JP2005515470A - 望ましくないバックグラウンド蛍光を最小にする蛍光検出のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、蛍光性サンプルの励起および蛍光発光を測定するための方法を提供する。本発明の方法は、有意に減少した量のバックグラウンド蛍光という利点を有する。この方法は、基材中のサンプルを、この基材に４５°以下の角度で、そして好ましくは、２０°以下の角度で入る光のビームで励起させる工程、次いで、レンズシステムを用いて、サンプルからの蛍光発光を収集する工程を包含する。このレンズシステムは、発光された光を、検出用のＣＣＤに集束させる。本発明の記載は、説明のためにチャネルプレートを使用する走査システムを使用するが、本明細書中に記載される方法はまた、非走査システムおよびキャピラリーシステムを用いて、使用され得る。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、蛍光分析技術に関する。より具体的には、本発明は、望ましくないバックグラウンドを最小にする、蛍光性サンプルを検出するための方法および装置に関する。

（発明の背景）
蛍光検出は、その高い感度に起因して、生化学的研究および医学的研究の応用において、広く使用されている。例えば、蛍光検出は、自動ＤＮＡ配列決定、キャピラリー電気泳動および種々の免疫アッセイにおいて、使用されている。励起に応答して、蛍光性生体分子および色素が、特徴的な波長で光を発光し、この波長は、励起波長とは異なる。これらの特徴的な波長を検出することによって、サンプルの組成が決定され得る。

多くの生物学的応用において、検出されるべきサンプルの量は、通常、非常に少ない。何年にもわたって、方法および装置は、次第に小さくなる規模（μＭの範囲からｎＭおよびｐＭの範囲まで）で操作および分離することができるようになっている。サンプルの大きさが減少するにつれて、バックグラウンドの蛍光が、サンプルの蛍光に対してより有意になる。

蛍光検出器における優勢なバックグラウンド雑音源は、しばしば、ショット雑音である。ショット雑音は、サンプル蛍光およびバックグラウンド蛍光から発する。バックグラウンド蛍光は、サンプルから、およびサンプルが含まれる基材からの蛍光またはラマン散乱から発する。高いバックグラウンド蛍光はまた、検出器の飽和を引き起こすことによって、検出器のダイナミックレンジを減少させる。従って、バックグラウンド雑音を減少させることは、蛍光検出器の性能を改善するための１つのストラテジーである。

（発明の要旨）
本発明は、蛍光性サンプルの励起、および蛍光発光の測定のための方法を提供する。この方法は、バックグラウンド蛍光の量を有意に減少させる。この方法は、約４５°以下、そしてより好ましくは、約２０°以下の角度で、基材に入る光のビームで、基材中のサンプルを励起させる工程、およびサンプルからの蛍光発光をレンズ系で収集する工程であって、このレンズ系は、発光された光を、検出用の電荷結合素子（ＣＣＤ）に集束させる、工程を包含する。

光のビームは、レーザーから発生され、そして走査ミラーおよびプリズムによって、サンプルを含む基材に指向される。この光は、チャネルプレートの軸に対して約４５°以下の角度、そしてより好ましくは、約２０°以下の角度で、基材に入り、そしてチャネルプレートを通ってサンプル中に進む。別の実施形態において、レンズシステムが、励起したサンプルによって発光された蛍光を収集し、そして平行化する。次いで、収集された光は、広帯域フィルタを通って、散乱されたレーザー光を排除する。次いで、収集された光は、透過型格子を通過し、この格子は、光を、基材の軸に対して垂直に配向するスペクトル軸でずらす。次いで、画像が、検出用の科学等級ＣＣＤに集束される。

本発明の方法は、走査系または非走査系とともに使用され得る。本発明の応用の非限定的な例は、チャネルプレートおよびキャピラリーシステム（例えば、キャピラリー電気泳動）を使用する走査系である。

本発明の適用可能性のさらなる領域は、本明細書中以下に提供される詳細な説明から明らかになる。詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、説明の目的のみを意図され、そして本発明の範囲を限定することは意図されないことが、理解されるべきである。

本発明の種々の利点は、以下の明細書および添付の特許請求の範囲を読み、そして以下の図面を参照することによって、当業者に明らかになる。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、蛍光性サンプルの励起および蛍光発光の測定のための方法を提供する。この方法は、約４５°以下、そしてより好ましくは、約２０°以下の角度で基材に入る光のビームで、基材中のサンプルを励起させる工程、次いでサンプルからの蛍光発光をレンズ系で収集する工程であって、このレンズ系は、検出用のＣＣＤに発光した光を集束させる、工程を包含する。本発明の以下の説明は、例としてチャネルプレートを使用する走査系を使用するが、本明細書中に記載される方法はまた、非走査系およびキャピラリー系とともに使用され得る。

