphism appeared to correlate with BMD in a portion of the cohort examined (other gene polymorphisms have been tested for small, national cohorts But most of it is rather a boon for bone metabolism). This is not surprising, as the gene's influence on the development of osteoporosis is caused by insufficient action of multiple genes. In order to gain and obtain better predictive capabilities that are effective within a larger geographic area, the need to identify additional genetic polymorphisms that have an impact on bone formation / resorption is it is obvious. In this regard, we believe it is important to concentrate and concentrate on the promoter regions of genes encoding various proteins present in bone, for the following reasons: Predisposition to osteoporosis This is because the mutation has been rejected from physical detection for over 50 years, or it is a subtle thing that is difficult to catch in nature. Mutations that affect the expression but not the function of a gene product would be expected to show such a subtle effect. Gene expression is controlled by a promoter located upstream of the coding region of the gene, and mutations in this region should cause altered gene expression.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
Thus, the present invention is a method for assessing and determining an individual's predisposition to a selected constant calcification state, comprising a bone sialoprotein gene promoter, a matrix gla protein gene promoter, an osteopontin gene promoter, or an OPG / It is intended to provide the evaluation and determination method comprising determining the genotype of the promoter of the OCIF gene, or any of these four promoters or any combination of two or more thereof.
[0018]
The calcification state that is the target of disease predisposition evaluated according to the present invention has a high or low bone mass peak (as the future, present or past state) or a large or small bone loss rate (in the future, present or As the past state). That is, the present invention can also be used to evaluate and determine a predisposition to osteoporosis.
[0019]
In a second aspect, the present invention provides a method for evaluating and determining the predisposition of an individual to any condition / symptom associated with allelic variation in one or a combination of the promoters.
[0020]
The methods of the present invention typically involve an individual having a bone sialoprotein promoter (BSP), a matrix gla protein promoter (MGP), an osteopontin promoter (OPN), an OPG / OCIF promoter, or all or Determining whether it is homozygous or heterozygous for the two or more arbitrarily combined promoters. This method is conveniently used for bone sialoprotein, matrix gla protein, osteopontin or OPG / OCIF, or a condition or disease that correlates with abnormal production of all four or more of these four promoters, such as bone Used to screen for individuals who are at risk such as psoriasis or atherosclerosis.
[0021]
The DNA of the human sialoprotein promoter is known and reported by Kim, RH et al. In Matrix Biol. 14: 31-40 (1994). This sequence deposited by this group with GenBank under accession number L24756 will hereinafter be referred to as the wild type sequence or reported sequence. The DNA of the human matrix gla protein promoter is known and reported by Cancel, L. et al. In J. Biol. Chem. 265 (25): 15040-15048 (1990). This sequence deposited by this group with GenBank under accession number M55270 will hereinafter be referred to as the wild type sequence or reported sequence. The DNA of the human osteopontin promoter is known and reported by Hijiya et al. In Biochem. J., 303: 255-262 (1994). This sequence deposited by this group with GenBank as accession number D14813 will hereinafter be referred to as the wild type sequence or reported sequence. The DNA of the human OPG / OCIF promoter is known and reported by Morinaga et al. In Eur. J. Biochem. 254 (3): 658-691 (1998). This sequence deposited by this group with GenBank as accession number AB008821 will hereinafter be referred to as the wild type sequence or reported sequence. Such term means that any sequence of these reported sequences predominates over these variants in the population or that each sequence or any sequence of such sequences has the lowest pathological risk. It does not mean that it is related to. In the method of the present invention, the individual to be tested is identical to a reported sequence (or identical to a selected region of said sequence), a bone sialoprotein promoter, a matrix gla protein promoter, an osteopontin promoter, OPG / Whether or not it has an OCIF promoter, or any combination of all four or more of these four promoters, or the individual is different from the reported sequence (or different at the selected location) Homozygous bone homologous protein promoter, matrix gla protein promoter, osteopontin promoter, OPG / OCIF promoter, or any combination of two or more of these four promoters. Is intended to include determining regardless of whether the a or heterozygous at.
[0022]
In the method described above, the present invention determines whether the sequence at the base pair 1496 position of the BSP, specifically, the sequence at this position is A (reported) or G, or base pair 1869. A method of determining whether the sequence at a position is specifically G (reported) or A at that position. The positions identified above are numbered from the start of the reported sequence. In yet another numbering scheme, these positions are base pair -683 and base pair -310 from the start of the transcription sequence of the gene. From now on, such specific allelic variations will be indicated using the terms BSP-A1496G and BSP-G1869A.
[0023]
Similarly, according to the present invention, in the method, the allelic variation is MGP base pair 242 position (when numbered from the start point of the reported sequence or base pair -3157 from the start point of the transcription sequence). And a method for determining whether the sequence at said position is C (reported) or A—hereinafter referred to as MGP-C242A.
[0024]
Similarly, according to the present invention, in this method, the allelic variation is at a position of base pair 520 of OPN (when numbered from the start point of a reported sequence or a position of base pair -1748 from the start point of a transcription sequence). And specifically a method for determining whether the sequence at said position is G (reported) or A—hereinafter referred to as OPN-G520A.
[0025]
Similarly, according to the present invention, in such a method, the allelic variation is a position of base pair 1825 of OPN (when numbered from the start point of a reported sequence or a position of base pair -443 from the start point of a transcription sequence). And specifically a method for determining whether the sequence at said position is T (reported) or C—hereinafter referred to as OPN-T1825C.
