JP2005514347A5

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Publication number: JP2005514347A5
Application number: JP2003542209A
Authority: JP
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2022-11-07

Description

アレルギー性好酸球性疾患を治療するための抗原アレイAntigen arrays for treating allergic eosinophilic disease

本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学、および医学の分野に関する。本発明は、規則的で繰り返し並べられた抗原または抗原決定基のアレイ、特にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを含むアレイを構成する組成物を提供する。より具体的には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、及び／又はエオタキシンの少なくとも１種のタンパク質またはペプチドとを含む組成物を提供する。また本発明は、結合体と規則的な反復アレイをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を予防しまたは治療しかつ免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こす治療用ワクチン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）として有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。 The present invention relates to the fields of molecular biology, virology, immunology, and medicine. The present invention provides a composition comprising an array of regularly or repeatedly arranged antigens or antigenic determinants, in particular an array comprising IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. More specifically, the present invention provides a composition comprising a virus-like particle and at least one protein or peptide of IL-5, IL-13, and / or eotaxin bound thereto. The present invention also provides a process for generating combined and regular repeating arrays, respectively. The composition of the present invention is useful in the manufacture of a vaccine for treating allergic diseases associated with eosinophil components, and also prevents or treats allergic diseases associated with eosinophil components and provides an immune response, particularly It is useful as a therapeutic vaccine that efficiently elicits an antibody response. Furthermore, the compositions of the present invention are particularly useful for efficiently causing a self-specific immune response in the indicated situation.

喘息、鼻炎、鼻ポリープ、好酸球性症候群、およびアトピー性皮膚炎を含めたいくつかのアレルギー性疾患は、明らかな好酸球浸潤を特徴とする顕著な炎症成分を有する。 Several allergic diseases, including asthma, rhinitis, nasal polyps, eosinophilic syndrome, and atopic dermatitis have a prominent inflammatory component characterized by overt eosinophil infiltration.

これらの疾患で最も医学的に重要なグループであるアトピー性喘息は、臨床的には偶発的な空気流の閉塞、気道の炎症、および非特異的なアレルゲンに対する気管支の過剰反応を特徴とした、気道の慢性炎症性疾患であることがわかっている。気道閉塞および反応亢進の程度は、しばしば気道の炎症レベルと関連がある。このような臨床上の特徴は、喘息の重症度を示している（Ｋａｙ，Ａ．Ｂ．、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８７：８９３；ＤｅＭｏｎｃｈｙ，Ｊ．Ｇ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９８５、１３１：３７３；Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｒ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９８９、１３９：８０６；Ａｚｚａｗｉ，Ｍ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９９０、１４２：１４０７；Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９９２、１４５：１４６９；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９９２、１４６：３７４；Ｂｒｏｉｄｅ，Ｄ．Ｈ．他、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８８：６３７；Ｗａｒｌａｗ，Ａ．Ｊ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９８８、１３７：６２）。細胞浸潤は、疾患の進行に関連し、病原および病理の主な要因である気道の炎症を示す。喘息における炎症性浸潤は複雑であるが、現在ではこの障害の臨床的な発現および病原において、Ｔｈ２プロフィル（Ｔｈ２細胞）のサイトカイン発現を伴うＣＤ４^＋Ｔｈリンパ球が極めて重要な役割を果たすことが広く認識されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、１９９３、９２：３９７；Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．他、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、１９９１、８８：９３５）。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、−５、−９、−１０、−１３などのある範囲のサイトカインを放出して気道のアレルギー性炎症を整えることにより、疾患の進行および気道過敏症（ＡＨＲ）を調節する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、ＮＥｎｇＪＭｅｄ、１９９２、３２６：２９８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．他、ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ、１９９３、９２：３１３；Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．他、ＡｍＲｅｖＲｅｓｐｉｒＤｉｓ、１９９２、１４６：１０９；Ｄｒａｚｅｎ，Ｊ．Ｍ．他、ＪＥｘｐＭｅｄ、１９９６、１８３：１）。Ｔｈ２細胞と同様に、肺の中の好酸球およびその炎症産物のレベルは疾患の重症度に関連し、気道におけるこの白血球の蓄積は、遅発相喘息性反応中の気管支機能不全の中心的な特徴である（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｊ．他、ＮＥｎｇＪＭｅｄ、１９９０、３２３：１０３３）。Ｔｈ２細胞はアレルギー性応答の数多くの面を整えるが、ＩＬ−５の分泌によって好酸球増加症を抑制する際のその役割は、喘息での主要な炎症誘発性経路であると考えられる。 Atopic asthma, the most medically important group of these diseases, is characterized by clinically incidental airflow obstruction, airway inflammation, and bronchial hyperresponsiveness to non-specific allergens, It is known to be a chronic inflammatory disease of the respiratory tract. The degree of airway obstruction and hyperresponsiveness is often associated with airway inflammation levels. Such clinical features indicate the severity of asthma (Kay, AB, J Allergy Clin Immunol, 1991, 87: 893; De Monchy, JG, et al., Am Rev Respir Dis, 1985, 131: 373; Beasley, R. et al., Am Rev Respir Dis, 1989, 139: 806; Azzawai, M. et al., Am Rev Respir Dis, 1990, 142: 1407; Nakajima, H. et al., Am Rev Respir Dis, 1992, 146: 374; Broide, DH et al., J Allergy Clin Immunol, 1991, 88: 637; Et al., Am Rev Respir Dis, 1988, 137: 62). Cellular infiltration is associated with disease progression and indicates airway inflammation, a major factor in pathogenesis and pathology. Inflammatory infiltration in asthma is complex, but CD4 ⁺ Th lymphocytes with cytokine expression of Th2 profile (Th2 cells) now play a pivotal role in the clinical expression and pathogenesis of this disorder (Robinson, D. S. et al., J Allergy Clin Immunol, 1993, 92: 397; Walker, C. et al., J Allergy Clin Immunol, 1991, 88: 935). Th2 cells reduce disease progression and airway hyperresponsiveness (AHR) by releasing a range of cytokines such as IL-4, -5, -9, -10, -13 and regulating allergic inflammation of the airways. (Robinson, DS et al., N Eng J Med, 1992, 326: 298; Robinson, DS et al., J Allergy Clin Immunol, 1993, 92: 313; Walker, C. et al., Am Rev Respirer. Dis, 1992, 146: 109; Drazen, JM et al., J Exp Med, 1996, 183: 1). Like Th2 cells, levels of eosinophils and their inflammatory products in the lung are related to the severity of the disease, and this leukocyte accumulation in the respiratory tract is central to bronchial dysfunction during late-phase asthmatic reactions. (Bousequet, J. et al., N Eng J Med, 1990, 323: 1033). Although Th2 cells arrange many aspects of the allergic response, its role in suppressing eosinophilia by secretion of IL-5 is thought to be a major pro-inflammatory pathway in asthma.

インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、喘息患者で高レベルで発現する炎症誘発性サイトカインである。さらにＩＬ−５は、アトピー性疾患の病原に主として関与するサイトカインである。これは特に、アトピー性疾患における組織損傷の主な原因である好酸球の産生、活性化、および局在化を制御する。さらにＩＬ−５は、好酸球系列に著しく特異的な、誘発性Ｔ細胞由来のサイトカインである。ＩＬ−５は転写レベルで制御され、遺伝子を調節することは、喘息や湿疹、鼻炎などの好酸球依存型アレルギー性障害の治療の将来有望な目標である。 Interleukin-5 (IL-5) is a pro-inflammatory cytokine that is expressed at high levels in asthmatic patients. Furthermore, IL-5 is a cytokine mainly involved in the pathogenesis of atopic diseases. This specifically controls the production, activation, and localization of eosinophils, which are the main cause of tissue damage in atopic diseases. Furthermore, IL-5 is an inducible T cell-derived cytokine that is highly specific for the eosinophil lineage. IL-5 is regulated at the transcriptional level and gene regulation is a promising future target for the treatment of eosinophil-dependent allergic disorders such as asthma, eczema and rhinitis.

好酸球が喘息におけるアレルギー反応の重要な成分であるという、数多くの証拠がある。ＩＬ−５は好酸球の産生に独自に関与するものであり、ＩＬ−１３などの様々なその他のサイトカインの場合、エオタキシンなどのケモカインおよびその他のファクターが、その活性化、局在化、および生存を制御する。したがってＩＬ−５は、新しい抗喘息薬の重要な薬物標的になっている（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．他、ＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ、２００２、９４（３）：２５３；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．他、ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ、２００２、８（４）：１６２）。 There is a lot of evidence that eosinophils are an important component of allergic reactions in asthma. IL-5 is uniquely involved in the production of eosinophils, and in the case of various other cytokines such as IL-13, chemokines such as eotaxin and other factors are activated, localized, and Control survival. Thus, IL-5 has become an important drug target for new anti-asthma drugs (Foster, PS et al., Pharmacol Ther, 2002, 94 (3): 253; Foster, PS et al., Trends Mol. Med, 2002, 8 (4): 162).

ヒトタンパク質とマウスタンパク質との相同性は７１％である（サイトカインハンドブック（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｈａｎｄｂｏｏｋ）。ＩＬ−５のアミノ酸配列は、マウスインターロイキン３、マウスＧＭ−ＣＳＦ、およびマウスインターフェロンγタンパク質の短いストレッチ領域を除き、その他のサイトカインのアミノ酸配列との相同性が著しいものではない。ヒトとマウス両方のタンパク質配列に関して予想される分子質量は、１３．１ｋＤａである。生物学的に活性なＩＬ−５は、モノマーを頭−尾構造に向ける高度に保存されたシステイン残基（４４〜８６’および８６〜４４’）が共有結合した、ジスルフィド結合ホモダイマーである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９１１〜９２０、１９９０）。野生型モノマーＩＬ−５は生物学的に不活性であるが、挿入性の突然変異誘発によって、機能性ＩＬ−５モノマーが設計製作されている（Ｄｉｃｋａｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ７４：５３５〜４６、１９９６）。ヒトＩＬ−５の結晶構造の分析によれば、新規な２つのドメイン構造が示され、各ドメインでは２つの鎖の関与が必要であり、サイトカインの折畳みに対する高い類似性がＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン３、およびインターロイキン４に見られることが実証された（Ｍｉｌｂｕｒｎ，Ｍ．Ｖ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３６３：１７２〜１７６）。ＩＬ−５のＣ末端領域は、ＩＬ−５レセプターとの結合および生物活性に重要であるようにみえる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他、Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．１５（５）：４９１〜９、１９９６）。ＩＬ−５とそのレセプターとの結合は、らせんＡが主にレセプターのαサブユニットの結合に関与する、らせんＡとＤが重複する領域で生じると考えられる（Ｇｒａｂｅｒ、Ｐ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５７６２〜１５７６９、１９９５）。天然のヒトＩＬ−５には、２つの潜在的なグリコシル化部位があり、マウスＩＬ−５には３つの部位がある。ヒトＩＬ−５は、Ｔｈｒ３でＮグリコシル化しかつＯグリコシル化している。真核系内で発現した組換えＩＬ−５は、差次的なグリコシル化が原因で、４５〜６０ｋＤａという広範囲にわたる分子質量を示す。脱グリコシル化したＩＬ−５と原核細胞内で発現したＩＬ−５は、完全な生体活性を維持する（ＴｏｍｉｎａｇａＡ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４４：１３４５〜１３５２、１９９０）。 The homology between human protein and mouse protein is 71% (Cytokine hand book) The amino acid sequence of IL-5 is a short stretch region of mouse interleukin 3, mouse GM-CSF, and mouse interferon gamma protein The molecular mass expected for both human and mouse protein sequences is 13.1 kDa, except for the biologically active IL-5, except for the amino acid sequence of other cytokines. , A disulfide bond homodimer covalently linked by highly conserved cysteine residues (44-86 'and 86-44') that direct the monomer to a head-to-tail structure (Takahashi, T. et al., Mol. Immunol. 27). : 911-920, 1990 Wild-type monomer IL-5 is biologically inactive, but functional IL-5 monomers have been engineered by insertional mutagenesis (Dickason, RR et al., J. Mol. Med 74: 535-46, 1996. Analysis of the crystal structure of human IL-5 showed two novel domain structures, each domain requiring the involvement of two chains and the folding of the cytokine. It has been demonstrated that a high similarity to is found in GM-CSF, interleukin 3, and interleukin 4 (Milburn, MV et al., Nature 363: 172-176). The terminal region appears to be important for IL-5 receptor binding and biological activity (Proudfoot et al., J. Protein Che 15 (5): 491-9, 1996. Binding of IL-5 to its receptor occurs in the region where helices A and D overlap, where helix A is primarily responsible for the binding of the α subunit of the receptor. (Graber, P. et al., J. Biol. Chem. 270: 15762-15769, 1995) Natural human IL-5 has two potential glycosylation sites, which are present in mouse IL-5. There are three sites: human IL-5 is N-glycosylated and O-glycosylated at Thr 3. Recombinant IL-5 expressed in the eukaryotic system is due to differential glycosylation. It exhibits a broad molecular mass of ˜60 kDa Deglycosylated IL-5 and IL-5 expressed in prokaryotic cells maintain full biological activity (Tominaga A. et al. J. et al. Immunol 144: 1345-1352, 1990).

薬物送達への経路は、一般に、ＩＬ−５産生の阻害剤のスクリーニング、リガンド拮抗剤、レセプターの発現およびレセプターの活性化の制御に基づく。特にＩＬ−５の作用の阻害は、喘息および好酸球に関連するその他の疾患に対する治療方法を提供することができる。免疫療法は、ＩＬ−５レベルおよび喘息などの好酸球に関連した疾患状態を制御するための、もう１つの非常に魅力ある手法である。 The pathway to drug delivery is generally based on screening for inhibitors of IL-5 production, ligand antagonists, receptor expression and control of receptor activation. In particular, inhibition of the action of IL-5 can provide a therapeutic method for asthma and other diseases associated with eosinophils. Immunotherapy is another very attractive approach for controlling disease states associated with eosinophils such as IL-5 levels and asthma.

現在、喘息の症状を予防する最も一般的な治療は、吸入用コルチコステロイドを使用することである。一般にこれらの薬剤を使用することは、非常に安全で安価である。しかしこれらの薬剤は、全身に免疫抑制作用を引き起こすことによって機能し、したがってこれらの薬剤を長期使用することにより、高血圧や骨粗鬆症、白内障の発症を含めた副作用が生じる。コルチコステロイドは毎日摂取しなければならず、そのためこれらの薬品を首尾良く使用するうえで、患者のコンプライアンスが別の問題になる。さらに、コルチコステロイドを使用しても治りにくく、別の療法の使用を必要とする喘息患者がいる。ＩＬ−５を対象とした免疫治療薬を使用して、好酸球を選択的に標的とすることにより、多面的作用を伴う全身性免疫抑制剤を使用することの副作用を克服することができる。 Currently, the most common treatment to prevent asthma symptoms is to use corticosteroids for inhalation. In general, the use of these drugs is very safe and inexpensive. However, these drugs function by causing an immunosuppressive action throughout the body. Therefore, long-term use of these drugs causes side effects including the development of hypertension, osteoporosis, and cataract. Corticosteroids must be taken daily, so patient compliance is another issue in the successful use of these drugs. In addition, there are asthma patients who are difficult to cure using corticosteroids and require the use of alternative therapies. By selectively targeting eosinophils using immunotherapeutics directed against IL-5, the side effects of using systemic immunosuppressive agents with pleiotropic effects can be overcome. .

喘息などの疾患の将来可能な治療には、受動免疫化、したがってＩＬ−５に特異的なモノクローナル抗体の使用を含めることができる。喘息患者の好酸球を減少させることを目標とした、ＩＬ−５に対するヒト化モノクローナル抗体による臨床試験が進行中である。特に、様々な種のＩＬ−５に対して活性なヒト化モノクローナル抗体であるＳＣＨ５５７００（エスリズマブ（ｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、ＳｃｈｅｒｉｎｇＰｌｏｕｇｈ）を使用した臨床試験［Ｅｇａｎ，Ｒ．Ｗ．他、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、１９９９、４９：７７９］と、ヒトおよび霊長類のインターロイキン５に特異的なヒト化抗体であるＳＢ２４０５６３（メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を使用した臨床試験［Ｈａｒｔ，Ｔ．Ｋ．他、ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ、１９９８、１５７：Ａ７４４；Ｚｉａ−Ａｍｉｒｈｏｓｓｅｉｎｉ，Ｐ．他、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ、１９９９、２９１：１０６０］が報告されている。どちらのモノクローナル抗体も、第１相試験で許容可能な安全プロフィルであることが実証され、その結果好酸球の数が減少したが、気道の機能亢進の低下は観察されなかった。好酸球によって喘息患者の気道に生じる有害な作用は、組織の再建を伴う慢性的現象と考えられる。この意味で抗ＩＬ−５療法の効き目を試験するように設計された研究を評価する必要があり、開発中である。 Future possible treatments for diseases such as asthma can include passive immunization and thus the use of monoclonal antibodies specific for IL-5. Clinical trials with humanized monoclonal antibodies against IL-5 are ongoing, with the goal of reducing eosinophils in asthmatic patients. In particular, clinical trials using SCH55700 (eslizumab, Schering Plow), an active humanized monoclonal antibody against various species of IL-5 [Egan, R .; W. Et al., Arzneimtel-Forschung, 1999, 49: 779] and clinical trials using SB240563 (mepolizumab, Glaxo Smith Kline), a humanized antibody specific for human and primate interleukin-5 [Hart, T.A. K. Et al., Am J Respir Crit Care Med, 1998, 157: A744; Zia-Amirhosseini, P. et al. Et al., J Pharmacol Exp Ther, 1999, 291: 1060]. Both monoclonal antibodies proved to be an acceptable safety profile in Phase 1 trials, resulting in a decrease in the number of eosinophils, but no decrease in airway hyperactivity was observed. The detrimental effects of eosinophils on the airways of asthmatic patients are considered a chronic phenomenon with tissue reconstruction. In this sense, studies designed to test the efficacy of anti-IL-5 therapy need to be evaluated and are under development.

しかしｍＡｂによる治療には、いくつかの欠点が伴う。モノクローナル抗体は、毎月または隔月に摂取しなければならない高価な治療薬である。注射用薬物の投与のために医療機関を繰り返し訪れなければならないことから生じる患者の非コンプライアンスの問題は、重要な問題である。さらに、患者と治療用抗体とのアロタイプが様々であることから、モノクローナル抗体療法が結局効果のないものになる可能性がある。ｍＡｂが高用量であり免疫形成が複雑であることも、受動免疫化の効果を低下させる可能性がある。ワクチン接種を活発に行う試みにより、これらの合併症が抑制される。 However, mAb treatment has several drawbacks. Monoclonal antibodies are expensive therapeutics that must be taken every month or every other month. The problem of patient non-compliance resulting from repeated visits to medical institutions for the administration of injectable drugs is an important issue. Furthermore, because of the various allotypes of patients and therapeutic antibodies, monoclonal antibody therapy may eventually be ineffective. The high dose of mAb and the complexity of immunization can also reduce the effect of passive immunization. Active attempts at vaccination suppress these complications.

慢性の喘息または実証された好酸球増加症に伴うその他の疾患またはＩＬ−５に関連するその他の状態に対する治療薬を提供する別の手法が、ＷＯ９７／４５４４８に記載されている。その中で、天然または変異形態のＩＬ５によって引き起こされた異常な作用を改善し、軽減し、またはその他の方法で低減させる際に「ＩＬ５の活性に拮抗可能な変性または変種形態のＩＬ５分子」を使用することが提案されている。拮抗作用は、低親和性のＩＬ５Ｒ鎖に結合するが高親和性のレセプターには結合しない変種形態のＩＬ５の結果であることが報告されている。このように作用することによって、変種はＩＬ５と競合し、ＩＬ５の生理的作用をもたらすことなくそのレセプターと結合しようとする。 Another approach providing therapeutics for other diseases associated with chronic asthma or documented eosinophilia or other conditions associated with IL-5 is described in WO 97/45448. Among them, a “denatured or variant form of an IL5 molecule that can antagonize the activity of IL5” in ameliorating, reducing, or otherwise reducing an abnormal effect caused by a natural or mutant form of IL5 It is proposed to use. Antagonism has been reported to be the result of a variant form of IL5 that binds to the low affinity IL5R chain but not to the high affinity receptor. By acting in this way, the variant competes with IL5 and attempts to bind to its receptor without causing the physiological effects of IL5.

エオタキシンは、好酸球、好塩基球、およびＴｈ２細胞上に存在する、ケモカインレセプター３に特異的なケモカインである。しかしエオタキシンは、好酸球に対する特異性が高い（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。好酸球の遊走は、エオタキシン１ノックアウトマウスで７０％低減するが、依然として好酸球を発生させることができる（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７８５〜９０（１９９７））。ＩＬ−５は、好酸球が骨髄から血液に遊走する原因と考えられ、エオタキシンは、組織内での局所的な遊走の原因と考えられる（Ｈｕｍｂｌｅ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６０１〜１２（１９９７））。したがって、ＩＬ−５の他にエオタキシンを標的とすることによって、好酸球の減少に向けた免疫療法を強化することができる。 Eotaxin is a chemokine specific for chemokine receptor 3 present on eosinophils, basophils, and Th2 cells. However, eotaxin is highly specific for eosinophils (Zimmerman et al., J. Immumol. 165: 5839-46 (2000)). Eosinophil migration is reduced by 70% in eotaxin-1 knockout mice, but can still generate eosinophils (Rothenbergs et al., J. Exp. Med. 185: 785-90 (1997)). IL-5 is thought to cause eosinophils to migrate from the bone marrow to the blood, and eotaxin is thought to cause local migration within the tissue (Humle et al., J. Exp. Med. 186: 601). 12 (1997)). Therefore, by targeting eotaxin in addition to IL-5, immunotherapy towards eosinophil reduction can be enhanced.

ヒトゲノムは、３０％が相同な３個のエオタキシン遺伝子、エオタキシン１〜３を含有する。今日まで、２個の遺伝子、エオタキシン１およびエオタキシン２がマウスでわかっている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。これらは３８％が相同である。マウスエオタキシン２は、ヒトエオタキシン２に対して５９％が相同である。マウスでは、エオタキシン１が、胃腸管に偏在して発現するようであり、一方エオタキシン２は、空腸に優先的に発現するようである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。エオタキシン１は、気管支肺胞液中に存在する（Ｔｅｉｘｅｉｒａ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１６５７〜６６（１９９７））。ヒトエオタキシン１の配列は配列番号２４２で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応する）、ヒトエオタキシン２の配列は配列番号２４３で示され（ａａ１〜２６がシグナルペプチドに対応し）、ヒトエオタキシン３の配列は配列番号２４４で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応し）、マウスエオタキシン１の配列は配列番号２４５で示され（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応し）、マウスエオタキシン２の配列は配列番号２４６で示される（ａａ１〜２３がシグナルペプチドに対応する）。 The human genome contains three eotaxin genes, eotaxins 1-3, which are 30% homologous. To date, two genes, eotaxin 1 and eotaxin 2, are known in mice (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). These are 38% homologous. Mouse eotaxin 2 is 59% homologous to human eotaxin 2. In mice, eotaxin 1 appears to be ubiquitously expressed in the gastrointestinal tract, whereas eotaxin 2 appears to be preferentially expressed in the jejunum (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). ). Eotaxin 1 is present in bronchoalveolar fluid (Teixeira et al., J. Clin. Invest. 100: 1657-66 (1997)). The sequence of human eotaxin 1 is represented by SEQ ID NO: 242 (aa1 to 23 corresponds to a signal peptide), the sequence of human eotaxin2 is represented by SEQ ID NO: 243 (aa1 to 26 corresponds to a signal peptide), and human eotaxin The sequence of 3 is shown in SEQ ID NO: 244 (aa1-23 corresponds to the signal peptide), the sequence of mouse eotaxin 1 is shown in SEQ ID NO: 245 (aa1-23 corresponds to the signal peptide), and the sequence of mouse eotaxin 2 The sequence is shown in SEQ ID NO: 246 (aa1 to 23 correspond to the signal peptide).

エオタキシンのモノマーは、その質量が８．３ｋＤａであり、広範囲にわたる条件全体を通してダイマーエオタキシンと平衡状態を保つ。推定されるＫｄは３７℃で１．３ｍＭであるが、モノマーが主な形態である（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。エオタキシンの構造は、ＮＭＲ分光測定によって明らかにした。そのレセプターＣＣＲ３に対する結合部位はＮ末端にあり、第１のシステインの前にある領域が非常に重要である（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９、１９９８）。エオタキシンに結合したケモカインレセプターから得られたペプチドが、この発見を裏付けた。エオタキシンは、２つのジスルフィド架橋を形成する４つのシステインを持ち、化学的に合成することができる（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３０：３１２８〜３１３５、１９９１）。エオタキシン１は、Ｔｈｒ７１上で様々にＯグリコシル化する（Ｎｏｓｏ，Ｎ．他、ＥｕｒＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：１１４〜１２２）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質ゾルでのエオタキシン１の発現についても記述されている（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。封入体としてのＥ．ｃｏｌｉでの発現とその後に続くリフォールディング（Ｍａｙｅｒ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３９：８３８２〜９５（２０００））、および昆虫細胞の発現（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１〜６（１９９７））が、エオタキシン２に関して報告されている。 The eotaxin monomer has a mass of 8.3 kDa and is in equilibrium with dimer eotaxin throughout a wide range of conditions. The estimated Kd is 1.3 mM at 37 ° C., but the monomer is the predominant form (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). The structure of eotaxin was revealed by NMR spectroscopy. The binding site for its receptor CCR3 is at the N-terminus, and the region preceding the first cysteine is very important (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9, 1998). Peptides obtained from chemokine receptors bound to eotaxin confirmed this finding. Eotaxin has four cysteines that form two disulfide bridges and can be chemically synthesized (Clark-Lewis et al., Biochemistry 30: 3128-3135, 1991). Eotaxin 1 is variously O-glycosylated on Thr71 (Noso, N. et al., Eur J. Biochem. 253: 114-122). E. Eotaxin 1 expression in the E. coli cytosol has also been described (Crump et al., J. Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). E. as an inclusion body and subsequent refolding (Mayer et al., Biochemistry 39: 8382-95 (2000)), and insect cell expression (Forssmann et al., J. Exp. Med. 185: 2171-6 ( 1997)) have been reported for eotaxin-2.

インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、生物学的に活性なモノマーＴｈ２サイトカインとして分泌される。成熟した形態のＩＬ−１３は、ヒトの場合は１１２個のアミノ酸を含み、マウスの場合は１１１個のアミノ酸を含む。計算されたタンパク質の分子質量は約１２．４ｋＤａである。ＩＬ−１３は、Ｎ結合グリコシル化することができ（ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＫ．Ａ．他、ＴｈｅＣｙｔｏｋｉｎｅｓＦａｃｔＢｏｏｋ、第２版、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ＩＬ−１３は、Ｔｈ２細胞、マスト細胞、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞によって産生される（ＢｒｏｍｂａｃｈｅｒＦ、２０００ＢｉｏｅｓｓａｙｓＪｕｌ；２２（７）：６４６〜５６）。機能的ＩＬ−１３レセプターは、インターロイキン４レセプターα鎖（ＩＬ−４Ｒ α鎖）と、２つのＩＬ−１３レセプターα結合タンパク質の一方とからなるヘテロダイマーである（ＢｒｏｍｂａｃｈｅｒＦ、２０００ＢｉｏｅｓｓａｙｓＪｕｌ；２２（７）：６４６〜５６）。 Interleukin 13 (IL-13) is secreted as a biologically active monomeric Th2 cytokine. The mature form of IL-13 contains 112 amino acids for humans and 111 amino acids for mice. The calculated molecular mass of the protein is approximately 12.4 kDa. IL-13 can be N-linked glycosylated (Fitzgerald KA et al., The Cytokines Fact Book, 2nd edition, Academic Press), IL-13 is a Th2 cell, mast cell, basophil, and Produced by natural killer cells (Brombacher F, 2000 Bioessays Jul; 22 (7): 646-56). A functional IL-13 receptor is a heterodimer consisting of an interleukin 4 receptor alpha chain (IL-4R alpha chain) and one of two IL-13 receptor alpha binding proteins (Brombacher F, 2000 Bioessays Jul; 22 (7): 646-56).

ＩＬ１３は、喘息の病状にかなりの役割を果たす。ＩＬ１３は、この疾患の中心的な特徴に関与することが示されている。これは、アレルゲン誘発性気道過敏症（ＡＨＲ）および粘液産生に直接作用し、好酸球増加症に関与する（ＫｕｐｅｒｍａｎＤ．Ａ．、２００２、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、印刷前の電子版）。マウスにおけるＩＬ−１３の選択的中和により、喘息の表現型が著しく弱められた。さらに、ＩＬ−１３を投与すると、喘息様の表現型が非感作Ｔ細胞欠失マウスまたは未処置のマウスに与えられた（ＧｒｕｎｉｇＧ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２６１〜３、Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２５８〜６１）。ＩＬ−１３の標的欠失がなされたマウスは、アレルゲン誘発性ＡＨＲを発症させることができず、粘液産生が著しく低下したことが示された（Ｗａｌｔｅｒ，Ｄ．Ｍ．他、２００１、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１６７（８）：４６６８〜７５）。ＩＬ−１３は、マウス喘息モデルでは好酸球増加症にも影響を及ぼすので（ＧｒｕｎｉｇＧ．他、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２（５３９７）：２２６１〜３）、ＩＬ−１３は、好酸球増加症に関連したより多くのアレルギー性疾患に関与する可能性があり、したがってその活性を中和することによって、患者に将来有望な治療を提供することができる。 IL13 plays a significant role in asthma pathology. IL13 has been shown to be involved in the central features of this disease. It directly affects allergen-induced airway hyperresponsiveness (AHR) and mucus production and is involved in eosinophilia (Kuperman DA, 2002, Nature Medicine, electronic version before printing). Selective neutralization of IL-13 in mice significantly attenuated the asthma phenotype. In addition, administration of IL-13 gave an asthma-like phenotype to non-sensitized T cell-deficient or naïve mice (Grunig G. et al., 1998, Science, 282 (5397): 2261-3, Wills-Karp, M. et al., 1998, Science, 282 (5397): 2258-61). Mice with a targeted deletion of IL-13 were unable to develop allergen-induced AHR, indicating that mucus production was significantly reduced (Walter, DM et al., 2001, J Immunol, 167 (8): 4668-75). Since IL-13 also affects eosinophilia in the mouse asthma model (Grunig G. et al., 1998, Science, 282 (5397): 2261-3), IL-13 is an eosinophil It may be involved in more allergic diseases associated with bulopenia and thus neutralizing its activity can provide patients with promising treatments in the future.

さらに、ＩＬ−１３およびＩＬ−１３レセプターのアップレギュレーションが多くの腫瘍型に見られた（例えば、今日まで試験が行われているすべてのＨｏｄｇｋｉｎリンパ腫疾患細胞系）。したがってＩＬ−１３に対する免疫化は、ＩＬ−１３を過発現する腫瘍患者の治療方法を提供することができる。 In addition, IL-13 and IL-13 receptor upregulation was seen in many tumor types (eg, all Hodgkin lymphoma disease cell lines that have been tested to date). Thus, immunization against IL-13 can provide a method for treating tumor patients that overexpress IL-13.

ワクチン接種の効率を改善する１つの方法は、加えられる抗原の反復度を高めることである。単離されたタンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けによりまたはＴ細胞の助けなしで、いかなるアジュバントも存在しない状態で、即座にかつ効率的に免疫応答を引き起こす（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ：１５：２３５〜２７０（１９９１））。ウイルスはしばしばごく少ないタンパク質からなるが、単離された成分よりも非常に強い免疫応答を引き起こすことができる。Ｂ細胞応答では、ウイルスの免疫原性に関する１つの極めて重要なファクターが、表面エピトープの反復性および順序正しさであることがわかっている。多くのウイルスは、エピトープに特異的な免疫グロブリンをＢ細胞に効率的に架橋するエピトープの規則正しいアレイを示す、準結晶質表面を示す（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７：５５３〜５５８（１９９６））。この免疫グロブリンのＢ細胞への架橋は、細胞周期の進行およびＩｇＭ抗体の産生を直接誘発させる強力な活性化シグナルである。さらに、そのようなトリガーＢ細胞はＴヘルパー細胞を活性化することができ、それによってＢ細胞内でＩｇＭからＩｇＧ抗体産生への切換えを誘発させ、長命Ｂ細胞記憶を生成する−すなわちこれがすべてのワクチン接種の目標である（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウイルス構造は、自己免疫疾患での抗抗体の生成にも関係し、病原に対する自然な応答の一部としても関係する（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、ＪＥｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）参照）。したがって高度に組織化されたウイルス表面に存在する抗体は、強力な抗抗体応答を引き起こすことができる。 One way to improve the efficiency of vaccination is to increase the repeatability of the added antigen. Unlike isolated proteins, viruses elicit an immune response immediately and efficiently in the absence of any adjuvant, with or without the help of T cells (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15: 235-270 (1991)). Viruses often consist of very few proteins, but can elicit a much stronger immune response than isolated components. In B cell responses, one crucial factor regarding viral immunogenicity has been found to be the repeatability and order of surface epitopes. Many viruses exhibit a quasicrystalline surface that shows an ordered array of epitopes that efficiently cross-link immunoglobulin specific for the epitope to B cells (Bachmann and Zinkneragel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996). ). This cross-linking of immunoglobulins to B cells is a strong activation signal that directly triggers cell cycle progression and production of IgM antibodies. In addition, such trigger B cells can activate T helper cells, thereby inducing a switch from IgM to IgG antibody production within the B cells and generating long-lived B cell memory—that is, all Vaccination goal (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Viral structure is also involved in the generation of anti-antibodies in autoimmune diseases and as part of the natural response to pathogens (Fehr, T. et al., J Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997). reference). Thus, antibodies present on highly organized viral surfaces can cause a strong anti-antibody response.

しかし上述のように、免疫系は通常、自己由来の構造に対する抗体を産生することができない。低濃度で存在する可溶性抗原の場合、これはＴｈ細胞レベルでの寛容に起因する。これらの条件下、Ｔヘルプを送達することができる担体に自己抗原を連結することによって、寛容性が破壊される可能性がある。高濃度で存在する可溶性タンパク質または低濃度の膜タンパク質では、ＢおよびＴｈ細胞が寛容になり得る。しかしＢ細胞寛容は可逆的であり（アネルギー）、高度に組織化された手法で外来の担体に連結した抗原の投与によって破壊される可能性がある（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。 However, as mentioned above, the immune system usually cannot produce antibodies against autologous structures. In the case of soluble antigens present at low concentrations, this is due to tolerance at the Th cell level. Under these conditions, tolerance can be destroyed by linking the autoantigen to a carrier capable of delivering T-help. Soluble proteins present at high concentrations or membrane proteins at low concentrations can tolerate B and Th cells. However, B cell tolerance is reversible (anergy) and can be destroyed by administration of antigen linked to a foreign carrier in a highly organized manner (Bachmann and Zinkneragel, Ann. Rev. Immunol. 15). : 235-270 (1997)).

本発明者等はついに、固有の反復性組織を有する構造のコア粒子、すなわち本明細書では特にウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびＶＬＰのサブユニットにそれぞれ結合して高度に規則的で反復性の結合体になった、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンに特異的な抗体を誘発させるための潜在的な免疫原になることを見出した。さらにこれらの自動反応性抗体は、喘息のマウスモデルにおける好酸球増加症を阻害する。したがって本発明は、規則的で反復性の、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子とのアレイ、特にＶＬＰと、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの結合体およびアレイをそれぞれ基にした、アレルギー性好酸球疾患を治療するための治療手段を提供する。この療法は、ワクチン接種した動物で抗ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシン抗体の高い力価を引き出すことができ、喘息のマウスモデルで好酸球増加症を阻害することができる。 We finally have a highly regular and repetitive binding that binds to core particles with a structure that has a unique repetitive organization, ie, specifically virus-like particles (VLP) and VLP subunits, respectively, here. IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide in the body becomes a potential immunogen to elicit antibodies specific for IL-5, IL-13, or eotaxin I found it. Furthermore, these autoreactive antibodies inhibit eosinophilia in a mouse model of asthma. Accordingly, the present invention provides a regular and repetitive array of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and core particles, particularly VLP, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or Provided are therapeutic means for treating allergic eosinophil disease, each based on conjugates and arrays with peptides. This therapy can elicit high titers of anti-IL-5, IL-13, or eotaxin antibodies in vaccinated animals and can inhibit eosinophilia in a mouse model of asthma.

したがって本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位は前記第１の付着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。本発明での使用に適するコア粒子の好ましい実施形態は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、細菌線毛またはべん毛、あるいは本発明による規則正しい反復性抗原アレイを形成することが可能な固有の繰返し構造を有する任意のその他のコア粒子である。 Accordingly, the present invention provides a composition comprising (a) a core particle having at least one first attachment site , and (b) at least one antigen or antigenic determinant having at least one second attachment site. Wherein the antigen or antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and the second attachment site is (i) a non-naturally occurring attachment to the antigen or antigenic determinant A site , (ii) selected from the group consisting of attachment sites naturally present on the antigen or antigenic determinant, wherein the second attachment site is capable of associating with the first attachment site , the antigen or antigenic determinant And the core particles interact through the association to form an ordered repetitive antigen array . Preferred embodiments of core particles suitable for use in the present invention are viruses, virus-like particles, bacteriophages, bacterial pili or flagella, or unique repeats capable of forming an ordered repetitive antigen array according to the present invention. Any other core particle having a structure.

より詳細には、本発明は、規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイを含む組成物、したがって本明細書では特にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとの結合体を含む組成物を提供する。より詳細には本発明は、ウイルス様粒子と、そこに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドとを含む、組成物を提供する。また本発明は、結合体と、規則的で反復性のアレイとをそれぞれ生成するためのプロセスも提供する。本発明の組成物は、好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療するためのワクチンの製造に有用であり、また、好酸球成分によるアレルギー性疾患を予防しまたは治療し、免疫応答、特に抗体応答を効率的に引き起こすための治療用ワクチンとしても有用である。さらに本発明の組成物は、指示される状況で自己特異的な免疫応答を効率的に引き起こすのに特に有用である。 More particularly, the present invention relates to a composition comprising a regular and repetitive antigen or antigenic determinant array, and thus specifically herein an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and a VLP. Compositions comprising the conjugate are provided. More particularly, the present invention provides a composition comprising a virus-like particle and at least one protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin bound thereto. The present invention also provides a process for generating a combination and a regular and repeatable array, respectively. The composition of the present invention is useful in the manufacture of a vaccine for treating allergic diseases caused by eosinophil components, and also prevents or treats allergic diseases caused by eosinophil components and provides immune responses, particularly antibodies. It is also useful as a therapeutic vaccine to efficiently cause a response. Furthermore, the compositions of the present invention are particularly useful for efficiently eliciting a self-specific immune response in the indicated context.

本発明では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合し、典型的な場合は方向が示された手法で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの規則正しい反復性抗原アレイが得られる。さらに、コア粒子およびＶＬＰの高度に反復的かつ組織化された構造はそれぞれ、高度に規則的で反復的に、ＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの表示を媒介し、それが高度に組織化され反復的な抗原アレイにつながる。さらに、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合により、それぞれＴヘルパー細胞エピトープが得られるが、これは、コア粒子とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシのタンパク質またはペプチドのアレイ、さらにはＶＬＰとＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドのアレイでそれぞれ免疫化した宿主に対して、コア粒子およびＶＬＰが外来のものだからである。これらのアレイは、高度に組織化された構造であり、寸法であり、またアレイ表面に抗原が繰り返し存在する点で、従来技術の結合体とは異なる。 In the present invention, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide binds to the core particle and VLP, respectively, typically in a directed manner, with IL-5, IL-13, Or an ordered repetitive antigen array of eotaxin proteins or peptides is obtained. Furthermore, the highly repetitive and organized structures of the core particle and VLP, respectively, mediate the expression of IL5, IL-13, or eotaxin protein or peptide in a highly regular and repetitive manner, which Organized into a repetitive antigen array. Furthermore, binding of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to core particles and VLPs, respectively, yields T helper cell epitopes, which are core particles and IL-5, IL-13, Or because the core particles and VLPs are foreign to a host immunized with an array of eotaxic proteins or peptides, and further with an array of VLPs and IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides, respectively. . These arrays are highly organized structures, are dimensional, and differ from prior art conjugates in that antigens are repeatedly present on the surface of the array.

本発明の一態様では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質あるいはＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドの適正な折畳みに適合した安定な発現宿主に発現し、あるいは合成され、一方コア粒子およびＶＬＰはそれぞれ、コア粒子およびＶＬＰの折畳みおよび組織体にそれぞれ適した発現宿主で発現し、精製される。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、化学的に合成することができる。次いで、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシアレイのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンアレイのタンパクまたはペプチドを組織化（ａｓｓｅｍｂｌｅ）する。 In one aspect of the invention, the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is a proper fold of the IL5, IL-13, or eotaxin protein or the IL-5, IL-13, or eotaxin peptide. Expressed in a stable expression host compatible with or synthesized, while the core particle and VLP are expressed and purified respectively in an expression host suitable for folding and tissue of the core particle and VLP, respectively. IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides can be chemically synthesized. The IL-5, IL-13, or eotaxin array protein or peptide is then assembled by binding the IL-5, IL-13, or eotaxy array protein or peptide to the core particle and VLP, respectively. .

別の態様で、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含む組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、（ａ）請求項１または請求項２２に記載の組成物と、（ｂ）許容可能な医薬品担体とを含む医薬品組成物を提供する。 In another aspect, the invention provides a composition comprising (a) a virus-like particle and (b) at least one antigen or antigenic determinant, wherein the antigen or antigenic determinant is IL-5, A pharmaceutical composition comprising IL-13 or eotaxin protein or peptide, comprising (a) a composition according to claim 1 or claim 22 and (b) an acceptable pharmaceutical carrier.

さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。 In yet another aspect, the present invention includes a core particle having at least one first attachment site (a), and at least one antigen or antigenic determinant with at least one second attachment site (b) Providing a vaccine composition, wherein the antigen or antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and the second attachment site is (i) A non-naturally occurring attachment site on the antigen or antigenic determinant, (ii) selected from the group consisting of an attachment site that is naturally present on the antigen or antigenic determinant, and the antigen or antigenic determinant and the core particle are: The association interacts to form an ordered and repetitive antigen array .