本発明の１つの実施形態において、励起ビームは、散乱ミラーおよびプリズムによって、チャネルに指向される。この励起ビームは、ＵＶ光源、可視光源または赤外光源によって発生され、好ましくはレーザーによって発生され得る。ミラーの角度は、励起ビームがチャネルに入る角度を制御するために、調節され得る。好ましくは、励起ビームは、約４５°以下の角度、そしてより好ましくは、約２０°以下の角度で、チャネルに入る。入射ビームの最適な角度は、チャネルプレートの材料の屈折率に依存する。一般に、この角度がより浅いほど、収集されるサンプル蛍光の量がより大きくなり、これに付随して、バックグラウンド蛍光が減少する。

本発明の別の実施形態において、収集光学系は、励起したサンプルからの蛍光を収集し、そして平行光線に平行化する。好ましくは、レンズは、チャネル軸に対して垂直に設置される。収集レンズは、単純なカメラレンズであり得る。次いで、収集された光は、長帯域フィルタまたは広帯域フィルタを通過し、このフィルタは、レーザー波長での散乱光を除去する。次いで、残りの濾波された光（これは、本質的に、サンプルからの蛍光およびチャネルからのバックグラウンドからなる）は、透過型回折格子を通過する。この透過型格子は、光を異なる波長の光線に分離し、この光線は、チャネル軸に対して垂直なスペクトル軸の方向に沿って発散する。最後に、集束レンズが、この光をＣＣＤに指向する。

さらなる実施形態において、ＣＣＤからの画像が収集され、データファイルとしてビン化（ｂｉｎ）されるか、または読み取られる。好ましくは、ＣＣＤ上の画像の、サンプルの蛍光に関連するセクションのみが、ビン化および読み取りのために適切なピクセルの選択によって収集される。本発明の方法において、励起ビームがある角度でプレートを通って移動するにつれて、この励起ビームは、蛍光の軌跡を作製する。この軌跡が収集光学系によって画像化される場合、チャネルの異なる部分からの蛍光は、ＣＣＤの空間軸の異なるセクションに入る。図２に示されるように、サンプルに関連する蛍光は、バックグラウンド蛍光から分離される。

上記本発明の方法を実施するための装置が、図１に示される。図１は、チャネルプレート１２を使用する走査系を用いて使用するための装置１０を示す。チャネルプレート１２は、チャネル１４を規定し、このチャネルは、サンプル１６を含有する媒体を受容する。１対の電極１８によって、電流が、サンプル１６を含有する媒体に適用される。電流を媒体に流す際に、サンプル１６は、電気蛍光の分野において公知であるように、分離される。チャネルプレート１２は、ガラス、融解シリカ、プラスチックまたは他の透明な型の材料から形成され得る。チャネルプレート１２は、ガラス、融解シリカ、プラスチックまたは他の透明材料から形成される支持プレート１３によって、支持される。さらに、チャネル１４は、他の適切な構造体（例えば、キャピラリー管、キャピラリー管のアレイおよび視野を制限されたレンズを備えるスラブゲル）によって規定され得る。

レーザー２０は、励起ビーム２２を発生させ、この励起ビームは、チャネルプレート１２に本質的に平行であり、そして反射ミラー２４に指向される。ミラー２４は、励起ビーム２２を、所望の角度でチャネルプレート１２に反射するように調節される。ここでまた、励起ビーム２２は、約４５°以下の角度、そして好ましくは、約２０°以下の角度で、チャネルプレート１２に入る。励起ビーム２２は、プリズム２６を通して、支持プレート１３への励起ビーム２２の侵入を容易にするように指向される。支持プレート１３は、水、直接接触、またはチャネルプレートと類似の屈折率を有する任意の透明材料を使用して、チャネルプレート１２に光学的に結合されている。集束された励起ビーム２２は、チャネルプレート１２に入り、そしてチャネルプレート１２を通過し、その後、サンプル１６を収容するチャネル１４に達する。集束された励起ビーム２２は、チャネルプレート１２の頂部層を通って進む。Ｆｒｅｓｎｅｌの式によって規定されるように、いくらかの光は、屈折率が変化する境界において反射される。これにより、反射ビーム２８が生じる。集束された励起ビーム２２と反射されたビーム２８との両方が、サンプル１６からの望ましくない蛍光発光を発生させ得る。