[0026]
The present invention includes a method for determining whether the sequence at the position of base pair 163 of the OPG / OCIF, specifically, the sequence at this position is A (reported) or G in the above-described method. . The positions identified above are numbered from the start of the reported sequence. In another numbering scheme, these positions are base pair -943 from the start of the transcription sequence of the gene. From now on, such specific allelic variations will be indicated using the term OPG-A163G.
[0027]
We have such a case where at least one copy of the individual's BSP gene has G rather than A at position 1496 or A rather than G at position 1869 The fact has been found that the peak bone mass is related to greater.
[0028]
Similarly, if we have at least one copy of the individual's MGP gene with an A rather than a C at position 242, this fact will result in a higher peak bone mass loss rate. I found out that it was related to something.
[0029]
The inventors have further found that having at least one copy where A instead of G is present at the OPN base pair 520 position is associated with a higher bone mass loss rate.
[0030]
The inventors have further found that having at least one copy in which T is present instead of C at the base pair 1825 position of OPN is associated with less bone mass.
[0031]
The inventors have found that if at least one copy of an individual's OPG / OCIF gene has A rather than G at the base pair 163 position, this fact is associated with higher bone mass. It was.
[0032]
Related measurements related to gene promoter sequences are generally performed in a widely known manner, including amplifying the relevant portion of the individual's gene promoter. The amplified partial sequence can be determined by a hybridization assay or restriction enzyme digestion fragment length analysis.
[0033]
Specifically, amplification may be performed using a selected promoter, and such promoter selection may be performed by amplification when a sequence selected from among the reported sequences or a mutation in the reported sequence exists. This is done so that a new part of the amplified gene is cut by a kind of restriction enzyme. That is, a plurality of different restriction enzyme cleavage fragments are generated by enzymatic treatment of the amplified gene. The present invention includes an oligonucleotide primer used for amplification of a corresponding portion of the gene promoter. Specifically, the present invention encompasses promoters that are selected to generate different restriction enzyme cleavage patterns depending on the presence or absence of the selected mutation. Suitable promoters according to the present invention are described in the examples below.
[0034]
The present invention determines one of the predispositions described above and then administers the drug to the individual, thus preventing or treating osteoporosis, or the individual has a low peak bone mass or a high bone mass loss rate. A method of treating osteoporosis comprising delaying the onset of osteoporosis if predisposed is included.
[0035]
Bone sialoprotein is a 33-34 kD nascent protein that is specific to bone tissue and is extensively post-translationally modified by glycosylation, phosphorylation and sulfation resulting in a final molecular weight of 57 kD. (Oldberg et al., 1988; Ecarot-Charrier et al., 1989; Fisher et al., 1990; Zhang et al., 1991). Along with osteopontin, BSP is the most abundant non-collagenous protein in the bone matrix (Nagata et al., 1991) and is found in osteoclasts. V β Three It contains an RGD motif that mediates cell attachment via integrin-type cell surface receptors (Oldberg et al., 1988; Flores et al. 1992; Ross et al., 1993). It also has several segments of polyglutamic acid that create strong hydroxyapatite nucleation regions (Hunter & Goldberg, 1993). Research on localization of endogenous BSP using rats (Chen et al., 1991; Chen et al., 1992) and transgenic mice (Chen et al., 1996) showed the highest BSP Expression has occurred in newborn bone, and it has been found that expression decreases significantly with subsequent growth and development. BSP was localized before the mineralization front using immunohistochemical techniques, suggesting that BSP is required for initiation of bone mineralization (Roach, 1994). Thus, mRNA was only detected in osteoblasts, dendritic cells and cementoblasts differentiated at de novo mineralized tissue formation sites (Chen et al., 1991; Chen et al., 1992). The same expression pattern was observed in the transgenic mouse, in which the transgene was a fusion of the approximately 2.7 kb promoter region obtained from rat BSP to the luciferase gene, resulting in an approximately 2.7 kb region of the rat promoter. It has been shown to be sufficient to mediate transcription specific for bone tissue (Chen et al., 1996).
[0036]
Matrix gla protein is a small protein consisting of 79 amino acid residues with a molecular weight of approximately 14 kDa, containing five γ-carboxyglutamic acid (gla) residues (Price &Williamson; Loeser & Wallin, 1992). . This gla residue is probably the product of post-translational modification by γ-carboxylase, a vitamin K-dependent enzyme. MGP binds strongly to hydroxyapatite in a gla-dependent manner (Dowd et al., 1995). High concentrations of MGP have been found in the extracellular matrix consisting of bone, dentin and cartilage (Hail et al., 1988). However, MGP is expressed in many tissues and the highest concentration of mRNA is found in lung, heart, kidney and cartilage (Fraser & Price, 1988). The first signs of the function of MGP inside the bone came from experiments with rats treated with warfarin, a γ-carboxylase inhibitor. The animals used showed that the growth plate was overmineralized, and one function of MGP in bone could be inhibition of hydroxyapatite production (Price et al., 1982). Final evidence for such function comes from studies on MGP knockout mice. This knockout mouse died within 2 months of birth due to vascular rupture due to arterial calcification and calcium deposition. MGP-deficient mice can also have poor calcification of the growth layer, but in this case calcification is not restricted to the lower thickening sites found in healthy animals, but rather to the proliferating chondrocyte area It is expanded to. Healthy calcification leads to the disassembly and collapse of the chondrocyte column, and eventually causes short elongation, osteopenia and fracture (Luo et al., 1997). These results strongly suggest that MGP functions to inhibit calcification in soft tissue and to limit mineralization within the growth plate cartilage only to the lower thickened part. Note that the latter is probably due to inhibition of calcification in the basal region of proliferating chondrocytes.