別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子と、（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含んだ組成物を含む、ワクチン組成物を提供し、前記抗原または前記抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、前記ウイルス様粒子に結合する。 In another aspect, the invention provides a vaccine composition comprising a composition comprising (a) a virus-like particle and (b) at least one antigen or antigenic determinant, wherein said antigen or said antigenic determination The group is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and the at least one antigen or antigenic determinant binds to the virus-like particle.

さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子を提供する工程と、（ｂ）少なくとも１つの抗原、あるいはＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを提供する工程と、（ｃ）前記ウイルス様粒子と前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基を結合して、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に結合するようにする工程とを含む、請求項１に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。 In yet another aspect, the invention provides (a) providing virus-like particles; (b) providing at least one antigen, or IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide; (C) binding the virus-like particle and the at least one antigen or antigenic determinant such that the at least one antigen or antigenic determinant binds to the virus-like particle. A process for producing the composition of claim 1 is provided.

さらに別の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子を提供する工程と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供する工程であって、前記抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位が、（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位が、前記第１の付着部位に会合可能なものである工程と、（ｃ）前記コア粒子と、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを結合する工程であって、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とが前記会合によって相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する工程とを含む、請求項２２に記載の組成物を生成するためのプロセスを提供する。 In yet another aspect, the present invention is, (a) providing a core particle with at least one first attachment site, (b) at least one antigen or antigens with at least one second attachment site Providing a determinant, wherein the antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin, and the second attachment site is (i) the antigen or antigen A non-naturally occurring attachment site in the determinant; (ii) selected from the group consisting of the antigen or a naturally occurring attachment site in the antigenic determinant, wherein the second attachment site is capable of associating with the first attachment site And (c) binding the core particle to the at least one antigen or antigenic determinant, wherein the antigen or antigenic determinant and the core particle are Interacts with the serial association, and forming a ordered and repetitive antigen array, provides a process for producing the composition of claim 22.

別の態様では、本発明は、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む、免疫化の方法を提供する。 In another aspect, the present invention provides a method of immunization comprising administering the composition of claim 1 or claim 22 or claim 74 to an animal or human.

別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療する薬品を製造するための、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物の使用を提供する。 In another aspect, the present invention provides the use of a composition according to claim 1 or claim 22 or claim 74 for the manufacture of a medicament for treating allergic diseases caused by eosinophil components.

さらに別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患、好ましくは喘息を治療しまたは予防する薬品を調製するための、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物の使用を提供する。さらに別の態様では、本発明は、好酸球成分によるアレルギー性疾患、特に喘息を治療しまたは予防するための組成物、ワクチン、薬物、または薬品を製造するために、請求項１または請求項２２または請求項７４に記載の組成物を単独でまたは他の薬剤と併せて使用することを提供する。 In yet another aspect, the invention provides a composition according to claim 1 or claim 22 or claim 74 for the preparation of a medicament for treating or preventing allergic diseases caused by eosinophil components, preferably asthma. Provide the use of things. In yet another aspect, the present invention provides a composition, vaccine, drug, or drug for treating or preventing an allergic disease caused by an eosinophil component, particularly asthma, or claim 1, or claim 1. 22 or claim 74 is provided for use alone or in combination with other agents.

さらに本発明は、特に、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるのに適したワクチン組成物を提供する。本発明はさらに、動物、特に雌ウシ、ヒツジ、ウシ、ならびにヒトにおける、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させるための、免疫化およびワクチン接種の方法をそれぞれ提供する。本発明の組成物は、予防的にまたは治療的に使用することができる。 The present invention further provides a vaccine composition that is particularly suitable for preventing and / or alleviating allergic diseases or conditions associated with eosinophil components. The present invention further provides immunization and vaccination methods for preventing and / or alleviating allergic diseases or conditions associated with eosinophil components in animals, particularly cows, sheep, cows, and humans. Provide each. The compositions of the invention can be used prophylactically or therapeutically.

特定の実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物、すなわち本明細書で使用する「自己抗原」によって引き起こされまたは悪化する、好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を、予防しかつ／または軽減させる方法を提供する。関係する実施形態では、本発明は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされまたは悪化する好酸球成分によるアレルギー性疾患またはそれに関連した状態を予防しかつ／または軽減させる抗体の産生をもたらす免疫応答を、動物および個体においてそれぞれ誘発させる方法を提供する。 In certain embodiments, the present invention prevents allergic diseases or conditions associated with eosinophil components that are caused or exacerbated by “self” gene products, ie, “self antigens” as used herein. And / or a method of mitigating. In a related embodiment, the invention provides an immune response that results in the production of antibodies that prevent and / or reduce allergic diseases or conditions associated with eosinophil components caused or exacerbated by “self” gene products. Provides a method of triggering in animals and individuals, respectively.

当業者に理解されるように、本発明の組成物を動物またはヒトに投与する場合、その組成物は、塩、緩衝液、アジュバント、またはこの組成物の効能を改善するのに望ましいその他の物質を含有する組成物でよい。医薬品組成物の調製に適した物質の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ，Ａ．編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（１９９０））を含めた非常に数多くの出典に示されている。 As will be appreciated by those skilled in the art, when a composition of the invention is administered to an animal or human, the composition may be a salt, buffer, adjuvant, or other substance desirable to improve the efficacy of the composition. It may be a composition containing Examples of materials suitable for the preparation of pharmaceutical compositions are given in numerous sources, including Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A. Ed., Mack Publishing Co. (1990)).

本発明の組成物は、その投与が受容者個人によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能」といえる。さらに本発明の組成物は、「治療上有効な量」（すなわち、所望の生理学的効果をもたらす量）で投与される。 A composition of the invention can be said to be “pharmacologically acceptable” if its administration is acceptable by the recipient individual. Further, the compositions of the invention are administered in a “therapeutically effective amount” (ie, an amount that provides the desired physiological effect).

本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法で投与することができるが、通常は注射、輸液、吸入、経口投与、またはその他の適切な物理的方法によって投与される。あるいは組成物は、筋肉内、静脈内、または皮下から投与することができる。投与される組成物の成分には、滅菌水溶液（例えば生理食塩水）、または滅菌非水性溶液または懸濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯法を使用して、皮膚の浸透を増すことができ、抗原吸収を高めることができる。 The compositions of the present invention can be administered in a variety of ways known in the art, but are usually administered by injection, infusion, inhalation, oral administration, or other suitable physical method. Alternatively, the composition can be administered intramuscularly, intravenously, or subcutaneously. Ingredients of the composition to be administered include sterile aqueous solutions (eg, saline) or sterile non-aqueous solutions or suspensions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Carriers or hermetic bandages can be used to increase skin penetration and increase antigen absorption.

本発明のその他の実施形態は、当技術分野で知られている事項、下記の本発明の図面および記述、特許請求の範囲に照らし、当業者に明らかにされよう。 Other embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art in light of what is known in the art, the following drawings and description of the invention, and the claims.

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

他に特に示さない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明を実施しまたは試験するにあたり、本明細書に記述するものと同様のまたは均等な任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料について以下に記述する。 Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice or testing of the present invention, the preferred methods and materials are now described.

１．定義
好酸球成分によるアレルギー性疾患：本明細書で使用される好酸球成分によるアレルギー性疾患という用語は、循環血液または体組織および体液中の好酸球の数が増加する、疾患の状態または条件を指す。好酸球が増加して、疾患状態に直接または間接的な影響が生じる疾患には、喘息、枯草熱、鼻炎、鼻ポリープ、特発性好酸球増多症、アトピー性皮膚炎、皮膚病および発疹、レフラー症候群などの肺疾患、慢性好酸球肺炎、チャウグ−シトラウス症候群、および原因不明の過好酸性症候群が含まれる。当業者なら、好酸球成分によるアレルギー性疾患を理解することができる。 1. Definitions Allergic disease due to eosinophil component: As used herein, the term allergic disease due to eosinophil component is a disease state in which the number of eosinophils in the circulating blood or body tissue and fluid increases. Or refers to a condition. Diseases with increased eosinophils that have a direct or indirect effect on the disease state include asthma, hay fever, rhinitis, nasal polyps, idiopathic eosinophilia, atopic dermatitis, skin diseases and These include rashes, pulmonary diseases such as Leffler's syndrome, chronic eosinophil pneumonia, Chaug-Citrus syndrome, and hyperacidic syndrome of unknown cause. One skilled in the art can understand allergic diseases caused by eosinophil components.

アミノ酸リンカー：本明細書で使用されるように、本明細書内の「アミノ酸リンカー」は、単なる「リンカー」という用語も同様に、抗原または抗原決定基を第２の付着部位に会合させ、またはより好ましくは第２の付着部位をすでに含みまたは含有し、典型的な場合は、必ずしも必要ではないが、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含みまたは含有する。しかし本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態であったとしても、そのようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示唆するものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、天然に生ずるアミノ酸または当技術分野で知られている非天然のアミノ酸、全Ｌ型または全Ｄ型、あるいはこれらの混合物からなることが好ましい。しかし、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明に包含される。そのような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしアミノ酸リンカーの他、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルキル、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、またはヘテロアリール部分を含んで任意のアミノ酸に欠けるリンカーも、本発明の範囲内に包含すべきである。抗原または抗原決定基あるいは任意選択の第２の付着部位とアミノ酸リンカーとの会合は、少なくとも１つの共有結合によることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によることがより好ましい。 Amino acid linker: As used herein, an “amino acid linker” as used herein is simply the term “linker”, associating an antigen or antigenic determinant with a second attachment site , or More preferably, it already contains or contains a second attachment site, and in the typical case, but not necessarily, contains or contains as one amino acid residue, preferably as a cysteine residue. However, as used herein, the term “amino acid linker” suggests that even if an amino acid linker consisting of amino acid residues is a preferred embodiment of the present invention, such an amino acid linker consists only of amino acid residues. Not what you want. The amino acid residues of the amino acid linker are preferably composed of naturally occurring amino acids or non-natural amino acids known in the art, all L or D forms, or mixtures thereof. However, amino acid linkers comprising molecules with sulfhydryl groups or cysteine residues are also encompassed by the present invention. Such molecules preferably contain a C1-C6 alkyl, cycloalkyl (C5, C6), aryl, or heteroaryl moiety. However, in addition to amino acid linkers, linkers lacking any amino acids, preferably including C1-C6 alkyl, cycloalkyl (C5, C6), aryl, or heteroaryl moieties, should also be included within the scope of the present invention. The association between the antigen or antigenic determinant or the optional second attachment site and the amino acid linker is preferably by at least one covalent bond, more preferably by at least one peptide bond.

動物：本明細書で使用する「動物」という用語は、例えばヒト、ヒツジ、オオシカ、シカ、ミンク、哺乳類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ、ニワトリ、爬虫類、魚、昆虫、およびクモを含むものとする。 Animal: As used herein, the term “animal” includes, for example, human, sheep, elk, deer, mink, mammal, monkey, horse, cow, pig, goat, dog, cat, rat, mouse, bird, chicken, Includes reptiles, fish, insects, and spiders.

抗体：本明細書で使用する「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することが可能な分子を指す。この用語は、抗体全体と、その抗原結合断片であって、１本鎖抗体を含めたものを含むものとする。抗体は、ヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶ_ＬまたはＶ_Ｈドメインを含んだ断片を含むがこれらに限定するものではないことが、最も好ましい。抗体は、トリおよび哺乳類を含めた任意の動物由来のものから形成することができる。抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに関して遺伝子導入された動物から単離した抗体、および内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含み、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるものである。 Antibody: As used herein, the term “antibody” refers to a molecule capable of binding to an epitope or antigenic determinant. This term is intended to include whole antibodies and antigen-binding fragments thereof, including single chain antibodies. The antibody is a human antigen binding antibody fragment, Fab, Fab ′ and F (ab ′) 2, Fd, single chain Fvs (scFv), single chain antibody, disulfide bond Fvs (sdFv), and _VL or V Most preferably, including but not limited to fragments containing the _H domain. Antibodies can be formed from any animal origin including birds and mammals. The antibody is preferably a human, mouse, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken. As used herein, a “human” antibody includes an antibody having the amino acid sequence of a human immunoglobulin and is isolated from a human immunoglobulin library or from an animal that has been transgenic for one or more human immunoglobulins. Including antibodies and antibodies that do not express endogenous immunoglobulins, such as those described in US Pat. No. 5,939,598 by Kucherlapati et al.

抗原：本明細書で使用する「抗原」という用語は、抗体に、あるいはＭＨＣ分子によって提示される場合にはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合可能な分子を指す。本明細書で使用する「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原はさらに、免疫系によって認識することができ、かつ／または体液性免疫応答及び／又は細胞免疫応答を引き起こして、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらすことができる。しかしこれは、少なくともある特定の場合には、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有しまたは結合し、アジュバントに与えられることを必要とする。抗原は、１つまたは複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上述の特定の反応は、抗原が、典型的な場合には非常に選択的な手法で、好ましくはその対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって引き起こされる可能性のある数多くのその他の抗体またはＴＣＲとは反応しないことを示すものとする。本明細書で使用する抗体は、いくつかの個別の抗原の混合物でもよい。 Antigen: As used herein, the term “antigen” refers to a molecule capable of binding to an antibody or, when presented by an MHC molecule, to a T cell receptor (TCR). As used herein, the term “antigen” also encompasses T cell epitopes. The antigen can further be recognized by the immune system and / or cause a humoral immune response and / or a cellular immune response, resulting in activation of B and / or T lymphocytes. However, this requires that, at least in certain cases, the antigen contains or binds to a Th cell epitope and is given to an adjuvant. An antigen can have one or more epitopes (B and T epitopes). The specific reactions described above are those in which an antigen typically reacts in a very selective manner, preferably with its corresponding antibody or TCR, and numerous other antigens that can be triggered by other antigens. It shall indicate that it does not react with the antibody or TCR. As used herein, an antibody may be a mixture of several individual antigens.

抗原決定基：本明細書で使用する「抗原決定基」という用語は、ＢまたはＴリンパ球によって特異的に認識される抗原のタンパク質を指すものとする。抗原決定基に応答するＢリンパ球は抗体を産生し、一方Ｔリンパ球は、細胞及び／又は体液性免疫の媒介に極めて重要なエフェクター機能の増大および確立によって、抗原決定基に応答する。 Antigenic determinant: As used herein, the term “antigenic determinant” is intended to refer to a protein of an antigen that is specifically recognized by B or T lymphocytes. B lymphocytes that respond to antigenic determinants produce antibodies, while T lymphocytes respond to antigenic determinants by increasing and establishing effector functions critical to mediating cellular and / or humoral immunity.

会合：本明細書で使用する「会合」という用語は、第１および第２の付着部位に適用されるように、少なくとも１つの非ペプチド結合によることが好ましい第１および第２の付着部位の結合を指す。会合の性質は、共有結合、イオン結合、疎水結合、極性結合、またはこれらの任意の組合せでよく、この会合の性質は共有結合であることが好ましい。 Meeting: The term "association" as used herein, as applied to the first and second attachment sites, binding of at least one of the first and second preferred attachment site be by non-peptide bonds Point to. The nature of the association may be a covalent bond, an ionic bond, a hydrophobic bond, a polar bond, or any combination thereof, and the association property is preferably a covalent bond.

第１の付着部位：本明細書で使用する「第１の付着部位」という文言は、抗原または抗原決定基上に位置する第２の付着部位が会合し得る、非天然または天然由来の要素を指す。第１の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。第１の付着部位は、典型的な場合かつ好ましくは、好ましくはウイルス様粒子などのコア粒子の表面に位置する。複数の第１の付着部位は、コアおよびウイルス様粒子の表面にそれぞれ存在し、典型的な場合は繰返し構成体内にある。 First attachment site : As used herein, the term “first attachment site ” refers to a non-naturally occurring or naturally-derived element with which a second attachment site located on an antigen or antigenic determinant can associate. Point to. The first attachment site is a protein, polypeptide, amino acid, peptide, sugar, polynucleotide, natural or synthetic polymer, secondary metabolite or compound (biotin, fluorescein, retinol, digoxigenin, metal ion, phenylmethylsulfonyl fluoride) ), Or combinations thereof, or chemically reactive groups thereof. The first attachment site is typically and preferably located on the surface of a core particle, preferably a virus-like particle. A plurality of first attachment sites are present on the surface of the core and virus-like particles, respectively, and are typically in a repetitive configuration.

第２の付着部位：本明細書で使用する「第２の付着部位」という文言は、コア粒子およびウイルス様粒子の表面にそれぞれ位置付けられた第１の付着部位が会合し得る、抗原または抗原決定基に会合する要素を指す。抗原または抗原決定基の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成のポリマー、二次代謝産物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはこれらの組合せ、あるいはその化学反応基でよい。少なくとも１つの第２の付着部位は、抗原または抗原決定基上に存在する。したがって「少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基」という用語は、抗原または抗原構造であって、少なくとも抗原または抗原決定基と第２の付着部位を含むものを指す。しかし特に、非天然由来の第２の付着部位、すなわち抗原または抗原決定基内に自然に生じないものに関しては、これらの抗原または抗原構造が、「アミノ酸リンカー」を含む。 Second attachment site : As used herein, the term “second attachment site ” refers to an antigen or antigenic determination where a first attachment site located on the surface of a core particle and a virus-like particle, respectively, can associate. Refers to the element that meets the group. The second attachment site of the antigen or antigenic determinant is a protein, polypeptide, peptide, sugar, polynucleotide, natural or synthetic polymer, secondary metabolite or compound (biotin, fluorescein, retinol, digoxigenin, metal ion, phenyl Methylsulfonyl fluoride), or combinations thereof, or chemically reactive groups thereof. At least one second attachment site is present on the antigen or antigenic determinant. Thus, the term “antigen or antigenic determinant having at least one second attachment site ” refers to an antigen or antigenic structure comprising at least an antigen or antigenic determinant and a second attachment site . However, particularly for non-naturally occurring second attachment sites , ie those that do not naturally occur within an antigen or antigenic determinant, these antigens or antigenic structures comprise an “amino acid linker”.

結合：本明細書で使用する「結合」という用語は、例えば化学的な連結による共有結合、または例えばイオン的相互作用や疎水的相互作用、水素結合などの非供給結合などの、結合または結着を指す。共有結合は、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などでよい。「結合」という用語は、「連結」や「融合」、「結着」などの用語よりも広く、これらを含むものである。 Binding: As used herein, the term “bond” refers to a bond or binding, such as a covalent bond, eg, a chemical linkage, or a non-feed bond, eg, an ionic or hydrophobic interaction, a hydrogen bond, etc. Point to. The covalent bond may be, for example, an ester, ether, phosphate ester, amide, peptide, imide, carbon-sulfur bond, carbon-phosphorus bond, and the like. The term “bond” is broader than the terms “link”, “fusion”, “bond”, and the like, and includes these.

コートタンパク質：本明細書で使用する「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのカプシド組織体内に組み込むことが可能なバクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかし、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を指す場合は、「ＣＰ」という用語を使用する。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特定の遺伝子産物を「Ｑβ ＣＰ」と呼び、一方バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は、「Ｑβ ＣＰ」ならびにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのカプシドは、主にＱβ ＣＰからなり、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。同様にＶＬＰＱβコートタンパク質は、主にＱβ ＣＰを含有し、さらに少量のＡｌタンパク質を含有する。 Coat protein: As used herein, the term “coat protein” refers to a bacteriophage or RNA phage protein that can be incorporated into the capsid tissue of a bacteriophage or RNA phage. However, the term “CP” is used when referring to a specific gene product of an RNA phage coat protein gene. For example, the specific gene product of the coat protein gene of RNA phage Qβ is referred to as “Qβ CP”, while the “coat protein” of bacteriophage Qβ includes “Qβ CP” as well as the A1 protein. The capsid of bacteriophage Qβ consists mainly of Qβ CP and contains a small amount of Al protein. Similarly, VLP Qβ coat protein contains mainly Qβ CP and also contains a small amount of Al protein.

コア粒子：本明細書で使用する「コア粒子」という用語は、固有の反復性組織を有する硬質構造を指す。本明細書で使用するコア粒子は、合成プロセスの生成物または生物学的プロセスの産物でよい。 Core particle: As used herein, the term “core particle” refers to a hard structure having an inherent repetitive texture. As used herein, the core particle may be the product of a synthetic process or the product of a biological process.

連結：本明細書で使用する「連結」という用語は、共有結合または強力な非共有相互作用による結着を指し、典型的な場合かつ好ましくは、共有結合による結着を指す。本発明では、生物学的に活性な物質を連結させるために当業者によって通常使用される任意の方法を、使用することができる。 Linkage: As used herein, the term “linkage” refers to binding by covalent bonds or strong non-covalent interactions, and typically and preferably refers to binding by covalent bonds. In the present invention, any method commonly used by those skilled in the art to link biologically active substances can be used.

有効な量：本明細書で使用する「有効な量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。組成物の有効な量は、この選択された結果を実現する量であると考えられ、そのような量は、当業者により日常的な業務として決定することができる。例えば、免疫系障害を治療するのに有効な量とは、免疫系の活性化を引き起こし、それよって、抗原に曝されたときに抗原特異的免疫応答を誘発させるのに必要な量である。この用語は、「十分な量」とも同義である。 Effective amount: As used herein, the term “effective amount” refers to an amount necessary or sufficient to achieve a desired biological effect. An effective amount of the composition is considered to be an amount that achieves this selected result, and such amount can be determined by one of ordinary skill in the art as a routine task. For example, an amount effective to treat an immune system disorder is that amount necessary to cause activation of the immune system and thus elicit an antigen-specific immune response when exposed to an antigen. The term is also synonymous with “sufficient amount”.

任意の特定の適用例での有効な量は、治療する疾患や状態、投与される特定の組成物、被験者のサイズ、及び／又は疾患または状態の重症度などのファクターに応じて様々に変えることができる。当業者なら、必要以上の実験を行うことなく、本発明の特定の組成物の有効な量を経験的に決定することができる。 The effective amount for any particular application will vary depending on factors such as the disease or condition being treated, the particular composition being administered, the size of the subject, and / or the severity of the disease or condition. Can do. One of ordinary skill in the art can empirically determine the effective amount of a particular composition of the present invention without undue experimentation.

エオタキシンタンパク質：本明細書で使用する「エオタキシンタンパク質」という用語は、エオタキシン遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。エオタキシンタンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ引き起こすことができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって引き起こすことができ、明らかに本発明の範囲内に包含されるべきである。エオタキシンが差次的にグリコシル化した形、ならびにタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によってさらに変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「エオタキシンタンパク質」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないエオタキシンタンパク質変種も包含すべきである。 Eotaxin protein: As used herein, the term “eotaxin protein” refers to a protein encoded by the eotaxin gene. Various variants of the eotaxin protein can be caused by nucleotide point mutations and polymorphisms, respectively, as well as by insertion, deletion and / or substitution of one or more nucleotides, clearly the present invention Should be included within the scope of Further changes can be caused by post-translational modifications, such as the differentially glycosylated form of eotaxin, as well as the form cleaved by proteolysis. As used herein, the term “eotaxin protein” should also encompass eotaxin protein variants, including but not limited to the preferred examples described above.

エオタキシンペプチド：本明細書で使用する「エオタキシンペプチド」という用語は、エオタキシンタンパク質の一部であり、もとのエオタキシンタンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちエオタキシンタンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するエオタキシンタンパク質の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するエオタキシンの一部である、任意のペプチドと広く定義される。 Eotaxin peptide: As used herein, the term “eotaxin peptide” is part of an eotaxin protein and is at least 2, preferably at least 3, more preferably at least 4, more preferably the original eotaxin protein. Contains at least 5, more preferably at least 6 consecutive amino acids, i.e. part of the eotaxin protein, most preferably a folded portion of the eotaxin protein containing the B cell epitope, even more preferably medium Broadly defined as any peptide that is part of an eotaxin containing a sum epitope.

「エオタキシンペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記エオタキシンペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、エオタキシンタンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。エオタキシペプチドは、例えばエオタキシンペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはエオタキシンペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、エオタキシンペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。エオタキシンペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をエオタキシンペプチドに付加することができる。あるいはエオタキシンペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するエオタキシンペプチドという用語は、好ましくはエオタキシンの３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなエオタキシンペプチドは、必ずしもエオタキシンの連続アミノ酸配列から得るものではなく、エオタキシンからの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するエオタキシンタンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。 The term “eotaxin peptide” should more preferably include any portion of the eotaxin peptide, wherein the portion lacks one or more amino acids at the N and / or C terminus of the eotaxin protein. Is preferably obtained by Eotaxipeptides can be used as eotaxin peptides alone or others by recombinant expression in eukaryotic or prokaryotic expression systems, for example, to facilitate folding, expression, or lysis of eotaxin peptides, or to facilitate purification of eotaxin peptides. Can be obtained as a fusion with the amino acid or protein. Preferably at least one second attachment site can be added to the eotaxin peptide to allow linkage of the eotaxin peptide to the VLP or capsid subunit protein. Alternatively, eotaxin peptides can be synthesized using methods known in the art. As used herein, the term eotaxin peptide should preferably also encompass peptides that simulate the three-dimensional surface structure of eotaxin. Such eotaxin peptides are not necessarily derived from the contiguous amino acid sequence of eotaxin and can be formed by discontinuous amino acid residues from eotaxin. Such peptides may contain amino acids that are not present in the corresponding eotaxin protein.

エピトープ：本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおいて、抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの連続または不連続な部分を指す。エピトープは、抗体によって、またはＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞レセプターを介してＴ細胞によって認識される。本明細書で使用する「免疫原性エピトープ」は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定されるように、動物の抗体応答を引き出しまたはＴ細胞応答を誘発させるポリペプチドの一部と定義される（例えばＧｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）参照）。本明細書で使用する「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定されるように、抗体がその抗原を免疫特異的に結合させることができるタンパク質の一部と定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を除外するものであるが、必ずしも他の抗原との交差反応性を除外するものではない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはＴ細胞エピトープでもよく、その場合、ＭＨＣ分子の場合にはＴ細胞に免疫特異的に結合することができる。 Epitope: As used herein, the term “epitope” refers to a continuous or discontinuous portion of a polypeptide having antigenic or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, most preferably a human. Epitopes are recognized by antibodies or by T cells via T cell receptors in the case of MHC molecules. As used herein, an “immunogenic epitope” is a portion of a polypeptide that elicits an antibody response or elicits a T cell response in an animal, as determined by any method known in the art. (See, eg, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)). As used herein, the term “antigenic epitope” refers to a portion of a protein that allows an antibody to bind its antigen immunospecifically, as determined by any method well known in the art. Defined. Immunospecific binding excludes non-specific binding but does not necessarily exclude cross-reactivity with other antigens. An antigenic epitope need not necessarily be immunogenic. The antigenic epitope can be a T cell epitope, in which case it can bind immunospecifically to a T cell in the case of an MHC molecule.

エピトープは、空間構造内に３個のアミノ酸を含むことができるが、これはこのエピトープに独特なものである。一般にエピトープは、少なくとも約５個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には少なくとも約８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。エピトープが有機分子である場合、ニトロフェニル程度に小さくなる。 An epitope can contain three amino acids in the spatial structure, which is unique to this epitope. In general, an epitope consists of at least about 5 such amino acids, and more usually consists of at least about 8-10 such amino acids. If the epitope is an organic molecule, it is as small as nitrophenyl.

融合：本明細書で使用する「融合」という用語は、コードヌクレオチド配列のフレーム内の組合せによる、１つのポリペプチド鎖での異なる由来のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」という用語は、末端の一方への付加の他、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内への異なる由来の配列の挿入を明らかに包含する。 Fusion: As used herein, the term “fusion” refers to a combination of different derived amino acid sequences in one polypeptide chain by an in-frame combination of coding nucleotide sequences. The term “fusion” clearly encompasses addition to one of the ends as well as internal fusion, ie, insertion of sequences of different origins within the polypeptide chain.

免疫応答：本明細書で使用する「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞の活性化または増殖に繋がる体液免疫応答及び／又は細胞免疫応答を指す。しかし、ある場合には、この免疫応答の強度が低くなる可能性があり、本発明による少なくとも１つの物質を使用した場合にしか検出することができなくなる。「免疫原性」は、生きている生物の免疫系を刺激するのに使用される薬剤を指し、したがって免疫系の１つまたは複数の機能が増大し、免疫原性薬剤へと向かう。「免疫原性ポリペプチド」は、アジュバントの存在下でまたは存在しない状態で、単独であってもまたは担体に結合した状態であっても細胞及び／又は体液免疫応答を引き出すポリペプチドである。抗原提示細胞は、活性化できることが好ましい。 Immune response: As used herein, the term “immune response” refers to a humoral and / or cellular immune response that leads to activation or proliferation of B and / or T lymphocytes and / or antigen presenting cells. However, in some cases, the intensity of this immune response can be low and can only be detected using at least one substance according to the invention. “Immunogenic” refers to an agent used to stimulate the immune system of a living organism, thus increasing one or more functions of the immune system towards the immunogenic agent. An “immunogenic polypeptide” is a polypeptide that elicits a cellular and / or humoral immune response in the presence or absence of an adjuvant, whether alone or bound to a carrier. The antigen presenting cell is preferably capable of being activated.

免疫応答を「高める」物質とは、その物質を添加せずに測定した同じ免疫応答と比べた場合、その物質を添加することによって多少なりとも大きくなりまたは強くなりまたは偏向した免疫応答が観察される物質を指す。例えば細胞障害性Ｔ細胞の溶解活性は、例えば免疫化中にその物質を使用してまたは使用せずに得られたサンプルで、^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して測定することができる。この物質がない場合のＣＴＬ溶解活性に比べてＣＴＬ溶解活性が高められた物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分な量と言える。好ましい実施形態では、免疫応答が少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上、高められる。分泌されたサイトカインの量またはタイプは変えてもよい。あるいは、誘発された抗体またはそのサブクラスの量を変えることができる。 A substance that “enhances” an immune response is observed to have an immune response that is somewhat greater, stronger, or biased by the addition of that substance when compared to the same immune response measured without the addition of that substance. Refers to a substance. For example, the lytic activity of cytotoxic T cells can be measured using a ⁵¹ Cr release assay, for example, on a sample obtained with or without the substance during immunization. It can be said that the amount of the substance with enhanced CTL lytic activity compared to the CTL lytic activity in the absence of this substance is sufficient to enhance the animal's immune response to the antigen. In preferred embodiments, the immune response is enhanced by at least about 2-fold, more preferably about 3-fold or more. The amount or type of cytokine secreted may vary. Alternatively, the amount of antibody or subclass induced can be varied.

免疫化：本明細書で使用する、「免疫化する」または「免疫化」という用語あるいはこれに関連する用語は、標的抗原またはエピトープに対して実質的な免疫応答を引き起こす能力を与えることを指す（抗体及び／又は細胞免疫性であってエフェクターＣＴＬなど）。これらの用語は、完全な免疫性をもたらすことを必要とせず、むしろベースラインよりも実質的に大きい免疫応答を生成することを指す。例えば哺乳類は、本発明の方法を適用した後に標的抗原に対する細胞及び／又は体液免疫応答が生じた場合、標的抗原に対して免疫化されたと考えられる。 Immunization: As used herein, the term “immunize” or “immunization” or related terms refers to providing the ability to elicit a substantial immune response against a target antigen or epitope. (Antibodies and / or cell immunity, such as effector CTL). These terms do not require producing full immunity, but rather generate an immune response that is substantially greater than baseline. For example, a mammal is considered immunized against a target antigen if a cellular and / or humoral immune response against the target antigen occurs after applying the method of the invention.

天然由来：本明細書で使用する「天然由来」という用語は、その全体または一部が合成ではなく、自然に存在しまたは産生されることを意味する。 Natural origin: As used herein, the term “natural origin” means that the whole or a part thereof is not synthetic but exists or is produced in nature.

非天然：本明細書で使用されるこの用語は、一般に、天然からのものではないことを意味し、より具体的にはこの用語は、人の手によるものであることを意味する。 Non-natural: As used herein, this term generally means not from nature, and more specifically, this term means by the hand of man.

非天然由来：本明細書で使用する「非天然由来」という用語は、一般に、合成したものまたは天然からのものではないことを意味し、より具体的には、この用語は人の手によるものであることを意味する。 Non-naturally occurring: As used herein, the term “non-naturally occurring” generally means synthesized or not from nature, and more specifically, the term is human. It means that.

規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ：本明細書で使用する「規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイ」いう用語は、一般に、抗原または抗原決定基の反復パターンを指し、典型的な場合かつ好ましくは、コア粒子およびウイルス様粒子に対してそれぞれ抗原または抗原決定基が均一な空間配置であることを特徴とする。本発明の一実施形態で、反復パターンは幾何学的パターンでよい。適切な規則的で反復性の抗原または抗原決定基アレイの典型的かつ好ましい例は、厳密に繰り返される準結晶の配列の抗原または抗原決定基を所有するものであり、好ましくは１〜３０ナノメートルの間隔があり、好ましくは５〜１５ナノメートルの間隔があるものである。 Regular and repetitive antigen or antigenic determinant array: As used herein, the term “regular and repetitive antigen or antigenic determinant array” generally refers to a repeating pattern of antigens or antigenic determinants, Typically and preferably, the antigen or antigenic determinant is characterized by a uniform spatial arrangement with respect to the core particle and virus-like particle, respectively. In one embodiment of the present invention, the repeating pattern may be a geometric pattern. A typical and preferred example of a suitable regular and repetitive antigen or antigenic determinant array is one that possesses a strictly repeating quasicrystalline sequence of antigens or antigenic determinants, preferably 1-30 nanometers And preferably have a spacing of 5 to 15 nanometers.

線毛（ｐｉｌｉ）：本明細書で使用する「線毛」（単数形は「ｐｉｌｕｓ」）は、規則的で反復性のパターンに組織化されたタンパク質モノマー（例えばピリンモノマー）からなる細菌細胞の細胞外構造を指す。さらに線毛は、細菌細胞と宿主細胞表面レセプターとの結着や、細胞間での遺伝子交換、および細胞−細胞認識などのプロセスに関与する構造である。線毛の例には、１型線毛、Ｐ線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ線毛、および９８７Ｐ線毛が含まれる。線毛の追加の例を、以下に示す。 Pili: As used herein, “pili” (“pilus” in the singular) is a bacterial cell composed of protein monomers (eg, pilin monomers) organized in a regular, repetitive pattern. Refers to the extracellular structure. Furthermore, pili are structures that are involved in processes such as binding between bacterial cells and host cell surface receptors, gene exchange between cells, and cell-cell recognition. Examples of pili include Type 1 pili, P pili, F1C pili, S pili, and 987P pili. Additional examples of pili are shown below.

線毛様構造：本明細書で使用する「線毛様構造」という文言は、線毛の構造およびタンパク質モノマーからなる構造と同様の特徴を有する構造を指す。「線毛様構造」の一例は、天然の線毛と同一の規則的で反復性のアレイを形成しない修飾ピリンタンパク質を発現する細菌細胞によって形成された構造である。 Piliary structure: As used herein, the term “piliary structure” refers to a structure having characteristics similar to those of pili and structures composed of protein monomers. An example of a “pilus-like structure” is a structure formed by a bacterial cell that expresses a modified pilin protein that does not form the same regular and repeatable array as natural pili.

ポリペプチド：本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）によって線形に結合したモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがってペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化なども指すものとする。組換えまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。化学合成を含めた任意の手法で生成してもよい。 Polypeptide: As used herein, the term “polypeptide” refers to a molecule composed of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also called peptide bonds). This indicates a molecular chain of amino acids and does not refer to a specific length of the product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides, and proteins are included in the definition of polypeptide. The term is also intended to refer to post-expression modifications of the polypeptide, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation and the like. A recombinant or derived polypeptide need not necessarily be translated from a designated nucleic acid sequence. You may produce | generate by arbitrary methods including chemical synthesis.

ＩＬ−５タンパク質：本明細書で使用する「ＩＬ−５タンパク質」という用語は、ＩＬ−５遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。ＩＬ−５タンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ誘発させることができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって誘発させることができ、本発明の範囲内に明らかに含まれるべきである。ＩＬ−５が差次的にグリコシル化した形、ならびにＩＬ−５がタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によって別の変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「ＩＬ−５」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないＩＬ−５タンパク質変種も包含すべきである。 IL-5 protein: As used herein, the term “IL-5 protein” refers to a protein encoded by the IL-5 gene. Various variants of IL-5 protein can be induced by nucleotide point mutations and polymorphisms, respectively, as well as by insertion, deletion, and / or substitution of one or more nucleotides, It should be clearly included within the scope of the present invention. Post-translational modifications can cause other changes, such as the differentially glycosylated form of IL-5, as well as the form in which IL-5 is proteolytically cleaved. As used herein, the term “IL-5” should also encompass IL-5 protein variants, including but not limited to the preferred examples described above.

ＩＬ−５ペプチド：本明細書で使用する「ＩＬ−５ペプチド」という用語は、ＩＬ−５タンパク質の一部であり、もとのＩＬ−５タンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちＩＬ−５タンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するＩＬ−５の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するＩＬ−５の一部である、任意のペプチドと広く定義される。 IL-5 peptide: As used herein, the term “IL-5 peptide” is part of an IL-5 protein and is at least 2, preferably at least 3, of the original IL-5 protein. IL-5 containing preferably at least 4, more preferably at least 5, more preferably at least 6 consecutive amino acids, ie part of the IL-5 protein, most preferably containing a B cell epitope Is broadly defined as any peptide that is a part of IL-5 that contains a neutralizing epitope.

「ＩＬ−５ペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記ＩＬ５ペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、ＩＬ−５タンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。ＩＬ−５ペプチドは、例えばＩＬ−５ペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはＩＬ−５ペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、ＩＬ−５ペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。ＩＬ−５ペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をＩＬ−５ペプチドに付加することができる。あるいはＩＬ−５ペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するＩＬ−５ペプチドという用語は、好ましくはＩＬ−５の３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなＩＬ５ペプチドは、必ずしもＩＬ５の連続アミノ酸配列から得る必要はなく、ＩＬ５からの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するＩＬ５タンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。 The term “IL-5 peptide” should more preferably include any part of said IL5 peptide, said part comprising one or more amino acids at the N and / or C termini of the IL-5 protein. It is preferably obtained by deletion. IL-5 peptides can be produced by recombinant expression in eukaryotic or prokaryotic expression systems, for example, to promote IL-5 peptide folding, expression, or lysis, or to facilitate purification of IL-5 peptides. It can be obtained as a -5 peptide alone or as a fusion with other amino acids or proteins. Preferably at least one second attachment site can be added to the IL-5 peptide to allow linking of the IL-5 peptide to the VLP or capsid subunit protein. Alternatively, IL-5 peptides can be synthesized using methods known in the art. As used herein, the term IL-5 peptide should also encompass peptides that preferably simulate the three-dimensional surface structure of IL-5. Such IL5 peptides need not necessarily be derived from the contiguous amino acid sequence of IL5, and can be formed by discontinuous amino acid residues from IL5. Such peptides may contain amino acids that are not present in the corresponding IL5 protein.

ＩＬ−１３タンパク質：本明細書で使用する「ＩＬ−１３タンパク質」という用語は、ＩＬ−１３遺伝子によってコードされたタンパク質を指す。ＩＬ−１３タンパク質の種々の変種は、ヌクレオチド点変異および多形性によってそれぞれ誘発させることができ、同様に１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換によって誘発させることができ、本発明の範囲内に明らかに含まれるべきである。ＩＬ−１３が差次的にグリコシル化した形、ならびにＩＬ−１３がタンパク質分解によって切断された形など、翻訳後修飾によって別の変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する「ＩＬ−１３」という用語は、上述の好ましい例も含むがこれらに限定されないＩＬ−１３タンパク質変種も包含すべきである。 IL-13 protein: As used herein, the term “IL-13 protein” refers to a protein encoded by the IL-13 gene. Various variants of IL-13 protein can be induced by nucleotide point mutations and polymorphisms, respectively, as well as by insertion, deletion, and / or substitution of one or more nucleotides, It should be clearly included within the scope of the present invention. Other changes can be caused by post-translational modifications, such as the differentially glycosylated form of IL-13, as well as the form of IL-13 cleaved by proteolysis. The term “IL-13” as used herein should also encompass IL-13 protein variants, including but not limited to the preferred examples described above.

ＩＬ−１３ペプチド：本明細書で使用する「ＩＬ−１３ペプチド」という用語は、ＩＬ−１３タンパク質の一部であり、もとのＩＬ−１３タンパク質の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも６個の連続したアミノ酸を含有し、すなわちＩＬ−１３タンパク質の一部であり、最も好ましくはＢ細胞エピトープを含有するＩＬ−１３の折畳み部分であり、さらにより好ましくは中和エピトープを含有するＩＬ−１３の一部である、任意のペプチドと広く定義される。 IL-13 peptide: As used herein, the term “IL-13 peptide” is part of an IL-13 protein and is at least 2, preferably at least 3, of the original IL-13 protein. Preferably IL-13 containing at least 4, more preferably at least 5, more preferably at least 6 consecutive amino acids, ie part of the IL-13 protein, most preferably containing a B cell epitope. Is broadly defined as any peptide that is a part of IL-13 that contains a neutralizing epitope.

「ＩＬ−１３ペプチド」という用語は、さらに好ましくは、前記ＩＬ−１３ペプチドの任意の一部分を包含すべきであり、前記一部分は、ＩＬ−１３タンパク質のＮおよび／Ｃ末端で１つまたは複数のアミノ酸が欠失することによって得られることが好ましい。ＩＬ−１３ペプチドは、例えばＩＬ−１３ペプチドの折畳み、発現、または溶解を促進させるために、あるいはＩＬ−１３ペプチドの精製を促進させるために、真核または原核発現系における組換え発現によって、ＩＬ−１３ペプチド単独としてあるいは他のアミノ酸またはタンパク質との融合として、得ることができる。ＩＬ−１３ペプチドとＶＬＰまたはカプシドのサブユニットタンパク質との連結を可能にするために、好ましくは少なくとも１つの第２の付着部位をＩＬ−１３ペプチドに付加することができる。あるいはＩＬ−１３ペプチドを、当技術分野で知られている方法を使用して合成することができる。本明細書で使用するＩＬ−１３ペプチドという用語は、好ましくはＩＬ−１３の３次元表面構造をシミュレートするペプチドも包含すべきである。そのようなＩＬ−１３ペプチドは、必ずしもＩＬ−１３の連続アミノ酸配列から得る必要はなく、ＩＬ−１３からの不連続なアミノ酸残基によって形成することができる。そのようなペプチドは、対応するＩＬ−１３タンパク質中に存在しないアミノ酸を含有してもよい。 The term “IL-13 peptide” should more preferably include any part of said IL-13 peptide, said part comprising one or more at the N and / or C termini of the IL-13 protein. It is preferably obtained by deleting amino acids. IL-13 peptides can be produced by recombinant expression in eukaryotic or prokaryotic expression systems, for example, to promote IL-13 peptide folding, expression, or lysis, or to facilitate purification of IL-13 peptides. It can be obtained as a -13 peptide alone or as a fusion with other amino acids or proteins. Preferably at least one second attachment site can be added to the IL-13 peptide to allow linking of the IL-13 peptide to the VLP or capsid subunit protein. Alternatively, IL-13 peptides can be synthesized using methods known in the art. As used herein, the term IL-13 peptide should preferably also encompass peptides that simulate the three-dimensional surface structure of IL-13. Such IL-13 peptides do not necessarily have to be derived from the contiguous amino acid sequence of IL-13, and can be formed by discontinuous amino acid residues from IL-13. Such peptides may contain amino acids that are not present in the corresponding IL-13 protein.