サンプル蛍光発光３０の一部は、収集光学系３２に入り、ここで、発光した光が収集され、平行化され、そして発散されて、その後、公知の光学系およびＣＣＤ技術を使用して、ＣＣＤ３４に集束される。この点に関して、収集光学系３２は、第一の平行化レンズを備え、このレンズは、励起したサンプル１６からの蛍光を収集し、そして平行光線に平行化する。次いで、収集された光は、長帯域フィルタまたはレーザー排除フィルタを通過し、このフィルタは、レーザー波長の散乱光または迷光を除去する。次いで、残りの濾波された光（これは、サンプル１６からの蛍光発光およびチャネルプレート１２からの蛍光バックグラウンドからなる）が、透過型回折格子、グリズム（ｇｒｉｓｍ）、プリズムを通過するか、または反射性格子から反射される。透過型回折格子は、この光を異なる波長の光線に分離し、この光線は、チャネル１４の軸に対して垂直な、スペクトル軸の方向に沿って発散する。最後に、第二の集束レンズが、この光をＣＣＤ３４に集束させる。収集光学系３２は、２０００年５月５日に出願された米国特許出願番号０９／５６４，７９０、またはＳｉｍｐｓｏｎら、「Ａ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０００，２１，１３５−１４９（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）に開示される光学系と類似のものであり得る。しかし、他の適切な光学系が使用され得る。さらに、他の型の検出器もまた、サンプル１６から光を受けるために使用され得ることが理解される。これらとしては、ＣＭＯＳ検出器、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、光増倍管、光増倍管アレイまたは他の適切な検出器が挙げられる。さらに、収集光学系３２の好ましい配向は、サンプル１６に入る励起ビーム２２に対して実質的に垂直である。なぜなら、これにより、サンプルからより多量の光が収集され、同時にバックグラウンドをなお排除することが可能になるからである。

ＣＣＤ３４からの画像は、図２に示され、そして図示されるように、データファイルとして読み取られるように収集される。この点に関して、図２は、ガラスの蛍光３６（これは、チャネルプレート１２からのバックグラウンド蛍光である）、およびチャネル１４内から収集された光３８（これは、サンプル１６からの蛍光からなる）の両方を示す。この収集された光３８は、好ましくは、ＣＣＤ３４の、サンプル１６の蛍光に関連する画像のセクションのみであり、これは、意味のあるデータが読み取られる適切な検出器要素またはピクセル（これは、バックグラウンド蛍光をほとんど受信しない）の選択によって収集される。ＣＣＤ３４はまた、「ビン化」を使用し得、ここで、隣接する検出器要素における光により発生する変化が、単一の読み取りの間に組み合わせられた電荷ポケットとして読み取られる。ビン化の使用は、他の処理技術と比較される場合に、全体の雑音を減少させ得るが、これに付随して、空間的分解が失われ得る。

励起ビーム２２がチャネルプレート１２に、約４５°以下、そして好ましくは約２０°以下の角度で入ることを可能にすることによって、チャネルプレート１２に入る、反射される光および励起ビーム２２によって生じるバックグラウンド蛍光の大部分が、図２に示されるように、収集光学系から離れる方向に指向される。従って、より少ないバックグラウンド雑音が収集光学系３２に入るので、装置１０の感度が増加する。さらに、励起ビーム２２は、収集プレート１２に対して比較的小さい角度でプレートに入るので、より多量の蛍光がサンプル１６によって作製され、サンプルの蛍光を増加させ、従って、感度を改善する。

どのピクセルまたは検出器要素が、意味のあるデータ（これから、スペクトル情報が決定される）を作成するために使用されるか、およびどのピクセルまたは検出器要素が、過剰のバックグラウンド蛍光を受信するとして無視されるべきかを選択するための方法は、２つの懸念を含む。ＣＣＤ３４の信号対雑音非は、ＣＣＤ３４のダイナミックレンジが過度に制限されずに最大にされるべきである。どの検出器要素が、分析のために意味のあるデータを作製するために使用されるべきかを選択するための１つの方法は、以下のとおりである。

第一に、ＣＣＤ３４の画像の中心の近くの、第一の群の検出器要素からの出力が記録され、そして信号対雑音比が決定される。一旦、信号対雑音比が、この第一のセットの検出器要素から決定されると、この信号対雑音比は、第二の群の検出器要素からの信号対雑音比と比較される。この第二の群の検出器要素は、第一の群における検出器要素、および第一の群における検出器要素に隣接する検出器要素を含む。信号対雑音費画像化する場合、このことは、第一の群の検出器要素を使用する場合と比較して、第二の群の検出器要素を使用してスペクトル情報を作成する場合に、より良好なデータが得られ得ることを示す。従って、第二の群の検出器要素の出力は、最初に、スペクトル情報が決定されるために意味のあるデータを作成するために使用されるように、選択される。