[0037]
Osteopontin is a 44 kDa phosphorylated and glycosylated protein (Price et al., 1987), and along with BSP, OPN is the most abundant non-collagenous protein in the bone matrix (Nagata et al. al., 1991), and is also expressed in several other tissues, unlike BSP (Denhardt & Guo, 1993). Osteopontin and BSP are clearly related: 1) these are both α V β Three It has an RGD region that mediates cell attachment through integrin-type cell surface receptors (Ross et al., 1993; Wong et al., 1996); 2) All of these are acidic amino acids (OPN It has a polyaspartic acid segment and BSP has a polyglutamic acid segment) and a high content of sialic acid (Franzen & Heinegard).
[0038]
Phosphorylated osteopontin is a potent hydroxyapatite formation inhibitor, while its dephosphorylated form contains an RGD motif that mediates a much weaker inhibitory effect (Hunter et al., 199). Within the bone, osteopontin is found in high concentrations in the lamina limitans underlying the bone lining cells, and within the reverse (cemented) line, the matrix-matrix interface where bone deposition is delayed in decreasing bone resorption (McKee & Nanci 1996; McKee et al., 1993). These findings combined with the inhibitory activity of osteopontin on hydroxyapatite, as discussed by Hunter et al., 1994, osteopontin sealed and enclosed the surface of growing hydroxyapatite once active bone formation was terminated. This suggests that there is a possibility of exerting an action to be performed. Recently, osteopontin knockout mice show healthy development and bone structure, but osteoclastogenesis has been enhanced in vitro (Rittling et al., 1998) and the number of osteoclasts is greater than that in wild-type mice. In /-, it is clarified that there are many in the epiphyseal region (Yoshitake et al., 1998). Interestingly, Yoshitake and co-workers also found that extra bone formed after bone marrow excision in the large bones of wild-type animals was resorbed after 2 weeks, while in OPN − / − mice. In the same experiment, it was clarified that no bone resorption was observed (Yoshitake et al., 1998). Thus, an increase in osteoclast number in OPN − / − mice may be a compensation for the decreased ability of bone resorption. This materializes the concept that osteopontin, submitted by Hunter and its collaborators, has the effect of limiting the surface of growth hydroxyapatite after bone formation.
[0039]
Another symptom that has been suggested to be promoted by matrix gla protein and osteopontin is atherosclerosis (Shanahan et al., 1994; Sohnma et al., 1994). Using differential hybridization techniques to search for a cDNA library derived from the aorta of a Watanabe hereditary hyperlipidemia (WHHL) rabbit, Sohma and coworkers have identified clones encoding matrix gla proteins. One was found (Sohma et al., 1994). Northern blot analysis of RNA generated from aorta from different age WHHL and healthy rabbits revealed that mRNA expression of matrix gla protein increased in proportion to progression to atherosclerosis in WHHL rabbits. (Sohma et al., 1994). Furthermore, mice deficient in matrix gla protein have died due to aortic calcification (Luo et al., 1997). No atherosclerotic plaque was observed in these mice, suggesting that the matrix gla protein may affect calcification once plaque is formed. However, high concentrations of matrix gla protein were localized to the high lipid content sites of atherosclerotic plaques (Shanahan et al., 1994). High concentrations of osteopontin mRNA and protein are also found in necrotic lipid cores and mineralized regions in human atherosclerotic plaques (Shanahan et al., 1994).
[0040]
Osteoprotegerin (OPG) / osteoclastogenesis inhibitor (OCIF) has a molecular weight of approximately 55 kDa and is related to the tumor necrosis factor receptor (TNF-R) superfamily, recently and independently by two groups. Has been identified as a glycoprotein with 380 amino acid residues (Simonet et al., 1997: Yasuda et al., 1997). Unlike other TNF-R-like molecules, this cytokine receptor lacks the transmembrane region (Simonet et al., 1997), so OPG / OCIF is a disulfide-binding homodimer with a molecular weight of approximately 110 kDa. It is a secreted protein that appears (Simonet et al., 1997).
[0041]
Initially, mice that were transgenic for rat OPG / OCIF were found to develop osteoporosis, so that OPG / OCIF increased osteoblast-mediated bone formation or osteoclasts -The potential for reducing or functioning in interstitial bone formation has been demonstrated (Simonet et al., 1997). In vitro osteoclastogenesis assay, recombinant OPG / OCIF It was found to be an inhibitor of bone cell formation (Simonet et al., 1997). Consistent with this finding, OPG / OCIF knockout mice developed osteoporosis, highlighting that OPG / OCIF is an important regulator of postnatal bone mass (Bucay et al. 1998).
[0042]
During mouse embryogenesis, OPG / OCIF is highly expressed in developing bone cartilage and in several major arteries, gastrointestinal tract and skin (Simonet et al., 1997). In adult animals, OPG / OCIF expression has been found in several tissues including heart, brain, lung and liver, which means that OPG / OCIF expression is not observed in brain and liver in human tissues, Different from being highly expressed in the kidney and detectable in various hematopoietic and immune organs (Simonet et al., 1997). Such different observations are not explained at all except that they may be due to true species-specific expression differences.
