JP2005515760A - Nucleic acids encoding G protein-coupled receptors and uses thereof - Google Patents

Abstract

炎症および生理学的な免疫反応におけるシグナル変換に関与する新規の有用なＧタンパク質共役受容体を提供する。また、該受容体を用いて該受容体の活性を調節し得る分子をスクリーニングする方法を提供する。このような分子は、多くの炎症および免疫関連の病気および障害を治療するのに容易に用いることができる。  New and useful G protein-coupled receptors involved in signal transduction in inflammation and physiological immune responses are provided. Also provided are methods for screening for molecules that can modulate the activity of the receptor using the receptor. Such molecules can be readily used to treat many inflammation and immune related diseases and disorders.

Description

本発明は、一般的に、これまで知られていないＧタンパク質共役受容体であるＧＡＶＥ１８をコードする新規の核酸分子、および、その核酸分子およびＧＡＶＥ１８の使用に関する。   The present invention relates generally to a novel nucleic acid molecule encoding GAVE18, a previously unknown G protein coupled receptor, and the use of the nucleic acid molecule and GAVE18.

Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞のシグナル伝達を引き起こす完全貫通性膜タンパク質の大規模なファミリーである。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光などの多様な細胞外シグナルに応答し、細胞内で第２メッセンジャー応答を開始させるようにシグナルを伝達させることができる。この受容体は、炎症、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌および蠕動などの多様な生理学的応答を媒介するために、多くの治療剤はＧＰＣＲを標的にする。   G protein-coupled receptors (GPCRs) are a large family of fully permeable membrane proteins that cause cellular signaling. GPCRs can respond to a variety of extracellular signals such as neurotransmitters, hormones, odorants, and light, and signal to initiate a second messenger response within the cell. Many therapeutic agents target GPCRs because this receptor mediates a variety of physiological responses such as inflammation, vasodilation, heart rate, bronchodilation, endocrine and peristalsis.

ＧＰＣＲは、細胞外ドメイン、７回膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインで特徴付けられる。リガンドとの結合やＧタンパク質との相互作用などの受容体が行う機能のいくつかは、特定の位置の特定のアミノ酸の存在に関連している。例えば、様々な研究により、ＧＰＣＲにおけるアミノ酸配列の差が、天然リガンド、または、低分子物質アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかに対する親和性における差の原因となることが示されている。言い換えれば、配列におけるわずかな差が、異なる結合親和性および活性の原因となり得る。（例えばＭｅｎｇ等，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ（１９９６年）２７１（５０）：３２０１６〜２０；Ｂｕｒｄ等，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ（１９９８年）２７３（５１）：３４４８８〜９５；および、Ｈｕｒｌｅｙ等，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９９年）７２（１）：４１３〜２１を参照）。特に、研究により、第三の細胞内ドメインにおけるアミノ酸配列の差が、異なる活性を生じさせ得ることが示されている。Ｍｙｂｕｒｇｈ等は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体の第三細胞内ループのアラニン２６１が、Ｇタンパク質共役および受容体細胞内移行に不可欠であることを見出した（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（１９９８年）３３１（第３部）：８９３〜６）。Ｗｏｎｅｒｏｗ等は、チロトロピン受容体を研究しており、第三細胞内ループにおける欠失により構成的な受容体活性が生じることを実証している（Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ（１９９８年）２７３（１４）：７９００〜５）。   GPCRs are characterized by an extracellular domain, a 7-transmembrane domain, and an intracellular domain. Some of the functions performed by receptors such as ligand binding and interaction with G proteins are related to the presence of specific amino acids at specific positions. For example, various studies have shown that amino acid sequence differences in GPCRs cause differences in affinity for either natural ligands or small molecule agonists or antagonists. In other words, slight differences in sequence can cause different binding affinities and activities. (E.g. Meng et al., J BioChem (1996) 271 (50): 32016-20; Burd et al., J BioChem (1998) 273 (51): 34488-95; and Hurley et al., J Neurochem (1999). ) 72 (1): 413-21). In particular, studies have shown that amino acid sequence differences in the third intracellular domain can result in different activities. Myburgh et al. Found that alanine 261 in the third intracellular loop of the gonadotropin-releasing hormone receptor is essential for G protein coupling and receptor intracellular translocation (Biochem J (1998) 331 (Part 3). : 893-6). Wonerow et al. Have studied the thyrotropin receptor and have demonstrated that deletions in the third intracellular loop result in constitutive receptor activity (J BioChem (1998) 273 (14): 7900. ~ 5).

一般的に、内因性のリガンドの受容体への結合作用により、受容体の細胞内ドメインがコンフォメーション変化を起こし、それにより細胞内ドメインと細胞内の成分であるＧタンパク質との結合が起こる。数種のＧタンパク質が存在し、例えば、Ｇ_q、Ｇ_s、Ｇ_i、Ｇ_zおよびＧ₀がある（例えばＤｅｓｓａｕｅｒ等，Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）（１９９６年）９１（５）：５２７〜３７を参照）。ＩＣ−３ループ、および、受容体のカルボキシ末端は、Ｇタンパク質と相互作用する（Ｐａｕｗｅｌｓ等，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ（１９９８年）１７（１〜３）：１０９〜１３５、および、上述のＷｏｎｅｒｏｗ等）。いくつかのＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に関して「無差別」である、すなわち、ＧＰＣＲは２以上のＧタンパク質と相互作用することができる（例えば、Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８８年）４３：１０９５を参照）。 In general, the binding action of an endogenous ligand to a receptor causes a conformational change in the intracellular domain of the receptor, whereby binding between the intracellular domain and a G protein that is a component in the cell occurs. There are several G proteins, for example, G _q , G _s , G _i , G _z and G ₀ (eg Dessauer et al., Clin Sci (Colch) (1996) 91 (5): 527-37. reference). The IC-3 loop and the carboxy terminus of the receptor interact with the G protein (Pauwels et al., Mol Neurobiol (1998) 17 (1-3): 109-135, and Wonelow et al., Supra). Some GPCRs are “promiscuous” with respect to G proteins, ie GPCRs can interact with more than one G protein (see, eg, Kenakin, Life Sciences (1988) 43: 1095).

リガンドによりＧＰＣＲとＧタンパク質との結合が活性化され、それによりシグナル伝達カスケードプロセスが作動する（「シグナル伝達」と称する）。最終的に、このようなシグナル伝達は、細胞の活性化または細胞の阻害を引き起こす。   Ligand activates the binding between GPCR and G protein, thereby activating the signaling cascade process (referred to as “signaling”). Ultimately, such signaling causes cell activation or cell inhibition.

ＧＰＣＲは、２種の異なるコンフォメーション、すなわち「不活性」状態と「活性」状
態とが平衡した状態で細胞膜に存在する。不活性状態の受容体は、細胞内シグナル伝達経路と連携して生物学的な反応を起こすことができない（ただし形質導入細胞における受容体の過剰発現のような例外がある；例えば、www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.を参照）。活性状態へのコンフォメーション変換により、伝達経路（Ｇタンパク質を介した）に連結し、生物学的な反応が生じる。アゴニストが結合すれば、活性コンフォメーションをより高く生じさせることができる。しかしながら、場合によっては、アゴニストがまったく存在しない状態で相当な反応がすでに生じている場合は、このような受容体は、構成的に活性であると考えられる（すなわち、すでに活性コンフォメーションであるか、リガンド非依存性であるか、または、自律的な活性状態である）。このような系にアゴニストを加えた場合、通常は強い反応が得られる。しかしながら、典型的なアンタゴニストを加えた場合、このような分子の結合による効果は現れない。一方で、ある種のアンタゴニストは受容体の構成的な活性の阻害を引き起こすが、これは、後者の薬物群は技術的にはアンタゴニストではなく、本質的に負の活性を有するアゴニストであることを示す。このような薬物は、インバースアゴニストという（www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm）。 GPCRs exist in the cell membrane in a balance between two different conformations: an “inactive” state and an “active” state. Inactive receptors cannot initiate biological responses in conjunction with intracellular signaling pathways (with exceptions such as receptor overexpression in transduced cells; eg, www.creighton see .edu / Pharmacology / inverse.htm. ). Conformational conversion to the active state links to the transmission pathway (via the G protein) and produces a biological response. If an agonist is bound, a higher active conformation can be generated. However, in some cases, such a receptor is considered constitutively active if a substantial response has already occurred in the absence of any agonist (ie, is it already in an active conformation? Ligand-independent or autonomously active). When an agonist is added to such a system, a strong response is usually obtained. However, the effects of such molecular binding do not appear when typical antagonists are added. On the other hand, certain antagonists cause inhibition of the constitutive activity of the receptor, indicating that the latter group of drugs is technically not antagonists and is essentially an agonist with negative activity. Show. Such drugs are called inverse agonists ( www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm ).

受容体に関する従来の研究は、まず内因性のリガンドを同定し、それからアンタゴニストやその他の受容体エフェクター分子を同定する発見を進行させるという仮説に基づき続けられてきた。アンタゴニストが最初に発見される可能性がある場合でも、内因性のリガンドを同定することが独断的な応対であった（ＷＯ００／２２１３１）。しかしながら、分析スクリーニング目的では活性状態が最も有用であるため、このような構成的受容体、特にＧＰＣＲを得ることにより、内因性のリガンドに関する情報がない場合のアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストの容易な単離が可能になると考えられる。その上、受容体活性障害に起因する病気において、構成的な活性の阻害を引き起こす薬物、またはより特異的には、活性のある受容体の濃度を減少させる薬物を、自律的な活性状態の受容体を用いる分析でより簡単に発見することができる。例えば、病気を治療する予定の患者にトランスフェクトすることができる受容体のような受容体の活性を、このような分析により発見されたインバースアゴニストで微調整することができる。   Traditional research on receptors has continued based on the hypothesis of first identifying endogenous ligands and then proceeding with the discovery of antagonists and other receptor effector molecules. Even when antagonists could be discovered for the first time, identifying endogenous ligands was a voluntary response (WO 00/22131). However, since the active state is most useful for analytical screening purposes, obtaining such constitutive receptors, particularly GPCRs, allows for agonists, partial agonists, inverse agonists and antagonists in the absence of information on endogenous ligands. It is thought that easy isolation is possible. In addition, in diseases caused by impaired receptor activity, drugs that cause inhibition of constitutive activity, or more specifically, drugs that reduce the concentration of active receptors, are accepted in an autonomously active state. It can be discovered more easily by analysis using the body. For example, the activity of a receptor, such as a receptor that can be transfected into a patient scheduled to treat a disease, can be fine-tuned with an inverse agonist discovered by such an analysis.

一般的に、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）やリウマチ様関節炎（ＲＡ）のような病気は、ヘルパーＴ細胞、単球−マクロファージおよび好酸球が関与する炎症が原因であると考えられている。現在の、コルチコステロイドを用いた抗炎症的な治療は、喘息には有効であるが、代謝や内分泌の副作用が付随する。同様のことが、肺または鼻の粘膜を介して吸収可能な吸入製剤に関して当てはまる可能性がある。ＲＡまたはＣＯＰＤの経口療法は、現状ではうまくいっていない。   In general, diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and rheumatoid arthritis (RA) are thought to be caused by inflammation involving helper T cells, monocytes-macrophages and eosinophils. ing. Current anti-inflammatory treatments with corticosteroids are effective for asthma but are associated with metabolic and endocrine side effects. The same may be true for inhalation formulations that can be absorbed through the lung or nasal mucosa. Oral therapy of RA or COPD has not been successful at present.

好酸球は、アレルギーや喘息における気道の機能障害のほとんどに介在する。インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、好酸球の増殖性および活性化サイトカインである。研究によれば、ＩＬ−５は、気道過敏性を引き起こす組織の好酸球増加症や好酸球が介在する組織の損傷に必須であることが示されている（Ｃｈａｎｇ等，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６年）９８（５ｐｔ１）：９２２〜９３１、および、Ｄｕｅｚ等，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ（２０００年）１６１（１）：２００〜２０６）。アトピー性喘息の場合、アレルゲン（例えばイエダニ抗原）に晒された後、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）からＩＬ−５が産生される。   Eosinophils mediate most airway dysfunction in allergies and asthma. Interleukin-5 (IL-5) is a proliferative and activated cytokine of eosinophils. Studies have shown that IL-5 is essential for tissue eosinophilia that causes airway hyperresponsiveness and eosinophil-mediated tissue damage (Chang et al., J Allergy Clin Immunol). (1996) 98 (5pt1): 922-931, and Duez et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 161 (1): 200-206). In the case of atopic asthma, IL-5 is produced from type 2 helper T cells (Th2) after exposure to allergens (eg house dust mite antigen).

ＲＡは、罹患した滑膜で活性化マクロファージが蓄積することにより発症するものと考えられている。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）から誘導される多数の炎症促進特性を有するサイトカインである。これは、最も効力のあるマクロファージ活性化サイトカインであり、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子転写を誘導し、樹状細
胞様の表現型に寄与する。 RA is thought to develop due to the accumulation of activated macrophages in the affected synovium. Interferon gamma (IFNγ) is a cytokine with numerous pro-inflammatory properties derived from type 1 helper T cells (Th1). This is the most potent macrophage activating cytokine, inducing MHC class II gene transcription and contributing to a dendritic cell-like phenotype.

リポ多糖体（ＬＰＳ）は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）放出などの炎症性反応を誘発させるグラム陰性菌の細胞壁の成分である。ＲＡにおける静脈内への抗ＴＮＦα療法の有効性が臨床で実証されている。またＣＯＰＤは、肺でマクロファージが蓄積し、それによりマクロファージが好中球の化学誘引物質（例えば、ＩＬ−８：ｄｅ Ｂｏｅｒ等，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２０００年）１９０（５）：６１９〜６２６）が産生されることにより発症するものと考えられている。マクロファージおよび好中球はいずれも、肺胞壁の分解を引き起こすカテプシンを放出する。肺上皮が、炎症性細胞の化学誘引物質やその他の炎症性細胞活性化物質の重要な源であると考えられている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ等，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０００年）７４（１８）：８４２５〜８４３３；Ｌａｍｋｈｉｏｕｅｄ等，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ（２０００年）１６２（２ Ｐｔ．１）：７２３〜７３２；および、Ｓｅｋｉｙａ等，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００年）１６５（４）：２２０５〜２２１３を参照）。   Lipopolysaccharide (LPS) is a component of the cell wall of Gram-negative bacteria that induces inflammatory responses such as tumor necrosis factor alpha (TNFα) release. The effectiveness of intravenous anti-TNFα therapy in RA has been demonstrated clinically. In COPD, macrophages accumulate in the lung, which produces neutrophil chemoattractants (for example, IL-8: de Boer et al., J Pathol (2000) 190 (5): 619-626). It is thought that it develops by being done. Both macrophages and neutrophils release cathepsins that cause alveolar wall degradation. The lung epithelium is thought to be an important source of inflammatory cell chemoattractants and other inflammatory cell activators (eg, Thomas et al., J Virol (2000) 74 (18): 8425. 8433; Lamkhioued et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 162 (2 Pt. 1): 723-732; and Sekiya et al., J Immunol (2000) 165 (4): 2205-2213).

病気においてＧＰＣＲが有する役割、および、ＧＰＣＲ活性調節による病気を治療する能力を考慮して、これまで知られていないＧＰＣＲを同定し、特徴付けすることにより、ＧＰＣＲ活性が関連する病状を治療する新規の組成物および方法の開発を提供することができる。従って、これまで知られていないＧＰＣＲをコードする新規の有用な核酸分子の発見、単離および特徴付けが必要である。   Considering the role of GPCRs in disease and the ability to treat diseases by modulating GPCR activity, identifying and characterizing previously unknown GPCRs, a novel treatment for conditions associated with GPCR activity Development of compositions and methods can be provided. Accordingly, there is a need for the discovery, isolation and characterization of new useful nucleic acid molecules that encode previously unknown GPCRs.

また、このようなこれまで知られていないＧＰＣＲを用いて特定のＧＰＣＲの可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストとして役立つ分子を同定する分析も必要である。これら分子は、インビボでＧＰＣＲ活性を調節する治療剤としての用途を有し、それによりＧＰＣＲ活性に関連する多くの病気を治療する可能性がある。   There is also a need for an analysis to identify molecules that serve as potential agonists or antagonists of a particular GPCR using such previously unknown GPCRs. These molecules have use as therapeutic agents that modulate GPCR activity in vivo, thereby potentially treating many diseases associated with GPCR activity.

本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、このような参考文献が本願の「従来技術」として利用可能であると認めたものと解釈されるべきではない。   Citation of any reference herein shall not be construed as an admission that such reference is available as “Prior Art” to this application.

本発明では、新規の構成的に活性なＧＰＣＲであるＧＡＶＥ１８の発現を同定し、特徴付けており、本発明は、この発見を関連する病気の同定および治療に適用するための組成物および方法を提供する。   The present invention identifies and characterizes the expression of GAVE18, a novel constitutively active GPCR, and the present invention provides compositions and methods for applying this discovery to the identification and treatment of related diseases. provide.

従って、大まかに言えば、本発明は、単離された図５のＤＮＡ配列（配列番号１）を含む核酸分子、それらの変異体、それらの断片、または、それらの類似体もしくは誘導体を含む。このような本発明の変異体としては、突然変異体、縮重変異体、または、配列において縮重変化を起こす縮重変異体が挙げられる。   Thus, broadly speaking, the present invention includes nucleic acid molecules comprising the isolated DNA sequence of FIG. 5 (SEQ ID NO: 1), variants thereof, fragments thereof, or analogs or derivatives thereof. Such variants of the present invention include mutants, degenerate variants, or degenerate variants that cause degenerative changes in sequence.

その上、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の単離された核酸分子またはそれらの変異体にハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を含む。さらにその上、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のＤＮＡ配列に相補的な核酸分子にハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は後述する。   Moreover, the present invention includes an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing to the isolated nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof under stringent hybridization conditions. Furthermore, the present invention includes an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing to a nucleic acid molecule complementary to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent hybridization conditions. Stringent hybridization conditions will be described later.

その上、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子を含む。   Moreover, the present invention includes an isolated nucleic acid molecule comprising a DNA sequence encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

場合により、上述の本発明の単離された核酸分子は、検出可能に標識することができる。本発明で用いることができる検出可能な標識の例としては、これらに限定されないが、酵素、放射性同位体、または、蛍光を発する化学物質が挙げられる。検出可能な標識の特定の例は後述する。   Optionally, the above-described isolated nucleic acid molecule of the present invention can be detectably labeled. Examples of detectable labels that can be used in the present invention include, but are not limited to, enzymes, radioisotopes, or fluorescent chemicals. Specific examples of detectable labels are described below.

特定のポリペプチドも本発明に含まれる。例えば、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド、それらの保存的な変異体、またはそれらの類似体もしくは誘導体を含む。場合により、本発明のポリペプチドは、検出可能に標識されてもよい。   Certain polypeptides are also included in the present invention. For example, the invention includes purified polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, conservative variants thereof, or analogs or derivatives thereof. In some cases, the polypeptides of the invention may be detectably labeled.

加えて、本発明は、本発明のポリペプチドが抗体生産で用いられる免疫原であるような抗体を含む。これら抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルが可能である。その上、これら抗体は、例えば、異なる種において本発明の精製ポリペプチドに対して生じる抗体のタンパク質ドメインを含むような「キメラ」も可能である。特定の実施形態において、本発明の抗体は、「ヒト化」されてもよい。もちろん、本発明の抗体は検出可能に標識されてもよい。本発明で用いることができる検出可能な標識の特定の例は後述する。   In addition, the present invention includes antibodies wherein the polypeptides of the present invention are immunogens used in antibody production. These antibodies can be monoclonal or polyclonal. Moreover, these antibodies can be “chimeric”, for example, including the protein domains of antibodies raised against the purified polypeptides of the invention in different species. In certain embodiments, the antibodies of the invention may be “humanized”. Of course, the antibodies of the invention may be detectably labeled. Specific examples of detectable labels that can be used in the present invention are described below.

本発明は、発現調節要素と操作可能に結合した、配列番号１のＤＮＡ配列を含む核酸分子、それらの変異体、それらの類似体もしくは誘導体、または、それらの断片を含む発現ベクターをさらに含む。その上、本発明の発現ベクターは、発現調節要素と操作可能に結合した、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、または、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子に相補的なハイブリダイゼーションプローブ（ハイブリダイゼーションプローブが発現調節要素と操作可能に結合している）にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を含み得る。本発明で用いることができる発現調節要素の特定の例は、プロモーターである。本発明で用いることができる特定のプロモーターの例としては、これらに限定されないが、ｈＣＭＶの初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスの初期プロモーター、ワクシニアの初期プロモーター、ポリオーマの初期プロモーター、ＳＶ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、ｌａｃ、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、または酵母α交配因子のプロモーターが挙げられる。   The present invention further includes an expression vector comprising a nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, a variant, an analogue or derivative thereof, or a fragment thereof operably linked to an expression control element. Moreover, the expression vector of the present invention is an isolated vector capable of hybridizing under stringent hybridization conditions to an isolated nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 operably linked to an expression control element. Hybridization that is stringent to a nucleic acid molecule or a hybridization probe complementary to an isolated nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the hybridization probe is operably linked to an expression control element It may include an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing under conditions. A specific example of an expression control element that can be used in the present invention is a promoter. Examples of specific promoters that can be used in the present invention include, but are not limited to, early hCMV promoter, early SV40 promoter, early adenovirus promoter, early vaccinia promoter, early polyoma promoter, late SV40 promoter Promoter, late promoter of adenovirus, late promoter of vaccinia, late promoter of polyoma, lac, trp system, TAC system, TRC system, major operator and promoter region of lambda phage, regulatory region of fd coat protein, 3-phosphoglycerin Examples include an acid kinase promoter, an acid phosphatase promoter, or a yeast alpha mating factor promoter.

本発明の発現ベクターを用いれば、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換させ、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれらの変異体を生産することができる。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれでもよい。本発明で用いることができる単細胞宿主の特定の例としては、いくつか例を挙げれば、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０およびＳｆ９細胞が挙げられる。   Using the expression vector of the present invention, a host cell can be transfected or transformed to produce a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a variant thereof. The host cell can be either prokaryotic or eukaryotic. Specific examples of unicellular hosts that can be used in the present invention include E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, yeast, CHO, R1.1, BW, LM, COS1. , COS7, BSC1, BSC40, BMT10 and Sf9 cells.

その上、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド、それらの変異体、または、それらの断片の製造方法をさらに含む。このような方法は、本発明の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を精製されたポリペプチドが発現されるような条件下で培養すること、続いて、単細胞宿主、宿主細胞を含む培養物、またはその両方から精製されたポリペプチドを回収すること、を含む。   Moreover, the present invention further includes a method for producing a purified polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a variant thereof, or a fragment thereof. Such methods include culturing host cells transformed or transfected with an expression vector of the invention under conditions such that the purified polypeptide is expressed, followed by unicellular host, host cells. Recovering the purified polypeptide from the culture, or both.

その上、本発明は、ＧＡＶＥ１８の活性を調節することができる化合物を同定するための分析方法を含む。このような化合物は、ＧＡＶＥ１８のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストであり得る。従って、本発明は、ＧＡＶＥ１８のアゴニスト
の同定方法を含み、該方法は、可能性のあるアゴニストと、内因性リガンドの存在下でＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させること、および、可能性のあるアゴニストの非存在下におけるＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性に比べて、該可能性のあるアゴニストの存在下でＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性が増加するかどうかを決定することを含む。 Moreover, the present invention includes analytical methods for identifying compounds that can modulate the activity of GAVE18. Such a compound can be an agonist, antagonist, or inverse agonist of GAVE18. Thus, the present invention includes a method of identifying an agonist of GAVE18, which method comprises contacting a potential agonist with a cell expressing GAVE18 in the presence of an endogenous ligand, and potentially Determining whether the signaling activity of GAVE18 is increased in the presence of the potential agonist as compared to the signaling activity of GAVE18 in the absence of the agonist.

同様に、本発明は、ＧＡＶＥ１８のインバースアゴニストの同定方法を含む。このような方法は、可能性のあるインバースアゴニストとＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させること、および、可能性のあるインバースアゴニストおよび内因性リガンドまたはアゴニストの存在下でＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性が、内在性リガンドまたはアゴニストが存在するが、可能性のあるインバースアゴニストの非存在下という条件下でのＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性に比べて減少するかどうか、および、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下で減少するかどうかを決定すること、を含む。   Similarly, the present invention includes methods for identifying inverse agonists of GAVE18. Such a method involves contacting a potential inverse agonist with a cell expressing GAVE18, and the signaling activity of GAVE18 in the presence of the potential inverse agonist and endogenous ligand or agonist is endogenous. Whether or not there is a sex ligand or agonist but compared to the signaling activity of GAVE18 in the absence of a potential inverse agonist and in the presence of an endogenous ligand or agonist Determining whether or not.

もちろん、本発明は、ＧＡＶＥ１８のアンタゴニストの同定方法を含む。このような方法は、可能性のあるアンタゴニストとＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させる工程、および、前記可能性のあるアンタゴニストの存在下でＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性が、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ１８活性に比べて減少するかどうかを決定する工程を含む。   Of course, the present invention includes methods for identifying antagonists of GAVE18. Such a method comprises contacting a potential antagonist with a cell expressing GAVE18, and in the presence of said potential antagonist, the signaling activity of GAVE18 is increased in the presence of an endogenous ligand or agonist. Determining whether it decreases relative to GAVE18 activity at

従って、本発明の目的の一つは、ＧＡＶＥ１８タンパク質、それらの断片、またはそれらの変異体をコードする単離された核酸配列を提供することである。   Accordingly, one object of the present invention is to provide isolated nucleic acid sequences encoding GAVE18 proteins, fragments thereof, or variants thereof.

また、配列番号１のＤＮＡ配列を含む核酸分子、または、ストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズ可能な核酸分子の変異体を提供することも、本発明の目的である。   It is also an object of the present invention to provide a nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or a variant of a nucleic acid molecule that can hybridize to SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.

本発明のさらなる目的は、ＧＡＶＥ１８、およびそれらの変異体、それらの断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体に関するアミノ酸配列を提供することである。   A further object of the present invention is to provide amino acid sequences for GAVE18, and variants, fragments thereof, or analogs or derivatives thereof.

本発明のさらなる目的は、ＧＡＶＥ１８、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供することであり、該ＤＮＡ配列は発現調節要素と操作可能に結合している。   A further object of the present invention is to provide an expression vector comprising a DNA sequence encoding GAVE18, a variant thereof, a fragment thereof, or an analogue or derivative thereof, the DNA sequence being manipulated with expression control elements. Combined as possible.

本発明のさらなる目的は、ＧＡＶＥ１８、それらの変異体、それらの類似体もしくは誘導体、または、それらの断片を免疫原とする抗体を提供することである。   A further object of the present invention is to provide antibodies that immunogenize GAVE18, variants thereof, analogs or derivatives thereof, or fragments thereof.

本発明のさらにその他の目的は、ＧＡＶＥ１８タンパク質の活性を調節できる化合物の同定方法に関する。このような調節因子としては、ＧＡＶＥ１８のアンタゴニスト、ＧＡＶＥ１８のアゴニスト、またはＧＡＶＥ１８のインバースアゴニストが可能である。   Yet another object of the present invention relates to a method for identifying compounds capable of modulating the activity of GAVE18 protein. Such a modulator can be an antagonist of GAVE18, an agonist of GAVE18, or an inverse agonist of GAVE18.

本発明のさらなる目的は、ＧＡＶＥ１８活性を調節するのに用いる医薬組成物を提供することである。このような調節は、ＧＡＶＥ１８活性に関する多種多様な病気を治療するのに用いることができ、例えば、いくつか例を挙げれば、様々な炎症性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、およびリウマチ様関節炎が挙げられる。   It is a further object of the present invention to provide a pharmaceutical composition used to modulate GAVE18 activity. Such modulation can be used to treat a wide variety of diseases related to GAVE18 activity, such as various inflammatory diseases, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and to name a few. Rheumatoid arthritis.

本発明の上記観点およびその他の観点は、以下の図面および詳細な説明を参照することによってさらによく理解することができる。   These and other aspects of the invention can be better understood with reference to the following drawings and detailed description.

添付図面において、
図１は、様々なタイプの組織、特に「免疫関連の」組織、例えば、胸腺および肝臓にお
けるＧＡＶＥ１８のＤＮＡの転写を示すノーザンブロットである。
図２は、様々なタイプの細胞におけるＧＡＶＥ１８ＤＮＡの相対的発現を示すヒストグラムである。
図３は、様々なタイプの組織におけるＧＡＶＥ１８ＤＮＡの相対的発現を示すヒストグラムである。
図４は、ＧＡＶＥ１８発現のプロフィルである。発現のプロフィルデータによれば、ＧＡＶＥ１８は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理したＮＨＢＥ（正常なヒト気管支上皮細胞）において、発現レベルが上昇したことが示される。ＴＮＦαは、炎症組織で常に観察される。その上、気管支上皮細胞は喘息において重要な役割を有する。
図５は、ＧＡＶＥ１８のＤＮＡ配列である（配列番号１）。
図６は、ＧＡＶＥ１８の推定アミノ酸配列である（配列番号２）。 In the accompanying drawings,
FIG. 1 is a Northern blot showing the transcription of GAVE18 DNA in various types of tissues, in particular “immune related” tissues such as thymus and liver.
FIG. 2 is a histogram showing the relative expression of GAVE18 DNA in various types of cells.
FIG. 3 is a histogram showing the relative expression of GAVE18 DNA in various types of tissues.
FIG. 4 is a profile of GAVE18 expression. Expression profile data indicate that GAVE18 has increased expression levels in NHBE (normal human bronchial epithelial cells) treated with tumor necrosis factor α (TNFα). TNFα is always observed in inflamed tissues. Moreover, bronchial epithelial cells have an important role in asthma.
FIG. 5 shows the DNA sequence of GAVE18 (SEQ ID NO: 1).
FIG. 6 is the deduced amino acid sequence of GAVE18 (SEQ ID NO: 2).

上述したように、本発明は、これまで知られていないＧタンパク質共役受容体ををコードするこれまで知られていない核酸分子（本発明においてはＧＡＶＥ１８と称する）の驚くべき意外な発見に関する。特に、ＧＡＶＥ１８が、免疫系組織または器官、例えば腎臓、肝臓および小腸で発現されることがわかった。その上、驚くべきことに、かつ意外なことに、ＧＡＶＥ１８は、炎症組織で常に観察されるタンパク質である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理されたＮＨＢＥ（正常なヒト気管支上皮細胞）において発現レベルが上昇することがわかった。その結果として、ＧＡＶＥ１８活性の改変は、免疫関連病気および障害、例えば様々な炎症性疾患およびリウマチ様関節炎の治療において有用である可能性がある。   As mentioned above, the present invention relates to the surprising and surprising discovery of a previously unknown nucleic acid molecule (referred to herein as GAVE18) that encodes a previously unknown G protein coupled receptor. In particular, GAVE18 has been found to be expressed in immune system tissues or organs such as kidney, liver and small intestine. Moreover, surprisingly and surprisingly, GAVE18 is expressed in NHBE (normal human bronchial epithelial cells) treated with tumor necrosis factor α (TNFα), a protein that is always observed in inflammatory tissues. Was found to rise. Consequently, alterations in GAVE18 activity may be useful in the treatment of immune related diseases and disorders such as various inflammatory diseases and rheumatoid arthritis.

本発明を説明するための、本明細書および請求項で用いられる様々な用語および成句を以下に記載する：
本発明で用いられる用語「調節因子」は、ＧＡＶＥ１８活性を調節する成分（例えば、これらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。本発明の調節因子としては、ＧＡＶＥ１８のアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストが挙げられる。 Various terms and phrases used in the specification and claims to describe the invention are described below:
The term “modulator” as used herein refers to components that modulate GAVE18 activity, such as, but not limited to, ligands and candidate compounds. The modulators of the present invention include GAVE18 agonists, partial agonists, antagonists, or inverse agonists.

本発明で用いられる用語「アゴニスト」は、受容体に結合すると細胞内の反応を活性化するか、または、ＧＴＰの膜への結合を強める成分（例えば、これらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。   The term “agonist” as used herein refers to a component that activates an intracellular response upon binding to a receptor or enhances binding of GTP to a membrane (eg, but not limited to, a ligand and a candidate compound). ).

本発明で用いられる用語「部分アゴニスト」は、受容体に結合すると細胞内の反応を低い程度で活性化し、アゴニストとして作用するか、または、ＧＴＰの膜への結合をアゴニスト作用より低い程度で強める成分（例えば、これらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。   The term “partial agonist” as used in the present invention activates an intracellular response to a low degree when bound to a receptor and acts as an agonist or enhances the binding of GTP to the membrane to a lesser degree than the agonistic action. Refers to components such as, but not limited to, ligands and candidate compounds.

本発明で用いられる用語「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合する成分（例えば、これらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。しかしながら、アンタゴニストは、活性型受容体により生じた細胞内の反応を活性化しないため、アゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内の反応を阻害することができる。それに関連して、アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下における基準の細胞内の反応を減少させない。   The term “antagonist” as used herein refers to components that competitively bind to the receptor at the same site as the agonist (eg, but not limited to, ligands and candidate compounds). However, since the antagonist does not activate the intracellular response generated by the activated receptor, it can inhibit the intracellular response caused by the agonist or partial agonist. In that regard, antagonists do not reduce the baseline intracellular response in the absence of an agonist or partial agonist.

本明細書において用語「インバースアゴニスト」は、構成的に活性な受容体に結合し、基準の細胞内の反応を阻害する成分（例えば、これらに限定されないが、リガンドおよび候補化合物）を意味する。基準の反応は、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下、または、ＧＴＰの膜への結合の減少下で観察される活性の正常な基準レベル未満で、活性型受容体により生じる。   As used herein, the term “inverse agonist” refers to components that bind to a constitutively active receptor and inhibit a reference intracellular response, such as, but not limited to, ligands and candidate compounds. A baseline response is produced by the activated receptor in the absence of an agonist or partial agonist, or below the normal baseline level of activity observed in a decrease in GTP membrane binding.

本明細書において用語「候補化合物」は、スクリーニング技術で扱うことができる成分（例えば、これらに限定されないが、化学物質）を意味する。一実施形態において、この用語は、ＧＡＶＥ１８のアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストからなる群より選択される公知の化合物は含まれない。このような化合物は、受容体に特異的な内因性のリガンドの同定および／または候補化合物の受容体に対するスクリーニング（このようなスクリーニングは有効性を評価するための競合的な分析を必要とする）などからなる従来の創薬プロセスにより同定されたものである。   As used herein, the term “candidate compound” means a component that can be handled by a screening technique (for example, but not limited to, a chemical substance). In one embodiment, the term does not include known compounds selected from the group consisting of GAVE18 agonists, partial agonists, inverse agonists or antagonists. Such compounds are capable of identifying endogenous ligands specific for the receptor and / or screening for candidate compound receptors (such screens require competitive analysis to assess efficacy). It was identified by the conventional drug discovery process which consists of these.

本明細書において交換可能に用いられる用語「構成的に活性化した受容体」または「自律的に活性な受容体」は、リガンドの非存在下で活性化され得る受容体を意味する。このような構成的に活性な受容体は、内因性（例えばＧＡＶＥ１８）でもよいし、非内因性でもよい；すなわち、ＧＰＣＲは、野生型ＧＰＣＲの構成的な形態の突然変異体を産生するように組換え法により改変することができる（例えば、欧州特許第１０７１７０１号；ＷＯ００／２２１２９；ＷＯ００／２２１３１；および、米国特許第６,１５０,３９３号および第６,１４０,５０９号を参照し、参照により本発明に加入する）。   The terms “constitutively activated receptor” or “autonomously active receptor” used interchangeably herein refer to a receptor that can be activated in the absence of a ligand. Such a constitutively active receptor may be endogenous (eg, GAVE18) or non-endogenous; ie, the GPCR will produce a constitutive form of a mutant of the wild-type GPCR. Can be modified by recombinant methods (see, eg, European Patent No. 10717101; WO00 / 22129; WO00 / 22131; and US Pat. Nos. 6,150,393 and 6,140,509, see To the present invention).

本明細書において用語「構成的な受容体の活性化」は、受容体と、内因性のリガンドまたはそれと同等の化学物質とが結合すること以外の手段による、活性状態における受容体の安定化を意味する。   As used herein, the term “constitutive receptor activation” refers to the stabilization of a receptor in an active state by means other than the binding of the receptor to an endogenous ligand or equivalent chemical. means.

本明細書において用語「リガンド」は、もう一方の分子に結合する成分を意味し、このような成分は、例えば、これらに限定されないが、ホルモンまたは神経伝達物質であり、加えて、前記成分は、立体選択的に受容体に結合する。   As used herein, the term “ligand” means a component that binds to another molecule, such as, but not limited to, a hormone or neurotransmitter, in addition, the component , Stereoselectively binds to the receptor.

用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質および核酸分子について用いられる場合、共通すると考えられる構造ドメインを有し、本明細書において定義される十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を有する２またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味することとする。このようなファミリーメンバーは、天然に存在するものでもよいし、同じ種または異なる種のいずれかから得られたものでもよい。例えば、ファミリーは、第一のヒト起源タンパク質、および、マウス起源の該タンパク質の相同体、同様に、第二の、別個のヒト起源タンパク質、および、該タンパク質のマウス相同体を含み得る。ファミリーメンバーはまた、共通の機能的な特徴を有し得る。   The term “family”, when used with the proteins and nucleic acid molecules of the invention, has two or more structural domains that are considered common and that have sufficient amino acid or nucleotide sequence identity as defined herein. It shall mean a protein or nucleic acid molecule. Such family members may be naturally occurring or obtained from either the same or different species. For example, a family can include a first human origin protein and a homologue of the protein of mouse origin, as well as a second, distinct human origin protein and a mouse homologue of the protein. Family members may also have common functional characteristics.

本明細書において交換可能に用いられる「ＧＡＶＥ１８活性」、「ＧＡＶＥ１８の生物活性」および「ＧＡＶＥ１８の機能的な活性」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで測定された、ＧＡＶＥ１８タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によりＧＡＶＥ１８反応細胞で作用する活性を意味する。ＧＡＶＥ１８活性は、直接的な活性、例えば第二のタンパク質との結合や第二のタンパク質における酵素活性でもよいし、または、間接的な活性、例えばＧＡＶＥ１８タンパク質と第二のタンパク質との相互作用が介在する細胞のシグナル伝達活性でもよい。特定の実施形態において、ＧＡＶＥ１８活性は、これらに限定されないが、少なくとも１またはそれ以上の下記の活性：（ｉ）ＧＡＶＥ１８シグナル伝達経路においてタンパク質と相互作用する能力；（ｉｉ）ＧＡＶＥ１８リガンドと相互作用する能力；および、（ｉｉｉ）細胞内の標的タンパク質と相互作用する能力、を含む。   “GAVE18 activity”, “biological activity of GAVE18” and “functional activity of GAVE18” used interchangeably herein are GAVE18 protein, polypeptide or polypeptide measured in vivo or in vitro according to standard techniques. It means an activity that acts on a GAVE18-reactive cell by a nucleic acid molecule. The GAVE18 activity may be a direct activity, such as binding to a second protein or an enzymatic activity in the second protein, or an indirect activity, such as an interaction between the GAVE18 protein and the second protein. It may also be the signal transduction activity of the cells that do. In certain embodiments, GAVE18 activity includes, but is not limited to, at least one or more of the following activities: (i) ability to interact with a protein in the GAVE18 signaling pathway; (ii) interact with GAVE18 ligand. Ability; and (iii) ability to interact with the target protein in the cell.

その上、本発明に従って、当業界の技術の範囲内の通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、以下を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」
第二版（１９８９年），コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（本明細書においては「Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年」とする）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９４年）］。 Moreover, conventional molecular biology, microbiology, and recombinant DNA techniques within the skill of the art can be used in accordance with the present invention. Such techniques are explained fully in the literature. For example, see: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" by Sambrook, Fritsch and Maniatis
Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (referred to herein as “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames and S.H. J. et al. Higgins (1985)]; Transcribation And Translation [B. D. Hames and S.H. J. et al. Higgins (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press (1986)]; Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); M.M. Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols [Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994)].

それゆえに、以下の用語は、本発明で用いられる場合は下記の定義を有するものとする。   Therefore, the following terms shall have the following definitions when used in the present invention.

「ベクター」は、レプリコンであり、例えば、いくつか例を挙げれば、プラスミド、ファージまたはコスミドであり、これに他のＤＮＡセグメントを結合させて、結合させたセグメントが複製されるようにすることができる。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製可能なあらゆる遺伝学的成分（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。ベクターの特定の例は後述する。   A “vector” is a replicon, such as a plasmid, phage or cosmid, to name a few, to which other DNA segments can be ligated so that the ligated segment is replicated. it can. A “replicon” is any genetic component (eg, plasmid, chromosome, virus) that functions as an autonomous unit of DNA replication in vivo, ie, capable of replicating under its own control. Specific examples of vectors are described below.

「カセット」は、特異的な制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、対象のポリペプチドをコードしており、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳に適切なリーディングフレーム中にカセットが確実に挿入されるように設計される。   “Cassette” means a DNA segment that can be inserted into a vector at specific restriction sites. The DNA segment encodes the polypeptide of interest, and the cassette and restriction sites are designed to ensure that the cassette is inserted into a reading frame appropriate for transcription and translation.

このようなＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞は、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡにより「トランスフェクトされる」という。トランスフェクトされたＤＮＡが表現型の変化を引き起こした場合、細胞は、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡで「形質転換される」という。好ましくは、形質転換するＤＮＡは（共有結合で）染色体ＤＮＡに統合され、それにより細胞のゲノムが形成されるべきである。   A cell is said to be “transfected” by exogenous or heterologous DNA when such DNA is introduced into the cell. A cell is said to be “transformed” with exogenous or heterologous DNA when the transfected DNA causes a phenotypic change. Preferably, the transforming DNA should be integrated (covalently) into the chromosomal DNA, thereby forming the genome of the cell.