このプロセスは、信号対雑音比が減衰するまで、次第に番号が増加するセットの検出器要素で続けられる。信号対雑音比が減衰し始める場合、さらなる検出器要素を含めることは、意味のあるデータの収集を改善せず、従って、残りの検出器要素からの出力は、考慮されない。しかし、このプロセスの間、バックグラウンド雑音が、ＣＣＤ３４のダイナミックレンジを減少させるほどＣＣＤ３４の能力を失わせないように、注意しなければならない。あまりに大きいダイナミックレンジが失われる場合、より少ない数のビンが使用されるべきである。

上記説明は、本発明の単なる例示的な実施形態を議論し、そして説明する。例えば、励起ビーム２２は、収集光学系３２が軸からずれて（すなわち、サンプルに入る励起ビーム２２の方向に対して垂直な方向からずれて）配置される場合、４５°より大きい角度でチャネルプレート１２に入り得る。さらに、チャネルプレート１２の内側の頂部表面は、低屈折率の材料でコーティングされ得るか、または低屈折率の材料（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ＡＦ）から作製され得る。このような場合、励起ビーム２２は、検出領域をバックグラウンド領域からさらに分離するために全反射する角度（すなわち、約２２°）で配向され得る。さらに、複数の励起ビーム２２、および複数の検出要素が使用され得る。当業者は、このような議論から、そして付随する図面から、種々の変化、改変およびバリエーションが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明においてなされ得ることを、容易に認識する。

図１は、蛍光検出システムを示す概略ブロック図である。 図２は、光の励起ビームへの曝露の後に作成されたＣＣＤ画像を示す写真である。

Claims (28)