[0043]
Ligands for OPG / OCIF were also independently identified by the same two groups that identified OPG / OCIF. This ligand, also called OPG ligand (OPGL) (Lacey et al., 1998) or osteoclast differentiation factor (ODF) (Yasuda et al., 1998), is a TNF-related cytokine, Bind to hematopoietic ancestor cells committed to the osteoclast lineage (Lacey et al., 1998). In vitro OPGL / ODF also stimulates osteoclasts to perform bone resorption, and recombinant OPGL / ODF injected subcutaneously stimulates bone resorption in mice (Lacey et al., 1998). OPGL / ODF is produced as a 45 kDa membrane-bound protein or as a 31 kDa soluble secreted C-terminal fragment (Lacey et al., 1998).
OPGL / ODF is essential for two previously identified cytokines, namely TNF-related activation-inducing cytokines (TRANCE) essential for T cell activation (Wing et al., 1997) and dendritic cell activation Is the same as the receptor activator of NF-kB ligand (RANKL) (Anderson et al., 1997) and is highly expressed in lymphoid tissue and cancellous (Lacey et al., 1998; Yasuda et al. 1998).
[0044]
Since OPG / OCIF binds to and inhibits the action of OPGL / ODF, these two proteins are important extracellular regulators of osteoclast development, and ultimately bone resorption It seems.
[0045]
Apart from the osteoporosis phenotype, OPG / OCIF knockout mice also had significant aortic and renal artery calcification by 2 months of age (Bucay et al., 1998). That is, OPG / OCIF inhibits skeletal demineralization and at the same time inhibits some vascular calcifications. Similar reductions have been previously observed in matrix gla protein (MGP) knockout animals (Luo et al., 1997). However, such arterial calcification is more prevalent and evident in MGP knockout animals, while bone loss is severe in OPG / OCIF knockout animals. Abnormal expression of proteins involved in preventing / preventing vascular calcification could theoretically be related to the generation of atherosclerotic plaques. However, in OPG / OCIF knockout mice (Bucay et al., 1998), no atherosclerotic plaque was observed except for a direct role in the development of atherosclerosis. Even so, the abnormal expression of OPG / OCIF would not preclude that once the primary lesion occurs, it may be a secondary factor that promotes the formation of atherosclerotic plaques. .
[0046]
The method for determining and evaluating an individual's predisposition to osteoporosis or other diseases related to calcification as described above may be combined with a bone mass measurement method based on the whole body or a selected body part. Examples of these measuring methods include X-ray or ultrasonic BMD measuring methods. The methods described herein are also used to measure chemical bone resorption markers in body fluids such as serum and blood, such as Crosslaps of C-telopeptide fragments of type I collagen. TM Or measurement of N-telopeptides of type I collagen.
[0047]
Each of these different types of measurement methods is treated as a risk factor and may be combined with one or more of the other methods (one of course is a genetic disease predisposition measurement method according to the present invention) in a weighted manner.
[0048]
【Example】
In order that the nature of the present invention may be more clearly understood, examples will be described with reference to the drawings shown in the accompanying drawings.
[0049]
Example 1 (18 years of research)
Method
Subjects—133 people were followed for 18 years (1977-1995) for BMD, biochemical markers, height and weight and used in this study. A detailed description of this cohort has been reported previously (Joergensen et al., 1996).
DNA analysis. BSP-G1496A and OPG-G1869A polymorphism (base pair numbering according to the numbering of the BSP promoter sequence deposited at GenBank as deposit number M55270), MGP-C242A polymorphism (accession number L24756 at GenBank) According to the numbering of the MGP promoter sequence deposited as base pair numbering) and OPN-G520A and OPN-T1825C polymorphism (according to the numbering of the osteopontin promoter sequence deposited as GenBank deposit number D14813) A search for (base pair numbering) was performed as follows:
[0050]
Approximately 250 bp long from BSP, MGP and OPN promoters containing BSP-A1496G, BSP-G1869A, MGP-C242A, OPN-G520A and OPN-T1825C polymorphic base pairs using the polymerase chain reaction (PCR) The DNA fragment was amplified. PCR techniques are well known in the art and are suitable for the BSP, MGP and OPN genes including positions 1696 bp and p1869 bp within the BSP promoter, 242 bp within the MGP promoter and 520 bp and 1825 bp within the osteopontin promoter. Identifying the primers necessary to amplify a section will fall within the scope of those having ordinary skill in the art. The PCR technique is described in, for example, patent publications US Pat. No. 4,683,202 and EP0200362. 200 ng of genomic DNA was added to 1.5 mM MgCl 2 Of 1 × Taq polymerase buffer (Perkin Elmer), 5 nmol of each dNTP, 20 pmol forward and reverse primers and 1.25 units of AmpliTaq Gold (Perkin Elmer) in 25 μl reaction. The reaction was heated to 95 ° C. over 9 minutes, followed by 95 ° C. for 30 seconds at 46 ° C. (BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorph) or 49 ° C. (MGP-C242A polymorph) or 46 ° C. (OPN -G520A polymorph) or 48 cycles at 48 ° C (OPN-T1825C) for 30 seconds and 72 degrees for 30 seconds, with the last incubation extending 5 seconds for each cycle. This reaction solution was finally incubated at 72 ° C. for 7 minutes to complete the chain extension reaction. The primers for performing PCR amplification of DNA fragments containing BSP-A1496G, BSP-G1869A, MGP-C242A, OPN-G520A and OPN-T1825C polymorphic sequences were as follows:
BSP-A1496G polymorphic primer set:
Forward primer: 5′-GAA AAG ATA TAT ATA GAA GCC CAA G-3 ′ (SEQ ID No. 1)
Reverse primer: 5′-TAA TAT CAT TTG ATG TTT CCT CCT G-3 ′ (SEQ ID No. 2)
BSP-G1869A polymorphic primer set:
Forward primer: 5′-TTC TTT CGA CAT AGT GAA AAC ACG T-3 ′ (SEQ ID No. 3)
Reverse primer: 5′-CGT GGA TTC TCA CCA GAA AAC-3 ′ (SEQ ID No. 4)
MGP-C242A polymorphic primer set:
Forward primer: 5′-CAG TGA GAA AGC TCA TCA CTT GGT C-3 ′ (SEQ ID No. 5)
Reverse primer: 5′-ATT CTC CCA TCC ATC CAT CCA TGC A-3 ′ (SEQ ID No. 6)
OPN-G520A polymorphic primer set:
Forward primer: 5′-CGC TGG AAT TAA GAA AAT TGG TAG A-3 ′ (SEQ ID No. 7)
Reverse primer: 5′-GTT GTC AAT TTA GTG GAG GGA GAT C-3 ′ (SEQ ID No. 8)
OPN-T1825D polymorphic primer set:
Forward primer: 5′-GAG TAG TAA AGG ACA GAG GCG AGC T-3 ′ (SEQ ID No. 9)
Reverse primer: 5′-CTA GCT TTT TCA TTT ACG GGA TGG G-3 ′ (SEQ ID No. 10)
[0051]
To determine the presence or absence of polymorphic genotypes in DNA fragments PCR amplified using the PCR primer set described above, restriction enzyme analysis was performed as follows:
A DNA fragment obtained by PCR amplification using the BSP-A1496G polymorphic primer set was placed in 20 μl of a reaction solution containing 1 × buffer H (Amersham Pharmacia), 4 units of Eco T14 I (Amersham Pharmacia) and 5 μl of a cycled PCR reaction solution. Then, restriction enzyme treatment was performed using Eco T14 I. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerin aqueous solution) to 20 μl of Eco T14 I digestion solution and add 2.5% agarose gel. Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is homozygous for the wild type BSP sequence, a single band of 270 bp will be observed. If the analyzed DNA sample is heterozygous for the polymorph, two bands of 270 bp and 245 bp will be observed.
[0052]
A DNA fragment PCR-amplified using the BSP-G1869A polymorphic primer set is Eco-reacted with 20 μl of a reaction solution containing 1 × Universal buffer (Straragene), 4 units of Eco 72 I (Stratagene) and 5 μl of a cycled PCR reaction solution. The restriction enzyme was treated with 72I. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerin aqueous solution) to 20 μl of Eco 72 I digestion solution and add 2.5% agarose gel Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is heterozygous for the wild type BSP sequence, two bands of 253 bp and 230 bp will be observed. If the analyzed DNA sample is homozygous for the polymorph, one band of 230 bp will be observed.
[0053]
20 μl of the reaction mixture containing 1 × buffer H (Amersham Pharmacia), 4 units of Eco T22 I (Amersham Pharmacia) and 5 μl of the cycled PCR reaction solution from the DNA fragment PCR amplified using the MGP-C242A polymorphic primer set And restriction enzyme treatment with Eco T22 I. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% aqueous glycerin) to 20 μl of Eco T22 I digestion solution and add 2.5% agarose gel Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is heterozygous for the wild type MGP sequence, two bands of 266 bp and 241 bp will be observed. If the DNA sample is homozygous for the polymorph, a single band of 241 bp will be observed.
[0054]
A DNA fragment PCR-amplified using the OPN-G520A polymorphic primer set was added to 20 μl of a reaction solution containing 1 × buffer H (Amersham Pharmacia), 4 units of Bgl II (Amersham Pharmacia) and 5 μl of a cycled PCR reaction solution. Treated with Bgl II. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% aqueous glycerin) to 20 μl of Bgl II digestion solution and add to 2.5% agarose gel. Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is homozygous for the wild-type OPN sequence, one band of 278 bp will be observed. If the DNA sample is heterozygous, two bands of 278 bp and 257 bp will be observed. If the DNA sample is homozygous for the polymorphism, a single band of 257 bp will be observed.
[0055]
The DNA fragment PCR-amplified using the OPN-T1825C polymorphic primer set was added to 20 μl of a reaction solution containing 1 × buffer H (Amersham Pharmacia), 4 units of Sac I (Amersham Pharmacia) and 5 μl of the cycled PCR reaction solution. Restriction enzyme treatment was performed with Sac I. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerin aqueous solution) to 20 μl of Sac I digestion solution and add to 2.5% agarose gel. Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is homozygous for the wild type OPN sequence, one band of 256 bp will be observed. If the analyzed DNA sample is heterozygous, two bands of 256 bp and 235 bp will be observed. If the DNA sample is homozygous for the polymorphism, a single band of 235 bp will be observed.
[0056]
Statistical method. A two-way unpaired t-test was applied to determine if the difference between the average BMDs of the two genotypes was statistically significant.
[0057]
result
Forty DNA samples collected from healthy women were subjected to PCR amplification and then sequenced for specific promoter regions from the human BSP gene promoter, human MGP gene promoter and human OPN gene promoter. Five missing polymorphs were identified. The BSP-A1496G, BSP-G1869A, MGP-C242A, OPN-G520A, and OPN-T1825C polymorphisms are to be encoded as Xx, Yy, Zz, Bb, and Ss, respectively. The presence of a wild-type base pair at the shape position is meant, and the lower case letters mean the presence of a base pair different from the wild-type base pair at a particular polymorphic position.