「異種」ＤＮＡは、細胞中または細胞の染色体部位に天然には存在しないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子である。   “Heterologous” DNA refers to DNA that does not naturally occur in a cell or in a chromosomal site of the cell. Preferably, the heterologous DNA is a foreign gene for the cell.

「相同組換え」は、染色体にベクターの外来ＤＮＡ配列を挿入することを意味する。特に、ベクターは、相同組換えに関して特異的な染色体部位を標的とする。特異的な相同組換えに関して、ベクターは、ベクターが染色体へ相補的に結合し組み込まれるように、十分に長い染色体配列に相同な領域を含み得る。相同な領域が長いほど、および、配列類似性が大きいほど、相同組換えの効率を高めることができる。   “Homologous recombination” means inserting a foreign DNA sequence of a vector into a chromosome. In particular, the vector targets a specific chromosomal site for homologous recombination. With respect to specific homologous recombination, the vector may contain a region that is sufficiently long to homologous to a chromosomal sequence so that the vector complementarily binds and integrates into the chromosome. The longer the homologous region and the greater the sequence similarity, the higher the efficiency of homologous recombination.

本発明単離された核酸分子
一つの観点において、本発明は、図５のＤＮＡ配列（配列番号１）、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体を含む単離された核酸分子を含む。 In one aspect of the present invention isolated nucleic acid molecule , the present invention includes an isolated DNA sequence of FIG. 5 (SEQ ID NO: 1), a variant thereof, a fragment thereof, or an analogue or derivative thereof. Contains nucleic acid molecules.

「核酸分子」は、一本鎖型または二本鎖型ヘリックスのいずれかの形態の、リボヌクレ
オシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル多量体、またはそれらのあらゆるホスホエステル類似体、例えばホスホロチオエートおよびチオエステルを意味する。二本鎖型ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語「核酸分子」、および特に「ＤＮＡ分子」または「ＲＮＡ分子」は、分子の一次および二次構造のみを意味しており、いかなる特定の三次形態に限定するものではない。従って、この用語は、特に、直鎖または環状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミド、および染色体で見出される二本鎖型ＤＮＡを含む。特定の二本鎖型ＤＮＡ分子の構造を考察する際、本明細書において、配列は、一般的な慣例に従って記載することができ、すなわち、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）にそって５’から３’への方向の配列のみが記載される。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的な操作で処理したＤＮＡ分子である。 A “nucleic acid molecule” is a ribonucleoside (adenosine, guanosine, uridine or cytidine; “RNA molecule”) or deoxyribonucleoside (deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxy) in either a single-stranded or double-stranded helix form. Thymidine, or deoxycytidine; “DNA molecule”) refers to phosphate ester multimers, or any phosphoester analogs thereof, such as phosphorothioates and thioesters. Double stranded DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA helices are possible. The term “nucleic acid molecule”, and in particular “DNA molecule” or “RNA molecule”, means only the primary and secondary structure of the molecule and is not limited to any particular tertiary form. Thus, this term includes double-stranded DNA found, inter alia, in linear or circular DNA molecules (eg, restriction fragments), plasmids, and chromosomes. In considering the structure of a particular double-stranded DNA molecule, the sequences herein can be described according to general conventions, i.e., the non-transcribed strand of DNA (i.e., the sequence homologous to mRNA). Only the sequences in the 5 ′ to 3 ′ direction are described along the chain. A “recombinant DNA molecule” is a DNA molecule that has been processed by molecular biological manipulation.

「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。特に、「単離された」核酸は、核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて、通常ＧＡＶＥ１８をコードする核酸の末端に位置する（すなわち核酸の５’および３’末端に位置する）配列（好ましくはタンパク質をコードする配列）を含まない。様々な実施形態では、単離されたＧＡＶＥ１８核酸分子は、核酸が誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸分子の側にあるヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満で含み得る。その上、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術で生産された場合、実質的に他の細胞物質または培地を含まず、または、化学合成されば場合、実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない。   An “isolated” nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid. In particular, an “isolated” nucleic acid is a sequence (preferably located at the end of the nucleic acid encoding GAVE18 (ie, located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the nucleic acid) in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid is derived. Does not contain a protein-encoding sequence. In various embodiments, an isolated GAVE18 nucleic acid molecule has a nucleotide sequence that naturally flank the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the cell from which the nucleic acid is derived, of about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb,. May contain less than 5 kb or 0.1 kb. In addition, an “isolated” nucleic acid molecule, eg, a cDNA molecule, is substantially free of other cellular material or media when produced recombinantly, or substantially when chemically synthesized. Contains no chemical precursors or other chemicals.

本発明の核酸分子、例えば、配列番号1の核酸分子、または、そのヌクレオチド配列のあらゆる部分の断片もしくは相補体、または、それらの類似体もしくは誘導体を、標準的な分子生物学技術や本発明で提供される配列情報を用いて単離することができる。配列番号１の核酸配列の全部または部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いてＧＡＶＥ１８核酸分子を単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等で説明される）。   The nucleic acid molecule of the present invention, for example, the nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 1, or a fragment or complement of any part of its nucleotide sequence, or an analog or derivative thereof, can be obtained using standard molecular biology techniques or the present invention. It can be isolated using the sequence information provided. By using all or part of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a hybridization probe, GAVE18 nucleic acid molecules can be isolated using standard hybridization and cloning techniques (eg, as described in Sambrook et al.). .

本発明の核酸分子は、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。このようなプライマーは、配列番号１に記載の情報、および慣例的な実験技術を用いて容易に作製することができる。このようにして増幅した核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。その上、ＧＡＶＥ１８ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造することができる。   The nucleic acid molecules of the present invention can be amplified according to standard PCR amplification techniques using cDNA, mRNA or genomic DNA as a template and appropriate oligonucleotide primers. Such a primer can be easily prepared by using the information described in SEQ ID NO: 1 and a conventional experimental technique. The nucleic acid thus amplified can be cloned into an appropriate vector and characterized by DNA sequence analysis. Moreover, oligonucleotides corresponding to the GAVE18 nucleotide sequence can be produced by standard synthetic techniques, for example using an automated DNA synthesizer.

ＧＡＶＥ１８のＤＮＡにハイブリダイズ可能な単離された核酸分子
本発明は、ＧＡＶＥ１８のＤＮＡにハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＧＡＶＥ１８のＤＮＡに相補的なハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズ可能な単離された核酸分子、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその両方にハイブリダイズ可能な単離された核酸分子をさらに含む。特に、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1のＤＮＡ配列を含む核酸分子、または、配列番号1のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子に相補的なプローブにハイブリダイズ可能な単離された核酸分子を含む。 The present invention relates to an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing to GAVE18 DNA, a hybridized complementary to GAVE18 DNA under stringent hybridization conditions. Further included is an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing to the probe, or an isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing to both under stringent hybridization conditions. In particular, the present invention hybridizes under stringent hybridization conditions to a nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or a probe complementary to an isolated nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. Including possible isolated nucleic acid molecules.

核酸分子が、他の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡに「ハイブリダイズ可能である」とは、核酸分子の一本鎖型が温度および溶液のイオン強度が適切な条件下で（上記のＳｕｍｂｒｏｏｋ等を参照）他の核酸分子にアニールすることができる場合をいう。温度およびイオン強度条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決定される。相同核酸の予備的スクリーニングには、Ｔ_mが５５℃に相当する低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド非含有；または、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）である。より高いＴ_mに相当する中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、４０％ホルムアミドを５×または６×ＳＳＣに含む条件である。最も高いＴ_mに相当する高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＳＣである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが存在してもよい。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸の長さや相補性の度合い、当業界周知の変数によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなれば、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴ_m値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴ_mに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に減少する。１００個を超えるヌクレオチド長のハイブリッドに関して、Ｔ_mを計算する方程式が導かれている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，９．５０〜０．５１を参照）。より短い核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションに関しては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，１１．７〜１１．８を参照）。ハイブリダイズ可能な核酸分子の最小限の長さは、少なくとも約２０個のヌクレオチド；特定には少なくとも約３０個のヌクレオチド；より特定には少なくとも約４０個のヌクレオチド、さらにより特定には約５０個のヌクレオチド、さらにより特定には少なくとも約６０個のヌクレオチドである。本発明の特定の実施形態において、本発明のハイブリダイズ可能な核酸分子は、少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００または１１００個のヌクレオチド長さを有し、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはコーディング配列、それらの相補体またはそれらの断片を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。 A nucleic acid molecule is “hybridizable” to other nucleic acid molecules, eg, cDNA, genomic DNA, or RNA, when the single-stranded form of the nucleic acid molecule is under conditions where the temperature and ionic strength of the solution are appropriate (see above). (See, eg, Sumbrook et al.) Where it can anneal to other nucleic acid molecules. The temperature and ionic strength conditions determine the “stringency” of hybridization. Preliminary screening for homologous nucleic acids can use low stringency hybridization conditions with a T _m equivalent to 55 ° C., eg 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.25% milk, and formamide Not contained; or 30% formamide, 5 × SSC, 0.5% SDS). Moderate stringency hybridization conditions corresponding to higher T _m are, for example, those containing 40% formamide in 5 × or 6 × SSC. High stringency hybridization conditions corresponding to the highest T _m are, for example, 50% formamide, 5 × or 6 × SSC. Hybridization requires that the two nucleic acids contain complementary sequences, but there may be mismatches between bases depending on the stringency of the hybridization. The appropriate stringency for hybridizing nucleic acids depends on the length of the nucleic acids, the degree of complementation, and variables well known in the art. The greater the degree of similarity or homology between two nucleotide sequences, the greater the value of T _m for hybrids of nucleic acids having those sequences. The relative stability of nucleic acid hybridization (corresponding to a higher T _m ) decreases in the order of RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. For hybrids with a length of more than 100 nucleotides, an equation has been derived to calculate _Tm (see Sambrook et al., 9.50-0.51 above). For hybridization with shorter nucleic acids (ie oligonucleotides), the position of the mismatch becomes more important and the length of the oligonucleotide determines its specificity (see Sambrook et al., 11.7-11.8 above). ). The minimum length of a hybridizable nucleic acid molecule is at least about 20 nucleotides; specifically at least about 30 nucleotides; more particularly at least about 40 nucleotides, and even more particularly about 50. Of nucleotides, and more particularly at least about 60 nucleotides. In certain embodiments of the invention, the hybridizable nucleic acid molecule of the invention has at least 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000. Alternatively, it hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule having a length of 1100 nucleotides and comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, preferably the coding sequence, their complement or a fragment thereof.

本発明で用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、少なくとも少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％またはそれ以上互いに相補的なヌクレオチド配列が、一般的にハイブリダイズし続けるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を説明することとする。このようなストリンジェントな条件は当業者既知であり、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８９年）、６．３．１〜６．３．６）で見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄、である。好ましくは、配列番号１の配列またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本発明で用いられる「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する（例えば天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。当業者であれば理解できることであるが、条件は、配列特異的な変数（例えば、長さ、Ｇ−Ｃリッチ度など）を考慮して改変可能である。 As used herein, the term “hybridizes under stringent conditions” generally refers to nucleotide sequences that are at least 55%, 60%, 65%, 70%, preferably 75% or more complementary to each other. The hybridization and washing conditions that will continue to hybridize will be described. Such stringent conditions are known to those skilled in the art and are described in "Current Protocols in Molecular."
Biology "(John Wiley and Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6). A preferred non-limiting example of stringent hybridization conditions is hybridization in 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C., followed by 0.2 × SSC at 50-65 ° C. One or more washes in 0.1% SDS. Preferably, an isolated nucleic acid molecule of the invention that hybridizes under stringent conditions to the sequence of SEQ ID NO: 1 or its complement corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule. As used herein, a “naturally-occurring” nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule having a nucleotide sequence that occurs in nature (eg, encodes a natural protein). As will be appreciated by those skilled in the art, conditions can be modified in view of sequence specific variables (eg, length, GC richness, etc.).

本発明は、類似の特性を有するＧＡＶＥ１８様分子を診断するためのＧＡＶＥ１８の核
酸断片を含むものとする。診断用の断片は、ＧＡＶＥ１８遺伝子のあらゆる部分、例えばフランキング配列から得ることができる。この断片は、既知の方法を実施するライブラリーのプローブとして用いることができる。 The present invention is intended to include GAVE18 nucleic acid fragments for diagnosing GAVE18-like molecules having similar properties. Diagnostic fragments can be obtained from any part of the GAVE18 gene, such as flanking sequences. This fragment can be used as a library probe for performing known methods.

その上、本発明の核酸分子は、ＧＡＶＥ１８をコードする核酸配列の部分のみを含んでもよく、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることができる断片、または、ＧＡＶＥ１８の生物学的に活性な部分をコードする断片である。例えば、このような断片は、これらに限定されないが、配列番号２に記載のアミノ酸残基約１〜約１４をコードする領域を含み得る。ヒトＧＡＶＥ１８遺伝子クローニングから決定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型で、例えば他の組織からＧＡＶＥ１８相同体を同定および／またはクローニングすること、同様に、他の哺乳動物からのＧＡＶＥ１８相同体を同定および／またはクローニングするためのプローブおよびプライマーを作製することができる。一般的に、該プローブ／プライマーは、十分に精製されたオリゴヌクレオチドで構成される。一般的に、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１のセンスもしくはアンチセンス配列または配列番号１の天然に存在する突然変異体の、少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ヒトＧＡＶＥ１８ヌクレオチド配列に基づくプローブは、類似または同一なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するのに用いることができる。   Moreover, the nucleic acid molecules of the invention may contain only a portion of the nucleic acid sequence encoding GAVE18, eg, a fragment that can be used as a probe or primer, or a biologically active portion of GAVE18. It is a fragment. For example, such a fragment can include, but is not limited to, a region encoding from about 1 to about 14 amino acid residues set forth in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence determined from human GAVE18 gene cloning identifies and / or clones GAVE18 homologues in other cell types, eg, from other tissues, as well as GAVE18 homologues from other mammals and Probes and primers for cloning can be generated. In general, the probe / primer is composed of fully purified oligonucleotides. Generally, the oligonucleotide is at least about 12, preferably about 25, more preferably about 50, 75, 100 of a sense or antisense sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring mutant of SEQ ID NO: 1. , 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, or 400 contiguous nucleotides and regions of nucleotide sequence that hybridize under stringent conditions. Probes based on the human GAVE18 nucleotide sequence can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding similar or identical proteins.

本発明で用いられる用語の、本発明の単離された核酸分子の「断片」または「部分」は、少なくとも１２、特に約２５、より特定には約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドを含む。従って、本発明の単離された核酸分子の「断片」は、わずか１または２個のヌクレオチドではない。   As used herein, the term “fragment” or “portion” of an isolated nucleic acid molecule of the present invention means at least 12, in particular about 25, more particularly about 50, 75, 100, 125, 150, 175. 200, 250, 300, 350 or 400 consecutive nucleotides. Thus, a “fragment” of an isolated nucleic acid molecule of the present invention is no more than 1 or 2 nucleotides.

同様に、本発明のポリペプチドの「断片」または「部分」は、少なくとも９個の連続したアミノ酸残基を含む。本発明のポリペプチドの断片の特定の例は、ＧＡＶＥ１８抗体またはそれらの断片が結合するエピトープを含む。   Similarly, a “fragment” or “portion” of a polypeptide of the invention comprises at least 9 consecutive amino acid residues. Specific examples of fragments of the polypeptides of the invention include the epitope to which the GAVE18 antibody or fragment thereof binds.

「ＧＡＶＥ１８の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、ＧＡＶＥ１８生物活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離すること、ＧＡＶＥ１８タンパク質のコードされた部分を（例えばインビトロでの組換え発現により）発現させること、および、ＧＡＶＥ１８のコードされた部分の活性を評価することにより、製造することができる。本発明は、遺伝子コードの縮重のために配列番号１のヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列でコードされたのと同じＧＡＶＥ１８タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。   A nucleic acid fragment encoding a “biologically active portion of GAVE18” can be obtained by isolating the portion of SEQ ID NO: 1 that encodes a polypeptide having GAVE18 biological activity, By expression) and by assessing the activity of the encoded portion of GAVE18. The invention further includes a nucleic acid molecule that differs from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 due to the degeneracy of the genetic code, but encodes the same GAVE18 protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.

相同核酸分子
本発明は、ＧＡＶＥ１８のＤＮＡ分子に相同な単離された核酸分子、例えば、配列番号１のＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子に相同な単離された核酸分子をさらに含む。２つのＤＮＡ配列において、所定のＤＮＡ配列長に対してヌクレオチドが、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）適合する場合、それらは「実質的に相同」しているか、または「実質的に類似」している。実質的に相同な配列は、デフォルトパラメーターを用いる配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより、または、例えば特定のシステムのために定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業界の技術の範囲内である。例えば、上記のＭａｎｉａｔｉｓ等；上記の「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」第Ｉ巻および第ＩＩ巻；上記の「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」を参照。その上、ヒトＧＡＶＥ１８の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する他の種のからのＧＡＶＥ１８タンパク質をコードする核酸分子（ＧＡＶＥ１８相同体）も、本発明の範囲内であるとする。 Homologous Nucleic Acid Molecules The present invention further includes an isolated nucleic acid molecule that is homologous to the GAVE18 DNA molecule, eg, an isolated nucleic acid molecule that is homologous to the isolated nucleic acid molecule having the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. If two nucleotide sequences match at least about 50% (preferably at least about 75%, most preferably at least about 90 or 95%) for a given DNA sequence length, they are “substantially homologous”. Or “substantially similar”. Substantially homologous sequences can be determined by comparing sequences using standard software available in a sequence data bank using default parameters, or under stringent conditions, eg, defined for a particular system. Can be identified by performing Southern hybridization experiments. The definition of suitable hybridization conditions is within the skill of the art. See, for example, Maniatis et al., Above; “DNA Cloning”, Volumes I and II; Nucleic Acid Hybridization, above. Moreover, nucleic acid molecules (GAVE18 homologues) encoding GAVE18 proteins from other species having nucleotide sequences different from that of human GAVE18 are also within the scope of the present invention.

本発明の単離された核酸分子の変異体
本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子の変異体をさらに含む。このような変異体は、縮重変異体、対立遺伝子変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。 Variants of isolated nucleic acid molecules of the invention The invention further includes variants of the isolated nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1. Such variants can be degenerate variants, allelic variants, or combinations thereof.

本発明のＧＡＶＥ１８のｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、本発明で開示されたヒトＧＡＶＥ１８核酸との同一性に基づき、ヒトｃＤＮＡまたはそれらの部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的なハイブリダイゼーション技術により、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で単離することができる。   The nucleic acid molecules corresponding to the natural allelic variants and homologues of the GAVE18 cDNA of the present invention are based on the identity of the human GAVE18 nucleic acid disclosed in the present invention, and human cDNA or a part thereof as a hybridization probe. It can be used to isolate under stringent hybridization conditions by standard hybridization techniques.

本発明において用語「〜に対応する」とは、類似配列または相同配列に言及する場合に用いられ、それらの厳密な位置は、類似性または相同性が測定された分子と同一であってもよいし、異なっていてもよい。従って、用語「〜に対応する」は、配列類似性を意味するものであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを意味するものではない。   In the present invention, the term “corresponds to” is used when referring to a similar or homologous sequence, and their exact position may be the same as the molecule whose similarity or homology was measured. And may be different. Thus, the term “corresponds to” means sequence similarity and not the numbering of amino acid residues or nucleotide bases.

その上、遺伝子コードにおいてコドンが縮重される性質により、本発明のＧＡＶＥ１８タンパク質は、多数の単離された核酸分子によりコードされ得る。「短縮される特性」は、遺伝子コードに従って特定のアミノ酸を明示するために様々な３文字コドンが用いられることを意味する。   Moreover, due to the degeneracy of codons in the genetic code, the GAVE18 protein of the present invention can be encoded by a number of isolated nucleic acid molecules. “Abbreviated property” means that various three letter codons are used to specify a particular amino acid according to the genetic code.

以下のコドンが、特定のアミノ酸をそれぞれコードするのに交換可能に用いることができることは当業界周知である：
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ、
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ、
イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ、
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ、
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＣまたはＧＵＡまたはＧＵＧ、
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ、
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ、
スレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ、
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ、
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ、
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ、
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ、
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ、
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ、
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ、
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ、
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ、
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ、
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ、
終止コドン ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）。 It is well known in the art that the following codons can be used interchangeably to encode each specific amino acid:
Phenylalanine (Phe or F) UUU or UUC,
Leucine (Leu or L) UUA or UUG or CUU or CUC or CUA or CUG,
Isoleucine (Ile or I) AUU or AUC or AUA,
Methionine (Met or M) AUG,
Valine (Val or V) GUU or GUC or GUA or GUG,
Serine (Ser or S) UCU or UCC or UCA or UCG or AGU or AGC,
Proline (Pro or P) CCU or CCC or CCA or CCG,
Threonine (Thr or T) ACU or ACC or ACA or ACG,
Alanine (Ala or A) GCU or GCG or GCA or GCG,
Tyrosine (Tyr or Y) UAU or UAC
Histidine (His or H) CAU or CAC,
Glutamine (Gln or Q) CAA or CAG,
Asparagine (Asn or N) AAU or AAC,
Lysine (Lys or K) AAA or AAG,
Aspartic acid (Asp or D) GAU or GAC,
Glutamic acid (Glu or E) GAA or GAG,
Cysteine (Cys or C) UGU or UGC,
Arginine (Arg or R) CGU or CGC or CGA or CGG or AGA or AGG,
Glycine (Gly or G) GGU or GGC or GGA or GGG,
Tryptophan (Trp or W) UGG,
Stop codon UAA (ocher) or UAG (amber) or UGA (opal).

当然ながら、上述したコドンはＲＮＡ配列に対するものである。ＤＮＡに対応するコドンはＵをＴで置換すればよい。   Of course, the codons described above are for RNA sequences. The codon corresponding to the DNA may be substituted with T for U.

配列番号１で示されるヒトＧＡＶＥ１８ヌクレオチド配列に加えて、ＧＡＶＥ１８のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多型が、集団（例えばヒト集団）中に存在してもよいことは、当業者であれば理解可能である。このようなＧＡＶＥ１８遺伝子における遺伝学的多型は、天然の対立遺伝子変異により、集団中の個体に存在し得る。対立遺伝子とは、所定の遺伝子座に二者択一的に起こる遺伝子群の一つである。本発明で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＧＡＶＥ１８タンパク質、好ましくは哺乳動物ＧＡＶＥ１８タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。本発明で用いられる、成句「対立遺伝子変異体」は、ＧＡＶＥ１８遺伝子座で発生するヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを意味する。二者択一的な対立遺伝子は、多数の異なる個体の対象の遺伝子を配列解析することによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて多種多様な個体で同じ遺伝子座を同定することにより容易に実行することができる。このようなヌクレオチド変異のいずれかおよび全部、ならびに、その結果生じた、天然の対立遺伝子変異により生じたものでありＧＡＶＥ１８の機能活性を変化させないＧＡＶＥ１８のアミノ酸多型または変異も、本発明の範囲の範囲内とする。   Those skilled in the art will understand that in addition to the human GAVE18 nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, DNA sequence polymorphisms that alter the amino acid sequence of GAVE18 may exist in a population (eg, the human population). It is. Such genetic polymorphisms in the GAVE18 gene may exist in individuals in the population due to natural allelic variation. An allele is one of a group of genes that occur alternatively at a given locus. The terms “gene” and “recombinant gene” as used in the present invention mean a nucleic acid molecule comprising an open reading frame encoding a GAVE18 protein, preferably a mammalian GAVE18 protein. As used herein, the phrase “allelic variant” means a nucleotide sequence that occurs at the GAVE18 locus, or a polypeptide encoded by the nucleotide sequence. Alternative alleles can be identified by sequencing genes of interest in a number of different individuals. This can be easily performed by identifying the same locus in a wide variety of individuals using hybridization probes. Any and all such nucleotide mutations, and the resulting amino acid polymorphisms or mutations of GAVE18 that are caused by natural allelic variation and do not alter the functional activity of GAVE18 are also within the scope of the present invention. Within range.

その上、本発明の単離された核酸分子の変異体は、当業界で一般的な技術のいずれかにより、慣例的な実験技術（例えば部位特異的変異誘発）を用いて容易に作製することができる。   Moreover, variants of the isolated nucleic acid molecules of the present invention can be readily generated using routine laboratory techniques (eg, site-directed mutagenesis) by any of the techniques common in the art. Can do.

アンチセンスヌクレオチド配列
本発明はまた、アンチセンス核酸分子、すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な分子、例えば、二本鎖型ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的な分子、または、ｍＲＮＡ配列に相補的な分子を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、ＧＡＶＥ１８コーディング鎖全体またはそれらの部分のみに相補的であるものが可能であり、例えば、タンパク質コーディング領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または部分に相補的なものが可能である。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ１８をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対してアンチセンスであるものが可能である。非コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コーディング領域の端に存在しておりアミノ酸には翻訳されない５’および３’配列である。 Antisense Nucleotide Sequences The present invention also relates to antisense nucleic acid molecules, ie, molecules complementary to sense nucleic acids encoding proteins, such as molecules complementary to the coding strand of double stranded cDNA molecules, or mRNA sequences. Includes complementary molecules. Thus, an antisense nucleic acid can hydrogen bond to a sense nucleic acid. An antisense nucleic acid can be complementary to the entire GAVE18 coding strand or only to portions thereof, for example, can be complementary to all or a portion of a protein coding region (or open reading frame). An antisense nucleic acid molecule can be one that is antisense to a non-coding region of the coding strand of a nucleotide sequence encoding GAVE18. Non-coding regions ("5 'and 3' untranslated regions") are 5 'and 3' sequences that are at the end of the coding region and are not translated into amino acids.

本発明で開示されたＧＡＶＥ１８をコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１）を考慮すると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン−クリック型塩基対のルールに基づき設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的なものが可能であるが、より好ましくは、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り巻く領域に相補的であるものでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチドの長さを有するものが可能である。本発明のアンチセンス核酸は、当業界既知の方法を用いた化学合成および酵素によるライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または、分子の生物学的な安定性またはアンチセンスおよびセンス核酸間で形成される二本鎖の物理的な安定性を増加させるように設計された様々な化学修飾されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ホスホネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。   In view of the coding strand sequence (for example, SEQ ID NO: 1) encoding GAVE18 disclosed in the present invention, the antisense nucleic acid of the present invention can be designed based on the rules of Watson-Crick base pairing. The antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of GAVE18 mRNA, but more preferably is an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of GAVE18 mRNA. is there. For example, the antisense oligonucleotide may be complementary to the region surrounding the translation start site of GAVE18 mRNA. Antisense oligonucleotides can be, for example, those having a length of about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides. The antisense nucleic acid of the present invention can be constructed using chemical synthesis and enzymatic ligation reactions using methods known in the art. For example, an antisense nucleic acid (eg, an antisense oligonucleotide) is a naturally occurring nucleotide, or the biological stability of a molecule or the physical stability of a duplex formed between an antisense and a sense nucleic acid. Can be chemically synthesized using a variety of chemically modified nucleotides designed to increase, for example, phosphorothioate derivatives, phosphonate derivatives and acridine substituted nucleotides can be used.

アンチセンス核酸を作製するのに用いることができる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ⁶−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ⁶−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ⁶−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および、２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、対象の標的核酸に対してアンチセンス方向となる）発現ベクターを用いて生物学的に作製することができる。 Examples of modified nucleotides that can be used to make antisense nucleic acids include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (Carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, β-D-galactosylkeosine, inosine, N ⁶ -isopentenyl adenine, 1 - methylguanine, 1-methyl inosine, 2,2-dimethyl guanine, 2-methyl-adenine, 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N ⁶ - adenine, 7-methylguanine, 5-methylamino Methylurasi , 5-methoxy aminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosyl Rukeo Shin (queosine), 5- methoxy-carboxymethyl uracil, 5-methoxy uracil, 2-methylthio--N ⁶ - isopentenyladenine, uracil-5-oxy Acetic acid, wivetoxosin, pseudouracil, queosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5 Examples include oxyacetic acid, 5-methyl-2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, and 2,6-diaminopurine. Alternatively, antisense nucleic acids are biologically expressed using expression vectors in which the nucleic acid is subcloned in the antisense direction (ie, RNA transcribed from the inserted nucleic acid is in the antisense direction with respect to the target nucleic acid of interest). Can be produced.

本発明のアンチセンス核酸分子は、一般的には、タンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合し、それにより例えば転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質発現を阻害するように、被検体に投与するか、またはインサイチュで生成させることができる。ハイブリダイゼーションは、安定した二本鎖を形成するような通常のヌクレオチド相補性により、または、例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝における特異的な相互作用、またはＧＡＶＥ１８の調節領域に対する特異的な相互作用によりなされ得る。   The antisense nucleic acid molecules of the present invention generally inhibit protein expression by hybridizing or binding to mRNA and / or genomic DNA of the cell encoding the protein, thereby inhibiting, for example, transcription and / or translation. As such, it can be administered to a subject or generated in situ. Hybridization can be achieved by normal nucleotide complementarity to form a stable duplex, or in the case of antisense nucleic acid molecules that bind to a DNA duplex, for example, specific interactions in the main groove of a double helix. Can be made by action or specific interaction to the regulatory region of GAVE18.

本発明のアンチセンス核酸分子投与経路の例としては、組織部位への直接注入がある。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変して、全身投与することもできる。例えば、全身投与に関しては、アンチセンス分子は、分子が選択された細胞表面で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ、例えば、アンチセンス核酸分子に細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体を結合させることにより改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本発明で説明されたベクターを用いて細胞に送達することもできる。十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が好ましい。   An example of a route of administration of antisense nucleic acid molecules of the present invention is direct injection into a tissue site. Alternatively, antisense nucleic acid molecules can be modified to target selected cells and administered systemically. For example, for systemic administration, an antisense molecule can be modified so that the molecule specifically binds to a receptor or antigen expressed on the selected cell surface, eg, the antisense nucleic acid molecule is attached to the cell surface. Modifications can be made by binding peptides or antibodies that bind to receptors or antigens. Antisense nucleic acid molecules can also be delivered to cells using the vectors described in the present invention. In order to achieve sufficient intracellular concentrations of antisense molecules, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is placed under the control of a strong pol II or pol III promoter are preferred.

本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子が可能である。α−アノマー核酸分子は、相補ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（この場合、その鎖は互いに平行に並ぶ）（Ｇａｕｌｔｉｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７年）１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、メチルリボヌクレオチドを含んでもよく（Ｉｎｏｕｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８７年）１５：６１３１〜６１４８）、または、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体を含んでもよい（Ｉｎｏｕｅ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９８７年）２１５：３２７〜３３０）。   The antisense nucleic acid molecule of the present invention can be an α-anomeric nucleic acid molecule. The α-anomeric nucleic acid molecule forms a specific double-stranded hybrid with the complementary RNA (in which case the strands are parallel to each other) (Gaulter et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6625-6641). Antisense nucleic acid molecules may also include methyl ribonucleotides (Inoue et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6131-6148), or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue et al., FEBS Lett (1987) 215: 327-330).

リボザイム
本発明はまた、リボザイムを含む。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡ分子であり、これは、リボザイムにハイブリダイズする一本鎖型核酸（例えばｍＲＮＡ）を分解することができるリボヌクレアーゼ活性を有する。従って、リボザイム、例えばハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）３３４：５８５〜５９１で説明された）を、ＧＡＶＥ８ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂させるのに用いることができ、それにより、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＧＡＶＥ８をコードする核酸に特異性を有するリボザイムを、本発明で開示されたＧＡＶＥ８のｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に基づき設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができ、ここで、活性部位のヌクレオチド配列は、ＧＡＶＥ８をコードするｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に相補的である。例えばＣｅｃｈ等の米国特許第４,９８７,０７１号；および、Ｃｅｃｈ等の米国特許第５,１１６,７４２号を参照。あるいは、ＧＡＶＥ８のｍＲＮＡを、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択するのに用いることができる。例えばＢａｒｔｅｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）２６１：１４１１〜１４１８を参照。 Ribozymes The present invention also includes ribozymes. Ribozymes are catalytic RNA molecules having ribonuclease activity, which have ribonuclease activity that can degrade single-stranded nucleic acids (eg, mRNA) that hybridize to the ribozyme. Thus, ribozymes such as hammerhead ribozymes (described in Haselhoff et al., Nature (1988) 334: 585-591) can be used to catalytically cleave GAVE8 mRNA transcripts, thereby Translation of GAVE8 mRNA can be inhibited. A ribozyme having specificity for a nucleic acid encoding GAVE8 can be designed based on the nucleotide sequence (eg, SEQ ID NO: 1) of GAVE8 cDNA disclosed in the present invention. For example, a derivative of Tetrahymena L-19IVS RNA can be constructed, where the nucleotide sequence of the active site is complementary to the nucleotide sequence that is cleaved in the mRNA encoding GAVE8. See, for example, Cech et al. US Pat. No. 4,987,071; and Cech et al. US Pat. No. 5,116,742. Alternatively, GAVE8 mRNA can be used to select catalytic RNAs with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules. See, for example, Bartel et al., Science (1993) 261: 1411-1418.

本発明の三重らせん核酸分子およびペプチド核酸
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を含む。例えば、ＧＡＶＥ８の調節領域（例えばＧＡＶＥ８プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的にすることによりＧＡＶＥ８遺伝子発現を阻害し、標的細胞におけるＧＡＶＥ８遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することができる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ（１９９１年）６（６）：５６９；Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２年）６６０：２７；および、Ｍａｈｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ（１９９２年）１４（１２）：８０７を参照。 Triple Helix Nucleic Acid Molecules and Peptide Nucleic Acids of the Invention The present invention also includes nucleic acid molecules that form triple helix structures. For example, inhibition of GAVE8 gene expression by targeting a nucleotide sequence complementary to the regulatory region of GAVE8 (eg, GAVE8 promoter and / or enhancer), forming a triple helix structure that prevents transcription of the GAVE8 gene in target cells Can do. In general, Helene, Anticancer Drug Dis (1991) 6 (6): 569; Helene, Ann NY Acad Sci (1992) 660: 27; and Maher, Bioassays (1992) 14 (12): 807 See

特定の実施形態において、本発明の核酸分子を、塩基成分、糖成分、または、リン酸主鎖において改変して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸主鎖を改変して、ペプチド核酸を生産することができる（Ｈｙｒｕｐ等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６年）４：５を参照）。本発明で用いられる用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸ミミックスを意味し、例えばデオキシリボースリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖で置き換えられ、４種の天然核酸塩基のみが保持されたＤＮＡミミックスを意味する。ＰＮＡの中性の主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡと特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが示されている。標準的な固相ペプチド合成プロトコール（上述したＨｙｒｕｐ等（１９９６年）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６年）９３：１４６７０で説明された）を用いて、ＰＮＡオリゴマーの合成を行うことができる。 In certain embodiments, the nucleic acid molecules of the invention can be modified in the base component, sugar component, or phosphate backbone to improve, for example, molecular stability, hybridization, or solubility. For example, peptide nucleic acids can be produced by modifying the deoxyribose phosphate backbone of nucleic acids (Hyrup et al., Bioorganic & Medicinal
Chemistry (1996) 4: 5). The term “peptide nucleic acid” or “PNA” as used in the present invention means a nucleic acid mimix, for example, a DNA in which the deoxyribose phosphate backbone is replaced with a pseudopeptide backbone and only four natural nucleobases are retained. It means mimix. The neutral backbone of PNA has been shown to be capable of specific hybridization with DNA and RNA under conditions of low ionic strength. Synthesis of PNA oligomers using a standard solid phase peptide synthesis protocol (explained in Hyrup et al. (1996), described above; Perry-O'Keefe et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93: 14670). It can be performed.

ＧＡＶＥ８のＰＮＡを、治療および診断用途に用いることができる。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳の停止の誘導または複製の阻害による配列特異的な遺伝子発現調節のためのアンチセンスまたはアンチジーン剤として用いることができる。ＧＡＶＥ８のＰＮＡはまた、例えばＰＣＲクランピングに向けられたＰＮＡによる遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼ（上述したＨｙｒｕｐ等（１９９６年））との組み合わせで用いる場合は、人工制限酵素として、または、ＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（上述したＨｙｒｕｐ等（１９９６年）；上述したＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等（１９９６年））、用いることができる。   GAVE8 PNA can be used for therapeutic and diagnostic applications. For example, PNA can be used as an antisense or anti-gene agent for sequence-specific gene expression regulation, for example by inducing transcription or translational arrest or inhibiting replication. GAVE8 PNAs are also used in combination with other enzymes, eg S1 nuclease (Hyrup et al. (1996) mentioned above), for example in the analysis of single base pair mutations in genes by PNA directed to PCR clamping Can be used as an artificial restriction enzyme or as a probe or primer for DNA sequence and hybridization (Hyrup et al. (1996) mentioned above; Perry-O'Keefe et al. (1996) mentioned above).

他の実施形態において、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに付着させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、または、リポソームまたは当業界既知のその他のドラッグデリバリー技術の使用により、ＧＡＶＥ８のＰＮＡを改変し、例えばそれらの安定性、特異性または細胞の取り込みを強化することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述したＨｙｒｕｐ等（１９９６年），Ｆｉｎｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９６年）２４（１７）：３３５７〜６３，Ｍａｇ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８９年）１７：５９７３；および、Ｐｅｔｅｒｓｅｒ等，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ（１９７５年）５：１１１９で説明されたように行うことができる。   In other embodiments, the GAVE8 PNA is attached by attaching lipophilic or other helper groups to the PNA, by forming a PNA-DNA chimera, or by using liposomes or other drug delivery techniques known in the art. Modifications can be made, for example, to enhance their stability, specificity or cellular uptake. PNA-DNA chimeras were synthesized as described above in Hyrup et al. (1996), Finn et al., Nucleic Acids Res (1996) 24 (17): 3357-63, Mag et al., Nucleic Acids Res (1989) 17: 5973; And as described in Peterser et al., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5: 1119.

ＧＡＶＥ１８タンパク質
その上、本発明は、図６のアミノ酸配列（配列番号２）、それらの変異体、それらの断片、または、それらの類似体もしくは誘導体を含む単離されたポリペプチドを含む。 In addition, the present invention includes an isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of FIG. 6 (SEQ ID NO: 2), variants, fragments thereof, or analogs or derivatives thereof.

配列番号２の配列とは異なる配列を有するＧＡＶＥ１８タンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば変異体）は、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように、１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号１のヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。   An isolated nucleic acid molecule (eg, a variant) encoding a GAVE18 protein having a sequence different from that of SEQ ID NO: 2 is introduced into the protein encoded by one or more amino acid substitutions, additions or deletions As such, it can be made by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

特定の実施形態において、突然変異ＧＡＶＥ１８タンパク質は、（１）タンパク質を形成する能力：ＧＡＶＥ１８シグナル伝達経路におけるタンパク質とタンパク質との相互作用；（２）ＧＡＶＥ１８リガンドと結合する能力；または、（３）細胞内の標的タンパク質に結合する能力に関して分析することができる。さらに他の実施形態において、突然変異ＧＡＶＥ１８は、細胞増殖または細胞分化を調節する能力に関して分析することができる。   In certain embodiments, the mutant GAVE18 protein has (1) the ability to form a protein: protein-protein interaction in the GAVE18 signaling pathway; (2) the ability to bind a GAVE18 ligand; or (3) a cell. Analysis for the ability to bind to the target protein within. In still other embodiments, the mutant GAVE18 can be analyzed for the ability to modulate cell proliferation or cell differentiation.

野生型ＧＡＶＥ１８タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより細胞または組織源から単離することができる。あるいは、ＧＡＶＥ１８タンパク質は、組換えＤＮＡ技術で容易に製造することができる。本発明に含まれるさらにその他の代替法は、標準的なペプチド合成技術を用いたＧＡＶＥ１８タンパク質またはポリペプチドの化学合成である。   Wild-type GAVE18 protein can be isolated from cells or tissue sources by an appropriate purification scheme using standard protein purification techniques. Alternatively, GAVE18 protein can be readily produced by recombinant DNA technology. Yet another alternative included in the present invention is chemical synthesis of GAVE18 protein or polypeptide using standard peptide synthesis techniques.

「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分は、細胞性の物質またはＧＡＶＥ１８タンパク質が誘導される細胞または組織源からのその他の不純タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合は、化学前駆体またはその他の化学物質実質的に含まない。「細胞性の物質を実質的に含まない」という句は、ＧＡＶＥ１８タンパク質が単離される細胞またはＧＡＶＥ１８タンパク質が組換えにより生産される細胞の細胞成分から分離されているＧＡＶＥ１８タンパク質の調製物を含む。従って、細胞性の物質を実質的に含まないＧＡＶＥ１８タンパク質において、非ＧＡＶＥ１８タンパク質（または本明細書においては「不純タンパク質」と称する）が約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥質量で）未満であるＧＡＶＥ１８タンパク質の調製物を含む。また、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分が組換えにより生産される場合、実質的に培地を含まないことが好ましく、すなわち、培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％または５％未満で存在することが好ましい。ＧＡＶＥ１８タンパク質が化学合成で生産される場合、化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク質合成に伴う化学前駆体またはその他の化学物質と分離されていることが好ましい。従って、このようなＧＡＶＥ１８タンパク質調製物において、化学前駆体または非ＧＡＶＥ１８化学物質が約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥質量で）未満で存在する。   An “isolated” or “purified” protein or biologically active portion thereof is substantially free of cellular material or other impure proteins from cells or tissue sources from which the GAVE18 protein is derived. Contains no or substantially no chemical precursor or other chemical when it is chemically synthesized. The phrase “substantially free of cellular material” includes preparations of GAVE18 protein that are separated from cellular components of the cells from which GAVE18 protein is isolated or from cells in which GAVE18 protein is produced recombinantly. Thus, in a GAVE18 protein substantially free of cellular material, non-GAVE18 protein (or referred to herein as “impure protein”) is about 30%, 20%, 10% or 5% (by dry mass) ) Containing a preparation of GAVE18 protein that is less than Also, if the GAVE18 protein or biologically active portion thereof is produced recombinantly, it is preferably substantially free of medium, ie, the medium is about 20% of the volume of the protein preparation, 10% % Or less than 5%. When the GAVE18 protein is produced by chemical synthesis, it is preferably substantially free of chemical precursors or other chemical substances, that is, separated from chemical precursors or other chemical substances involved in protein synthesis. preferable. Thus, in such GAVE18 protein preparations, chemical precursors or non-GAVE18 chemicals are present in less than about 30%, 20%, 10% or 5% (by dry weight).