残基：本明細書で使用する「残基」という用語は、ポリペプチドの主鎖または側鎖における特定のアミノ酸を意味するものとする。 Residue: As used herein, the term “residue” shall mean a specific amino acid in the main chain or side chain of a polypeptide.

自己抗原：本明細書で使用する「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質を指し、宿主のＤＮＡでコードされたタンパク質またはＲＮＡにより生成された生成物は、自己と定義される。さらに、２個またはいくつかの自己分子の組合せから得られ、あるいは自己分子の一部であるタンパク質と、上述の相同性の高い２個の自己分子（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質は、自己と見なしてもよい。 Autoantigen: As used herein, the term “self-antigen” refers to a protein encoded by the host DNA, and a product produced by a protein or RNA encoded by the host DNA is defined as self. The In addition, a protein that is obtained from a combination of two or several self-molecules or is part of a self-molecule and two self-molecules with high homology as described above (> 95%, preferably> 97%, more Proteins with preferably> 99%) may be considered self.

治療：本明細書で使用する「治療」、「治療する」、「治療した」、または「治療している」という用語は、予防及び／又は療法を指す。例えば感染症に対して使用する場合、この用語は、病原体で感染に対する被験者の耐性を増大させ、すなわち言い換えれば被験者が病原体に感染しまたは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療を指し、同様に、被験者が感染した後にその感染と闘うための治療、例えば感染を軽減しまたはなくし、あるいは悪化するのを防止する治療を指す。好酸球成分によるアレルギー性疾患に対して使用する場合、「治療」という用語は、とりわけかつ好ましくは、アレルギー性好酸球疾患に伴うアレルギー性炎症成分を阻害しまたは減少させる予防的治療または療法を指す。 Treatment: As used herein, the terms “treatment”, “treat”, “treated” or “treating” refer to prophylaxis and / or therapy. For example, when used against infectious diseases, the term is prophylaxis that increases a subject's resistance to infection with a pathogen, i.e., reduces the likelihood that the subject will be infected with the pathogen or show signs of disease resulting from the infection. Refers to treatment, as well as treatment to combat the infection of a subject after infection, such as treatment to reduce or eliminate or prevent the infection from worsening. When used against allergic diseases caused by eosinophil components, the term “treatment” particularly and preferably prevents or reduces allergic inflammatory components associated with allergic eosinophil diseases. Point to.

ワクチン：本明細書で使用する「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含有しかつ動物に投与可能な形態の製剤を指す。典型的な場合、ワクチンは、本発明の組成物を懸濁させまたは溶解させた、従来の生理食塩水または緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物を都合よく使用して、状態を予防し、改善し、またはその他の方法で治療することができる。宿主に導入することにより、ワクチンは、抗体及び／又はサイトカインの産生、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、およびまたはその他の細胞応答も含むがこれらに限定することのない免疫応答を引き起こすことができる。 Vaccine: As used herein, the term “vaccine” refers to a formulation that contains a composition of the present invention and that can be administered to an animal. Typically, the vaccine comprises a conventional saline or buffered aqueous medium in which the composition of the invention is suspended or dissolved. In this form, the compositions of the present invention can be conveniently used to prevent, ameliorate, or otherwise treat the condition. By introduction into the host, the vaccine also includes production of antibodies and / or cytokines and / or activation of cytotoxic T cells, antigen presenting cells, helper T cells, dendritic cells, and / or other cellular responses. Can elicit an immune response that is not limited to these.

任意選択で、本発明のワクチンはさらに、本発明の化合物に対して少量または多量の割合で存在可能なアジュバントを含む。本明細書で使用する「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、または本発明のワクチンと組み合わせたときに免疫応答をさらに高めるデポー剤を宿主内で生成することが可能な物質を指す。様々なアジュバントを使用することができる。例として、完全および不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、および変性ムラミールジペプチドが含まれる。 Optionally, the vaccine of the present invention further comprises an adjuvant that can be present in a small or large proportion relative to the compound of the present invention. As used herein, the term “adjuvant” is a non-specific stimulator of an immune response, or a substance capable of generating in a host a depot that further enhances the immune response when combined with a vaccine of the invention. Point to. A variety of adjuvants can be used. Examples include complete and incomplete Freund's adjuvant, aluminum hydroxide, and denatured muramyl dipeptide.

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する「ウイルス様粒子」は、ウイルス粒子に似ている構造を指す。さらに本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべてまたは一部、特にウイルスゲノムの複製的で感染性の成分が欠けているので、非複製的であり非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、そのゲノムとは異なる核酸を含有してよい。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウイルスカプシドなどのウイルスカプシドである。本明細書で同義として使用される「ウイルスカプシド」または「カプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。典型的な場合かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットは、固有の反復性組織を備えた構造を有するウイルスカプシドおよびカプシドにそれぞれ組織化され、前記構造は、典型的な場合、球状または管状である。例えばＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのカプシドは、対称な正二重面体の球形である。本明細書で使用する「カプシド様構造」という用語は、上記定義した意味でカプシドの形態に似ているが、典型的な対称組織体から逸脱すると共に十分な程度の規則性と反復性を維持する、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子組織体を指す。 Virus-like particle (VLP): As used herein, “virus-like particle” refers to a structure resembling a virus particle. Furthermore, the virus-like particles according to the invention are non-replicating and non-infectious because they lack all or part of the viral genome, in particular the replicative and infectious components of the viral genome. The virus-like particle according to the present invention may contain a nucleic acid different from its genome. An exemplary and preferred embodiment of a virus-like particle according to the invention is a virus capsid, such as the virus capsid of the corresponding virus, bacteriophage or RNA phage. The terms “viral capsid” or “capsid” as used interchangeably herein refer to a macromolecular assembly composed of viral protein subunits. Typically and preferably, viral protein subunits are organized into viral capsids and capsids, each having a structure with a unique repetitive tissue, said structures typically being spherical or tubular. For example, RNA phage or HBcAg capsids are symmetrical icosahedron spheres. As used herein, the term “capsid-like structure” is similar to the capsid morphology in the sense defined above, but deviates from a typical symmetrical structure and maintains a sufficient degree of regularity and repeatability. Refers to a macromolecular assembly composed of viral protein subunits.

バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用する「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、バクテリオファージの構造に似ており、非複製的で非感染性であり、さらに少なくともバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子に欠けているウイルス様粒子、典型的な場合はウイルスの宿主への結着またはウイルスの宿主への進入の原因となるタンパク質をコードする遺伝子にも欠けているウイルス様粒子を指す。しかしこの定義は、前述の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがってバクテリオファージの非複製的で非感染性のウイルス様粒子が得られる、バクテリオファージのウイルス様粒子も包含すべきである。 Bacteriophage virus-like particle: As used herein, the term “bacteriophage virus-like particle” is similar to the structure of a bacteriophage, is non-replicating and non-infectious, and at least a bacteriophage replication. Virus-like particles lacking a gene encoding the mechanism, typically virus-like particles that are also deficient in the gene encoding the protein responsible for the attachment or entry of the virus into the host. Point to. However, this definition should also include bacteriophage virus-like particles, in which the aforementioned genes are still present but inactive, thus yielding non-replicating, non-infectious virus-like particles of bacteriophages.

ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０個のサブユニットの自己組織化から形成され、任意選択で宿主ＲＮＡを含有するカプシド構造は、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。特定の例は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰがＱβ ＣＰサブユニットのみから組織化され（例えば抑制によってより長いＡ１タンパク質のすべての発現を除外するＴＡＡ停止コドンを含有したＱβ ＣＰ遺伝子の発現によって生成、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ３９：９〜１５（１９９６））、または追加としてカプシド組織体中にＡ１タンパク質サブユニットを含有してよい。 RNA phage coat protein VLP: The capsid structure formed from the self-assembly of 180 subunits of RNA phage coat protein, optionally containing host RNA, is referred to as "VLP of RNA phage coat protein". A specific example is the VLP of Qβ coat protein. In this particular case, the Vβ of the Qβ coat protein is organized only from the Qβ CP subunit (eg generated by expression of a Qβ CP gene containing a TAA stop codon that excludes all expression of the longer A1 protein by repression, Kozlovska, TM et al., Intervirology 39: 9-15 (1996)), or in addition, may contain A1 protein subunits in capsid tissues.

ウイルス粒子：本明細書で使用する「ウイルス粒子」という用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルスのタイプでは、タンパク質カプシドで取り囲まれたゲノムを含み、その他のタイプでは、追加の構造（例えば外被や末端部など）を含む。 Virus particle: As used herein, the term “virus particle” refers to the morphological form of a virus. Some virus types include genomes surrounded by protein capsids, and other types include additional structures (eg, envelopes and tails).

１つ：この開示で「１つ」という用語を使用する場合は、他に特に指示しない限り、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。 One: When the term “one” is used in this disclosure, it means “at least one” or “one or more” unless otherwise indicated.

当業者に明らかにされるように、本発明のある特定の実施形態は、クローニングやポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核細胞および真核細胞での組換えタンパク質の発現などの、組換え核酸技術の使用を含む。そのような方法は当業者に周知であり、出版された実験方法マニュアルに都合よく見出すことができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、ＪｏｈｎＨ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた基本的な実験室技法（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、第２版（１９９８））、および抗体をベースにした技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：実験室マニュアル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「タンパク質精製の手引き（ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、タンパク質精製の原理および実践（ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ）、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４））も、文献に十分に記載されており、そのすべてを参照により本明細書に援用する。 As will be apparent to those skilled in the art, certain embodiments of the present invention may include recombinant, such as cloning and polymerase chain reaction, DNA and RNA purification, and expression of recombinant proteins in prokaryotic and eukaryotic cells. Including the use of nucleic acid technology. Such methods are well known to those skilled in the art and can be conveniently found in published laboratory method manuals (eg, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual (A Laboratory Manual) 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); Inc. (1997)). Basic laboratory techniques using tissue culture cell lines (Celis, J. Ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition (1998)), and antibody-based techniques (Harlow, E And Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988); Deutscher, MP, Hand of Protein Purification. (Guide to Protein Purification) ", Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, RK, Ta The principles and practices of protein purification (Protein Purification Principles and Practice), 3rd edition, Springer-Verlag, New York (1994)) are also well described in the literature, all of which are incorporated herein by reference. To do.

２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示される発明は、動物の、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子と、（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含み、あるいはこれらからなり、前記抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、前記第２の付着部位は、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の付着部位からなる群から選択され、前記第２の付着部位は前記第１の付着部位と会合可能であり、前記抗原または抗原決定基と前記コア粒子とは、前記会合により相互に作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。より詳細には、本発明の組成物は、ウイルス様粒子と少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを含みあるいはこれらからなり、抗原または抗原決定基は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、少なくとも１つの抗原または抗原決定基は、規則的で反復性の抗原ＶＬＰアレイが形成されるようにウイルス様粒子に結合する。さらに本発明によれば、とりわけ好酸球成分によるアレルギー性疾患を治療しかつ／または予防的に阻止するために、そのような組成物を医者が都合よく構成することが可能である。 2. Compositions and Methods for Increasing Immune Response The disclosed invention provides compositions and methods for enhancing an animal's immune response to IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. The composition of the invention comprises (a) core particles having at least one first attachment site , and (b) at least one antigen or antigenic determinant having at least one second attachment site , or The antigen or antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and the second attachment site is (i) non-natural with the antigen or antigenic determinant An attachment site , (ii) selected from the group consisting of natural attachment sites with said antigen or antigenic determinant, wherein said second attachment site is capable of associating with said first attachment site , said antigen or antigenic determinant And the core particles interact through the association to form an ordered repetitive antigen array . More particularly, the composition of the invention comprises or consists of a virus-like particle and at least one antigen or antigenic determinant, wherein the antigen or antigenic determinant is of IL-5, IL-13, or eotaxin. A protein or peptide, at least one antigen or antigenic determinant binds to a virus-like particle such that a regular and repetitive antigen VLP array is formed. Further in accordance with the present invention, such compositions can be conveniently configured by a physician to treat and / or prevent prophylactically, particularly allergic diseases caused by eosinophil components.

一実施形態では、コア粒子には、ウイルス、細菌線毛、細菌性ピリンから形成された構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、またはこれらの組換え形態が含まれる。規則的で反復性の被覆及び／又はコアタンパク質構造を有する当技術分野で知られている任意のウイルスが、本発明のコア粒子として選択することができ、適切なウイルスの例には、シンドビスおよびその他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例えばヒトライノウイルス、アイチウイルス）、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えばトゴトウイルス、バトケンウイルス、家禽ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例えばポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、トリポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、***ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、およびヒトパピローマウイルスが含まれ、好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７である（例えばＢａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．およびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１７：５５３〜５５８（１９９６）の表１参照）。 In one embodiment, the core particles include viruses, bacterial pili, structures formed from bacterial pilins, bacteriophages, virus-like particles, virus capsid particles, or recombinant forms thereof. Any virus known in the art having a regular and repetitive coating and / or core protein structure can be selected as the core particle of the present invention, examples of suitable viruses include Sindbis and Other alphaviruses, rhabdoviruses (eg vesicular stomatitis virus), picornaviruses (eg human rhinovirus, aichivirus), togaviruses (eg rubella virus), orthomyxoviruses (eg togotovirus, Batken virus, poultry) Plague virus), polyomavirus (eg, polyomavirus BK, polyomavirus JC, avian polyomavirus BFDV), parvovirus, rotavirus, norwalk virus, foot-and-mouth disease virus, retrovirus, hepatitis B virus, tobacco mosaic virus Including flockhouse virus and human papillomavirus, preferably RNA phage, bacteriophage Qβ, bacteriophage R17, bacteriophage M11, bacteriophage MX1, bacteriophage NL95, bacteriophage fr, bacteriophage GA, bacteriophage SP, bacteriophage MS2, bacteriophage f2, bacteriophage PP7 (see, for example, Table 1 of Bachmann, MF and Zinkernagel, RM, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).

別の実施形態では、本発明は、ウイルスの遺伝子工学を利用して、規則的で反復性のウイルス外被タンパク質と、選択された異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基、または反応性アミノ酸残基を含む第１の付着部位との融合を生成する。本発明の組成物を構成するには、当技術分野で知られるその他の遺伝子操作を含めることができ、例えば遺伝子の変異により組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましい。さらに本発明で使用されるウイルスは、化学的または物理的不活性が原因となって、または示されるように複製適格ゲノムが欠けていることから、複製不可能である。第１の付着部位に融合するよう選択されたウイルスタンパク質は、組織化された繰返し構造を有するべきである。そのような組織化繰返し構造は、ウイルスの表面に、間隔が５〜３０ナノメートル、好ましくは５〜１５ｎｍの準結晶質組織を含む。このタイプの融合タンパク質の生成によって、ウイルス表面に、複数の規則的で反復性の第１の付着部位が得られ、天然のウイルスタンパク質の通常の組織化を反映することになる。当業者に理解されるように、第１の付着部位は、任意の適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然または合成ポリマー、二次代謝産物、またはこれらの組合せでよく、あるいはこれらの一部でよく、すなわちこれらは抗原または抗原決定基に特異的に結着するよう役立てることができ、それによって規則正しい反復性抗原アレイが得られる。 In another embodiment, the present invention utilizes viral genetic engineering to combine a regular and repetitive viral coat protein and a selected heterologous protein, peptide, antigenic determinant, or reactive amino acid residue. A fusion with the first attachment site containing is generated. Other genetic manipulations known in the art can be included in the composition of the present invention, and it is desirable to limit the replication ability of the recombinant virus, for example, by mutation of the gene. In addition, the viruses used in the present invention are not replicable due to chemical or physical inactivity or lack of replication competent genomes as indicated. Viral proteins selected to fuse to the first attachment site should have an organized repeat structure. Such an organized repeating structure includes a quasicrystalline structure with a spacing of 5-30 nanometers, preferably 5-15 nm, on the surface of the virus. Generation of this type of fusion protein results in multiple regular and repetitive first attachment sites on the viral surface, reflecting the normal organization of the native viral protein. As will be appreciated by those skilled in the art, the first attachment site can be any suitable protein, polypeptide, sugar, polynucleotide, peptide (amino acid), natural or synthetic polymer, secondary metabolite, or combinations thereof. May be, or may be part of them, i.e. they can serve to bind specifically to antigens or antigenic determinants, thereby providing an ordered repetitive antigen array .

本発明の別の実施形態で、コア粒子は組換えアルファウイルスであり、より詳細には組換えシンビスウイルスである。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で、ＤＮＡの中間体なしで、そのゲノムＲＮＡ全体を複製するプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルス科のいくつかのメンバー、シンドビス（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４３：１１８８〜１１９１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１８〜２２（１９９３））、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．＆Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３５６〜１３６１（１９９１））、およびその他のもの（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７１：１８９〜２０４（１９８９））は、様々な異なるタンパク質に関するウイルスベースの発現ベクターとして（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８〜５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５〜５００（１９９４））、さらにワクチン開発の候補物質として使用することを目的に、かなりの注目を集めている。最近、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためにアルファウイルスを使用することを対象としたいくつかの特許が発行されている（米国特許第５，７６６，６０２号；第５，７９２，４６２号；第５，７３９，０２６号；第５，７８９，２４５号、および第５，８１４，４８２号参照）。本発明のアルファウイルスコア粒子の構成体は、参照により本明細書に援用する前述の論文に記載されている、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている手段によって行うことができる。 In another embodiment of the invention, the core particle is a recombinant alphavirus, more specifically a recombinant symbis virus. Alphaviruses are positive-strand RNA viruses that replicate the entire genomic RNA in the cytoplasm of infected cells, without DNA intermediates (Struss, J. and Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562). (1994)). Several members of the Alphaviridae, Sindbis (Xiong, C. et al., Science 243: 1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol., 11: 18-22 (1993)), Semliki Forest virus (SFV) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio / Technology 9: 1356-1361 (1991)) and others (Davis, NL et al., Virology 171: 189-204 (1989) )) As a virus-based expression vector for a variety of different proteins (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578-582 (1997); Lilje trom, P., Curr.Opin.Biotechnol.5: 495~500 (1994)), intended to be used further as candidates for vaccine development has attracted considerable attention. Recently, several patents have been issued (US Pat. Nos. 5,766,602; 5,792,462) directed to the use of alphaviruses for heterologous protein expression and vaccine development. No. 5,739,026; 5,789,245 and 5,814,482). The construction of the alphavirus core particles of the present invention can be performed by means generally known in the field of recombinant DNA technology, as described in the aforementioned paper, which is incorporated herein by reference.

抗原または抗原決定基結着用のウイルスベースのコア粒子を生成するには、様々な異なる組換え宿主細胞を利用することができる。例えばアルファウイルスは、広い宿主範囲を有することが知られており、シンドビスウイルスは、培養した哺乳動物、爬虫類、両性類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３５：３３５（１９７７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．、ＴＨＥＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ、Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８０）、第５８３〜６２１頁）。したがって本発明の実施に際して数多くの組換え宿主細胞を使用することができる。ＢＨＫ、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が、異種タンパク質の生成に特に適しているが、その理由は、これらの細胞がヒト細胞と同様の手法で異種タンパク質をグリコシル化することができ（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．他、糖鎖生物学（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）４：２２７（１９９４））、選択することができ（Ｚａｎｇ，Ｍ．他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：３８９（１９９５））、または遺伝子工学によって合成することができ（Ｒｅｎｎｅｒ，Ｗ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４：４７６（１９９５）；Ｌｅｅ，Ｋ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、それによって血清を含まない培地ならびに懸濁液中で成長させることができるからである。 A variety of different recombinant host cells can be utilized to produce virus-based core particles for attachment of antigens or antigenic determinants. For example, alphaviruses are known to have a broad host range, and Sindbis virus infects cultured mammals, reptiles, amphibians, as well as some insect cells (Clark, H., J. et al. Natl. Cancer Inst., 51: 645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol., 35: 335 (1977); 1980), pages 583-621). Thus, a large number of recombinant host cells can be used in the practice of the present invention. BHK, COS, Vero, HeLa, and CHO cells are particularly suitable for the production of heterologous proteins because they can glycosylate the heterologous protein in a manner similar to human cells (Watson). , E. et al., Glycobiology 4: 227 (1994)) and can be selected (Zang, M. et al., Bio / Technology 13: 389 (1995)), or synthesized by genetic engineering (Renner, W. et al., Biotech. Bioeng. 4: 476 (1995); Lee, K. et al., Biotech. Bioeng. 50: 336 (1996)), thereby in serum-free media and suspensions It is because it can be made to grow.

宿主細胞内へのポリヌクレオチドベクターの導入は、標準的な実験室マニュアルに記載されている方法により行うことができ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、第９章；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ）、ＪｏｈｎＨ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）、第１６章参照）、電気穿孔法やＤＥＡＥデキストラン媒介型トランスフェクション、トランスフェクション、微量注入、陽イオン脂質媒介型トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入、および感染などの方法が含まれる。宿主細胞に外因性ＤＮＡ配列を導入する方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．他の米国特許第５，５８０，８５９号で論じられている。 Introduction of a polynucleotide vector into a host cell can be performed by a method described in a standard laboratory manual (for example, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning), a laboratory manual (A LABORATORY MANUAL), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition Cold Spring Harbor, NY (1989), Chapter 9; Ausbel, F. et al. John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Chapter 16), electroporation and DEAE dextran media Methods include mediated transfection, transfection, microinjection, cationic lipid-mediated transfection, transduction, scrape loading, bullet introduction, and infection. Methods for introducing exogenous DNA sequences into host cells are described in Felgner, P .; Discussed in other US Pat. No. 5,580,859.

宿主細胞に感染させるには、パッケージのＲＮＡ配列を使用することもできる。このようなパッケージＲＮＡ配列は、培地に添加することによって宿主細胞に導入することができる。例えば非感染性のアルファウイルス粒子の調製について、「シンドビス発現系（ＳｉｎｄｂｉｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）」バージョンＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｋ７５０−１）を含めたいくつかの出典に記載されている。 The package RNA sequence can also be used to infect host cells. Such packaged RNA sequences can be introduced into host cells by adding them to the medium. For example, the preparation of non-infectious alphavirus particles is described in several sources, including the “Sindbis Expression System” version C (Invitrogen catalog number K750-1).

ウイルスベースのコア粒子を生成するために組換え宿主細胞として哺乳動物細胞を使用する場合、この細胞は一般に、組織培養によって増殖させることになる。培養によって細胞を増殖させる方法は、当技術分野では周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、細胞生物学（ＣＥＬＬＢＩＯＬＯＧＹ）、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ）、実験室マニュアル（ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ）第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．他編、分子生物学における現代のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ）、ＪｏｈｎＨ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．、動物細胞の培養（ＣＵＬＴＵＲＥＯＦＡＮＩＭＡＬＣＥＬＬＳ）、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）参照）。 When using mammalian cells as recombinant host cells to produce virus-based core particles, the cells will generally be propagated by tissue culture. Methods for growing cells by culture are well known in the art (eg, Celis, J. ed., Cell Biology, Academic Press 2nd edition (1998); Sambrook, J. et al., Molecular. MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); R., Animal Cell Culture (CULTURE OF ANIMAL CELLS), Alan R.Liss, Inc. (1983) refer).

本発明のコア粒子としての使用に適しているＲＮＡウイルスの別の例には、下記のものが含まれるが、これらに限定するものではない：すなわちオルトレオウイルス属（哺乳動物とトリレトロウイルスの両方の複数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、オイゲナンギーウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、トリロタウイルス）を含むレオウイルス科；エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＧ型肝炎ウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルスムリス（ｍｕｒｉｓ）、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも１１３のサブタイプを含むヒトライノウイルス；その他のライノウイルス）、アプトウイルス属（***（ＦＭＤＶ））を含むピコルナウイルス科；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルス、およびノーウォークウイルスを含むカリシウイルス科；アルファウイルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含むトガウイルス科；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス属（シシリアサシチョウバエウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミアン−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウークウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）を含むブンヤウイルス科；インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）を含むオルソミクソウイルス科；ブタインフルエンザウイルス、トリおよびウマインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な別の属）；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、ＨＡウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、ニューモウイルス属（呼吸器合法胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含むパラミクソウイルス科；ベシクロウイルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フランダース−ハートパークウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、フィッシュラブドウイルス、およびフィロウイルス（マーブルグウイルスおよびエボラウイルス）を含むラブドウイルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、およびラッサウイルスを含むアレナウイルス科；伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸炎コロナウイルス、およびネコ伝染性腸炎ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバーである。 Other examples of RNA viruses suitable for use as the core particle of the present invention include, but are not limited to: Orthoreoviruses (mammalian and avian retroviruses) Multiple serotypes of both), Orbivirus (bluetongue virus, Eugenangivirus, Kemerovovirus, African horse virus, and Colorado tick virus), Rotavirus (human rotavirus, Nebraska calf diarrhea virus, Reoviridae, including murine rotavirus, simian rotavirus, bovine or ovine rotavirus, avian rotavirus; enteroviruses (poliovirus, coxsackievirus A and B, echovirus (ECHO), A, C, D, E, and Hepatitis G virus, Sarenterovirus Mouse encephalomyelitis (ME) virus, poliovirus muris, bovine enterovirus, porcine enterovirus), cardiovirus genus (encephalomyocarditis virus (EMC), mengovirus), rhinovirus genus (at least 113 subtypes) Human rhinoviruses including: other rhinoviruses), Picornaviridae including Aptovirus (FMDV); including swine vesicular rash virus, San Miguel sea lion virus, feline picorna virus, and Norwalk virus Caliciviridae; Alphavirus genus (Eastern equine encephalomyelitis virus, Semliki Forest fever virus, Sindbis virus, Chikungunya virus, Onyonyon virus, Ross River virus, Venezuelan equine encephalitis virus, Western equine encephalitis Irs), Flavivirus genus (mosquito-borne yellow fever virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, St. Louis encephalitis virus, Mary Valley encephalitis virus, West Nile virus, Kunjin virus, Central European tick-borne virus, Far Eastern tick-borne virus, Casanur forest virus Togaviridae, including the genus leap virus, poissan virus, omsk hemorrhagic fever virus), rubivirus genus (rubella virus), pestivirus genus (mucosal disease virus, porcine cholera virus, border disease virus); And related viruses, California encephalitis virus), Flevovirus genus (Sicilian flies flies virus, Rift Valley fever virus), Nirovirus genus (Crimea-Congo hemorrhagic fever virus, Nairobi sheep disease) Viruses), and the Bunyaviridae family that includes the genus wakevirus (Ukuniemi and related viruses); the Orthomyxoviridae family that includes the genus influenza virus (influenza virus type A, many human subtypes); swine flu virus, birds and horses Influenza virus; influenza B (many human subtypes), and influenza C (another possible genus); Paramyxovirus (parainfluenza virus type 1, Sendai virus, HA virus, parainfluenza virus types 2-5 , Newcastle disease virus, mumps virus), measles virus genus (measles virus, subacute sclerosing panencephalitis virus, distemper virus, rinderpest virus), pneumovirus genus (respiratory reticulum virus (R V), bovine respiratory syncytial virus, and mouse pneumonia virus); Forest virus, Sindbis virus, Chikungunya virus, Onyung Nyon virus, Ross River virus, Venezuelan equine encephalomyelitis virus, Western horse Encephalitis virus), Flavivirus genus (mosquito-borne yellow fever virus, dengue virus, Japanese encephalitis virus, St. Louis encephalitis virus, Marie Valley encephalitis virus, West Nile virus, Kunjin virus, Central European tick-borne virus, Far Eastern tick-borne virus, Casanur forest virus , Jumping disease virus, poissan virus, omsk hemorrhagic fever virus), rubivirus genus (rubella virus), pestivirus genus (mucosal disease virus, porcine cholera virus, border disease virus); bunyavirus genus ( Nyamwela and related viruses, California encephalitis virus), Flevovirus genus (Sicilian moth fly virus, Rift Valley fever virus), Nirovirus genus (Crimian-Congo hemorrhagic fever virus, Nairobi sheep disease virus), and wake virus genus ( Bunyaviridae, including Ukuniemi and related viruses; Orthomyxoviridae, including influenza virus genus (influenza virus type A, many human subtypes); Swine influenza virus, avian and equine influenza viruses; Human subtype), and influenza C type (another possible genus); Paramyxovirus genus (parainfluenza virus type 1, Sendai virus, HA virus, Parainflue Nzavirus type 2-5, Newcastle disease virus, mumps virus), measles virus genus (measles virus, subacute sclerosing panencephalitis virus, distemper virus, rinderpest virus), pneumovirus genus (respiratory legal endoplasmic reticulum virus (RSV)) Paramyxoviridae, including Bovine Respiratory Syncytial Virus and Mouse Pneumoniae Virus; Becyclovirus (VSV) (Chandipuravirus, Flanders-Heartpark Virus), Lissavirus (Rabies Virus), Fish Labored Virus, And Rhabdoviridae, including filovirus (Marburg virus and Ebola virus); Arenaviridae, including lymphocytic choriomeningitis virus (LCM), Tacaribe virus complex, and Lassa virus; Scan (IBV), a member of the coronavirus family, including Mouse Hepatitis virus, Human enteritis coronavirus, and feline infectious enteritis virus.

コア粒子として使用することができる例示的なＤＮＡウイルスには下記のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、オルソポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア、牛痘、バッファロー痘ウイルス、家兎痘、エクトロメリア）、レポリポックスウイルス属（粘液腫、線維腫）、アビポックスウイルス属（鶏痘、その他のトリポックスウイルス）、カプリポップスウイルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウイルス属（豚痘）、パラポックスウイルス（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含むポックスウイルス科；イリドウイルス科（アフリカブタ熱ウイルス、カエルウイルス２および３型、魚のリンホシスチウイルス）；αヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１および２型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３型、仮性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ角結膜炎ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス）、βヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、ブタ、サル、およびげっ歯類のサイトメガロウイルス）を含むヘルペスウイルス科；γヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス、ヘルペスｓａｉｍｉｒｉ、ヘルペスウイルスａｔｅｌｅｓ、ヘルペスウイルスｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）；マストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと、分類されていないもの）、サルアデノウイルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、ウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、および多くのその他の種のアデノウイルス、アビアデノウイルス属（トリアデノウイルス）を含むアデノウイルス科；非培養性アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピローマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギパピローマウイルス、その他の種の様々な病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サル空胞剤（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞剤（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、およびリンパ増殖性パピローマウイルスなどのその他の霊長類のポリオーマウイルス）を含むパポウイルス科；アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）を含むパルボウイルス科である。最後に、ＤＮＡウイルスには、慢性伝染性神経障害剤（ＣＨＩＮＡウイルス）などのウイルスを含めることができる。 Exemplary DNA viruses that can be used as core particles include, but are not limited to: That is, orthopoxviruses (major pressure ulcers, small ulcers, monkey vaccinia, cowpox, buffalo pox virus, rabbits, ectromelia), repolipoxviruses (myxoma, fibromas), avipoxviruses (fowlpox) , Other tripox viruses), Capripops virus genus (sheep moth, goat moth), Suipox virus genus (pig moth), parapox virus (infectious pustular dermatitis virus, pseudo cowpox, bovine papular stomatitis virus) Podviridae; Iridoviridae (African swine fever virus, frog virus 2 and 3, fish lymphocystis virus); α herpesvirus (herpes simplex virus 1 and 2, varicella zoster, equine abortion virus, horse Herpesvirus type 2 and 3, pseudorabies virus, infectious virus Includes keratoconjunctivitis virus, infectious bovine rhinotracheitis virus, feline rhinotracheitis virus, infectious laryngotracheitis virus), beta-herpesvirus (human cytomegalovirus, swine, monkey, and rodent cytomegalovirus) Herpesviridae; gammaherpesvirus (Epstein-Barr virus (EBV), Marek's disease virus, herpes saimiri, herpesvirus ateles, herpesvirus sylviragus, guinea pig herpesvirus, Rücke tumor virus); mast adenovirus genus (human subgroup A, B, C, D, and E, not classified), simian adenovirus (at least 23 serotypes), contagious canine hepatitis, cattle, pigs, sheep, frogs, and many other species of adenovirus Abi Adenoviridae, including the genus Denovirus (avian adenovirus); non-cultured adenovirus; genus papillomavirus (human papillomavirus, bovine papillomavirus, shope rabbit papillomavirus, various other pathogenic papillomaviruses), polyoma Other primate polyomaviruses such as virus genus (polyomavirus, monkey vacuolar (SV-40), rabbit vacuolar (RKV), K virus, BK virus, JC virus, and lymphoproliferative papillomavirus Papoviridae, including adeno-associated virus genus, parvovirus genus (feline panleukopenia virus, bovine parvovirus, canine parvovirus, Aleutian Mink disease virus, etc.). Finally, DNA viruses can include viruses such as chronic infectious neuropathies (CHINA viruses).

その他の実施形態では、細菌性ピリン、細菌性ピリンの小部分、あるいは細菌性ピリンまたはその小部分を含有する融合タンパク質を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。ピリンタンパク質の例には、大腸菌、インフルエンザ菌、ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌、カウロバクタークレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、シュードモナス−スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）、および緑膿菌によって生成されたピリンが含まれる。本発明と共に使用するのに適したピリンタンパク質のアミノ酸配列には、ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＪ０００６３６（配列番号１）、ＡＪ１３２３６４（配列番号２）、ＡＦ２２９６４６（配列番号３）、ＡＦ０５１８１４（配列番号４）、ＡＦ０５１８１５（配列番号５）、およびＸ００９８１（配列番号６）に記載されたものが含まれ、その開示の全体を参照により本明細書に援用する。 In other embodiments, bacterial pilin, a small portion of bacterial pilin, or a fusion protein containing bacterial pilin or a small portion thereof may be used to prepare the compositions and vaccine compositions of the invention, respectively. it can. Examples of pilin proteins are produced by E. coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Caurobacter crescentus, Pseudomonas stutzeri, and Pseudomonas aeruginosa Contains pilin. Suitable amino acid sequences for pilin proteins for use with the present invention include GenBank reports AJ000636 (SEQ ID NO: 1), AJ132364 (SEQ ID NO: 2), AF229646 (SEQ ID NO: 3), AF051814 (SEQ ID NO: 4), AF0551815 (SEQ ID NO: 4). No. 5), and those described in X00981 (SEQ ID NO: 6), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.

細菌性ピリンタンパク質は、一般に、タンパク質を細菌性ペリプラズムへと移出する前に、Ｎ末端リーダー配列が除去されるようにプロセッシングされる。さらに当業者に理解されるように、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、一般に、天然に存在するリーダー配列を持たない。 Bacterial pilin proteins are generally processed such that the N-terminal leader sequence is removed before the protein is exported to the bacterial periplasm. As will be further appreciated by those skilled in the art, the bacterial pilin proteins used to prepare the compositions and vaccine compositions of the invention, respectively, generally do not have a naturally occurring leader sequence.

本発明での使用に適するピリンタンパク質の１つの特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰピリンである（ＧｅｎＢａｎｋレポートＡＦ２３７４８２（配列番号７））。本発明と共に使用するのに適した１型Ｅ．ｃｏｌｉピリンの例は、ＧｅｎＢａｎｋレポートＰ０４１２８に記載されたアミノ酸配列（配列番号８）を有するピリンであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋレポートＭ２７６０３に記載されたヌクレオチド配列（配列番号９）を有する核酸でコードされたものである。これらＧｅｎＢａｎｋレポートの開示全体を、参照により本明細書に援用する。同様に、一般に上記タンパク質の成熟形態を使用して、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製することができる。 One particular example of a pilin protein suitable for use in the present invention is E. coli. E. coli P-pilin (GenBank report AF237482 (SEQ ID NO: 7)). Type 1 E.C. suitable for use with the present invention. An example of an E. coli pilin is a pilin having the amino acid sequence described in GenBank report P04128 (SEQ ID NO: 8), which was encoded by a nucleic acid having the nucleotide sequence described in GenBank report M27603 (SEQ ID NO: 9). Is. The entire disclosure of these GenBank reports is incorporated herein by reference. Similarly, the mature forms of the above proteins can generally be used to prepare the compositions and vaccine compositions, respectively, of the present invention.

本発明を実施する際、使用に適する細菌性ピリンまたはピリン小部分は、一般に規則正しい反復性抗原アレイが形成されるよう会合することができる。 In practicing the present invention, bacterial pilin or pilin subportions suitable for use can generally be associated to form a regular repetitive antigen array .

ピリンおよび線毛様構造を生体外で調製する方法は、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１２８９０〜１２８９５（１９９６）は、Ｅ．ＣｏｌｉＰ線毛サブユニットのｉｎｖｉｔｒｏ再構成体について述べている。さらにＥｓｈｄａｔ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８：３０８〜３１４（１９８１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛の解離および線毛の再構成体に適した方法について述べている。簡単に言えば、これらの方法は以下の通りである。すなわち線毛を、飽和塩酸グアニジン中、３７℃でインキュベートすることによって解離させる。次いでピリンタンパク質をクロマトグラフィーで精製し、その後、５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーを形成する。Ｅｓｈｄａｔ他は、５ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０）に対して透析することにより、ピリンダイマーが再会合して線毛を形成することも見出した。 Methods for preparing pilin and pilus-like structures in vitro are known in the art. See, for example, Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12890-12895 (1996). Describes the in vitro reconstitution of the Coli P pili subunit. In addition, Eshdat et al. Bacteriol. 148: 308-314 (1981). A method suitable for dissociation of E. coli type 1 pili and reconstitution of pili is described. Simply put, these methods are as follows. That is, the pili are dissociated by incubating at 37 ° C. in saturated guanidine hydrochloride. The pilin protein is then purified by chromatography and then dialyzed against 5 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (pH 8.0) to form pilin dimers. Eshdat et al. Also found that pilin dimers reassociate to form pili by dialyzing against 5 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (pH 8.0) containing 5 mM MgCl ₂ .

さらに、例えば従来の遺伝子工学およびタンパク質変性方法を使用して、抗原または抗原決定基が第２の付着部位を介して結合される第１の付着部位が含まれるように、ピリンタンパク質を変性させることができる。あるいは抗原または抗原決定基は、第２の付着部位を介して、これらのタンパク質中に自然に存在するアミノ酸残基に直接結合することができる。次いでこれらの変性ピリンタンパク質を、本発明のワクチン組成物に使用することができる。 Furthermore, using conventional genetic engineering and protein denaturation methods, for example, denaturing the pilin protein so that it includes a first attachment site to which an antigen or antigenic determinant is bound via a second attachment site Can do. Alternatively, an antigen or antigenic determinant can be directly linked to an amino acid residue naturally present in these proteins via a second attachment site . These modified pilin proteins can then be used in the vaccine composition of the present invention.

本発明の組成物およびワクシン組成物をそれぞれ調製するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、ＨＢｃＡｇに関して本明細書で述べた場合と同様の手法で変性させることができる。例えばシステインおよびリジン残基は、欠失させることができ、または他のアミノ酸残基で置換することができ、第１の付着部位をこれらのタンパク質に付加することができる。さらにピリンタンパク質を、変性した形で発現させることができ、または発現後に化学的に変性させることができる。同様に、無傷の線毛を細菌から収集し、次いで化学的に変性させることができる。 The bacterial pilin protein used to prepare the compositions of the present invention and the vaccin composition, respectively, can be denatured in the same manner as described herein for HBcAg. For example, cysteine and lysine residues can be deleted or substituted with other amino acid residues, and a first attachment site can be added to these proteins. Furthermore, the pilin protein can be expressed in a denatured form or chemically denatured after expression. Similarly, intact pili can be collected from bacteria and then chemically denatured.

別の実施形態では、線毛または線毛様構造を細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）から収集し、これを使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を形成する。組成物およびワクチン組成物の調製に適した線毛の一例は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するピリンモノマーから形成された、Ｅ．ｃｏｌｉの１型線毛である。 In another embodiment, pili or pili-like structures are collected from bacteria (eg, E. coli) and used to form the compositions and vaccine compositions of the present invention. One example of pili suitable for the preparation of compositions and vaccine compositions is the E. coli formed from a pilin monomer having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. E. coli type 1 pili.

細菌線毛を収集する方法のいくつかは、当技術分野で知られている。例えばＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：６２３〜６３２（１９９８））は、Ｅ．ｃｏｌｉからＰ線毛を収集するための線毛精製方法について述べている。この方法によれば、線毛は、Ｐ線毛プラスミドを含有する過度に線毛化したＥ．ｃｏｌｉから剪断され、溶解およびＭｇＣｌ_２（１．０Ｍ）沈殿のサイクルによって精製される。 Several methods for collecting bacterial pili are known in the art. For example, Bullitt and Makowski (Biophys. J. 74: 623-632 (1998)) A pili purification method for collecting P pili from E. coli is described. According to this method, the pili are over-piled E. coli containing the P pili plasmid. and is purified by a cycle of dissolution and MgCl ₂ (1.0 M) precipitation.

収集した後、線毛または線毛様構造を様々な方法で変性させることができる。例えば第１の付着部位は、第２の付着部位を介して抗原または抗原決定基を結着させることができる線毛に付加することができる。言い換えれば、細菌線毛または線毛様構造を収集して変性させることにより、規則正しい反復性抗原アレイを得ることができる。 After collection, the pili or pili-like structure can be denatured in various ways. For example, a first attachment site can be added to a pili that can bind an antigen or antigenic determinant via a second attachment site . In other words, a regular repetitive antigen array can be obtained by collecting and denaturing bacterial pili or pili-like structures.