[0058]
133 DNA samples from this 18-year study were searched for the presence of any of these five polymorphs.
[0059]
Table 1 shows the genotype distribution for the DNA samples collected in this study over 18 years for all identified polymorphic sites, namely BSP-A1496G, BSP-G1869A, MGP-C242A, OPN-G520A and OPN-T1825C. . The left table shows the real numbers of samples classified into three genotypes for the three identified polymorphic sites, and the right table shows the same analysis results as the left table. The numbers represent the percentage of all samples analyzed for each polymorphic site.
wt = XX, YY, ZZ, BB or SS
hz = Xx, Yy, Zz, Bb or Ss
pm = xx, yy, zz, bb or ss
[0060]
[Table 1]
[0061]
The genotype distribution for the five polymorphs is shown in Table 1. For the BSP-A1496G polymorphism, the homozygous wild type genotype has the highest abundance, followed by heterozygous and homozygous polymorphic genotypes, but there are very few homozygous polymorphism groups. is there. In the case of BSP-G1869A, wild-type genotypes are extremely rare as defined by the BSP gene promoter sequence obtained from GenBank, and heterozygous polymorphic genotypes are more than 10 times more frequent, Homozygous polymorphic genotypes are twice as frequent as heterozygotes. For the MGP-C242A polymorphism, the heterozygous genotype has the highest abundance, followed by the homozygous wild type and the homozygous polymorphic genotype in that order. In the case of OPN-G520A polymorphism, the homozygous polymorphic genotype has the highest abundance, followed by the heterozygous genotype and the wild type homozygous genotype. The genotype distribution of OPN-G1825A Takei was generally the same as for the MGP-242A polymorph.
[0062]
The effect of the five identified polymorphic sites on bone mass represented by BMC and BMD measurements in the distal arm and BMC / BMD changes over time was analyzed.
[0063]
Table 2 summarizes the statistical analysis results of the results obtained by searching for DNA samples obtained from this study for 18 years for the presence or absence of any of the five identified polymorphisms. Table A: Numbers indicate the likelihood / probability of differences in mean BMD between different genotype (homozygous wild type or heterozygous / homozygous polymorphic genotype) groups. The assay includes BMC (bone mineral content) and BMD measured in the distal arm. The numbers in parentheses represent the year of BMC / BMD measurement. Table B: Differences in mean BMD values of two genotypes (heterozygous / homozygous polymorphic group extracted from homozygous wild type group) are shown as a percentage of the maximum BMD value for that polymorphic site.
[0064]
[Table 2]
[0065]
As is apparent from this table, the BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorphic sites determine whether an individual is genetically predisposed to BMC / BMD levels, especially when combined. It is a good site for prediction. However, when the OPN-T1825C polymorph is combined with the BSP-G1869A polymorph, the percent segregation of genotypes is better than with either polymorph alone (Table 2). On the other hand, the MGP-C242A and OPN-G520A polymorphs do not appear to be suitable sites for such prediction. None of these identified polymorphs appeared to have a statistically significant effect on bone mass changes over time (data not shown). The age, elongation, and weight of individuals participating in the 18-year study were not significantly different between any of the genotype groups (data not shown).
[0066]
These observations strongly indicated that the BSP polymorphism has an effect on peak bone mass rather than on bone loss rate. In order to materialize this, we analyzed the variation of BMD measured four times for the same individual for different genotypes from 1977 to 1995. In 1977, the average age of individuals who participated in this 18-year study was 51.1 years, but in 1995 it ended at 69.1 years. The expected result for a curve obtained by plotting the BMD mean value obtained for one of these two BSP polymorphs against time should be two parallel curves, each These curves represent BMD values measured in individuals with wild-type genotypes and BMD values measured in individuals with polymorphic genotypes. As can be seen from FIGS. 2 and 3, this is actually true for the BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorphic sites. Furthermore, these two promoter polymorphs work together on peak bone mass, increasing the average BMD differences between genotypes even more greatly than if each polymorph contributed in isolation. There is (Figure 4).
[0067]
The effects and roles of MGP-C242A and OPN-G520A polymorphisms on MGP and OPN promoter on bone metabolism, if any, were not clear from the first analysis summarized in Table 2. However, when BMC values classified according to genotype were plotted against time, a group of curves appeared, and both the MGP-C242A (FIG. 5) and OPN-G520A (FIG. 6) polymorphic sites showed bone loss rates. It was suggested to be a determinant. Of particular note is that the ZZ and Zzz + zz curves and the BB + Bb and bb curves separated between 1979 and 1995 as the mean ages were 53.1 and 63.1, resulting in a constant It has been shown that genetic reduction is associated with menopause. Similar to the BSP polymorphism, the combined action of these MGP-C242A and OPN-G520A polymorphs results in a greater difference between genotypes than when alone (FIG. 7).
[0068]
According to the results summarized in Table 2, the effect of OPN-T1825C polymorphism on BMC / BMD was only observed when this polymorph was combined with the BSP-1869A polymorph. From the graphs obtained by classifying BMC values according to genotype and plotting against time, the two curves are close together, so such polymorphs have an effect on bone loss rate or peak bone mass. It is difficult to determine whether or not However, by combining this polymorph with the BSP-G1869A polymorph, a group of time curves are obtained, so that these two polymorphs cooperate additively and hence the OPN-T1825C polymorph. Was clearly shown to have an effect on peak bone mass rather than on bone loss rate, similar to the BSP-G1869A polymorph (FIG. 9).