1. チャネル軸を有するチャネルプレート中の蛍光性サンプルの蛍光を検出するための方法であって、以下：
   該蛍光性サンプルを、光の励起ビームで励起させる工程であって、該光の励起ビームは、該チャネル軸の約４５°の長手方向軸以下の角度で、該サンプルに入る、工程；および
   該サンプルの蛍光を、収集光学系で収集する工程であって、該収集光学系は、蛍光を収集し、そして該蛍光を検出器に再集束させる、工程、
   を包含する、方法。
2. 前記検出器が、電荷結合素子、ＣＭＯＳ検出器、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、光増倍管、光増倍管アレイからなる群より選択される検出器を備える、請求項１に記載の方法。
3. 前記収集光学系が、前記蛍光を平行化し、そして該蛍光を検出器に再集束させる、請求項１に記載の方法。
4. 前記光の励起ビームが、約２０°以下の角度で前記サンプルに入る、請求項１に記載の方法。
5. 前記収集光学系が、さらに、長帯域フィルタを使用して、前記励起ビームからの散乱光を除去する、請求項１に記載の方法。
6. 前記収集光学系が、さらに、帯域フィルタを使用して、前記励起ビームからの散乱光を除去する、請求項１に記載の方法。
7. 前記チャネルプレートに対して実質的に平行な前記光の励起ビームを、反射ミラーに指向する工程をさらに包含し、該反射ミラーは、該光の励起ビームを、約４５°以下の角度で前記サンプルに指向する、請求項５に記載の方法。
8. 前記反射ミラーからの前記光の励起ビームを、プリズムを通るように指向し、該反射された光の励起ビームを前記サンプルに指向する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
9. サンプルの蛍光検出のための装置であって、以下：
   光の励起ビームを発生させるために作動可能な光源；
   該光の励起ビームを、約４５°以下の角度で該サンプル中に反射させるように作動可能なミラー；および
   該サンプルからの蛍光を収集し、そして該蛍光を再集束させるように作動可能な収集光学系、
   を備える、装置。
10. 前記再集束された蛍光を前記収集光学系から受信する、電荷結合素子をさらに備える、請求項９に記載の装置。
11. 前記収集光学系が、前記光の励起ビームの波長の散乱光を除去するように作動可能な長帯域フィルタをさらに備える、請求項９に記載の装置。
12. 前記収集光学系が、光を異なる波長に分離するよう作動可能な透過型回折格子をさらに備える、請求項９に記載の装置。
13. 前記光の励起ビームを前記サンプルに集束させるように作動可能なプリズムをさらに備える、請求項９に記載の装置。
14. 前記光源がレーザーである、請求項９に記載の装置。
15. 前記サンプルを収容するチャネルを規定するチャネルプレートをさらに備える、請求項９に記載の装置。
16. サンプルの蛍光検出のための方法であって、以下：
    チャネルを提供する工程であって、該チャネルを通ってサンプルが流れ得、該チャネルが軸を有する、工程；
    光の励起ビームを、該チャネルの該軸に対してある角度で該サンプルに指向する工程；
    該サンプルの蛍光画像およびバックグラウンドに関連する蛍光画像を作成する工程であって、該サンプルの蛍光画像は、該バックグラウンドに関連する蛍光画像からずれた方向で作成される、工程、
    収集光学系を用いて該サンプルの蛍光を収集する工程であって、該収集光学系が、該蛍光を平行化しそして該蛍光を電荷結合素子に再集束させる、工程、
    を包含する、方法。
17. 前記光の励起ビームが、前記チャネルの軸に対して約４５°以下の角度で、前記サンプルに指向される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記光の励起ビームが、前記チャネルの軸に対して約２０°以下の角度で、前記サンプルに指向される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記光の励起ビームを発生させるためのレーザーを提供する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
20. 前記レーザーからの前記光の励起ビームを反射ミラーに指向する工程をさらに包含し、該反射ミラーは、該光の励起ビームを、ある角度で前記サンプルに指向する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記反射ミラーからの前記光の励起ビームを、プリズムを通るように指向する工程をさらに包含し、該プリズムは、該反射された光の励起ビームをサンプル内に指向する、請求項２０に記載の方法。
22. 複数の検出器要素を有する電荷結合素子を使用する、蛍光検出の方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）チャネルを提供する工程であって、該チャネルを通って、サンプルが流れ得、該チャネルが、チャネル軸を有する、工程；
    （ｂ）光の励起ビームを、該チャネル軸に対してある角度で指向する工程であって、その結果、該サンプルの蛍光画像が、バックグラウンドに関する蛍光画像の方向とはずれた方向で作成される、工程；
    （ｃ）第一の群の検出器要素の信号対雑音比を決定する工程；
    （ｄ）第二の群の検出器要素の信号対雑音比を決定する工程であって、該第二の群の検出器要素は、該第一の郡の検出器要素における少なくとも１つの検出器要素を含む、工程；
    （ｅ）該第一の群の検出器要素の該信号対雑音比を、該第二の群の検出器要素の該信号対雑音比と比較する工程；ならびに
    該第二の群の検出器要素の信号対雑音比が、該第一の群の検出器要素の信号対雑音比に対して減衰するまで、増加する番号の検出器要素の群の検出器要素に対して、工程（ｃ）から（ｅ）を繰り返す工程、
    を包含する、方法。
23. 以下のさらなる工程：
    蛍光性サンプルを、光の励起ビームで励起させる工程であって、該光の励起ビームは、前記チャネル軸に対して約４５°以下の角度で、該サンプルに入る、工程；および
    該サンプルの蛍光を、収集光学系で収集する工程であって、該収集光学系は、該蛍光を平行化し、そして該蛍光を電荷結合素子に再集束させる、工程、
    をさらに包含する、請求項２２に記載の蛍光検出の方法。
24. 前記光の励起ビームが、前記チャネル軸に対して約２０°以下の角度で、前記サンプルに入る、請求項２３に記載の蛍光検出の方法。
25. さらに、以下：
    光の励起ビームを発生させるように作動可能な光源を提供する工程；
    該光の励起ビームを、前記チャネル軸に対して約４５°以下の角度で、前記サンプル中に反射させるように作動可能なミラーを提供する工程；および
    サンプルからの蛍光を平行化し、そして該蛍光を電荷結合素子に再集束させるように作動可能な収集光学系を提供する工程、
    を包含する、請求項２２に記載の蛍光検出の方法。
26. 前記サンプルの蛍光を収集光学系で収集する工程をさらに包含し、該収集光学系は、該蛍光を平行化し、そして該蛍光を、電荷結合素子に再集束させる、請求項２２に記載の蛍光検出の方法。
27. サンプルの蛍光を測定するように構成された装置であって、以下：
    該サンプルを励起ビームで照射するように作動可能な源であって、該励起ビームは、該サンプルの表面に対して約４５°未満の入射角を有する伝播軸を有する、源；
    該サンプルからの蛍光を収集するように作動可能な収集光学系であって、該収集光学系は、該励起ビームの該伝播軸に対して約４５°より大きい軸を有する、収集光学系、
    を備える、装置。
28. 前記収集光学系の前記軸が、前記励起ビームの前記伝播軸に対して約９０°で配向している、請求項２７に記載の装置。

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