抗原または抗原決定基は、線毛または線毛様構造内に存在する、天然に生ずるシステイン残基またはリジン残基に結合することができる。そのような場合、天然に生ずるアミノ酸残基が高度に配列され繰り返されることにより、抗原または抗原決定基と線毛または線毛様構造とが連結するようになる。例えば線毛または線毛様構造は、異種２官能性架橋剤を使用して、抗原または抗原決定基の第２の付着部位に結合することができる。 Antigens or antigenic determinants can be bound to naturally occurring cysteine or lysine residues present in pili or pili-like structures. In such a case, naturally occurring amino acid residues are highly sequenced and repeated to link the antigen or antigenic determinant to the pili or pili-like structure. For example, pili or pilus-like structures can be attached to a second attachment site of an antigen or antigenic determinant using a heterobifunctional cross-linking agent.

生物体によって自然に合成される構造（例えば線毛）を使用して本発明の組成物およびワクチン組成物を調製する場合、所望の特徴を有する構造が生成されるように、これらの生物体を遺伝子工学を使用して合成することがしばしば有利になる。例えばＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を使用する場合、この線毛が収集されるＥ．ｃｏｌｉは、特定の特徴を備えた構造が生成されるように、変性させることができる。ピリンタンパク質の可能な変性例には、１つまたは複数のリジン残基の挿入、１つまたは複数の天然に存在するリジン残基の欠失または置換、１つまたは複数の天然に存在するシステイン残基の欠失または置換が含まれる（例えば、配列番号８の位置４４および８４のシステイン残基）。 When preparing the compositions and vaccine compositions of the present invention using structures that are naturally synthesized by the organisms (eg, pili), the organisms are selected so that structures having the desired characteristics are produced. It is often advantageous to synthesize using genetic engineering. For example, E.I. When using E. coli type 1 pili, this pili is collected. The E. coli can be modified so that a structure with specific features is generated. Possible modifications of pilin proteins include insertion of one or more lysine residues, deletion or substitution of one or more naturally occurring lysine residues, one or more naturally occurring cysteine residues. Group deletions or substitutions are included (eg, the cysteine residues at positions 44 and 84 of SEQ ID NO: 8).

さらに、追加の変性をピリン遺伝子に行うことができ、その結果、リジン残基以外の第１の付着部位を含有する発現生成物が得られる（例えばＦＯＳまたはＪＵＮドメイン）。当然ながら一般に、適切な第１の付着部位は、本発明のワクチン組成物での使用に適する線毛または線毛様構造をピリンタンパク質が形成するのを妨げないものに限定される。 In addition, additional denaturation can be performed on the pilin gene, resulting in an expression product containing a first attachment site other than a lysine residue (eg, FOS or JUN domain). Of course, in general, suitable first attachment sites are limited to those that do not prevent the pilin protein from forming pili or pili-like structures suitable for use in the vaccine compositions of the invention.

細菌細胞内に自然に存在するピリン遺伝子は、生体内で変性させることができ（例えば同種組換えによって）、または特定の特徴を備えたピリン遺伝子を、これらの細胞に挿入することができる。例えばピリン遺伝子は、複製可能なクローニングベクターまたは細菌染色体に挿入されるベクターの成分として、細菌細胞に導入することができる。挿入されたピリン遺伝子は、発現調節制御配列（例えばｌａｃオペレーター）に結合してもよい。 Naturally occurring pilin genes in bacterial cells can be denatured in vivo (eg, by homologous recombination), or pilin genes with specific characteristics can be inserted into these cells. For example, the pilin gene can be introduced into bacterial cells as a component of a replicable cloning vector or vector inserted into a bacterial chromosome. The inserted pilin gene may be bound to an expression regulatory control sequence (for example, a lac operator).

ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される線毛または線毛様構造は、単一タイプのピリンサブユニットからなる。同一サブユニットからなる線毛または線毛様構造は、高度に配列されかつ繰り返された抗原アレイを提示する構造を形成することが予想されるので、一般的に使用される。 In most cases, the pili or pilus-like structures used in the compositions and vaccine compositions of the invention, respectively, consist of a single type of pilin subunit. Pili or pili-like structures composed of the same subunits are commonly used because they are expected to form structures that are highly ordered and present a repeated antigen array.

しかし本発明の組成物は、異質なピリンサブユニットから形成された線毛または線毛様構造を含んだ組成物およびワクチンも含む。これらの線毛または線毛様構造を形成するピリンサブユニットは、細菌細胞内に自然に存在する遺伝子から発現させることができ、または細菌細胞に導入することができる。天然に存在するピリン遺伝子と導入した遺伝子は共に、線毛または線毛様構造を形成する細胞内で発現し、その結果、一般にこれらのピリンタンパク質の混合物から形成された構造になる。さらに、２個以上のピリン遺伝子が細菌細胞内で発現した場合、各ピリン遺伝子の相対的な発現は典型的な場合、線毛または線毛様構造における異なるピリンサブユニットの比を決定するファクターになる。 However, the compositions of the present invention also include compositions and vaccines comprising pili or pili-like structures formed from heterogeneous pilin subunits. The pilin subunits that form these pili or pilus-like structures can be expressed from genes that are naturally present in bacterial cells or introduced into bacterial cells. Both naturally occurring pilin genes and introduced genes are expressed in cells that form pili or pilus-like structures, resulting in structures generally formed from a mixture of these pilin proteins. Furthermore, when more than one pilin gene is expressed in a bacterial cell, the relative expression of each pilin gene is typically a factor that determines the ratio of different pilin subunits in pili or pilus-like structures. Become.

混合型ピリンサブユニットの特定の組成物を有する線毛または線毛様構造が望まれる場合、ピリン遺伝子の少なくとも１つの発現は、異種誘発性プロモーターによって調節することができる。他の遺伝要素と同様にそのようなプロモーターを使用して、細菌細胞内で産生される異なるピリンサブユニットの相対的な量を調節することができ、したがって線毛または線毛様構造の組成を調節することができる。 If pili or pili-like structures with a specific composition of mixed pilin subunits are desired, the expression of at least one of the pilin genes can be regulated by a heterologous inducible promoter. As with other genetic elements, such promoters can be used to regulate the relative amounts of different pilin subunits produced in bacterial cells, thus controlling the composition of pili or pili-like structures. Can be adjusted.

さらに、抗原または抗原決定基は、ペプチド結合ではない結合によって細菌線毛または線毛様構造に結合することができ、本発明の組成物に使用される線毛または線毛様構造を産生する細菌細胞を遺伝子工学により合成して、抗原または抗原決定基と融合するピリンタンパク質を生成することができる。線毛または線毛様構造を形成するそのような融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物で使用するのに適している。 In addition, the antigen or antigenic determinant can be bound to the bacterial pili or pilus-like structure by a bond that is not a peptide bond, producing a pilus or pili-like structure for use in the compositions of the present invention. Cells can be synthesized by genetic engineering to produce pilin proteins that fuse with antigens or antigenic determinants. Such fusion proteins that form pili or pili-like structures are suitable for use in the vaccine composition of the invention.

本願におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子に似ているが病原体ではない構造を指す。一般にウイルス様粒子はウイルスゲノムに欠けており、したがって非感染性である。またウイルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することもでき、容易に精製することもできる。 Virus-like particles in this application refer to structures that resemble virus particles but are not pathogens. In general, virus-like particles lack the viral genome and are therefore non-infectious. Virus-like particles can also be produced in large quantities by heterologous expression and can be easily purified.

好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。当業者なら、組換えＤＮＡ技術と一般に公開されているウイルスコード配列とを使用して、ＶＬＰを生成することができる。例えばウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、ウイルスプロモーターの調節制御の下、市販のバキュロウイルスベクターを使用するバキュロウイルス発現ベクターにおける発現を目的として設計製作することができるが、この場合、配列の適切な変更によってコード配列と調節配列との機能的連鎖が可能になる。ウイルス外被またはコアタンパク質のコード配列は、例えば細菌発現ベクターでの発現を目的として設計製作することもできる。 In a preferred embodiment, the virus-like particle is a recombinant virus-like particle. One skilled in the art can generate VLPs using recombinant DNA technology and publicly available viral coding sequences. For example, the coding sequence of the viral coat or core protein can be designed and produced for the purpose of expression in a baculovirus expression vector using a commercially available baculovirus vector under the regulatory control of the viral promoter. Appropriate changes allow functional linkage between the coding and regulatory sequences. The viral coat or core protein coding sequence can also be designed and produced, for example for expression in bacterial expression vectors.

ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈ他、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウイルス（Ｗａｒｎｅｓ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および米国特許第５，３７４，４２６号）、***ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）１３：１６０３〜１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒファージ、ＧＡファージ、およびＱβファージが含まれるが、これらに限定されない。 Examples of VLPs include the hepatitis B virus capsid protein (Ulrich et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), measles virus (Warnes et al., Gene 160: 173-178 (1995)). Sindbis virus, rotavirus (US Pat. No. 5,071,651 and US Pat. No. 5,374,426), foot-and-mouth disease virus (Twomey et al., Vaccine 13: 1603-1610 (1995)), no Walk virus (Jiang, X. et al., Science 250: 1580-1583 (1990); Matsui, SM et al., J. Clin. Invest. 87: 1456-1461 (1991)), retroviral GAG protein (WO96 / 30 23), retrotransposon Ty protein p1, hepatitis B virus surface protein (WO92 / 11291), human papillomavirus (WO98 / 15631), RNA phage, Ty, fr phage, GA phage, and Qβ phage. It is not limited to.

当業者に容易に明らかにされるように、本発明のＶＬＰは、いかなる特定の形態にも限定するものではない。粒子は、化学的に合成することができ、あるいは自然のまたは非自然の生物学的プロセスを経て合成することができる。例として、このタイプの実施形態は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。 As will be readily apparent to those skilled in the art, the VLPs of the present invention are not limited to any particular form. The particles can be synthesized chemically or can be synthesized via natural or non-natural biological processes. By way of example, this type of embodiment comprises a virus-like particle or a recombinant form thereof.

より特定の実施形態では、ＶＬＰは、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、***ウイルスの組換えポリペプチド、はしかウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えポリペプチド（例えばＨＢｃＡｇ）、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、フロックハウスウイルスの組換えポリペプチド、ヒトパピローマウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組換えポリペプチド、Ｔｙの組換えポリペプチド、ｆｒファージの組換えポリペプチド、ＧＡファージの組換えポリペプチド、およびＱβファージの組換えポリペプチドから選択された、組換えポリペプチドまたはその断片を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ウイルス様粒子はさらに、そのようなポリペプチドの１つまたは複数の断片、ならびにそのようなポリペプチドの変種を含むことができ、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ポリペプチドの変種は、例えばこれに対応する野生型との同一性が、アミノ酸レベルで少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％である。 In a more specific embodiment, the VLP is a rotavirus recombinant polypeptide, a Norwalk virus recombinant polypeptide, an alphavirus recombinant polypeptide, a foot-and-mouth disease virus recombinant polypeptide, or a measles virus recombinant polypeptide. Peptide, Sindbis virus recombinant polypeptide, Polyoma virus recombinant polypeptide, Retrovirus recombinant polypeptide, Hepatitis B virus recombinant polypeptide (eg HBcAg), Tobacco mosaic virus recombinant polypeptide Flockhouse virus recombinant polypeptide, human papillomavirus recombinant polypeptide, bacteriophage recombinant polypeptide, RNA phage recombinant polypeptide, Ty recombinant polypeptide, fr phage recombinant polypeptide, GA Aji recombinant polypeptides, and is selected from recombinant polypeptides of Qβ phage can include a recombinant polypeptide or fragment thereof, or consist essentially of these, or consists thereof. Virus-like particles can further comprise, consist essentially of, or consist of one or more fragments of such polypeptides, as well as variants of such polypeptides. A variant of a polypeptide is, for example, at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to the wild type at the amino acid level.

好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、およびｌ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択されることが好ましい。 In a preferred embodiment, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of an RNA phage recombinant protein or fragment thereof. RNA phages are a) bacteriophage Qβ, b) bacteriophage R17, c) bacteriophage fr, d) bacteriophage GA, e) bacteriophage SP, f) bacteriophage MS2, g) bacteriophage M11, h) bacteriophage. Preferably, it is selected from the group consisting of MX1, i) bacteriophage NL95, k) bacteriophage f2, and l) bacteriophage PP7.

本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子が、ＲＮＡバクテリオファージＱβまたはＲＮＡバクテリオファージｆｒの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In another preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of RNA bacteriophage Qβ or RNA bacteriophage fr recombinant protein or fragments thereof.

本発明の別の好ましい実施形態で、組換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In another preferred embodiment of the invention, the recombinant protein comprises, consists essentially of, or consists of an RNA phage coat protein.

したがって、ＶＬＰのカプシドを形成するＲＮＡファージコートタンパク質、あるいはカプシドまたはＶＬＰへの自己組織体に適合したバクテリオファージコートタンパク質の断片は、本発明のさらに好ましい実施形態である。例えばバクテリオファージＱβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えによって発現することができる。さらにそのような発現の後、これらのタンパク質は自然発生的にカプシドを形成する。さらにこれらのカプシドは、固有の繰返し編成を持つ構造を形成する。 Thus, RNA phage coat proteins that form the capsids of VLPs, or fragments of bacteriophage coat proteins that are adapted for self-assembly into capsids or VLPs are further preferred embodiments of the present invention. For example, bacteriophage Qβ coat protein is E. coli. It can be expressed recombinantly in E. coli. Furthermore, after such expression, these proteins spontaneously form capsids. In addition, these capsids form structures with unique repetitive organization.

本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ ＣＰを指す。配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ Ａ１タンパク質を指す。）、バクテリオファージＲ１７（配列番号１２；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３０３７４、ＳＰＣＰを指す。配列番号１６；受入番号、ＳＰＡｌタンパク質を指す。）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号２２）などの、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質、あるいはそのＣ末端から１００、１５０、または１８０のアミノ酸を失ったＣ末端切断型を、Ｑβコートタンパク質のカプシド組織体に組み込むことができる。一般に、カプシド組織体におけるＱβ ＣＰに対するＱβ Ａ１タンパク質のパーセンテージは、カプシドの形成を確実にするために、限定されている。 Certain preferred examples of bacteriophage coat proteins that can be used to prepare the compositions of the invention include bacteriophage Qβ (SEQ ID NO: 10; PIR database, accession number VCBPQβ, Qβ CP. SEQ ID NO: 11; No. AAA16663, refers to Qβ A1 protein.), Bacteriophage R17 (SEQ ID NO: 12; PIR accession number VCBPR7), bacteriophage fr (SEQ ID NO: 13; PIR accession number VCBPFR), bacteriophage GA (SEQ ID NO: 14; GenBank accession number) NP-040754), bacteriophage SP (SEQ ID NO: 15; GenBank accession number CAA30374, SP CP. SEQ ID NO: 16; accession number, SP Al protein), bacteriophage MS2 (SEQ ID NO: 17; PIR accession number VCBPM2), bacteriophage M11 (SEQ ID NO: 18; GenBank accession number AAC06250), bacteriophage MX1 (SEQ ID NO: 19; GenBank accession number AAC14699), bacteriophage NL95 (SEQ ID NO: 20; GenBank accession number AAC14704), Included are RNA bacteriophage coat proteins such as bacteriophage f2 (SEQ ID NO: 21; GenBank accession number P03611), bacteriophage PP7 (SEQ ID NO: 22). In addition, the A1 protein of bacteriophage Qβ, or a C-terminal truncated form that has lost 100, 150, or 180 amino acids from its C-terminus can be incorporated into the capsid tissue of the Qβ coat protein. In general, the percentage of Qβ A1 protein to Qβ CP in the capsid tissue is limited to ensure capsid formation.

Ｑβコートタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した場合、カプシドに自己組織化することも見出されている（ＫｏｚｌｏｖｓｋａＴＭ．他、遺伝子（ＧＥＮＥ）１３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ、Ｔ＝３の、準対称的な正二十面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造も解析された。カプシドは、コートタンパク質の１８０のコピーを含有するが、これらのコピーは、ジスルフィド架橋によって共有５量体または６量体に結合しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコートタンパク質のカプシドは極めて安定した状態になる。しかし、組換えＱβコートタンパク質から作製されたＶＬＰのカプシドは、ジスルフィド結合を介してカプシド内の他のサブユニットに結合していないかまたは不完全に結合しているサブユニットを含有する可能性がある。したがって組換えＱβカプシドを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに導入することによって、モノマーＱβコートタンパク質に対応するバンドならびにＱβコートタンパク質の６量体または５量体に対応するバンドが目に見えるようになる。不完全なジスルフィド結合サブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、２量体、３量体、または４量体のバンドとしても現れる。Ｑβカプシドタンパク質は、有機溶媒および編成剤に対しても異常な耐性を示す。意外なことに本発明者等は、ＤＭＳＯおよびアセトニトリルの濃度が３０％程度でありグアニジン濃度が１Ｍ程度であると、カプシドの安定性に影響が生じないことを観察した。Ｑβコートタンパク質のカプシドの安定性が高いことは、本発明による哺乳類およびヒトの免疫化およびワクチン接種で使用する場合に、特に有利な特徴である。 Qβ coat protein is E. coli. It has also been found to self-assemble into capsids when expressed in E. coli (Kozlovska ™ et al., Gene (GENE) 137: 133-137 (1993)). The resulting capsid or virus-like particles exhibited a quasi-symmetric icosahedral phage-like capsid structure with a diameter of 25 nm and T = 3. Furthermore, the crystal structure of phage Qβ was also analyzed. The capsid contains 180 copies of the coat protein, but these copies are linked to the covalent pentamer or hexamer by disulfide bridges (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543). 5554 (1996)), the capsid of Qβ coat protein becomes very stable. However, VLP capsids made from recombinant Qβ coat proteins may contain subunits that are not or incompletely bound to other subunits in the capsid via disulfide bonds. is there. Thus, by introducing recombinant Qβ capsid into non-reducing SDS-PAGE, a band corresponding to the monomeric Qβ coat protein as well as a band corresponding to the hexamer or pentamer of Qβ coat protein becomes visible. Incomplete disulfide bond subunits also appear as dimer, trimer, or tetramer bands in non-reducing SDS-PAGE. Qβ capsid protein also shows abnormal resistance to organic solvents and knitting agents. Surprisingly, the present inventors have observed that when the concentration of DMSO and acetonitrile is about 30% and the guanidine concentration is about 1M, the stability of capsid is not affected. The high stability of the capsid of Qβ coat protein is a particularly advantageous feature when used in mammalian and human immunization and vaccination according to the present invention.

Ｅ．ｃｏｌｉでの発現後、Ｑβコートタンパク質のＮ末端メチオニンは、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）に記載されているＮ末端Ｅｄｍａｎ配列決定によって本発明者等が観察したように、通常は除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコートタンパク質から構成されたＶＬＰ、あるいはＮ末端メチオニンが切断されまたは存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内にある。 E. After expression in E. coli, the N-terminal methionine of the Qβ coat protein was found in Stoll, E., et al. J. et al. Biol. Chem. 252: 990-993 (1977), usually removed as we observed by N-terminal Edman sequencing. VLPs composed of Qβ coat protein from which the N-terminal methionine has not been removed, or VLPs comprising a mixture of Qβ coat proteins in which the N-terminal methionine is cleaved or present are also within the scope of the present invention.

別のＲＮＡファージコートタンパク質も、細菌宿主内で発現した後に自己組織化することが示されている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．ＮａｕｋＳＳＳＲ２８７：４５２〜４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージカプシドは、コートタンパク質の他に、いわゆる読抜けタンパク質Ａ１および成熟タンパク質Ａ２を含有する。Ａ１はＵＧＡ停止コドンで抑制によって生成され、その長さは３２９ａａである。本発明で使用されるファージＱβ組換えコートタンパク質のカプシドは、Ａ２溶解タンパク質に欠けており、宿主からのＲＮＡを含有する。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクル中に翻訳抑制因子として働くレプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位のステムループと相互に作用する。この相互作用の配列および構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８：７１〜７６（１９８９）；Ｌｉｍ，Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。ステムループおよびＲＮＡは一般に、ウイルス組織体に関与することが知られている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５５４（１９９６））。 Another RNA phage coat protein has also been shown to self-assemble after expression in bacterial hosts (Kastelein, RA. Et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. Et al.). Dokl.Akad.Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). The Qβ phage capsid contains, in addition to the coat protein, so-called read-through protein A1 and mature protein A2. A1 is generated by suppression at the UGA stop codon and its length is 329aa. The capsid of the phage Qβ recombinant coat protein used in the present invention lacks the A2 lytic protein and contains RNA from the host. The coat protein of RNA phage is an RNA-binding protein that interacts with the stem loop of the ribosome binding site of the replicase gene that acts as a translational repressor during the viral life cycle. The sequence and structural elements of this interaction are known (Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC., Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim, F. et al., J. Biol. Chem. 271. : 31839-31845 (1996)). Stem loops and RNA are generally known to be involved in viral tissues (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)).

本発明の別の好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質、好ましくは上述のＲＮＡファージの変異コートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換によって少なくとも１つのリジン残基を除去することにより、または置換によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させ、あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失により、または挿入によって少なくとも１つのリジン残基を付加することにより、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質を変性させた。 In another preferred embodiment of the present invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a RNA phage recombinant protein or fragment thereof, wherein the recombinant protein is an RNA phage mutation. It comprises, consists essentially of, or consists of a coat protein, preferably a mutant coat protein of the RNA phage described above. In another preferred embodiment, the mutant phage protein of the RNA phage is denatured by removing at least one lysine residue by substitution, or by adding at least one lysine residue by substitution, or at least 1 RNA phage mutant coat proteins were denatured by deletion of one lysine residue or by addition of at least one lysine residue by insertion.

別の好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、あるいは配列番号１０と配列番号１１のアミノ酸配列を有するコートタンパク質の混合物、あるいは配列番号１１の変異体を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。 In another preferred embodiment, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a recombinant protein of RNA bacteriophage Qβ or a fragment thereof, the recombinant protein comprising the amino acid of SEQ ID NO: 10 A coat protein having the sequence, a mixture of coat proteins having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, or a variant of SEQ ID NO: 11, or consisting essentially of, or consisting of, an N-terminal methionine Is preferably cut.

本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子はＱβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、変異Ｑβコートタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。別の好ましい実施形態では、置換による少なくとも１つのリジン残基の除去によって、または置換による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。あるいは、少なくとも１つのリジン残基の欠失によって、または挿入による少なくとも１つのリジン残基の付加によって、これらの変異コートタンパク質を変性させた。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, or consists essentially of, or consists of a recombinant protein of Qβ, or a fragment thereof, wherein the recombinant protein comprises a mutant Qβ coat protein, Or essentially consists of or consists of these. In another preferred embodiment, these mutant coat proteins were denatured by removal of at least one lysine residue by substitution or by addition of at least one lysine residue by substitution. Alternatively, these mutant coat proteins were denatured by deletion of at least one lysine residue or by addition of at least one lysine residue by insertion.

Ｑβタンパク質のカプシド表面には４個のリジン残基が露出する。露出したリジン残基に代わってアルギニンが配置されたＱβ変異体も、本発明で使用することができる。したがって本発明を実施する際には、下記のＱβコートタンパク質変異体および変異Ｑβ ＶＬＰを使用することができる：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号２４）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、「Ｑβ−２５１」（配列番号２６）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。したがって本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列、ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列、ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列、ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列、およびｅ）配列番号２７のアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、変異Ｑβコートタンパク質の組換えタンパク質を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。上述のＱβコートタンパク質、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびカプシドの構成体、発現、および精製のそれぞれは、２００２年１月１８日に本願の譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に開示されている。特に本明細書では、上述の出願の実施例１８を参照する。 Four lysine residues are exposed on the capsid surface of the Qβ protein. Qβ variants in which arginine is placed in place of the exposed lysine residue can also be used in the present invention. Therefore, in carrying out the present invention, the following Qβ coat protein variants and mutant Qβ VLPs can be used: “Qβ-240” (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), “Qβ-243” (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 24), "Qβ-250" (Lys2-Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO: 25), "Qβ-251" (SEQ ID NO: 26) and "Qβ-259" (Lys2-Arg, Lys16) -Arg; SEQ ID NO: 27). Accordingly, in a further preferred embodiment of the present invention, the virus-like particle comprises a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, c) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 And e) comprising, consisting essentially of, or consisting of a recombinant protein of a mutant Qβ coat protein, including a protein having an amino acid sequence selected from the group of amino acid sequences of SEQ ID NO: 27. Each of the constructs, expression, and purification of the Qβ coat protein, mutant Qβ coat protein VLP and capsid described above are described in pending US application Ser. No. 10/050, filed Jan. 18, 2002 by the assignee of the present application. No. 902. In particular, reference is made here to Example 18 of the above-mentioned application.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、Ｑβの組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなり、この組換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１つと対応するＡ１タンパク質との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a recombinant protein of Qβ or a fragment thereof, wherein the recombinant protein comprises Contains, consists essentially of, or consists of any one and a corresponding A1 protein.

本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a recombinant protein of RNA phage AP205 or a fragment thereof.

ＡＰ２０５ゲノムは、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼ、および関連するファージに存在しない２つのオープンリーディングフレームからなり；溶解遺伝子およびオープンリーディングフレームは、成熟遺伝子の翻訳で役割を果たす（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．、他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号９４）から発現することができるが、これはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含むものである。あるいはＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流でｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。いずれの手法も、その全体を参照により援用する２００２年７月１６日に本願譲受人によって出願された「分子抗原アレイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎｔｉｇｅｎＡｒｒａｙｓ）」という名称の同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、タンパク質を発現させ、カプシドを形成する。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから得られたベクターであり、これらのベクターでクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御される（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３〜５８（配列番号７９）は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつＡＰ２０５コートタンパク質のＡＴＧ開示コドンのすぐ上流に、以下の配列の推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流でありかつ開始コドンの上流に、シャイン−ダルガーノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、下線はシャイン−ダルガーノ配列）。 The AP205 genome consists of two open reading frames that are not present in the mature protein, coat protein, replicase, and related phage; the lytic and open reading frames play a role in the translation of the mature gene (Klovins, J., et al. J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). AP205 coat protein can be expressed from plasmid pAP283-58 (SEQ ID NO: 94), which is a derivative of pQb10 (Kozlovska, TM et al., Gene 137: 133-37 (1993). ), Which contains an AP205 ribosome binding site. Alternatively, AP205 coat protein can be cloned into pQb185 downstream of the ribosome binding site present in the vector. Both approaches are described in a co-pending US provisional patent application entitled “Molecular Antigen Arrays” filed by the assignee of this application on July 16, 2002, which is incorporated by reference in its entirety. As such, proteins are expressed and capsids are formed. The vectors pQb10 and pQb185 are vectors derived from the pGEM vectors, and the expression of genes cloned in these vectors is controlled by the trp promoter (Kozlovska, TM et al., Gene 137: 133). -37 (1993)). Plasmid PAP283～58 (SEQ ID NO: 79) is immediately upstream of the ATG disclosure codon downstream a it is and AP205 coat protein XbaI site, including putative AP205 ribosomal binding site in the following sequence: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGT GAGGAA AATCACatg. Vector pQb185 contains a Shine-Dalgarno sequence downstream of the XbaI site and upstream of the start codon (tctagaTTAAACCCAACGCGT AGGAG TCAGGCCatg, underlined Shine-Dalgarno sequence).

本発明のさらに好ましい実施形態で、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a recombinant coat protein of RNA phage AP205 or a fragment thereof.

したがって本発明のこの好ましい実施形態は、カプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。そのようなタンパク質は、組換えによって発現させ、または自然源から調製する。細菌内で生成されたＡＰ２０５コートタンパク質は、電子顕微鏡（ＥＭ）および免疫拡散法によって明らかにされるように、自発的にカプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号８０）によって形成されたカプシドおよびＡＰ２０５ＲＮＡファージのコートタンパク質によって形成されたカプシドの構造的特性は、ＥＭで見た場合にほとんど見分けがつかない。ＡＰ２０５ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／又は抗原決定基に結合して、繰り返し向きが定められた抗原及び／又は抗原決定基を示すワクチン構成体を生成することができる。そのように示された抗原に対して高い力価が引き出され、結合した抗原及び／又は抗原決定基は抗体分子と相互に作用し易く、免疫原性であることが示される。 Thus, this preferred embodiment of the present invention comprises an AP205 coat protein that forms a capsid. Such proteins are expressed recombinantly or prepared from natural sources. AP205 coat protein produced in bacteria spontaneously forms capsids as revealed by electron microscopy (EM) and immunodiffusion methods. The structural properties of the capsid formed by the AP205 coat protein (SEQ ID NO: 80) and the capsid formed by the AP205 RNA phage coat protein are almost indistinguishable when viewed by EM. AP205 VLPs are highly immunogenic and can bind to antigens and / or antigenic determinants to produce vaccine constructs that exhibit repetitively directed antigens and / or antigenic determinants. High titers are elicited against the antigens so shown, indicating that the bound antigen and / or antigenic determinant is likely to interact with the antibody molecule and is immunogenic.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a recombinant mutant coat protein of RNA phage AP205 or a fragment thereof.

本発明を実施する際、アミノ酸５でプロリンがトレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号８１）を含む、組織体−ＡＰ２０５ＶＬＰのコンピテント変異形態を使用してもよく、さらに好ましい本発明の実施形態になる。これらのＶＬＰ、自然源から得られたＡＰ２０５ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウイルス粒子を抗原に結合して、本発明による抗原の規則的で反復性のアレイを生成することができる。 In practicing the present invention, a competent mutant form of tissue-AP205 VLP comprising the AP205 coat protein (SEQ ID NO: 81) wherein amino acid 5 is substituted with proline by threonine may be used, and further preferred in accordance with the present invention. It becomes an embodiment. These VLPs, AP205 VLPs obtained from natural sources, or AP205 viral particles can be bound to antigens to produce a regular and repetitive array of antigens according to the present invention.

ＡＰ２０５Ｐ５−Ｔ変異コートタンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号８２）から発現することができるが、これはｐＱｂ１８５から直接誘導されたものであり、またＱβコートタンパク質遺伝子の代わりに変異ＡＰ２０５被覆タンパク質遺伝子を含有するものである。ＡＰ２０５コートタンパク質の発現用ベクターは、ＡＰ２０５コートタンパク質の発現を目的としてＥ．ｃｏｌｉに形質移入される。 The AP205 P5-T mutant coat protein can be expressed from the plasmid pAP281-32 (SEQ ID NO: 82), which is derived directly from pQb185 and is a mutant AP205 coat protein instead of the Qβ coat protein gene. It contains a gene. The AP205 coat protein expression vector is an E. coli strain for the purpose of expressing AP205 coat protein. E. coli is transfected.

ＶＬＰへの自己組織体に繋がるコートタンパク質および変異コートタンパク質をそれぞれ発現させるための方法は、「分子抗原アレイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎｔｉｇｅｎＡｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１６日に本願譲受人により出願された、同時係属の米国仮特許出願に記載されており、その全体を参照により援用する。適切なＥ．ｃｏｌｉ株には、Ｅ．ｃｏｌｉＫ８０２、ＪＭ１０９、ＲＲ１が含まれるが、これらに限定されない。適切なベクターおよび株およびそれらの組合せは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、コートタンパク質および変異コートタンパク質の発現をそれぞれ試験することにより確認でき、また、カプシドの形成および組織体は、任意選択でまずゲルろ過によりカプシドを精製し、その後、免疫拡散アッセイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ試験）または電子顕微鏡でそれらを試験することによって、確認できる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ、Ｔ．Ｍ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜３７（１９９３））。 A method for expressing each coat protein and mutant coat protein linked to self-assembly into VLP was filed by the assignee of the present application on July 16, 2002, entitled “Molecular Antigen Arrays”. As described in co-pending US Provisional Patent Application, which is incorporated by reference in its entirety. Suitable E. E. coli strains include E. coli strains. E. coli K802, JM109, and RR1 are included, but are not limited thereto. Appropriate vectors and strains and combinations thereof can be confirmed by SDS-PAGE by examining the expression of coat protein and mutant coat protein, respectively, and capsid formation and tissue can optionally be first gel-filtered. Capsids can be purified and then confirmed by examining them in an immunodiffusion assay (Ouchterlony test) or electron microscopy (Kozlovska, TM et al., Gene 137: 133-37 (1993)).

ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現したＡＰ２０５コートタンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉの細胞質内でのプロセッシングが原因で、初期メチオンニンアミノ酸に欠けている可能性がある。ＡＰ２０５ＶＬＰの切断形態、非切断形態、またはその混合物は、本発明のさらに好ましい実施形態である。 The AP205 coat protein expressed from the vectors pAP283-58 and pAP281-32 is E. coli. It is possible that the initial methionine amino acid is lacking due to processing in the cytoplasm of Coli. A truncated form, non-cut form of AP205 VLP, or a mixture thereof is a further preferred embodiment of the present invention.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換え変異コートタンパク質またはその断片との混合物を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises a mixture of, or essentially consists of, a recombinant coat protein of RNA phage AP205 or a fragment thereof and a recombinant mutant coat protein of RNA phage AP205 or a fragment thereof. Or consist of these.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質または組換え変異コートタンパク質の断片を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる。 In a further preferred embodiment of the invention, the virus-like particle comprises, consists essentially of, or consists of a fragment of a recombinant coat protein or recombinant mutant coat protein of RNA phage AP205.

ＶＬＰおよびカプシドにそれぞれ組織化可能な組換えＡＰ２０５コートタンパク質断片も、本発明の実施に有用である。これらの断片は、コートタンパク質および変異コートタンパク質それぞれの内部またはその末端における欠失によって生成することができる。コートタンパク質および変異コートタンパク質の配列への挿入、あるいはコートタンパク質および変異コートタンパク質の配列との抗原配列の融合、およびＶＬＰへの組織体との適合性は、本発明の別の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質および粒子がそれぞれ得られる。コートタンパク質配列への挿入、欠失、および融合の結果と、これらがＶＬＰへの組織体に適合するか否かは、電子顕微鏡によって決定することができる。 Recombinant AP205 coat protein fragments that can be organized into VLPs and capsids, respectively, are also useful in the practice of the present invention. These fragments can be generated by deletions within or at the ends of each coat protein and mutant coat protein. Insertion of coat proteins and mutant coat proteins into sequences, or fusion of antigen sequences with coat protein and mutant coat protein sequences, and compatibility with tissues to VLPs is another embodiment of the present invention; Chimeric AP205 coat protein and particles are obtained, respectively. The results of insertions, deletions, and fusions into the coat protein sequence and whether they fit into the organization to VLP can be determined by electron microscopy.

上述のＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質断片、およびキメラコートタンパク質によって形成された粒子は、その全体を参照により援用する「分子抗原アレイ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｎｔｉｇｅｎＡｒｒａｙｓ）」という名称の、２００２年７月１６日に本願譲受人により出願された同時係属の米国仮特許出願に記載されているように、沈殿による分画工程と、例えばセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラム、およびこれらの組合せを使用したゲルろ過による精製工程との組合せにより、純粋な形で単離することができる。ウイルス様粒子を単離するためのその他の方法が当技術分野で知られており、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離するのに使用することができる。例えば、その全体を本明細書に参照により援用する米国特許第４，９１８，１６６号には、酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離するために超遠心分離を使用することが記載されている。 Particles formed by the above-mentioned AP205 coat protein, coat protein fragment, and chimeric coat protein were filed on July 16, 2002, named “Molecular Antigen Arrays”, which is incorporated by reference in its entirety. As described in the co-pending US provisional patent application filed by the assignee, the fractionation step by precipitation, eg, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose CL-6B columns, and combinations thereof, It can be isolated in pure form by combination with the purification step by gel filtration used. Other methods for isolating virus-like particles are known in the art and can be used to isolate virus-like particles (VLPs) of bacteriophage AP205. For example, US Pat. No. 4,918,166, which is incorporated herein by reference in its entirety, describes the use of ultracentrifugation to isolate VLPs of yeast retrotransposon Ty.

いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）４：５４３〜５５４（１９９６））。そのような情報を使用して、表面が露出した残基を同定することができ、したがってＲＮＡファージコートタンパク質は、１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を挿入または置換することによって挿入できるように、変性させることができる。その結果、バクテリオファージコートタンパク質が変性した形のものも、本発明で使用することができる。したがって、本発明の組成物を調製するにあたり、カプシドまたはカプシド様構造（例えばバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、およびバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）を形成するタンパク質の変種も使用することができる。 The crystal structure of several RNA bacteriophages has been determined (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-554 (1996)). Such information can be used to identify surface-exposed residues, so that an RNA phage coat protein can be inserted by inserting or substituting one or more reactive amino acid residues. Can be denatured. As a result, a denatured form of the bacteriophage coat protein can also be used in the present invention. Thus, in preparing the compositions of the present invention, capsids or capsid-like structures (eg, bacteriophage Qβ, bacteriophage R17, bacteriophage fr, bacteriophage GA, bacteriophage SP, and bacteriophage MS2 coat proteins) are formed. Protein variants can also be used.

上記で論じた変種タンパク質の配列は、これに対応する野生型の配列とは異なるが、これらの変種タンパク質は一般に、カプシドまたはカプシド様構造を形成する能力を維持することになる。したがって本発明はさらに、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質の変種をさらに含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含み、同様に、そのような組成物およびワクチン組成物のそれぞれと、そのような組成物の調製に使用される個々のタンパク質サブユニットと、これらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する方法も含む。したがって本発明の範囲内には、カプシドまたはカプシド様構造を形成しかつカプシドまたはカプシド様構造を会合し形成する能力を維持する野生型タンパク質の変種形態が含まれる。 Although the variant protein sequences discussed above are different from the corresponding wild-type sequences, these variant proteins will generally retain the ability to form capsids or capsid-like structures. Accordingly, the invention further includes compositions and vaccine compositions, respectively, further comprising capsids or protein variants that form capsid-like structures, as well as each such composition and vaccine composition, Also included are methods of preparing individual protein subunits used in the preparation of the compositions and nucleic acid molecules encoding these protein subunits. Thus, within the scope of the present invention are variants of wild-type proteins that form capsids or capsid-like structures and maintain the ability to associate and form capsids or capsid-like structures.

その結果、本発明はさらに、規則的なアレイを形成して固有の繰返し構造をそれぞれ有する、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなる組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。 As a result, the present invention further provides amino acids that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to the wild-type protein, each having a unique repeating structure forming a regular array. Each comprises a composition and a vaccine composition comprising, consisting essentially of, or consisting of sequences.

本発明の範囲内には、本発明の組成物を調製するのに使用されるタンパク質をコードする核酸分子がさらに含まれる。 Further included within the scope of the present invention are nucleic acid molecules that encode proteins used to prepare the compositions of the present invention.

その他の実施形態では、本発明はさらに、配列番号１０〜２７で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。 In other embodiments, the invention further comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to any of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10-27, Alternatively, a composition comprising a protein consisting essentially of or consisting of these is included.

本発明での使用に適するタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造あるいはＶＬＰを形成するタンパク質のＣ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。 Proteins suitable for use in the present invention also include capsids or capsid-like structures or C-terminal truncated variants of proteins that form VLPs. Specific examples of such truncated variants include proteins having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 10-27, in which case 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12 , 14, 15, or 17 amino acids have been removed from the C-terminus. Typically, these C-terminal truncation mutants will maintain the ability to form capsids or capsid structures.

本発明での使用に適する別のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するタンパク質のＮ末端切断型変異体も含む。そのような切断型変異体の特定の例には、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれ、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸はＮ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。 Other proteins suitable for use in the present invention also include N-terminal truncated variants of proteins that form capsids or capsid-like structures. Specific examples of such truncated variants include proteins having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 10-27, in which case 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12 , 14, 15, or 17 amino acids have been removed from the N-terminus. Typically, these N-terminal truncated variants will maintain the ability to form capsids or capsid structures.

本発明での使用に適する追加のタンパク質は、カプシドまたはカプシド様構造を形成するＮ末端およびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、配列番号１０〜２７のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、この場合、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＣ末端から除去されている。典型的な場合、これらのＮ末端およびＣ末端切断型変異体は、カプシドまたはカプシド用構造を形成する能力を維持することになる。 Additional proteins suitable for use in the present invention include N-terminal and C-terminal truncated variants that form capsids or capsid-like structures. Suitable truncated variants include proteins having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 10-27, where 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 Amino acids have been removed from the N-terminus and 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids have been removed from the C-terminus. Typically, these N-terminal and C-terminal truncation mutants will maintain the ability to form capsids or capsid structures.

本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるタンパク質を含んだ組成物を含む。 The present invention further includes, consists essentially of, or consists essentially of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to the truncated variants described above. And a composition containing the protein.

したがって本発明は、カプシドまたはＶＬＰを形成するタンパク質から調製された組成物およびワクチン組成物と、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰまたはカプシドからこれらの組成物を調製する方法と、これらのタンパク質サブユニットおよびこれらのサブユニットをコードする核酸分子を調製する方法と、本発明のこれらの組成物を使用して、個体にワクチン接種しかつ／または個体に免疫応答を誘発させる方法を含む。 Accordingly, the present invention relates to compositions and vaccine compositions prepared from proteins that form capsids or VLPs, methods of preparing these compositions from individual protein subunits and VLPs or capsids, and the protein subunits and Methods of preparing nucleic acid molecules encoding these subunits and methods of using these compositions of the invention to vaccinate an individual and / or elicit an immune response in an individual.

前述のように、本発明は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を含む。１つのさらに好ましい実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇの断片からなる。別の実施形態では、本発明の組成物に使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇタンパク質の断片からなるが、これはいくつかの遊離システイン残基を排除しまたはその数が減少するように変性させたものである。Ｚｈｏｕ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたＨＢｃＡｇがカプシドを会合し形成する能力を維持することを実証した。したがって本発明の組成物での使用に適するＶＬＰは、天然に存在するシステイン残基の１つまたは複数が欠失しまたは別のアミノ酸残基（例えばセリン残基）で置換された変性ＨＢｃＡｇまたはその断片を含んだものを含む。 As mentioned above, the present invention includes virus-like particles or recombinant forms thereof. In one more preferred embodiment, the particles used in the composition of the invention consist of hepatitis B core protein (HBcAg) or a fragment of HBcAg. In another embodiment, the particles used in the composition of the invention consist of hepatitis B core protein (HBcAg) or a fragment of HBcAg protein, which excludes some or some number of free cysteine residues. Is denatured so as to decrease. Zhou et al. (J. Virol. 66: 5393-5398 (1992)) demonstrated that HBcAg modified to remove naturally occurring cysteine residues maintains the ability to associate and form capsids. Accordingly, a VLP suitable for use in the compositions of the present invention is a modified HBcAg or one of its naturally occurring cysteine residues in which one or more of the cysteine residues have been deleted or replaced with another amino acid residue (eg, a serine residue). Including those containing fragments.

ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質をプロセッシングされることによって生成されたタンパク質である。ＨＢｃＡｇのいくつかのアイソタイプが同定され、それらのアミノ酸配列は、当業者が容易に入手可能である。ほとんどの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、ＨＢｃＡｇをプロセッシングされた形のもの（すなわちＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を除去したＨＢｃＡｇ）を使用して調製される。 HBcAg is a protein produced by processing a hepatitis B core antigen precursor protein. Several isotypes of HBcAg have been identified and their amino acid sequences are readily available to those skilled in the art. In most cases, each of the compositions and vaccine compositions of the invention is prepared using a processed form of HBcAg (ie, HBcAg with the N-terminal leader sequence of the hepatitis B core antigen precursor protein removed). Is done.

さらに、プロセッシングが行われない条件下でＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にＨＢｃＡｇは、「プロセッシングされた」形で発現させる。例えば、細胞質に向けてタンパク質を発現させるＥ．ｃｏｌｉ発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成する場合、一般にこれらのタンパク質は、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現することになる。 Furthermore, when producing HBcAg under non-processing conditions, HBcAg is generally expressed in a “processed” form. For example, E. coli expressing proteins towards the cytoplasm. When the E. coli expression system is used to produce the HBcAg of the present invention, these proteins will generally be expressed in the absence of the N-terminal leader sequence of the hepatitis B core antigen precursor protein.

本発明で使用することができるＢ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、例えばＷＯ００／３２２２７、本明細書では特に実施例１７〜１９および２１〜２４と、ＷＯ０１／８５２０８、本明細書では特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１、および４１と、２００２年１月１８日に本願譲受人によって出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２に開示されている。後者の出願では、特に実施例２３、２４、３１、および５１に記載されている。３つの文書のすべてを参照により本明細書に明らかに援用する。 The preparation of hepatitis B virus-like particles that can be used in the present invention is for example carried out in WO 00/32227, especially in Examples 17-19 and 21-24 here, and in WO 01/85208, especially here. Examples 17-19, 21-24, 31, and 41 and pending US application Ser. No. 10 / 050,902 filed Jan. 18, 2002 by the assignee of the present application. The latter application is described in particular in Examples 23, 24, 31, and 51. All three documents are expressly incorporated herein by reference.

また本発明は、１つまたは複数の追加のシステイン残基を欠失させまたは置換するように変性したＨＢｃＡｇ変種も含む。遊離システイン残基がいくつかの化学副反応に関与し得ることが、当技術分野で知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、あるいは例えば他の物質と共に併用療法で注入されまたは形成された化学物質または代謝産物との反応、あるいはＵＶ光に曝露することによるヌクレオチドとの直接酸化および反応が含まれる。毒性付加物は、ＨＢｃＡｇが核酸に結合する傾向が強い点を特に考慮して、このように生成される。したがって毒性付加物は、それぞれが個々に低濃度で存在するが一緒になると毒性レベルに達する複数の種の間に分布する。 The present invention also includes HBcAg variants that have been modified to delete or replace one or more additional cysteine residues. It is known in the art that free cysteine residues can participate in several chemical side reactions. These side reactions include disulfide exchange, or reaction with chemicals or metabolites injected or formed in combination therapy with other substances, for example, or direct oxidation and reaction with nucleotides by exposure to UV light. included. Toxic adducts are produced in this way, especially considering that HBcAg has a strong tendency to bind to nucleic acids. Thus, toxic adducts are distributed among multiple species, each of which is present individually at low concentrations, but when combined, reaches a toxicity level.

上記事項に鑑み、天然に存在するシステイン残基が除去されるよう変性させたワクチン組成物にＨＢｃＡｇを使用することの１つの利点とは、抗原または抗原決定基が結着したときに毒性種が結合可能な部位が、数のうえでは減少しまたはすべてなくなることである。 In view of the above, one advantage of using HBcAg in a vaccine composition that has been modified to remove naturally occurring cysteine residues is that the toxic species are not bound when the antigen or antigenic determinant is attached. The number of sites capable of binding is reduced or eliminated in number.

本発明の実施に際して使用に適した天然に生ずるＨＢｃＡｇ変種の数が確認されている。例えばＹｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号２８の位置９７に対応した位置のイソロイシン残基をロイシン残基またはフェニルアラニン残基で置換した変種について述べている。いくつかのＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列が、いくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体変種と同様にＧｅｎＢａｎｋレポートＡＡＦ１２１２４０（配列番号２９）、ＡＦ１２１２３９（配列番号３０）、Ｘ８５２９７（配列番号３１）、Ｘ０２４９６（配列番号３２）、Ｘ８５３０５（配列番号３３）、Ｘ８５３０３（配列番号３４）、ＡＦ１５１７３５（配列番号３５）、Ｘ８５２５９（配列番号３６）、Ｘ８５２８６（配列番号３７）、Ｘ８５２６０（配列番号３８）、Ｘ８５３１７（配列番号３９）、Ｘ８５２９８（配列番号４０）、ＡＦ０４３５９３（配列番号４１）、Ｍ２０７０６（配列番号４２）、Ｘ８５２９５（配列番号４３）、Ｘ８０９２５（配列番号４４）、Ｘ８５２８４（配列番号４５）、Ｘ８５２７５（配列番号４６）、Ｘ７２７０２（配列番号４７）、Ｘ８５２９１（配列番号４８）、Ｘ６５２５８（配列番号４９）、Ｘ８５３０２（配列番号５０）、Ｍ３２１３８（配列番号５１）、Ｘ８５２９３（配列番号５２）、Ｘ８５３１５（配列番号５３）、Ｕ９５５５１（配列番号５４）、Ｘ８５２５６（配列番号５５）、Ｘ８５３１６（配列番号５６）、Ｘ８５２９６（配列番号５７）、ＡＢ０３３５５９（配列番号５８）、Ｘ５９７９５（配列番号５９）、Ｘ８５２９９（配列番号６０）、Ｘ８５３０７（配列番号６１）、Ｘ６５２５７（配列番号６２）、Ｘ８５３１１（配列番号６３）、Ｘ８５３０１（配列番号６４）、Ｘ８５３１４（配列番号６５）、Ｘ８５２８７（配列番号６６）、Ｘ８５２７２（配列番号６７）、Ｘ８５３１９（配列番号６８）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６９）、Ｘ８５２８５（配列番号７０）、ＡＢ０１０２８９（配列番号７１）、ＡＦ１２１２４２（配列番号７２）、Ｍ９０５２０（配列番号７３）、Ｐ０３１５３（配列番号７４）、ＡＦ１１０９９９（配列番号７５）、およびＭ９５５８９（配列番号７６）に開示されており、そのそれぞれの開示を参照により本明細書に援用する。これらのＨＢｃＡｇ変種は、配列番号７７における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２、および１８３に位置付けられたアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めたいくつかの位置で、アミノ酸配列が異なっている。本発明の組成物での使用に適する他のＨＢｃＡｇ変種、および本明細書の開示に従ってさらに変性し得るものが、ＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８、およびＷＯ００／２１４４７８に記載されている。 A number of naturally occurring HBcAg variants suitable for use in the practice of this invention have been identified. For example, Yuan et al. (J. Virol. 73: 10122-10128 (1999)) describe variants in which the isoleucine residue at the position corresponding to position 97 of SEQ ID NO: 28 is replaced with a leucine or phenylalanine residue. The amino acid sequences of some HBcAg variants, as well as some hepatitis B core antigen precursor variants, are reported as GenBank reports AAF121240 (SEQ ID NO: 29), AF121239 (SEQ ID NO: 30), X85297 (SEQ ID NO: 31), X02496 (sequence) No. 32), X85305 (SEQ ID NO: 33), X85303 (SEQ ID NO: 34), AF151735 (SEQ ID NO: 35), X85259 (SEQ ID NO: 36), X85286 (SEQ ID NO: 37), X85260 (SEQ ID NO: 38), X85317 (SEQ ID NO :) 39), X85298 (SEQ ID NO: 40), AF043593 (SEQ ID NO: 41), M20706 (SEQ ID NO: 42), X85295 (SEQ ID NO: 43), X80925 (SEQ ID NO: 44), X85284 (SEQ ID NO: 45), X85275 (SEQ ID NO: 46) ), 72702 (SEQ ID NO: 47), X85291 (SEQ ID NO: 48), X65258 (SEQ ID NO: 49), X85302 (SEQ ID NO: 50), M32138 (SEQ ID NO: 51), X85293 (SEQ ID NO: 52), X85315 (SEQ ID NO: 53), U95551 (SEQ ID NO: 54), X85256 (SEQ ID NO: 55), X85316 (SEQ ID NO: 56), X85296 (SEQ ID NO: 57), AB033559 (SEQ ID NO: 58), X59795 (SEQ ID NO: 59), X85299 (SEQ ID NO: 60), X85307 ( Sequence number 61), X65257 (sequence number 62), X85311 (sequence number 63), X85301 (sequence number 64), X85314 (sequence number 65), X85287 (sequence number 66), X85272 (sequence number 67), X85319 (sequence) Number 68), A 010289 (SEQ ID NO: 69), X85285 (SEQ ID NO: 70), AB010289 (SEQ ID NO: 71), AF121242 (SEQ ID NO: 72), M90520 (SEQ ID NO: 73), P03153 (SEQ ID NO: 74), AF110999 (SEQ ID NO: 75), and M95589 (SEQ ID NO: 76), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference. These HBcAg variants are positions 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64 in SEQ ID NO: 77. , 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141 The amino acid sequences differ at several positions including amino acid residues corresponding to amino acid residues located at 147, 149, 157, 176, 178, 182, and 183. Other HBcAg variants suitable for use in the compositions of the invention, and those that can be further modified according to the disclosure herein, are described in WO 00/198333, WO 00/177158, and WO 00/214478.

上述のように、一般にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわちリーダー配列にかけたもの）が、本発明の組成物およびワクチン組成物でそれぞれ使用される。本発明は、ワクチン組成物、ならびに上述の変種ＨＢｃＡｇを用いるこれらの組成物の使用方法を含む。 As noted above, generally processed HBcAg (ie, subjected to a leader sequence) is used in the compositions and vaccine compositions of the invention, respectively. The present invention includes vaccine compositions, as well as methods of using these compositions with the variant HBcAg described above.

ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記野生型アミノ酸配列の１つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの既知のコンピュータプログラムを従来通り使用して決定することができる。例えば特定の配列が参照アミノ酸配列と９５％同一であるか否かを決定するのに、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意のその他の配列アライメントプログラムを使用する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが完全長の参照アミノ酸配列全体にわたって計算されるように、かつ参照配列のアミノ酸残基の総数の５％までが相同なギャップが可能になるように設定する。 Whether the amino acid sequence of the polypeptide has an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to one of the wild-type amino acid sequences, such as the Bestfit program, etc. Can be determined using conventional computer programs. For example, when using Bestfit or any other sequence alignment program to determine whether a particular sequence is 95% identical to a reference amino acid sequence, the parameter is a reference amino acid whose percentage of identity is full length. Set to allow for homologous gaps as calculated over the entire sequence and up to 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence.

配列番号２９〜７２および７３〜７７に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ変種および前駆体は、互いに相対的に類似している。したがって、配列番号７７の特定の位置に対応する位置に位置付けられたＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸残基を言う場合は、配列番号７７で示されるアミノ酸配列のその位置に存在するアミノ酸残基を指す。ＨＢｃＡｇ変種同士の相同性は、哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルスのほとんどの部分で十分に高く、そのため当業者は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列と特定のＨＢｃＡｇ変種のアミノ酸配列の両方について検討しかつ「対応する」アミノ酸残基を特定することがほとんど困難ではない。さらに、ウッドチャックに感染するウイルスから得られたＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号７３に示されるＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列番号７７に示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと十分に相同であり、配列番号７７のアミノ酸残基１５５と１５６の間の配列番号６４に３アミノ酸残基挿入断片が存在することが容易に明らかにされる。 HBcAg variants and precursors having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29-72 and 73-77 are relatively similar to each other. Thus, when referring to an amino acid residue of an HBcAg variant located at a position corresponding to a particular position in SEQ ID NO: 77, it refers to an amino acid residue present at that position in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77. The homology between HBcAg variants is sufficiently high in most parts of the hepatitis B virus that infects mammals, so that those skilled in the art will consider both the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77 and the amino acid sequence of a particular HBcAg variant. And it is hardly difficult to identify “corresponding” amino acid residues. Furthermore, the HBcAg amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73, which shows the amino acid sequence of HBcAg obtained from a virus that infects woodchuck, is sufficiently homologous to the HBcAg having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: It is readily apparent that there is a 3 amino acid residue insert in SEQ ID NO: 64 between 77 amino acid residues 155 and 156.

また本発明は、トリに感染するＢ型肝炎ウイスルのＨＢｃＡｇ変種を含んだワクチン組成物、ならびにこれらのＨＢｃＡｇ変種の断片を含んだワクチン組成物も含む。これらのＨＢｃＡｇ変種では、これらのポリペプチドに自然に存在するシステイン残基の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上を、別のアミノ酸残基で置換しまたは欠失させ、その後、本発明のワクチン組成物に含めることができる。 The present invention also includes vaccine compositions containing HBcAg variants of hepatitis B virus that infect birds, as well as vaccine compositions containing fragments of these HBcAg variants. In these HBcAg variants, one, two, three, or more of the naturally occurring cysteine residues in these polypeptides are replaced or deleted with another amino acid residue, after which the invention In the vaccine composition.

上記で論じたように、遊離システイン残基をなくすことによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合できる部位の数を減少させ、また、同じかまたは隣接するＨＢｃＡｇ分子のリジンおよびシステイン残基の架橋が生じ得る位置をなくす。したがって本発明の別の実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質の１つまたは複数のシステイン残基を欠失させ、または別のアミノ酸残基で置換した。 As discussed above, the elimination of free cysteine residues reduces the number of sites where a toxic component can bind to HBcAg and can result in cross-linking of lysine and cysteine residues of the same or adjacent HBcAg molecules. Lose position. Thus, in another embodiment of the invention, one or more cysteine residues of the hepatitis B virus capsid protein have been deleted or replaced with another amino acid residue.

その他の実施形態で、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、Ｃ末端領域（例えば配列番号７７のアミノ酸残基１４５〜１８５または１５０〜１８５）を除去したＨＢｃＡｇを含有することになる。そのため、本発明を実施する際の使用に適した追加の変性ＨＢｃＡｇは、Ｃ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇを含む。 In other embodiments, each of the compositions and vaccine compositions of the invention will contain HBcAg with the C-terminal region removed (eg, amino acid residues 145-185 or 150-185 of SEQ ID NO: 77). As such, additional modified HBcAg suitable for use in practicing the present invention includes C-terminal truncated variants. Suitable truncation mutants include HBcAg with 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 amino acids removed from the C-terminus.

本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、Ｎ末端切断型変異体も含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、または１７アミノ酸がＮ末端から除去された変性ＨＢｃＡｇを含む。 HBcAg suitable for use in practicing the present invention also includes N-terminal truncated variants. Suitable truncated variants include denatured HBcAg with 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, or 17 amino acids removed from the N-terminus.

本発明を実施する際の使用に適したＨＢｃＡｇは、ＮおよびＣ末端切断型変異体を含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、および１７アミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ末端から除去された、ＨＢｃＡｇを含む。 HBcAg suitable for use in practicing the present invention includes N- and C-terminal truncated variants. Suitable truncation mutants are those in which 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, and 17 amino acids have been removed from the N-terminus, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, Includes HBcAg with 34, 35 amino acids removed from the C-terminus.

本発明はさらに、上述の切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいは本質的にこれらからなり、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。 The invention further comprises, consists essentially of, or consists of amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to the truncated variants described above. Each comprises a composition comprising a HBcAg polypeptide and a vaccine composition.

本発明のある特定の実施形態では、ＨＢｃＡｇポリペプチドにリジン残基を導入して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＨＢｃＡｇのＶＬＰとの結合を媒介するようにする。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、配列番号７７のアミノ酸１〜１４４、または１〜１４９、１〜１８５を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇを使用して調製するが、これは、位置７９および８０に対応するアミノ酸がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを有するペプチドで置換されるように変性させたものである（配列番号７８）。さらに好ましい実施形態では、配列番号７７の位置４８および１０７のシステイン残基をセリンに変異させる。本発明はさらに、配列番号２９〜７４のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含んだ組成物を含むが、これは上述のアミノ酸の変化があるものである。本発明の範囲内には、カプシドまたはＶＬＰを形成するように会合すること可能でありかつ上述のアミノ酸変化を有する、追加のＨＢｃＡＧ変種がさらに含まれる。したがって本発明はさらに、野生型アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドと、適切な場合にはＮ末端リーダー配列を除去するようプロセッシングされて上述の変化によって変性されるこれらタンパク質のプロセッシングされた形とを含んだ組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。 In certain embodiments of the invention, lysine residues are introduced into the HBcAg polypeptide to mediate binding of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the VLP of HBcAg. In a preferred embodiment, the composition of the invention is prepared using HBcAg comprising or consisting of amino acids 1-144, or 1-149, 1-185 of SEQ ID NO: 77, which is at position 79. And the amino acid corresponding to 80 has been modified so that it is substituted with a peptide having Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 78). In a further preferred embodiment, the cysteine residues at positions 48 and 107 of SEQ ID NO: 77 are mutated to serine. The present invention further includes a composition comprising a corresponding polypeptide having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 29 to 74, which has the amino acid changes described above. Further included within the scope of the present invention are additional HBcAG variants that can associate to form capsids or VLPs and have the amino acid changes described above. Accordingly, the present invention further comprises an HBcAg polypeptide comprising, or consisting of, an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, or 99% identical to any of the wild type amino acid sequences, Each comprising a composition and a vaccine composition, each containing a processed form of these proteins that have been processed to remove the N-terminal leader sequence and denatured by the aforementioned changes.

本発明の組成物またはワクチン組成物は、種々のＨＢｃＡｇの混合物を含んでよい。したがってこれらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇからなる。例えば、「野生型」ＨＢｃＡｇと、１つまたは複数のアミノ酸残基が変化した（例えば欠失し、挿入され、または置換された）変性ＨＢｃＡｇとを含む、ワクチン組成物を調製することができる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、抗原がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである、高度に規則正しい反復性抗原アレイを提示するものである。本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの共有結合によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドが前記コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ結合する。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドは、少なくとも１つの共有結合によってコア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ結合し、前記共有結合は非ペプチド結合であって、コア粒子とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの規則的で反復性のアレイと、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとのアレイまたは結合体をそれぞれもたらすものであることが好ましい。このＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとのアレイおよび結合体のそれぞれは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つであり通常は複数のタンパク質またはペプチドが向きの定められた状態でＶＬＰに結合するので、典型的な場合かつ好ましくは反復性で規則性の構造を有する。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの１０、２０、４０、８０、１２０を超えるタンパク質またはペプチドがＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットに結合することが好ましい。反復性で規則性のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドアレイおよび結合体の形成はそれぞれ、下記の事項で明らかにされるように、配列され向きが定められ、かつ画定されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドとＶＬＰとの結合および結着によって、確実になされる。さらに、ＶＬＰの典型的な固有の高度に繰り返され編成された構造は、高度に編成され繰り返されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドアレイおよび結合がそれぞれ得られるように、高度に順序付けられ繰り返される手法で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを表示することに寄与することが有利である。 The composition or vaccine composition of the present invention may comprise a mixture of various HBcAg. Therefore, these vaccine compositions consist of HBcAg having different amino acid sequences. For example, a vaccine composition can be prepared that includes “wild-type” HBcAg and a modified HBcAg in which one or more amino acid residues are changed (eg, deleted, inserted, or substituted). Furthermore, preferred vaccine compositions of the present invention present highly ordered repetitive antigen arrays in which the antigen is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. In a further preferred embodiment of the invention, at least one covalent bond binds at least one protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin to the core particle and virus-like particle, respectively. At least one protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin is bound to the core particle and virus-like particle, respectively, by at least one covalent bond, the covalent bond being a non-peptide bond, Provide a regular and repetitive array with IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and an array or conjugate of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and VLP, respectively. It is preferable. Each of the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and VLP arrays and conjugates is at least one of IL-5, IL-13, or eotaxin, usually a plurality of proteins or peptides Typically bind to the VLP in a defined orientation, so that it typically has a repetitive and regular structure. Preferably more than 10, 20, 40, 80, 120 proteins or peptides of IL-5, IL-13, or eotaxin bind to a VLP or VLP subunit. The formation of repetitive and regular IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide arrays and conjugates, respectively, is aligned, oriented and defined, as will be demonstrated below. This is ensured by binding and binding of at least one protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin to the VLP. In addition, the typical unique highly repeated and organized structure of VLPs is such that a highly organized and repeated IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide array and binding, respectively, are obtained. It would be advantageous to contribute to displaying IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides in a highly ordered and repeated manner.

したがって、好ましい本発明の結合体およびアレイのそれぞれは、高度に編成された構造、寸法であること、およびアレイ表面の抗原の反復性が、従来技術の結合体とは異なる。さらに本発明の好ましい実施形態によれば、発現宿主内で粒子と抗原の両方を発現させることが可能になり、抗原、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドの適正な折畳みと、ＶＬＰの適正な折畳みおよび組織体が保証される。 Accordingly, each of the preferred conjugates and arrays of the present invention differs from prior art conjugates in that it is a highly organized structure, size, and repeatability of antigen on the array surface. Further in accordance with a preferred embodiment of the present invention, it is possible to express both particles and antigens in an expression host, wherein at least one protein or peptide of the antigen, ie IL-5, IL-13, or eotaxin. Proper folding and proper folding and organization of the VLP are ensured.

本発明は、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合する方法を開示する。示すように、本発明の一態様では、化学的架橋によって、典型的な場合かつ好ましくは異種２官能性架橋剤を使用することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをそれぞれコア粒子およびＶＬＰに結合させる。いくつかの異種１官能性架橋剤は、当技術分野で知られている。好ましい実施形態で、異種２官能性架橋剤は、好ましい第１の付着部位、すなわちコア粒子およびＶＬＰまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットそれぞれのリジン残基の側鎖アミノ基とそれぞれ反応することができる官能基と、好ましい第２の付着部位、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に天然に存在し、還元による反応に供され、または設計製作され、任意選択で還元による反応にも供される、システイン残基と反応することができる別の官能基を含有する。この手順の第１の工程は、典型的な場合は誘導体化と呼ばれ、コア粒子またはＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化コア粒子または活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第２の工程では、ゲルろ過や透析などの通常の方法を使用して、未反応の架橋剤を除去する。第３の工程では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを活性化担体と反応させるが、この工程は典型的な場合、連結工程と呼ばれる。未反応のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、例えば透析によって、第４の工程で任意選択で除去することができる。いくつかの異種２官能性架橋剤が当技術分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡと、例えばＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）から入手可能であって一方の官能基がアミノ基に対して反応性があり他方の官能基がシステイン残基に対して反応性があるその他の架橋剤が含まれる。上述の架橋剤はすべて、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明の実施に適した別のクラスの架橋剤は、連結によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子またはＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することを特徴とする。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤によるコア粒子およびＶＬＰそれぞれの誘導化の程度は、各反応相手の濃度や、１つの試薬が他の試薬よりも過剰であること、ｐＨ、温度、およびイオン強度などの実験条件を変えることによって影響を受ける可能性がある。連結の程度、すなわちコア粒子およびＶＬＰそれぞれのサブユニット当たりのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量は、ワクチンの要件に一致するよう上述の実験条件を変化させることによって調節することができる。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの溶解度によって、各サブユニットに連結し得るＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量に制限が課される可能性があり、得られるワクチンが不溶性である場合は、サブユニット当たりのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの量を減少させることが有利である。 The present invention discloses a method of binding IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the core particle and VLP, respectively. As shown, in one aspect of the invention, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is obtained by chemical cross-linking, typically and preferably by using a heterobifunctional cross-linking agent. Bind to core particle and VLP respectively. Several heterogeneous monofunctional crosslinkers are known in the art. In a preferred embodiment, the heterobifunctional crosslinker is a functional first capable of reacting with the preferred first attachment site , ie, the side chain amino group of the core particle and the lysine residue of each of the VLP or at least one VLP subunit, respectively. Naturally occurring on the group and the preferred second attachment site , ie, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, subjected to a reduction reaction, or engineered, and optionally a reduction reaction It also contains another functional group that can react with cysteine residues. The first step of this procedure, typically referred to as derivatization, is the reaction of the core particle or VLP with a crosslinker. The product of this reaction is activated core particles or activated VLPs, also called activated carriers. In the second step, unreacted cross-linking agent is removed using a normal method such as gel filtration or dialysis. In the third step, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is reacted with an activated carrier, which is typically referred to as the ligation step. Unreacted IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide can optionally be removed in the fourth step, for example, by dialysis. Several heterobifunctional crosslinkers are known in the art. These include the preferred crosslinking agents SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA and, for example, Pierce Chemical Company (Rockford, Other cross-linking agents are available which are available from the US), one functional group being reactive to amino groups and the other functional group being reactive to cysteine residues. All of the above mentioned crosslinkers result in the formation of thioether bonds. Another class of cross-linking agents suitable for the practice of the present invention is characterized by the introduction of disulfide bonds between the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and the core particle or VLP by ligation. To do. Preferred crosslinkers belonging to this class include, for example, SPDP and Sulfo-LC-SPDP (Pierce). The degree of derivatization of each of the core particles and VLPs by the cross-linking agent can vary the concentration of each reaction partner, one reagent in excess of the other, experimental conditions such as pH, temperature, and ionic strength. May be affected by. The degree of ligation, ie, the amount of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide per subunit of core particle and VLP, respectively, is adjusted by varying the experimental conditions described above to match vaccine requirements. can do. The solubility of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide may impose a limit on the amount of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide that can be linked to each subunit. If the resulting vaccine is insoluble, it is advantageous to reduce the amount of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide per subunit.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させる特に好ましい方法は、コア粒子およびＶＬＰの表面のリジン残基をそれぞれ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上のシステイン残基と結合させることである。したがって本発明の好ましい実施形態では、第１の付着部位がリジン残基であり、第２の付着部位がシステイン残基である。いくつかの実施形態では、コア粒子およびＶＬＰそれぞれに結合させるため、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対し、第２の付着部位としてまたはその一部として、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーを設計製作することが必要になる。あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド内への挿入または変異によって、システインを導入することができる。あるいはシステイン残基またはチオール基を、化学的な連結によって導入することができる。 Particularly preferred methods of binding IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the core particle and VLP, respectively, are the lysine residues on the surface of the core particle and VLP, respectively, IL-5, IL-13, or Bind to a cysteine residue on the protein or peptide of eotaxin. Thus, in a preferred embodiment of the invention, the first attachment site is a lysine residue and the second attachment site is a cysteine residue. In some embodiments, a cysteine residue is attached to the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide as a second attachment site or as part thereof for binding to the core particle and VLP, respectively. It is necessary to design and produce an amino acid linker containing it. Alternatively, cysteine can be introduced by insertion or mutation of IL-5, IL-13, or eotaxin into a protein or peptide. Alternatively, cysteine residues or thiol groups can be introduced by chemical linkage.

アミノ酸リンカーの選択は、抗原および自己抗原のそれぞれの性質に応じてなされ、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの性質、ｐＩや電荷分布、グリコシル化などのその生化学的特性に応じてなされる。一般に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの好ましい実施形態は、（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ末端γ１リンカー、（ｃ）Ｎ末端γ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー、（ｆ）（Ｇ）_ｋＣ（Ｇ）_ｎであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５であるもの、（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）（Ｇ）_ｋＣ（Ｇ）_ｍ（Ｓ）_ｌ（ＧＧＧＧＳ）_ｎであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２であるもの、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）Ｃ末端γ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端γ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）（Ｇ）_ｎＣ（Ｇ）_ｋであってｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５であるもの、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）（Ｇ）_ｍ（Ｓ）_ｌ（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（Ｇ）_ｏＣ（Ｇ）_ｋであってｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、およびｏ＝０〜８であるものからなる群から選択される。 The choice of amino acid linker is made according to the respective properties of the antigen and autoantigen, i.e. the nature of the protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin, its biochemical properties such as pi, charge distribution, glycosylation, etc. It is made according to the characteristics. In general, flexible amino acid linkers are preferred. Preferred embodiments of the amino acid linker are: (a) CGG, (b) N-terminal γ1 linker, (c) N-terminal γ3 linker, (d) Ig hinge region, (e) N-terminal glycine linker, (f) (G) _k C (G) _n where n = 0-12 and k = 0-5, (g) N-terminal glycine-serine linker, (h) (G) _k C (G) _m (S) _l (GGGGS) _n , where n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2, (i) GGC, (k) GGC-NH2, (l) C Terminal γ1 linker, (m) C-terminal γ3 linker, (n) C-terminal glycine linker, (o) (G) _n C (G) _k , where n = 0-12 and k = 0-5, (P) C-terminal glycine-serine linker, (q) (G) _m (S) _l (GGGGGS) _n (G) _o C (G) _k selected from the group consisting of n = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, l = 0-2, and o = 0-8.

アミノ酸リンカーのさらに好ましい例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）_ｎであって、すべてが第２の付着部位としてシステイン残基をさらに含有し、さらに任意選択でグリシン残基を含有するものである。典型的な場合、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端γ３；ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ；Ｃ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧ；Ｃ末端グリシン−リジンリンカー：ＧＧＫＫＧＣ；Ｎ末端グリシン−リジンリンカー：ＣＧＫＫＧＧである。 Further preferred examples of amino acid linkers are an immunoglobulin hinge region, a glycine serine linker (GGGGS) _n , and a glycine linker (G) _n , all further containing a cysteine residue as a second attachment site , Optionally contains a glycine residue. In a typical case, preferred examples of the amino acid linker are N-terminal γ1: CGDKTHTSPP; C-terminal γ1: DKTHTSPPCG; N-terminal γ3: CGGPKPSTPPGSSGGAP; C-terminal γ3; PKPSTPPGSSSGGAPGCG; N-terminal glycine linker: GCGGGG; C-terminal glycine-lysine linker: GGKKGC; N-terminal glycine-lysine linker: CGKKGG.

本発明のさらに好ましい実施形態では、特に抗原がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである場合、ペプチドのＣ末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ、またはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化の略である）リンカーあるいはそのＮ末端のＣＧＧは、アミノ酸リンカーとして好ましい。一般にグリシン残基は、連結反応におけるバルク状アミノ酸の可能性ある立体障害が回避されるように、バルク状アミノ酸と第２の付着部位として使用されるシステインとの間に挿入される。 In a further preferred embodiment of the invention, particularly when the antigen is IL-5, IL-13, or an eotaxin peptide, GGCG, GGC, or GGC-NH2 ("NH2" stands for amidation) at the C-terminus of the peptide. A) linker or its N-terminal CGG is preferred as an amino acid linker. In general, a glycine residue is inserted between the bulk amino acid and the cysteine used as the second attachment site so that the possible steric hindrance of the bulk amino acid in the ligation reaction is avoided.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に存在するシステイン残基は、活性化ＶＬＰ上の異種２官能性架橋剤と反応するように、その還元状態になければならず、すなわち遊離システインまたは遊離スルフィドリル基を有するシステイン残基が利用可能でなければならない。結合部位として機能するシステイン残基が酸化された形のものである場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合は、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールとのこのジスルフィド架橋の還元が必要とされる。 Cysteine residues present on IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides must be in their reduced state to react with the heterobifunctional crosslinker on the activated VLP, ie Cysteine residues with free cysteine or free sulfhydryl groups must be available. If the cysteine residue that functions as the binding site is in an oxidized form, for example if it forms a disulfide bridge, reduction of this disulfide bridge with, for example, DTT, TCEP, or β-mercaptoethanol is required. The

上述の好ましい方法による異種２官能性架橋剤を使用することによる、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの結合のそれぞれは、向きが定められた手法によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとの連結をそれぞれ可能にする。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰとをそれぞれ結合するその他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させる方法が含まれる。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、またはイミノチオタンとの反応によって最初にチオール化してもよい。次いでＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、必要に応じて脱保護を行った後、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに以下のように連結することができる。過剰なチオール化試薬を分離した後、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、システイン反応性部分を含む異種２官能性架橋剤で事前に活性化させたコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させ、したがって少なくとも１つまたはいくつかの官能基がシステイン残基に対して反応性があることが示されるが、これは上述のように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのチオール化タンパク質またはペプチドが反応することが可能なものである。任意選択で、少量の還元剤を反応混合物に含める。別の方法では、グルタルアルデヒドやＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］_４、ＢＳ^３、（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）などの同種２官能性架橋剤、あるいは、コア粒子およびＶＬＰそれぞれのアミン基またはカルボキシル基に対して反応性を有する官能基を備えたその他の知られている同種２官能性架橋剤を使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結着する。 Each of the binding of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the core particle and VLP by using a heterobifunctional crosslinker according to the preferred method described above is directed by a directed method. , IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, and allow linking of the core particle and VLP, respectively. Other methods of binding IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the core particle and VLP, respectively, include carbodiimide EDC and NHS, using IL-5, IL-13, or eotaxin. In which the protein or peptide is bound to the core particle and VLP, respectively. An IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide may be first thiolated, for example by reaction with SATA, SATP, or iminothiotan. The IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide can then be deprotected as necessary and then linked to each of the core particle and VLP as follows. After separation of excess thiolation reagent, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is pre-activated with a heterobifunctional cross-linker containing a cysteine reactive moiety and the VLP Reacting with each, thus indicating that at least one or several functional groups are reactive towards cysteine residues, which, as mentioned above, may be of IL-5, IL-13, or eotaxin. A thiolated protein or peptide is one that can react. Optionally, a small amount of reducing agent is included in the reaction mixture. Alternatively, homobifunctional cross-linking agents such as glutaraldehyde, DSG, BM [PEO] ₄ , BS ³ , (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA), or the amine groups of core particles and VLPs respectively Using other known homobifunctional crosslinkers with functional groups that are reactive towards carboxyl groups, IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides can be used as core particles and VLPs. Bind to each.

別の実施形態では、グリコシル化したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に存在する炭水化物部分を変性させ、その後コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させることによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに結合する。一実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのグリコシル化タンパク質またはペプチドを、炭水化物部分の緩慢な酸化反応で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドを得る。このように活性化したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを過剰な過ヨウ素酸ナトリウムから分離し、さらにコア粒子およびＶＬＰのそれぞれと反応させるが、この場合、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に記載されているように、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのリジン残基を、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上の事前形成されたアルデヒド官能基と反応させる。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドの自己重合は、前述の文献に記載されているように、ｐＨを調節することによって制御することができる。形成されたシッフ塩基は、好ましくはシアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元し、その後ゲルろ過または透析によって除去する。あるいは、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれを、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれまたは少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのカルボキシル基でＥＤＣと反応させ、さらにアジピン酸ジヒドラジドなどのジヒドラジドと反応させて、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチド上に存在する１つまたは複数のアルデヒド官能基と反応することが可能なヒドラジド部分を得る。このように形成されたヒドラゾンは、シアノホウ水素化ナトリウムでさらに還元することができる。あるいは、１つまたは複数のアルデヒド官能基を持つＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの活性化タンパク質またはペプチドをシステアミンと反応させて、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドにシステイン基を導入する。コア粒子およびＶＬＰのそれぞれに対するＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに適した追加の架橋方法および架橋剤、ならびに連結反応の実施と化学架橋剤および化学架橋手順の使用に関する指針は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、米国に見出すことができる。 In another embodiment, IL-5, by modifying the carbohydrate moiety present on the glycosylated IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, followed by reaction with each of the core particle and VLP, IL-13, or eotaxin protein or peptide, binds to the core particle and VLP, respectively. In one embodiment, an IL-5, IL-13, or eotaxin glycosylated protein or peptide is reacted with sodium periodate in a slow oxidation reaction of the carbohydrate moiety to have one or more aldehyde functional groups. An IL-5, IL-13, or eotaxin activating protein or peptide is obtained. The thus activated IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is separated from excess sodium periodate and further reacted with each of the core particles and VLPs, for example, Hermanson, G . T.A. Bioconjugate Technologies, Academic Press Inc., Bioconjugate Technologies. , San Diego, CA, USA, each of lysine residues of the core particle and VLP or at least one VLP subunit on the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide React with pre-formed aldehyde functionality. Self-polymerization of activating proteins or peptides of IL-5, IL-13, or eotaxin can be controlled by adjusting the pH, as described in the aforementioned literature. The formed Schiff base is preferably further reduced with sodium cyanoborohydride and then removed by gel filtration or dialysis. Alternatively, each of the core particle and VLP is reacted with EDC at the carboxyl group of each of the core particle and VLP or at least one VLP subunit, and further reacted with a dihydrazide such as adipic acid dihydrazide to produce IL-5, IL- 13 or a hydrazide moiety capable of reacting with one or more aldehyde functional groups present on the activating protein or peptide of eotaxin. The hydrazone thus formed can be further reduced with sodium cyanoborohydride. Alternatively, an IL-5, IL-13, or eotaxin activating protein or peptide having one or more aldehyde functional groups is reacted with cysteamine to produce an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. Introduce cysteine group. Additional cross-linking methods and cross-linking agents suitable for IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides for core particles and VLPs, respectively, as well as guidance on performing ligation reactions and using chemical cross-linking agents and chemical cross-linking procedures are Hermanson, G .; T.A. Bioconjugate Technologies, Academic Press, Inc. , San Diego, CA, USA.

ＶＬＰをＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに結合するその他の方法には、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれをビオチニル化し、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをストレプタビジン融合タンパク質として発現させる方法、あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとの両方を、例えはＷＯ００／２３９５５に記載されているようにビオチニル化する方法が含まれる。この場合、自由な結合部位を、次の工程で添加されるコア粒子およびＶＬＰのそれぞれの結合にそのまま利用することができるように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとストレプタビジンとの比を調節することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをまずストレプタビジンまたはアビジンに結合させる。あるいは、すべての成分を「ワンポット（ｏｎｅｐｏｔ）」反応で混合することができる。その他のリガンド−レセプター対は、可溶形態にあるレセプターおよびリガンドを利用可能であり、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれと架橋可能であり、あるいは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびＶＬＰのそれぞれとを結合させるための結合剤として使用することができる。あるいは、リガンドまたはレセプターをＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと融合させ、それによって、このレセプターまたはリガンドにそれぞれ化学結合しまたは融合しているコア粒子およびＶＬＰのそれぞれへの結合を仲介することができる。融合は、挿入または置換によって行ってもよい。 Other methods of binding VLPs to IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides include biotinylation of each of the core particles and VLPs, and IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides. A method of expression as a streptavidin fusion protein, or both IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and each of the core particle and VLP, eg, biotinyl as described in WO 00/23955 To include In this case, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide and streptavidin so that the free binding site can be directly used for the binding of the core particle and VLP added in the next step. The IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is first bound to streptavidin or avidin. Alternatively, all ingredients can be mixed in a “one pot” reaction. Other ligand-receptor pairs can utilize receptors and ligands in soluble form and can crosslink with core particles and VLPs, respectively, or IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides Can be used as a binding agent for binding IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to the core particle and VLP, respectively. Alternatively, a ligand or receptor is fused to an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, thereby binding to each of the core particles and VLPs that are chemically bound or fused to the receptor or ligand, respectively. Can mediate. Fusion may be by insertion or substitution.

既に述べたように、本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。 As already mentioned, in a preferred embodiment of the invention, the VLP is an RNA phage VLP, and in a more preferred embodiment the VLP is an RNA phage Qβ coat protein VLP.

１つまたはいくつかの抗原分子、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、立体的に可能な場合、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリジン残基によって、カプシドまたはＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの１つのサブユニットに結着することができる。したがってＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの特定の特徴とは、サブユニット当たりいくつかの抗原に連結できることである。このため、稠密な抗原アレイを生成することが可能になる。 One or several antigen molecules, ie IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, if sterically possible, preferably by an exposed lysine residue in the VLP of an RNA phage, either by capsid or RNA Can bind to one subunit of VLP of phage coat protein. Thus, a particular feature of RNA phage coat protein VLPs, particularly Qβ coat protein VLPs, is that they can be linked to several antigens per subunit. This makes it possible to generate a dense antigen array.

本発明の好ましい実施形態で、少なくともＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとコア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれとの結合および結着は、それぞれ、ウイルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と、抗原または抗原決定基の少なくとも１つの第２の付着部位との相互作用および会合による。 In a preferred embodiment of the invention, the binding and binding of at least IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide to each of the core particle and virus-like particle, respectively, is at least one of the at least one first of the virus-like particle. By interaction and association of one attachment site with at least one second attachment site of an antigen or antigenic determinant.

Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、その表面に、定められた数のリジン残基を示し、３個のリジン残基がカプシドの内部に向かってＲＮＡと相互に作用し、他の４個のリジン残基がカプシドの外部に露出しているという、定められたトポロジーを持つ。これらの定められた性質は、リジン残基がＲＮＡを相互に作用する粒子の内部よりも粒子の外部に抗原が結着するのに都合良い。その他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰも、その表面に定められた数のリジン残基を有し、これらのリジン残基は定められたトポロジーを持つ。 The VLP or capsid of the Qβ coat protein shows a defined number of lysine residues on its surface, with 3 lysine residues interacting with RNA towards the interior of the capsid and the other 4 lysine residues. It has a defined topology in which residues are exposed outside the capsid. These defined properties are more convenient for the antigen to be bound to the exterior of the particle than the interior of the particle where lysine residues interact with RNA. Other RNA phage coat protein VLPs also have a defined number of lysine residues on their surface, and these lysine residues have a defined topology.

本発明の別の実施形態で、第１の付着部位はリジン残基であり、かつ／または第２の付着部位はスルフィドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施形態では、第１の付着部位がリジン残基であり、第２の付着部位がシステイン残基である。 In another embodiment of the invention, the first attachment site is a lysine residue and / or the second attachment site comprises a sulfhydryl group or a cysteine residue. In a highly preferred embodiment of the invention, the first attachment site is a lysine residue and the second attachment site is a cysteine residue.

本発明の非常に好ましい実施形態で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に天然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基を介して、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰリジン残基、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに結合する。 In a highly preferred embodiment of the invention, the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is naturally occurring or engineered on the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. It binds to the VLP lysine residue of the RNA phage coat protein, in particular to the VLP of the Qβ coat protein, through the cysteine residue.