[0069]
Finally, genotype and urinary osteocalcin levels (N-MIDR, Osteometer Biotech A / S) and different urinary type I collagen C-terminal cross-linking values (CrossLaps (R) , Osteometer Biotech A / S). As expected, there was no significant difference between the mean values of any biochemical bone metabolism markers obtained for the polymorphic sites of BSP-G1496G and BSP-G1869A (data not shown). In addition, no significant difference was observed between any average values of the biochemical bone metabolism markers obtained for the polymorphic sites of MGP-C242A and OPN-G520A. This is shown in FIGS. 5 and 6 with N-MIDR and Crosslaps. (R) This may be due to the equal rate of bone loss between the (1995) ZZ and Zzz + zz genotype groups and the BB + Bb and bb genotype groups at the time of measurement.
[0070]
Example 2 (18 years of research)
Method
Subjects—Following 133 women for 18 years (1977-1995) for bone mineral content (BMC) or bone mineral density (BMD), biochemical markers, height and weight and used for this study It was. A detailed description of this cohort has been reported previously (Joergensen et al., 1996).
[0071]
DNA analysis. A search for the OPG-G163G polymorphism (base pair numbering according to the numbering of the OPG / OCIF promoter sequence deposited at GenBank as deposit number AB008821) was performed as follows:
The polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify an approximately 253 bp long DNA fragment obtained from the OPG / OCIF promoter containing the OPG-A163G polymorphic base pair. 200 ng of genomic DNA was converted into 1 × PCR Gold buffer (Perkin Elmer), 1.5 mM MgCl 2 Added to 25 μl of reaction containing 5 nmol of each dNTP, 20 pmol forward and reverse primers and 1.25 units of AmpliTaq Gold (Perkin Elmer). The reaction was heated to 95 ° C. in 9 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 46 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds, with the final incubation at each cycle. It was extended for 5 seconds. This reaction solution was finally incubated at 72 ° C. for 7 minutes to complete the chain extension reaction. The lymer sequence for performing this PCR amplification was as follows:
OPG-A163G polymorphic primer set:
Forward primer: 5'-AGT CTA ACT TCT AGA CCA GGC AAT T-3 '(SEQ ID No. 11)
Reverse primer: 5′-AGT TAG AGC CAG AGA GAA TCT G-3 ′ (SEQ ID No. 12)
[0072]
In order to determine the presence or absence of polymorphic genotypes in DNA fragments PCR amplified using the PCR primer set described above, restriction enzyme analysis was performed as follows:
20 μl of a reaction mixture containing 1 × NEBuffer 4 (New England Biolabs), 4 units of Mfe I (New England Biolabs) and 5 μl of a cycled PCR reaction mixture of DNA fragments PCR-amplified using the BSP-A1496G polymorphic primer set The restriction enzyme was treated with Mfe I. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Add 4 μl of 6 × gel loading buffer (0.25% bromophenol, 0.25% xylene cyanol FF, 30% aqueous glycerin) to 20 μl of Mfe I digestion solution and add to 2.5% agarose gel. Loaded. The DNA fragments were then separated by electrophoresis until 2/3 of the bromophenol blue marker flowed through the gel. If the analyzed DNA sample is homozygous for the wild type BSP sequence, two bands of 253 bp and 232 bp will be observed. If the analyzed DNA sample is heterozygous for the polymorph, a single band of 232 bp will be observed.
[0073]
Statistical method. A two-way unpaired t-test was applied to determine if the difference between the mean BMD values of the two genotypes was statistically significant.
[0074]
result
After performing PCR amplification on 40 DNA samples collected from healthy women and then sequencing the specific promoter region from the human OPG / OCIF gene promoter, one previously unknown polymorph, OPG -A163G was identified. This OPG-A163G polymorph was decided to be encoded as Mm, where capital letters mean the presence of wild-type base pairs at a particular polymorphic position, and lowercase letters are wild-type at a particular polymorphic position. A base pair means the presence of a different base pair. The position of this polymorph is shown in FIG.
[0075]
We searched 133 DNA samples from this 18-year study and examined the presence of the polymorph of OPG-A163G.
[0076]
The genotype distribution of the DNA samples collected in this study for 18 years was as follows: homozygous wild type (MM) = 71.3% (n = 92), heterozygote (Mm) = 25.6% (n = 33) and homozygous polymorphism (mm) = 3.1% (n = 4). The genotype could not be determined in 4 of the 133 DNA samples.
[0077]
We analyzed the effects of the polymorphic sites identified this time on bone mass represented by bone mineral content (BMC) and bone mineral density (BMD) measurements in the distal arm in 1977 and 1995, respectively. (Table 3). The percent difference between genotype groups did not change significantly from 1977 to 1995, indicating that the OPG-A163G polymorph had a certain effect on peak bone mass. I mean. The two polymorphs described above, referred to as BSP-A1496G and BSP-G1869A, also affect the bone mass. Therefore, it was interesting to examine whether any cooperation / cooperation exists between the OPG polymorph and one of the two BSP polymorphs. When the combination / merging of OPG-A163G / BSP-A1496G and OPG-A163G / BSP-G1869A was performed, these polymorphisms ensured the zero hypothesis t-test p-value (ie, between genotypes). No difference) but was found to act in a cooperative manner in the sense that the mean BMC / BMD values were increased for the two genotype groups while decreasing to statistically significant values (Table 3).