ＧＡＶＥ１８タンパク質の生物学的に活性な部分としては、ＧＡＶＥ１８タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２で示されたアミノ酸配列）と十分に同一なアミノ酸配列、または、ＧＡＶＥ１８タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２で示されたアミノ酸配列）から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、該ペプチドは、全長ＧＡＶＥ１８タンパク質より少ないアミノ酸を含み、ＧＡＶＥ１８タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。一般的に、生物学的に活性な部分は、ＧＡＶＥ１８タンパク質少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＧＡＶＥ１８タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドであり得る。特定の生物学的に活性なポリペプチドとしては、１またはそれ以上の同定されたＧＡＶＥ１８構造ドメインが挙げられる。   The biologically active portion of the GAVE18 protein includes an amino acid sequence that is sufficiently identical to the amino acid sequence of the GAVE18 protein (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2), or the amino acid sequence of the GAVE18 protein (for example, SEQ ID NO: 2). In which the peptide contains fewer amino acids than the full-length GAVE18 protein and exhibits at least one activity of the GAVE18 protein. Generally, the biologically active portion comprises a domain or motif having at least one activity of GAVE18 protein. A biologically active portion of a GAVE18 protein can be, for example, a polypeptide of 10, 25, 50, 100 or more amino acids in length. Certain biologically active polypeptides include one or more identified GAVE18 structural domains.

その上、タンパク質のその他の領域が欠失している生物学的に活性なその他の部分を、組換え技術で製造することができ、１またはそれ以上の野生型のＧＡＶＥ１８タンパク質の機能的な活性に関して評価することができる。   In addition, other biologically active portions lacking other regions of the protein can be produced recombinantly, and the functional activity of one or more wild-type GAVE18 proteins Can be evaluated.

他の有用なＧＡＶＥ１８タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、配列番号２のタンパク質の機能的な活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異または変異誘発によりアミノ酸配列は異なる。例えば、このようなＧＡＶＥ１８タンパク質およびポリペプチドは、本明細書において説明される少なくとも１つの生物活性を有する。   Other useful GAVE18 proteins are substantially identical to SEQ ID NO: 2 and retain the functional activity of the protein of SEQ ID NO: 2, but differ in amino acid sequence due to natural allelic variation or mutagenesis. For example, such GAVE18 proteins and polypeptides have at least one biological activity described herein.

従って、有用なＧＡＶＥ１８タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号２のＧＡＶＥ１８タンパク質の機能的な活性を保持するタンパク質である。特定の実施形態において、ＧＡＶＥ１８タンパク質は、配列番号２のＧＡＶＥ１８タンパク質の機能的な活性を保持する。   Thus, a useful GAVE18 protein has an amino acid sequence that is at least about 45%, preferably 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. A protein that retains the functional activity of the GAVE18 protein of SEQ ID NO: 2. In certain embodiments, the GAVE18 protein retains the functional activity of the GAVE18 protein of SEQ ID NO: 2.

２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性（％）を決定するために、最適な比較目的にあうように配列を並べる（例えば、第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することにより、第二のアミノまたは核酸配列との最適なアライメントを得ることができる）。続いて、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていた場合、分子はその位置において同一であるとみなされる。２つの配列間の同一性（％）は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち同一性（％）＝同一な位置の数／位置の総数（例えばオーバーラップする位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。   To determine the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg, by introducing a gap in the sequence of the first amino acid or nucleic acid sequence) Optimal alignment with the second amino or nucleic acid sequence can be obtained). Subsequently, the amino acid residues or nucleotides at corresponding amino acid positions or nucleotide positions are compared. If a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are considered identical at that position. Identity (%) between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences (ie,% identity) = number of identical positions / total number of positions (eg overlapping positions) × 100). In one embodiment, the two sequences are the same length.

２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較で用いられる数学的アルゴリズムの特定の非限定的な例としては、Ｋａｒｌｉｎ等のアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：２２６４）が挙げられる（Ｋａｒｌｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３年）９０：５８７３〜５８７７に記載のように改変された）。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏ（１９９０年）２１５：４０３）に取り込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラムで、例えばスコア＝１００、語長＝１２で行い、本発明のＧＡＶＥ１８核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、語長＝３で行い、本発明のＧＡＶＥ１８タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ入りのアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９７年）２５：３３８９で説明されたように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を行うのに使用可能である。上述したＡｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７年）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。   The determination of percent identity between two sequences can be accomplished using a mathematical algorithm. Specific non-limiting examples of mathematical algorithms used in comparing two sequences include the algorithm of Karlin et al. (Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 2264) (Karlin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 5873-5877). Such algorithms are incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (Altschul et al., J Mol Bio (1990) 215: 403) such as Altschul et al. A BLAST nucleotide search is performed with the NBLAST program, for example, with a score = 100 and word length = 12, and a nucleotide sequence homologous to the GAVE18 nucleic acid molecule of the present invention can be obtained. A BLAST protein search is performed with the XBLAST program with a score = 50 and a word length = 3, and an amino acid sequence homologous to the GAVE18 protein molecule of the present invention can be obtained. To obtain a gapped alignment for comparison purposes, Gapped BLAST can be used as described in Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25: 3389. Alternatively, PSI-Blast can be used to perform an iterated search that detects distance relationships between molecules. Altschul et al. (1997), described above. When utilizing BLAST, Gapped BLAST, and PSI-Blast programs, the default parameters of the respective programs (eg, XBLAST and NBLAST) can be used. See http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの他の特定の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ等のアルゴリズムである（Ｍｙｅｒｓ等，ＣＡＢＩＯＳ（１９８８年）４：１１〜１７）。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧシークエンスアライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０の重量残留表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティが１２、および、ギャップペナルティが４で使用可能である。   Another specific, non-limiting example of a mathematical algorithm utilized for sequence comparison is the Myers et al. Algorithm (Myers et al., CABIOS (1988) 4: 11-17). Such an algorithm is incorporated into the ALIGN program (version 2.0) which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, a PAM120 weight residue table, gap length penalty of 12, and gap penalty of 4 can be used.

２つの配列間の同一性（％）は、上述した技術と類似の技術をギャップ有り、または無しで用いて決定することができる。同一性（％）を計算する際、正確な適合のみを計数する。   The percent identity between two sequences can be determined using techniques similar to those described above, with or without gaps. When calculating identity (%), only exact matches are counted.

本発明はまた、ＧＡＶＥ１８キメラまたは融合タンパク質を提供する。本発明で用いられるように、ＧＡＶＥ１８の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＧＡＶＥ１８ポリペプチドに操作可能に結合したＧＡＶＥ１８ポリペプチドを含む。「ＧＡＶＥ１８ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ１８に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。それに対して、「非ＧＡＶＥ１８ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ１８タンパク質と実質的に同一ではないタンパク質（例えばＧＡＶＥ１８タンパク質と異なるタンパク質、および、同じ生物または異なる生物から誘導されたタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＧＡＶＥ１８融合タンパク質中で、ＧＡＶＥ１８ポリペプチドは、ＧＡＶＥ１８タンパク質の全部または部分、好ましくは、ＧＡＶＥ１８タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分に対応し得る。融合タンパク質中で、用語「操作可能に結合した」は、ＧＡＶＥ１８ポリペプチドおよび非ＧＡＶＥ１８ポリペプチドが、互いにフレーム内で融合していることとする。非ＧＡＶＥ１８ポリペプチドは、ＧＡＶＥ１８ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。１つの有用な融合タンパク質は、ＧＡＶＥ１８配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列のＣ末端に融合したＧＳＴ−ＧＡＶＥ１８融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＧＡＶＥ１８の精製を容易にすることができる。   The invention also provides a GAVE18 chimeric or fusion protein. As used herein, a GAVE18 “chimeric protein” or “fusion protein” comprises a GAVE18 polypeptide operably linked to a non-GAVE18 polypeptide. “GAVE18 polypeptide” means a polypeptide having an amino acid sequence corresponding to GAVE18. In contrast, a “non-GAVE18 polypeptide” has an amino acid sequence that corresponds to a protein that is not substantially identical to the GAVE18 protein (eg, a protein different from the GAVE18 protein and a protein derived from the same organism or a different organism). Means polypeptide. In the GAVE18 fusion protein, the GAVE18 polypeptide may correspond to all or a portion of the GAVE18 protein, preferably at least one biologically active portion of the GAVE18 protein. In the fusion protein, the term “operably linked” means that a GAVE18 polypeptide and a non-GAVE18 polypeptide are fused together in frame. The non-GAVE18 polypeptide can be fused to the N-terminus or C-terminus of the GAVE18 polypeptide. One useful fusion protein is the GST-GAVE18 fusion protein in which the GAVE18 sequence is fused to the C-terminus of the glutathione-S-transferase (GST) sequence. Such fusion proteins can facilitate the purification of recombinant GAVE18.

他の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＧＡＶＥ１８の全部または部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーから誘導された配列に融合したＧＡＶＥ１８−免疫グロブリン融合タンパク質を含む。本発明のＧＡＶＥ１８−免疫グロブリン融合タンパク質を医薬組成物に含ませ、被検体に投与することにより、ＧＡＶＥ１８リガンドとＧＡＶＥ１８タンパク質との細胞表面上での相互作用を阻害し、それによりＧＡＶＥ１８介在シグナル伝達をインビボで抑制することができる。ＧＡＶＥ１８−免疫グロブリン融合タンパク質を、ＧＡＶＥ１８と同種のリガンドの生物学的利用能に影響を与えるのに用いることができる。ＧＡＶＥ１８リガンド−ＧＡＶＥ１８相互作用の阻害は、増殖性疾患および分化に関する疾患を治療すること、および、細胞の生存を調節すること（例えば促進または阻害すること）のいずれに関しても、治療上有用である可能性がある。その上、本発明のＧＡＶＥ１８−免疫グロブリン融合タンパク質を、被検体において抗ＧＡＶ
Ｅ１８抗体を生産させるための免疫原、ＧＡＶＥ１８リガンドを精製するための免疫原、および、スクリーニング分析においてＧＡＶＥ１８とＧＡＶＥ１８リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として用いることができる。 In other embodiments, the fusion proteins of the invention comprise a GAVE18-immunoglobulin fusion protein in which all or part of GAVE18 is fused to a sequence derived from a member of an immunoglobulin protein family. The GAVE18-immunoglobulin fusion protein of the present invention is included in a pharmaceutical composition and administered to a subject, thereby inhibiting the interaction between the GAVE18 ligand and the GAVE18 protein on the cell surface, thereby causing GAVE18-mediated signal transduction. It can be suppressed in vivo. A GAVE18-immunoglobulin fusion protein can be used to affect the bioavailability of the same type of ligand as GAVE18. Inhibition of the GAVE18 ligand-GAVE18 interaction may be therapeutically useful both for treating proliferative diseases and diseases related to differentiation and for modulating (eg, promoting or inhibiting) cell survival. There is sex. In addition, the GAVE18-immunoglobulin fusion protein of the present invention is treated with anti-GAV in a subject.
It can be used as an immunogen for producing E18 antibodies, an immunogen for purifying GAVE18 ligand, and an immunogen for identifying molecules that inhibit the interaction between GAVE18 and GAVE18 ligand in screening analysis.

特定の実施形態において、本発明のＧＡＶＥ１８キメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、通常の技術に従って（例えばライゲートのために平滑化または段差のある末端にした末端により）フレーム内に共にライゲートされ、制限酵素消化を用いて、適切な末端を提供し、適切なアルカリホスファターゼ処理で付着端を充填し、望ましくない結合や酵素によるライゲートを防ぐ。他の実施形態において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡシンセサイザーなどの通常の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を２つの連続した遺伝子断片間で相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いて行うことができ、続いて、アニールし、再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば上述したＡｕｓｕｂｅｌ等を参照）。その上、多くの発現ベクターは、すでに融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードした市販品が利用可能である。融合成分がフレーム内でＧＡＶＥ１８タンパク質に結合するように、ＧＡＶＥ１８をコードする核酸をこのような発現ベクターにクローニングすることができる。   In certain embodiments, the GAVE18 chimeric or fusion proteins of the invention can be made by standard recombinant DNA techniques. For example, DNA fragments encoding different polypeptide sequences can be ligated together in frame (eg, with blunted or stepped ends for ligation) according to conventional techniques, using restriction enzyme digests, and Provide a suitable end and fill the sticky end with appropriate alkaline phosphatase treatment to prevent unwanted binding and enzymatic ligation. In other embodiments, the fusion gene can be synthesized by conventional techniques such as automated DNA synthesizers. Alternatively, PCR amplification of gene fragments can be performed using anchor primers that produce complementary overhangs between two consecutive gene fragments, followed by annealing and re-amplification to create a chimeric gene sequence (See, eg, Ausubel et al. Above). In addition, many expression vectors are commercially available that already encode a fusion component (eg, a GST polypeptide). A nucleic acid encoding GAVE18 can be cloned into such an expression vector such that the fusion component binds to the GAVE18 protein in frame.

変異体
上述したように、本発明は、ＧＡＶＥ１８タンパク質の変異体をさらに含む。例えば、突然変異は、標準的な技術を用いて、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲによる変異誘発を用いて、配列番号２のアミノ酸配列に導入することができる。その上、１またはそれ以上の予想される非必須アミノ酸残基において保存的なアミノ酸置換を行ってもよい。「保存的なアミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基が置換されることである。例えば、１またはそれ以上のアミノ酸は、機能的に同等に作用しサイレントな変化しか生じない類似の極性を有する他のアミノ酸で置換することができる。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換体は、そのアミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げらる。芳香環構造を含むアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。中性極性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。陽性に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。陰性に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点で測定された見かけの分子量に影響を与えないと考えられる。 Variants As noted above, the present invention further includes variants of the GAVE18 protein. For example, mutations can be introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 using standard techniques, for example using site-directed mutagenesis and PCR mutagenesis. In addition, conservative amino acid substitutions may be made at one or more predicted non-essential amino acid residues. A “conservative amino acid substitution” is one in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. For example, one or more amino acids can be replaced with other amino acids of similar polarity that act functionally equally and produce only silent changes. An amino acid substitution in the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention can be selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine. Amino acids containing an aromatic ring structure are phenylalanine, tryptophan, and tyrosine. Neutral polar amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. Such changes are believed not to affect the apparent molecular weight measured by polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric point.

特に好ましい置換は：
- Ａｒｇに対しては、陽電荷が維持されるようにＬｙｓ（逆もまた同様）；
- Ａｓｐに対しては、陰電荷が維持されるようにＧｌｕ（逆もまた同様）；
- Ｔｈｒに対しては、遊離ＯＨが維持されるようにＳｅｒ；および、
- Ａｓｎに対しては、遊離ＮＨ₂が維持されるようにＧｌｎである。 Particularly preferred substitutions are:
-For Arg, Lys (and vice versa) so that a positive charge is maintained;
-For Asp, Glu (and vice versa) so that the negative charge is maintained;
-For Thr, Ser so that free OH is maintained; and
- For Asn, it is Gln as the free NH ₂ can be maintained.

その上、アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を有するアミノ酸で置換されるように導入することもできる。例えば、他のＣｙｓとのジスルフィド架橋に関して可能性のある部位にＣｙｓを導入することができる。特に「触媒」部位としてＨｉｓを導入することもできる（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、生化学的な触媒作用において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、特に平面的な構造を有し、タンパク質構造にβターンを誘導するため、Ｐｒｏを導入することもできる。   Moreover, amino acid substitutions can also be introduced so that they are substituted with amino acids having particularly favorable properties. For example, Cys can be introduced at potential sites for disulfide bridges with other Cys. In particular, His can also be introduced as a “catalytic” site (ie, His can act as an acid or base and is the most common amino acid in biochemical catalysis). Pro has a particularly planar structure, and Pro can be introduced to induce a β-turn in the protein structure.

突然変異は、飽和変異導入などによりＧＡＶＥ１８のコーディング配列の全部または部分に沿ってランダムに導入することもでき、得られた突然変異体をＧＡＶＥ１８生物活性に関してスクリーニングし、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え発現させることができ、タンパク質の活性を測定することができる。   Mutations can also be introduced randomly along all or part of the coding sequence of GAVE18, such as by saturation mutagenesis, and the resulting mutants screened for GAVE18 biological activity and mutants that retain activity are detected. Can be identified. Following mutagenesis, the encoded protein can be expressed recombinantly and the activity of the protein can be measured.

本発明の変異体は、ＧＡＶＥ１８アゴニスト（ミメティック）またはＧＡＶＥ１８アンタゴニストとして機能し得る。ＧＡＶＥ１８タンパク質の変異体は、変異誘発、例えば散在した点突然変異またはＧＡＶＥ１８タンパク質の短縮化により、生産することができる。ＧＡＶＥ１８タンパク質のアゴニストは、実質的に、同じ、または、部分的な、天然に存在するＧＡＶＥ１８タンパク質の生物活性を保持し得る。例えば、ＧＡＶＥ１８タンパク質のアンタゴニストは、細胞のシグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバー（ＧＡＶＥ１８タンパク質を含む）に競合的に結合し、それによって天然型のＧＡＶＥ１８タンパク質の一つ以上の活性を阻害することができる。従って、特異的な生物学的な効果は、限定された機能を有する変異体で処理することにより引き出すことができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物活性の一部を有する変異体を用いた被検体の治療は、ＧＡＶＥ１８タンパク質の天然に存在する形態での治療に比べて被検体の副作用をより少なくできる。   The variants of the invention may function as GAVE18 agonists (mimetics) or GAVE18 antagonists. Variants of the GAVE18 protein can be produced by mutagenesis, eg, scattered point mutations or shortening of the GAVE18 protein. An agonist of the GAVE18 protein may retain substantially the same or partial biological activity of the naturally occurring GAVE18 protein. For example, an antagonist of GAVE18 protein may competitively bind to downstream or upstream members of the cellular signaling cascade (including GAVE18 protein), thereby inhibiting one or more activities of the native GAVE18 protein. it can. Thus, specific biological effects can be elicited by treatment with mutants having limited functions. Treatment of a subject with a variant having some of the biological activity of the naturally occurring form of the protein can result in fewer side effects of the subject compared to treatment with the naturally occurring form of the GAVE18 protein.

ＧＡＶＥ１８アゴニスト（ミメティック）またはＧＡＶＥ１８アンタゴニストのいずれかとして機能するＧＡＶＥ１８タンパク質の変異体は、突然変異体、例えばＧＡＶＥ１８タンパク質のトランケーション突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、ＧＡＶＥ１８アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態において、多様なＧＡＶＥ１８変異体ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発法で作製され、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＧＡＶＥ１８変異体の多様なライブラリーを作製することができ、これは、例えば、可能性のあるＧＡＶＥ１８配列のディジェネレートセットが、個々のポリペプチドとして、またあるいは、ＧＡＶＥ１８配列のセットを含むより大きい融合タンパク質（例えばファージディスプレイ用）として発現可能なように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることによりなされる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＧＡＶＥ１８変異体のライブラリーを作製するのに用いることができる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡシンセサイザーで行い、続いて、合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲートすることができる。遺伝子の縮重セットの使用により、１つの混合物において、可能性のあるＧＡＶＥ１８配列の望ましいセットをコードする配列の全ての供給が可能である。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当業界既知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３年）３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ等，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４年）５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４年）１９８：１０５６；Ｉｋｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８３年）１１：４７７を参照）。   Variants of GAVE18 protein that function as either a GAVE18 agonist (mimetic) or a GAVE18 antagonist are identified by screening a combinatorial library of mutants, eg, truncation mutants of GAVE18 protein, for GAVE18 agonist or antagonist activity can do. In one embodiment, a diverse GAVE18 mutant library is generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level and is encoded by a diverse gene library. A diverse library of GAVE18 variants can be generated, for example, where the potential degenerate set of GAVE18 sequences is larger than individual polypeptides and / or alternatively includes a set of GAVE18 sequences. This is done by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides to a gene sequence so that it can be expressed as a fusion protein (eg for phage display). There are a variety of methods that can be used to generate a library of potential GAVE18 variants from a degenerate oligonucleotide sequence. Chemical synthesis of degenerate gene sequences can be performed with an automated DNA synthesizer, followed by ligation of the synthetic gene into an appropriate expression vector. By using a degenerate set of genes, it is possible to provide all of the sequences encoding the desired set of potential GAVE18 sequences in one mixture. Methods for synthesizing degenerate oligonucleotides are known in the art (eg, Narang, Tetrahedron (1983) 39: 3; Itura et al., Ann Rev Biochem (1984) 53: 323; Itura et al., Science (1984) 198 : 1056; see Ike et al., Nucleic Acids Res (1983) 11: 477).

加えて、ＧＡＶＥ１８タンパク質をコードする配列の断片のライブラリーを用いて、スクリーニングのためのＧＡＶＥ１８断片の変種の個体群を作製することができ、その後、ＧＡＶＥ１８タンパク質の変異体を選択することができる。一実施形態において、コーディング配列の断片のライブラリーの作製は、分子あたり約１回だけニック導入が起こる条件下でＧＡＶＥ１８のコーディング配列の二本鎖型ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理すること、二本鎖型ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生して二本鎖ＤＮＡを形成すること（該二本鎖型ＤＮＡは異なるニック導入された産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る）、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再生された二本鎖から一本鎖化した部分を除去すること、および、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲートすること、によってなすことができる。この方法により、様々な大きさのＧＡＶＥ１８タンパク質のＮ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。   In addition, a library of fragments of sequences encoding the GAVE18 protein can be used to generate a population of variants of the GAVE18 fragment for screening, after which mutants of the GAVE18 protein can be selected. In one embodiment, generating a library of coding sequence fragments comprises treating a double-stranded PCR fragment of the coding sequence of GAVE18 with a nuclease under conditions where nicking occurs only about once per molecule, By denaturing the type DNA, regenerating the DNA to form double stranded DNA (the double stranded DNA may contain sense / antisense pairs from different nicked products), S1 nuclease treatment This can be done by removing the single-stranded portion from the regenerated duplex and ligating the resulting fragment library to an expression vector. By this method, an expression library can be derived which encodes N-terminal and internal fragments of various sizes of GAVE18 protein.

選択された特性を有する遺伝子産物に関して点突然変異または短縮化により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、数々の技術が当業界既知である。このような技術は、ＧＡＶＥ１８タンパク質のコンビナトリアル変異誘発法により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用される。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適用しやすい最も広く用いられている技術としては、一般的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および、コンビナトリアル遺伝子を発現すること（望ましい活性を検出することが生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で）、を含む。再帰的アンサンブル変異誘発法（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリー中で機能的突然変異体の頻度を高める技術であり、これをスクリーニング分析と組み合わせて用いることにより、ＧＡＶＥ１８変異体を同定することができる（Ａｒｋｉｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３年）６（３）：３２７〜３３１）。   Numerous techniques are known in the art for screening gene products of combinatorial libraries created by point mutations or truncations for gene products with selected properties and for screening cDNA libraries. . Such a technique is applied to rapid screening of gene libraries generated by combinatorial mutagenesis of GAVE18 protein. The most widely used technique that can be easily applied to high-throughput analysis for screening large gene libraries is generally the cloning of gene libraries into replicable expression vectors. Transforming appropriate cells with this library, and expressing a combinatorial gene (under conditions where detecting the desired activity facilitates isolation of the vector encoding the gene from which the product was detected) ),including. Recursive ensemble mutagenesis (REM) is a technique that increases the frequency of functional mutants in a library and uses it in combination with screening analysis to identify GAVE18 mutants. (Arkin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering (1993) 6 (3): 327-331).

ＧＡＶＥ１８の類似体および誘導体
その上、本発明はまた、化学修飾により製造されたＧＡＶＥ１８の誘導体または類似体を含む。本発明のＧＡＶＥ１８タンパク質は、１またはそれ以上の化学成分をタンパク質成分に付着させることによって誘導体化できる。 Analogs and derivatives of GAVE18 Moreover, the present invention also includes derivatives or analogs of GAVE18 produced by chemical modification. The GAVE18 protein of the present invention can be derivatized by attaching one or more chemical components to the protein component.

誘導体化のための化学成分
誘導体化に適した化学成分は、ＧＡＶＥ１８類似体もしくは誘導体が水性の環境、例えば生理学的な環境で沈殿しないような水溶性ポリマーから選択することができる。このようなポリマーは、場合により製薬上許容できる。当業者は、ポリマー／構成要素結合体が治療に使用可能かどうかという考察、使用可能であれば、望ましい投与量、循環時間、タンパク質分解への耐性、およびその他の考察に基づいて、望ましいポリマーを選択することができる。ＧＡＶＥ１８に関しては、上記考察は、本発明で提供された分析を用いて確認することができる。本発明において用いることができる水溶性ポリマーの例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールまたはポリビニルアルコールが挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが、水中で安定であることから、製造に有利であり得る。 Chemical Components for Derivatization Chemical components suitable for derivatization can be selected from water-soluble polymers such that the GAVE18 analog or derivative does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. Such polymers are optionally pharmaceutically acceptable. One skilled in the art will determine the desired polymer based on the consideration of whether the polymer / component conjugate can be used therapeutically, if available, the desired dosage, circulation time, resistance to proteolysis, and other considerations. You can choose. Regarding GAVE 18, the above considerations can be confirmed using the analysis provided in the present invention. Examples of water-soluble polymers that can be used in the present invention include, but are not limited to, polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymers, carboxymethyl cellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, poly-1,3-dioxolane, Poly-1,3,6-trioxane, ethylene / maleic anhydride copolymer, polyamino acid (either homopolymer or random copolymer), dextran, poly (n-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / Mention may be made of ethylene oxide copolymers, polyoxyethylated polyols or polyvinyl alcohol. Polyethylene glycol propionaldehyde may be advantageous for production because it is stable in water.

上記ポリマーは、どのような分子量のものでもよく、分枝状でも非分枝状でもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、操作および製造を容易にするために、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（用語「約」は、ポリエチレングリコール調製物において、いくつかの分子が定められた分子量より多少増減し得ることを示す）。その他のサイズも、望ましい治療プロフィル（例えば、望ましい持続放出時間、生物活性への効果（それらがある場合）、操作容易性、抗原性の度合いまたは欠落、およびその他の既知の治療用タンパク質または類似体へのポリエチレングリコールの効果）に応じて使用可能
である。 The polymer may be of any molecular weight and may be branched or unbranched. For polyethylene glycol, the preferred molecular weight is from about 2 kDa to about 100 kDa for ease of handling and manufacture (the term “about” means that some molecules in polyethylene glycol preparations are more or less than the defined molecular weight. Indicates that it can increase or decrease). Other sizes may also be desirable therapeutic profiles (eg, desired sustained release times, effects on biological activity (if any), ease of manipulation, degree or lack of antigenicity, and other known therapeutic proteins or analogs) Can be used according to the effect of polyethylene glycol).

このようにしてＧＡＶＥ１８に結合するポリマー分子の数は様々であり、当業者であれば機能に対する効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うことができ、または、同じ化学成分または異なる化学成分（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールのようなポリマー）を用いた、ジ、トリ、テトラ誘導体化または数種の誘導体化の組み合わせを行うこともできる。ポリマー分子のＧＡＶＥ１８分子に対する割合、同様に反応混合物中のそれらの濃度は様々である。一般的に、最適な比率（過量の未反応の構成要素または構成要素およびポリマーがないような反応効率という観点で）は、誘導体化の望ましい度合い（例えば、モノ、ジ−、トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分枝状か非分枝状かとうこと、および反応条件のようなファクターにより決定することができる。   Thus, the number of polymer molecules bound to GAVE18 varies, and those skilled in the art can confirm the effect on the function. Mono-derivatization can be performed, or a combination of di-, tri-, tetra-derivatization or several derivatizations using the same or different chemical components (eg, polymers such as polyethylene glycols of different molecular weights) Can also be done. The ratio of polymer molecules to GAVE18 molecules, as well as their concentration in the reaction mixture, varies. In general, the optimal ratio (in terms of reaction efficiency such that there is no excess of unreacted components or components and polymer) is the desired degree of derivatization (eg mono, di-, tri-, etc.), It can be determined by factors such as the molecular weight of the selected polymer, whether the polymer is branched or unbranched, and the reaction conditions.

ポリエチレングリコール分子（またはその他の化学成分）は、ＧＡＶＥ１８の機能的ドメインまたは抗原性ドメインへの効果を考慮してＧＡＶＥ１８に結合させるべきである。当業者が利用できる多数の結合方法があり、例えば欧州特許第０４０１３８４号（を参照により本発明に加入する）（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング）であり、また、Ｍａｌｉｋ等，１９９２年，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜１０３５を参照（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化が報告されている）。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応性基を介してアミノ酸残基と共有結合することができる。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としては、リシン残基、および、Ｎ末端アミノ酸残基が挙げられ；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、および、Ｃ末端アミノ酸残基が挙げられる。また、スルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として用いることができる。治療目的において、アミノ基での結合、例えばＮ末端またはリシン基での結合が好ましい。   Polyethylene glycol molecules (or other chemical components) should be attached to GAVE18 in view of effects on functional or antigenic domains of GAVE18. There are a number of conjugation methods available to those skilled in the art, for example EP 040384 (incorporated by reference) (coupling of PEG to G-CSF), and Malik et al., 1992, Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (pegylation of GM-CSF using tresyl chloride has been reported). For example, polyethylene glycol can be covalently linked to an amino acid residue via a reactive group such as a free amino or carboxyl group. A reactive group is a group to which an activated polyethylene glycol molecule can bind. Amino acid residues having a free amino group include lysine residues and N-terminal amino acid residues; amino acid residues having a free carboxyl group include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and C-terminal Amino acid residues are mentioned. A sulfhydryl group can also be used as a reactive group for binding polyethylene glycol molecules. For therapeutic purposes, attachment at the amino group, such as attachment at the N-terminus or lysine group, is preferred.

Ｎ末端で化学修飾されたＧＡＶＥ１８が特に望ましい。ポリエチレングリコールを用いて本組成物を説明すれば、多種多様なポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などにより）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のＧＡＶＥ１８分子に対する割合、実施されるペグ化反応のタイプ、および、選択されたＮ末端でペグ化されたタンパク質を得る方法を選択することができる。Ｎ末端でペグ化した調製物を得る方法（すなわち、この成分を必要に応じて他のモノペグ化成分から分離すること）としては、Ｎ末端でペグ化した物質をペグ化タンパク質分子集合体から精製することが挙げられる。選択的なＮ末端の化学修飾は、ＧＡＶＥ１８の誘導体化に利用可能な様々なタイプの最初のアミノ基の差別的な反応性（リシンのＮ末端に対する）を利用する還元的アルキル化により達成することができる。適切な反応条件下で、実質的に選択的な、Ｎ末端でのポリマーを含むカルボニル基を用いたＧＡＶＥ１８誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のε−アミノ基とＧＡＶＥ１８のＮ末端残基のα−アミノ基とのｐＫａの差を利用することができるｐＨで反応させることにより、ＧＡＶＥ１８を選択的にＮ末端でペグ化することができる。このような選択的誘導体化により、水溶性ポリマーのＧＡＶＥ１８への結合が制御される：ポリマーとの結合は、主にＧＡＶＥ１８のＮ末端で起こり、その他の反応性基（例えばリシン側鎖のアミノ基）には顕著な改変は起こらない。還元的アルキル化を用いれば、水溶性ポリマーを上述したタイプのものにすることが可能であり、ＧＡＶＥ１８へのカップリングに関して反応性を有する一つのアルデヒドを有するべきである。一つの反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを用いることができる。   GAVE18 chemically modified at the N-terminus is particularly desirable. Explaining the composition using polyethylene glycol, a wide variety of polyethylene glycol molecules (by molecular weight, branching, etc.), the ratio of polyethylene glycol molecules to GAVE18 molecules in the reaction mixture, the type of pegylation reaction performed, And a method of obtaining a protein pegylated at the selected N-terminus can be selected. As a method of obtaining a preparation PEGylated at the N-terminus (ie, separating this component from other mono-PEGylated components as needed), the N-terminal PEGylated material is purified from the PEGylated protein molecular assembly. Can be mentioned. Selective N-terminal chemical modification is achieved by reductive alkylation utilizing the differential reactivity of the first amino group of various types available for derivatization of GAVE18 (relative to the N-terminus of lysine). Can do. Under appropriate reaction conditions, substantially selective GAVE18 derivatization with a carbonyl group comprising a polymer at the N-terminus is achieved. For example, GAVE18 is selectively pegylated at the N-terminus by reacting at a pH that can take advantage of the difference in pKa between the ε-amino group of a lysine residue and the α-amino group of the N-terminal residue of GAVE18. can do. Such selective derivatization controls the binding of the water-soluble polymer to GAVE18: Binding to the polymer occurs primarily at the N-terminus of GAVE18 and other reactive groups (eg, amino groups on the lysine side chain). ) Does not change significantly. With reductive alkylation, the water soluble polymer can be of the type described above and should have one aldehyde that is reactive with respect to coupling to GAVE18. Polyethylene glycol propionaldehyde containing one reactive aldehyde can be used.

ＧＡＶＥ１８、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体の抗体
単離されたＧＡＶＥ１８タンパク質またはそれらの部分もしくは断片を免疫原として用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的な技術を用いてＧＡＶＥ１８に結合する抗体を作製することができる。本発明で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち特異的にＧＡＶＥ１８またはその断片のような抗原に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。ＧＡＶＥ１８に特異的に結合する分子とは、ＧＡＶＥ１８に結合するが、サンプル中、例えばＧＡＶＥ１８を天然に含む生物学的なサンプル中で実質的にその他の分子と結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、Ｆ_(ab)およびＦ_(ab')2断片があり、これらは、ペプシンのような酵素で抗体を処理することにより得られる。本発明は、ＧＡＶＥ１８、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの類似体もしくは誘導体を免疫原とするポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体を提供する。ヒトの病気または障害の治療に用いるには、キメラ抗体が好ましく、なぜなら、ヒトまたはヒト化抗体は、外因性抗体よりそれらによる免疫反応、特にアレルギー性応答を誘導する可能性がかなり低いためである。 Antibodies of GAVE18, variants thereof, fragments thereof, or analogues or derivatives thereof Techniques can be used to generate antibodies that bind to GAVE18. The term “antibody” as used herein refers to an immunoglobulin molecule and an immunologically active portion of an immunoglobulin molecule, ie a molecule comprising an antigen binding site that specifically binds an antigen such as GAVE18 or a fragment thereof. Means. A molecule that specifically binds to GAVE18 is a molecule that binds to GAVE18 but does not substantially bind to other molecules in a sample, eg, a biological sample that naturally contains GAVE18. Examples of immunologically active portions of immunoglobulin molecules are F _(ab) and F _{(ab ′) 2} fragments, which can be obtained by treating the antibody with an enzyme such as pepsin. The present invention provides polyclonal, monoclonal and chimeric antibodies that immunogenize GAVE18, variants thereof, fragments thereof, or analogs or derivatives thereof. Chimeric antibodies are preferred for use in the treatment of human diseases or disorders because human or humanized antibodies are much less likely to induce immune responses, particularly allergic responses, than exogenous antibodies. .

完全長ＧＡＶＥ１８タンパク質を用いることができ、一方で、本発明は、免疫原として用いるためのＧＡＶＥ１８の抗原性ペプチド断片を提供する。ＧＡＶＥ１８の抗原性ペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の少なくとも８個（好ましくは１０、１５、２０、３０個またはそれ以上）のアミノ酸残基を含み、ペプチドに対して生産された抗体がＧＡＶＥ１８と特異的な免疫複合体を形成するようなＧＡＶＥ１８のエピトープを包む。   While full-length GAVE18 protein can be used, the present invention provides an antigenic peptide fragment of GAVE18 for use as an immunogen. The antigenic peptide of GAVE18 contains at least 8 (preferably 10, 15, 20, 30 or more) amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an antibody produced against the peptide Envelops an epitope of GAVE18 that forms a specific immune complex with GAVE18.

一般的には、ＧＡＶＥ１８免疫原は、適切な動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）を免疫原で免疫することにより抗体を製造するのに用いられる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたＧＡＶＥ１８タンパク質、または、化学合成されたＧＡＶＥ１８ポリペプチドを含み得る。このような調製物はさらに、アジュバント、例えばフロインド完全もしくは不完全アジュバント、または、類似の免疫促進剤を含み得る。適切な被検体の免疫原性ＧＡＶＥ１８調製物での免疫化は、ポリクローナル抗−ＧＡＶＥ１８抗体反応を誘導する。   In general, the GAVE18 immunogen is used to produce antibodies by immunizing a suitable animal (eg, rabbit, goat, mouse or other mammal) with the immunogen. Suitable immunogenic preparations can include, for example, recombinantly expressed GAVE18 protein, or a chemically synthesized GAVE18 polypeptide. Such preparations can further comprise an adjuvant, such as Freund's complete or incomplete adjuvant, or similar immunostimulatory agent. Immunization of an appropriate subject with an immunogenic GAVE18 preparation induces a polyclonal anti-GAVE18 antibody response.

本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。本発明で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＧＡＶＥ１８の特定のエピトープで免疫反応が可能な抗原結合部位を一つだけ含む抗体分子の群を意味する。従って、モノクローナル抗体組成物は、一般的に、特定のＧＡＶＥ１８タンパク質エピトープに対する結合親和性のみを提示する。   The antibody of the present invention may be a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a chimeric antibody. The term “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” as used in the present invention means a group of antibody molecules comprising only one antigen-binding site capable of immunoreaction with a specific epitope of GAVE18. Thus, monoclonal antibody compositions generally display only the binding affinity for a particular GAVE18 protein epitope.

ポリクローナル抗ＧＡＶＥ１８抗体は、上述のように、ＧＡＶＥ１８免疫原で適切な動物を免疫化することにより製造することができる。免疫化された動物における抗ＧＡＶＥ１８抗体のタイターは、例えば固定化ＧＡＶＥ１８を用いた酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により長期にわたりモニターすることができる。必要に応じて、ＧＡＶＥ１８に対して向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離することができ、例えばＩｇＧ分画を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような周知の技術により、さらに精製することができる。免疫化した後適切な時間で、例えば、抗ＧＡＶＥ１８抗体タイターが最も高くなった時点で、動物から抗体産生細胞を得ることができ、標準的な技術でモノクローナル抗体を製造するのに用いることができ、この標準的な技術としては、例えば、ハイブリドーマ技術（もともとはＫｏｈｌｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５年）２５６：４９５〜４９７で説明された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ等，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ（１９８３年）４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５年），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ社，７７〜９６）、または、トリオーマ技術がある。ハイブリドーマ製造技術は、周知である（一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４年）Ｃｏｌｉｇａｎ等編，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社，ニューヨーク，ニューヨーク州を参照）。簡単に言えば、不死細胞系（一般的には骨髄腫）を、上述のようにＧＡＶＥ１８免疫原で免疫化された哺乳動物からのリンパ球（一般的に脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＧＡＶＥ１８に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定することができる。   Polyclonal anti-GAVE18 antibodies can be produced by immunizing a suitable animal with a GAVE18 immunogen as described above. Anti-GAVE18 antibody titers in immunized animals can be monitored over time by standard techniques such as, for example, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using immobilized GAVE18. If desired, antibody molecules directed against GAVE18 can be isolated from a mammal (eg, from blood), for example, by well-known techniques such as protein A chromatography to obtain an IgG fraction, Further purification is possible. At an appropriate time after immunization, for example, when the anti-GAVE18 antibody titer is highest, antibody-producing cells can be obtained from the animal and can be used to produce monoclonal antibodies using standard techniques. Examples of standard techniques include hybridoma technology (originally described in Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497), human B cell hybridoma technology (Kohler et al., Immunol Today (1983)). 4:72), EBV-hybridoma technology (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985), Alan R. Liss, 77-96), or trioma technology. Hybridoma production techniques are well known (see, in general, Current Protocols, Immunology (1994) Coligan et al., John Wiley & Sons, New York, NY)). Briefly, an immortal cell line (typically myeloma) was obtained by fusing lymphocytes (generally splenocytes) from a mammal immunized with a GAVE18 immunogen as described above. Hybridoma cell culture supernatants can be screened to identify hybridomas producing monoclonal antibodies that bind to GAVE18.

リンパ球と不死化細胞系とを融合するのに用いられる多くの周知のプロトコールのいずれも、抗ＧＡＶＥ１８モノクローナル抗体を生産する目的に適用することができる（例えば、上述したＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｇａｌｆｒｅ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７年）２６６：５５０５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ［Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９８０年）］；および、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（１９８１年）５４：３８７〜４０２を参照）。その上、有用となり得る方法の多くのバリエーションがあることは当業者に明白である。一般的に、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）は、同じ哺乳動物種からリンパ球として誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫化されたマウスからのリンパ球と、不死化マウ細胞系、例えばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性の骨髄腫細胞系とを融合することによって作製することができる。多数の骨髄腫細胞系のいずれも、標準的な技術に従って融合のための相方として用いることができ、該骨髄腫細胞系としては、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系がある。このような骨髄腫系は、ＡＴＣＣから入手可能である。一般的に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。続いて、この融合により得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地を用いて選択する［ＨＡＴ培地は、未融合の骨髄腫細胞や非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させる（未融合の脾細胞は形質転換されていないために数日後死滅する）］。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いてＧＡＶＥ１８と結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。   Any of the many well-known protocols used to fuse lymphocytes and immortalized cell lines can be applied for the purpose of producing anti-GAVE18 monoclonal antibodies (eg, Current Protocols, Immunology; Galfre et al., Supra). , Nature (1977) 266: 55052; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyzes [Plenum Publishing, New York, NY (1980)]; : 387-402). Moreover, it will be apparent to those skilled in the art that there are many variations of methods that can be useful. In general, immortal cell lines (eg, myeloma cell lines) are derived as lymphocytes from the same mammalian species. For example, a mouse hybridoma is transferred to a medium (“HAT medium”) containing lymphocytes from a mouse immunized with an immunogenic preparation of the present invention and an immortalized mau cell line such as hypoxanthine, aminopterin and thymidine. It can be made by fusing with a sensitive myeloma cell line. Any of a number of myeloma cell lines can be used as a companion for fusion according to standard techniques, such as P3-NS1 / 1-Ag4-1, P3-x63-Ag8. There are .653 or Sp2 / O-Ag14 myeloma lines. Such myeloma lines are available from ATCC. In general, HAT-sensitive mouse myeloma cells are fused to mouse splenocytes using polyethylene glycol (“PEG”). Subsequently, the hybridoma cells obtained by this fusion are selected using HAT medium [HAT medium kills unfused and nonproductively fused myeloma cells (unfused splenocytes are It will die after a few days because it is not transformed)]. Hybridoma cells producing the monoclonal antibodies of the invention are detected by screening the hybridoma culture supernatants for antibodies that bind to GAVE18 using, for example, standard ELISA analysis.