ＲＮＡファージから得られたＶＬＰの別の利点は、細菌内でのその発現収量が高いことであり、手ごろなコストで大量の物質の生成が可能になる。 Another advantage of VLPs obtained from RNA phage is their high expression yield in bacteria, which allows the production of large quantities of material at a reasonable cost.

述べたように、本発明の結合体およびアレイはそれぞれ、高度に編成された構造、寸法である点と、アレイ表面の抗原の反復性に関して、従来技術の結合体とは異なる。さらに、ＶＬＰを担体として使用することによって、抗原密度が様々な頑丈な抗原アレイおよび結合体がそれぞれ形成される。特にＲＮＡファージのＶＬＰを使用することによって、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを使用することによって、非常に高いエピトープ密度を実現することが可能になる。エピトープ密度の高いＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ組成物の調製は、本願の教示を使用して行うことができる。 As stated, the conjugates and arrays of the present invention differ from the prior art conjugates in that each is a highly organized structure, size, and the repeatability of antigen on the array surface. Furthermore, by using VLP as a carrier, robust antigen arrays and conjugates with varying antigen densities are formed, respectively. In particular, by using the VLP of RNA phage, it is possible here to achieve very high epitope densities, especially by using the VLP of RNA phage Qβ coat protein. Preparation of VLP compositions of RNA phage coat proteins with high epitope density can be performed using the teachings of the present application.

本明細書で定義する第２の付着部位は、抗原または抗原決定基に自然に存在するかまたは自然に存在しないものでよい。抗原または抗原決定上に、適切な天然の第２の付着部位が存在しない場合は、天然のものではない付着部位を抗原に対して設計製作しなければならない。 The second attachment site as defined herein may be naturally occurring or non-naturally occurring in the antigen or antigenic determinant. If there is no suitable natural second attachment site for antigen or antigen determination, a non-natural attachment site must be designed for the antigen.

上述のように、４個のリジン残基がＱβコートタンパク質のＶＬＰ表面に露出している。典型的な場合、これらの残基は、架橋剤分子との反応によって誘導化される。露出したリジン残基のすべてが抗原に連結し得るとは限らない場合、誘導化工程の後に、架橋剤分子がεアミノ基に結着した状態で、架橋剤と反応したリジン残基が残る。これは、ＶＬＰの溶解性および安定性に有害な、１つまたはいくつかの正電荷の消失に繋がる。以下に開示するＱβコートタンパク質変異体と同様に、アルギニン残基は架橋剤と反応しないので、リジン残基のいくつかをアルギニンに代えることによって、本発明者等は正電荷が過剰に消失するのを防止する。さらに、リジン残基をアルギニンに代えることにより、抗原との反応に利用部位が少なくなるので、より明確に定められた抗原アレイを得ることができる。 As described above, four lysine residues are exposed on the VLP surface of the Qβ coat protein. Typically, these residues are derivatized by reaction with a crosslinker molecule. If not all of the exposed lysine residues can be linked to the antigen, after the derivatization step, the lysine residue reacted with the crosslinker remains with the crosslinker molecule attached to the ε-amino group. This leads to the disappearance of one or several positive charges that are detrimental to the solubility and stability of the VLP. Like the Qβ coat protein variants disclosed below, arginine residues do not react with the cross-linking agent, so by replacing some of the lysine residues with arginine, the inventors lose excessive positive charge. To prevent. Furthermore, by replacing the lysine residue with arginine, the number of sites used for the reaction with the antigen is reduced, so that a more clearly defined antigen array can be obtained.

したがって、本願で開示する以下のＱβコートタンパク質変異体および変異体Ｑβ ＶＬＰでは、露出したリジン残基をアルギニンに代えた：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）、およびＱβ−２５９（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。これらの構造体をクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製して、ペプチドおよびタンパク質抗原との連結に使用した。Ｑβ−２５１；（配列番号２６）も構成し、Ｑβ−２５１コートタンパク質のＶＬＰをどのように発現させ、精製し、かつ連結させるかについての指針は、本願全体を通して見出すことができる。 Therefore, in the following Qβ coat protein mutants and mutant Qβ VLPs disclosed herein, the exposed lysine residue was replaced with arginine: Qβ-240 (Lys13-Arg; SEQ ID NO: 23), Qβ-250 (Lys 2 -Arg, Lys13-Arg; SEQ ID NO: 25), and Qβ-259 (Lys2-Arg, Lys16-Arg; SEQ ID NO: 27). These constructs were cloned, proteins were expressed, and VLPs were purified and used to link peptide and protein antigens. Qβ-251; (SEQ ID NO: 26) is also constructed, and guidance on how to express, purify and link the Vβ of the Qβ-251 coat protein can be found throughout the application.

他の実施形態では、本発明者等は、密度がさらに高い抗原アレイを得るのに適した、１つの追加のリジン残基を有するＱβ変異体コートタンパク質を開示する。この変異Ｑβコートタンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号２４）をクローニングし、タンパク質を発現させ、カプシドまたはＶＬＰを単離して精製したが、追加のリジン残基の導入が、サブユニットとカプシドまたはＶＬＰとの自己組織体に適合することを示した。したがって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと結合体のそれぞれは、Ｑβコートタンパク質変異体のＶＬＰを使用して調製することができる。抗原とＶＬＰ、特にＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰとを結着させる特に好ましい方法は、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ表面に存在するリジン残基と、抗原、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド上に自然に存在しまたは設計製作されたシステイン残基とを結合することである。システイン残基を第２の付着部位として有効なものにするため、スルフィドリル基を連結に利用しなければならない。したがって、システイン残基を還元状態にしなければならず、すなわち遊離したシステインまたは遊離したスルフィドリル基を持つシステイン残基を利用可能にしなければならない。第２の付着部位として機能するシステイン残基が酸化形態にある場合、例えばそれがジスルフィド架橋を形成する場合には、このジスルフィド架橋を、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはβメルカプトエタノールで還元することが必要である。還元剤の濃度、および抗原よりも過剰な還元剤のモル数は、各抗原ごとに調節しなければならない。１０μＭ程度またはそれ以下に低い濃度から始まり最高で１０〜２０ｍＭまたは必要に応じてそれ以上の濃度に至る還元剤の滴定範囲を試験し、抗原と担体との連結について評価する。２００２年１月１８日に本願譲受人により出願された係属中の米国出願第１０／０５０，９０２号に記載されるように、還元剤が低濃度であることは連結反応に適合することであるが、濃度がより高くなると、当業者に知られるようにこの連結反応が阻害され、その場合は還元剤を透析またはゲルろ過によって除去しなければならない。透析または平衡緩衝液のｐＨは７未満であり、好ましくは６である。ｐＨの低い緩衝液と抗原の活性または安定性との適合性について試験をしなければならない。 In other embodiments, we disclose a Qβ variant coat protein with one additional lysine residue suitable for obtaining a higher density antigen array. This mutant Qβ coat protein, Qβ-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 24) was cloned, the protein was expressed and the capsid or VLP was isolated and purified, but the introduction of additional lysine residues It has been shown to be compatible with the self-assembly of capsid and VLP. Thus, IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides and conjugates, respectively, can be prepared using QLP coat protein variant VLPs. A particularly preferred method of conjugating an antigen to a VLP, particularly an RNA phage coat protein VLP, is the lysine residue present on the VLP surface of the RNA phage coat protein and the antigen, ie IL-5, IL-13, or eotaxin. The binding of a naturally occurring or engineered cysteine residue on a protein or peptide. In order to make the cysteine residue effective as a second attachment site , the sulfhydryl group must be utilized for ligation. Therefore, the cysteine residue must be reduced, ie, a free cysteine or a cysteine residue with a free sulfhydryl group must be made available. If the cysteine residue that functions as the second attachment site is in an oxidized form, for example if it forms a disulfide bridge, this disulfide bridge must be reduced, for example with DTT, TCEP, or β-mercaptoethanol It is. The concentration of reducing agent and the number of moles of reducing agent in excess of the antigen must be adjusted for each antigen. Test the titration range of the reducing agent starting at concentrations as low as 10 μM or less and up to a maximum of 10-20 mM or more, if necessary, to assess the binding of antigen to carrier. As described in pending US application Ser. No. 10 / 050,902, filed by the assignee of the present application on Jan. 18, 2002, a low concentration of reducing agent is compatible with the ligation reaction. However, at higher concentrations, this ligation reaction is inhibited as known to those skilled in the art, in which case the reducing agent must be removed by dialysis or gel filtration. The pH of the dialysis or equilibration buffer is less than 7, preferably 6. The compatibility between the low pH buffer and the activity or stability of the antigen must be tested.

ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤またはその他の反応条件を選択することによって調節できる。例えば架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳやＳＭＰＨでは、典型的な場合、高いエピトープ密度に達することが可能である。誘導化は、還元剤の濃度を高くすることによって、良い影響が得られ、反応条件の操作を行うことによって、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰに連結する抗原の数を制御することができる。 The epitope density on the VLP of the RNA phage coat protein can be adjusted by selecting a cross-linking agent or other reaction conditions. For example, with the crosslinkers Sulfo-GMBS and SMPH, it is typically possible to reach high epitope densities. For derivatization, a good effect can be obtained by increasing the concentration of the reducing agent. By controlling the reaction conditions, the number of antigens linked to the VLP of the RNA phage coat protein, particularly the VLP of the Qβ coat protein, is controlled. can do.

非天然の第２の付着部位を設計する前に、そこに融合し挿入されまたは一般に設計製作される位置を選択しなければならない。第２の付着部位の位置の選択は、例として、抗原の結晶構造に基づくものでよい。そのような抗原の結晶構造は、分子のＣまたはＮ末端の利用可能性（例えば溶媒に対するその接触可能性から決定される）に関する情報、またはシステイン残基など、第２の付着部位としての使用に適する残基の溶媒への曝露に関する情報を提供することができる。Ｆａｂ断片の場合のように、露出したジスルフィド架橋は、一般に緩慢な還元によって単一システイン残基に変換可能であるので、第２の付着部位の源であってもよい。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの免疫原性に影響を及ぼさない緩慢な還元条件が選択される。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用を阻害する目的である場合、自然のリガンドとの相互作用の部位に対して抗体が生成されるように、第２の付着部位が付加されることになる。したがって第２の付着部位の位置は、第２の付着部位またはこれを含有する任意のアミノ酸リンカーからの立体障害が回避されるように、選択されることになる。他の実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとが相互に作用する部位とは別の部位を対象とした抗体応答が望まれる。そのような実施形態では、自己抗原とその自然のリガンドとの相互作用の部位に対する抗体の生成が妨げられるように、第２の付着部位を選択することができる。 Before designing a non-natural second attachment site , a location must be selected that is fused and inserted therein or generally designed and fabricated. The selection of the position of the second attachment site may be based on, for example, the crystal structure of the antigen. The crystal structure of such an antigen is useful for use as a second attachment site , such as information on the availability of the C or N terminus of the molecule (determined from its accessibility to solvents, for example), or a cysteine residue. Information regarding exposure of suitable residues to solvents can be provided. As in the case of the Fab fragment, the exposed disulfide bridge may be a source of a second attachment site because it can generally be converted to a single cysteine residue by slow reduction. Slow reducing conditions are selected that do not affect the immunogenicity of IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides. In general, if immunization with a self-antigen is intended to inhibit the interaction of this self-antigen with its natural ligand, the antibody is generated so that an antibody is generated against the site of interaction with the natural ligand. Two attachment sites will be added. Thus the position of the second attachment site, as steric hindrance from any amino acid linker containing a second attachment site or which are avoided, will be selected. In other embodiments, an antibody response directed at a site other than the site where the self-antigen and its natural ligand interact is desired. In such embodiments, the second attachment site can be selected such that production of antibodies against the site of interaction between the self antigen and its natural ligand is prevented.

第２の付着部位の位置を選択する際のその他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補因子の存在、抗原の変性が自己抗原の機能または自己抗原を認識する抗体の生成に適合する抗原構造および配列内の部位を開示する実験的証拠の利用可能性が含まれる。 Other criteria in selecting the location of the second attachment site include the oligomerization state of the antigen, the site of oligomerization, the presence of a cofactor, the function of an antibody that recognizes the function of the autoantigen or the self antigen. The availability of experimental evidence disclosing antigenic structures and sequences within the sequence that are compatible with production is included.

ほとんどの好ましい実施形態で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、コア粒子およびＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットとのそれぞれにある第１の付着部位と会合可能な単一の第２の付着部位または単一の反応性付着部位を含む。このため、少なくとも１つであるが典型的な場合は複数であり、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個を超える抗原とコア粒子およびＶＬＰそれぞれとの画定されかつ均一な結合および会合のそれぞれが確実になる。したがって、抗原上に単一の第２の付着部位または単一の反応性付着部位を設けることによって、単一および均一なタイプの結合および会合のそれぞれが確実になり、その結果、非常に高度に規則的で反復性のアレイが得られる。例えば、結合および会合のそれぞれが、リジン（第１の付着部位として）およびシステイン（第２の付着部位として）の相互作用を介して行われる場合、本発明のこの好ましい実施形態によれば、このシステイン残基が抗原上に天然のものとして存在するかまたは非天然のものとして存在するかに関わらず、抗原当たりただ１つのシステイン残基と、ＶＬＰおよびコア粒子の第１の付着部位との結合および会合のそれぞれが確実になる。 In most preferred embodiments, the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is a single second capable of associating with the first attachment site on the core particle and VLP or VLP subunit, respectively. of including attachment site or a single reactive attachment site. For this reason, there is at least one, but typically a plurality, preferably of defined, uniform binding and association of more than 10, 20, 40, 80, 120 antigens with core particles and VLPs respectively. Each is sure. Accordingly, by providing a single second attachment site or a single reactive attachment site on the antigen, it ensures each single and uniform type of binding and association, as a result, very highly A regular and repeatable array is obtained. For example, if each of the binding and association occurs via the interaction of lysine (as the first attachment site ) and cysteine (as the second attachment site ), according to this preferred embodiment of the invention, Binding of only one cysteine residue per antigen to the VLP and the first attachment site of the core particle, regardless of whether the cysteine residue is present naturally or non-naturally on the antigen And each of the meetings will be ensured.

いくつかの実施形態で、抗原上に第２の付着部位を設計製作することは、本発明の開示による第２の付着部位として適切なアミノ酸を含有するアミノ酸リンカーの融合を必要とする。したがって本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの共有結合によって、アミノ酸リンカーを抗原または抗原決定基に結合する。アミノ酸リンカーは、第２の付着部位を含み、あるいはこれからなることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、スルフィドリル基またはシステイン残基を含む。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーがシステインである。アミノ酸リンカーを選択するいくつかの基準、ならびに本発明によるアミノ酸リンカーのさらに好ましい実施形態については既に述べた。 In some embodiments, designing and producing a second attachment site on an antigen requires the fusion of an amino acid linker containing an appropriate amino acid as the second attachment site according to the present disclosure. Thus, in a preferred embodiment of the invention, the amino acid linker is attached to the antigen or antigenic determinant by at least one covalent bond. The amino acid linker preferably comprises or consists of a second attachment site . In a further preferred embodiment, the amino acid linker comprises a sulfhydryl group or a cysteine residue. In another preferred embodiment, the amino acid linker is cysteine. Some criteria for selecting amino acid linkers, as well as further preferred embodiments of amino acid linkers according to the invention have already been mentioned.

本発明のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原または抗原決定基、すなわちＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、コア粒子およびウイルス様粒子にそれぞれ融合させる。上述のように、ＶＬＰは、典型的な場合、ＶＬＰに組織化する少なくとも１つのサブユニットからなる。したがって、本発明のさらに好ましい実施形態でも同様に、抗原または抗原決定基、好ましくは少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ウイルス様粒子またはＶＬＰに組込み可能なタンパク質の少なくとも１つのサブユニットに融合させて、キメラのＶＬＰサブユニットとＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を生成する。 In a further preferred embodiment of the invention, at least one antigen or antigenic determinant, ie IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, is fused to the core particle and the virus-like particle, respectively. As mentioned above, a VLP typically consists of at least one subunit that organizes into a VLP. Thus, in a further preferred embodiment of the invention, an antigen or antigenic determinant, preferably a protein capable of incorporating at least one IL-5, IL-13 or eotaxin protein or peptide into a virus-like particle or VLP To produce a fusion of the chimeric VLP subunit with an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合は、ＶＬＰサブユニット配列への挿入によって行うことができ、あるいは、ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端あるいはＶＬＰに組込み可能なタンパク質との融合によって、行うことができる。以下、タンパク質またはペプチドとＶＬＰサブユニットとの融合を指す場合、サブユニット配列の両端への融合またはサブユニット配列内部へのペプチドの内部挿入が包含される。 Fusion of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide can be performed by insertion into the VLP subunit sequence, or with the NLP or C-terminus of the VLP subunit or a protein that can be integrated into the VLP. Can be done by fusion. Hereinafter, when referring to a fusion of a protein or peptide with a VLP subunit, fusion to both ends of the subunit sequence or internal insertion of the peptide within the subunit sequence is included.

融合は、サブユニット配列の一部が欠失したＶＬＰサブユニットの変種にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を挿入することによって行ってもよく、これは切断型変異体とも呼ばれるものである。切断型変異体は、ＮまたはＣ末端を有し、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部に内部欠失を有する。例えば、アミノ酸残基７９〜８１の欠失を伴うような特定のＶＬＰＨＢｃＡｇは、内部欠失を有する切断型変異体である。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドと、切断型変異体ＶＬＰサブユニットのＮまたはＣ末端との融合も、本発明の実施形態になる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合は、置換によって行ってもよく、例えば特定のＶＬＰＨＢｃＡｇでは、アミノ酸７９〜８１を外来のエピトープに代える。したがって以下に述べる融合は、ＶＬＰサブユニットの配列にＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を挿入することによって、あるいはＶＬＰサブユニットの配列の一部をＩＬ５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列で置換することによって、あるいは欠失、置換、または挿入の組合せによって行うことができる。 Fusion may be performed by inserting a protein or peptide sequence of IL-5, IL-13, or eotaxin into a variant of the VLP subunit lacking a portion of the subunit sequence, which is a truncated variant It is also called. Truncated variants have an N or C terminus, or have an internal deletion in part of the sequence of the VLP subunit. For example, certain VLP HBcAg, such as those involving deletion of amino acid residues 79-81, are truncated variants with internal deletions. Fusion of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide with the N or C terminus of the truncated mutant VLP subunit is also an embodiment of the present invention. Similarly, fusion of an epitope to the sequence of a VLP subunit may be performed by substitution, for example, in certain VLP HBcAg, amino acids 79-81 are replaced with a foreign epitope. Thus, the fusions described below can be performed by inserting IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide sequences into the VLP subunit sequence, or by inserting a portion of the VLP subunit sequence into IL5, IL-13, Or by substitution with a protein or peptide sequence of eotaxin, or by a combination of deletions, substitutions or insertions.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのキメラタンパク質またはペプチドのサブユニットは、一般に、ＶＬＰに自己組織化することが可能である。そのサブユニットに融合したエピトープを示すＶＬＰも、本明細書ではキメラＶＬＰと呼ぶ。示されるように、ウイルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含み、あるいはこれからなる。本発明の別の実施形態で、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわちそこに抗原が融合していないＶＬＰサブユニットとの混合物であり、いわゆるモザイク粒子と呼ばれる。これは、ＶＬＰの形成およびＶＬＰへの組織体を確実にするのに有利である。これらの実施形態で、キメラＶＬＰサブユニットの割合は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％、またはそれ以上でよい。 Subunits of IL-5, IL-13, or eotaxin chimeric proteins or peptides are generally capable of self-assembling into VLPs. VLPs that display epitopes fused to their subunits are also referred to herein as chimeric VLPs. As indicated, the virus-like particle comprises or consists of at least one VLP subunit. In another embodiment of the invention, the virus-like particle is a mixture of a chimeric VLP subunit and a non-chimeric VLP subunit, ie a VLP subunit to which no antigen is fused, and is referred to as a so-called mosaic particle. This is advantageous to ensure the formation of the VLP and the organization to the VLP. In these embodiments, the proportion of chimeric VLP subunits may be 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95%, or more.

ペプチドの配列の両端またはＶＬＰのサブユニットの配列の両端に融合されるエピトープには、フランキングアミノ酸残基を付加することができ、またはそのようなペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列に内部挿入することができる。グリシンおよびセリン残基は、融合するＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに付加されるフランキング配列に使用するのに特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基は追加の柔軟性をもたらし、それによって、外来の配列をＶＬＰサブユニットの配列に融合する際に不安定な影響が出る可能性を減じることができる。 The epitope fused to both ends of the peptide sequence or both ends of the VLP subunit sequence can be appended with flanking amino acid residues, or such a peptide sequence is inserted internally into the VLP subunit sequence. can do. Glycine and serine residues are particularly preferred amino acids for use in flanking sequences added to IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides to be fused. Glycine residues provide additional flexibility, which can reduce the possibility of instability when fusing foreign sequences to sequences of VLP subunits.

本発明の特定の実施形態で、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））またはいわゆる主免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１）、ＷＯ０１／９８３３３）、本発明の好ましい実施形態である。ＭＩＲ内の欠失を伴う天然に生ずるＨＢｃＡｇの変種も記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１）、その全体を参照により明確に援用する）、ＮまたはＣ末端への融合、ならびにｗｔＨＢｃＡｇと比較した場合の欠失部位に対応するＭＩＲの位置での挿入は、本発明の別の実施形態である。Ｃ末端への融合についても記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者なら、古典的な分子生物学的技法を使用して融合タンパク質をどのように構成すべきかという方向性を容易に見出すであろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、実験室マニュアル第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈｏ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、７７：５１（１９８９））。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用な、ベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１）、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実施する際に使用することができる。また本発明者等は、例として（実施例６）、キメラ自己組織化ＨＢｃＡｇをもたらすＨＢｃＡｇのＭＩＲへのエピトープの挿入についても述べている。自己組織体の効率およびＨＢｃＡｇのＭＩＲに挿入するエピトープのディスプレイを最適化するための重要なファクターは、挿入部位の選択、ならびに挿入によってＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ４２１’６３５；米国第６，２３１，８６４号）であり、言い換えればＨＢｃＡｇからのアミノ酸類を新しいエピトープで置換しなければならない。例えば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１を、外来のエピトープで置換することが記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；米国第６，２３１，８６４号）。ＨＢｃＡｇは、カプシド組織体には重要ではなく核酸に結合可能な長いアルギニン末端部（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１））を含有する（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン末端部を含みまたは含まないＨＢｃＡｇは、いずれも本発明の実施形態である。 In certain embodiments of the invention, the VLP is a hepatitis B core antigen VLP. HBcAg N-terminal fusion proteins (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5: 1157-1163 (1999)) or so-called major immunodominant regions (MIR) have been described (Pumpens, P. and). Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), WO 01/98333), a preferred embodiment of the present invention. Variants of naturally occurring HBcAg with deletions within the MIR have also been described (Pumpens, P. and Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), specifically incorporated by reference in its entirety), Fusion to the N- or C-terminus and insertion at the position of the MIR corresponding to the deletion site when compared to wtHBcAg is another embodiment of the invention. Fusion to the C-terminus has also been described (Pumpens, P. and Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). One skilled in the art will readily find directions on how to construct fusion proteins using classical molecular biology techniques (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Ho et al., Gene, 77:51 (1989)). Vectors and plasmids encoding HBcAg and HBcAg fusion proteins and useful for expression of HBcAg and HBcAg fusion proteins have been described (Pumpens, P. and Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck). S. et al., Nature Med. 5: 1157 to 1163 (1999)), can be used in practicing the present invention. The inventors have also described by way of example (Example 6) the insertion of an epitope into the MIR of HBcAg resulting in a chimeric self-assembled HBcAg. An important factor for optimizing self-assembly efficiency and display of epitopes inserted into the MIR of HBcAg is the selection of the insertion site, as well as the number of amino acids that are deleted from the HBcAg sequence within the MIR (Pumpens, P And Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001); EP421'635; US 6,231,864), in other words, the amino acids from HBcAg must be replaced with new epitopes. For example, replacement of HBcAg amino acids 76-80, 79-81, 79-80, 75-85, or 80-81 with foreign epitopes has been described (Pumpens, P. and Glens, E., Intervirology). 44: 98-114 (2001); EP0421635; US 6,231,864). HBcAg contains a long arginine end (Pumpens, P. and Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)) that is not critical to the capsid organization and can bind to nucleic acids (Pumpens, P. and). Glens, E., Intervirology 44: 98-114 (2001)). Any HBcAg with or without this arginine terminus is an embodiment of the present invention.

本発明のさらに好ましい実施形態で、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主なコートタンパク質は、細菌内、特にＥ．ｃｏｌｉ内での発現によって自発的にＶＬＰに組織化する。本発明の組成物を調製するのに使用可能なバクテリオファージコートタンパク質の特定の例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱβ、Ｑβ ＣＰを指すもの、および配列番号１１；受入番号ＡＡＡ１６６６３、Ｑβ Ａ１タンパク質を指すもの）やバクテリオファージｆｒ（配列番号４；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）などのＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が含まれる。 In a further preferred embodiment of the invention, the VLP is a VLP of RNA phage. The main coat protein of RNA phage is in bacteria, especially E. coli. Spontaneously organized into VLPs by expression in E. coli. Specific examples of bacteriophage coat proteins that can be used to prepare the compositions of the invention include bacteriophage Qβ (SEQ ID NO: 10; PIR database, accession number VCBPQβ, refers to Qβ CP, and SEQ ID NO: 11; RNA bacteriophage coat proteins such as accession number AAA16663, which refers to the Qβ A1 protein) and bacteriophage fr (SEQ ID NO: 4; PIR accession number VCBPFR).

より好ましい実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを、Ｑβコートタンパク質に融合させる。切断型のＱβのＡ１タンパク質のＣ末端にエピトープを融合させ、またはＡ１タンパク質内にエピトープを挿入した融合タンパク質構成体が、記述されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンで抑制することによって生成し、Ｎ末端メチオニンの切断を考慮した場合、その長さは３２９ａａまたは３２８ａａである。アラニン（Ｑβ ＣＰ遺伝子によってコードされた第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は、通常Ｅ．ｃｏｌｉで起こり、Ｑβコートタンパク質ＣＰのＮ末端ではそれが起こる。ＵＧＡアンバーコドンのＡ１遺伝子３’の部分は、長さが１９５アミノ酸であるＣＰ伸長部をコードする。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを挿入することも、本発明の実施形態になる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端切断型のＱβ Ａ１タンパク質のＣ末端で、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを融合することも、本発明のさらに好ましい実施形態になる。例えばＫｏｚｌｏｖｓｋａ他は（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））、位置１９で切断されたＱβ ＣＰ伸長部のＣ末端でエピトープが融合した、Ｑβ Ａ１タンパク質融合について述べている。 In a more preferred embodiment, at least one protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin is fused to the Qβ coat protein. Fusion protein constructs have been described in which an epitope is fused to the C-terminus of the A1 protein of truncated Qβ, or an epitope inserted within the A1 protein (Kozlovska, TM et al., Intervirology, 39: 9- 15 (1996)). The A1 protein is generated by suppression with a UGA stop codon, and its length is 329aa or 328aa when considering cleavage of the N-terminal methionine. Cleavage of the N-terminal methionine before alanine (the second amino acid encoded by the Qβ CP gene) is usually E. coli. that occurs at the E. coli and at the N-terminus of the Qβ coat protein CP. The A1 gene 3 'portion of the UGA amber codon encodes a CP extension that is 195 amino acids in length. Insertion of at least one IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide between positions 72 and 73 of the CP extension is also an embodiment of the invention (Kozlovska, TM et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). Fusion of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide at the C-terminus of the C-terminal truncated Qβ A1 protein is also a more preferred embodiment of the present invention. For example, Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) describe Qβ A1 protein fusions in which the epitope is fused at the C-terminus of the Qβ CP extension cleaved at position 19.

Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記述されるように、融合エピトープを示す粒子の組織体は、典型的な場合、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体と、ｗｔＣＰとの両方を存在させて、モザイク粒子を形成する必要がある。しかし、ウイルス様粒子、本明細書では特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰであって、そこに融合した少なくとも１つのＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを有するＶＬＰサブユニットのみからなるものを含む実施形態も、本発明の範囲内である。 As described by Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)), the organization of particles exhibiting a fusion epitope typically consists of an A1 protein and IL-5, IL-13, or eotaxin. Both the fusion with protein or peptide and wtCP need to be present to form mosaic particles. However, from virus-like particles, particularly VLPs of RNA phage Qβ coat protein, only VLP subunits having at least one IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide fused thereto Embodiments including such are also within the scope of the present invention.

モザイク粒子の生成は、いくつかの方法で行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇ、３９：９〜１５（１９９６）は、２つの方法について述べており、これらはいずれも本発明を実施する際に使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上での融合エピトープの効率的な提示が、クローニングされたＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミドを収容したＥ．ｃｏｌｉ株のＣＰとＣＰ伸長部との間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ Ａ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって仲介され、ＵＧＡコドンがＴｒｐに翻訳される（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（ＳｍｉｌｅｙＢ．Ｋ．他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３４：３３〜４０（１９９３）））。別の手法では、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡに変更し、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製源は第１のプラスミドに適合するものである（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｋ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されているように、ＣＰと、Ａ１タンパク質とＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合体を、２シストロン的手法でコードし、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに動作可能に結合する。 The generation of mosaic particles can be done in several ways. Kozlovska et al., Intervirolog, 39: 9-15 (1996), describes two methods, both of which can be used in practicing the present invention. In the first approach, efficient presentation of fusion epitopes on VLPs was performed in E. coli containing a plasmid encoding a cloned UGA suppressor tRNA. The UGA codon is translated into Trp mediated by expression of a plasmid encoding a Qβ A1 protein fusion with a UGA stop codon between the CP and CP extension of E. coli strain (pISM3001 plasmid (Smiley BK et al. Gene 134: 33-40 (1993)). In another approach, the CP gene stop codon is changed to UAA and a second plasmid expressing a fusion of the A1 protein and an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is cotransformed. The second plasmid encodes a different antibiotic resistance and the source of replication is compatible with the first plasmid (Kozlovska, TK et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996)). In the third approach, as described in FIG. 1 of Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996), CP and A1 protein and IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide Is fused in a bicistronic manner and operably linked to a promoter such as the Trp promoter.

別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ｆｒＣＰのアミノ酸２と３（切断ＣＰの付番、すなわちＮ末端メチオニンが切断される）の間に挿入し、したがってＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとｆｒＣＰ融合タンパク質になる。ＶＬＰに自己組織化するｆｒＣＰ融合タンパク質を構成し発現するためのベクターおよび発現系であって、本発明の実施に有用なものが、記載されている（ＰｕｓｈｋｏＰ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド配列を、アミノ酸２の後の、ｆｒＣＰの欠失変種、すなわちｆｒＣＰの残基３および４が欠失している部分に挿入する（ＰｕｓｈｋｏＰ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。 In another embodiment, IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is inserted between amino acids 2 and 3 of fr CP (numbering of the cleavage CP, ie, the N-terminal methionine is cleaved). Thus, it becomes a fr CP fusion protein with IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. Vectors and expression systems for constructing and expressing fr CP fusion proteins that self-assemble into VLPs and useful for the practice of the present invention have been described (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6). : 883-891 (1993)). In certain embodiments, the protein or peptide sequence of IL-5, IL-13, or eotaxin is deleted after deletion of fr CP of amino acid 2, ie, residues 3 and 4 of fr CP. (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)).

ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ末端***βヘアピンへのエピトープの融合と、その後の、ＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上での融合エピトープの提示についても記述されており（ＷＯ９２／１３０８１）、ＭＳ−２ＲＮＡファージのコートタンパク質への挿入または置換によるＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合も、本発明の範囲内に含まれる。 The fusion of the epitope to the N-terminal raised β hairpin of the RNA phage MS-2 coat protein and subsequent display of the fusion epitope on the self-assembled VLP of RNA phage MS-2 has also been described (WO92 / 13081), fusion of IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides by insertion or substitution of MS-2 RNA phage into the coat protein is also included within the scope of the present invention.

本発明の別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、パピローマウイルスのカプシドタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要カプシドタンパク質Ｌ１に融合する。バキュロウイルス／昆虫細胞系内でＢＰＶ−１融合タンパク質を構成し発現させるためのベクターおよび発現系について、記述されている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６を、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドで置換することによって、ＢＰＶ−１Ｌ１と、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質が得られるが、これは本発明の好ましい実施形態である。バキュロウイルスベクターでのクローニング、およびバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞での発現について記述されており、本発明を実施する際に使用することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ００／２３９５５）。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの融合タンパク質またはペプチドを示す組織化粒子の精製は、ゲルろ過やショ糖勾配超遠心分離などのいくつかの方法で行うことができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ００／２３９５５）。 In another embodiment of the invention, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is fused to the capsid protein of papillomavirus. In a more specific embodiment, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is fused to the major capsid protein L1 of bovine papillomavirus type 1 (BPV-1). Vectors and expression systems for constructing and expressing BPV-1 fusion proteins in baculovirus / insect cell systems have been described (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373. 2378 (1999), WO 00/23955). By replacing amino acids 130-136 of BPV-1 L1 with IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, BPV-1 L1 and IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide A fusion protein with a peptide is obtained, which is a preferred embodiment of the present invention. It has been described for cloning in baculovirus vectors and expression in baculovirus infected Sf9 cells and can be used in practicing the present invention (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955). Purification of organized particles exhibiting IL-5, IL-13, or eotaxin fusion protein or peptide can be accomplished by several methods such as gel filtration or sucrose gradient ultracentrifugation (Chackerian, B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2373-2378 (1999), WO 00/23955).

本発明の別の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ＴｙＶＬＰに組込み可能なＴｙタンパク質に融合する。より特定の実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを、ＴＹＡ遺伝子でコードしたｐ１またはカプシドタンパク質に融合する（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．、酵母（Ｙｅａｓｔ）、１６：７８５〜７９５（２０００））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３、および４は、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＳｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離し、一方、レトロトランスポゾンＴｆ１は、シゾサッカロミセスポンベ（ＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＰｏｍｂａｅ）から単離した（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．およびＳａｎｄｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｂ．、「ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔｓ」、ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅｄｙｎａｍｉｃｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄＥｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、第１９３頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は、コピア種の植物および動物要素に関係し、一方Ｔｙ３は、植物および動物のレトロウイルスに関係するジプシー科のレトロトランスポゾンに属する。Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｇａｇまたはカプシドタンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質の長さが４４０アミノ酸である。Ｐ１は、位置４０８でのＶＬＰの成熟中に切断され、その結果、ＶＬＰの本質的な成分であるｐ２タンパク質が得られる。 In another embodiment of the invention, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is fused to a Ty protein that can be incorporated into a Ty VLP. In a more specific embodiment, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is fused to the p1 or capsid protein encoded by the TYA gene (Roth, JF, Yeast, 16: 785-795 (2000)). Yeast retrotransposons Ty1, 2, 3, and 4 were isolated from Saccharomyces Serevisiae, while retrotransposon Tf1 was isolated from Schizosaccharomyces pombae (Boeke, JD, and Sandy). B., “Yeast Transposable elements”, The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, p. Retrotransposons Ty1 and 2 are related to copia plant and animal elements, while Ty3 belongs to the gypsy family of retrotransposons related to plant and animal retroviruses. In the Ty1 retrotransposon, the length of the p1 protein, also called Gag or capsid protein, is 440 amino acids. P1 is cleaved during VLP maturation at position 408, resulting in the p2 protein, an essential component of VLP.

ｐ１との融合タンパク質と、酵母内で前記融合タンパク質を発現させるためのベクターが記述されている（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。したがって例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをｐ１に融合することができる（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２９：６８〜７０（１９８７））。ｐＭＡ５６２０ベクターへの外来エピトープをコードする配列のクローニングによって、外来エピトープのＮ末端にＣ末端が融合したＴｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質が発現する。同様に、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドのＮ末端融合、あるいはｐ１配列への内部挿入、あるいはｐ１配列の一部の置換も、本発明の範囲内に含まれるものとする。特に、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０〜３１と、６７〜６８と、１１３〜１１４と、１３２〜１３３との間のＴｙ配列に、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを挿入することも（ＥＰ０６７７１１１）、本発明の好ましい実施形態になる。 A fusion protein with p1 and a vector for expressing the fusion protein in yeast have been described (Adams, SE et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Thus, for example, by inserting a sequence encoding an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide into the BamH1 site of the pMA5620 plasmid, the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide becomes p1. Can be fused (Adams, SE et al., Nature 329: 68-70 (1987)). Cloning of the sequence encoding the foreign epitope into the pMA5620 vector expresses a fusion protein comprising amino acids 1-381 of p1 of Ty1-15 fused at the C-terminus to the N-terminus of the foreign epitope. Similarly, N-terminal fusions of IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides, or internal insertions into the p1 sequence, or substitutions of parts of the p1 sequence are also included within the scope of the present invention. To do. In particular, an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide is inserted into the Ty sequence between amino acids 30-31, 67-68, 113-114, and 132-133 of Ty protein p1. (EP0677111) is also a preferred embodiment of the present invention.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの融合に適する別のＶＬＰは、例えば、レトロウイルス様粒子（ＷＯ９６３０５２３）、ＨＩＶ２Ｇａｇ（Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｃ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３５３〜３６４（１９９９））、ササゲモザイクウイルス（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３８７〜３９２（１９９９））、パルボウイルスＶＰ２ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ，Ｐ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２６３：８９〜９９（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国第４，７２２，８４０号、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）である。 Other VLPs suitable for fusion of IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides are, for example, retrovirus-like particles (WO9630523), HIV2 Gag (Kang, YC, et al., Biol. Chem. 380: 353-364 (1999)), cowpea mosaic virus (Taylor, KM et al., Biol. Chem. 380: 387-392 (1999)), parvovirus VP2 VLP (Rueda, P. et al., Virology 263: 89- 99 (1999)), HBsAg (US Pat. No. 4,722,840, EP0020416B1).

本発明の実施に適するキメラＶＬＰの例として、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ３９：１（１９９６）に記載されているものもある。本発明での使用が企図されるＶＬＰのその他の例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスのウイルス様粒子も作製され、これらＶＬＰのキメラＶＬＰも、本発明の範囲内にある。 An example of a chimeric VLP suitable for the practice of the present invention is that described in Intervirology 39: 1 (1996). Other examples of VLPs contemplated for use in the present invention are HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG. , Tobacco mosaic virus. Virus-like particles of SV-40, polyomavirus, adenovirus, herpes simplex virus, rotavirus, and Norwalk virus have also been made, and chimeric VLPs of these VLPs are also within the scope of the present invention.

本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである。 In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide.

本発明のさらに好ましい実施形態で、抗原または抗原決定基はＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの変種であり、例えばアミノ酸の置換、ペプチドの挿入、または多形性を含むものである。既に述べたように、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの変種を含む組成物およびワクチン組成物のそれぞれは、本発明の範囲に含まれる。 In further preferred embodiments of the invention, the antigen or antigenic determinant is a protein or peptide variant of IL-5, IL-13, or eotaxin, including, for example, amino acid substitutions, peptide insertions, or polymorphisms . As already mentioned, each of the compositions and vaccine compositions comprising variants of IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide are within the scope of the present invention.

ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドは、原核または真核発現系でＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンｃＤＮＡを発現させることによって生成することができる。これに関する様々な例が文献に記載されており、おそらくは変性後に使用して、任意の所望の種の任意のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを発現することができる。ＩＬ−５のタンパク質またはペプチドをどのように生成するかについてもＷＯ９００／６５０５８に開示されており、その関連事項も記載されている。 An IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide can be generated by expressing IL-5, IL-13, or eotaxin cDNA in a prokaryotic or eukaryotic expression system. Various examples in this regard are described in the literature and can possibly be used after denaturation to express any IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide of any desired species. How to produce IL-5 protein or peptide is also disclosed in WO900 / 65058, and the related matters are also described.

本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである。そのようなＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドまたはその断片は、標準的な分子生物学的技法を使用して生成することができ、すなわち問題となっている断片をコードするヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅し、ＧＳＴタグやＭＢＰタグ、ヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、または抗体の定常部（Ｆｃ領域）などのポリペプチドタグに、融合体としてクローニングする。ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシン断片とタグとの間にプロテアーゼ切断部位を導入することによって、対応するプロテアーゼを用いた消化による精製の後、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドをタグから分離することができる。別の手法では、当業者に知られている標準的なペプチド合成反応を使用して、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをｉｎｖｉｔｒｏ合成することができる。別の手法では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの完全長タンパク質のプロテアーゼ消化または化学的切断によって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドを生成することができるが、これらの方法はどちらも当業者に周知である。 In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant is IL-5, IL-13, or an eotaxin peptide. Such IL-5, IL-13, or eotaxin peptides or fragments thereof can be generated using standard molecular biological techniques, i.e. the nucleotide sequence encoding the fragment in question. It is amplified by PCR and cloned as a fusion into a polypeptide tag such as a GST tag, MBP tag, histidine tag, Flag tag, myc tag, or antibody constant region (Fc region). By introducing a protease cleavage site between the IL-5, IL-13, or eotaxin fragment and the tag, after purification by digestion with the corresponding protease, the IL-5, IL-13, or eotaxin peptide Can be separated from the tag. In another approach, IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides can be synthesized in vitro using standard peptide synthesis reactions known to those skilled in the art. In another approach, IL-5, IL-13, or eotaxin peptides can be produced by protease digestion or chemical cleavage of IL-5, IL-13, or eotaxin full-length protein, but these Both methods are well known to those skilled in the art.

本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基はさらに、（ｉ）前記抗原または抗原決定基との天然でない付着部位、（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基との天然の付着部位からなる群から選択された少なくとも１つの第２の付着部位を含む。ウイルス様粒子との結合のためにＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドをどのように変性させるかに関する指針は、本願全体を通して示されている。好ましい第２の付着部位は、誘導化ＶＬＰと結合するシステイン残基を含み、その例が、上記事項と実施例１２および１３に記載されている。 In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant further comprises (i) a non-natural attachment site with said antigen or antigenic determinant, (ii) a natural attachment site with said antigen or antigenic determinant It includes at least one second attachment site selected from the group. Guidance on how to denature IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides for binding to virus-like particles is provided throughout this application. Preferred second attachment sites include cysteine residues that bind to derivatized VLPs, examples of which are described above and in Examples 12 and 13.