[0078]
[Table 3]
[0079]
That is, to predict whether an individual is genetically predisposed to the level of BMC / BMD, especially when the OPG-A163G polymorph is combined and combined with the BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorphs It is clear that it is a good site.
[0080]
The age, elongation, and weight of individuals participating in the 18-year study were not significantly different between any of the genotype groups (data not shown).
[0081]
Changes in BMD measured four times for the same individual for different genotypes from 1977 to 1995 to materialize the original observation that the OPG / OCIF polymorphism affects peak bone mass I tried to analyze. In 1977, the average age of individuals participating in this 18-year study was 51.1 years, but in 1995 it ended at 69.1 years. The expected result for the curve obtained by plotting the BMD mean values obtained for the OPG-A163G polymorphism against time should be two parallel curves, each curve representing the wild type genotype Represents the BMD value measured in the individual and the BMD value measured in the heterozygous or polymorphic homozygous genotype individual. FIG. 11 shows that this is definitely true. Furthermore, by combining and combining the OPG-A163G and BSP-A1496G polymorphs, these two polymorphs cooperate to act on the peak bone mass, and the average BMD difference between the genotypes can be determined for each polymorph. It was found that the shape increased much more than if it contributed in isolation (FIG. 12). In fact, such collaboration is completely additive (Table 4). The numbers of BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorphs in Table 4 are extracted from the results shown in FIGS. Further, when the OPG-A163G and BSP-G1869A polymorphs are combined and combined, a positive cooperative action is obtained (FIG. 13), but this action is almost additive (Table 4).
[0082]
[Table 4]
[0083]
Finally, genotype and urinary osteocalcin level (N-MID (R) , Osteometer Biotech A / S) and different urinary type I collagen C-terminal crosslinking values (Crosslaps (R) , Osteometer Biotech A / S). After reaching the peak bone mass and age, urine samples were collected. As expected, there was no significant difference between the mean values of any biochemical bone metabolism markers obtained for the OPG-A163G polymorphism (data not shown). Such a result is N-MID. (R) And CrossLaps (R) This is due to the equal rate of bone loss in the (1995) MM and Mm + mm genotype groups at the time of measurement, and it is not surprising for polymorphs that affect peak bone mass.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 Panel A shows the location of two polymorphisms designated BSP-A1496G and BPS-G1869A in the bone sialoprotein gene promoter. Panel B shows the position of the polymorphism designated MGP-C242 in the matrix gla protein gene promoter. Panel C shows the positions of polymorphisms designated OPN-G520A and OPN-T1825C in the osteopontin gene promoter. The wild-type sequence containing the four polymorphic sites for all three promoters described above, the nucleotide at the polymorphic position shown in bold and the substitution sequence located above the polymorphic position-again shown in bold With- All numbering of nucleotides is relative to base sequence 1, which is the 5 'nucleotide of each of the promoter sequences published in the GenBank nucleotide database.
FIG. 2 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the BSP-A1496G polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 3 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the BSP-G1869A polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 4 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the BSP-A1496G and BSP-G1869A polymorphic site combinations are classified into two genotypes. The upper curve represents the combination BSP-A1496A heterozygous / homozygous polymorphic position and BSP-G1869A wild type position, and the lower curve represents the BSP-A196G wild type position and BSP-G1869A heterozygote. / Indicates a combination of homozygous polymorphic positions. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 5 shows the time dependence of average BMCs measured in the distal arm when the MGP-C242A polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 6 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the OPN-G520A polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 7 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when MGP-C242A and OPN-G520A polymorphic sites are classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 8 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the OPN-T1825C polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 9 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the BSP-G1869A and OPN-T1825C polymorphic site combinations are classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 10 shows the position of the OPG-A163G polymorphism in the OPG / OCIF gene promoter. The wild-type sequence containing the polymorphic site of the promoter described above is shown together with the nucleotide at the polymorphic position shown in bold and the substitution sequence located above the polymorphic position—also shown in bold. All nucleotide numbering is relative to base sequence 1, which is the 5 'nucleotide of each of the promoter sequences published in the GenBank nucleotide database.
FIG. 11 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the OPG-A163G polymorphic site is classified into two genotypes. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 12 shows the time dependence of average BMCs measured in the distal arm when the BSP-G1496G and OPG-A163G polymorphic site combinations are classified into two genotypes. The upper curve represents the combination of BSP-A1496G heterozygous / homozygous polymorphic position and OPG-A163G wild type position, and the lower curve represents the BSP-A1496G wild type position and OPG-A163G heterozygote. / Indicates a combination of homozygous polymorphic positions. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
FIG. 13 shows the time dependence of mean BMCs measured in the distal arm when the BSP-G1869A and OPG-A163G polymorphic site combinations are classified into two genotypes. The upper curve represents the combination BSP-G1869A heterozygous / homozygous polymorphic position and OPG-G1869A wild type position, and the lower curve represents the BSP-G1869A wild type position and OPG-A163G heterozygote. / Indicates a combination of homozygous polymorphic positions. These BMCs were measured at four time points of 1977, 1979, 1989 and 1995 for each individual out of 133 in an 18-year study. Each point on the curve is the average BMC for the year and genotype, and the SEM error is indicated by a bar. The table below the graph shows the actual BMC values measured in 1977, 1979, 1989 and 1995 for the two genotype groups and the percentage difference between the two genotypes for each of the four sampling years. It is listed in.
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