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを製造する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＧＡＶＥ１８でスクリーニングし、それによりＧＡＶＥ１８に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗ＧＡＶＥ１８抗体を同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、ファルマシア社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１：および、ストラタジーンの「ＳＵＲＦＺＡＰ」ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。   Instead of producing a monoclonal antibody-producing hybridoma, a recombinant combinatorial immunoglobulin library (eg, an antibody phage display library) is screened with GAVE18, thereby isolating immunoglobulin library members that bind to GAVE18. Anti-GAVE18 antibodies can be identified and isolated. Kits for generating and screening phage display libraries are commercially available (eg, Pharmacia recombinant phage antibody system, catalog number 27-9400-01: and Stratagene's “SURFZAP” phage display kit, catalog Number 240612).

加えて、特にスクリーニング 抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに適用できる方法および試薬の例は、以下に見出すことができる：例えば、米国特許第５,２２３,４０９号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１７２７１：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５６７９：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７：ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）９：１３７０〜１３７２；Ｈａｙ等，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２年）３：８１〜８５；Ｈｕｓｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９年）２４６：１２７５〜１２８１；および、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９９３年）２５１２：７２５〜７３４。   In addition, examples of methods and reagents particularly applicable to the generation and screening of screening antibody display libraries can be found below: for example, US Pat. No. 5,223,409; PCT Publication No. WO 92/18619; PCT Publication No. WO 91/17271: PCT Publication No. WO 92/20791; PCT Publication No. WO 92/15679: PCT Publication No. WO 93/01288; PCT Publication No. WO 92/01047: PCT Publication No. WO 92/09690; PCT Publication No. WO 90/02809; Fuchs etc. , Bio / Technology (1991) 9: 1370-1372; Hay et al., Hum Antibody Hybridomas (1992) 3: 81-85; Huse et al., Science (1989). ) 246: 1275-1281; and, Griffiths, etc., EMBO J (1993 years) 2512: 725-734.

加えて、組換え抗ＧＡＶＥ１８抗体、例えばヒト部分と非ヒト部分との両方を含むキメラやヒト化モノクローナル抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術で作製することができ、これらは本発明の範囲内である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は当業界既知の組換えＤＮＡ技術により作製することができ、例えば、以下で説明される方法を用いることができる：ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第号１８４,１８７；欧州特許出願第号１７１,４９６；欧州特許出願第号１７３,４９４；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４,８１６,５６７号；欧州特許出願第号１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７年）８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｎ等，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７年）１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８７年）８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等，Ｃａｎｃ Ｒｅｓ（１９８７年）４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗ等，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（１９８８年）８０：１５５３〜１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６年）４：２１４；米国特許第５,２２５,５３９号；Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年）３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２３９：１５３４；および、Ｂｅｉｄｌｅｒ等，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８年）１４１：４０５３〜４０６０。   In addition, recombinant anti-GAVE18 antibodies, such as chimeric and humanized monoclonal antibodies containing both human and non-human portions, can be produced by standard recombinant DNA techniques and are within the scope of the present invention. It is. Such chimeric and humanized monoclonal antibodies can be produced by recombinant DNA techniques known in the art, for example, the methods described below can be used: PCT Publication No. WO87 / 02671; European Patent Application No. European Patent Application No. 171,496; European Patent Application No. 173,494; PCT Publication No. WO86 / 01533; US Pat. No. 4,816,567; European Patent Application No. 125,023; Et al., Science (1988) 240: 1041-1043; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 3439-3443; Lin et al., J Immunol (1987) 139: 3521-3526; Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA (1 87) 84: 214-218; Nishimura et al., Canc Res (1987) 47: 999-1005; Wood et al., Nature (1985) 314: 446-449; Shaw et al., J Natl Cancer Inst (1988) 80 Morrison, Science (1985) 229: 1202-1207; Oi et al., Bio / Techniques (1986) 4: 214; US Pat. No. 5,225,539; Jones et al., Nature (1986) 321: 552-525; Verhoeyan et al., Science (1988) 239: 1534; and Beidler et al., J Immunol (1988) 141: 4053-4060.

完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処理に特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて生産させることができる。該トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばＧＡＶＥ１８全体または部分を用いて通常の様式で免疫化される。該抗原に対して向けられたモノクローナル抗体を通常のハイブリドーマテクノロジーを用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが保持するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の際に再編成され、その後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このようなエピトープを用いて、例えばＧＡＶＥ１８活性を阻害する抗体が同定される。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖をクローニングし、ファージディスプレイＦ_ab断片を作製するのに用いる。例えば、重鎖が細菌から分泌されるように重鎖遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖がファージ表面で発現されるように軽鎖遺伝子をファージコートタンパク質遺伝子にクローニングすることができる。ファージに融合したヒト軽鎖のレパートリー（ランダムコレクション）は、非ヒト重鎖を発現する細菌に感染させるのに用いられる。得られた後代ファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選択された抗原は、選択された抗原に結合するファージを選択するためのパニングスクリーニングで用いられる。このようなファージを同定するのに数回の選択を必要とすることがある。 Completely human antibodies are particularly desirable for therapeutic treatment of human patients. Such antibodies can be produced using transgenic mice that cannot express endogenous immunoglobulin heavy and light chain genes but can express human heavy and light chain genes. The transgenic mice are immunized in the usual manner with a selected antigen, such as all or part of GAVE18. Monoclonal antibodies directed against the antigen can be obtained using conventional hybridoma technology. The human immunoglobulin transgenes carried by the transgenic mice are rearranged during B cell differentiation and subsequently undergo class switching and somatic mutation. Thus, using such epitopes, for example, antibodies that inhibit GAVE18 activity are identified. The heavy and light chains of the non-human antibody are cloned and used to generate phage display _Fab fragments. For example, the heavy chain gene can be cloned into a plasmid vector so that the heavy chain is secreted from the bacterium. The light chain gene can be cloned into a phage coat protein gene such that the light chain is expressed on the phage surface. A repertoire (random collection) of human light chains fused to phage is used to infect bacteria expressing non-human heavy chains. The resulting progeny phage displays a hybrid antibody (human light chain / non-human heavy chain). The selected antigen is used in a panning screen to select phage that bind to the selected antigen. Several selections may be required to identify such phage.

次に、選択された抗原と結合する選択されたファージからヒト軽鎖遺伝子を単離する。続いて、これら選択されたヒト軽鎖遺伝子は、ヒト重鎖遺伝子の選択を先導するのに以下のように用いられる。選択されたヒト軽鎖遺伝子を細菌で発現させるためにベクターに挿入する。選択されたヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージに融合したヒト重鎖のレパートリーで感染させる。得られた後代ファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。   The human light chain gene is then isolated from the selected phage that binds to the selected antigen. Subsequently, these selected human light chain genes are used as follows to guide the selection of human heavy chain genes. The selected human light chain gene is inserted into a vector for expression in bacteria. Bacteria expressing the selected human light chain are infected with a repertoire of human heavy chains fused to phage. The resulting progeny phage displays a human antibody (human light chain / human heavy chain).

次に、選択された抗原は、選択された抗原と結合するファージを選択するためのパニングスクリーニングに用いられる。選択されたファージは、最初に選択された非ヒトモノクローナル抗体により認識される同じエピトープを認識する完全ヒト抗体を提示する。重鎖
および軽鎖の両方ををコードする遺伝子は、単離され、ヒト抗体産生のためにさらに加工することができる。この技術はＪｅｓｐｅｒｓ等により説明されている（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４年）１２：８９９〜９０３）。 The selected antigen is then used for panning screening to select phage that bind to the selected antigen. The selected phage displays a fully human antibody that recognizes the same epitope recognized by the initially selected non-human monoclonal antibody. Genes encoding both heavy and light chains can be isolated and further processed for human antibody production. This technique is described by Jespers et al. (Bio / Technology (1994) 12: 899-903).

抗ＧＡＶＥ１８抗体（例えばモノクローナル抗体）を、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によりＧＡＶＥ１８を単離するのに用いることができる。抗ＧＡＶＥ１８抗体は、天然ＧＡＶＥ１８を細胞から精製すること、および、宿主細胞で発現された組換えにより生産されたＧＡＶＥ１８を精製することを容易にすることができる。その上、ＧＡＶＥ１８タンパク質を（例えば細胞溶解産物または細胞上清で）検出し、ＧＡＶＥ１８タンパク質発現の量およびパターンを評価するのに、抗ＧＡＶＥ１８抗体を用いることができる。抗ＧＡＶＥ１８抗体を、臨床的な試験手順の一部として組織内のタンパク質レベルをモニターするのに診断的に用いることができ、例えば、所定の治療方式の有効性を決定することができる。抗体と検出可能な物質（後述する）とをカップリングすることにより検出を容易にすることができる。   Anti-GAVE18 antibodies (eg, monoclonal antibodies) can be used to isolate GAVE18 by standard techniques such as affinity chromatography or immunoprecipitation. Anti-GAVE18 antibodies can facilitate the purification of native GAVE18 from cells and the recombinantly produced GAVE18 expressed in host cells. Moreover, anti-GAVE18 antibodies can be used to detect GAVE18 protein (eg, in cell lysates or cell supernatants) and assess the amount and pattern of GAVE18 protein expression. Anti-GAVE18 antibodies can be used diagnostically to monitor protein levels in tissues as part of a clinical testing procedure, for example, to determine the effectiveness of a given treatment modality. Detection can be facilitated by coupling an antibody to a detectable substance (described later).

検出可能な標識
場合により、本発明の単離された核酸分子、本発明のポリペプチド、および本発明の抗体、同様に、このような成分の断片は、検出可能に標識することができる。適切な標識としては、酵素、蛍光団（例えば、蛍光団の例を挙げると、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド類の塩、特にＥｕ³⁺）、発色団、放射性同位体、キレート剤、色素、コロイド金、ラテックス粒子、リガンド（例えばビオチン）、生物発光物質、および化学発光剤が挙げられる。コントロールマーカーが用いられる場合、同じ標識または異なる標識を受容体およびコントロールマーカーに用いることができる。 Detectable labels Optionally, isolated nucleic acid molecules of the invention, polypeptides of the invention, and antibodies of the invention, as well as fragments of such components, can be detectably labeled. Suitable labels include enzymes, fluorophores (eg, fluorescent isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), Texas Red (TR), rhodamine, free or chelated lanthanide salts, to name examples of fluorophores, In particular, Eu ³⁺ ), chromophores, radioisotopes, chelating agents, dyes, colloidal gold, latex particles, ligands (eg biotin), bioluminescent materials, and chemiluminescent agents. Where control markers are used, the same label or different labels can be used for the receptor and the control marker.

放射性標識、例えば同位体³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、および¹⁸⁶Ｒｅを用いる場合、既知の現在利用可能な計数方法を用いることができる。標識が酵素である場合、現在利用されている当業界既知の比色分析技術、分光光度分析技術、蛍光分光光度分析技術、電流測定分析またはガス定量分析技術のいずれかにより検出を行うことができる。 Known when using radiolabels such as isotopes ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, ³⁶ Cl, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ⁵⁸ Co, ⁵⁹ Fe, ⁹⁰ Y, ¹²⁵ I, ¹³¹ I, and ¹⁸⁶ Re Currently available counting methods can be used. If the label is an enzyme, the detection can be performed by any of the colorimetric techniques known in the art, spectrophotometric techniques, fluorescent spectrophotometric techniques, amperometric analysis or quantitative gas analysis techniques currently used in the industry .

本発明に従って用いることができる標識の一例は、直接的な標識である。直接的な標識は、その天然状態で、肉眼で、または、光学フィルターおよび／または蛍光を強めるために適用された刺激（例えば紫外光）により容易に見ることができる物質と定義されている。本発明に従って用いることができる着色標識の例としては、金属性のゾル粒子、例えば、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４,３１３,７３４号）で説明されているような金ゾル粒子；色素ゾル粒子、例えばＧｒｉｂｎａｕ等（米国特許第４,３７３,９３２号）およびＭａｙ等（ＷＯ８８／０８５３４）で説明されている；染色されたラテックス、例えば、上述のＭａｙ、Ｓｎｙｄｅｒ（欧州特許公開第０２８０５５９号および第０２８１３２７号で説明されている）；または、Ｃａｍｐｂｅｌｌ等（米国特許第４,７０３,０１７号）で説明されたようなリポソームに封入された色素、が挙げられる。その他の直接的な標識としては、放射性ヌクレオチド、蛍光成分、または、発光成分が挙げられる。これらの直接的な標識手段に加えて、酵素を含む間接的な標識も本発明に従って用いることができる。イムノアッセイ関連の様々なタイプの酵素が当業界周知であり、例えば、アルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼが挙げられ、これら酵素およびその他の酵素は、Ｅｖａ ＥｎｇｖａｌｌによりＥｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ＥＭＩＴ［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７０．４１９〜４３９，１９８０年］、および米国特許第４,８５７,４５３号で詳細に考察されている。   An example of a label that can be used according to the present invention is a direct label. Direct labeling is defined as a substance that is readily visible in its natural state, with the naked eye, or with an optical filter and / or stimulus (eg, ultraviolet light) applied to enhance fluorescence. Examples of colored labels that can be used in accordance with the present invention include metallic sol particles such as gold sol particles as described in Leuvering (US Pat. No. 4,313,734); dye sol particles such as Gribnau et al. (U.S. Pat. No. 4,373,932) and May et al. (WO 88/08534); dyed latexes such as the above-mentioned May, Snyder (European Patent Publication Nos. 0280559 and 0281327). Or dyes encapsulated in liposomes as described in Campbell et al. (US Pat. No. 4,703,017). Other direct labels include radioactive nucleotides, fluorescent components, or luminescent components. In addition to these direct labeling means, indirect labels including enzymes can also be used according to the present invention. Various types of enzymes related to immunoassays are well known in the art, including alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, lysozyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, urease, and these and other enzymes include It is discussed in detail by Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA and EMI [Methods in Enzymology, 70.419-439, 1980] and US Pat. No. 4,857,453.

本発明で使用できるその他の標識としては、磁気ビーズ、または、磁気共鳴イメージング標識が挙げられる。   Other labels that can be used in the present invention include magnetic beads or magnetic resonance imaging labels.

他の実施形態において、³²Ｐで標識するために、リン酸化部位を単離された本発明のポリペプチド、本発明の抗体、または、それらの断片に作製することができ、例えば、Ｓｉｄｎｅｙ Ｐｅｓｔｋａの欧州特許第０３７２７０７号（出願番号８９３１１１０８．８）、または、１０月１７日１９９５年に発行されたＦｏｘｗｅｌｌ等の米国特許第５,４５９,２４０号で説明されている。 In other embodiments, phosphorylation sites can be generated in isolated polypeptides of the invention, antibodies of the invention, or fragments thereof for labeling with ³² P, eg, from Sidney Pestka. EP 0 372 707 (application number 89311108.8) or Foxwell et al. US Pat. No. 5,459,240 issued Oct. 17, 1995.

本明細書において例示したように、抗体などのタンパク質は、代謝標識により標識することができる。代謝標識は、インビトロで、代謝標識（例えば［³⁵Ｓ］−メチオニンまたは［³²Ｐ］−オルトホスフェート）を添加した培地の存在下で、タンパク質を発現する細胞をインキュベートする際に起こる。［³⁵Ｓ］−メチオニンを用いた代謝（または生合成）標識に加えて、本発明はさらに、［¹⁴Ｃ］−アミノ酸および［³Ｈ］−アミノ酸での標識（不安定ではない位置でのトリチウム置換を伴う）も意図する。 As exemplified herein, proteins such as antibodies can be labeled with metabolic labels. Metabolic labeling occurs when incubating cells expressing proteins in vitro in the presence of a medium supplemented with a metabolic label (eg, [ ³⁵ S] -methionine or [ ³² P] -orthophosphate). In addition to metabolic (or biosynthetic) labeling with [ ³⁵ S] -methionine, the present invention further provides labeling with [ ¹⁴ C] -amino acids and [ ³ H] -amino acids (tritium at non-labile positions). With substitution).

組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のその他の観点は、ＧＡＶＥ１８（またはそれらの部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。上記で例示したように、ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲート可能な環状二本鎖化ＤＮＡループを意味する。ベクターのその他のタイプはウイルスベクターであり、この場合、追加のＤＮＡセグメントはそのウイルスゲノムにライゲートさせることができる。特定のベクターは、宿主細胞において自発的な複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムへ統合され、それにより宿主ゲノムと共に複製される。その上、特定のベクター、発現ベクターは、ベクターに操作可能に結合した遺伝子を発現させるように仕向けることができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド（ベクター）の形態である。しかしながら、本発明は、このような他の形態の発現ベクター、例えば同等の機能を提供するウイルスベクター（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むこととする。 Recombinant expression vectors and host cells Another aspect of the present invention relates to vectors, preferably expression vectors, comprising nucleic acids encoding GAVE18 (or portions thereof). As illustrated above, one type of vector is a “plasmid”, which means a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated to the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) are integrated into the genome of the host cell upon introduction into the host cell, and are thereby replicated along with the host genome. In addition, specific vectors, expression vectors can be directed to express genes operably linked to the vector. In general, expression vectors useful in recombinant DNA technology are often in the form of plasmids (vectors). However, the present invention is intended to include such other forms of expression vectors, eg, viral vectors that provide equivalent function (eg, replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses).

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸発現に適切な形態で本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択された１またはそれ以上の調節配列が、発現しようとする核酸に操作可能に結合した状態で含まれるを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に結合した」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能な様式で（例えば、インビボでの転写／翻訳系において、または、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞において）調節配列に結合していることを意味することとする。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むこととする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，アカデミックプレス，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）］に説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を導くような配列（例えば組織特異的な調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換され得る宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベルなどのファクターに依存し得ることは当業者であれば明白である。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に導入することができ、それにより、本明細書において説明される核酸（例えばＧＡＶＥ１８タンパク質、ＧＡＶＥ１８の突然変異体、融合タンパク質など）によりコードされたタンパク質またはペプチドを生産することができる。   The recombinant expression vector of the present invention comprises the nucleic acid of the present invention in a form suitable for nucleic acid expression in a host cell. This means that the recombinant expression vector includes one or more regulatory sequences selected based on the host cell used for expression, operably linked to the nucleic acid to be expressed. Within a recombinant expression vector, “operably linked” refers to the nucleotide sequence of interest in a manner that allows expression of the nucleotide sequence (eg, in an in vivo transcription / translation system or when the vector is a host cell). When introduced into, it means to be bound to a regulatory sequence (in the host cell). The term “regulatory sequence” is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (eg, polyadenylation signals). Such regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Emmology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. Regulatory sequences include sequences that direct constitutive expression of the nucleotide sequence in many types of host cells (eg, tissue-specific regulatory sequences). It will be apparent to those skilled in the art that the design of the expression vector can depend on factors such as the choice of host cells that can be transformed and the level of expression of the desired protein. An expression vector of the invention can be introduced into a host cell, thereby allowing a protein or peptide encoded by a nucleic acid described herein (eg, a GAVE18 protein, a mutant of GAVE18, a fusion protein, etc.). Can be produced.

原核または真核細胞、例えば細菌細胞、例えばＥ．Ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いた）、酵母細胞または哺乳動物細胞において、本発明の組換え発現ベクターをＧＡＶＥ１８の発現のために設計することができる。適切な宿主細胞は、上述したＧｏｅｄｄｅｌにおいてさらに考察されている。あるいは、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼのようなファージの調節要素およびタンパク質を用いて組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することができる。   Prokaryotic or eukaryotic cells such as bacterial cells such as E. coli. The recombinant expression vector of the present invention can be designed for the expression of GAVE18 in E. coli, insect cells (using baculovirus expression vectors), yeast cells or mammalian cells. Suitable host cells are further discussed in Goeddel, supra. Alternatively, recombinant expression vectors can be transcribed and translated in vitro using T7 promoter regulatory sequences and phage regulatory elements and proteins such as T7 polymerase.

原核におけるタンパク質発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは、それがコードするタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加させる。一般的に、このような融合ベクターは、以下の３つの目的の役に立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の溶解性を高めること；および、３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合成分と組換えタンパク質との結合部分にタンパク質分解の開裂部位を導入し、組換えタンパク質を融合成分から分離し、続いて融合タンパク質を精製することができる。このような酵素およびそれらの同種の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。一般的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（ファルマシアバイオテク社：Ｓｍｉｔｈ等，Ｇｅｎｅ（１９８８年）６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴＳ（ファルマシア，ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは、それぞれグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる。   Protein expression in prokaryotes most often involves E. coli having a vector containing a constitutive or inducible promoter that directs the expression of either a fusion protein or a non-fusion protein. performed in E. coli. A fusion vector adds a number of amino acids to the protein it encodes, usually at the amino terminus of the recombinant protein. In general, such fusion vectors serve the following three purposes: 1) increasing the expression of the recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) in affinity purification. Assisting in the purification of recombinant proteins by acting as ligands. Often, in fusion expression vectors, a proteolytic cleavage site can be introduced at the junction of the fusion component and the recombinant protein to separate the recombinant protein from the fusion component and subsequently purify the fusion protein. Such enzymes and their cognate recognition sequences include Factor Xa, thrombin and enterokinase. Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech: Smith et al., Gene (1988) 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) And pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ) Which fuses glutathione 5-transferase (GST), maltose E binding protein or protein A, respectively, to the target recombinant protein.

適切な誘導性非融合Ｅ．Ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｍ等，Ｇｅｎｅ（１９８８年）６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミックプレス，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）１８５：６０〜８９］）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。   Suitable inducible non-fused E. Examples of E. coli expression vectors include pTrc (Amam et al., Gene (1988) 69: 301-315) and pET11d (Studer et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA 18 (90) : 60-89]). Target gene expression from the pTrc vector relies on host RNA polymerase transcription from a hybrid trp-lac fusion promoter.

Ｅ．ｃｏｌｉで組換えタンパク質発現を最大化する１つの方法は、タンパク質を組換えタンパク質をタンパク質分解により開裂させる能力が欠損した宿主細菌中で発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミックプレス，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９０年）１８５：１１９〜１２８］）。   E. One method for maximizing recombinant protein expression in E. coli is to express the protein in a host bacterium that lacks the ability to proteolytically cleave the recombinant protein (Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185: 119-128]).

他の方法は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで優先的に利用されるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９２年）２０：２１１１〜２１１８）。このような本発明の核酸配列の改変を、標準的なＤＮＡ合成技術で行うことができる。   Another method is that the individual codons of each amino acid are E. coli. modification of the nucleic acid sequence of the nucleic acid inserted into the expression vector to be preferentially used in E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res (1992) 20: 2111-2118). Such modification of the nucleic acid sequence of the present invention can be performed by standard DNA synthesis techniques.

他の実施形態において、ＧＡＶＥ１８発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８２年）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等，Ｇｅｎｅ（１９８７年）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロ
ジェン社、サンディエゴ，カリフォルニア州）、およびｐＰｉｃＺ（インビトロジェン社、サンディエゴ，カリフォルニア州）。 In other embodiments, the GAVE18 expression vector is a yeast expression vector. Yeast S. Examples of vectors for expression in C. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933-943), pJRY88 (Schultz) Et al., Gene (1987) 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), And pPicZ (Invitrogen, San Diego, Calif.).

あるいは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中でＧＡＶＥ１８を発現させることができる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ（１９８３年）３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９年）１７０：３１〜３９）が挙げられる。 Alternatively, GAVE18 can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors. Examples of baculovirus vectors that can be used for protein expression in cultured insect cells (eg, Sf9 cells) include the pAc series (Smith et al., Mol Cell).
Biol (1983) 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow et al., Virology (1989) 170: 31-39).

さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：１８７〜１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルス調節要素により提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から誘導される。原核および真核細胞の両方にその他の適切な発現系については、上述したＳａｍｂｒｏｏｋ等の１６および１７章を参照。   In yet other embodiments, the nucleic acids of the invention are expressed in mammalian cells using mammalian expression vectors. Examples of mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187-195). When used in mammalian cells, the expression vector's control functions are often provided by viral regulatory elements. For example, commonly used promoters are derived from polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus and simian virus 40. For other suitable expression systems for both prokaryotic and eukaryotic cells, see Sambrook et al., Chapters 16 and 17 above.

他の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸を発現させることができる（例えば組織特異的な調節要素が核酸を発現させるのに用いられる）。組織特異的な調節要素は当業界既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８７年）１：２６８〜２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ等，Ａｄｖ Ｉｍｎｕｎｏｌ（１９８８年）４３：２３５〜２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８９年）８：７２９〜７３３）、および、免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ等，Ｃｅｌｌ（１９８３年）３３：７２９〜７４０；Ｑｕｅｅｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８３年）３３：７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９年）８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２３０：９１２〜９１６）、および、乳腺特異的プロモーター（例えばミルクホエイプロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号および欧州出願公報第２６４,１６６号）が挙げられる。発育上調節されるプロモーターはまた、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：３７４〜３７９）、および、α−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ等，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ（１９８９年）３：５３７〜５４６）も含む。   In other embodiments, the recombinant mammalian expression vectors are capable of preferentially expressing nucleic acids in specific cell types (eg, tissue-specific regulatory elements are used to express nucleic acids). Tissue specific regulatory elements are known in the art. Non-limiting examples of suitable tissue specific promoters include albumin promoters (liver specific; Pinkert et al., Genes Dev (1987) 1: 268-277), lymph specific promoters (Callame et al., Adv Immunol (1988) Year) 43: 235-275), in particular the T cell receptor promoter (Winoto et al., EMBO J (1989) 8: 729-733), and immunoglobulin (Banerji et al., Cell (1983) 33: 729- 740; Queen et al., Cell (1983) 33: 741-748), neuron specific promoters (eg, neurofilament promoters; Byrne et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 5473-5477. , Pancreas-specific promoters (Edlund et al., Science (1985) 230: 912-916), and mammary gland specific promoters (eg, milk whey promoter; US Pat. No. 4,873,316 and European Application Publication No. 264,166). Issue). Developmentally regulated promoters are also, for example, the mouse hox promoter (Kessel et al., Science (1990) 249: 374-379) and the alpha-fetoprotein promoter (Campes et al., Genes Dev (1989) 3: 537-546). ) Is also included.

本発明は、さらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。これは、ＤＮＡ分子が、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現が可能な様式（ＤＮＡ分子の転写により）で調節配列に操作可能に結合していることである。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に操作可能に結合した調節配列としては、多様な細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を導く調節配列を選択することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な組織特異的または細胞型特異的発現を導くウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態が可能であり、これらにおいて、高効率の調節領域の制御下でアンチセンス核酸が生産され、その活性をベクターが導入された細胞型により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察に関しては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１巻（１）１９８６年］）を参照。   The invention further provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule of the invention cloned into the expression vector in the antisense orientation. This is because the DNA molecule is operably linked to regulatory sequences in a manner that allows expression of an RNA molecule that is antisense to GAVE18 mRNA (by transcription of the DNA molecule). As a regulatory sequence operably linked to a nucleic acid cloned in the antisense orientation, a regulatory sequence that leads to continuous expression of the antisense RNA molecule in a variety of cell types can be selected. For example, viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences that direct constitutive tissue-specific or cell-type specific expression of antisense RNA can be selected. Antisense expression vectors can be in the form of recombinant plasmids, phagemids or attenuated viruses, in which antisense nucleic acids are produced under the control of highly efficient regulatory regions and the activity of the cells into which the vector has been introduced. Can be determined by type. See Weintraub et al. (Reviews-Trends [Genetics, Vol. 1 (1) 1986]) for a discussion of the regulation of gene expression using antisense genes.

本発明の他の観点は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に用いられる。このような用語が、特定の対象となる細胞を意味するのではなく、このような細胞の後代または可能性のある後代を意味することが理解される。突然変異または環境的影響のいずれかのために特定の改変が後続の世代に生じる可能性があるため、このような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それもまた本発明で用いられる用語の範囲内に含まれる。   Another aspect of the present invention relates to a host cell into which the recombinant expression vector of the present invention has been introduced. The terms “host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably herein. It is understood that such terms do not mean a particular subject cell, but rather a progeny or potential progeny of such a cell. Such progeny may not actually be identical to the parental cell because certain modifications may occur in subsequent generations, either due to mutations or environmental effects, It is also included within the scope of terms used in the present invention.

宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれでも可能である。例えばＧＡＶＥ１８タンパク質は、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞またはＣＯＳ細胞）で発現させることができる。他の適切な宿主細胞が、当業者既知である。ベクターＤＮＡを通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞に導入することができる。本発明で用いられる用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当業界で認められる技術を意味することとし、該技術としては例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、変換、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションがある。   The host cell can be either prokaryotic or eukaryotic. For example, GAVE18 protein is a bacterial cell such as E. coli. It can be expressed in E. coli, insect cells, yeast or mammalian cells (eg Chinese hamster ovary cells (CHO), 293 cells or COS cells). Other suitable host cells are known to those skilled in the art. Vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells via conventional transformation or transfection techniques. The terms “transformation” and “transfection” as used in the present invention shall mean various art-recognized techniques for introducing foreign nucleic acid (eg, DNA) into a host cell, including, for example, Calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, conversion, DEAE dextran mediated transfection, lipofection or electroporation.

哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関して、用いられた発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞のほんの一部が、外来ＤＮＡをゲノムに組み入れる可能性があるが知られている。このような組み入れ体を同定および選択するために、選択マーカー（例えば抗生物質耐性に関する）をコードする遺伝子が、一般的に、対象の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸の宿主細胞への導入は、ＧＡＶＥ１８をコードしたのと同じベクター上になされてもよいし、または、別々のベクターになされてもよい。導入核酸で安定してトランスフェクトされた細胞を、薬剤選択により同定することができる（例えば選択マーカー遺伝子を取り込ませた細胞は生き残り、一方で他の細胞は死滅する）。   With respect to stable transfection of mammalian cells, it is known that depending on the expression vector and transfection technique used, only a fraction of the cells may incorporate foreign DNA into the genome. In order to identify and select such integrants, a gene that encodes a selectable marker (eg, for resistance to antibiotics) is generally introduced into the host cells along with the gene of interest. Preferred selectable markers include markers that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate. Introduction of the nucleic acid encoding the selectable marker into the host cell may be on the same vector that encoded GAVE18 or may be on a separate vector. Cells stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg, cells that have incorporated the selectable marker gene survive while other cells die).

本発明の宿主細胞、例えば培養された原核または真核性宿主細胞を、ＧＡＶＥ１８タンパク質を生産（すなわち発現）させるのに用いることができる。従って、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を用いたＧＡＶＥ１８タンパク質生産方法を提供する。一実施形態において、該方法は、本発明の宿主細胞（ＧＡＶＥ１８をコードする組換え発現ベクターが導入された）をＧＡＶＥ１８タンパク質が生産されるように適切な培地で培養することを含む。他の実施形態において、該方法はさらに培地または宿主細胞からＧＡＶＥ１８を単離することを含む。   Host cells of the invention, such as cultured prokaryotic or eukaryotic host cells, can be used to produce (ie, express) GAVE18 protein. Therefore, the present invention further provides a method for producing GAVE18 protein using the host cell of the present invention. In one embodiment, the method comprises culturing a host cell of the invention (introduced with a recombinant expression vector encoding GAVE18) in a suitable medium so that the GAVE18 protein is produced. In other embodiments, the method further comprises isolating GAVE18 from the medium or the host cell.

他の実施形態において、ＧＡＶＥ１８は、改変発現ベクターにサブクローニングされたその他のタンパク質の組換え発現のための誘導性の発現系を含む。例えば、突然変異Ｇタンパク質を含む宿主細胞（例えば、酵母細胞、Ｙ２副腎皮質細胞およびｃｙｃ^-Ｓ４９、米国特許第６,１６８,９２７号（Ｂ１）、第５,７３９,０２９号および第５,４８２,８３５号；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９（１９）：８９３３〜３７、および、Ｋａｔａｄａ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４年）２５９（６）：３５８６〜９５を参照）に、ＧＡＶＥ１８をコードする核酸配列を含む第一の発現ベクターが導入され、前記ＧＡＶＥ１８が宿主細胞で機能的に発現する。発現したＧＡＶＥ１８が構成的に活性であるにもかかわらず、突然変異体はシグナル伝達を起こすことができない；すなわち、下流のカスケードに向けられたＧタンパク
質の活性化が起こらない（例えば、アデニリルシクラーゼの活性化が起こらない）。その後、第二の発現ベクターをを用いて、ＧＡＶＥ１８を含む宿主細胞を導入する。第二のベクターは、宿主細胞のＧタンパク質の突然変異（すなわち、機能的な哺乳動物または酵母のＧ_s、Ｇ_i、Ｇ₀、またはＧ_q、例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／４８８２０；米国特許第６,１６８,９２７号（Ｂ１）、第５,７３９,０２９号および第５,４８２,８３５号を参照）に相補的な構造遺伝子、それに加えて、誘導系で発現され得る対象の遺伝子を含む。 In other embodiments, GAVE18 comprises an inducible expression system for recombinant expression of other proteins subcloned into the modified expression vector. For example, host cells containing a mutant G protein (eg, yeast cells, Y2 adrenocortical cells and cyc ^- S49, US Pat. Nos. 6,168,927 (B1), 5,739,029 and 5,482). Mitchell et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89 (19): 8933-37 and Katada et al., J Biol Chem (1984) 259 (6): 3586-95), A first expression vector comprising a nucleic acid sequence encoding GAVE18 is introduced and said GAVE18 is functionally expressed in a host cell. Despite the constitutive activity of expressed GAVE18, the mutant is unable to signal; that is, no activation of G protein directed to the downstream cascade (eg, adenylyl). Cyclase activation does not occur). Thereafter, a host cell containing GAVE18 is introduced using the second expression vector. The second vector is a mutation of the host cell G protein (ie, a functional mammalian or yeast G _s , G _i , G ₀ , or G _q , eg, PCT Publication No. WO 97/48820; US Pat. 6,168,927 (B1), see 5,739,029 and 5,482,835), in addition to the gene of interest that can be expressed in the induction system .

第二のベクターの相補的な構造遺伝子は、誘導性である；すなわち、外的に付加された成分（例えば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、低分子物質など、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照）の制御下で、前記相補的な構造遺伝子に操作可能に結合したプロモーターを活性化する。誘導物質を加えると、前記相補的な構造遺伝子によりコードされるタンパク質が機能的に活性化され、構成的に活性なＧＡＶＥ１８が複合体を形成し、適切な下流経路の活性化（例えば第２メッセンジャー形成）をもたらす。第二のベクターを含む対象の遺伝子は、操作可能に連結したプロモーターを含み、このプロモーターは適切な第２メッセンジャー（例えば、ＣＲＥＢ、ＡＰＩ要素）により活性化される。従って、第２メッセンジャーが蓄積すると、対象の遺伝子の上流にあるプロモーターが活性化され、前記遺伝子の産物が発現される。誘導物質が存在しない場合は、対象の遺伝子の発現は停止する。   The complementary structural gene of the second vector is inducible; that is, under the control of an externally added component (eg, tetracycline, IPTG, low molecular weight material, see Sambrook et al. Above), A promoter operably linked to the complementary structural gene is activated. When an inducer is added, the protein encoded by the complementary structural gene is functionally activated and constitutively active GAVE18 forms a complex that activates the appropriate downstream pathway (eg, second messenger). Formation). The gene of interest, including the second vector, includes an operably linked promoter that is activated by an appropriate second messenger (eg, CREB, API element). Therefore, when the second messenger accumulates, the promoter upstream of the gene of interest is activated and the gene product is expressed. If no inducer is present, the expression of the gene of interest stops.

好ましい実施形態において、誘導性の発現系のための宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｓ４９（ｃｙｃ^-）細胞が挙げられる。細胞系がＧタンパク質の突然変異体を含むように考慮すれば、適切な突然変異体を人工的に生産／構築することができる（酵母細胞については、米国特許第６,１６８,９２７号（Ｂ１）、第５,７３９,０２９号および第５,４８２,８３５号を参照）。 In a preferred embodiment, host cells for the inducible expression system include, but are not limited to, S49 (cyc ⁻ ) cells. Considering that the cell line contains a G protein mutant, an appropriate mutant can be artificially produced / constructed (for yeast cells, see US Pat. No. 6,168,927 (B1)). ), 5,739,029 and 5,482,835).

関連する観点において、細胞に、配列番号２に記載のタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡに操作可能に結合したベクターがトランスフェクトされる。前記系を含む第一および第二のベクターは、これらに限定されないが、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：１８７〜１９５）、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ等，ＥＭＢＯ Ｊ（１９８７年）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ等，Ｃｅｌｌ（１９８２年）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ等，Ｇｅｎｅ（１９８７年）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社、サンディエゴ，カリフォルニア州）およびｐＰｉｃＺ（インビトロジェン社、サンディエゴ，カリフォルニア州）を含むように考慮される。   In a related aspect, the cell is transfected with a vector operably linked to a cDNA comprising a sequence encoding the protein set forth in SEQ ID NO: 2. The first and second vectors comprising the system include, but are not limited to, pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187-195) PYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54: 113- 123), pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) and pPicZ (Invitrogen, San Diego, CA).

関連する観点において、トランスフェクションにより機能的なＧＡＶＥ１８タンパク質の発現が生じるような適切な手段で、宿主細胞をトランスフェクトしてもよい（例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、および、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ニューヨーク州，１９９０年）。このような「機能的タンパク質」としては、これらに限定されないが、発現されればＧタンパク質との複合体を形成するタンパク質が挙げられ、この場合、前記Ｇタンパク質は第２メッセンジャーの形成を調節する。本発明で用いることができる宿主細胞をトランスフェクトさせるその他の方法としては、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、変換、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体が挙げられる（例えば、Ｗｕ等，１９９２年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ＷｕおよびＷｕ，１９８８年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４；１９９０年３月１５日に出願されたＨａｒｔｍｕｔ等のカナダ国特許出願第２,０１２,３１１号を参照）。   In a related aspect, host cells may be transfected by suitable means such that transfection results in the expression of a functional GAVE18 protein (eg, Sambrook et al., And Kriegler, Gene Transfer and Expression described above: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, New York, 1990). Such “functional proteins” include, but are not limited to, proteins that, when expressed, form a complex with the G protein, where the G protein regulates the formation of a second messenger. . Other methods of transfecting host cells that can be used in the present invention include, but are not limited to, transfection, electroporation, microinjection, conversion, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, lipofection (lysosomal fusion). ), Use of gene guns, or DNA vector transporters (eg, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; see Hartmut et al., Canadian Patent Application 2,012,311 filed March 15, 1990).

多種多様のプロモーターが本発明で用いられる。実際には、本発明のポリペプチドの発現は、当業界既知のあらゆるプロモーター／エンハンサー要素により制御することができるが、これら調節要素は、発現に関して選択された宿主において機能的でなければならない。   A wide variety of promoters are used in the present invention. In practice, expression of the polypeptides of the invention can be controlled by any promoter / enhancer element known in the art, but these regulatory elements must be functional in the host selected for expression.