本発明者等は、ＩＬ−５の３次元構造モデルの分析を行って、本発明によるＶＬＰ上の第１の付着部位に連結可能になるよう選択された第２の結着部（ＮＨ_２末端）の接触可能性について決定した。Ｎ末端は、追加のシステイン残基と共にアミノ酸リンカーを含む第２の付着部位を結着するのに好ましい。しかし、第２の付着部位としてシステイン残基を含有し、ＩＬ−５構成体のＣ末端で融合するアミノ酸リンカーも、本発明のさらに好ましい実施形態になる。システイン残基融合Ｌを含有するＮ末端アミノ酸リンカーを持つヒトＩＬ−５構成体は、本発明の非常に好ましい実施形態である。 The inventors have analyzed the three-dimensional structural model of IL-5 and selected a second binding site (NH ₂ terminal selected) to be connectable to the first attachment site on the VLP according to the present invention. ) Contact possibility was determined. The N-terminus is preferred for attaching a second attachment site comprising an amino acid linker with an additional cysteine residue. However, an amino acid linker that contains a cysteine residue as the second attachment site and is fused at the C-terminus of the IL-5 construct is also a more preferred embodiment of the present invention. A human IL-5 construct with an N-terminal amino acid linker containing a cysteine residue fusion L is a highly preferred embodiment of the present invention.

当業者なら、同様の手順を使用して、ＶＬＰの第１の付着部位との連結が最適化されるように、ＩＬ−１３およびエオタキシン上の付着部位の接触可能性をモデル化することができる。 A person skilled in the art can use similar procedures to model the accessibility of attachment sites on IL-13 and eotaxin so that the linkage of the VLP to the first attachment site is optimized. .

マウスＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド構成体が開示されており、好ましいヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチド断片構成体も生成することができる。さらに好ましい構成体は、すべてのヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンタンパク質、ヒトＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンペプチドである。好ましくはＶＬＰに結合したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドを含む本発明の組成物を使用した、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに対する免疫化は、好酸球成分に伴うアレルギー性疾患を治療しまたは予防する方法を提供することができる。 Mouse IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide constructs are disclosed, and preferred human IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide fragment constructs can also be generated. Further preferred constructs are all human IL-5, IL-13, or eotaxin protein, human IL-5, IL-13, or eotaxin peptide. Immunization against IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide, preferably using a composition of the invention comprising IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide conjugated to VLP, A method of treating or preventing allergic diseases associated with eosinophil components can be provided.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドが、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質の少なくとも１つの抗原部位を含む。当業者なら、対応するペプチドおよびアミノ酸配列のそれぞれをどのように識別するか理解している。 In a further preferred embodiment of the invention, the IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide comprises at least one antigenic site of the IL-5, IL-13, or eotaxin protein. Those skilled in the art understand how to identify each of the corresponding peptide and amino acid sequences.

本発明のさらに好ましい実施形態では、モノクローナル抗体を中和することによって定められるような（Ｄｉｃｋａｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（３）：１０３０〜７１９９６）、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの非隣接または隣接ペプチドが含まれる。 In a further preferred embodiment of the invention, IL-5, IL as defined by neutralizing monoclonal antibodies (Dickason, RR et al., J. Immunol. 156 (3): 1030-7 1996). -13, or non-adjacent or adjacent peptides of eotaxin.

本発明のさらに好ましい実施形態では、レセプターの相互作用に関与しかつＩＬ−５のＣＯＯ−末端からなどのレセプターとの相互作用に重要であることが予想される、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの非隣接または隣接ペプチドが含まれる。 In a further preferred embodiment of the invention, IL-5, IL-13, which are involved in receptor interaction and are expected to be important for interaction with receptors such as from the COO-terminus of IL-5, Or non-adjacent or adjacent peptides of eotaxin.

本発明での使用に適するその他のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、Ｔ細胞または抗体応答を誘発するその固有の性質によって実験的に決定することができる。これは一般に、免疫学的に適切な製剤において選択されたペプチドで個別に実験動物を免疫化し、当業者に知られている方法を使用してＴ細胞およびＢ細胞、すなわち抗体応答を測定することによって実現される。抗原がタンパク質またはペプチドである場合、この領域は、連続アミノ酸配列によって形成することができる。あるいは、不連続アミノ酸配列によって抗体エピトープを形成することができ、その場合、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの３次元折畳みの後、空間的に互いに近付いてエピトープを形成するような状態で、アミノ酸が配列する。問題となっている連続ペプチド断片は、上述の免疫化実験によって識別することができる。 Other IL-5, IL-13, or eotaxin peptides suitable for use in the present invention can be empirically determined by their intrinsic properties that elicit T cell or antibody responses. This generally involves immunizing laboratory animals individually with selected peptides in an immunologically appropriate formulation and measuring T and B cells, ie antibody responses, using methods known to those skilled in the art. It is realized by. If the antigen is a protein or peptide, this region can be formed by a contiguous amino acid sequence. Alternatively, an antibody epitope can be formed by a discontinuous amino acid sequence, in which case the amino acids are in a state such that after three-dimensional folding of the protein, polypeptide, or peptide, they are spatially close together to form the epitope. Arrange. The contiguous peptide fragment in question can be identified by the immunization experiments described above.

本発明での使用に適するさらに好ましいＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、既存のまたは将来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して識別することができ、これに関する手順は当業者に知られている。 More preferred IL-5, IL-13, or eotaxin peptides suitable for use in the present invention can be identified using existing or future monoclonal or polyclonal antibodies, and procedures relating thereto are known to those skilled in the art. Are known.

本発明での使用に適するその他のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのペプチドは、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドに特異的な抗体で、ファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって識別することができ、これは当業者に周知の方法である。 Other IL-5, IL-13, or eotaxin peptides suitable for use in the present invention are antibodies specific for IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides, and phage display peptide libraries. It can be identified by screening, a method well known to those skilled in the art.

本発明のさらに好ましい実施形態では、抗原または抗原決定基は、任意の動物から単離したＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質、ならびに任意の動物の、任意のＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンの抗原ペプチドである。当業者なら、これらの単離されたＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドからどのようにペプチドを生成するかを理解している。 In a further preferred embodiment of the invention, the antigen or antigenic determinant comprises IL-5, IL-13, or eotaxin protein isolated from any animal, as well as any IL-5, IL- of any animal. 13, or an antigen peptide of eotaxin. Those skilled in the art understand how to produce peptides from these isolated IL-5, IL-13, or eotaxin proteins or peptides.

本発明の別の好ましい実施形態では、抗原決定基がインターロインキン１３（ＩＬ−１３）である。ＩＬ−１３は、活性化Ｔリンパ球によって分泌され、単球、マクロファージ、およびＢ細胞に影響を及ぼすサイトカインである。前駆体ヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列を配列番号２３０で示し、プロセッシングされたヒトＩＬ−１３のアミノ酸配列を配列番号２３１で示す。前駆体タンパク質の最初の２０のアミノ酸はシグナルペプチドに対応し、プロセッシングされたタンパク質は存在しない。マウス配列も記載されており、プロセッシングされたアミノ酸配列を配列番号２３２に示す（ＢｒｏｗｎＫ．Ｄ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：６７９〜６８７（１９８９））。発現宿主に応じて、ＩＬ−１３構成体は、例えば真核宿主での発現および分泌では前駆体タンパク質の配列を含むことになり、あるいは例えばＥ．ｃｏｌｉでの細胞質発現では、成熟タンパク質からなる。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでの発現では、ＩＬ−１３のシグナルペプチドを細菌シグナルペプチドに代える。 In another preferred embodiment of the invention, the antigenic determinant is interlokin 13 (IL-13). IL-13 is a cytokine that is secreted by activated T lymphocytes and affects monocytes, macrophages, and B cells. The amino acid sequence of the precursor human IL-13 is shown in SEQ ID NO: 230, and the amino acid sequence of processed human IL-13 is shown in SEQ ID NO: 231. The first 20 amino acids of the precursor protein correspond to the signal peptide and there is no processed protein. A mouse sequence has also been described, and the processed amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 232 (Brown KD et al., J. Immunol. 142: 679-687 (1989)). Depending on the expression host, the IL-13 construct will contain the sequence of the precursor protein, eg, for expression and secretion in a eukaryotic host, or For cytoplasmic expression in E. coli, it consists of mature protein. E. For expression in the periplasm of E. coli, the IL-13 signal peptide is replaced with a bacterial signal peptide.

ＩＬ−１３は、最近になってアレルギー性気道応答（喘息）に結び付けられたＴヘルパー２由来サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５など）である。ＩＬ−１３およびＩＬ−１３レセプターのアップレギュレーションは、多くの腫瘍型（例えばホジキンリンパ腫）に見出されている。インターロイキン１３は、ホジキン細胞およびリード−ステンベルグ細胞の増殖によって分泌され、これらの細胞の増殖を刺激する（ＫａｐｐＵ他、ＪＥｘｐＭｅｄ．１８９：１９３９〜４６（１９９９））。したがってＩＬ−１３に対する免疫化は、とりわけ喘息やホジキンリンパ腫などの上述の状態を治療する方法を提供する。 IL-13 is a T helper 2 derived cytokine (IL-4, IL-5, etc.) that has recently been linked to an allergic airway response (asthma). Upregulation of IL-13 and IL-13 receptor has been found in many tumor types (eg, Hodgkin lymphoma). Interleukin 13 is secreted by the growth of Hodgkin cells and Reed-Stemberg cells and stimulates the growth of these cells (Kapp U et al., J Exp Med. 189: 1939-46 (1999)). Thus, immunization against IL-13 provides a method of treating the above-mentioned conditions such as asthma and Hodgkin lymphoma, among others.

組成物は、遊離システイン残基を含有して成熟ＩＬ−１３配列のＮまたはＣ末端に融合するアミノ酸リンカーを含み、それによってタンパク質内に第２の付着部位を導入することが好ましい。さらに好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーは、ＩＬ−１３のＮＭＲ構造により自由に接触可能であるので、成熟形態のＩＬ−１３のＮ末端に付加する（Ｅｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒ，Ｅ．Ｚ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１０：２３１（２００１））。さらに好ましい実施形態でも、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーを、プロセッシング済みのタンパク質の配列に対応する配列のＮ末端に融合し、またはシグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端で挿入する。さらに好ましい実施形態では、遊離システイン残基を含有するアミノ酸リンカーを、タンパク質のＣ末端に付加する。 The composition preferably includes an amino acid linker containing a free cysteine residue and fused to the N- or C-terminus of the mature IL-13 sequence, thereby introducing a second attachment site within the protein. In a more preferred embodiment, an amino acid linker containing a free cysteine is freely accessible by the NMR structure of IL-13, and thus adds to the N-terminus of mature form of IL-13 (Eisenmesser, EZ et al. J. Mol. Biol. 310: 231 (2001)). In further preferred embodiments, an amino acid linker containing a free cysteine is fused to the N-terminus of the sequence corresponding to the sequence of the processed protein, or the N-terminus of the sequence of the mature form protein on the C-terminal side of the signal peptide. Insert with. In a further preferred embodiment, an amino acid linker containing a free cysteine residue is added to the C-terminus of the protein.

ＩＬ−１３は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させることができ（ＥｉｓｅｎｍｅｓｓｅｒＥ．Ｚ．他、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０：１８６〜９５（２０００））、またはＮＳ−０細胞（真核細胞系）で発現させることができる（Ｃａｎｎｏｎ−ＣａｒｌｓｏｎＳ．他、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：２３９〜４８（１９９８））。実施例８は、細菌内での、システイン残基を含有するアミノ酸リンカーに融合したマウスＩＬ−１３−Ｆの、クローニンング、構成体の発現、および精製について示している。また、エオタキシン−ＶＬＰワクチンの生成および試験についても述べている。ヒトＩＬ−１３構成体は、実施例８の教示により生成することができ、融合タンパク質の発現と、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼのそれぞれによる切断の後に、タンパク質であるヒトＣ−ＩＬ−１３（配列番号３３０）およびヒトＣ−ＩＬ−１３−Ｓ（配列番号３３１）が得られる。このように生成されたタンパク質は、ＶＰＬおよび線毛に連結することができ、本発明の好ましい実施形態が得られる。 IL-13 is E.I. can be expressed in E. coli (Eisenmeser E.Z. et al., Protein Expr. Purif. 20: 186-95 (2000)), or can be expressed in NS-0 cells (eukaryotic cell lines) (Cannon- Carlson S. et al., Protein Expr. Purif.12: 239-48 (1998)). Example 8 shows cloning, construct expression, and purification of mouse IL-13-F fused to an amino acid linker containing a cysteine residue in bacteria. It also describes the production and testing of eotaxin-VLP vaccines. Human IL-13 constructs can be generated according to the teachings of Example 8, and after expression of the fusion protein and cleavage by factor Xa and enterokinase, respectively, the protein human C-IL-13 (sequence No. 330) and human C-IL-13-S (SEQ ID NO: 331) are obtained. The protein thus generated can be linked to VPL and pili, resulting in a preferred embodiment of the present invention.

本発明のさらに別の実施形態では、抗原決定基がインターロイキン５（ＩＬ−５）である。ＩＬ−５は、好酸球形成に関する系統特異的サイトカインであり、喘息などの、好酸球数の増加に関連する疾患において重要な役割を果たす。前駆体およびプロセッシング済みのヒトＩＬ−５の配列を、配列番号２３３および配列番号２３４にそれぞれ示し、プロセッシングされたマウスアミノ酸配列を配列番号２３５で示す。 In yet another embodiment of the invention, the antigenic determinant is interleukin 5 (IL-5). IL-5 is a lineage-specific cytokine related to eosinophil formation and plays an important role in diseases associated with increased eosinophil count, such as asthma. The precursor and processed human IL-5 sequences are shown in SEQ ID NO: 233 and SEQ ID NO: 234, respectively, and the processed mouse amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 235.

ＩＬ−５の生物学的機能は、いくつかの研究で示されており（ＣｏｆｆｍａｎＲ．Ｌ．他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５：３０８〜１０（１９８９）；Ｋｏｐｆ他、免疫性（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）４：１５〜２４（１９９６））、これらは、好酸球により媒介される疾患において、ＩＬ−５の機能を阻害するという有益な作用を示している。したがってＩＬ−５の動作の阻害は、喘息および好酸球に関連するその他の疾患に対する治療法を提供する。 The biological function of IL-5 has been shown in several studies (Coffman RL et al., Science 245: 308-10 (1989); Kopf et al., Immunity 4: 15-24 (1996)), which have shown beneficial effects of inhibiting IL-5 function in diseases mediated by eosinophils. Thus, inhibition of IL-5 action provides a treatment for asthma and other diseases associated with eosinophils.

ＩＬ−５は、ジスルフィド架橋によって共有結合するダイマーを形成する。ＩＬ−５の２つのモノマーがペプチドリンカーによって結合される１本鎖（ｓｃ）構成体が報告されている。 IL-5 forms dimers that are covalently linked by disulfide bridges. A single chain (sc) construct in which two monomers of IL-5 are joined by a peptide linker has been reported.

本発明の好ましい実施形態で、遊離システインを含有するペプチドリンカーは、プロセッシング済み形態のＩＬ−５の配列のＮ末端に付加される。遊離システインを含有するリンカーの付加は、好ましくはプロセッシング済み形態のｓｃＩＬ−５の配列のＮ末端でなされることも考えられる。さらに好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーが、プロセッシング済みタンパク質の配列に対応した配列のＮ末端に融合され、シグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端に挿入される。 In a preferred embodiment of the invention, a peptide linker containing a free cysteine is added to the N-terminus of the sequence of the processed form of IL-5. It is also contemplated that the addition of a linker containing a free cysteine is preferably made at the N-terminus of the sequence of the processed form of scIL-5. In a further preferred embodiment, an amino acid linker containing a free cysteine is fused to the N-terminus of the sequence corresponding to the sequence of the processed protein and inserted at the N-terminus of the sequence of the mature form protein on the C-terminal side of the signal peptide. Is done.

さらに好ましい実施形態でも、遊離システインを含有するリンカーが、ＩＬ−５の配列のＣ末端に融合し、またはｓｃＩＬ−５配列のＣ末端に融合する。 In further preferred embodiments, a linker containing a free cysteine is fused to the C-terminus of the IL-5 sequence or to the C-terminus of the scIL-5 sequence.

ＩＬ−５に関するいくつかの発現系が記載されており、本発明の組成物の調製に使用することができる。Ｅ．ｃｏｌｉを使用する細菌発現系が、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他により述べられている（ＢｉｏｃｈｅｍＪ．２７０：３５７〜６１（１９９０））。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質内でＩＬ−５が発現する場合、ＩＬ−５構成体にはシグナルペプチドが欠けている。本発明の組成物を作成するためにＩＬ−５構成体を生成する際、昆虫細胞を使用してもよい（ＰｉｅｒｒｏｔＣ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５３：７５６〜６０（１９９８））。同様に、バキュロウイルス発現系（ｓｆ９細胞；ＩｎｇｌｅｙＥ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６：６２３〜９（１９９１）、およびＢｒｏｗｎＰ．Ｍ．他、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６：６３〜７１（１９９５））を使用することもできる。最後に、哺乳動物発現系も報告されており（ＣＨＯ細胞）、本発明のこれらの組成物を調製するのに使用することができる（ＫｏｄａｍａＳ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）１１０：６９３〜７０１（１９９１））。 Several expression systems for IL-5 have been described and can be used to prepare the compositions of the invention. E. A bacterial expression system using E. coli has been described by Proudfoot et al. (Biochem J. 270: 357-61 (1990)). E. When IL-5 is expressed in the cytoplasm of E. coli, the IL-5 construct lacks the signal peptide. Insect cells may be used in generating IL-5 constructs to make the compositions of the present invention (Pierrot C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 756-60 (1998)). ). Similarly, the baculovirus expression system (sf9 cells; Ingley E. et al., Eur. J. Biochem. 196: 623-9 (1991), and Brown PM et al., Protein Expr. Purif. 6: 63-71 ( 1995)) can also be used. Finally, mammalian expression systems have also been reported (CHO cells) and can be used to prepare these compositions of the invention (Kodama S et al., J. Biochem. (Tokyo) 110: 693). 701 (1991)).

バキュロウイルス発現系（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：３３２Ｓ（１９９３）；ＫｕｎｉｍｏｔｏＤＹ他、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）３：２２４〜３０（１９９１））およびＣＨＯ細胞を使用する哺乳動物細胞発現系（ＫｏｄａｍａＳ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：４１９〜２７（１９９２））も、マウスＩＬ−５に関するものが記載されている。 Baculovirus expression system (Mitchell et al., Biochem. Soc. Trans. 21: 332S (1993); Kunimoto DY et al., Cytokine 3: 224-30 (1991)) and mammalian cell expression system using CHO cells ( Kodama S et al., Glycobiology 2: 419-27 (1992) also describes mouse IL-5.

実施例７および１０は、ＶＬＰおよび線毛と連結するためのシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーに対してＩＬ−５配列がそのＮ末端で融合しているマウスＩＬ−５構成体の、実験的喘息のマウスモデルにおける、発現、精製、ＶＬＰとの連結、免疫化、及び試験について述べている。ヒト構成体は、実施例７および１０の教示により生成することができ、ＶＬＰおよび線毛との連結に適したタンパク質であるヒトＣ−ＩＬ−５−Ｅ（配列番号３３５）、ヒトＣ−ＩＬ−５−Ｆ（配列番号３３６）、およびヒトＣ−ＩＬ−５−Ｓ（配列番号３３７）が得られ、本発明の好ましい実施形態になる。 Examples 7 and 10 are experimental studies of mouse IL-5 constructs in which the IL-5 sequence is fused at its N-terminus to an amino acid linker containing a cysteine residue for linking to VLP and pili. Describes expression, purification, linking with VLPs, immunization, and testing in a mouse model of asthma. Human constructs can be generated according to the teachings of Examples 7 and 10, human C-IL-5-E (SEQ ID NO: 335), a protein suitable for ligation with VLPs and pili, human C-IL -5-F (SEQ ID NO: 336) and human C-IL-5-S (SEQ ID NO: 337) are obtained and are a preferred embodiment of the present invention.

別の特定の実施形態では、抗原決定基はエオタキシンである。エオタキシンは、好酸球、好塩基球、およびＴｈ２細胞上に存在する、ケモカインレセプター３に特異的なケモカインである。しかしエオタキシンは、好酸球に非常に特異的であるようにみえる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５８３９〜４６（２０００））。好酸球の遊走は、エオタキシン１ノックアウトマウスで７０％低下するが、依然として好酸球が発生する可能性がある（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：７８５〜９０（１９９７））。ＩＬ−５は、骨髄から血液に好酸球が遊走する原因であり、エオタキシンは、組織内での局所的遊走の原因であるようにみえる（Ｈｕｍｂｌｅｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６０１〜１２（１９９７））。 In another specific embodiment, the antigenic determinant is eotaxin. Eotaxin is a chemokine specific for chemokine receptor 3 present on eosinophils, basophils, and Th2 cells. However, eotaxin appears to be very specific for eosinophils (Zimmerman et al., J. Immunol. 165: 5839-46 (2000)). Eosinophil migration is reduced by 70% in eotaxin-1 knockout mice, but eosinophils may still develop (Rothenberg et al., J. Exp. Med. 185: 785-90 (1997)). IL-5 is responsible for the migration of eosinophils from the bone marrow into the blood, and eotaxin appears to be responsible for the local migration within the tissue (Humbles et al., J. Exp. Med. 186: 601). 12 (1997)).

したがって好ましい実施形態では、本発明の組成物は、第２の付着部位としてシステイン残基を含有し、かつ好ましくはエオタキシン配列のＣ末端に融合するアミノ酸リンカーを含む。その他の好ましい実施形態では、遊離システインを含有するアミノ酸リンカーは、プロセッシングされたタンパク質の配列に対応した配列のＮ末端に融合し、またはシグナルペプチドのＣ末端側にある成熟形態のタンパク質の配列のＮ末端に挿入される。これらの特定の構成体をコードする遺伝子は、適切な発現ベクターでクローニングする。 Thus, in a preferred embodiment, the composition of the invention comprises an amino acid linker containing a cysteine residue as the second attachment site and preferably fused to the C-terminus of the eotaxin sequence. In other preferred embodiments, the amino acid linker containing a free cysteine is fused to the N-terminus of the sequence corresponding to the sequence of the processed protein, or N of the sequence of the mature form protein on the C-terminal side of the signal peptide. Inserted at the end. Genes encoding these specific constructs are cloned in an appropriate expression vector.

実施例９および１１は、マウスエオタキシン構成体のクローニングおよび発現について述べており、この場合エオタキシン配列は、そのＣ末端が、ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するアミノ酸残基に融合している。ヒト構成体は、実施例９の教示により生成することができ、ＶＬＰおよび線毛との連結に適したタンパク質が得られ、本発明の好ましい実施形態になる。エオタキシンは、化学的に合成することができる（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３０：３１２８〜３１３５（１９９１））。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現も、細胞質でのエオタキシン１に関して記載されている（Ｃｒｕｍｐ他、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２４７１〜９（１９９８））。封入体としてのＥ．ｃｏｌｉでの発現とその後の折畳み（Ｍａｙｅｒ他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３９：８３８２〜９５（２０００））、および昆虫細胞の発現（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：２１７１〜６（１９９７））が、エオタキシン２に関して述べられており、さらにこれを使用して、本発明の特定の実施形態とすることができる。 Examples 9 and 11 describe the cloning and expression of a mouse eotaxin construct, where the eotaxin sequence is an amino acid residue containing a cysteine residue for ligation to the VLP and pili. It is fused. Human constructs can be generated according to the teachings of Example 9, resulting in proteins suitable for ligation with VLPs and pili and become preferred embodiments of the present invention. Eotaxin can be synthesized chemically (Clark-Lewis et al., Biochemistry 30: 3128-3135 (1991)). E. E. coli expression has also been described for eotaxin 1 in the cytoplasm (Crump et al., J, Biol. Chem. 273: 22471-9 (1998)). E. as an inclusion body expression in E. coli and subsequent folding (Mayer et al., Biochemistry 39: 8382-95 (2000)), and expression in insect cells (Forssmann et al., J. Exp. Med. 185: 2171-6 (1997) ) Is described with respect to eotaxin 2, and can be used to make certain embodiments of the invention.

当業者なら、本明細書に記載する方法および適用例に対するその他の適切な変更例および適応例が、容易に明らかになり、本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなく変更を加えかつ適応可能であることが理解されよう。本発明について詳細に述べてきたが、本発明は、本発明の単なる例示を目的とするものであり本発明を限定しようとするものではない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されよう。 Other suitable modifications and adaptations to the methods and applications described herein will be readily apparent to those skilled in the art, and modifications may be made without departing from the scope of the invention or any embodiment thereof. And it will be understood that it is adaptable. Having described the invention in detail, the invention is more clearly understood by reference to the following examples, which are intended to be merely exemplary of the invention and are not intended to limit the invention. Let's be done.

変異Ｑβコートタンパク質の構成体および発現、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰまたはカプシドの精製
プラスミドの構成体および変異コートタンパク質のクローニング
ｐＱβ―２４０の構成体
プラスミドｐＱβ１０（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，ＴＭ他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１３７：１３３〜１３７）を、ｐＱβ−２４０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１３→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣ−３’、および
５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＣＴＣＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣ−３’
に設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。 Construction and expression of mutant Qβ coat protein, purification of mutant Qβ coat protein VLP or capsid Cloning of plasmid construct and mutant coat protein Construction of pQβ-240 Plasmid pQβ10 (Kozlovska, TM et al., Gene 137: 133) ~ 137) was used as the initial plasmid for the construct of pQβ-240. Inverse PCR caused the mutation Lys13 → Arg. The reverse primer has a reverse tail-to-tail binding direction:
5′-GGTAACATCGGTCGGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3 ′, and 5′-GGACAGAGTTTTGTTTTCCATTCGCACCGATGTTACC-3 ′
Designed. The product of the first PCR was used as a template for the second PCR reaction, in which case the upstream primer 5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3 'and the downstream primer 5'-CGATGCATTTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3'
It was used. The product of the second PCR was digested with XbaI and Mph1103I and cloned into the pQβ10 expression vector, which was cut with the same restriction enzymes. PCR reactions were performed using PCR kit reagents according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).

直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２３）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ The desired mutants were confirmed by sequencing using the direct label integration method. E. housing pQβ-240 E. coli cells supported efficient synthesis of 14-kD protein co-migrating on SDS-PAGE with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
The resulting amino acid sequence (SEQ ID NO: 23):
AKLETVLTGNIRGDGKQTLVLNPRGVNPTNGVALSQAGAVPALEKRVTVSVSPSRNNRNKNYKVQVKIQNPPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFFTFTQYSTDEERAFVRLILAIDLALPLLID

ｐＱβ−２４３の構成体：
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２４３の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ａｓｎ１０→Ｌｙｓを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。 Constituents of pQβ-243:
Plasmid pQβ10 was used as the initial plasmid for the construct of pQβ-243. Inverse PCR caused the mutation Asn10 → Lys. The reverse primer has a reverse tail-to-tail binding direction:
5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGGG-3 ′, and 5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTCATTTTTGCC-3 ′
Designed with. The product of the first PCR was used as a template for the second PCR reaction, in which case the upstream primer 5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3 ′ and the downstream primer 5′-CGATGCATTTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3 ′
It was used. The product of the second PCR was digested with XbaI and Mph1103I and cloned into the pQβ10 expression vector, which was cut with the same restriction enzymes. PCR reactions were performed using PCR kit reagents according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).

直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２４３を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳＤ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２４）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＫＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ The desired mutant was confirmed by sequencing using the direct label integration method. E. housing pQβ-243 E. coli cells supported efficient synthesis of 14-kD protein co-migrating on SDSD-PAGE with control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
The resulting amino acid sequence (SEQ ID NO: 24):
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTGNGVALSQAGAVPALEKRTVTVVSQPSRNRNKNYKVQVKIQNPPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTTFFTFTYLY

ｐＱβ−２５０の構成体：
プラスミドｐＱβ２４０を、ｐＱβ−２５０の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。変異ＰＣＲ断片を合成するために、上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。 Construction of pQβ-250:
Plasmid pQβ240 was used as the initial plasmid for the construct of pQβ-250. The mutation Lys2 → Arg was caused by site-directed mutagenesis. To synthesize mutant PCR fragments, upstream primer 5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAG-3 ', and downstream primer 5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'
This was introduced into the pQβ-185 expression vector with its own restriction sites NcoI and HindIII. PCR reactions were performed using PCR kit reagents according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).

直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５０を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２５）：
ＡＲＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＲＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ The desired mutant was confirmed by sequencing using the direct label integration method. E. housing pQβ-250. E. coli cells supported efficient synthesis of 14-kD protein co-migrating on PAGE with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
The resulting amino acid sequence (SEQ ID NO: 25):
ARLETVLTGNIRGDGKQTLVLNPRGVNPTNGVALSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRNKNYKVQVKIQNPPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFFTQYSTDEAFAFVRPALAIDPLAID

ｐＱβ−２５１の構成体
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２５１の構成体用の初期プラスミドとして使用した。逆ＰＣＲによって、変異Ｌｙｓ１６→Ａｒｇを引き起こした。逆プライマーは、逆向き尾−尾結合方向：
５’−ＧＡＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＧＧ−３’、および
５’−ＣＣＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’
で設計した。第１のＰＣＲの生成物を、第２のＰＣＲ反応用の鋳型として使用したが、その場合、上流プライマー
５’−ＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧ−３’
を使用した。第２のＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉで消化し、ｐＱβ１０発現ベクターにクローニングし、これを同じ制限酵素によって切断した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。 Construction of pQβ-251 Plasmid pQβ10 was used as the initial plasmid for the construction of pQβ-251. Inverse PCR caused the mutation Lys16 → Arg. The reverse primer has a reverse tail-to-tail binding direction:
5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCTCCAATCCGCGTGGGGG-3 ′, and 5′-CCCCACCGGGATTGAGGGACCAGAGTTTGACGTCCCATC-3 ′
Designed with. The product of the first PCR was used as a template for the second PCR reaction, in which case the upstream primer 5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3 ′ and the downstream primer 5′-CGATGCATTTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3 ′
It was used. The product of the second PCR was digested with XbaI and Mph1103I and cloned into the pQβ10 expression vector, which was cut with the same restriction enzymes. PCR reactions were performed using PCR kit reagents according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).

直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５１を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。この構成体でコードされた、得られたアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。 The desired mutants were confirmed by sequencing using the direct label integration method. E. housing pQβ-251 E. coli cells supported efficient synthesis of 14-kD protein co-migrating on SDS-PAGE with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles. The resulting amino acid sequence encoded by this construct is shown in SEQ ID NO: 26.

ｐＱβ−２５９の構成体
プラスミドｐＱβ−２５１を、ｐＱβ−２５９の構成体用の初期プラスミドとして使用した。部位特異的突然変異誘発によって、変異Ｌｙｓ２→Ａｒｇを引き起こした。上流プライマー
５’−ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＡＧＧ−３’、および下流プライマー
５’−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’
を、変異ＰＣＲ断片の合成に使用し、これを、独自の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＱβ−１８５発現ベクターに導入した。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲキット試薬を用い、製造業者のプロトコルに従って行った（ＭＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｖｉｌｎｉｕｓ、リトアニア）。 Construction of pQβ-259 Plasmid pQβ-251 was used as the initial plasmid for the construction of pQβ-259. The mutation Lys2 → Arg was caused by site-directed mutagenesis. Upstream primer 5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGGG-3 'and downstream primer 5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3'
Was used for the synthesis of the mutant PCR fragment, which was introduced into the pQβ-185 expression vector with its own restriction sites NcoI and HindIII. PCR reactions were performed using PCR kit reagents according to the manufacturer's protocol (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania).

直接標識組込み法を使用した配列決定により、所望の変異体を確認した。ｐＱβ−２５９を収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｑβファージ粒子から単離した対照Ｑβコートタンパク質と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで共遊走する１４−ｋＤタンパク質の効率的な合成を支援した。
得られたアミノ酸配列（配列番号２７）：
ＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＫＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ The desired mutants were confirmed by sequencing using the direct label integration method. E. housing pQβ-259 E. coli cells supported efficient synthesis of 14-kD protein co-migrating on SDS-PAGE with a control Qβ coat protein isolated from Qβ phage particles.
The resulting amino acid sequence (SEQ ID NO: 27):
AKLETVTLGNIGKDKGQTLVLNPRGVNPTNGVALSQQAVAVALEKVRVTVSVSPSRNNRNKNYKVQVKIQNPPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFFTFTQYSTDEERAFVRPALAIDLAPLPLID

ＱβおよびＱβ変異体を発現し精製するための一般的手順
発現
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換した。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地５ｍｌを、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドで形質転換したクローンと共にインキュベートした。接種培養物を、振盪せずに、３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。調製された接種材料を、引き続き２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する新鮮なＬＢ培地１００〜３００ｍｌに入れて１：１００に希釈し、振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。得られた第２の接種材料を、フラスコ内で、１％カザミノ酸および０．２％グルコースを含有するＭ９培地に入れ、１：５０に希釈し、これを振盪せずに３７℃で一晩インキュベートした。 General procedure for expressing and purifying Qβ and Qβ variants. E. coli JM109 was transformed with a Qβ coat protein expression plasmid. 5 ml of LB liquid medium containing 20 μg / ml ampicillin was incubated with clones transformed with Qβ coat protein expression plasmid. The inoculum culture was incubated for 16-24 hours at 37 ° C. without shaking. The prepared inoculum was subsequently diluted 1: 100 in 100-300 ml fresh LB medium containing 20 μg / ml ampicillin and incubated overnight at 37 ° C. without shaking. The resulting second inoculum is placed in M9 medium containing 1% casamino acid and 0.2% glucose in a flask, diluted 1:50, and this is overnight at 37 ° C. without shaking. Incubated.

精製
精製手順用の溶液および緩衝液
１．Ｌｙｓｉｓ緩衝液ＬＢ
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０
５ｍＭＥＤＴＡ０．１％、トリトンＸ１００、および新たに調製したＰＭＳＦを、濃度ｍｌ当たり５マイクログラム含む。
リゾチームおよびＤＮＡｓｅなし。
２．ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
３．緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８
５ｍＭＥＤＴＡおよび１５０ｍＭＮａＣｌを含む。
４．ＰＥＧ
ポリエチレングリコール６０００の４０％（ｗ／ｖ）ＮＥＴ溶液。 Purification Solutions and buffers for purification procedures Lysis buffer LB
50 mM Tris-HCl pH 8.0
5 mM EDTA 0.1%, Triton X100, and freshly prepared PMSF contain 5 micrograms per ml concentration.
No lysozyme and DNAse.
2. SAS
2. Saturated aqueous ammonium sulfate solution Buffer NET
20 mM Tris-HCl, pH 7.8
Contains 5 mM EDTA and 150 mM NaCl.
4). PEG
40% (w / v) NET solution of polyethylene glycol 6000.

破壊および溶解
凍結細胞を、ＬＢに２ｍｌ／ｇ細胞で再懸濁した。溶液を氷上で冷却するために１分の間隔を空けて、混合物を１５分間２２ｋＨで５回超音波処理した。次いでＪａｎｅｃｋｉＫ６０ローターを使用して、溶解産物を１時間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。下記の遠心分離工程は、他に特に示さない限り、すべて同じローターを使用して行った。上清を４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢで２回洗浄した。遠心分離後、溶解産物の上清と洗浄画分を溜めた。 Disruption and lysis Frozen cells were resuspended in LB at 2 ml / g cells. The mixture was sonicated 5 times at 22 kH for 15 minutes with a 1 minute interval to cool the solution on ice. The lysate was then centrifuged at 14000 rpm for 1 hour using a Janecki K60 rotor. The following centrifugation steps were all performed using the same rotor unless otherwise indicated. The supernatant was stored at 4 ° C. and the cell debris was washed twice with LB. After centrifugation, the lysate supernatant and washing fractions were pooled.

分画
飽和硫酸アンモニウム溶液を１滴ずつ、撹拌しながら、上述の溜めた溶解産物に添加した。ＳＡＳの体積を、全体積の５分の１になるように調節して、飽和度が２０％になるようにした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離した。得られた上清を溜め、ＳＡＳを１滴ずつ添加して、飽和度４０％にした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液に溶解した。 Fractionation Saturated ammonium sulfate solution was added drop by drop to the above pooled lysate with stirring. The volume of the SAS was adjusted to be one fifth of the total volume so that the saturation was 20%. The solution was left overnight and centrifuged the next day at 14000 rpm for 20 minutes. The pellet was washed with a small amount of 20% ammonium sulfate and centrifuged again. The resulting supernatant was pooled and SAS was added dropwise to bring the saturation to 40%. The solution was left overnight and centrifuged the next day at 14000 rpm for 20 minutes. The resulting pellet was dissolved in NET buffer.

クロマトグラフィー
ＮＥＴ緩衝液に再度溶解したカプシドまたはＶＬＰタンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。クロマトグラフィー中、３つのピークが溶出された。最初の１つは主に、膜および膜断片を含有し、回収しなかった。カプシドは２番目のピークに含有され、３番目のピークはその他のＥ．ｃｏｌｉタンパク質を含有していた。 Chromatography Capsid or VLP protein redissolved in NET buffer was introduced onto a Sepharose CL-4B column. Three peaks were eluted during chromatography. The first one mainly contained membranes and membrane fragments and was not recovered. The capsid is contained in the second peak and the third peak is the other E. coli. contained the E. coli protein.

ピーク画分を溜め、ＮａＣｌ濃度を調節して、その最終濃度を０．６５Ｍにした。溜めたピーク画分の２分の１に相当する体積のＰＥＧ溶液を、撹拌しながら１滴ずつ添加した。溶液を、撹拌せずに一晩放置した。１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、カプシドタンパク質を沈降させた。次いでこれを、最小体積のＮＥＴに溶解し、再びセファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。ピーク画分を溜め、飽和度６０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムで沈殿させた。遠心分離してＮＥＴ緩衝液に再度溶解した後、カプシドタンパク質をセファロースＣＬ−６Ｂカラムに導入して、再びクロマトグラフィーを行った。 The peak fractions were pooled and the NaCl concentration was adjusted to a final concentration of 0.65M. A volume of PEG solution corresponding to one half of the pooled peak fraction was added dropwise with stirring. The solution was left overnight without stirring. The capsid protein was precipitated by centrifuging at 14000 rpm for 20 minutes. This was then dissolved in a minimum volume of NET and reintroduced onto the Sepharose CL-4B column. Peak fractions were pooled and precipitated with 60% (w / v) ammonium sulfate. After centrifugation and re-dissolution in NET buffer, the capsid protein was introduced into a Sepharose CL-6B column and chromatographed again.

透析および乾燥
上記得られたピーク画分を溜め、滅菌水に対して広範にわたり透析し、凍結乾燥して貯蔵した。 Dialysis and drying The peak fractions obtained above were pooled, dialyzed extensively against sterile water, lyophilized and stored.

発現および精製Ｑβ−２４０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、プラスミドｐＱβ−２４０で形質転換された）をＬＢに再懸濁し、１５分間、５回超音波処理し、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上清を、さらにプロセッシングされるまで４℃で貯蔵し、細胞破壊片は、ＬＢ９ｍｌで２回洗浄し、最後に、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素９ｍｌで洗浄した。すべての上清を溜め、セファロースＣＬ−４Ｂカラムに導入した。溜めたピーク画分を、硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離した。次いで再溶解したタンパク質をセファロース２Ｂカラムでさらに精製し、最後にセファロース６Ｂカラムで精製した。最後にカプシドのピークを、水に対して広範にわたり透析し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質とカプシドとの組織体を、電子顕微鏡によって確認した。 Expression and purification Qβ-240
Cells (E. coli JM 109, transformed with plasmid pQβ-240) were resuspended in LB, sonicated 5 times for 15 minutes, and centrifuged at 13000 rpm for 1 hour. The supernatant was stored at 4 ° C. until further processing and the cell debris was washed twice with 9 ml LB and finally with 9 ml 0.7 M urea dissolved in LB. All supernatants were pooled and loaded onto a Sepharose CL-4B column. The collected peak fraction was precipitated with ammonium sulfate and centrifuged. The re-dissolved protein was then further purified on a Sepharose 2B column and finally purified on a Sepharose 6B column. Finally, the capsid peak was dialyzed extensively against water and lyophilized as described above. The organization of the coat protein and capsid was confirmed by electron microscopy.

発現および精製Ｑβ−２４３
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１）をＬＢに再懸濁し、一般的手順で述べたように処理した。セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、タンパク質を、連続した２回のゲルろ過工程により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製した。ピーク画分を溜め、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。 Expression and purification Qβ-243
Cells (E. coli RR1) were resuspended in LB and processed as described in the general procedure. The protein was purified on a Sepharose CL-4B column by two successive gel filtration steps and finally on a Sepharose CL-2B column. Peak fractions were pooled and lyophilized as described above. The tissue in which the coat protein was incorporated into the capsid was confirmed by an electron microscope.

発現および精製Ｑβ−２５０
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、ｐＱβ−２５０で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、上述のように処理した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムでゲルろ過により精製し、最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムで精製し、上述のように凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。 Expression and purification Qβ-250
Cells (transformed with E. coli JM109, pQβ-250) were resuspended in LB and treated as described above. The protein was purified by gel filtration on a Sepharose CL-4B column and finally purified on a Sepharose CL-2B column and lyophilized as described above. The tissue in which the coat protein was incorporated into the capsid was confirmed by an electron microscope.

発現および精製Ｑβ−２５９
細胞（Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９、ｐＱβ−２５９で形質転換した）をＬＢに再懸濁し、超音波処理した。細胞破壊片をＬＢ１０ｍｌで１回洗浄し、２回目は、ＬＢに溶かした０．７Ｍ尿素１０ｍｌで洗浄した。タンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムで、２回のゲルろ過クロマトグラフィー工程により精製した。タンパク質を、上述のように透析し凍結乾燥した。コートタンパク質がカプシドに組み込まれた組織体を、電子顕微鏡によって確認した。 Expression and purification Qβ-259
Cells (transformed with E. coli JM109, pQβ-259) were resuspended in LB and sonicated. The cell debris was washed once with 10 ml of LB and the second time with 10 ml of 0.7 M urea dissolved in LB. The protein was purified by two gel filtration chromatography steps on a Sepharose CL-4B column. The protein was dialyzed and lyophilized as described above. The tissue in which the coat protein was incorporated into the capsid was confirmed by an electron microscope.