ＧＡＶＥ１８発現を制御するのに用いることができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１年，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ等，１９８０年，Ｃｅｌｌ２２：７８７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等，１９８２年，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９〜４２）；原核性の発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７〜３７３１）、または、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等，１９８３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１〜２５）；また、「Ｕｓｅｆｕｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０年，２４２：７４〜９４）も参照；酵母またはその他の菌類からのプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および、組織特異性を示しトランスジェニック動物で利用されている動物の転写制御領域：膵臓の腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ３８：６３９〜６４６；Ｏｒｎｉｔｚ等，１９８６年，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７年，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５〜５１５）；膵臓のβ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５〜１２２）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ３８：６４７〜６５８；Ａｄａｍｅｓ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３〜５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等，１９８７年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６〜１４４４）、精巣、***、リンパ球系および肥満細胞で活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ４５：４８５〜４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ等，１９８７年，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜２７６）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ等，１９８５年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８；Ｈａｍｍｅｒ等，１９８７年，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：５３〜５８）、肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ等，１９８７年，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜１７１）、骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８〜３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ４６：８９〜９４）、脳の希突起膠細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ等，１９８７年，Ｃｅｌｌ４８：７０３〜７１２）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３〜２８６）、および、視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ等，１９８６年，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２〜１３７８）が挙げられる。   Promoters that can be used to control GAVE18 expression include, but are not limited to, the SV40 early promoter region (Benoist and Chamber, 1981, Nature 290: 304-310), the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus. Included promoter (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), metallothionein Regulatory sequences of genes (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); prokaryotic expression vectors such as the β-lactamase promoter (Villa-Kam Roff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731, or the tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 80: 21-25); see also “Useful Proteins from recombinant bacteria” (Scientific American, 1980, 242: 74-94); promoter elements from yeast or other fungi such as the Gal4 promoter, ADC ( (Alcohol dehydrogenase) promoter, PGK (phosphoglycerol kinase) promoter, alkaline phosphatase promoter; and are used in transgenic animals showing tissue specificity Transcriptional control region of animals: Elastase I gene control region active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); Insulin gene regulatory region active in pancreatic β cells (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), immunoglobulin gene active active in lymphoid cells Region (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), mouse mammary carcinoma virus control region active in testis, breast, lymphoid and mast cells (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495), albumin gene control region active in liver (Pinkert) Et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), α-fetoprotein gene regulatory region active in the liver (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987). , Science 235: 53-58), α1-antitrypsin gene regulatory region active in liver (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), β-globin gene regulatory region active in bone marrow cells (Mogram) Etc., 1 85, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94), myelin basic protein gene regulatory region active in brain oligodendrocytes (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712). ), Myosin light chain-2 gene regulatory region active in skeletal muscle (Sani, 1985, Nature 314: 283-286), and gonadotropin releasing hormone gene regulatory region active in the hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

本発明の核酸分子を含む発現ベクターは、以下の４つの一般的な方法によって同定することができる：（ａ）望ましいプラスミドＤＮＡまたは特異的なｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在または非存在
、および（ｄ）挿入された配列の発現。第一の方法において、核酸をＰＣＲで増幅させ、増幅産物を検出することができる。第二の方法において、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子に相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第三の方法において、外来遺伝子のベクターへの挿入により生じる特定の「選択マーカー」の遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の存在または非存在に基づき、組換えベクター／宿主系を同定し選択することができる。その他の例において、ＧＡＶＥ１８タンパク質、それらの変異体、またはそれらの類似体もしくは誘導体をコードする核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、ＧＡＶＥ１８遺伝子機能の非存在により同定することができる。第四の方法において、組換え発現ベクターは、組換えにより発現された遺伝子産物の活性、生化学的、または免疫学的な特徴を分析することによって同定することができるが、ただしこれは、発現されたタンパク質が機能的に活性なコンフォメーションであると仮定する場合である。 Expression vectors containing the nucleic acid molecules of the invention can be identified by the following four general methods: (a) PCR amplification of the desired plasmid DNA or specific mRNA, (b) nucleic acid hybridization, (c) ) Presence or absence of selectable marker gene function, and (d) expression of the inserted sequence. In the first method, the nucleic acid can be amplified by PCR, and the amplification product can be detected. In the second method, the presence of a foreign gene inserted into an expression vector can be detected by nucleic acid hybridization using a probe containing a sequence homologous to the inserted marker gene. In the third method, the gene function of a specific “selection marker” resulting from the insertion of a foreign gene into a vector (eg, β-galactosidase activity, thymidine kinase activity, resistance to antibiotics, transformation phenotype, baculovirus Recombinant vectors / host systems can be identified and selected based on the presence or absence of inclusion bodies in In other examples, when a nucleic acid encoding a GAVE18 protein, a variant thereof, or an analog or derivative thereof is inserted into the “selectable marker” gene sequence of the vector, the recombinant containing the insert is GAVE18 It can be identified by the absence of gene function. In the fourth method, recombinant expression vectors can be identified by analyzing the activity, biochemical, or immunological characteristics of the gene product expressed recombinantly, provided that This is the case when it is assumed that the produced protein is in a functionally active conformation.

本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体のセグメント、非染色体のセグメント、および、合成ＤＮＡ配列で構成されていてもよい。適切なベクターとしては、ＳＶ４０誘導体、および、既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドのｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ等，１９８８年，Ｇｅｎｅ６７：３１〜４０）、ｐＭＢ９、および、それらの誘導体、プラスミド、例えばＲＰ４；ファージＤＮＡＳ、例えば、多数のファージλ誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および、その他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、および、線維状一本鎖化ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミドまたはそれらの誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから得られたベクター、例えばファージＤＮＡまたはその他の発現制御配列を用いるために改変されたプラスミド；などが挙げられる。   A wide variety of host / expression vector combinations may be used to express the DNA sequences of this invention. For example, useful expression vectors may be composed of chromosomal segments, non-chromosomal segments, and synthetic DNA sequences. Suitable vectors include SV40 derivatives and known bacterial plasmids, such as E. coli plasmids colE1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., 1988, Gene 67: 31-40), pMB9, And derivatives thereof, plasmids, such as RP4; phage DNAS, such as a number of phage λ derivatives, such as NM989, and other phage DNA, such as M13, and filamentous single-stranded phage DNA; yeast plasmids A vector useful in eukaryotic cells, such as a vector useful in insect or mammalian cells; a vector obtained from a combination of a plasmid and phage DNA, such as phage DNA or Plasmids modified to use other expression control sequences; and the like.

例えば、バキュロウイルス発現系においては、非融合トランスファーベクター、例えば、これらに限定されないが、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨＩクローニング部位；サマーズ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＰｓｔＩクローニング部位；インビトロジェン）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位；サマーズおよびインビトロジェン）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、青／白組換え体スクリーニングが可能；インビトロジェン）、ならびに、融合トランスファーベクター、例えば、これらに限定されないが、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩクローニング部位（ＢａｍＨＩ認識部位は開始コドンで始まる）；サマーズ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じであるが、異なるリーディングフレームを有する）、ｐＡｃ３６０（ＢａｍＨＩクローニング部位はポリヘドリン開始コドンの３６塩基対下流；インビトロジェン（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製およびプラークの青／白組換え体スクリーニングのためのＮ末端ペプチドを含む３つの異なるリーディングフレーム；インビトロジェン（２２０））のいずれも用いることができる。   For example, in baculovirus expression systems, non-fusion transfer vectors such as, but not limited to, pVL941 (BamHI cloning site; Summers), pVL1393 (BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII, and PstI cloning Sites; Invitrogen), pVL1392 (BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, and BamHI cloning sites; Summers and Invitrogen), and pBlueBacIII (BamHI, BglII, PstI, NcoI, and HindIII cloning sites Recombinant screening is possible; Invitrogen), and fusion transfer vectors PAc700 (BamHI and KpnI cloning sites (BamHI recognition site begins at the start codon); Summers), pAc701 and pAc702 (same as pAc700 but with different reading frames), but not limited to, (The BamHI cloning site is 36 base pairs downstream of the polyhedrin start codon; Invitrogen (195)), and pBlueBacHisA, B, C (BamHI, BglII, PstI, NcoI, and HindIII cloning sites, ProBond purification and plaque blue / white recombination Any of three different reading frames including an N-terminal peptide for body screening; Invitrogen (220)) can be used.

本発明での使用が考えられる哺乳動物発現ベクターとしては、誘導性プロモーター、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターを含むベクター、例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターを有するあらゆる発現ベクター、またはＤＨＦＲ／メトトレキセート共増幅ベクター、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏ
ＲＩクローニング部位、クローニングされた遺伝子とＤＨＦＲとの両方を発現するベクターを有する；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６．１２（１９９１年）］を参照）が挙げられる。あるいは、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えばｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、このベクターは、グルタミンシンターゼとクローニングされた遺伝子とを発現する；セルテック）が挙げられる。他の実施形態において、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソームでの発現を指示するベクターを用いることができ、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネインＩｉａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー：インビトロジェン）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー；インビトロジェン）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカー；インビトロジェン）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、Ｎ末端ペプチドはＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を介して精製可能でありエンテロキナーゼで分解される；インビトロジェン）。本発明で用いられる選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；インビトロジェン）などが挙げられる。本発明に従って用いられるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（上述のＫａｕｆｍａｎ，１９９１年を参照）としては、これらに限定されないが、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が挙げられる。 Mammalian expression vectors contemplated for use in the present invention include vectors containing inducible promoters, such as dihydrofolate reductase (DHFR) promoters, such as any expression vector having a DHFR expression vector, or DHFR / methotrexate co-amplification vector, For example, pED (PstI, SalI, SbaI, SmaI, and Eco
RI cloning site, having a vector that expresses both the cloned gene and DHFR; see Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)]. Alternatively, a glutamine synthetase / methionine sulphoximine co-amplification vector, such as pEE14 (HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, and BclI cloning sites, this vector expresses glutamine synthase and the cloned gene; Celltech) Is mentioned. In other embodiments, vectors that direct episomal expression under the control of Epstein-Barr virus (EBV) can be used, such as pREP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, And KpnI cloning site, constitutive RSV-LTR promoter, hygromycin selectable marker; Invitrogen), pCEP4 (BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, and KpnI cloning site, constitutive hCMV immediate early gene, Hygromycin selectable marker; Invitrogen), pMEP4 (KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI Kroni Site, inducible metallothionein Iia gene promoter, hygromycin selectable marker: Invitrogen), pREP8 (BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI, and KpnI cloning sites, RSV-LTR promoter, histidinol selectable marker; Invitrogen), pREP9 (KpnI) , NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, and BamHI cloning sites, RSV-LTR promoter, G418 selectable marker; Invitrogen, and pEBVHis (RSV-LTR promoter, hygromycin selectable marker, N-terminal peptide via ProBond resin It can be purified and degraded with enterokinase; Invitrogen). Selectable mammalian expression vectors used in the present invention include pRc / CMV (HindIII, BstXI, NotI, SbaI, and ApaI cloning sites, G418 selection; Invitrogen), pRc / RSV (HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI cloning site, G418 selection; Invitrogen) and the like. Vaccinia virus mammalian expression vectors (see Kaufman, 1991, above) used in accordance with the present invention include, but are not limited to, pSC11 (SmaI cloning site, TK- and β-gal selection), pMJ601 (SalI, SmaI). , AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, and HindIII cloning sites; TK- and β-gal selection), and pTKgptF1S (EcoRI, PstI, SalI, AccI, HinDIII, SbaI, pHaB Cloning sites, TK or XPRT selection).

酵母発現系もまた、ＧＡＶＥ１８タンパク質、それらの変異体、またはそれらの類似体もしくは誘導体を発現させるのに本発明に従って用いることができる。例えば、２つだけ例を挙げると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；インビトロジェン）、または、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、Ｎ末端ペプチドはＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製されエンテロキナーゼで分解される；インビトロジェン）が本発明に従って使用可能である。   Yeast expression systems can also be used in accordance with the present invention to express GAVE18 proteins, variants thereof, or analogs or derivatives thereof. For example, to name just two examples, an unfused pYES2 vector (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI, and HindIII cloning sites; Invitrogen), or fused pYESHisA, B, C (XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI, and HindIII cloning sites, the N-terminal peptide is purified with ProBond resin and degraded with enterokinase; Invitrogen) can be used according to the present invention is there.

特定の組換えＤＮＡ分子が同定され単離されれば、当業界既知の数種の方法を用いてそれを増やすことができる。適切な宿主系および成長状態が確立されれば、組換え発現ベクターを大量に増やし製造することができる。これまでに述べたように、使用可能な発現ベクターとしては、これらに限定されないが、以下のベクターまたはそれらの誘導体が挙げ
られる：ヒトまたは動物ウイルス、例えばワクシニアウイルスまたはアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばλ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターなど。 Once a specific recombinant DNA molecule has been identified and isolated, it can be expanded using several methods known in the art. Once an appropriate host system and growth state is established, a large number of recombinant expression vectors can be produced. As previously mentioned, expression vectors that can be used include, but are not limited to, the following vectors or derivatives thereof: human or animal viruses such as vaccinia virus or adenovirus; insect viruses such as baculo Viruses; yeast vectors; bacteriophage vectors (eg, λ), and plasmid and cosmid DNA vectors.

加えて、宿主細胞系としては、挿入された配列の発現を調節するもの、または、特定の望ましい様式で遺伝子産物を改変および加工するものを選択することができる。それぞれの宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えばグリコシル化、分解［例えばシグナル配列］）に関する特徴的で特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセシングが確実になるように、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、非グリコシル化コアタンパク質産物を生産するためには、細菌系における発現が用いられる。   In addition, a host cell system may be chosen that modulates the expression of the inserted sequences, or that modifies and processes the gene product in a particularly desirable manner. Each host cell has characteristic and specific mechanisms for protein translation and post-translational processing and modification (eg, glycosylation, degradation [eg, signal sequences]). Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the desired modification and processing of the foreign protein expressed. For example, expression in bacterial systems is used to produce non-glycosylated core protein products.

トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いることができる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ１８をコードする配列が導入された受精した卵母細胞または胚幹細胞である。続いて、このような宿主細胞は、外来性ＧＡＶＥ１８配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または、内在性ＧＡＶＥ１８配列が改変された相同組換え動物を作製するのに用いることができる。このような動物は、ＧＡＶＥ１８の機能および／または活性を研究するため、および、ＧＡＶＥ１８活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書において用いられる「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、例えばラットまたはマウスであり、該動物の１またはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。 Transgenic animals The host cells of the invention can also be used to produce non-human transgenic animals. For example, in one embodiment, the host cell of the invention is a fertilized oocyte or embryonic stem cell into which a sequence encoding GAVE18 has been introduced. Subsequently, such host cells can be used to produce non-human transgenic animals in which exogenous GAVE18 sequences have been introduced into the genome, or homologous recombinant animals in which endogenous GAVE18 sequences have been modified. Such animals are useful for studying the function and / or activity of GAVE18 and for identifying and / or evaluating modulators of GAVE18 activity. As used herein, a “transgenic animal” is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a rodent, such as a rat or mouse, wherein one or more cells of the animal are transgenes. including. Other examples of transgenic animals include non-human primates, sheep, dogs, cows, goats, chickens, amphibians and the like.

「導入遺伝子」とは、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟した動物のゲノム中に残存する外来性ＤＮＡである。そのためにトランスジェニック動物の１またはそれ以上の細胞種または組織でコードされた遺伝子産物の発現が導かれる。本発明で用いられる「相同組換え動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、これら動物において、相同組換えによって内在性ＧＡＶＥ１８遺伝子が改変されている。この相同組換えは、動物の発生前に内在性遺伝子とその動物の細胞（例えばその動物の胚細胞）に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で達成される。   A “transgene” is an exogenous DNA that is integrated into the genome of a cell from which a transgenic animal develops and remains in the genome of a mature animal. This leads to the expression of the gene product encoded in one or more cell types or tissues of the transgenic animal. The “homologous recombinant animal” used in the present invention is a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a mouse, in which the endogenous GAVE18 gene has been altered by homologous recombination. This homologous recombination is achieved between the endogenous gene and the exogenous DNA molecule introduced into the animal's cells (eg, the animal's embryonic cells) prior to the animal's development.

本発明のトランスジェニック動物の作製は、上述したトランスフェクション技術のいずれかを用いてＧＡＶＥ１８をコードする核酸を受精した卵母細胞の精核に導入することにより行うことができる。続いて、偽妊娠のメス里親動物中で卵母細胞を成長させることができる。ＧＡＶＥ１８のｃＤＮＡ配列、例えば配列番号１の配列を、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ヒトＧＡＶＥ１８遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスＧＡＶＥ１８遺伝子をヒトＧＡＶＥ１８のｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づき単離することができ、導入遺伝子として用いることができる。導入遺伝子の発現効率を高めるために、導入遺伝子にイントロン配列およびポリアデニル化シグナルが含まれていてもよい。特定の細胞にＧＡＶＥ１８タンパク質を発現させるように、組織特異的調節配列をＧＡＶＥ１８導入遺伝子に操作可能に結合させることができる。特にマウスのような動物での胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を作製する方法は当業界で通常であり、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号および第４,８７０,００９号、米国特許第４,８７３,１９１号、ならびに、Ｈｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６年）で説明されている。ゲノムに導入遺伝子を有する
、および/または、組織または細胞でＧＡＶＥ１８ｍＲＮＡを発現するその他のトランスジェニック動物の作製には類似の方法が用いられる。続いて、トランスジェニックファウンダー動物を、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるのに用いることができる。その上、ＧＡＶＥ１８をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に育てることもできる。 The transgenic animal of the present invention can be prepared by introducing a nucleic acid encoding GAVE18 into the sperm nucleus of a fertilized oocyte using any of the transfection techniques described above. The oocytes can then be grown in pseudopregnant female foster animals. The cDNA sequence of GAVE18, for example the sequence of SEQ ID NO: 1, can be introduced as a transgene into the genome of a non-human animal. Alternatively, a non-human homologue of the human GAVE18 gene, such as the mouse GAVE18 gene, can be isolated based on hybridization to human GAVE18 cDNA and can be used as a transgene. In order to increase the expression efficiency of the transgene, the transgene may contain an intron sequence and a polyadenylation signal. Tissue specific regulatory sequences can be operably linked to the GAVE18 transgene so that specific cells express the GAVE18 protein. Methods for producing transgenic animals by embryo manipulation and microinjection, particularly in animals such as mice, are routine in the art, eg, US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009, US No. 4,873,191 and Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986). Similar methods are used to produce other transgenic animals that have a transgene in the genome and / or express GAVE18 mRNA in tissues or cells. Subsequently, the transgenic founder animals can be used to breed additional animals carrying the transgene. Moreover, transgenic animals having transgenes encoding GAVE18 can be further raised to other transgenic animals having other transgenes.

相同組換え動物を作製するために、ＧＡＶＥ１８遺伝子（例えばＧＡＶＥ１８遺伝子のヒトまたは非ヒト相同体、例えばマウスＧＡＶＥ１８遺伝子）の少なくとも部分を含み、ＧＡＶＥ１８遺伝子を改変（例えば機能的に破壊）するために欠失、付加または置換が導入されたベクターが製造される。好ましい実施形態において、相同組換えの際に、内在性ＧＡＶＥ１８遺伝子が機能的に破壊されるようにベクターを設計する（すなわち機能的なタンパク質がすでにコードされない；あるいは「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。   In order to create a homologous recombinant animal, it contains at least a portion of the GAVE18 gene (eg, a human or non-human homologue of the GAVE18 gene, eg, the mouse GAVE18 gene), and is lacking to modify (eg, functionally disrupt) the GAVE18 gene. Vectors into which deletions, additions or substitutions have been introduced are produced. In a preferred embodiment, the vector is designed such that upon homologous recombination, the endogenous GAVE18 gene is functionally disrupted (ie, no functional protein is already encoded; alternatively referred to as a “knockout” vector).

あるいは、相同組換えの際に、内在性ＧＡＶＥ１８遺伝子が突然変異するか、または改変されるが、それでも機能的なタンパク質がコードされるようにベクターを設計することができる（例えば上流の調節領域が改変され、それにより内在性ＧＡＶＥ１８タンパク質の発現を改変することができる）。   Alternatively, during homologous recombination, the endogenous GAVE18 gene is mutated or modified, but the vector can be designed such that it still encodes a functional protein (eg, upstream regulatory regions Modified, thereby altering the expression of the endogenous GAVE18 protein).

相同組換えベクターにおいて、ＧＡＶＥ１８遺伝子の改変された部分は、ＧＡＶＥ１８遺伝子の付加核酸配列により５’および３’末端の側に存在し、それにより、ベクターによりもたらされた外来性ＧＡＶＥ１８遺伝子と、胚幹細胞中の内在性ＧＡＶＥ１８遺伝子との間に相同組換えを起こすことができる。付加のフランキングＧＡＶＥ１８核酸配列は、内在性遺伝子での良好な相同組換えに十分な長さを有する。一般的に、数キロ塩基のフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方における）は、ベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関するＴｈｏｍａｓ等，Ｃｅｌｌ（１９８７年）５１：５０３を参照）。   In the homologous recombination vector, the modified portion of the GAVE18 gene is present on the 5 ′ and 3 ′ ends by the additional nucleic acid sequence of the GAVE18 gene, so that the foreign GAVE18 gene provided by the vector and the embryo Homologous recombination can occur between the endogenous GAVE18 gene in stem cells. The additional flanking GAVE18 nucleic acid sequence is of sufficient length for good homologous recombination with the endogenous gene. In general, several kilobases of flanking DNA (at both the 5 ′ and 3 ′ ends) are included in the vector (eg, Thomas et al., Cell (1987) 51: 503 for a description of homologous recombination vectors). reference).

該ベクターを胚幹細胞系に導入し（例えばエレクトロポレーションにより）、導入されたＧＡＶＥ１８遺伝子が内在性ＧＡＶＥ１８遺伝子を相同組換えした細胞が選択される（例えばＬｉ等，Ｃｅｌｌ（１９９２年）６９：９１５を参照）。続いて、選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成させる（例えばＢｒａｄｌｅｙ ｉｎ Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７年）第１１３頁〜第１５２頁を参照）。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠メス里親動物に移植し、胚を妊娠期間の終わりまで成長させる。生殖細胞において相同組換えされたＤＮＡを保持する仔獣を、生殖細胞の導入遺伝子の伝達により全ての細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに用いることができる。   The vector is introduced into an embryonic stem cell line (eg, by electroporation), and cells in which the introduced GAVE18 gene is homologously recombined with the endogenous GAVE18 gene are selected (eg, Li et al., Cell (1992) 69: 915). See). Subsequently, the selected cells are injected into blastocysts of animals (eg, mice) to form aggregate chimeras (eg, Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, 7F. Year) See pages 113-152). The chimeric embryo is then transferred into an appropriate pseudopregnant female foster animal and the embryo is allowed to grow until the end of gestation. A pup that retains DNA homologously recombined in germ cells can be used to breed animals that contain DNA in which all cells are homologously recombined by germline transgene transfer.

相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）２：８２３〜８２９に記載の「Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ」、ならびに、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０１１４０、ＷＯ９２／０９６８およびＷＯ９３／０４１６９でさらに説明される。   Methods for constructing homologous recombination vectors and homologous recombination animals are described in “Bradley, Current Opinion” described in Bio / Technology (1991) 2: 823-829, and PCT Publication Nos. WO90 / 11354, WO91 / 01140, Further explanation is given in WO 92/0968 and WO 93/04169.

他の実施形態において、導入遺伝子の発現を調節することができる選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このようなシステムの一例としては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明に関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：６２３２〜６２３６を参照。リコンビ
ナーゼ系の他の例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系がある（Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）２５１：１３５１〜１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するのに用いられる場合、ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質との両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、例えば２つのトランスジェニック動物（一つは、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、もう一つは、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することにより「ダブル」トランスジェニック動物を構築することによって提供することができる。 In other embodiments, transgenic non-human animals can be generated that include selected systems capable of regulating transgene expression. An example of such a system is the cre / loxP recombinase system of bacteriophage P1. For a description of the cre / loxP recombinase system, see, eg, Lakso et al., Proc Natl
See Acad Sci USA (1992) 89: 6232-6236. Other examples of recombinase systems include S. There is a cerevisiae FLP recombinase system (O'Gornan et al., Science (1991) 251: 1351-1355). If the cre / loxP recombinase system is used to regulate transgene expression, an animal containing a transgene encoding both the cre recombinase and the selected protein is required. Such animals can be “doubled” by crossing, for example, two transgenic animals, one containing a transgene encoding a selected protein and the other containing a transgene encoding a recombinase. Can be provided by constructing transgenic animals.

本明細書において説明された非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８５：８１０〜８１３およびＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９で説明された方法に従って作製することができる。簡単に言えば、細胞、例えばトランスジェニック動物からの体細胞を単離し、成長周期を抜けてＧ₀期に入らせるように誘導することができる。続いて、例えば電気パルスの使用により、休止細胞を、休止細胞が単離されたのと同じ種の動物からの除核した卵母細胞に融合させることができる。続いて、再構築された卵母細胞が桑実胚または未分化胚芽細胞に発達するように培養し、続いて、偽妊娠メス里親動物に移植する。そのメス里親動物から生まれた子孫は、その動物のクローンであり、それから細胞、例えば体細胞が単離される。 The clones of non-human transgenic animals described herein may also be made according to the methods described in Wilmut et al., Nature (1997) 385: 810-813 and PCT Publication Nos. WO 97/07668 and WO 97/07669. Can do. Briefly, cells, for example, isolating somatic cells from a transgenic animal, can be missing the growth cycle to induce such that enter G ₀ phase. Subsequently, resting cells can be fused to enucleated oocytes from the same species of animal from which the resting cells were isolated, for example by use of electric pulses. Subsequently, the reconstructed oocyte is cultured so as to develop into a morula or an undifferentiated germ cell, and then transplanted into a pseudopregnant female foster animal. Offspring born from the female foster animal are clones of the animal from which cells, eg, somatic cells, are isolated.

医薬組成物
本発明のＧＡＶＥ１８核酸分子、ＧＡＶＥ１８タンパク質および抗ＧＡＶＥ１８抗体（または本明細書において「活性化合物」とも称する）は、投与に適切な医薬組成物に含ませることができる。一般的に、このような組成物は、核酸分子、タンパク質または抗体、および、製薬上許容できるキャリアーを含む。本発明で用いられるように、言い回し「製薬上許容できるキャリアー」は、薬務行政に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび全部を含むこととする。製薬上活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は当業界周知である。通常の媒質または薬剤のいずれかが活性化合物と適合しない場合を除いては、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足の活性化合物を組成物に含ませてもよい。 Pharmaceutical Compositions GAVE18 nucleic acid molecules, GAVE18 proteins and anti-GAVE18 antibodies (or also referred to herein as “active compounds”) of the present invention can be included in pharmaceutical compositions suitable for administration. In general, such compositions comprise a nucleic acid molecule, a protein or antibody, and a pharmaceutically acceptable carrier. As used in the present invention, the phrase “pharmaceutically acceptable carrier” refers to any solvent, dispersion medium, coating, antibacterial and antifungal agent, isotonic and absorption delaying agent, and the like that is compatible with pharmaceutical administration. It will include everything. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except insofar as any of the usual media or drugs are incompatible with the active compound, their use in the composition is contemplated. Supplementary active compounds can be included in the compositions.

本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜および直腸内投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含ませることができる：滅菌希釈剤、例えば注入用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラオキシ安息香酸エステル類；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝剤、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート；および、張度を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨのような酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルのシリンジまたはガラスまたはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention is formulated to be compatible with the intended route of administration. Examples of routes of administration include parenteral, such as intravenous, intradermal, subcutaneous, oral (eg inhalation), transdermal (topical), transmucosal and rectal administration. Solutions or suspensions used for parenteral, intradermal or subcutaneous application may contain the following components: sterile diluents such as water for injection, saline, fixed oils, polyethylene glycols, glycerin, Propylene glycol or other synthetic solvents; antibacterial agents such as benzyl alcohol or methyl paraoxybenzoates; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as EDTA; buffers such as acetate, citrate or phosphate; And agents for adjusting tonicity, such as sodium chloride or dextrose. The pH can be adjusted with acids or bases, such as HCl or NaOH. The parenteral preparation can be enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials made of glass or plastic.

注入用途に適切な医薬組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製物のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、適切なキャリアーとしては、生理食塩水、静菌性の水、「ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ
ＥＬ」（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されていなければならず、容易な注入が可能な程度流体であるべきである。組成物は製造および貯蔵条件下で安定であり、細
菌や菌類などの微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。キャリアーは溶媒または分散媒が可能であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、および、それらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動度は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒度を維持することにより、および、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合において、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによって達成することができる。 Pharmaceutical compositions suitable for infusion use include sterile aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. For intravenous administration, suitable carriers include physiological saline, bacteriostatic water, “CREMOPHOR
EL "(BASF; Parsippany, NJ) or phosphate buffered saline (PBS). In all cases, the composition must be sterile and should be fluid to the extent that easy syringability exists. The composition is stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium and includes, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof. The proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of microbial action can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, paraoxybenzoates, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol, sodium chloride in the composition. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by including in the composition an agent that delays absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.

滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、必要量の活性化合物（例えばＧＡＶＥ１８タンパク質またはそれらの変異体、類似体もしくは誘導体、または、抗ＧＡＶＥ１８抗体）を上記で列挙された成分の一つまたはそれらの組み合わせと共に含ませ、必要に応じてろ過滅菌することによって製造することができる。一般的に、分散液は、基礎の分散媒と上記で列挙されたものから必要とされるその他の成分とを含む滅菌賦形剤に、活性化合物を含ませることによって製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、活性成分と追加の望ましい成分のいずれかとの粉末が、予めろ過滅菌したそれらの溶液から得られる。   Sterile injectable solutions consist of a required amount of active compound (eg, GAVE18 protein or a variant, analog or derivative thereof, or anti-GAVE18 antibody) in one suitable solvent or one of the above-listed components. And can be produced by sterilizing by filtration if necessary. Generally, dispersions are prepared by including the active compound in a sterile vehicle that contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. In the case of sterile powders for the production of sterile injectable solutions, the preferred production methods are vacuum drying and lyophilization, whereby the powder of the active ingredient and any of the additional desired ingredients has been previously filtered and sterilized. Obtained from solution.

一般的に、口用組成物は、不活性な希釈剤または食用キャリアーを含む。該組成物は、ゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよい。口用治療剤を投与する目的において、活性化合物は、添加剤と合体させてもよいし、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いてもよい。口用組成物はまた、口内洗浄剤として用いるための液状キャリアーを用いて製造することができ、この場合、液状キャリアー中の化合物を経口的に適用し、うがいし、吐き出すかまたは飲み込む。   Generally, oral compositions include an inert diluent or edible carrier. The composition may be enclosed in gelatin capsules or compressed into tablets. For the purpose of administering oral therapeutic agents, the active compound may be incorporated with additives or used in the form of tablets, troches, or capsules. Oral compositions can also be prepared using a liquid carrier for use as a mouthwash, in which case the compound in the liquid carrier is applied orally, gargled, exhaled or swallowed.

製薬上適合可能な結合剤および／またはアジュバント物質を該組成物の一部として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ等は、以下の、類似の性質を有する成分または化合物のいずれかを含ませることができる：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばスターチまたはラクトース；崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または、着香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ着香剤。吸入による投与に関しては、該化合物は、適切な噴射剤（例えば二酸化炭素のようなガス）を含む加圧されたコンテナーもしくはディスペンサーまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で運搬される。   Pharmaceutically compatible binding agents, and / or adjuvant materials can be included as part of the composition. Tablets, pills, capsules, troches and the like can contain any of the following components or compounds with similar properties: binders such as microcrystalline cellulose, tragacanth gum or gelatin; excipients such as starch Or lactose; disintegrating agents such as alginic acid, primogel or corn starch; lubricants such as magnesium stearate or Sterotes; lubricants such as colloidal silicon dioxide; sweeteners such as sucrose or saccharin; or flavoring agents such as peppermint, methyl salicylate Or orange flavor. For administration by inhalation, the compounds are delivered in the form of an aerosol spray from pressurized container or dispenser which contains a suitable propellant (eg, a gas such as carbon dioxide) or a nebulizer.

全身投与は経粘膜または経皮により行うこともできる。経粘膜または経皮投与に関しては、透過させたいバリアに適した浸透剤が製剤に用いられる。一般的にこのような浸透剤は当業界既知であり、例えば、経粘膜投与に関しては、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤の使用により達成することができる。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当業界既知のオイントメント、軟膏、ゲルまたはクリームに配合される。   Systemic administration can also be performed transmucosally or transdermally. For transmucosal or transdermal administration, penetrants appropriate to the barrier to be permeated are used in the formulation. In general, such penetrants are known in the art and include, for example, for transmucosal administration, surfactants, bile salts and fusidic acid derivatives. Transmucosal administration can be accomplished through the use of nasal sprays or suppositories. For transdermal administration, the active compounds are generally formulated into ointments, ointments, gels or creams known in the art.

該化合物はまた、坐剤（例えばカカオバターおよびその他のグリセリドのような通常の坐剤ベースと共に）、または、直腸へ運搬するための保留浣腸の形態で製造することができる。   The compounds can also be manufactured in the form of suppositories (eg, with conventional suppository bases such as cocoa butter and other glycerides) or retention enemas for delivery to the rectum.

一実施形態において、活性化合物は、迅速な体外排出から化合物を保護するキャリアー（例えば制御放出製剤）と共に製造され、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化した運搬システムが挙げられる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。   In one embodiment, the active compound is manufactured with a carrier (eg, a controlled release formulation) that protects the compound against rapid in vitro elimination, including, for example, implants and microencapsulated delivery systems. Biodegradable, biocompatible polymers can be used, such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid.

このような製剤を製造する方法は、当業者には明白である。Ａｌｚａ社やＮｏｖａ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から物質を購入することもできる。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体で感染させた細胞を標的とするリポソームを含む）はまた、製薬上許容できるキャリアーとして用いることができる。これらは、当業者既知の方法（例えば米国特許第４,５２２,８１１号で説明される方法）に従って製造することができる。   Methods for manufacturing such formulations will be apparent to those skilled in the art. Substances can also be purchased from Alza and Nova Pharmaceuticals. Liposomal suspensions (including liposomes targeted to cells infected with monoclonal antibodies) can also be used as pharmaceutically acceptable carriers. These can be prepared according to methods known to those skilled in the art (eg, the method described in US Pat. No. 4,522,811).

投与の簡易性と投与量の均一性のために、経口または非経口用組成物を投与量単位形態で配合することが特に有利である。本発明で用いられる投与量単位形態は、治療される患者に対する１回分の投与に相当する物理的に別個の単位を意味し、各単位は、予め決められた活性化合物量（必要な製剤用キャリアーと共同して望ましい治療効果を奏するように計算された）を含む。患者へ投与するための初期の候補投与量は、例えば１回またはそれ以上の別々の投与または連続的な注入のいずれの場合においても、病気のタイプおよび重症度に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の化合物である。一般的な１日投与量は、上述の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日またはそれ以上にわたる繰り返しの投与に関しては、状態に応じて、病気症状の望ましい抑制が生じるまで治療が継続される。しかしながら、その他の投与量方式も有用であり得る。治療の進行は、通常の技術および分析により容易にモニターされる。典型的な投薬方式は、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。本発明の投与量単位形態に関する明細は、活性化合物の特有の性質、および、達成されるべき特定の治療効果、および、個体を治療するためのこのような活性化合物の調剤に関する当業界で特有の制限により決定されるか、または、それらに直接依存する。   It is especially advantageous to formulate oral or parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. The dosage unit form used in the present invention means a physically separate unit corresponding to a single administration to a patient to be treated, each unit comprising a predetermined amount of active compound (required formulation carrier). Calculated to achieve the desired therapeutic effect). The initial candidate dose for administration to a patient is, for example, about 1 μg / kg to 15 mg depending on the type and severity of the disease, either in the case of one or more separate doses or continuous infusions. / Kg (for example, 0.1-20 mg / kg) of the compound. Typical daily dosages can range from about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the factors described above. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, the treatment is continued until a desired suppression of disease symptoms occurs. However, other dosage regimes may be useful. The progress of therapy is easily monitored by conventional techniques and analyses. A typical dosage regime is disclosed in WO94 / 04188. The specifications for the dosage unit forms of the present invention are specific to the industry regarding the specific nature of the active compound and the specific therapeutic effect to be achieved and the preparation of such active compounds for treating an individual. Determined by restrictions or depend directly on them.

その上、本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターの被検体への運搬は、例えば、静脈注射、局所投与により（米国特許第５,３２８,４７０号）、または、定位注入により（例えばＣｈｅｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４年）９１：３０５４〜３０５７を参照）なされ得る。遺伝子治療ベクターの医薬配合物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含ませてもよいし、または、遺伝子運搬用賦形剤が埋め込まれる徐放性マトリックスで構成されてもよい。あるいは、組換え細胞から完全遺伝子運搬ベクター（例えばレトロウイルスベクター）が無傷で生産され得る場合、医薬配合物は、遺伝子運搬システムを生産する１またはそれ以上の細胞を含み得る。   In addition, the nucleic acid molecules of the present invention can be inserted into vectors and used as gene therapy vectors. Delivery of gene therapy vectors to a subject is, for example, by intravenous injection, local administration (US Pat. No. 5,328,470) or by stereotaxic injection (eg, Chen et al., Proc Nat1 Acad Sci USA (1994)). 91: 3054-3057). The pharmaceutical formulation of the gene therapy vector may include the gene therapy vector in an acceptable diluent or may be composed of a sustained release matrix in which the gene delivery excipients are embedded. Alternatively, where a complete gene delivery vector (eg, a retroviral vector) can be produced intact from a recombinant cell, the pharmaceutical formulation can include one or more cells that produce the gene delivery system.

医薬組成物は、投与のための説明書と共にコンテナー、パックまたはディスペンサーに入れることができる。   The pharmaceutical composition can be placed in a container, pack or dispenser along with instructions for administration.

本発明の使用および方法
本発明の核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、抗体、およびこのような成分の断片を、以下の方法の１またはそれ以上で用いることができる：ａ）スクリーニング分析；ｂ）検出分析（例えば、染色体マッピング、組織型別、法医生物学）：ｃ）予測医学（例えば診断分析、予後分析、臨床試験のモニターおよび薬理ゲノム学）：および、ｄ）治療方法（例えば治療および予防の）。ＧＡＶＥ１８タンパク質は、他の細胞タンパク質と相互作用し、従って、以下に用いることができる：（ｉ）細胞増殖の調節；（ｉｉ）細胞分化の調節；および、（ｉｉｉ）細胞生存の調節。本発明の単離された核酸分子は、ＧＡＶ
Ｅ１８タンパク質を発現させること（例えば、遺伝子治療用途においては宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して）、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡを検出すること（例えば生物学的なサンプルにおいて）、または、ＧＡＶＥ１８遺伝子における遺伝子の損傷を検出すること、および、ＧＡＶＥ１８活性を調節することに用いることができる。加えて、ＧＡＶＥ１８タンパク質は、ＧＡＶＥ１８活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングすること、同様に、ＧＡＶＥ１８タンパク質の不十分または過剰な生産、または、ＧＡＶＥ１８野生型タンパク質に比べて減少した活性または異常な活性を有するＧＡＶＥ１８タンパク質形態の生産を特徴等する疾患を治療すること、に用いることができる。加えて、本発明の抗ＧＡＶＥ１８抗体は、ＧＡＶＥ１８タンパク質を検出および単離すること、および、ＧＡＶＥ１８活性を調節することに用いることができる。本発明は、さらに、上述のスクリーニング分析により同定された新規の薬剤、および、本明細書において説明された治療のためのそれらの使用に関する。 Uses and Methods of the Invention The nucleic acid molecules, proteins, protein homologues, antibodies, and fragments of such components of the invention can be used in one or more of the following methods: a) screening analysis; b) Detection analysis (eg chromosomal mapping, histology, forensic biology): c) predictive medicine (eg diagnostic analysis, prognostic analysis, clinical trial monitoring and pharmacogenomics): and d) therapeutic methods (eg treatment and prevention) of). The GAVE18 protein interacts with other cellular proteins and can therefore be used for: (i) regulation of cell proliferation; (ii) regulation of cell differentiation; and (iii) regulation of cell survival. The isolated nucleic acid molecule of the present invention comprises GAV
Expressing E18 protein (eg, via a recombinant expression vector in a host cell for gene therapy applications), detecting GAVE18 mRNA (eg, in a biological sample), or gene in the GAVE18 gene Can be used to detect the damage of and to modulate GAVE18 activity. In addition, GAVE18 protein can be screened for drugs or compounds that modulate GAVE18 activity or expression, as well as insufficient or excessive production of GAVE18 protein, or reduced or abnormal activity compared to GAVE18 wild-type protein. It can be used to treat diseases characterized by the production of active GAVE18 protein forms. In addition, the anti-GAVE18 antibodies of the present invention can be used to detect and isolate GAVE18 protein and to modulate GAVE18 activity. The present invention further relates to the novel agents identified by the screening analysis described above and their use for the treatments described herein.

スクリーニング分析
内因性のリガンドの存在下でのＧタンパク質受容体の活性化により、Ｇタンパク質受容体複合体が形成され、ＧＴＰのＧタンパク質への結合が起こる。Ｇタンパク質のＧＴＰアーゼドメインは、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくり加水分解し、その結果、正常な条件下で受容体が失活する。しかしながら、構成的に活性化した受容体は、ＧＤＰからＧＴＰへの加水分解を継続する。 Screening analysis Activation of the G protein receptor in the presence of an endogenous ligand results in the formation of a G protein receptor complex and binding of GTP to the G protein. The GTPase domain of the G protein slowly hydrolyzes GTP to GDP, resulting in inactivation of the receptor under normal conditions. However, the constitutively activated receptor continues to hydrolyze GDP to GTP.

Ｇタンパク質の加水分解されない基質、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳは、構成的に活性化した受容体を発現する膜への結合が強められたことをモニターするのに用いることができる。ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによれば、［³⁵Ｓ］ＧＴＰγＳは、リガンドの存在下および非存在下でのＧタンパク質の膜への結合をモニターするのに用いることができると報告している（Ｔｒａｙｎｏｒ等，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９５年）４７（４）：８４８〜５４）。このような分析システムは、一般的に、受容体に結合する特定のＧタンパク質に関係なく全Ｇタンパク質共役受容体に適用可能であるため、候補化合物の最初のスクリーニングに好ましく用いられる。 The non-hydrolyzed substrate of G protein, [ ³⁵ S] GTPγS, can be used to monitor enhanced binding to membranes expressing constitutively activated receptors. According to Raynor and Nahorski, [ ³⁵ S] GTPγS can be used to monitor the binding of G protein to the membrane in the presence and absence of ligand (Traynor et al., Mol. Pharmacol (1995) 47 (4): 848-54). Such an analytical system is generally used for initial screening of candidate compounds because it is generally applicable to all G protein coupled receptors regardless of the specific G protein that binds to the receptor.

Ｇ_s20は、酵素アデニリルシクラーゼを刺激するが、一方で、Ｇ_iおよびＧ₀は、この酵素を阻害する。当業界で周知であるが、アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する；従って、Ｇ_sタンパク質に結合する構成的に活性化したＧＰＣＲは、細胞のｃＡＭＰレベルの増加に関係する。あるいは、Ｇ_i（またはＧ₀）タンパク質を結合させ得る構成的に活性化したＧＣＰＲは、細胞のｃＡＭＰレベルの減少に関係する。「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第８章，ニューロン〜脳（第三版），Ｎｉｃｈｏｌｓ等編，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，１９９２年を参照。従って、ｃＡＭＰを検出する分析は、候補化合物が受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定するのに用いることができる。当業界で既知の多種多様なｃＡＭＰの測定方法を利用することができる。一実施形態において、ＥＬＩＳＡに基づく様式で抗ｃＡＭＰ抗体が用いられる。他の実施形態において、全細胞の第２メッセンジャーレポーターシステム分析が考慮される（ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／２２１３１を参照）。 G _s20 stimulates the enzyme adenylyl cyclase, while G _i and G ₀ inhibit this enzyme. As is well known in the art, adenylyl cyclase catalyzes the conversion of ATP to cAMP; thus, constitutively activated GPCRs that bind to G _s proteins are associated with increased cellular cAMP levels. . Alternatively, constitutively activated GCPR that can bind G _i (or G ₀ ) protein is associated with a decrease in cellular cAMP levels. See “Indirect Mechanical of Synthetic Transmission”, Chapter 8, Neurons-Brain (Third Edition), Nichols et al., Sinauer Associates, 1992. Thus, analysis to detect cAMP can be used to determine whether a candidate compound is an inverse agonist for the receptor. A wide variety of cAMP measurement methods known in the art can be utilized. In one embodiment, anti-cAMP antibodies are used in an ELISA-based manner. In other embodiments, whole cell second messenger reporter system analysis is considered (see PCT Publication No. WO00 / 22131).

関連する観点において、サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ反応性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進し、次に、ｃＡＭＰ反応性要素という特異的部位でプロモーターに結合し遺伝子を発現させることにより、遺伝子発現を作動させる。従って、レポーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ反応性要素を含むプロモーターを有するレポーターシステムを構築することができる。さらに、構成的に活性化したＧ_s結合受容体がｃＡＭＰ蓄積を起こすために、次にこの受容体は、遺伝子を活性化し、レポータータンパク質を発現させる。次に、レポータータンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼを標準的な生化学的分析により検出することができる（ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／２２１３１）。 In a related aspect, cyclic AMP promotes the binding of cAMP-responsive DNA binding protein or transcription factor (CREB), and then binds to the promoter at specific sites called cAMP-responsive elements to express the gene. Activating gene expression. Thus, a reporter system can be constructed that has a promoter that includes multiple cAMP-responsive elements in front of a reporter gene (eg, β-galactosidase or luciferase). Furthermore, in order to G _s coupled receptors constitutively activated causes cAMP accumulation, then this receptor, the gene is activated to express the reporter protein. The reporter protein, such as β-galactosidase or luciferase, can then be detected by standard biochemical analysis (PCT Publication No. WO00 / 22131).

その他のＧタンパク質、例えばＧ₀およびＧ_qは、酵素、ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、この酵素は順にリン脂質、ＰＩＰ２を加水分解し、それにより２種の細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）が放出される。ＩＰ３の蓄積の増加は、Ｇ_q関連受容体およびＧ₀関連受容体の活性化に関連する（ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／２２１３１）。ＩＰ３の蓄積を検出する分析は、候補化合物がＧ_q関連受容体またはＧ₀関連受容体に対するインバースアゴニストであるかどうかを決定するのに用いることができる。Ｇ_q関連受容体はまた、Ｇ_q依存性ホスホリパーゼＣがＡＰＩ要素を含む遺伝子の活性化を引き起こすかどうかを測定するＡＰＩレポーター分析を用いて試験することもできる。従って、活性化したＧ_q関連受容体は、このような遺伝子の発現の増加を証明し得るものであり、それにより、インバースアゴニストは、このような発現における減少を証明し得る。 Other G proteins, such as G ₀ and G _q, are associated with the activation of the enzyme, phospholipase C, which in turn hydrolyzes the phospholipid, PIP2, thereby two intracellular messengers: diacylglycerol (DAG ) And inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) are released. Increased accumulation of IP3 is associated with activation of G _q -related receptors and G ₀ -related receptors (PCT Publication No. WO 00/22131). Analysis for detecting the IP3 accumulation of a candidate compound can be used to determine whether an inverse agonist for G _q related receptor or G ₀ associated receptors. G _q -related receptors can also be tested using an API reporter assay that measures whether G _q- dependent phospholipase C causes activation of a gene containing an API element. Thus, G _q-related receptors activated, which may prove an increase in the expression of such genes, whereby inverse agonists may prove a reduction in such expression.

本発明はまた、モジュレーターを同定するための方法、すなわち、ＧＡＶＥ１８タンパク質に結合するか、または、例えばＧＡＶＥ１８発現またはＧＡＶＥ１８活性に対して刺激または阻害効果を有する候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えばペプチド、ペプチドミメティック、低分子物質またはその他の薬物）を同定するための方法（本明細書においては「スクリーニング分析」とも称する）を提供する。   The present invention also provides methods for identifying modulators, ie candidate or test compounds or agents that bind to GAVE18 protein or have a stimulatory or inhibitory effect on, for example, GAVE18 expression or GAVE18 activity (eg, peptides, Methods are provided for identifying peptidomimetics, small molecules or other drugs (also referred to herein as “screening assays”).

一実施形態において、本発明は、膜結合型ＧＡＶＥ１８タンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なそれらの部分に結合するか、または、それらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするための分析を提供する。本発明の試験化合物は、当業界既知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、該アプローチとしては：生物学的なライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「１−ビーズ−１−化合物」ライブラリー方法；および、親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法が挙げられる。生物学的なライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子物質の化合物ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ（１９９７年）１２：１４５）。   In one embodiment, the present invention is for screening candidate or test compounds that bind to or modulate membrane-bound GAVE18 protein or polypeptide or biologically active portions thereof. Provide analysis. Test compounds of the present invention can be obtained using any of a number of approaches in combinatorial library methods known in the art, including: biological libraries; spatially addressable parallel anchors. Synthetic library methods that require deconvolution; “1-bead-1-compound” library methods; and synthetic library methods using affinity chromatography selection. The biological library approach is limited to peptide libraries, while the other four approaches are applicable to peptide, non-peptide oligomer or small molecule compound libraries (Lam, Anticancer). Drug Des (1997) 12: 145).

分子ライブラリー合成方法の例は、当業界で見出すことができ、例えば：ＤｅＷｉｔｔ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３年）９０：６９０９；Ｅｒｂ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４年）９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｍ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９４年）３７：２６７８；Ｃｈｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（１９９４年）３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ等，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ（１９９４年）３３：２０６１；および、Ｇａｌｌｏｐ等，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９４年）３７：１２３３で見出すことができる。   Examples of molecular library synthesis methods can be found in the art, for example: DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 6909; Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 11422. Zuckerham et al., J Med Chem (1994) 37: 2678; Cho et al., Science (1993) 261: 1303; Carrell et al., Ang Chem Int Ed Engl (1994) 33: 2059; Carell et al., AngInt Chew Engl (1994) 33: 2061; and Gallop et al., J Med Chem (1994) 37: 1233.

化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２年）１３：４１２〜４２１）、または、ビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３年）３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（米国特許第号５,５７１,６９８；第５,４０３,４８４号；および、第５,２２３,４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２年）８９：１８６５〜１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０年）２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：６３７８〜６３８２；および、Ｆｅｌｉｃｉ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９１年）２２２：３０１〜３１０）に存在させることが可能である。   Compound libraries can be in solution (eg, Houghten, Bio / Techniques (1992) 13: 412-421) or on beads (Lam, Nature (1991) 354: 82-84), on chip (Fodor, Nature (1993) 364: 555-556), bacteria (US Pat. No. 5,223,409), spores (US Pat. No. 5,571,698; 5,403,484); 223,409), plasmids (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 1865-1869) or phage (Scott et al., Science (1990) 249: 386-390; Devlin, Science (1990) 249: 404-406; Cwirla et al., P roc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6378-6382; and Felici J Mol Biol (1991) 222: 301-310).

本発明の特定の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であって、該分析において、細胞表面で膜結合型ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を発現する細胞と試験化合物とを接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質に結合する能力を決定する。該細胞としては、例えば、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞が可能である。試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質に結合する能力を決定することは、例えば、複合体において標識された化合物を検出することによって試験化合物とＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分との結合が決定できるように、試験化合物と放射線同位体または酵素標識とをカップリングすることによって達成することができる。例えば、試験化合物を¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³Ｈで直接的または間接的のいずれかにより標識することができ、放射線同位体を放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数により検出することができる。あるいは、試験化合物を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、適切な基質の生成物への変換を測定することにより酵素標識を検出することができる。好ましい実施形態において、分析は、膜結合型ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を細胞表面で発現する細胞と、ＧＡＶＥ１８に結合する既知化合物とを接触させて分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する能力を決定すること、を含み、該分析において、試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する能力を決定することは、既知化合物に比べて、ＧＡＶＥ１８または生物学的に活性なそれらの部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。 In certain embodiments of the invention, the assay is a cell-based assay, wherein the cell expresses a membrane-bound GAVE18 protein or biologically active portion thereof on the cell surface and a test compound To determine the ability of the test compound to bind to the GAVE18 protein. The cell can be, for example, a yeast cell or a cell of mammalian origin. Determining the ability of a test compound to bind to the GAVE18 protein can determine the binding of the test compound to the GAVE18 protein or biologically active portion thereof, for example, by detecting the labeled compound in the complex As such, it can be accomplished by coupling a test compound with a radioisotope or enzyme label. For example, test compounds can be labeled either directly or indirectly with ¹²⁵ I, ³⁵ S, ¹⁴ C or ³ H, and radioisotopes can be detected by direct counting of radiation emission or scintillation counting. . Alternatively, the test compound can be enzymatically labeled, for example with horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or luciferase, and the enzyme label can be detected by measuring the conversion of the appropriate substrate to product. In a preferred embodiment, the analysis comprises contacting a cell surface expressing a membrane-bound GAVE18 protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds to GAVE18 to form an assay mixture; Determining the ability of the test compound to interact with the GAVE18 protein in the analysis, comprising contacting the analysis mixture with the test compound and determining the ability of the test compound to interact with the GAVE18 protein. Determining the ability of a test compound to bind preferentially to GAVE18 or a biologically active portion thereof relative to a known compound.

他の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であって、該分析は、膜結合型ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を細胞表面で発現する細胞と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を決定すること、を含む。ＧＡＶＥ１８または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＧＡＶＥ１８標的分子に結合またはＧＡＶＥ１８標的分子と相互作用するＧＡＶＥ１８タンパク質の能力を決定することにより達成することができる。本発明で用いられる「標的分子」とは、例えば、ＧＡＶＥ１８タンパク質を発現する細胞の表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外の環境に存在する分子、細胞膜の内部表面と結合する分子、または、細胞質の分子と、ＧＡＶＥ１８タンパク質とが、実質的に結合または相互作用する分子である。ＧＡＶＥ１８標的分子は、本発明の非ＧＡＶＥ１８分子または非ＧＡＶＥ１８タンパク質またはポリペプチドでもよい。一実施形態において、ＧＡＶＥ１８標的分子は、シグナル伝達経路の成分であって、該成分は、細胞外シグナル（例えば化合物と膜結合型ＧＡＶＥ１８分子との結合により生じるシグナル）を細胞膜を通過して細胞に容易に伝達させる。標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または、下流シグナル伝達分子とＧＡＶＥ１８との結合を容易にするタンパク質であり得る。   In other embodiments, the assay is a cell-based assay, wherein the assay comprises contacting a cell that expresses a membrane-bound GAVE18 protein or biologically active portion thereof on the cell surface with a test compound. And determining the ability of the test compound to modulate (eg, stimulate or inhibit) the activity of the GAVE18 protein or biologically active portion thereof. Determining the ability of a test compound to modulate the activity of GAVE18 or a biologically active portion thereof includes, for example, determining the ability of a GAVE18 protein to bind to or interact with a GAVE18 target molecule Can be achieved. The “target molecule” used in the present invention includes, for example, a molecule on the surface of a cell expressing GAVE18 protein, a molecule on the surface of a second cell, a molecule present in the extracellular environment, an inner surface of a cell membrane, A molecule that binds or interacts with a binding molecule or a cytoplasmic molecule and a GAVE18 protein. The GAVE18 target molecule may be a non-GAVE18 molecule or a non-GAVE18 protein or polypeptide of the invention. In one embodiment, the GAVE18 target molecule is a component of a signal transduction pathway, which component transmits an extracellular signal (eg, a signal generated by the binding of a compound and a membrane-bound GAVE18 molecule) across the cell membrane to the cell. Make it easy to communicate. The target can be, for example, a second intracellular protein with catalytic activity, or a protein that facilitates binding of downstream signaling molecules to GAVE18.

ＧＡＶＥ１８標的分子と結合または相互作用するＧＡＶＥ１８タンパク質の能力を決定することは、直接的な結合を決定することについて上述された方法の一つにより達成することができる。特定の実施形態において、ＧＡＶＥ１８標的分子と結合または相互作用するＧＡＶＥ１８タンパク質の能力を決定することは、標的分子の活性を決定することにより達成することができる。例えば、標的の細胞の第２メッセンジャー（例えば、細胞内の
Ｃａ²⁺、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導をを検出すること、適切な基質に対する標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子の誘導（例えば、検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）をコードする核酸に操作可能に結合したＧＡＶＥ１８反応性調節要素を検出すること、または、細胞応答、例えば細胞分化または細胞増殖を検出することによって、標的分子の活性を決定することができる。 Determining the ability of a GAVE18 protein to bind to or interact with a GAVE18 target molecule can be accomplished by one of the methods described above for determining direct binding. In certain embodiments, determining the ability of a GAVE18 protein to bind or interact with a GAVE18 target molecule can be accomplished by determining the activity of the target molecule. For example, detecting induction of second messengers (eg, intracellular Ca ²⁺ , diacylglycerol, IP3, etc.) in the target cell, detecting target catalytic / enzyme activity against the appropriate substrate, reporter Gene induction (eg, by detecting a GAVE18 responsive regulatory element operably linked to a nucleic acid encoding a detectable marker (eg, luciferase) or by detecting a cellular response, eg, cell differentiation or cell proliferation The activity of the target molecule can be determined.

本発明はさらに、無細胞系分析を含み、該分析は、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する試験化合物の能力を決定すること、を含む。試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質に結合することを、上述のように直接的または間接的のいずれかにより決定することができる。好ましい実施形態において、該分析は、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ１８に結合する既知化合物とを接触させ、分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定すること、を含み、該分析において、試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する能力を決定することは、既知化合物に比べて、ＧＡＶＥ１８または生物学的に活性なそれらの部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定すること、を含む。   The invention further includes a cell-free assay, wherein the assay comprises contacting the test compound with a GAVE18 protein or biologically active portion thereof, and the GAVE18 protein or biologically active thereof. Determining the ability of the test compound to bind to the moiety. Binding of the test compound to the GAVE18 protein can be determined either directly or indirectly as described above. In a preferred embodiment, the analysis comprises contacting the GAVE18 protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds to GAVE18 to form an analytical mixture, contacting the analytical mixture with the test compound. And determining the ability of the test compound to interact with the GAVE18 protein, wherein in the analysis, determining the ability of the test compound to interact with the GAVE18 protein is greater than that of the known compound, Determining the ability of the test compound to bind preferentially to those portions that are chemically active.

本発明の他の無細胞系分析は、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば刺激または阻害する）試験化合物の能力を決定すること、を含む。例えば、直接的な結合を決定することについて上述された方法の一つにより、ＧＡＶＥ１８タンパク質の、ＧＡＶＥ１８標的分子と結合する能力を決定することによって、ＧＡＶＥ１８の活性を調節する試験化合物の能力を決定することを達成することができる。その代わりの実施形態において、ＧＡＶＥ１８タンパク質がＧＡＶＥ１８標的分子をさらに調節する能力を決定することによって、ＧＡＶＥ１８の活性を調節する試験化合物の能力決定することを達成することができる。例えば、適切な基質における標的分子の触媒活性／酵素活性を、これまでに述べられたようにして決定することができる。   Other cell-free assays of the invention contact GAVE18 protein or biologically active portion thereof with a test compound and modulate the activity of GAVE18 protein or biologically active portion thereof. Determining the ability of the test compound to (eg, stimulate or inhibit). For example, determine the ability of a test compound to modulate the activity of GAVE18 by determining the ability of the GAVE18 protein to bind to a GAVE18 target molecule by one of the methods described above for determining direct binding. Can be achieved. In an alternative embodiment, determining the ability of a test compound to modulate the activity of GAVE18 can be accomplished by determining the ability of the GAVE18 protein to further modulate the GAVE18 target molecule. For example, the catalytic / enzymatic activity of the target molecule on the appropriate substrate can be determined as described above.

本発明のさらに他の無細胞系分析は、ＧＡＶＥ１８タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ１８に結合する既知化合物とを接触させ、分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することを含む。試験化合物がＧＡＶＥ１８タンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、ＧＡＶＥ１８標的分子に優先的に結合する、またはＧＡＶＥ１８標的分子の活性を調節するＧＡＶＥ１８タンパク質の能力を決定すること、を含む。   Yet another cell-free assay of the present invention comprises contacting the GAVE18 protein or biologically active portion thereof with a known compound that binds to GAVE18 to form an analytical mixture, the analytical mixture and the test compound. Contacting and determining the ability of the test compound to interact with the GAVE18 protein. Determining the ability of a test compound to interact with the GAVE18 protein includes determining the ability of the GAVE18 protein to bind preferentially to the GAVE18 target molecule or modulate the activity of the GAVE18 target molecule.

受容体を非リガンド分子により活性化することができ、このような非リガンド分子は、リガンド結合を阻害するとは限らないが、受容体の構造変化を引き起こし、Ｇタンパク質結合またおそらくは受容体集合、二量体化または活性化を引き起こす集合化を可能にする。従って、抗体を、細胞表面で接触するＧＡＶＥ１８の様々な部分に対して構築することができる。Ｇタンパク質カスケードを介して細胞を活性化する抗体を、ｃＡＭＰレベルまたは細胞内のＣａ⁺²レベルのモニターのような標準的な分析で決定し、選択することができる。抗体を既知の技術で製造することができる。分子マッピング、特にエピトープマッピングが関与するため、モノクローナル抗体が好ましいと考えられる。モノクローナル抗体は、細胞表面で発現される完全な受容体と、細胞表面に形成されることがわかっているペプチドとの両方に対して構築することができる。Ｇｅｙｓｅｎ等の米国特許第５,９９８,５７７号の方法を実施し、複数の適切なペプチドを得ることができる。 Receptors can be activated by non-ligand molecules, and such non-ligand molecules do not necessarily inhibit ligand binding but cause structural changes in the receptor, resulting in G protein binding or possibly receptor assembly, Allows assembly that causes merization or activation. Thus, antibodies can be constructed against various portions of GAVE18 that contact on the cell surface. Antibodies that activate cells via the G protein cascade can be determined and selected by standard assays such as monitoring cAMP levels or intracellular Ca ⁺² levels. Antibodies can be produced by known techniques. Monoclonal antibodies are considered preferred because they involve molecular mapping, particularly epitope mapping. Monoclonal antibodies can be constructed against both intact receptors expressed on the cell surface and peptides that are known to form on the cell surface. The method of Geysen et al. US Pat. No. 5,998,577 can be performed to obtain multiple suitable peptides.

ＧＡＶＥ１８を活性化することがわかった抗体は、補体結合のようなＧＡＶＥ１８活性化とは無関係な活性を最小限にするように改変されてもよい。従って、抗体分子を、トランケーションまたは突然変異させることによって、ＧＡＶＥ１８活性化以外の活性を除去することができる。例えば、特定の抗体に関しては、抗原結合部位だけが必要である。従って、抗体のＦ_c部分を除去してもよい。 Antibodies found to activate GAVE18 may be modified to minimize activities unrelated to GAVE18 activation, such as complement binding. Thus, activities other than GAVE18 activation can be eliminated by truncating or mutating the antibody molecule. For example, for certain antibodies, only an antigen binding site is required. Therefore, the _Fc portion of the antibody may be removed.

ＧＡＶＥ１８を発現する細胞を、抗体に接触させ、ＧＡＶＥ１８を活性化させる。次に、活性化した細胞を様々な分子に接触させ、どの分子がより高い活性化レベルまたは低い活性化レベルのいずれかに受容体活性を調節させるかを同定する。次に、このような目的に適合する分子を、抗体なしでＧＡＶＥ１８を発現する細胞で試験し、活性化されていない細胞での影響を観察することができる。次に、変更されたＧＡＶＥ１８代謝に関する疾患の既知の技術を用いた治療のための候補薬物として、標的分子を試験し、改変することができる。   A cell expressing GAVE18 is contacted with an antibody to activate GAVE18. The activated cells are then contacted with various molecules to identify which molecules modulate receptor activity at either higher or lower activation levels. Molecules that fit such purposes can then be tested in cells that express GAVE18 without antibodies and the effects on unactivated cells can be observed. The target molecule can then be tested and modified as a candidate drug for treatment using known techniques of diseases related to altered GAVE18 metabolism.

本発明の無細胞系分析は、可溶性形態または膜結合型のＧＡＶＥ１８両方の使用に適用することができる。膜結合型ＧＡＶＥ１８を含む無細胞系分析の場合、膜結合型ＧＡＶＥ１８が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ＴＨＥＳＩＴ、イソトリデシポリ（エチレングリコール−エーテル）_n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが挙げられる。 The cell-free assay of the present invention can be applied to the use of both soluble forms or membrane-bound GAVE18. In the case of a cell-free analysis containing membrane-bound GAVE18, it is desirable to use a solubilizer so that membrane-bound GAVE18 is maintained in solution. Examples of such solubilizers include nonionic surfactants such as n-octyl glucoside, n-dodecyl glucoside, n-dodecyl maltoside, octanoyl-N-methyl glucamide, decanoyl-N-methyl glucamide. , TRITON X-100, TRITON X-114, THESIT, isotridecipoly (ethylene glycol-ether) _n , 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3 -Colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO) or N-dodecyl = N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate.

本発明の上記した分析方法の１を超過する実施形態において、ＧＡＶＥ１８またはそれらの標的分子のいずれかを固定することが望ましい場合があり、それにより、一方または両方のタンパク質の複合体形態または非複合体形態の分離を容易にすることができ、同様に、分析の自動化を達成することができる。候補化合物の存在および非存在において、試験化合物がＧＡＶＥ１８へ結合すること、または、ＧＡＶＥ１８と標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適した容器のいずれかの中で達成することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠沈管が挙げられる。一実施形態において、１または両方のタンパク質をマトリックスへ結合させるドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ１８融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）に吸着させることができる。あるいは、グルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートを、試験化合物と結合させるか、または、試験化合物と非吸着標的タンパク質またはＧＡＶＥ１８タンパク質のいずれかと結合させ、その混合物を、複合体形成を助けるような条件下で（例えば塩およびｐＨに関して生理学的な条件下で）インキュベートすることができる。インキュベートした後、ビーズまたはマイクロタイタープレートプレートウェルを洗浄して、すべての未結合成分を除去し、複合体形成を例えば上述のように直接的または間接的のいずれかにより測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させることができ、ＧＡＶＥ１８の結合または活性レベルを標準的な技術を用いて測定することができる。   In more than one embodiment of the above described analytical method of the present invention, it may be desirable to immobilize either GAVE18 or their target molecules, thereby complexing or uncomplexing one or both proteins. Separation of body forms can be facilitated and, similarly, automation of analysis can be achieved. In the presence and absence of the candidate compound, the test compound binds to GAVE18 or the interaction of GAVE18 with the target molecule can be achieved in any container suitable for containing the reactants. . Examples of such containers include microtiter plates, test tubes, and microcentrifuge tubes. In one embodiment, a fusion protein can be provided that adds a domain that binds one or both proteins to a matrix. For example, glutathione-S-transferase / GAVE18 fusion protein or glutathione-S-transferase / target fusion protein can be adsorbed to glutathione sepharose beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Alternatively, a glutathione derivatized microtiter plate can be conjugated with a test compound, or conjugated with a test compound and either a non-adsorbed target protein or a GAVE18 protein, and the mixture under conditions that aid in complex formation ( Incubation can be performed (for example, under physiological conditions with respect to salt and pH). After incubation, the beads or microtiter plate plate wells are washed to remove any unbound components, and complex formation is measured either directly or indirectly as described above, for example. Alternatively, the complex can be dissociated from the matrix, and the level of GAVE18 binding or activity can be measured using standard techniques.

また、タンパク質をマトリックスに固定するその他の技術を、本発明のスクリーニング分析で用いてもよい。例えば、ＧＡＶＥ１８またはそれらの標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンとの結合により固定することができる。例えば、ＧＡＶＥ
１８またはその標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。当業界周知の技術を用いて（例えばビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ロックフォード，イリノイ州）、ビオチン化ＧＡＶＥ１８または標的分子をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造することができ、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定化することができる。あるいは、ＧＡＶＥ１８または標的分子と反応するがＧＡＶＥ１８タンパク質の標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合標的またはＧＡＶＥ１８は、抗体との結合によりウェルに捕獲される。このような複合体を検出する方法としては、上述のＧＳＴ固定化複合体に関する方法のほかにも、ＧＡＶＥ１８または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、同様に、ＧＡＶＥ１８または標的分子に関する酵素活性の検出に基づく酵素結合分析、が挙げられる。 Other techniques for immobilizing proteins to the matrix may also be used in the screening analysis of the present invention. For example, GAVE18 or any of their target molecules can be immobilized by binding to biotin and streptavidin. For example, GAVE
Either 18 or its target molecule can be immobilized utilizing the binding of biotin and streptavidin. Using techniques well known in the art (eg, biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.), Biotinylated GAVE18 or target molecules can be prepared from biotin-NHS (N-hydroxy-succinimide) and streptavidin Can be immobilized on wells of 96-well plates (Pierce Chemicals) coated with. Alternatively, an antibody that reacts with GAVE18 or a target molecule but does not interfere with the binding of the GAVE18 protein to the target molecule can be derivatized to the well of the plate, and unbound target or GAVE18 is captured in the well by binding to the antibody. Is done. As a method for detecting such a complex, in addition to the above-mentioned method related to the GST-immobilized complex, immunodetection of a complex using an antibody that reacts with GAVE18 or a target molecule, similarly, GAVE18 or a target molecule Enzyme binding analysis based on detection of enzyme activity.

他の実施形態において、ＧＡＶＥ１８発現のモジュレーターは、細胞と候補化合物とを接触させ、細胞におけるＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下におけるＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと、候補化合物の非存在下におけるＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルとを比較する。続いて、その比較に基づき、候補化合物をＧＡＶＥ１８発現のモジュレーターと同定することができる。例えば、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それが存在しない場合より大きい（統計学的に有意に大きい）場合、その候補化合物は、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質またはアゴニストと同定される。あるいは、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それが存在しない場合より低い（統計学的に有意に低い）場合、その候補化合物は、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤またはアンタゴニストと同定される。リガンドもしくはアゴニスト、または構成的ＧＡＶＥ１８の存在下でＧＡＶＥ１８活性が基準を下回って減少した場合、候補化合物は、インバースアゴニストと同定される。細胞におけるＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書において説明された方法により決定することができる。   In another embodiment, a modulator of GAVE18 expression is identified by a method of contacting a cell with a candidate compound and measuring the expression of GAVE18 mRNA or protein in the cell. The expression level of GAVE18 mRNA or protein in the presence of the candidate compound is compared with the expression level of GAVE18 mRNA or protein in the absence of the candidate compound. Subsequently, based on the comparison, the candidate compound can be identified as a modulator of GAVE18 expression. For example, if the expression of GAVE18 mRNA or protein is greater (statistically significantly greater) in the presence of the candidate compound than it is not present, the candidate compound is a stimulator of GAVE18 mRNA or protein expression Or identified as an agonist. Alternatively, if the expression of GAVE18 mRNA or protein is lower (statistically significantly lower) in the presence of the candidate compound than it is not, the candidate compound is an inhibitor of GAVE18 mRNA or protein expression Or identified as an antagonist. A candidate compound is identified as an inverse agonist if GAVE18 activity decreases below baseline in the presence of a ligand or agonist, or constitutive GAVE18. The level of GAVE18 mRNA or protein expression in the cells can be determined by the methods described herein for detection of GAVE18 mRNA or protein.

本発明のさらに他の観点において、ＧＡＶＥ１８タンパク質を、２−ハイブリッド分析または３−ハイブリッド分析において「ベイトタンパク質」として用いて（例えば米国特許第５,２８３,３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ等，Ｃｅｌｌ（１９９３年）７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａ等，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３年）２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３年）１４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３年）８：１６９３〜１６９６；および、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１０３００を参照）、ＧＡＶＥ１８と結合または相互作用するその他のタンパク質（「ＧＡＶＥ１８結合タンパク質」または「ＧＡＶＥ１８−ｂｐ」）を同定し、ＧＡＶＥ１８活性を調節することができる。このようなＧＡＶＥ１８結合タンパク質はまた、例えばＧＡＶＥ１８経路の上流または下流要素としてＧＡＶＥ１８タンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性が高い。   In yet another aspect of the invention, the GAVE18 protein is used as a “bait protein” in 2-hybrid analysis or 3-hybrid analysis (eg, US Pat. No. 5,283,317; Zervos et al., Cell (1993)). 72: 223-232; Madura et al., J Biol Chem (1993) 268: 12046-12054; Bartel et al., Bio / Techniques (1993) 14: 920-924; Iwabuchi et al., Oncogene (1993) 8: 1693 1696; and PCT Publication No. WO94 / 10300), other proteins that bind to or interact with GAVE18 (“GAVE18 binding protein” or “GAVE18-bp”) are identified and GAVE1 Capable of modulating the activity. Such GAVE18 binding proteins are also likely to be involved in signal transduction by the GAVE18 protein, for example as upstream or downstream elements of the GAVE18 pathway.

本発明では大量の純粋なＧＡＶＥ１８の製造が可能なので、合理的な薬物設計のために機能的と予測される領域のコンフォメーションの物理的な特徴付けを確認することができる。例えば、分子のＩＣ３領域およびＥＣドメインは、特定の興味のある領域である。領域の形状およびイオン構造が識別されれば、これら領域と相互作用すべき候補薬物を形成し、次に、インタクト細胞、動物および患者で試験することができる。このような三次元構造情報を得る方法としては、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ分光学、分子モデリングなどが挙げられる。また三次元構造から、その部位で作用する既知薬物が存在するその他の既知タンパク質における類似のコンフォメーション部位を同定することもできる。このような薬物ま
たはそれらの誘導体から、ＧＡＶＥ１８を用いる用途を見出すことができる。 The present invention allows the production of large quantities of pure GAVE18, thus confirming the physical characterization of the conformation of the region that is expected to be functional for rational drug design. For example, the IC3 region and EC domain of a molecule are regions of particular interest. Once the shape and ionic structure of the regions are identified, candidate drugs to interact with these regions can be formed and then tested in intact cells, animals and patients. Examples of methods for obtaining such three-dimensional structure information include X-ray crystallography, NMR spectroscopy, and molecular modeling. The three-dimensional structure can also identify similar conformational sites in other known proteins where there is a known drug acting at that site. Applications using GAVE18 can be found from such drugs or their derivatives.

さらに本発明は、上述のスクリーニング分析で同定された新規の薬剤、および、本明細書において説明される治療のためのそれらの使用に関する。   The present invention further relates to the novel agents identified in the screening analysis described above and their use for the treatments described herein.

本発明の分析
Ａ．検出分析
本発明のＤＮＡ配列の部分または断片を多数の方法でポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、該配列を、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体上にマッピングし、それにより遺伝病に関連する遺伝子領域を位置決定すること；（ｉｉ）わずかな生物学的なサンプル（組織型別）から個体を同定すること；および、（ｉｉｉ）生物学的なサンプルの法医学的な同定を補助すること、に用いることができる。この用途を以下の章で説明する。 Analysis of the present invention
A. Detection Analysis Portions or fragments of the DNA sequences of the present invention can be used as polynucleotide reagents in a number of ways. For example, the sequence may be (i) mapping each gene onto a chromosome, thereby locating a gene region associated with a genetic disease; (ii) from a small biological sample (by tissue type) Can be used to identify individuals; and (iii) assist in forensic identification of biological samples. This application is described in the following chapter.

１．染色体マッピング
遺伝子の配列（またはその配列の部分）が単離されたら、配列を遺伝子の位置を染色体にマッピングすることに用いることができる。従って、本明細書において説明されたＧＡＶＥ１８核酸分子、またはそれらの断片は、ＧＡＶＥ１８の位置をゲノムにマッピングすることに用いることができる。ＧＡＶＥ１８配列の第二染色体へのマッピングは、病気に関連する遺伝子を有する配列を関係付ける重要な第一工程である。 1. Once the sequence of a chromosomal mapping gene (or a portion of that sequence) has been isolated, the sequence can be used to map the location of the gene to the chromosome. Thus, the GAVE18 nucleic acid molecules described herein, or fragments thereof, can be used to map the location of GAVE18 to the genome. Mapping the GAVE18 sequence to the second chromosome is an important first step in relating sequences with genes associated with disease.

簡単に言えば、ＧＡＶＥ１８配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を製造することによって、ＧＡＶＥ１８遺伝子をゲノムにマッピングすることができる。続いて、プライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドをＰＣＲスクリーニングするのに用いることができる。ＧＡＶＥ１８配列に対応するヒト遺伝子を含む上記ハイブリッドのみが増幅断片を生産する。   Briefly, the GAVE18 gene can be mapped to the genome by producing PCR primers (preferably 15-25 bp in length) from the GAVE18 sequence. Subsequently, primers can be used to PCR screen somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Only those hybrids containing the human gene corresponding to the GAVE18 sequence will produce an amplified fragment.

体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（例えばヒトおよびマウス細胞）からの体細胞を融合させることにより製造される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが成長し分割するにつれて、細胞は次第にランダムな順番でヒト染色体を失うが、マウス染色体は保持される。マウス細胞は成長できないが（特に選択酵素が含まれないために）、ヒト細胞は成長できる培地を用いることにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体は保持される。様々な培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系のパネルが確立される。パネル中の各細胞系は、１つのヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および、マウス染色体の完全なセットを含み、個々の遺伝子を特異的なヒト染色体に簡単にマッピングすることができる。（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３年）２２０：９１９〜９２４）。ヒト染色体の断片のみを含む体細胞ハイブリッドも、転座および欠失を有するヒト染色体を用いて製造することができる。   Somatic cell hybrids are produced by fusing somatic cells from different mammals (eg, human and mouse cells). As hybrids of human and mouse cells grow and divide, the cells gradually lose human chromosomes in a random order, but mouse chromosomes are retained. Although mouse cells cannot grow (especially because they do not contain a selective enzyme), by using a medium in which human cells can grow, one human chromosome containing the gene encoding the required enzyme is retained. By using different media, a panel of hybrid cell lines is established. Each cell line in the panel contains either a single human chromosome or a small number of human chromosomes, and a complete set of mouse chromosomes, allowing individual genes to be easily mapped to specific human chromosomes. (D'Eustachio et al., Science (1983) 220: 919-924). Somatic cell hybrids containing only fragments of human chromosomes can also be produced using human chromosomes with translocations and deletions.

体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体割り当てるための迅速な手順である。１つのサーモサイクラーを用いれば、１日で３またはそれ以上の配列を決定することができる。   PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for assigning specific sequences to specific chromosomes. With one thermocycler, 3 or more sequences can be determined in a day.

ＧＡＶＥ１８配列を第二染色体にマッピングするのに同様に用いることができる他のマッピング方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：６２２３〜２７で説明された）、標識されたフロー分類されたした染色体を用いたプレスクリーニング、および、染色体に特異的なｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択、が挙げられる。   Other mapping methods that can also be used to map the GAVE18 sequence to the second chromosome include in situ hybridization (described in Fan et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6223-27). Pre-screening with labeled flow-classified chromosomes and pre-selection by hybridization to a chromosome-specific cDNA library.

さらに***中期染色体分布へのＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、正確な染色***置を１工程で提供することができる。染色体分布は、分割が***中期において有糸***紡錐体を破壊する化学物質（例えばコルセミド）によりブロックされている細胞を用いて作製することができる。染色体をトリプシンで短時間で処理し、続いて、ギムザ染色することができる。染色体がそれぞれ同定できるようにバンドの明暗パターンを各染色体に関して展開させた。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基の長さのＤＮＡ配列と共に用いることができる。しかしながら、１,０００塩基を超過する長さのクローンが、簡単に検出するのに十分なシグナル強度を有する特有の染色***置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、より好ましくは２,０００塩基が、適度な時間で良好な結果を得るのに十分であり得る。該技術のレビューに関しては、Ｖｅｒｍａ等を参照（Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８年））。染色体マッピングは、インシリコで、かつ分類学的な考察（例えばスコアまたは単なる近接）を用いて推測することができる。   Furthermore, the precise chromosomal location can be provided in one step using fluorescence in situ hybridization (FISH) of DNA sequences to metaphase chromosome distribution. Chromosome distribution can be generated using cells whose division is blocked by a chemical (eg colcemid) that disrupts the mitotic spindle during metaphase. Chromosomes can be treated with trypsin in a short time followed by Giemsa staining. A band light-dark pattern was developed for each chromosome so that each chromosome could be identified. FISH technology can be used with DNA sequences that are 500 or 600 bases in length. However, clones longer than 1,000 bases are more likely to bind to unique chromosomal locations with sufficient signal intensity for easy detection. Preferably 1,000 bases, more preferably 2,000 bases may be sufficient to obtain good results in a reasonable time. For a review of the technology, see Verma et al. (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988)). Chromosome mapping can be inferred in silico and using taxonomic considerations (eg, score or just proximity).

染色体マッピングのための試薬は、染色体上の一つの部位を決定するのに用いることができる。その上、試薬のパネルは、複数部位および／または複数の染色体をマークするのに用いることができる。実際には、ＧＡＶＥ１８遺伝子のフランキング領域に対応する試薬もマッピング目的にとって好ましい。いくつかのコーディング配列は、遺伝子ファミリー内で保存されている可能性が高く、そのため、染色体マッピングの際のクロスハイブリダイゼーションが起こる確率が増加する。   Reagents for chromosome mapping can be used to determine a single site on a chromosome. Moreover, a panel of reagents can be used to mark multiple sites and / or multiple chromosomes. In practice, a reagent corresponding to the flanking region of the GAVE18 gene is also preferred for mapping purposes. Some coding sequences are likely conserved within a gene family, thus increasing the probability of cross-hybridization during chromosomal mapping.

正確な染色***置に配列がマッピングされれば、染色体上の配列の物理的位置を、遺伝子地図データと関係付けることができる。（このようなデータは、例えばＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ［Ｍａｎで見出されており、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙにおいてオンラインで利用可能である）。続いて、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係を連鎖分析により同定することができ（物理学的に隣接した遺伝子の共遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））、例えばＥｇｅｌａｎｄ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７年）３２５：７８３〜７８７で説明される。   Once the sequence is mapped to the exact chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be related to genetic map data. (Such data is found, for example, at McKusick, Mendelian Inheritance [Man and available online at Johns Hopkins University, Welch Medical Library). Subsequently, the relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease can be identified by linkage analysis (co-inheritance of physically adjacent genes), eg, Egeland et al., Nature (1987). 325: 783-787.

その上、ＧＡＶＥ１８に関連する病気に罹った個体と罹っていない固体との間のＤＮＡ配列における差を決定することができる。ある突然変異が罹患した個体のいくつかまたは全部で観察されるが、罹患していない個体では観察されない場合、その突然変異は、特定の病気の原因因子である可能性がある。一般的に、罹患した個体と罹患していない個体との比較は、初めに、染色体分布から見てわかる、またはＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲで検出可能な欠失や転座のような染色体における構造的改変を探すことを含む。最終的には、数々の個体からの遺伝子の完全な配列解析を行い、突然変異の存在を確認し、突然変異を多型と区別することができる。   In addition, differences in DNA sequence between individuals with and without an illness associated with GAVE18 can be determined. If a mutation is observed in some or all of the affected individuals, but not in an unaffected individual, the mutation may be a causative factor for a particular disease. In general, a comparison between affected and unaffected individuals begins with the structure in the chromosome, such as deletions or translocations that are first seen by chromosome distribution or detectable by PCR based on DNA sequences. To search for a specific alteration. Ultimately, complete sequence analysis of genes from a number of individuals can be performed to confirm the presence of the mutation and to distinguish the mutation from the polymorphism.

２．組織型別
本発明のＧＡＶＥ１８配列はまた、わずかな生物学的なサンプルから個体を同定するのに用いることができる。アメリカ合衆国軍は、例えば、兵士の同定のために制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用することが考慮している。その技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１またはそれ以上の制限酵素で消化され、サザンブロットで調査され、同定のための特有のバンドを得ることができる。該方法は、失われたり、切り替えられたり、盗難されたりして明確な同定を困難にする現状の「認識票（Ｄｏｇ Ｔａｇ）」の制限を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰのための追加のＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５,２７２,０５７号で説明された）。 2. The GAVE18 sequences of the present invention by tissue type can also be used to identify individuals from a small number of biological samples. The United States military is considering using, for example, restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) for soldier identification. In that technique, an individual's genomic DNA can be digested with one or more restriction enzymes and examined on a Southern blot to obtain a unique band for identification. The method is not subject to the limitations of the current “Dog Tag” that is lost, switched, or stolen, making clear identification difficult. The sequences of the present invention are useful as additional DNA markers for RFLP (described in US Pat. No. 5,272,057).

その上、本発明の配列を用いて、個々のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替技術を提供することができる。従って、本明細書において説明されたＧＡＶＥ１８配列を、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを製造するのに用いることができる。続いて、プライマーを、個々のＤＮＡを増幅するのに用い、その後、その配列を提供することができる。   Moreover, the sequences of the present invention can be used to provide an alternative technique for determining the actual base-by-base DNA sequence of selected portions of individual genomes. Thus, the GAVE18 sequence described herein can be used to produce two PCR primers from the 5 'and 3' ends of the sequence. Subsequently, primers can be used to amplify individual DNAs and then provide their sequences.

各個体は対立遺伝子の違いによりこのようなＤＮＡ配列の特有のセットを有するために、その方法で製造された個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルから、特有の個体を同定することができる。本発明の配列を、個体および組織からのこのような同定配列を得るのに用いることができる。本発明のＧＡＶＥ１８配列は、ヒトゲノムの部分に特有に存在する。対立遺伝子の変異は、配列のコーディング領域ではある程度発生し、非コーディング領域ではより多く発生する。個々のヒト間の対立遺伝子変異は、５００塩基ごとに約１回の頻度発生すると推測される。本明細書において説明される各配列は、ある程度は、個体からのＤＮＡと同定目的で比較可能な標準として用いることができる。より多数の多型が非コーディング領域で発生する場合は、より少ない配列で個体を識別することができる。配列番号１の非コーディング配列は、約１０〜１,０００種のプライマーのパネル（それぞれ１００塩基の増幅された非コーディング配列を生じる）を用いた陽性個体の同定を提供することができる。予測されたコーディング配列（例えば配列番号１の配列）が用いられる場合、陽性個体の同定のためのより適切な数のプライマーは、５００〜２,０００種であり得る。   Because each individual has a unique set of such DNA sequences due to allelic differences, a unique individual can be identified from a panel of corresponding DNA sequences from individuals produced by that method. The sequences of the present invention can be used to obtain such identification sequences from individuals and tissues. The GAVE18 sequences of the present invention are uniquely present in portions of the human genome. Allelic variation occurs to some extent in the coding region of the sequence and more frequently in the non-coding region. It is estimated that allelic variation between individual humans occurs about once every 500 bases. Each sequence described herein can be used to some extent as a standard that can be compared with DNA from an individual for identification purposes. If more polymorphisms occur in the non-coding region, individuals can be identified with fewer sequences. The non-coding sequence of SEQ ID NO: 1 can provide identification of positive individuals using a panel of approximately 10-1,000 primers, each resulting in an amplified non-coding sequence of 100 bases. When the predicted coding sequence (eg, the sequence of SEQ ID NO: 1) is used, a more appropriate number of primers for identification of positive individuals can be between 500 and 2,000 species.

本明細書において説明されたＧＡＶＥ１８配列からの試薬パネルを用いて個体に特有の同定データベースを作成した場合、後々、その同じ試薬をその個体からの組織を同定するのに用いることができる。特有の同定データベースを用いれば、個体が生きていても死んでいても、きわめて少量の組織サンプルから陽性の同定が可能である。   If an individual-specific identification database is created using a reagent panel from the GAVE18 sequence described herein, the same reagent can later be used to identify tissue from that individual. Using a unique identification database, positive identification is possible from a very small tissue sample, whether the individual is alive or dead.

３．法医生物学における部分的なＧＡＶＥ１８配列の使用
ＤＮＡはまた、同定技術に基づいて、法医生物学に用いることができる。法医生物学とは、例えば犯罪の加害者を陽性同定する手段として、犯罪現場で発見された生物学的な証拠の遺伝子型決定を用いる科学的な分野である。このような同定を行うために、ＰＣＲテクノロジーを、組織、例えば、犯罪現場で発見された髪もしくは皮膚、または体液（例えば血液、唾液または***）のような非常に少量の生物学的なサンプルから得られたＤＮＡ配列を増幅するのに用いることができる。続いて、増幅された配列と標準とを比較し、それにより、生物学的なサンプルの起源を同定することができる。 3. Use of partial GAVE18 sequences in forensic biology DNA can also be used in forensic biology based on identification techniques. Forensic biology is a scientific field that uses genotyping of biological evidence found in crime scenes, for example, as a means of positively identifying perpetrators of crime. To make such an identification, PCR technology can be used from tissues, for example hair or skin found in crime scenes, or from very small biological samples such as body fluids (eg blood, saliva or semen). It can be used to amplify the resulting DNA sequence. Subsequently, the amplified sequence and the standard can be compared, thereby identifying the source of the biological sample.

本発明の配列を用いて、ポリヌクレオチド試薬、例えば、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的としたＰＣＲプライマーを提供することができる。対象の核酸は、ＤＮＡに基づく法医学的同定の信頼度を高めることができる。例えば、対象の核酸は、他の「同定マーカー」（すなわち特定の個体に特有の他のＤＮＡ配列）を提供することができる。上述したように、実際の塩基配列情報を、制限酵素で生じた断片により形成されたパターンの正確な代替物として、同定に用いることができる。より多くの多型が非コーディング領域で発生するため、配列番号１の非コーディング領域を標的とした配列がそのような使用に特に適切であり、その技術を用いて個体の識別力を高めることができる。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＧＡＶＥ１８配列またはそれらの部分、例えば少なくとも２０または３０塩基の長さの配列番号１の非コーディング領域から誘導された断片、が挙げられる。   The sequences of the present invention can be used to provide PCR reagents targeting polynucleotide reagents, eg, specific loci in the human genome. The nucleic acid of interest can increase the reliability of forensic identification based on DNA. For example, the nucleic acid of interest can provide other “identification markers” (ie other DNA sequences that are unique to a particular individual). As described above, the actual nucleotide sequence information can be used for identification as an accurate substitute for the pattern formed by fragments generated by restriction enzymes. Since more polymorphisms occur in the non-coding region, sequences targeting the non-coding region of SEQ ID NO: 1 are particularly suitable for such use, and the technique can be used to increase individual discrimination it can. Examples of polynucleotide reagents include GAVE18 sequences or portions thereof, eg, fragments derived from the non-coding region of SEQ ID NO: 1 that are at least 20 or 30 bases in length.

本明細書において説明されたＧＡＶＥ１８配列を用いて、ポリヌクレオチド試薬、例えば、標識されたプローブまたは標識可能なプローブをさらに提供することができ、これらを例えばインサイチュハイブリダイゼーション技術で用いて、特定の組織（例えば脳組織）を同定することができる。法医学病理学者に起源が未知の組織が提出された場合、この技術は非常に有用であり得る。このようなＧＡＶＥ１８プローブのパネルを、種および／または器官タイプで組織を同定するのに用いることができる。   The GAVE18 sequences described herein can be used to further provide polynucleotide reagents, such as labeled or labelable probes, which can be used, for example, in in situ hybridization techniques to identify specific tissues. (Eg brain tissue) can be identified. This technique can be very useful when a tissue of unknown origin is submitted to a forensic pathologist. Such a panel of GAVE18 probes can be used to identify tissue by species and / or organ type.

類似の様式において、該試薬、例えばＧＡＶＥ１８プライマーまたはプローブは、汚染に関して組織培養物をスクリーニングする（すなわち異なるタイプの細胞の混合物が培養物中に存在するかどうかをスクリーニングする）のに用いることができる。   In a similar manner, the reagent, eg, GAVE18 primer or probe, can be used to screen a tissue culture for contamination (ie, screen for a mixture of different types of cells in the culture). .

Ｂ．予測医学
本発明はまた、予測医学の分野に関し、該分野において、予後（予測）目的のために、診断分析、予後分析、薬理ゲノム学および臨床試験のモニターが用いられ、それにより、予防的に個体を治療することができる。従って、本発明の一つの観点は、生物学的なサンプル（例えば血液、尿、便、痰、血清、細胞または組織）においてＧＡＶＥ１８タンパク質および／または核酸発現、同様に、ＧＡＶＥ１８活性を決定するための診断分析に関する。該分析により、個体が病気または疾患に苦しめられているか、または、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する疾患を発症させる危険があるかどうかを決定することができる。 B. Predictive Medicine The present invention also relates to the field of predictive medicine, in which diagnostic analysis, prognostic analysis, pharmacogenomics and clinical trial monitors are used for prognostic (predictive) purposes, thereby prophylactically. Individuals can be treated. Accordingly, one aspect of the present invention is for determining GAVE18 protein and / or nucleic acid expression, as well as GAVE18 activity, in a biological sample (eg, blood, urine, stool, sputum, serum, cells or tissue). Concerning diagnostic analysis. The analysis can determine whether the individual is afflicted with a disease or disorder or is at risk of developing a disease associated with abnormal GAVE18 expression or activity.

本発明はまた、個体が、ＧＡＶＥ１８タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患を発症させる危険があるかどうかを決定することための、予後（または予測）分析を提供する。例えば、ＧＡＶＥ１８遺伝子における変異を、生物学的なサンプルにおいて分析することができる。このような分析を、予後または予測目的で用い、それにより、ＧＡＶＥ１８タンパク質、核酸発現または活性を特徴とするまたは、それらに関する疾患が発病する前に、個体を予防的に治療することができる。   The present invention also provides a prognostic (or predictive) analysis to determine whether an individual is at risk of developing a disease related to GAVE18 protein, nucleic acid expression or activity. For example, mutations in the GAVE18 gene can be analyzed in a biological sample. Such an analysis can be used for prognostic or predictive purposes, whereby individuals can be treated prophylactically before the disease is characterized by or related to GAVE18 protein, nucleic acid expression or activity.

本発明の他の観点は、個体においてＧＡＶＥ１８タンパク質、核酸発現またはＧＡＶＥ１８活性を決定する方法を提供し、該方法により、その個体に適した治療剤または予防剤を選択することができる（本明細書においては「薬理ゲノム学」とも称する）。薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に反応する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基いて、個体の治療的または予防的処理のために薬剤（例えば薬物）を選択することを可能にする。   Another aspect of the present invention provides a method for determining GAVE18 protein, nucleic acid expression or GAVE18 activity in an individual, whereby a therapeutic or prophylactic agent suitable for that individual can be selected (herein). Also referred to as “pharmacogenomics”). Pharmacogenomics is based on an individual's genotype (eg, an individual's genotype tested to determine an individual's ability to respond to a particular drug), for the therapeutic or prophylactic treatment of an individual. (E.g. drug) can be selected.

本発明のさらに他の観点は、臨床試験において、薬剤（例えば薬物またはその他の化合物）のＧＡＶＥ１８の発現または活性に対する影響をモニターすることに関する。上記物質およびその他の物質を以下の章でさらに詳細に説明する。   Yet another aspect of the invention relates to monitoring the effect of drugs (eg drugs or other compounds) on GAVE18 expression or activity in clinical trials. These and other materials are described in more detail in the following sections.

１．診断分析
生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ１８の存在または非存在を検出する典型的な方法は、被検体から生物学的なサンプルを得ること、および、生物学的なサンプルと、ＧＡＶＥ１８タンパク質、または、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ１８の存在が検出されるようにＧＡＶＥ１８タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することが可能な化合物または薬剤とを接触させること、を含む。ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい薬剤は、ＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズすることが可能な標識された核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、完全長ＧＡＶＥ１８核酸でもよいし、例えば配列番号１の核酸またはそれらの部分、例えば、長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００個のヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでもよい。本発明の診断分析において使用するための他の適切なプローブは、本明細書において説明されている。 1. Diagnostic Analysis A typical method for detecting the presence or absence of GAVE18 in a biological sample is to obtain a biological sample from a subject, and the biological sample and GAVE18 protein or organism Contacting with a compound or agent capable of detecting a nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA) encoding a GAVE18 protein such that the presence of GAVE18 is detected in a biological sample. A preferred agent for detecting GAVE18 mRNA or genomic DNA is a labeled nucleic acid probe capable of hybridizing to GAVE18 mRNA or genomic DNA. The nucleic acid probe can be, for example, a full-length GAVE18 nucleic acid, eg, a nucleic acid of SEQ ID NO: 1 or a portion thereof, eg, at least 15, 30, 50, 100, 250, or 500 nucleotides in length, and a string It may be sufficient oligonucleotides to specifically hybridize to GAVE18 mRNA or genomic DNA under gentle conditions. Other suitable probes for use in the diagnostic analysis of the present invention are described herein.

ＧＡＶＥ１８タンパク質を検出するのに好ましい薬剤は、ＧＡＶＥ１８タンパク質と結合可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体でもよいが、より好ましくはモノクローナル抗体である。完全抗体またはそれらの断片（例えば、Ｆ_abまたはＦ_(ab')2）を用いることができる。用語「生物学的なサンプル」は、被検体から単離された組織、細胞および生物学的な液体、同様に、被検体中に存在する組織、細胞および液体を含むこととする。すなわち、本発明の検出方法を用いて、インビボおよびインビトロで、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、インビボでのＧＡＶＥ１８のｍＲＮＡの検出技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。インビトロでのＧＡＶＥ１８タンパク質の検出技術としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、および、免疫蛍光法が挙げられる。インビトロでのＧＡＶＥ１８ゲノムＤＮＡの検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。その上、インビボでのＧＡＶＥ１８タンパク質の検出技術としては、被検体に標識された抗ＧＡＶＥ１８抗体を導入することが挙げられる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識し、被検体におけるその存在および位置を標準的なイメージング技術で検出することができる。 A preferred agent for detecting GAVE18 protein is an antibody capable of binding to GAVE18 protein, preferably an antibody with a detectable label. The antibody may be a polyclonal antibody, but more preferably is a monoclonal antibody. Complete antibodies or fragments thereof (eg, F _ab or F _{(ab ′) 2} ) can be used. The term “biological sample” is intended to include tissues, cells and biological fluids isolated from a subject, as well as tissues, cells and fluids present in a subject. That is, the detection method of the present invention can be used to detect GAVE18 mRNA, protein or genomic DNA in biological samples in vivo and in vitro. For example, in vivo GAVE18 mRNA detection techniques include Northern hybridization and in situ hybridization. In vitro GAVE18 protein detection techniques include ELISA, Western blot, immunoprecipitation, and immunofluorescence. Southern hybridization is a technique for detecting GAVE18 genomic DNA in vitro. In addition, in vivo GAVE18 protein detection techniques include introducing an anti-GAVE18 antibody labeled into a subject. For example, an antibody can be labeled with a radioactive marker and its presence and location in a subject detected by standard imaging techniques.

一実施形態において、生物学的なサンプルは、被検体からのタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的なサンプルは、被検体からのｍＲＮＡ分子、または、被検体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的なサンプルは、通常の手段で被検体から単離された末梢血液白血球サンプルである。   In one embodiment, the biological sample contains protein molecules from the subject. Alternatively, the biological sample can contain mRNA molecules from the subject or genomic DNA molecules from the subject. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means.

従って、キャリアーまたは患者における病気の関連、および、核酸またはタンパク質多型の診断薬の同定は、予後または診断分析の開発に有用であり得る。例えば、リウマチ様関節炎、喘息、クローン病などのための予後または診断分析があることは有利であり得る。ＧＡＶＥ１８発現は、活性化状態または炎症性状態に関連する細胞で上昇する。炎症に関する障害としては、アナフィラキシー状態、大腸炎、クローン病、水腫状の状態、接触過敏症、アレルギー、関節炎のその他の形態、髄膜炎およびその他の状態が挙げられ、この場合、免疫系が反応し、血管拡張、熱、細胞や体液の集合などにより、膨張を起こす部位で炎症が起こる。従って、ＧＡＶＥ１８代謝における障害は、リウマチ様関節炎の診断であり得る。その上、リウマチ様関節炎の分子メカニズムは、検出可能であり、例えば、診断ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、発現レベルの変動性、機能の変動性などが可能であり、これらは組織サンプル（例えば血液サンプル）で検出可能である。   Thus, the identification of diagnostics of disease associations and nucleic acid or protein polymorphisms in carriers or patients can be useful in the development of prognosis or diagnostic analyses. For example, it may be advantageous to have a prognostic or diagnostic analysis for rheumatoid arthritis, asthma, Crohn's disease, and the like. GAVE18 expression is elevated in cells associated with an activated or inflammatory condition. Inflammation-related disorders include anaphylactic conditions, colitis, Crohn's disease, edematous conditions, contact hypersensitivity, allergies, other forms of arthritis, meningitis and other conditions, in which the immune system reacts Inflammation occurs at the site where swelling occurs due to vasodilation, heat, cell and fluid collection. Thus, a disorder in GAVE18 metabolism can be a diagnosis of rheumatoid arthritis. In addition, the molecular mechanism of rheumatoid arthritis can be detected, for example, diagnostic SNP, RFLP, expression level variability, functional variability, etc., which are detected in tissue samples (eg blood samples) Is possible.

他の実施形態において、該方法は、コントロール被検体から生物学的なサンプルを得ること、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が検出されるように、コントロールサンプルと、ＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または薬剤とを接触させること、および、コントロールサンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量と、試験サンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量とを比較すること、をさらに含む。   In other embodiments, the method obtains a biological sample from a control subject, detects the presence of GAVE18 protein, mRNA or genomic DNA in the biological sample, Contacting with a compound or agent capable of detecting protein, mRNA or genomic DNA, and the presence and amount of GAVE18 protein, mRNA or genomic DNA in the control sample and the presence and presence of GAVE18 protein, mRNA or genomic DNA in the test sample and Comparing the amount.

化学物質ライブラリーのハイスループット分析
ＧＡＶＥ１８活性を調節できる化合物のあらゆる分析をハイスループットスクリーニングで処理することができる。ハイスループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ社，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，メントール，オハイオ州；ベックマンインスツルメンツ社，フラトン，カリフォルニア州；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ナティック，マサチューセッツ州などを参照）。一般的には、これらのシステムは、全サンプルおよび試薬ピペッティング、液体調剤、時間を定めたインキュベート、および分析に適した検出器で
のマイクロプレートの最終的な読み取りなどの全手順を自動化している。これら設定可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速なスタートアップ、同様に、高度なフレキシビリティーおよびカスタマイズを提供する。このようなシステムの製造元は、様々なハイスループットの詳細なプロトコールを提供している。従って、例えばＺｙｍａｒｋ社は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを説明する技術便覧を提供している。 High-throughput analysis of chemical libraries
Any analysis of compounds capable of modulating GAVE18 activity can be handled with high throughput screening. High throughput screening systems are commercially available (eg, Zymark, Hopkinton, Mass .; Air Technical
Industries, Mentor, Ohio; see Beckman Instruments, Inc., Fullerton, California; Precision Systems, Natick, Massachusetts, etc.). In general, these systems automate all procedures such as whole sample and reagent pipetting, liquid dispensing, timed incubation, and final reading of the microplate with a detector suitable for analysis. Yes. These configurable systems offer high throughput and quick start-up as well as a high degree of flexibility and customization. The manufacturers of such systems provide various high-throughput detailed protocols. Thus, for example, Zymark provides a technical handbook describing a screening system for detecting regulation of gene transcription, ligand binding, and the like.

キット
本発明はまた、生物学的なサンプル（試験サンプル）においてＧＡＶＥ１８の存在を検出するためのキットを含む。このようなキットをに用いて、ＧＡＶＥ１８の異常な発現に関連する疾患（例えば免疫疾患）に罹っているのかどうか、または、それらを発症させる危険が増加しているのかどうかを決定することができる。例えば、該キットは、生物学的なサンプルにおいてＧＡＶＥ１８タンパク質またはｍＲＮＡを検出することが可能な標識された化合物または薬剤、および、サンプル中のＧＡＶＥ１８の量を決定する手段（例えば、ＧＡＶＥ１８（例えば配列番号１）をコードするＤＮＡに結合する抗ＧＡＶＥ１８抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）、を含み得る。キットはまた、ＧＡＶＥ１８タンパク質またはｍＲＮＡの量が正常値より高いかまたは低い場合、試験された被検体が、ＧＡＶＥ１８の異常な発現に関連する疾患に罹っているかどうか、または、それらを発症させる危険があるかどうかを示す結果を得るために用いることもできる。 Kits The present invention also includes kits for detecting the presence of GAVE18 in a biological sample (test sample). Such kits can be used to determine whether a person is suffering from a disease associated with abnormal expression of GAVE18 (eg, an immune disease) or whether the risk of developing them is increased. . For example, the kit can be a labeled compound or agent capable of detecting GAVE18 protein or mRNA in a biological sample and a means for determining the amount of GAVE18 in the sample (eg, GAVE18 (eg, SEQ ID NO: Anti-GAVE18 antibody or oligonucleotide probe that binds to DNA encoding 1). The kit may also determine if the amount of GAVE18 protein or mRNA is higher or lower than normal, whether the tested subject suffers from or is at risk of developing a disease associated with abnormal expression of GAVE18. It can also be used to obtain a result indicating whether there is.

抗体ベースのキットに関しては、該キットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ１８タンパク質に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に付着させた）；および、必要に応じて（２）ＧＡＶＥ１８タンパク質または第一の抗体に結合し、検出可能な薬剤と結合する第二の異なる抗体、を含んでもよい。第二の抗体が存在しない場合、第一の抗体が検出可能に標識されるか、または、第一の抗体に結合する他の分子が検出可能に標識されるかのいずれかである。いずれの事象においても、標識された結合成分が誘導され、当業界で既知の検出可能なレポーター分子として作用する。   For antibody-based kits, the kit includes, for example: (1) a first antibody that binds to GAVE18 protein (eg, attached to a solid support); and (2) GAVE18 protein or first as required And a second different antibody that binds to a detectable agent. If the second antibody is not present, either the first antibody is detectably labeled or other molecules that bind to the first antibody are detectably labeled. In either event, the labeled binding component is derived and acts as a detectable reporter molecule known in the art.

オリゴヌクレオチドベースのキットに関しては、本発明のキットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ１８核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）ＧＡＶＥ１８核酸分子増幅に有用な１対のプライマー、を含んでもよい。   With respect to oligonucleotide-based kits, the kits of the present invention are useful, for example: (1) oligonucleotides that hybridize to GAVE18 nucleic acid sequences, eg, detectably labeled oligonucleotides, or (2) GAVE18 nucleic acid molecule amplification A pair of primers may be included.

該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤を含んでもよい。該キットはまた、検出可能な薬剤（例えば酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含んでもよい。その上、該キットはまた、含まれた試験サンプルを分析し、比較することができるコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含んでもよい。該キットの各成分は、通常、個別のコンテナーに封入され、それぞれのコンテナーは全部、１つのパッケージに入れられる。試験された被検体が、ＧＡＶＥ１８の異常な発現に関連する疾患に罹っているかどうか、または、それを発症させる危険があるかどうかを調べるための説明書も封入することができる。   The kit may also include, for example, a buffer, a preservative, or a protein stabilizer. The kit may also include components necessary to detect a detectable agent (eg, an enzyme or substrate). Moreover, the kit may also include a control sample or a series of control samples that can analyze and compare the included test samples. Each component of the kit is usually enclosed in a separate container, and each container is all in one package. Instructions can also be included to determine whether the tested subject is suffering from or at risk of developing a disease associated with abnormal expression of GAVE18.

２．予後分析
その上、本明細書において説明された方法を、診断または予後分析として利用して、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被検体を同定することができる。例えば、上述の診断分析または以下の分析などの、本明細書において説明される分析を用いて、ＧＡＶＥ１８タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被検体を同定することができる。例えば、近年は、細菌との接触や、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎に関する炎症が分析で調べることができる。あるいは、該予後分
析を用いて、このような病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被検体を同定することができる。 2. Prognostic Analysis In addition, a subject having or at risk of developing a disease or disorder associated with abnormal GAVE18 expression or activity, using the methods described herein as a diagnostic or prognostic analysis Can be identified. For example, the analysis described herein, such as the diagnostic analysis described above or the following analysis, is used to identify subjects who have or are at risk of developing a GAVE18 protein, nucleic acid expression or activity can do. For example, in recent years, contact with bacteria and inflammation associated with asthma, chronic obstructive pulmonary disease and rheumatoid arthritis can be analyzed. Alternatively, the prognostic analysis can be used to identify a subject having or at risk of developing such a disease or disorder.

従って、本発明は、試験サンプルを被検体から採取し、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供する。該方法において、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それらを発症させる危険がある被検体に関する診断になる。本発明で用いられる「試験サンプル」は、対象の被検体から得られた生物学的なサンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生物学的な液体（例えば血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。   Accordingly, the present invention provides a method of taking a test sample from a subject and detecting GAVE18 protein or nucleic acid (eg, mRNA, genomic DNA). In the method, the presence of GAVE18 protein or nucleic acid becomes a diagnosis for a subject having or at risk of developing a disease or disorder associated with abnormal GAVE18 expression or activity. As used herein, “test sample” means a biological sample obtained from a subject of interest. For example, the test sample can be a biological fluid (eg, serum), a cell sample, or a tissue.

その上、本明細書において説明される予後分析を用いて、被検体に、薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）を投与できるかどうかを決定し、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する病気または疾患を治療することができる。例えば、このような方法を用いて、特定の薬剤または薬剤クラス（例えばＧＡＶＥ１８活性を減少させるタイプの薬剤）で効果的に被検体を治療することができるかどうかを決定することができる。従って、本発明は、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する疾患のための薬剤で被検体を効果的に治療することができるかどうかを決定する方法を提供し、該方法において、試験サンプルを採取し、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸を検出する（例えば、該方法において、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する疾患を治療するための薬剤を投与することができる被検体に関する診断になる）。   In addition, can the prognostic analysis described herein be used to administer an agent (eg, agonist, antagonist, peptide mimetic, protein, peptide, nucleic acid, small molecule or other drug candidate) to a subject? Can be determined to treat a disease or disorder associated with abnormal GAVE18 expression or activity. For example, such methods can be used to determine whether a subject can be effectively treated with a particular drug or drug class (eg, a type of drug that decreases GAVE18 activity). Accordingly, the present invention provides a method for determining whether a subject can be effectively treated with an agent for a disease associated with abnormal GAVE18 expression or activity, in which a test sample is taken. A GAVE18 protein or nucleic acid is detected (eg, in the method, a diagnosis relating to a subject in which the presence of the GAVE18 protein or nucleic acid can be administered an agent for treating a disease associated with abnormal GAVE18 expression or activity) become).

また本発明の方法を用いて、ＧＡＶＥ１８遺伝子における遺伝子の損傷または突然変異を検出し、それにより損傷した遺伝子を有する被検体が、異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする疾患に関する危険を有するかどうかを決定することもできる。好ましい実施形態において、該方法は、被検体からの細胞サンプルにおいて、ＧＡＶＥ１８−タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの改変、または、ＧＡＶＥ１８遺伝子の誤った発現を特徴とする遺伝子の損傷または突然変異の存在または非存在を検出することを含む。例えば、このような遺伝子の損傷または突然変異は、以下の少なくとも１つが存在することを確認することによって検出することができる：１）ＧＡＶＥ１８遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）ＧＡＶＥ１８遺伝子への１またはそれ以上のヌクレオチドの付加；３）ＧＡＶＥ１８遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）ＧＡＶＥ１８遺伝子を含む染色体の配列換え；５）ＧＡＶＥ１８遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルにおける改変；６）ＧＡＶＥ１８遺伝子の異常な改変、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン；7）ＧＡＶＥ１８タンパク質の非野生型のレベル；8）ＧＡＶＥ１８遺伝子の対立遺伝子の喪失；および、9）ＧＡＶＥ１８タンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において説明されるように、ＧＡＶＥ１８遺伝子における損傷検出するのに用いることができる当業界既知の多数の分析技術がある。好ましい生物学的なサンプルは、通常の手段で被検体から単離された末梢血液白血球サンプルである。   Also, using the method of the present invention, a gene damage or mutation in the GAVE18 gene is detected, and thus the subject having the damaged gene is at risk for a disease characterized by abnormal cell proliferation and / or differentiation. You can also decide whether or not. In a preferred embodiment, the method comprises, in a cell sample from a subject, at least one modification that affects the integrity of the gene encoding GAVE18-protein, or of a gene characterized by incorrect expression of the GAVE18 gene. Including detecting the presence or absence of an injury or mutation. For example, such gene damage or mutations can be detected by confirming the presence of at least one of the following: 1) deletion of one or more nucleotides from the GAVE18 gene; 2) Addition of one or more nucleotides to the GAVE18 gene; 3) substitution of one or more nucleotides of the GAVE18 gene; 4) rearrangement of the chromosome containing the GAVE18 gene; 5) modification at the messenger RNA transcription level of the GAVE18 gene; 6) aberrant modification of the GAVE18 gene, eg, methylation pattern of genomic DNA; 7) non-wild type level of GAVE18 protein; 8) loss of allele of GAVE18 gene; and 9) inappropriate post-translation of GAVE18 protein Qualification. There are numerous analytical techniques known in the art that can be used to detect damage in the GAVE18 gene, as described herein. A preferred biological sample is a peripheral blood leukocyte sample isolated from a subject by conventional means.

特定の実施形態において、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照）、またあるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）２４１：１０７７〜１０８０；および、Ｎａｋａｚａｗａ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４年）９１：３６０〜３６４を参照）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、ＬＣＲは、ＧＡＶＥ１８遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（例えばＡｂｒａｖａｙａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９５年）２３：６７５〜６８２を参照）。該方法は、患者から細胞サンプルを回収する工程、サンプル細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、核酸サンプルと、ＧＡＶＥ１８遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅（存在する場合）が起こるような条件下でＧＡＶＥ１８遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマーとを接触させる工程、および、増幅産物の存在または非存在を検出する工程、または、増幅産物の大きさを検出する工程、および、コントロールサンプルに対して長さ比較する工程、を含み得る。本明細書において説明される突然変異を検出するのに用いられる技術のいずれかの使用と共に、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲを予備的な増幅工程として用いることが望ましいと考えられる。   In certain embodiments, damage detection is performed by polymerase chain reaction (PCR) such as anchor PCR or RACE PCR (see, eg, US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202), or alternatively Probe / primers in Ligation Chain Reaction (LCR) (see, for example, Landegran et al., Science (1988) 241: 1077-1080; and Nakazawa et al., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 360-364). Use, including LCR, may be particularly useful for detecting point mutations in the GAVE18 gene (see, eg, Abravaya et al., Nucleic Acids Res (1995) 23: 675-682). The method involves recovering a cell sample from a patient, isolating nucleic acid (eg, genome, mRNA or both) from the sample cell, hybridization and amplification (if any) of the nucleic acid sample and the GAVE18 gene. Contacting with one or more primers that specifically hybridize to the GAVE18 gene under such conditions, and detecting the presence or absence of the amplification product, or detecting the size of the amplification product And a step of comparing the length against a control sample. In conjunction with the use of any of the techniques used to detect mutations described herein, it may be desirable to use PCR and / or LCR as a preliminary amplification step.

その代わりの増幅方法としては、自律的な配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９０年）８７：１８７４〜１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９年）８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ等，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８年）６：１１９７）、またはその他のいかなる核酸増幅方法が挙げられ、その後、当業者周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。このような分子が非常に少量で存在する場合、核酸分子を検出するための検出スキームが特に有用である。   Alternative methods of amplification include autonomous sequence replication (Guatelli et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 1874-1878), transcription amplification system (Kwoh et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86. 1173-1177), Q-β replicase (Lizardi et al., Bio / Technology (1988) 6: 1197), or any other nucleic acid amplification method, which was then amplified using techniques well known to those skilled in the art. Detect molecules. Detection schemes for detecting nucleic acid molecules are particularly useful when such molecules are present in very small amounts.

その代わりの実施形態において、サンプル細胞からのＧＡＶＥ１８遺伝子における突然変異を制限酵素切断パターンにおける改変により同定することができる。例えば、サンプルＤＮＡおよびコントロールＤＮＡを単離し、増幅し（必要に応じて）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化させ、断片長サイズをゲル電気泳動により決定し、比較する。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間の断片長サイズの差は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。その上、配列特異的リボザイムの使用（例えば米国特許第５,４９８,５３１号を参照）により、リボザイム切断部位の発達または損失による特異的な突然変異の存在に関して評価することができる。   In an alternative embodiment, mutations in the GAVE18 gene from the sample cells can be identified by alterations in the restriction enzyme cleavage pattern. For example, sample DNA and control DNA are isolated, amplified (if necessary), digested with one or more restriction endonucleases, and fragment length sizes are determined by gel electrophoresis and compared. A difference in fragment length size between sample DNA and control DNA indicates a mutation in the sample DNA. Moreover, the use of sequence specific ribozymes (see, eg, US Pat. No. 5,498,531) can be evaluated for the presence of specific mutations due to the development or loss of ribozyme cleavage sites.

他の実施形態において、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることにより、ＧＡＶＥ１８における遺伝子の突然変異を同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ等，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９６年）７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６年）２：７５３〜７５９）。例えば、光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ（上述したＣｒｏｎｉｎ等において説明された）でＧＡＶＥ１８における遺伝子の突然変異を同定することができる。簡単に言えば、第一のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプル中のＤＮＡの長いストレッチを通してスキャンし、連続的にオーバーラップするプローブの直線状アレイを作製することにより配列間の塩基変化を同定することができる。この工程により点突然変異が同定できる。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレイを行い、検出された全ての変異体または突然変異体に相補的な、より少ない特殊化したプローブアレイを用いて特異的な突然変異を特徴付けることができる。各突然変異アレイは、パラレルプローブセットから成り、１つは野生型遺伝子に相補的であり、他方は、突然変異遺伝子に相補的である。   In other embodiments, identifying a gene mutation in GAVE18 by hybridizing a sample nucleic acid and a control nucleic acid (eg, DNA or RNA) to a high-density array comprising hundreds or thousands of oligonucleotide probes. (Cronin et al., Human Mutation (1996) 7: 244-255; Kozal et al., Nature Medicine (1996) 2: 753-759). For example, gene mutations in GAVE18 can be identified with a two-dimensional array (described in Cronin et al., Supra) containing photogenerated DNA probes. In brief, the first probe hybridization array is used to scan through long stretches of DNA in the sample, creating a linear array of probes that overlap continuously, thereby changing base changes between sequences. Can be identified. This process can identify point mutations. This step can be followed by a second hybridization array to characterize specific mutations with fewer specialized probe arrays that are complementary to all detected variants or mutants. it can. Each mutation array consists of a parallel probe set, one complementary to the wild type gene and the other complementary to the mutant gene.

さらに他の実施形態において、当業界既知の様々な配列解析反応いずれかを用いて、直接的にＧＡＶＥ１８遺伝子を配列解析し、サンプルＧＡＶＥ１８の配列と、対応する野生型（コントロール）配列とを比較することにより突然変異を検出することができる。配列解析反応の例としては、Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７年）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７７年）７４：５４６３）により開発された技術に
基づく技術が挙げられる。診断分析を行う際に様々な自動化配列解析手順のいずれかを用いることも考慮され（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５年）１９：４４８）、例えばマススペクトロメトリーによる配列解析がある（例えばＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ等，Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ（１９９６年）３６：１２７〜１６２；および、Ｇｒｉｆｆｉｎ等，Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３年）３８：１４７〜１５９を参照）。 In still other embodiments, the GAVE18 gene is directly sequenced using any of a variety of sequence analysis reactions known in the art, and the sequence of sample GAVE18 is compared to the corresponding wild type (control) sequence. Mutations can be detected. Examples of sequence analysis reactions include Maxam & Gilbert (Proc Natl Acad
Sci USA (1977) 74: 560) or Sanger (Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74: 5463). It is also contemplated to use any of a variety of automated sequence analysis procedures in performing diagnostic analysis (Bio / Techniques (1995) 19: 448), for example, sequence analysis by mass spectrometry (eg PCT Publication No. WO94 / 16101; Cohen et al., Adv Chromatogr (1996) 36: 127-162; and Griffin et al., Appl Biochem Biotechnol (1993) 38: 147-159).

ＧＡＶＥ１８遺伝子において突然変異を検出するその他の方法としては、切断剤からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５年）２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術は、野生型ＧＡＶＥ１８配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織サンプルから得られた突然変異体である可能性があるＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることにより形成されたヘテロ二本鎖を提供することが必要である。二本鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチにより存在するような二本鎖の一本鎖化された領域を切断する薬剤で処理される。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮアーゼで処理することによりミスマッチ領域を消化することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を消化することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理し、および、ピペリジンで処理することにより、ミスマッチ領域を消化することができる。続いて、ミスマッチ領域を消化した後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルで大きさで分離し、突然変異部位を決定することができる。例えばＣｏｔｔｏｎ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８８年）８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９２年）２１７：２８６〜２９５を参照。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡを検出のために標識することができる。   Other methods for detecting mutations in the GAVE18 gene include methods that detect mismatch bases in RNA / RNA or RNA / DNA duplexes using protection from cleaving agents (Myers et al., Science (1985). Year) 230: 1242). In general, the technique of “mismatch cleavage” hybridizes (labeled) RNA or DNA containing a wild-type GAVE18 sequence with RNA or DNA that may be a mutant obtained from a tissue sample. There is a need to provide heteroduplexes formed by this. The duplex is treated with an agent that cleaves the single stranded region of the duplex as present due to base pair mismatch between the control strand and the sample strand. The mismatch region can be digested by treating the RNA / DNA duplex with RNase, and the mismatch region can be digested by treating the DNA / DNA hybrid with S1 nuclease. In other embodiments, the mismatch region can be digested by treating either DNA / RNA or RNA / DNA duplex with hydroxylamine or osmium tetroxide and with piperidine. Subsequently, after digesting the mismatched region, the resulting material can be separated in size on a denaturing polyacrylamide gel to determine the mutation site. See, for example, Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 4397; Saleeba et al., Methods Enzymol (1992) 217: 286-295. In preferred embodiments, control DNA or RNA can be labeled for detection.

さらに他の実施形態において、細胞サンプルから得られたＧＡＶＥ１８のｃＤＮＡにおいて点突然変異を検出し、マッピングするために定義されたシステムにおいて、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおけるＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにおけるＴを切断する（Ｈｓｕ等，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９４年）１５：１６５７〜１６６２）。典型的な実施形態に従って、ＧＡＶＥ１８配列（例えば野生型ＧＡＶＥ１８配列）に基づくプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物が存在すれば電気泳動プロトコールなどにより検出することができる。例えば米国特許第５,４５９,０３９号を参照。   In yet another embodiment, in a system defined to detect and map point mutations in GAVE18 cDNA obtained from a cell sample, the mismatch cleavage reaction recognizes mismatched base pairs in double stranded DNA. One or more proteins (so-called “DNA mismatch repair” enzymes) are used. For example, E.I. The E. coli mutY enzyme cleaves A in the G / A mismatch and thymidine DNA glycosylase from HeLa cells cleaves T in the G / T mismatch (Hsu et al., Carcinogenesis (1994) 15: 1657-1662). According to an exemplary embodiment, a probe based on a GAVE18 sequence (eg, a wild type GAVE18 sequence) hybridizes to cDNA or other DNA product from a test cell. If the double strand is treated with a DNA mismatch repair enzyme and a cleavage product is present, it can be detected by an electrophoresis protocol or the like. See, for example, US Pat. No. 5,459,039.

他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化を用いて、ＧＡＶＥ１８遺伝子における突然変異を同定することができる。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体と野生型核酸との電気泳動の移動度の差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９年）８６：２７６６；または、Ｃｏｔｏｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ（１９９３年）２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ（１９９２年）９：７３〜７９を参照）。サンプルおよびコントロールＧＡＶＥ１８核酸の一本鎖化ＤＮＡ断片を変性させ、再生させる。一本鎖化核酸の二次構造は配列に応じて変化し、電気泳動の移動度において生じた変化により各個々の塩基変化が検出できる。ＤＮＡ断片を標識するか、または、標識されたプローブで検出することができる。ＲＮＡ（ＤＮＡよりむしろ）を用いて分析の感度を増強することができ、それにおいて、二次構造は、配列における変化に対してより高感度である。好ましい実施形態において、本方法は、ヘテロ二本鎖分析を用いて、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖型ヘテロ二本鎖分子を分離することができる（Ｋｅｅｎ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ（１９９１年）７：５）。   In other embodiments, changes in electrophoretic mobility can be used to identify mutations in the GAVE18 gene. For example, single strand conformation polymorphism (SSCP) can be used to detect differences in electrophoretic mobility between mutants and wild type nucleic acids (Orita et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989). Year) 86: 2766; or Coton, Mutat Res (1993) 285: 125-144; Hayashi, Genet Anal Tech Appl (1992) 9: 73-79). Single-stranded DNA fragments of sample and control GAVE18 nucleic acids are denatured and regenerated. The secondary structure of a single-stranded nucleic acid changes depending on the sequence, and each individual base change can be detected by a change that occurs in the mobility of electrophoresis. The DNA fragment can be labeled or detected with a labeled probe. RNA (rather than DNA) can be used to enhance the sensitivity of the analysis, where the secondary structure is more sensitive to changes in the sequence. In a preferred embodiment, the method can use heteroduplex analysis to separate double stranded heteroduplex molecules based on changes in electrophoretic mobility (Keen et al., Trends Genet ( (1991) 7: 5).

さらに他の実施形態において、変性剤の勾配を有するポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体または野生型断片の移動を、変性剤濃度勾配電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて分析する（Ｍｙｅｒｓ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合、ＤＮＡは、完全には変性しないように改変される（例えば、約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチＤＮＡにＧＣクランプをＰＣＲで加えることにより）。さらなる実施形態において、変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いて、コントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差を同定することができる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ等，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ（１９８７年）２６５：１２７５３）。   In yet another embodiment, the migration of mutant or wild-type fragments in polyacrylamide gels with denaturing gradients is analyzed using denaturing concentration gradient electrophoresis (DGGE) (Myers et al., Nature (1985). 313: 495). When DGGE is used as an analytical method, the DNA is modified so that it is not completely denatured (eg, by adding a GC clamp to the high melting point GC-rich DNA of about 40 bp by PCR). In further embodiments, temperature gradients can be used instead of denaturant gradients to identify mobility differences between control and sample DNA (Rosenbaum et al., Biophys Chem (1987) 265: 12753).

点突然変異を検出するその他の技術の例としては、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、既知の突然変異を中心に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを製造することができ、続いて、完全な適合が見出される場合にのみハイブリダイゼーションが可能な条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる（Ｓａｉｋｉ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年）３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ等，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９年）８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで増幅された標的ＤＮＡ、または、多数の異なる突然変異にハイブリダイズし、その際、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズメンブレンに付着し、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズする。   Examples of other techniques for detecting point mutations include, but are not limited to, selective oligonucleotide hybridization, selective amplification or selective primer extension. For example, oligonucleotide primers centered on known mutations can be produced and subsequently hybridized to the target DNA under conditions that allow hybridization only if a perfect match is found (Saiki et al. , Nature (1986) 324: 163; Saiki et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 6230). Such allele-specific oligonucleotides hybridize to PCR-amplified target DNA, or to a number of different mutations, where the oligonucleotide is attached to the hybridizing membrane and labeled target DNA Hybridize with.

あるいは、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的な増幅テクノロジーを本発明と共に用いることができる。特異的な増幅のためのプライマーとして用いられたオリゴヌクレオチドは、分子の中心に対象の突然変異を有する（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９８９年）１７：２４３７〜２４４８）、または、１つのプライマーの最３’末端に対象の変異を有し、この場合、適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨害または減少させる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ（１９９３年）１１：２３８）。加えて、突然変異領域に新規の制限部位を導入して、切断に基づく検出を行うことも望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ等，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２年）６：１）。特定の実施形態において、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて増幅を行うことも考えられる（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９１年）８８：１８９）。このような場合において、５’配列の３’末端で完全な適合が存在する場合のみライゲートが起こり、増幅の存在または非存在を調べることによって、特異的な部位における既知の突然変異の存在を検出することができる。   Alternatively, allele specific amplification technology by selective PCR amplification can be used with the present invention. Oligonucleotides used as primers for specific amplification have the mutation of interest at the center of the molecule (as amplification depends on differential hybridization) (Gibbs et al., Nucleic Acids Res (1989) 17 : 2437-2448), or having the mutation of interest at the most 3 'end of one primer, where mismatch prevents or reduces polymerase extension under appropriate conditions (Prossner, Tibtech (1993)) 11: 238). In addition, it is also desirable to introduce a new restriction site into the mutated region and perform cleavage-based detection (Gasparini et al., Mol Cell Probes (1992) 6: 1). In certain embodiments, amplification may also be performed using Taq ligase for amplification (Barany, Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88: 189). In such cases, ligation occurs only when there is a perfect match at the 3 'end of the 5' sequence and detects the presence of a known mutation at a specific site by examining the presence or absence of amplification. can do.

本明細書において説明された方法は、例えば、本明細書において説明される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパッケージされた診断キットを用いることによって行うことができる。該キットは、例えば臨床条件においてＧＡＶＥ１８遺伝子に関する病気または疾病の症状を示す患者または家族歴を診断するのに便利に用いることができる。   The methods described herein can be performed, for example, by using a prepackaged diagnostic kit that includes at least one probe nucleic acid or antibody reagent described herein. The kit can be conveniently used to diagnose a patient or family history exhibiting a disease or symptom of a disease associated with the GAVE18 gene in clinical conditions, for example.

その上、ＧＡＶＥ１８が発現される細胞型または組織のいずれも本明細書において説明される予後分析において利用することができる。   Moreover, any cell type or tissue in which GAVE18 is expressed can be utilized in the prognostic analysis described herein.

３．薬理ゲノム学
本明細書において説明されたスクリーニング分析により同定された、ＧＡＶＥ１８活性（例えばＧＡＶＥ１８遺伝子発現）に対して刺激または阻害効果を有する物質またはモジ
ュレーターを個体に投与して、ＧＡＶＥ１８活性に関連する疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎に関連する炎症）を治療する（予防的または治療的に）ことができる。このような治療と共に、個体の薬理ゲノム学（すなわち個体の遺伝子型と、その個体の外来化合物または薬物に対する応答との関係の研究）も考慮することができる。薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との関係が変化するために、治療剤の代謝における差により、深刻な毒性または治療的な失敗が生じる可能性がある。従って、個体の薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型の考察に基づく予防的または治療的処理に効果的な薬剤（例えば薬物）を選択することができる。このような薬理ゲノム学はさらに、適切な投与量および治療方式を決定するのに用いることができる。従って、個体におけるＧＡＶＥ１８タンパク質の活性、ＧＡＶＥ１８核酸の発現、または、ＧＡＶＥ１８遺伝子の突然変異内容を決定し、それにより、個体の治療的または予防的処理に適した薬剤を選択することができる。 3. Pharmacogenomics Diseases associated with GAVE18 activity by administering to the individual a substance or modulator having a stimulatory or inhibitory effect on GAVE18 activity (eg, GAVE18 gene expression) identified by the screening analysis described herein (Eg, inflammation associated with asthma, chronic obstructive pulmonary disease and rheumatoid arthritis) can be treated (prophylactically or therapeutically). Along with such treatment, the pharmacogenomics of an individual (ie, studying the relationship between an individual's genotype and the individual's response to a foreign compound or drug) can be considered. Because of the changing relationship between pharmacologically active drug dose and blood concentration, differences in the metabolism of therapeutic agents can cause serious toxicity or therapeutic failure. Thus, an individual's pharmacogenomics can select an agent (eg, drug) that is effective for prophylactic or therapeutic treatment based on consideration of the individual's genotype. Such pharmacogenomics can further be used to determine the appropriate dosage and regimen. Accordingly, the activity of GAVE18 protein, the expression of GAVE18 nucleic acid, or the mutation content of the GAVE18 gene in an individual can be determined, thereby selecting an agent suitable for the therapeutic or prophylactic treatment of the individual.

薬理ゲノム学は、罹患したヒトにおける変化した薬物の素因および異常な作用による薬物に対する応答における臨床的に顕著な遺伝的変異に対処する。例えばＬｉｎｄｅｒ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ（１９９７年）４３（２）：２５４〜２６６を参照。一般的に、２つのタイプの薬理ゲノム学的な条件を区別することができる。薬物が身体に作用する方法を改変する一つの因子として伝達される遺伝的条件は、「薬物作用が改変された」と称される。体が薬物に作用する方法を改変する一つの因子として伝達される遺伝的条件は、「薬物代謝が改変された」と称される。薬理ゲノム学的な条件は、まれな欠陥または多型のいずれかとして生じる。例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）は、共通して遺伝する酵素病であり、それにおいて、主な臨床的合併症は、酸化剤（抗マラリア剤、サルファ剤、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取、および、ソラマメ摂取の後の溶血である。   Pharmacogenomics addresses clinically significant genetic variation in response to drugs due to altered drug predisposition and abnormal effects in affected humans. See, for example, Linder, Clin Chem (1997) 43 (2): 254-266. In general, two types of pharmacogenetic conditions can be distinguished. A genetic condition that is transmitted as a factor that alters the way a drug acts on the body is termed "drug action has been altered". A genetic condition that is transmitted as a factor that alters the way the body acts on a drug is called "drug metabolism has been altered". Pharmacogenomic conditions occur as either rare defects or polymorphisms. For example, glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency (G6PD) is a commonly inherited enzyme disease in which the main clinical complications are oxidants (antimalarials, sulfa drugs, analgesics, nitrofurans). ) And hemolysis after fava bean consumption.

説明のための実施形態として、薬物を代謝する酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物を代謝する酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、ならびに、シトクロムＰ４５０酵素、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、なぜある患者は標準的で安全な用量の薬物を摂取した後に予想された薬物効果が得られない、または、過剰な薬物応答や深刻な毒性を示すのか、ということに対する説明を提供する。多型は、個体群における２つの表現型、迅速代謝者（ＥＭ）および代謝能が遅い群（ＰＭ）において発現される。ＰＭの出現率は、異なる集団で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高度の多型であり、数々の突然変異がＰＭで同定されており、その変異の全てが機能的なＣＹＰ２Ｄ６の非存在を生じさせる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が遅い群は、標準的な用量を摂取した場合、かなり頻繁に過剰な薬物応答および副作用を経験する。ＣＹＰ２Ｄ６が形成する代謝産物（モルヒネ）が介在するコデインの鎮痛効果に関して実証されたように、代謝産物が活性治療成分である場合、ＰＭは治療反応を示さない。その他の極端な例は、標準的な用量に反応しないいわゆる代謝能が極端に速い群であり。近年、極端に速い代謝の分子機構は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によることが同定されている。   As an illustrative embodiment, the activity of the enzyme that metabolizes the drug is a major determinant of both the intensity and duration of the drug action. The discovery of genetic polymorphisms of drugs that metabolize drugs (eg, N-acetyltransferase 2 (NAT2), and cytochrome P450 enzymes, CYP2D6 and CYP2C19) is why some patients have taken standard safe doses of drugs Provide an explanation for whether the expected drug effect is not achieved or whether it exhibits excessive drug response or severe toxicity. Polymorphisms are expressed in two phenotypes in the population, rapid metabolizer (EM) and slow metabolizing group (PM). The appearance rate of PM differs in different groups. For example, the gene encoding CYP2D6 is a highly polymorphic, and numerous mutations have been identified in PM, all of which result in the absence of functional CYP2D6. Groups with slow metabolic capacity of CYP2D6 and CYP2C19 experience excessive drug response and side effects quite often when taking standard doses. As demonstrated for the analgesic effect of codeine mediated by the metabolite (morphine) formed by CYP2D6, PM does not show a therapeutic response when the metabolite is the active therapeutic ingredient. Another extreme example is the so-called extremely fast metabolizing group that does not respond to standard doses. In recent years, the molecular mechanism of extremely fast metabolism has been identified to be due to CYP2D6 gene amplification.

従って、個体におけるＧＡＶＥ１８タンパク質の活性、ＧＡＶＥ１８核酸の発現、または、ＧＡＶＥ１８遺伝子の突然変異内容を決定することにより、個体の治療的または予防的処理に適した薬剤を選択することができる。加えて、薬理ゲノム学研究を用いて、薬物を代謝する酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定に適用し、個体の薬物反応性表現型を同定することができる。この知識を投薬または薬物選択に適用した場合、それにより副作用または治療の失敗を回避することができ、従って、ＧＡＶＥ１８モジュレーターで、例えば本明細書において説明される典型的なスクリーニング分析の一つにより同定されたモジュレーターで被検体を治療する際に、治療効率または予防効率を高めることができる。   Accordingly, by determining the activity of the GAVE18 protein, the expression of the GAVE18 nucleic acid, or the mutation content of the GAVE18 gene in the individual, an agent suitable for the therapeutic or prophylactic treatment of the individual can be selected. In addition, pharmacogenomic studies can be applied to genotyping polymorphic alleles encoding enzymes that metabolize drugs to identify an individual's drug responsive phenotype. When this knowledge is applied to medication or drug selection, it can avoid side effects or treatment failures and is thus identified with a GAVE18 modulator, for example, by one of the typical screening analyzes described herein. When the subject is treated with the modulated modulator, the therapeutic efficiency or the prevention efficiency can be increased.

４．臨床試験の際の効果のモニター
ＧＡＶＥ１８の発現または活性に対する薬剤（例えば薬物、化合物）の影響（例えば異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングの際だけでなく、臨床試験においても適用可能である。例えば、ＧＡＶＥ１８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を増加させることが本明細書において説明されたスクリーニング分析により決定された薬剤の有効性を、ＧＡＶＥ１８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の減少を示す被検体の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、ＧＡＶＥ１８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることがスクリーニング分析によって決定された薬剤の有効性を、ＧＡＶＥ１８遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の増加を示す被検体の臨床試験においてモニターすることができる。このような臨床試験において、ＧＡＶＥ１８発現または活性、および、好ましくは、例えば細胞増殖疾患に関与するその他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫反応のマーカーとして用いることができる。例えば、制限する目的ではないが、ＧＡＶＥ１８活性（例えば本明細書において説明されるスクリーニング分析により同定された）を調節する薬剤（例えば化合物、薬物または低分子物質）での処理により細胞で調節されるＧＡＶＥ１８などの遺伝子を同定することができる。従って、細胞増殖疾患に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、疾患に関与するＧＡＶＥ１８遺伝子およびその他の遺伝子の発現レベルを分析することができる。遺伝子発現レベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本明細書において説明されるようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、またあるいは、生産されたタンパク質の量を本明細書において説明される方法の一つによって測定することによって、または、ＧＡＶＥ１８遺伝子またはその他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量することができる。その方法において、遺伝子発現パターンは、細胞の薬剤に対する生理学的な応答を示すマーカーとして役立たせることができる。従って、応答状態は、個体の薬剤での治療の前、およびその間の様々な時点で決定することができる。 4). Monitoring effects during clinical trials Monitoring the effects of drugs (eg drugs, compounds) on the expression or activity of GAVE18 (eg ability to modulate abnormal cell growth and / or differentiation) is a fundamental drug screening It is applicable not only to clinical trials but also to clinical trials. For example, a subject exhibiting a decrease in GAVE18 gene expression, protein level or protein activity determined by the screening analysis described herein to increase GAVE18 gene expression, protein level or protein activity. Can be monitored in clinical trials. Alternatively, the effectiveness of a drug determined by screening analysis to reduce GAVE18 gene expression, protein level or protein activity is monitored in clinical trials of subjects exhibiting increased GAVE18 gene expression, protein level or protein activity. Can do. In such clinical trials, GAVE18 expression or activity, and preferably the expression or activity of other genes involved, for example, in cell proliferative disorders can be used as markers of immune responses of specific cells. For example, but not by way of limitation, it is regulated in cells by treatment with an agent (eg, a compound, drug or small molecule) that modulates GAVE18 activity (eg, identified by the screening analysis described herein). Genes such as GAVE18 can be identified. Thus, to study the effects of drugs on cell proliferative disorders, for example, in clinical trials, cells can be isolated, RNA can be prepared, and the expression levels of GAVE18 gene and other genes involved in the disease can be analyzed . Gene expression levels (ie gene expression patterns) are determined by Northern blot analysis or RT-PCR as described herein, or alternatively, the amount of protein produced is one of the methods described herein. Or by measuring the activity level of the GAVE18 gene or other genes. In the method, the gene expression pattern can serve as a marker indicating a physiological response of the cell to the drug. Thus, response status can be determined at various times prior to and during treatment of an individual with an agent.

特定の実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、本明細書において説明されるスクリーニング分析で同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）を用いた被検体の治療有効性をモニターする方法を提供し、該方法は、（ｉ）薬剤の投与の前に被検体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）投与前サンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）被検体から１またはそれ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後サンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を検出する工程；（ｖ）投与前サンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性と、投与後サンプルにおけるＧＡＶＥ１８タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性とをを比較する工程；および、（ｖｉ）それに応じて被検体への薬剤の投与を改変する工程、を含む。例えば、薬剤の投与を増すことにより、検出されたレベルより高いレベルにＧＡＶＥ１８の発現または活性を高めること、すなわち薬剤の有効性を高めることが望ましい。あるいは、薬剤の投与を少なくすることにより、検出されたレベルより低いレベルにＧＡＶＥ１８の発現または活性を減少させること、すなわち薬剤の有効性を減少させることが望ましい。   In certain embodiments, the present invention provides an agent (eg, an agonist, antagonist, peptidomimetic, protein, peptide, nucleic acid, small molecule or other drug candidate identified in the screening analysis described herein). (I) obtaining a pre-administration sample from the subject prior to administration of the drug; (ii) a GAVE18 protein in the pre-administration sample; detecting the expression level of mRNA or genomic DNA; (iii) obtaining one or more post-administration samples from the subject; (iv) determining the expression level or activity of GAVE18 protein, mRNA or genomic DNA in the post-administration sample. Detecting; (v) GAVE1 in the pre-dose sample Comparing the expression level or activity of the protein, mRNA or genomic DNA with the expression level or activity of the GAVE18 protein, mRNA or genomic DNA in the post-administration sample; and (vi) the agent to the subject accordingly Modifying the administration. For example, it is desirable to increase the expression or activity of GAVE18 to a level higher than the level detected, ie, increase the effectiveness of the drug, by increasing the administration of the drug. Alternatively, it is desirable to reduce the expression or activity of GAVE18 to a level below that detected, ie, reduce the effectiveness of the drug, by reducing the administration of the drug.

Ｄ．治療方法
本発明は、疾患の危険がある（または起こしやすい）患者、または、異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する疾患を有する患者を扱う予防方法および治療方法の両方を提供する。このような疾患としては、これらに限定されないが、例えば、炎症性障害、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎が挙げられる。 D. Therapeutic Methods The present invention provides both prophylactic and therapeutic methods for treating patients at risk for (or prone to) disease or having a disease associated with abnormal GAVE18 expression or activity. Such diseases include, but are not limited to, for example, inflammatory disorders such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, and rheumatoid arthritis.

１．予防方法
一つの観点において、本発明は、ＧＡＶＥ１８発現または少なくとも１つのＧＡＶＥ１８活性を調節する薬剤を患者に投与することにより、被検体において異常なＧＡＶＥ１８発現または活性に関連する病気または状態を予防する方法を提供する。異常なＧＡＶＥ１８発現または活性により発症または起因する病気の危険がある患者は、例えば、本明細書において説明される診断または予後分析のいずれか、またはその組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、病気または疾患を予防する、またあるいは進行を遅らせるように、ＧＡＶＥ１８異常の症状特徴が現れる前に行うことができる。ＧＡＶＥ１８異常のタイプに応じて、例えば、ＧＡＶＥ１８アゴニストまたはＧＡＶＥ１８アンタゴニスト剤を患者の治療に用いることができる。適切な薬剤を、本明細書において説明されるスクリーニング分析に基づき決定することができる。 1. In one aspect, the present invention provides a method for preventing a disease or condition associated with abnormal GAVE18 expression or activity in a subject by administering to the patient an agent that modulates GAVE18 expression or at least one GAVE18 activity. I will provide a. Patients at risk of developing or resulting from abnormal GAVE18 expression or activity can be identified, for example, by any of the diagnostic or prognostic analyzes described herein, or a combination thereof. Administration of the prophylactic agent can be performed before the onset of symptom features of GAVE18 abnormalities, so as to prevent the disease or disorder, or delay the progression. Depending on the type of GAVE18 abnormality, for example, a GAVE18 agonist or GAVE18 antagonist agent can be used to treat the patient. The appropriate agent can be determined based on the screening analysis described herein.

２．治療方法
本発明の他の観点は、治療目的でＧＡＶＥ１８発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞と、その細胞に関連するＧＡＶＥ１８タンパク質活性の１またはそれ以上の活性を調節する薬剤とを接触させることを含む。ＧＡＶＥ１８タンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書において説明された薬剤、例えば核酸またはタンパク質、ＧＡＶＥ１８タンパク質、ペプチドの天然に存在する同種のリガンド、ＧＡＶＥ１８ペプチドミメティックまたはその他の低分子物質であり得る。一実施形態において、該薬剤は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ１８タンパク質の生物活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性なＧＡＶＥ１８タンパク質、および、細胞に導入されたＧＡＶＥ１８をコードする核酸分子が挙げられる。他の実施形態において、該薬剤は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ１８タンパク質の生物活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＧＡＶＥ１８核酸分子、および、抗ＧＡＶＥ１８抗体が挙げられる。調節方法は、インビトロで（例えば薬剤と共に細胞を培養することにより）、またあるいは、インビボで（例えば薬剤を被検体に投与することにより）行うことができる。従って、本発明は、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする病気または疾患に罹っている個体を治療する方法を提供する。一実施形態において、該方法は、薬剤（例えば本明細書において説明されるスクリーニング分析で同定された薬剤）、または、ＧＡＶＥ１８発現または活性を調節する（例えばアップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤の組み合わせを投与することを含む。他の実施形態において、該方法は、減少したＧＡＶＥ１８発現または活性または異常なＧＡＶＥ１８発現または活性を埋め合わせるために、治療として、ＧＡＶＥ１８タンパク質または核酸分子を投与することを含む。 2. Therapeutic Methods Another aspect of the invention relates to methods of modulating GAVE18 expression or activity for therapeutic purposes. The modulatory method of the invention comprises contacting a cell with an agent that modulates one or more activities of GAVE18 protein activity associated with the cell. Agents that modulate GAVE18 protein activity can be agents described herein, such as nucleic acids or proteins, GAVE18 proteins, naturally occurring homologous ligands of peptides, GAVE18 peptide mimetics, or other small molecules. In one embodiment, the agent stimulates the biological activity of one or more GAVE18 proteins. Examples of such stimulants include active GAVE18 protein and nucleic acid molecules encoding GAVE18 introduced into cells. In other embodiments, the agent inhibits the biological activity of one or more GAVE18 proteins. Examples of such inhibitors include antisense GAVE18 nucleic acid molecules and anti-GAVE18 antibodies. The modulating method can be performed in vitro (eg, by culturing cells with the agent) or alternatively in vivo (eg, by administering the agent to a subject). Accordingly, the present invention provides a method of treating an individual suffering from a disease or disorder characterized by abnormal expression or activity of a GAVE18 protein or nucleic acid molecule. In one embodiment, the method comprises an agent (eg, an agent identified in a screening assay described herein) or an agent that modulates (eg, upregulates or downregulates) GAVE18 expression or activity. Administration of the combination. In other embodiments, the method comprises administering a GAVE18 protein or nucleic acid molecule as a treatment to compensate for decreased GAVE18 expression or activity or abnormal GAVE18 expression or activity.

ＧＡＶＥ１８活性の刺激は、ＧＡＶＥ１８が異常にダウンレギュレートされる状態および／または増加したＧＡＶＥ１８活性が有益な効果を持つ可能性がある状態において望ましい。逆に、ＧＡＶＥ１８活性の阻害は、ＧＡＶＥ１８が異常にアップレギュレートされる状態および／または減少したＧＡＶＥ１８活性が有益な効果を持つ可能性がある状態において望ましい。   Stimulation of GAVE18 activity is desirable in situations where GAVE18 is abnormally downregulated and / or where increased GAVE18 activity may have a beneficial effect. Conversely, inhibition of GAVE18 activity is desirable in situations where GAVE18 is abnormally upregulated and / or where reduced GAVE18 activity may have a beneficial effect.

本発明は、本発明の例示を示す以下の実施例によりさらに説明される以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより詳細に説明するために提供されたものである。しかしながら、本発明の広い範囲を限定するものとして解釈すべきではない。   The present invention is further illustrated by the following examples that illustrate the invention. The following examples are provided in order to more fully illustrate the preferred embodiments of the invention. However, this should not be construed as limiting the broad scope of the invention.

実施例
ＧＡＶＥ１８の同定
クエリーとして様々なＧＰＣＲを用いたヒトゲノム配列データベースＨＴＧ（ＮＣＢＩ／ＮＩＨ）での相同性検索をＦＡＳＴＡアルゴリズム（ウィスコンシンＧＣＧパッケージ
バージョン１０．１）を用いて行った。統計学的に有意な相同性を有すると返答されたゲノムＤＮＡ配列を、タンパク質データベースのＢＬＡＳＴｐ検索に関する３つのフォワードフレームに翻訳した。第７染色体からのゲノムＤＮＡ配列ＡＣ０８３８６５が推定のＧＰＣＲ配列を含むと同定され、これをＧＡＶＥ１８と命名した。ＧＡＶＥ１８の染色***置は、ｐ１４．１にマッピングされる。 Example
Homology search in the human genome sequence database HTG (NCBI / NIH) using various GPCRs as identification queries for GAVE18 was performed using the FASTA algorithm (Wisconsin GCG package version 10.1). Genomic DNA sequences replied to have statistically significant homology were translated into three forward frames for BLASTp searches of protein databases. The genomic DNA sequence AC083865 from chromosome 7 was identified as containing the putative GPCR sequence and was named GAVE18. The chromosomal location of GAVE18 is mapped to p14.1.

ＧＡＶＥ１８をコードするゲノムＤＮＡのクローニング
予想されるＧＡＶＥ１８の５’および３’配列に特異的なプライマーを設計した。フォワードプライマーＨＰ２７１：ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号３）、およびリバースプライマーＨＰ２７２：ＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣ（配列番号４）を用いて、テンプレートとしてヒトゲノムＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＧＡＶＥ１８ゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りである：変性：９４℃で３０秒、アニーリング：５５℃で３０秒、および伸長：７２℃で１分を、３５サイクル、続いて、伸長：７２℃で５分。増幅されたＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングした。クローニングされたＤＮＡ挿入物はＤＮＡ配列解析で確認された。ＰＣＲ増幅は全てＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（ＭＪリサーチ，モデルＰＴＣ−２２５）で行われた。 Cloning of genomic DNA encoding GAVE18 Primers specific for the expected 5 ′ and 3 ′ sequences of GAVE18 were designed. GAVE18 genomic DNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the forward primer HP271: AAAACTGCATGCTGTGGCTGC (SEQ ID NO: 3) and reverse primer HP272: TTTCAGCTGAGCCCCAGAACTC (SEQ ID NO: 4) using human genomic DNA as a template. PCR conditions are as follows: Denaturation: 94 ° C. for 30 seconds, Annealing: 55 ° C. for 30 seconds, and extension: 72 ° C. for 1 minute, 35 cycles followed by extension: 72 ° C. for 5 minutes. The amplified DNA fragment was cloned into pCRII-TOPO vector (Invitrogen). The cloned DNA insert was confirmed by DNA sequence analysis. All PCR amplifications were performed with DNA Engine Tetrad (MJ Research, model PTC-225).

ノーザンブロット分析
クロンテックのヒトの多数の組織のノーザンブロットを、製造元の説明書に従って、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識された完全長オープンリーディングフレームＤＮＡ断片でハイブリダイズした。ハイブリダイズされたブロットを、２×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳで５０℃で３０分間、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳで５０℃で１時間洗浄した。次にこのブロットを増感紙上で−７０℃でＸ線フィルムに露光させた。 Northern blot analysis Northern blots of multiple human tissues from Clontech were hybridized with full-length open reading frame DNA fragments labeled with [α- ³² P] dCTP according to the manufacturer's instructions. Hybridized blots were washed with 2 × SSPE and 0.1% SDS at 50 ° C. for 30 minutes, 0.1 × SSPE and 0.1% SDS at 50 ° C. for 1 hour. The blot was then exposed to X-ray film on an intensifying screen at -70 ° C.

Ｔａｑｍａｎ分析
ヒト組織からのトータルＲＮＡをクロンテックから購入した。ｃＤＮＡ生産の前に、可能性のあるゲノムＤＮＡ汚染を防ぐためにトータルＲＮＡをＤＮアーゼＩで処理した。簡単に言えば、トータルＲＮＡを、１０×ＤＮアーゼＩ緩衝液５μｌ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）；１０ｍＭのＣａＣｌ₂；１０ｍＭのＭｇＣｌ₂；１ｍＭのＤＴＴ、および、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）（アンビオン）、ＲＮアーゼ阻害剤、および、ＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ非含有）１μｌ（２Ｕ／μｌ；アンビオン）と、３７℃で１時間混合した（最終容量５０μｌ）。フェノール沈殿工程の後、ライフテクノロジーズにより説明されているＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ選択システムを用いてｃＤＮＡ合成を行った。Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブをプライマーエキスプレス１．０ソフトウェア（ＡＢＩ）を用いて設計した。ＧＡＶＥ１８アンプリコンは、フォワードプライマー：５’ＧＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＴ３’（配列番号５）、リバースプライマー：５’ＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＡＧＴ３’（配列番号６）、および、Ｔａｑｍａｎプローブ配列：５’ＦＡＭ−ＴＧＧＣＧＴＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号７）と共にオープンリーディングフレームの７２個のヌクレオチドを含む。Ｆａｍをレポーター色素として用い、Ｔａｍｒａをクエンチャーとして用いた。Ｔａｑｍａｎプローブをオペロンテクノロジーズで注文合成した。Ｔａｑｍａｎ反応は、９６−ウェルプレートＭｉｃｒｏＡｍｐ光学チューブ（ＰＥ）を用いて最終容量５０μｌ（ＴａｑｍａｎＰＣＲ混合物２５μｌ（パーキンエルマー）；フォワードプライマー１μｌ、最終濃度９００ｎＭ；リバースプライマー１μｌ、最終濃度９００ｎＭ、および、Ｔａｑｍａｎプローブ１μｌ、最終濃度２００ｎＭ；ｃＤＮＡテンプレート５μｌ（計算濃度１０ｎｇ／μｌ）、および、水１７μｌを含む）で行われた。ＴａｑｍａｎＰＣＲ条件はＰＥアプライドバイオシステムの説明通りにした。ヒトβアクチンプライマープローブ（ＰＥアプライドバイオシステムで設計しそれを購入した）をインターナルコントロールとして用いた。各組織に関して、Ｔａｑｍａｎ反応を標的遺伝子とインターナルコントロールとの両方に関して二連で行った。加えて、全ての脳ｃＤＮＡのヒトβアクチンに関する標準曲線をテンプレート増加量を用いて二連で作製した。これにより、増幅されたアンプリコン相対数を得ることができた。脳ｃＤＮＡの倍量の標的遺伝子が発現された。 Taqman analysis Total RNA from human tissue was purchased from Clontech. Prior to cDNA production, total RNA was treated with DNase I to prevent potential genomic DNA contamination. Briefly, total RNA was added in 5 μl of 10 × DNase I buffer (20 mM Hepes (pH 7.5); 10 mM CaCl ₂ ; 10 mM MgCl ₂ ; 1 mM DTT, and 50% (v / v) Glycerol) (Ambion), RNase inhibitor, and DNase I (RNase free) 1 μl (2 U / μl; Ambion) were mixed for 1 hour at 37 ° C. (final volume 50 μl). After the phenol precipitation step, cDNA synthesis was performed using the Superscript selection system described by Life Technologies. Taqman primers / probes were designed using Primer Express 1.0 software (ABI). The GAVE18 amplicon consists of a forward primer: 5′GATTCTGTTGGCTCTCCCAGTCTT3 ′ (SEQ ID NO: 5), a reverse primer: 5 ′ CCAGACTACTCTGGTGGAGATAG3 ′ (SEQ ID NO: 6), and a Taqman probe sequence: 5 ′ FAM-TGGCTAGTACCATCATCATACCATCATCATCATCATCATCATCATCATAC With 72 nucleotides of the open reading frame. Fam was used as a reporter dye and Tamra was used as a quencher. The Taqman probe was custom synthesized by Operon Technologies. Taqman reactions were performed in 96-well plate MicroAmp optical tubes (PE) using a final volume of 50 μl (25 μl Taqman PCR mix (Perkin Elmer); forward primer 1 μl, final concentration 900 nM; reverse primer 1 μl, final concentration 900 nM, and Taqman probe 1 μl). Final concentration 200 nM; 5 μl cDNA template (calculated concentration 10 ng / μl) and 17 μl water. Taqman PCR conditions were as described for PE Applied Biosystem. Human β-actin primer probe (designed and purchased with PE Applied Biosystem) was used as an internal control. For each tissue, Taqman reactions were performed in duplicate for both the target gene and the internal control. In addition, standard curves for human β-actin of all brain cDNAs were generated in duplicate using increasing amounts of template. Thereby, the amplified amplicon relative number could be obtained. The target gene was expressed in double the amount of brain cDNA.

ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲスクリーニング
ＧＡＶＥ１８コーディング領域：５’ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＣＡ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ３５（配列番号８）、および５’ＴＴＴ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＧＣ ＣＣＡ
ＧＡＡ ＣＴＣ３’（配列番号９）に特異的な ＰＣＲプライマーを用いて、プールされた脾臓、胎盤、および腎臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＰＣＲスクリーニングは、９６−ウェルプレートで、以下のＰＣＲプロトコールを用いて行われた：９４℃で３分間保持；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、および６８℃で４５秒間を４０サイクル。その後、陽性のサブプールを次回のＰＣＲスクリーニングのために希釈した。陽性サブプールからのいくつかのコロニーを寒天プレートにプレーティングし、陽性プラスミドをＰＣＲで確認し、ＤＮＡ配列分析を行った。 PCR screening of cDNA libraries GAVE18 coding region: 5'AAA ACT GCA TGC TGT GGC TGC 35 (SEQ ID NO: 8), and 5 'TTT CAG CTG AGC CCA
Pooled spleen, placenta, and kidney cDNA libraries were screened using PCR primers specific for GAA CTC3 ′ (SEQ ID NO: 9). PCR screening was performed in 96-well plates using the following PCR protocol: hold at 94 ° C. for 3 minutes; 40 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 45 seconds. The positive subpool was then diluted for the next PCR screen. Several colonies from positive subpools were plated on agar plates, positive plasmids were confirmed by PCR, and DNA sequence analysis was performed.

結果の説明
ＧＡＶＥ１８は、免疫系（大部分は骨髄、末梢血液白血球、脾臓および胸腺）に限定された発現パターンを有していた。ＧＡＶＥ１８ＧＰＣＲ受容体の阻害または活性化は、免疫細胞の成熟、発達および炎症の際の反応を調節することができる。ＧＡＶＥ１８ＧＰＣＲ受容体は、顆粒球でサイトカインＴＮＦ−αによりアップレギュレートされる。ＴＮＦ−αは、多くの炎症性疾患に関して重要な役割を有する。ＧＡＶＥ１８はまた、気管支上皮上皮においてＴＮＦ−αにより誘導されるため、喘息のような呼吸器疾患に関する優れた薬剤標的となり得る。ＧＡＶＥ１８はまた、その他の炎症性疾患、例えばＲＡ、ＣＯＰＤ等に関する極めて優れた標的であり得る。 Results Description GAVE18 had an expression pattern restricted to the immune system (mostly bone marrow, peripheral blood leukocytes, spleen and thymus). Inhibition or activation of the GAVE18 GPCR receptor can modulate responses during immune cell maturation, development and inflammation. The GAVE18 GPCR receptor is upregulated by the cytokine TNF-α in granulocytes. TNF-α has an important role with respect to many inflammatory diseases. GAVE18 is also induced by TNF-α in bronchial epithelial epithelium and may therefore be an excellent drug target for respiratory diseases such as asthma. GAVE18 may also be a very good target for other inflammatory diseases such as RA, COPD and the like.

本発明は、本発明で説明された特定の実施形態によりその範囲を限定されることはない。実際に、上述の説明および添付された図面から、当業者であれば、本発明で説明された改変に加えて本発明の様々な改変が明白になると思われる。このような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるように意図される。   The present invention is not limited in scope by the specific embodiments described in the present invention. Indeed, from the foregoing description and accompanying drawings, those skilled in the art will appreciate various modifications of the invention in addition to those described in the invention. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.

さらに、核酸またはポリペプチドに関して定められた塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および分子量または分子質量の値は全て概算値であり、説明するために提供されたものとする。   Furthermore, the base size or amino acid size, and molecular weight or molecular mass values defined for nucleic acids or polypeptides are all approximate and are provided for illustrative purposes.

様々な刊行物が本明細書で引用されており、それらの開示を参照により本発明に加入する。   Various publications are cited herein, the disclosures of which are incorporated herein by reference.

様々なタイプの組織、特に「免疫関連の」組織、例えば、胸腺および肝臓におけるＧＡＶＥ１８のＤＮＡの転写を示すノーザンブロットである。Northern blots showing the transcription of GAVE18 DNA in various types of tissues, in particular “immune related” tissues such as thymus and liver. 様々なタイプの細胞におけるＧＡＶＥ１８のＤＮＡの相対的発現を示すヒストグラムである。2 is a histogram showing the relative expression of GAVE18 DNA in various types of cells. 様々なタイプの組織におけるＧＡＶＥ１８のＤＮＡの相対的発現を示すヒストグラムである。2 is a histogram showing the relative expression of GAVE18 DNA in various types of tissues. ＧＡＶＥ１８発現プロフィルである。GAVE18 expression profile. ＧＡＶＥ１８のＤＮＡ配列である（配列番号１）。This is the DNA sequence of GAVE18 (SEQ ID NO: 1). ＧＡＶＥ１８の推定アミノ酸配列である（配列番号２）。This is the deduced amino acid sequence of GAVE18 (SEQ ID NO: 2).

Claims (29)

図５のＤＮＡ配列（配列番号１）を含む単離された核酸分子。   6. An isolated nucleic acid molecule comprising the DNA sequence of FIG. 5 (SEQ ID NO: 1). ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載の単離された核酸分子、または、請求項１に記載の単離された核酸分子に相補的なハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズ可能な、単離された核酸分子。   A single nucleic acid molecule capable of hybridizing under stringent hybridization conditions to the isolated nucleic acid molecule of claim 1 or a hybridization probe complementary to the isolated nucleic acid molecule of claim 1. A released nucleic acid molecule. 図６のアミノ酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。   The isolated nucleic acid molecule according to claim 1 or 2, which encodes a polypeptide having the amino acid sequence of Figure 6 (SEQ ID NO: 2). 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも３０％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離された核酸分子。   3. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, which encodes a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 30% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 検出可能に標識された、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。   3. An isolated nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 that is detectably labeled. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、または、蛍光を発する化学物質を含む、請求項５に記載の検出可能に標識された単離された核酸分子。   6. The detectably labeled isolated nucleic acid molecule of claim 5, wherein the detectable label comprises an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent chemical. 図６のアミノ酸配列（配列番号２）を含む単離されたポリペプチド。   An isolated polypeptide comprising the amino acid sequence of Figure 6 (SEQ ID NO: 2). 請求項７に記載の精製されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子。   8. An isolated nucleic acid molecule encoding the purified polypeptide of claim 7. 検出可能に標識された、請求項７に記載の精製されたポリペプチド。   8. The purified polypeptide of claim 7, which is detectably labeled. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、または蛍光を発する化学物質を含む、請求項９に記載の精製されたポリペプチド。   10. The purified polypeptide of claim 9, wherein the detectable label comprises an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent chemical. 請求項７に記載の精製されたポリペプチドを免疫原とする抗体。   The antibody which uses the purified polypeptide of Claim 7 as an immunogen. 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはキメラ抗体からなる群より選択される、請求項１１に記載の抗体。   The antibody according to claim 11, wherein the antibody is selected from the group consisting of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a chimeric antibody. 検出可能に標識された、請求項１１に記載の抗体。   12. The antibody of claim 11, wherein the antibody is detectably labeled. 検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、または、蛍光を発する化学物質を含む、請求項１３に記載の抗体。   14. The antibody of claim 13, wherein the detectable label comprises an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent chemical. 発現調節要素と操作可能に結合した請求項１に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。   An expression vector comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 1 operably linked to an expression control element. 発現調節要素と操作可能に結合した請求項２に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。   An expression vector comprising the isolated nucleic acid molecule of claim 2 operably linked to an expression control element. 発現調節要素は、構成的調節配列、細胞特異的調節配列、および誘導性調節配列からなる群より選択される、請求項１５または１６に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 15 or 16, wherein the expression regulatory element is selected from the group consisting of a constitutive regulatory sequence, a cell-specific regulatory sequence, and an inducible regulatory sequence. 発現調節要素はプロモーターである、請求項１７に記載の発現ベクター。   The expression vector according to claim 17, wherein the expression control element is a promoter. プロモーターは、ｈＣＭＶの前初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、
アデノウイルスの初期プロモーター、ワクシニアの初期プロモーター、ポリオーマの初期プロモーター、ＳＶ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、または酵母α交配因子のプロモーターを含む、請求項１８に記載の発現ベクター。 Promoters are hCMV immediate early promoter, SV40 early promoter,
Adenovirus early promoter, vaccinia early promoter, polyoma early promoter, SV40 late promoter, adenovirus late promoter, vaccinia late promoter, polyoma late promoter, lac system, trp system, TAC system, TRC system, λ 19. The expression vector of claim 18, comprising a phage major operator and promoter region, an fd coat protein regulatory region, a 3-phosphoglycerate kinase promoter, an acid phosphatase promoter, or a yeast alpha mating factor promoter. 請求項１５または１６に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。   A host cell transformed or transfected with an expression vector according to claim 15 or 16. 宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。   21. A host cell according to claim 20, wherein the host cell comprises a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. 宿主は、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０またはＳｆ９細胞を含む、請求項２１に記載の宿主細胞。   The host according to claim 21, wherein the host comprises E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, yeast, CHO, R1.1, BW, LM, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 or Sf9 cells. Host cell. ａ）単離されたポリペプチドが発現される条件下で請求項２０に記載の宿主細胞を培養する工程；および、
ｂ）単離されたポリペプチドを、宿主、培養物、またはそれらの組み合わせから回収する工程、
を含む、請求項７に記載の単離されたポリペプチドの製造方法。 a) culturing the host cell of claim 20 under conditions such that the isolated polypeptide is expressed; and
b) recovering the isolated polypeptide from the host, culture, or combinations thereof;
A method for producing an isolated polypeptide according to claim 7 comprising: ＧＡＶＥ１８のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを投与することを含む治療が必要な患者において、ＧＡＶＥ１８シグナル伝達活性またはシグナル変換を調節するための治療方法。   A therapeutic method for modulating GAVE18 signaling activity or signal transduction in a patient in need of treatment comprising administering an agonist, antagonist or inverse agonist of GAVE18. 可能性のあるアゴニストとＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させること、および、該可能性のあるアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性が、該可能性のあるアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ１８活性に比べて増加するかどうかを決定することを含む、ＧＡＶＥ１８のアゴニストの同定方法。   Contacting a potential agonist with a cell that expresses GAVE18, and the signaling activity of GAVE18 in the presence of the potential agonist is such that GAVE18 in the absence of the potential agonist A method of identifying an agonist of GAVE18 comprising determining whether it increases relative to activity. 可能性のあるインバースアゴニストとＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させること、および、該可能性のあるインバースアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ１８活性が、該可能性のあるインバースアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ１８活性に比べて減少するかどうか、および内因性リガンドまたはアゴニストの存在下で減少するかどうかを決定することを含む、ＧＡＶＥ１８のインバースアゴニストの同定方法。   Contacting a potential inverse agonist with a cell that expresses GAVE18, and GAVE18 activity in the presence of the potential inverse agonist results in GAVE18 in the absence of the potential inverse agonist. A method for identifying an inverse agonist of GAVE18, comprising determining whether it is reduced compared to activity and whether it is reduced in the presence of an endogenous ligand or agonist. 可能性のあるアンタゴニストとＧＡＶＥ１８を発現する細胞とを接触させること、および、該可能性のあるアンタゴニストの存在下でのＧＡＶＥ１８のシグナル伝達活性が、内因性リガンドまたはアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ１８活性に比べて減少するかどうかを決定することを含む、ＧＡＶＥ１８のアンタゴニストの同定方法。   Contacting a potential antagonist with a cell expressing GAVE18, and the signaling activity of GAVE18 in the presence of the potential antagonist becomes a GAVE18 activity in the presence of an endogenous ligand or agonist. A method of identifying an antagonist of GAVE18 comprising determining whether it is reduced compared to. ＧＡＶＥ１８シグナル伝達活性または変換を調節することができるＧＡＶＥ１８のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストを含む治療用組成物。   A therapeutic composition comprising an agonist, antagonist, or inverse agonist of GAVE18 capable of modulating GAVE18 signaling activity or conversion. ＧＡＶＥ１８シグナル伝達活性または変換を調節することができるＧＡＶＥ１８のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストを含む治療用組成物を治療が必要な患者に投与することを含む、疾患の治療方法。   A method of treating a disease comprising administering to a patient in need thereof a therapeutic composition comprising an agonist, antagonist or inverse agonist of GAVE18 capable of modulating GAVE18 signaling activity or conversion.

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