リジン残基を含有するペプチドの、ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）ｃ／ｅ１エピトープへの挿入
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面の先端領域に位置付けた。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構成体）で遺伝的に置き換えた。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有するが、これは、ＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。 Insertion of peptides containing lysine residues into the HBcAg (1-149) c / e1 epitope The c / e1 epitope of HBcAg (residues 72-88) is replaced with the apical region on the surface of the hepatitis B virus capsid (HBcAg) Positioned. Part of this region (proline 79 and alanine 80) was genetically replaced with the peptide Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (HBcAg-Lys construct). The introduced lysine residue contains a reactive amino group in its side chain, which can be used for intermolecular chemical cross-linking between HBcAg particles and any antigen containing a free cysteine group.

配列番号７８で示されるアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ−ＬｙｓＤＮＡを、ＰＣＲで生成した。ＨＢｃＡｇ断片（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）をコードする２つの断片をＰＣＲにより別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用されるプライマーも、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）断片は、プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用してｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、２つのＰＣＲ生成物の両端で相補的ＤＮＡ配列を導入し、したがって２つのＰＣＲ生成物の融合が後続の組織体ＰＣＲで可能になった。組織化された断片は、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。 HBcAg-Lys DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 78 was generated by PCR. Two fragments encoding the HBcAg fragments (amino acid residues 1-78 and 81-149) were amplified separately by PCR. The primers used for these PCRs also introduced DNA sequences encoding Gly-Gly-Lys-Gly-Gly peptides. The HBcAg (1-78) fragment was amplified from pEco63 using primers EcoRIHBcAg (s) and Lys-HBcAg (as). The HBcAg (81-149) fragment was amplified from pEco63 using primers Lys-HBcAg (s) and HBcAg (1-149) Hind (as). Primers Lys-HBcAg (as) and Lys-HBcAg (s) introduce complementary DNA sequences at both ends of the two PCR products, thus allowing fusion of the two PCR products in subsequent tissue PCR. It was. The organized fragments were amplified by PCR using primers EcoRIHBcAg (s) and HbcAg (1-149) Hind (as).

ＰＣＲでは、各オリゴ１００ｐｍｏｌと鋳型ＤＮＡ５０ｎｇを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭｄＮＴＰ、および２ｍＭＭｇＳＯ_４の５０ｍｌ反応混合物中で使用した。両方の反応で、温度サイクルは以下のように実施した：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクル。
プライマー配列：
ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）：
（５’−ＣＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＣ−３’）；
Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）：
（５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ−３’）；
ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）：
（５’−ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧ−３’） For PCR, 100 pmol of each oligo and 50 ng of template DNA were used in a 50 ml reaction mixture of 2 units of Pwo polymerase, 0.1 mM dNTPs, and 2 mM MgSO ₄ . In both reactions, the temperature cycle was performed as follows: 94 ° C., 2 minutes; 94 ° C. (1 minute), 50 ° C. (1 minute), 72 ° C. (2 minutes) 30 cycles.
Primer sequence:
EcoRIHBcAg (s):
(5'-CCCGGAATTCATGGACATTGACCCTTAATAAG-3 ');
Lys-HBcAg (as):
(5′-CCTAGAGCCACCCTTTGCCACATCATTCTCAAATTTAGTACCCACCCAGGTAGC-3 ′);
Lys-HBcAg (s):
(5′-GAAGATGGTGGCAAAAGGTGCCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTTATGTC-3 ′);
HBcAg (1-149) Hind (as):
(5'-CGCGTCCCCAAGCTTCTAAAACAACAAGTAGTCTCCGGAAG-3 ')

ＰＣＲによる２つのＰＣＲ断片の融合では、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）１００ｐｍｏｌを、Ｐｗｏポリメラーゼ２単位、０．１ｍＭｄＮＴＰ、および２ｍＭＭｇＳＯ_４を含有する５０ｍｌ反応混合物に溶かした２つの精製済みＰＣＲ断片１００ｎｇと共に使用した。ＰＣＲサイクル条件は：９４℃、２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）３０サイクルであった。組織化したＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液に入れて１９時間消化した。消化されたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターにライゲートして、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ生成物のベクターへの挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析および挿入物のＤＮＡ配列決定によって分析した。 For fusion of two PCR fragments by PCR, primers EcoRIHBcAg (s) and HBcAg (1-149) Hind (as) 100 pmol were added to a 50 ml reaction mixture containing 2 units of Pwo polymerase, 0.1 mM dNTPs, and 2 mM MgSO _4. Used with two 100 ng of purified PCR fragment dissolved. PCR cycle conditions were: 94 ° C., 2 minutes; 94 ° C. (1 minute), 50 ° C. (1 minute), 72 ° C. (2 minutes) 30 cycles. The organized PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis, purified, and digested for 19 hours in an appropriate buffer containing EcoRI and HindIII restriction enzymes. The digested DNA fragment was ligated into an EcoRI / HindIII digested pKK vector to generate a pKK-HBcAg-Lys expression vector. The insertion of the PCR product into the vector was analyzed by EcoRI / HindIII restriction analysis and DNA sequencing of the insert.

ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ８０２またはＪＭ１０９を、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。一晩培養した細菌１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピリシンＬＢ培地１００ｍｌに接種した。この培養物を、６００ｎｍでＯＤが約０．８に達するまで、３７度で４時間成長増殖させた。ＩＰＴＧを添加することにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘発を行って、最終濃度を１ｍＭにした。誘発後、細菌をさらに、３７℃で４時間振盪した。細菌を、５０００×ｇで１５分間遠心分離することにより収集した。ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを解凍し、２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）が補われた細菌溶解緩衝液（１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０、３０ｍＭＮａＣｌ、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を室温で３０分間インキュベートし、超音波によって破壊した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたは対照プラスミドを収容するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、ＩＰＴＧでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現を誘発させた。ＩＰＴＧを添加する前に、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを持つ細菌培養物と、対照プラスミドを持つ培養物からサンプルを取り出した。ＩＰＴＧを添加してから４時間後、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含有する培養物と対照培養物からサンプルを再び取り出した。タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした後、クーマシー染色を行った。 Expression and purification of HBcAg-Lys E. coli strain K802 or JM109 was transformed with pKK-HBcAg-Lys. One ml of overnight cultured bacteria was used to inoculate 100 ml of 100 μg / ml ampicillin LB medium. The culture was grown and expanded at 37 degrees for 4 hours until the OD reached approximately 0.8 at 600 nm. Induction of synthesis of HBcAg-Lys was performed by adding IPTG to a final concentration of 1 mM. After induction, the bacteria were further shaken at 37 ° C. for 4 hours. Bacteria were collected by centrifugation at 5000 xg for 15 minutes. The pellet was frozen at -80 ° C. The pellet was thawed and dissolved in bacterial lysis buffer (10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7.0, 30 mM NaCl, 0.25% Tween-20, 10 mM EDTA) supplemented with 200 μg / ml lysozyme and 10 μl Benzonase (Merck). Resuspended. Cells were incubated for 30 minutes at room temperature and disrupted by sonication. E. coli containing pKK-HBcAg-Lys expression plasmid or control plasmid. E. coli cells were used to induce HBcAg-Lys expression with IPTG. Samples were removed from bacterial cultures with the pKK-HBcAg-Lys plasmid and cultures with the control plasmid before adding IPTG. Four hours after adding IPTG, samples were again removed from cultures containing pKK-HBcAg-Lys and control cultures. Protein expression was monitored by SDS-PAGE followed by Coomassie staining.

次いで不溶性細胞破壊片を除去するため、溶解産物を、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、米国から購入）を使用して、上清とペレットをウェスタンブロット法によって分析したが、かなりの量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることが示された。簡単に、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現するＥ．ｃｏｌｉと対照細胞からの溶解産物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）とペレット（＝不溶性画分）を分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等体積にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後、抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でウェスタンブロット法を行った。 The lysate was then centrifuged at 12,000 xg for 30 minutes to remove insoluble cell debris. The supernatant and pellet were analyzed by Western blot using a monoclonal antibody against HBcAg (purchased from YVS1841, Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA), but significant amounts of HBcAg-Lys protein are soluble It was shown that. Briefly, E. coli expressing HBcAg-Lys. The lysates from E. coli and control cells were centrifuged at 14,000 xg for 30 minutes. The supernatant (= soluble fraction) and the pellet (= insoluble fraction) were separated and diluted with SDS sample buffer to an equal volume. Samples were analyzed by SDS-PAGE followed by Western blotting with anti-HBcAg monoclonal antibody YVS1841.

４ｍｌの６５％ショ糖溶液上に３ｍｌの１５％ショ糖溶液があり、その次に細菌溶解産物４ｍｌがある、ショ糖ステップ勾配を使用したステップ勾配遠心分離に、清浄にした細胞溶解産物を使用した。サンプルを、１００，０００×ｇ、４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、勾配最上部から１ｍｌ画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後、クーマシー染色を行った。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質は、クーマシー染色によって検出した。 Use the cleaned cell lysate for step gradient centrifugation using a sucrose step gradient, with 3 ml of 15% sucrose solution on 4 ml of 65% sucrose solution, followed by 4 ml of bacterial lysate did. Samples were centrifuged at 100,000 × g for 3 hours at 4 ° C. After centrifugation, 1 ml fraction was collected from the top of the gradient and analyzed by SDS-PAGE, followed by Coomassie staining. HBcAg-Lys protein was detected by Coomassie staining.

１５％と６５％のショ糖の間ではＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が濃縮され、カプシド粒子を形成することが示された。細菌タンパク質のほとんどは、ショ糖を含まない勾配上層で維持され、したがってＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子のステップ勾配遠心分離により、粒子が濃縮されかつ部分的に精製された。 It was shown that between 15% and 65% sucrose the HBcAg-Lys protein was concentrated and formed capsid particles. Most of the bacterial proteins were maintained in a gradient top layer without sucrose, thus the particles were concentrated and partially purified by step gradient centrifugation of HBcAg-Lys particles.

ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの大規模な発現および精製は、以下のように行った。１００ｍｌＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンに単コロニーを接種し、培養物を３７℃で一晩増殖させることによって、一晩培養物を調製した。翌日、予備培養物２５ｍｌを、８００ｍｌのＬＢアンピシリン培地で希釈し、その培養物を増殖させて光学密度ＯＤ^６００を０．６〜０．８にした。次いで１ｍＭのＩＰＴＧで培養を誘発させ、さらに４時間増殖させた。細胞を、本質的に上述のように収集し溶解した。 Large scale expression and purification of HBcAg-Lys was performed as follows. An overnight culture was prepared by inoculating a single colony in 100 ml LB, 100 μg / ml ampicillin and growing the culture overnight at 37 ° C. The next day, 25 ml of the preculture was diluted with 800 ml of LB ampicillin medium and the culture was grown to an optical density OD ⁶⁰⁰ of 0.6-0.8. Cultures were then induced with 1 mM IPTG and grown for an additional 4 hours. Cells were collected and lysed essentially as described above.

次いでＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを、まず清浄にした細胞溶解産物から硫酸アンモニウム（３０％飽和）でタンパク質を沈殿させ、次いで再溶解したペレットをゲルろ過カラム（セファクリルＳ−４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に導入することによって、精製した。溜まった画分を硫酸アンモニウムで再び沈殿させ、ペレットを再溶解して同じゲルろ過カラムに２回目の導入を行った。最後に、画分を溜め、濃縮し、その濃度をブラッドフォード試験を使用して評価した（ＢｉｏＲａｄ）。 HBcAg-Lys is then purified by first precipitating the protein from the cleaned cell lysate with ammonium sulfate (30% saturation) and then introducing the re-dissolved pellet into a gel filtration column (Sephaacryl S-400, Pharmacia). did. The collected fraction was precipitated again with ammonium sulfate, the pellet was redissolved, and the second introduction into the same gel filtration column was performed. Finally, fractions were pooled and concentrated, and the concentration was assessed using the Bradford test (BioRad).

遊離システイン残基に欠けており挿入したリジン残基を含有する、ＨＢｃＡｇの構成体
配列番号７７の４８および１０７に対応する位置でシステイン残基に欠けておりかつ挿入されたリジン残基を含有する、本明細書ではＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔと呼ぶ肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、以下の方法を使用して構成した。 HBcAg constructs lacking a free cysteine residue and containing an inserted lysine residue The hepatitis core antigen (HBcAg), referred to herein as HBcAg-lys-2cys-Mut, was constructed using the following method.

以下のＰＣＲプライマーの組合せを用い、実施例２で述べたように調製したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ遺伝子の３つの断片を最初に別々に増幅することによって、２つの変異体を導入した。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ遺伝子を調製した。 The two variants were introduced by first separately amplifying three fragments of the HBcAg-Lys gene prepared as described in Example 2 using the following PCR primer combinations: The HBcAg-lys-2cys-Mut gene was prepared using PCR and conventional cloning techniques.

簡単に言うと、下記のプライマーを使用して断片１を調製した。
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
プライマー２：４８ａｓ
ＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＣＴＣ Briefly, Fragment 1 was prepared using the following primers:
Primer 1: EcoRIHBcAg (s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG
Primer 2: 48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCCAGGAGACTC

以下のプライマーを使用して、断片２を調製した。
プライマー３：４８ｓ
ＧＳＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＣ
プライマー４：１０７ａｓ
ＣＴＴＣＣＡＡＡＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＣＣＡＣ Fragment 2 was prepared using the following primers:
Primer 3: 48s
GSGTCTCCTGAGCATTCTCCACCTCACCCATACTGCAC
Primer 4: 107as
CTTCCAAAAGTGGAGGGAAGAAATGTGAAAACCAC

以下のプライマーを使用して断片３を調製した。
プライマー５：ＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＴＴＧＡＴＡＧ
プライマー６：１０７ｓ
ＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧ Fragment 3 was prepared using the following primers:
Primer 5: HBcAg149hind-as
CGCGTCCCCAAGCTTCTAAAACAACATAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG
Primer 6: 107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTGGAAG

次いで断片１および２をＰＣＲプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）および１０７ａｓと組み合わせて、断片４を得た。次いで断片４および断片３をプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓと組み合わせて、完全長の遺伝子を生成した。次いで完全長の遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化してｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの発現および精製は、実施例３で述べたように行った。 Fragments 1 and 2 were then combined with PCR primers EcoRIHBcAg (s) and 107as to give fragment 4. Fragment 4 and fragment 3 were then combined with primers EcoRIHBcAg (s) and HBcAg149hind-as to generate the full length gene. The full length gene was then digested with EcoRI (GAATTC) and HindIII (AAGCTT) enzymes and cloned into the pKK vector (Pharmacia) and cut at the same restriction sites. Expression and purification of HBcAg-lys-2cys-Mut was performed as described in Example 3.

ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓの構成体
実施例２で述べたように、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）１−１８５を変性させた。ｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙで遺伝的に置き換えた（ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ構成体）。導入されたリジン残基は、その側鎖に反応性アミノ基を含有し、これをＨＢｃＡｇ粒子と遊離システイン基を含有する任意の抗原との分子間化学架橋に使用することができる。ＰＣＲ法および従来のクローニング技法を使用して、ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ遺伝子を調製した。 HBcAg1-185-Lys Constituent As described in Example 2, hepatitis core antigen (HBcAg) 1-185 was denatured. A portion of the c / e1 epitope (residues 72-88) region (proline 79 and alanine 80) was genetically replaced with the peptide Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (HBcAg1-185-Lys construct). The introduced lysine residue contains a reactive amino group in its side chain, which can be used for intermolecular chemical cross-linking between HBcAg particles and any antigen containing a free cysteine group. The HBcAg1-185-Lys gene was prepared using PCR and conventional cloning techniques.

実施例２で述べたように、ｐＥｃｏ６３からのＨＢｃＡｇ遺伝子の２つ別個の断片を増幅し、その後これら２つの断片をＰＣＲにより融合してＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を挿入し、それによって完全長の遺伝子を組織化した。以下のＰＣＲプライマーの組合せを使用した。 As described in Example 2, two separate fragments of the HBcAg gene from pEco63 were amplified and then the two fragments were fused by PCR to insert the Gly-Gly-Lys-Gly-Gly sequence, Organized the full-length gene. The following PCR primer combinations were used:

断片１：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）（実施例２参照）
断片２：
プライマー３：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー４：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩＩ
ＣＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ
組織体：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（実施例２参照）
プライマー２：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄＩＩＩＩ Fragment 1:
Primer 1: EcoRIHBcAg (s) (see Example 2)
Primer 2: Lys-HBcAg (as) (see Example 2)
Fragment 2:
Primer 3: Lys-HBcAg (s) (see Example 2)
Primer 4: HBcAgwtHindIIII
CGCGTCCCAGAGTCTCAACATTGAGATCTCGAGATG
Organization:
Primer 1: EcoRIHBcAg (s) (see Example 2)
Primer 2: HBcAgwtHindIIII

次いで組織化した完全長遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）酵素で消化し、ｐＫＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングし、同じ制限部位で切断した。 The organized full-length gene was then digested with EcoRI (GAATTC) and HindIII (AAGCTT) enzymes, cloned into the pKK vector (Pharmacia) and cut at the same restriction sites.

ＨｂｃＡｇのＭＩＲ領域でのペプチドエピトープの融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９よび８０を、配列ＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧのエピトープＣεＨ３で置換した。ＣεＨ３配列は、ヒトＩｇＥのＨ鎖の第３定常ドメインの配列から得られる。組織体ＰＣＲ法を使用して、エピトープをＨＢｃＡｇ１−１８５配列に挿入した。最初のＰＣＲ工程では、ＡＴＣＣクローンｐＥｃｏ６３由来のＨＢｃＡｇ１−１８５遺伝子であってプライマーＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖで増幅したものを、２つの個別の反応で鋳型として使用して、ＣεＨ３配列をコードする配列要素を含有した２つの断片を増幅した。次いでこれら２つの断片を、第２のＰＣＲ工程で、組織体ＰＣＲ反応により組織化した。 Fusion of peptide epitopes in the MIR region of HbcAg Residues 79 and 80 of HBcAg1-185 were replaced with the epitope CεH3 of the sequence VNLTWSRASG. The CεH3 sequence is derived from the sequence of the third constant domain of the heavy chain of human IgE. Using the tissue PCR method, the epitope was inserted into the HBcAg1-185 sequence. In the first PCR step, the CεH3 sequence was obtained using the HBcAg1-185 gene from ATCC clone pEco63, amplified with primers HBcAg-wt EcoRI fwd and HBcAg-wt HindIII rev as a template in two separate reactions. Two fragments containing the sequence element encoding were amplified. These two fragments were then organized by a tissue PCR reaction in a second PCR step.

第１のＰＣＲ工程でのプライマーの組合せ：ＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖを持つＣεＨ３ｆｗｄ、およびＣεＨ３ｒｅｖを持つＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ。組織体ＰＣＲ反応では、まず第１のＰＣＲ工程で単離した２つの断片を、３回のＰＣＲサイクル中は外部プライマーなしで組織化し、その後、次の２５回のサイクルでは外部プライマーを反応混合物に添加した。外部プライマー：ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ。 Primer combinations in the first PCR step: CεH3fwd with HBcAg-wt HindIII rev, and HBcAg-wt EcoRI fwd with CεH3rev. In the tissue PCR reaction, the two fragments isolated in the first PCR step are first organized without an external primer during 3 PCR cycles, and then the external primer is added to the reaction mixture in the next 25 cycles. Added. External primers: HBcAg-wt EcoRI fwd and HBcAg-wt HindIII rev.

Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のため、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、ＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３．３にクローニングした（実施例２参照）。キメラＶＬＰをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、実施例２で述べたように精製した。ＨＢｃＡｇ１−１８５−ＣεＨ３がゲルろ過から溶出した溶出体積は、融合タンパク質とキメラＶＬＰとの組織体を示していた。
プライマー配列：
ＣεＨ３ｆｗｄ：
５’ＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＴＣ３’
ＶＮＬＴＷＳＲＡＳＧＡ８０ＳＲＤＬＶＶ８６
ＣεＨ３ｒｅｖ：
５’ＡＣＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＣＣＡＣ３’
Ｄ７８ＥＬＮＮＧＶ７２
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ：
５’ＣＣＧｇａａｔｔｃＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＴＡＡＡＧ
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄＩＩＩｒｅｖ：
５’ＣＧＣＧＴＣＣＣａａｇｃｔｔＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧ E. The PCR product was cloned into pKK223.3 using EcoRI and HindIII sites for expression in E. coli (see Example 2). The chimeric VLP was transformed into E. coli. expressed in E. coli and purified as described in Example 2. The elution volume from which HBcAg1-185-CεH3 eluted from the gel filtration indicated the organization of the fusion protein and the chimeric VLP.
Primer sequence:
CεH3fwd:
5 'GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3'
V N L T W S R A S G A 80 S R L D L V V 86
CεH3rev:
5 'ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3'
D78 E L N N G V72
HBcAg-wt EcoRI fwd:
5'CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG
HBcAg-wt HindIIIrev:
5'CGCGTCCCagagttCTAACATTGAGATTCCGAGATG

システイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたＩＬ−５のクローニング、発現、および精製。好酸球成分によるアレルギー性喘息の実験モデルにおける、ＶＬＰとの連結、免疫化、および効能の実証
Ａ．マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５のクローニングおよび、Ｅ．ｃｏｌｉでの封入体としての発現
以下の２つのプライマーを使用して、ＰＣＲによりＡＴＣＣクローン（ｐｍＩＬ５−４Ｇ；ＡＴＣＣ番号：３７５６２）からＩＬ−５を増幅した：Ｓｐｅｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ１（配列番号３４０）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒ（配列番号３４２）。このＰＣＲの産物を、プライマーＳｐｅＮｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ２（配列番号３４１）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒを用いた第２のＰＣＲでの鋳型として使用した。挿入物を、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。この挿入物を、事前にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＥＴベクター誘導体（ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクター）にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＯＤＥＣ３−８にＩＬ５をクローニングすることによって生成された構成体は、そのＮ末端から、ヘキサヒスチジンタグ（精製を促進させる）、エンテロキナーゼ切断部位、システイン残基を含有するγ３誘導アミノ酸リンカー（Ｎ末端がアミノ酸ＡＬＶに、Ｃ末端がＡＳに隣接する）、および成熟形態のＩＬ−５タンパク質をコードするＤＮＡを含む。クローニング手順の中実度を、ＤＮＡ配列決定により確認した。 Cloning, expression and purification of IL-5 with an N-terminal amino acid linker containing a cysteine residue. Demonstration of VLP linkage, immunization, and efficacy in an experimental model of allergic asthma with eosinophil components Cloning of mouse His-C-IL-5; Expression as inclusion bodies in E. coli IL-5 was amplified from an ATCC clone (pmIL5-4G; ATCC number: 37562) by PCR using the following two primers: Spellinker3-F1 (SEQ ID NO: 340) and Il5StopXho -R (SEQ ID NO: 342). The product of this PCR was used as a template in the second PCR using primers SpeNlinker3-F2 (SEQ ID NO: 341) and Il5StopXho-R. The insert was digested with SpeI and NotI. This insert was ligated to a pET vector derivative (pMODEC3-8 vector) previously digested with NheI and NotI. E. coli TG1 cells were transformed. The construct generated by cloning IL5 into pMODEC3-8 has a γ3-derived amino acid linker (N-terminus) containing a hexahistidine tag (to facilitate purification), an enterokinase cleavage site, and a cysteine residue from its N-terminus. Contains the amino acid ALV, the C-terminus is adjacent to AS), and the DNA encoding the mature form of IL-5 protein. The solidity of the cloning procedure was confirmed by DNA sequencing.

上記ＩＬ−５を含有する構成体を、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５．２とし（ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５とも呼ぶ）、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１−ＤＥ３に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えタンパク質を、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と呼ぶ。 The construct containing IL-5 is designated as pMODC6-IL5.2 (also referred to as pMODC6-IL5). E. coli strain BL21-DE3 was transformed. E. The recombinant protein expressed in E. coli is called His-C-IL5.

ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を収容するクローンＢＬ２１−ＤＥ３細胞を、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ５ｍｌ中で一晩増殖させた。この培養物の一定量２．０ｍｌを、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌの富栄養培地（ＴＢ）で希釈した。培養物を、光学密度ＯＤ_{６００ｎｍ}で０．７〜１．０になるまで増殖させ、１．０Ｍのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）保存液を０．１ｍｌ添加することにより、４時間にわたり発現を誘導した。組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を不溶形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に位置付けた．Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の発現は、以下のように確認した。誘導後４時間経てから培養サンプル１０ｍｌを取り、４０００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００（ｐＨ８．０）からなる０．５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。この懸濁液に、リゾチーム（４０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加し、４℃で３０分間経た後、２分間超音波処理した。ベンゾナーゼの一定量１．０ｍｌと、５０ｍＭＭｇＣｌ_２の一定量１００μｌとを添加し、室温で３０分間インキュベートした。１３０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットをＳＤＳ導入緩衝液１００μｌ中で、９８℃で５分間加熱した。次いで一定量１０μｌを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、ＩＬ−５の質量に対応する１７ｋＤａのタンパク質のバンドが示された。対照として、ＩＰＴＧが存在しない状態でｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を含有するＢＬ２１−ＤＥ２細胞を増殖させ、上述のように不溶性細胞画分から抽出物を調製した。 Clone BL21-DE3 cells containing pMODC6-IL5 were grown overnight in 5 ml LB containing 1 mg / L ampicillin. An aliquot of 2.0 ml of this culture was diluted with 100 ml of rich medium (TB) containing 1 mg / L ampicillin. By growing the culture to 0.7-1.0 at an optical density OD _{600 nm} and adding 0.1 ml of 1.0 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) stock solution, Expression was induced over 4 hours. Recombinant His-C-IL5 was expressed in insoluble form and mapped to the inclusion body fraction of induced cells. The expression of His-C-IL5 was confirmed as follows. After 4 hours from induction, 10 ml of the cultured sample was taken and centrifuged at 4000 × g for 10 minutes. The pellet was resuspended in 0.5 ml lysis buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 (pH 8.0). 20 μl of lysozyme (40 mg / ml) was added to this suspension, and after 30 minutes at 4 ° C., sonication was performed for 2 minutes. An aliquot of 1.0 ml of benzonase and an aliquot of 100 μl of 50 mM MgCl ₂ were added and incubated for 30 minutes at room temperature. After centrifugation at 13000 × g for 15 minutes, the supernatant was discarded and the pellet was heated in 98 μl of SDS introduction buffer at 98 ° C. for 5 minutes. A constant volume of 10 μl was then analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions (FIG. 17A). SDS-PAGE analysis showed a 17 kDa protein band corresponding to the mass of IL-5. As a control, BL21-DE2 cells containing pMODC6-IL5 were grown in the absence of IPTG and extracts were prepared from the insoluble cell fraction as described above.

Ｂ．マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の精製および折畳み
ワクチン生成に十分な量の純粋なＩＬ−５を得るために、ＢＬ２１−ＤＥ３細胞でクローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５からＩＬ−５を大規模に発現させた。培養物を一晩増殖させ、１．０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する体積１００ｍｌまたは１ＬのＴＢ培地で希釈した。合計３リットルの培養物をこのように調製し、ＯＤ_{６００ｎｍ}が０．７になるまで３７℃で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを添加することにより、最終濃度１．０ｍＭを得た。４時間のインキュベーションの後、１００００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞を収集した。ペレットを収集した後、ＰＢＳ（５．０ｍｌ／ｇ湿潤重量）に再懸濁し、１００００×ｇで１５分間遠心分離した。洗浄したペレットを、次に使用するまで−２０℃で貯蔵した。 B. Purification and folding of mouse His-C-IL5 IL-5 was expressed extensively from clone pMODC6-IL5 in BL21-DE3 cells to obtain an amount of pure IL-5 sufficient for vaccine production. The culture was grown overnight and diluted with a volume of 100 ml or 1 L TB medium containing 1.0 mg / L ampicillin. A total of 3 liters of culture was prepared in this way and grown at 37 ° C. until the OD _{600 nm} was 0.7, at which point IPTG was added to give a final concentration of 1.0 mM. After 4 hours incubation, cells were harvested by centrifugation at 10,000 xg for 30 minutes. After collecting the pellet, it was resuspended in PBS (5.0 ml / g wet weight) and centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes. The washed pellets were stored at −20 ° C. until next use.

細菌ペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用してＰＢＳ（２．０ｍｌ／ｇ細胞湿潤重量）に再懸濁した。この懸濁液にリゾチーム（０．８ｍｇ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。懸濁液を、氷上で１分間、３回にわたり超音波処理し、次いでベンゾナーゼおよびＭｇＣｌ_２（最終濃度１０ｍＭ）を添加して、室温で３０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００を添加して最終濃度１％（ｗ／ｖ）にし、その混合物を、３０分間室温で静かに撹拌した。溶液を、２００００×ｇで２０分間遠心分離し（ＳＳ３４チューブ）、上清を捨てた。封入体を収容したペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して洗浄緩衝液（２Ｍ尿素および１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）に懸濁し（５．０ｍｌ／ｇ湿潤重量）、５分間撹拌した。溶液を２００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を捨てた。ペレットを洗浄し、上述のようにさらに２回遠心分離した。トリトンＸ−１００が存在しない状態で、洗浄緩衝液で封入体の最後の洗浄を行った。 The bacterial pellet was resuspended in PBS (2.0 ml / g cell wet weight) using a Dounce homogenizer. Lysozyme (0.8 mg / ml) was added to this suspension and incubated at room temperature for 30 minutes. The suspension was sonicated 3 times for 1 minute on ice, then Benzonase and MgCl ₂ (final concentration 10 mM) were added and incubated for 30 minutes at room temperature. Triton X-100 was added to a final concentration of 1% (w / v) and the mixture was gently stirred at room temperature for 30 minutes. The solution was centrifuged at 20000 × g for 20 minutes (SS34 tube) and the supernatant was discarded. The pellet containing the inclusion bodies was suspended (5.0 ml / g wet weight) in wash buffer (PBS containing 2M urea and 1% (w / v) Triton X-100) using a Dounce homogenizer. Stir for 5 minutes. The solution was centrifuged at 20000 × g for 20 minutes and the supernatant was discarded. The pellet was washed and centrifuged two more times as described above. In the absence of Triton X-100, the inclusion body was finally washed with a wash buffer.

ペレットの封入体中に存在するＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を、変性緩衝液（１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６．０Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ８．０）に溶解し（５．０ｍｌ／ｇ細胞湿潤重量）、２５℃で１時間、静かに撹拌した。懸濁液を２００００×ｇで２０分間遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合した（ＱＩＡｇｅｎ、可溶化緩衝液と平衡）。４℃で３時間、静かに撹拌した後、スラリーをガラスカラム（Ｃ１０／１０）に注ぎ、樹脂を、１００ｍｌの１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ６．３）で洗浄した。さらに１５ｍｌの１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ５．９）を用いて洗浄工程を実行した。マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、２０ｍｌの１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓ、６．０Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ４．５）を加えることによって樹脂から溶出した。精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 His-C-IL-5 present in the inclusion body of the pellet was dissolved in denaturation buffer (100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-HCl, 6.0 M guanidine hydrochloride, pH 8.0) (5.0 ml / g cell wet weight), gently stirred at 25 ° C. for 1 hour. The suspension was centrifuged at 20000 × g for 20 minutes and the supernatant was mixed with Ni-NTA resin (QIAgen, equilibrated with solubilization buffer). After gently stirring at 4 ° C. for 3 hours, the slurry was poured onto a glass column (C10 / 10) and the resin was washed with 100 ml of 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris, 6.0 M guanidine hydrochloride (pH 6.3). did. Further, a washing step was performed using 15 ml of 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris, 6.0 M guanidine hydrochloride (pH 5.9). Mouse His-C-IL5 was eluted from the resin by adding 100mM of _{_{20ml NaH 2 PO 4, 10mM Tris}} , 6.0M guanidine hydrochloride (pH 4.5). Purification was analyzed by SDS-PAGE.

Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を含有する溶出工程からの画分を溜め、１０ｋＤａのカットオフ膜を使用して、８．０Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む緩衝液に対して４℃で透析した。透析の後、以下の式を使用して、タンパク質濃度を分光測光により決定した：タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×Ａ_{２８０ｎｍ}）−（０．７６×Ａ_{２６０ｎｍ}）。タンパク質の濃度を、透析緩衝液で希釈して０．２ｍｇ／ｍｌにした。次いで溶液を、２．０Ｍ尿素、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）を含むリフォールディング緩衝液１に対し、３．５ｋＤａ膜で２４時間にわたり４℃で透析し、さらに５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｐＨ８．５）を含む別のリフォールディング緩衝液２に対して２４時間透析した。最後にタンパク質をＰＢＳｐＨ８．０に対して４℃で２４時間透析し、次いで３０分間１００００×ｇで遠心分離した。上清のタンパク質含量を、ブラッドフォードアッセイにより評価した。 Fractions from the elution step containing His-C-IL-5 were pooled and washed with 8.0 M urea, 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) using a 10 kDa cut-off membrane. Dialyzed at 4 ° C. against the containing buffer. After dialysis, the protein concentration was determined spectrophotometrically using the following formula: protein (mg / ml) = (1.55 × A _{280 nm} ) − (0.76 × A _{260 nm} ). The protein concentration was diluted to 0.2 mg / ml with dialysis buffer. The solution is then refolded buffer 1 containing 2.0 M urea, 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 5 mM reduced glutathione, 0.5 mM oxidized glutathione, 0.5 M arginine, 10% (v / v) glycerol (pH 8.5). On the other hand, it is dialyzed against a 3.5 kDa membrane for 24 hours at 4 ° C., and further 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 5 mM reduced glutathione, 0.5 mM oxidized glutathione, 0.5 M arginine, 10% (v / v) glycerol (pH 8. Dialyzed against another refolding buffer 2 containing 5) for 24 hours. Finally, the protein was dialyzed against PBS pH 8.0 at 4 ° C. for 24 hours and then centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes. The protein content of the supernatant was assessed by the Bradford assay.

Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５をさらに精製するために、ＨｉｔｒａｐＱ樹脂（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いた陰イオン交換を行った。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、遠心分離フィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａカットオフ）を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．４に対して１４時間透析した。溶液をＨｉｔｒａｐＱカラムに導入し、５０ｍＭリン酸ｐＨ８．４緩衝液で洗浄した。０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を加えることによって、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５をカラムから溶出した。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、１００ｍＭＮａＣｌでカラムから溶出した。精製の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥで行い、濃度をブラッドフォードアッセイで測定した。タンパク質の４次構造を、非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。 To further purify His-C-IL5, anion exchange with Hitrap Q resin (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) was performed. His-C-IL5 was concentrated to 1 mg / ml using a centrifugal filter (Ultrafree-15 Millipore, 10 kDa cutoff) and dialyzed for 14 hours against 50 mM phosphate buffer pH 8.4. The solution was introduced into a Hitrap Q column and washed with 50 mM phosphate pH 8.4 buffer. His-C-IL-5 was eluted from the column by adding a 0-1 M NaCl gradient. His-C-IL5 was eluted from the column with 100 mM NaCl. Purification analysis was performed by SDS-PAGE and the concentration was determined by Bradford assay. The quaternary structure of the protein was evaluated by SDS-PAGE performed under non-reducing conditions.

Ｃ．ワクチン生成：Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のＱβへの連結
様々な条件を調査して、連結反応の効率を最適化した。この手法には、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５への還元剤（ＴＣＥＰ）の添加、連結反応におけるＱβモノマーとＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のモル比の変化が含まれ、これを表１にまとめる。効能を調査するためのワクチンは、以下の方法で生成した。精製したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５（４０μＭ）を、ｐＨ８．０のＰＢＳに溶かした等モル量のＴＣＥＰで１時間還元した。還元したＩＬ−５（８０μＭ）を、全体積が７００μｌのＳＭＰＨで誘導化した４０μＭＱβと共に、２２℃で４時間インキュベートした。反応生成物を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してｐＨ８．０のＰＢＳに対して１２時間透析した。連結反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗Ｈｉｓおよび抗Ｑβ抗体を用いたウェスタンブロット法によって分析した。タンパク質濃度をブラッドフォードで測定した。クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析によって、連結効率［すなわちモルＱβ−ＩＬ５／モルＱβモノマー（合計）］を評価した。 C. Vaccine generation: Linking His-C-IL5 to Qβ Various conditions were investigated to optimize the efficiency of the ligation reaction. This approach includes the addition of a reducing agent (TCEP) to His-C-IL5, and changes in the molar ratio of Qβ monomer to His-C-IL5 in the ligation reaction, which are summarized in Table 1. The vaccine for investigating the efficacy was generated by the following method. Purified His-C-IL-5 (40 μM) was reduced with an equimolar amount of TCEP dissolved in PBS of pH 8.0 for 1 hour. Reduced IL-5 (80 μM) was incubated with 40 μM Qβ derivatized with 700 μl total volume of SMPH for 4 hours at 22 ° C. The reaction product was dialyzed for 12 hours against pH 8.0 PBS using a 300 kDa cut-off dialysis membrane. The ligation reaction was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting using anti-His and anti-Qβ antibodies. Protein concentration was measured with Bradford. The ligation efficiency [ie mol Qβ-IL5 / mol Qβ monomer (total)] was assessed by densitometric analysis of Coomassie blue stained SDS-PAGE.

Ｄ．ワクチンを評価するためのＥＬＩＳＡ
マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５のＱβへの連結は、図４に示す「４重」ＥＬＩＳＡを使用して評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり１ｍｇ／Ｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ１００ｕｌで一晩被覆した。プレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、次いでＰＢＳＴに溶かした２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ウサギからのポリクローナル抗Ｑβ血清（１：５０００に希釈）を添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、様々な量のＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５または対照を添加し（図５）、２５℃で１時間インキュベートした。２つの異なる３次抗体をアッセイに使用した。すなわちラット抗マウスＩＬ５（ＴＲＦＫ４）またはラット抗マウスＩＬ５（ＴＲＦＫ５）であり、いずれも中和モノクローナル抗体である。すべては濃度１μｇ／ｍｌで使用した。検出抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合され、これは３次抗体の特定のＦｃ断片に特異的であった。サンドイッチアッセイでの結合は、化学発光法（ＥＣＬ）により４５０ｎｍで測定した。 D. ELISA to evaluate vaccines
Ligation of mouse His-C-IL5 to Qβ was assessed using a “quadruple” ELISA as shown in FIG. A 96 well ELISA plate was coated overnight with 100 ul of 1 mg / L goat anti-rabbit IgG per well. The plate was washed 4 times with PBS-Tween 0.1% (v / v) (PBST) and then 2% (w / v) bovine serum albumin (BSA) in PBST for 2 hours at 37 ° C. Blocked. After washing with PBST, polyclonal anti-Qβ serum from rabbit (diluted 1: 5000) was added and incubated for 1 hour. Plates were washed twice with PBST and various amounts of Qβ-His-C-IL5 or controls were added (FIG. 5) and incubated at 25 ° C. for 1 hour. Two different tertiary antibodies were used in the assay. That is, rat anti-mouse IL5 (TRFK4) or rat anti-mouse IL5 (TRFK5), both of which are neutralizing monoclonal antibodies. All were used at a concentration of 1 μg / ml. The detection antibody was conjugated to horseradish peroxidase (HRP), which was specific for a particular Fc fragment of the tertiary antibody. Binding in the sandwich assay was measured at 450 nm by chemiluminescence (ECL).

Ｆ．ＩＬ−５活性のアッセイ
マウスＩＬ−５に応答してＢ細胞リンパ腫系ＢＣＬ１が増殖する能力を用いて、リフォールディング組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５の生物活性をチェックした（ＨａｒｒｉｍａｎＧ．Ｒ．（１９９１）免疫学における現行プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６．５．１〜６．５．５、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓＩｎｃ．）。Ｑβに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の増殖活性についても評価した。対照として組換えマウスＩＬ−５（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国）を使用した。様々な形態の組換えＩＬ−５を、ウェル当たり２×１０^４ＢＣＬ１細胞を有する平底９６ウェルプレートでインキュベートし、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。^３Ｈチミジン１μＣｉ（ＨａｒｔｍａｎｎＡｎａｌｙｔｉｃ、スイス）を各ウェルに添加し、このプレートをさらに６時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞を収集し、洗浄し、液体シンチレーションカウンターでβ放出をカウントすることによってチミジンの組込みを決定した。 F. Assay of IL-5 activity The ability of the B cell lymphoma line BCL1 to proliferate in response to mouse IL-5 was used to check the biological activity of the refolded recombinant His-C-IL-5 (Harriman GR). (1991) Current Protocols in Immunology 6.5.1-6.5.5, John Wiley and Sons Inc.). The proliferative activity of His-C-IL5 covalently bound to Qβ was also evaluated. Recombinant mouse IL-5 (R & D system, Minneapolis, USA) was used as a control. Various forms of recombinant IL-5 were incubated in flat bottom 96 well plates with 2 × 10 ⁴ BCL1 cells per well and incubated at 37 ° C., 5% CO ₂ for 24 hours. ³ μThymidine 1 μCi (Hartmann Analytical, Switzerland) was added to each well and the plate was incubated for an additional 6 hours at 37 ° C., 5% CO ₂ . Cells were harvested, washed, and thymidine incorporation was determined by counting β release in a liquid scintillation counter.

Ｇ．免疫化プロトコル
マウスＩＬ−５に対する自己反応性抗体を生成するために、４匹のＢａｌｂＣマウスに対して第０日目と第１４日目に、ＰＢＳ２００μｌに溶かしたＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５ワクチン２５μｇを皮下注射した。陰性対照として役立てるため、５匹のマウスを第０日目と第１４日目に、６．４μｇのＱβと１６μｇのＩＬ５の単純混合物で、すなわち非共有結合した（Ｑβ＋Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５）をＰＢＳに溶かしたもので免疫化した。免疫化の前と、免疫化プロトコルの第２１日目に、マウスから出血させた。血清をＥＬＩＳＡで分析した。 G. Immunization protocol Qβ-His-C-IL5 vaccine dissolved in 200 μl PBS on day 0 and day 14 on 4 BalbC mice to generate autoreactive antibodies against mouse IL-5 25 μg was injected subcutaneously. To serve as a negative control, 5 mice were conjugated with a simple mixture of 6.4 μg Qβ and 16 μg IL5 on days 0 and 14, ie non-covalently (Qβ + His-C-IL-5). Was immunized with PBS dissolved in PBS. Mice were bled prior to immunization and on day 21 of the immunization protocol. Serum was analyzed by ELISA.

Ｈ．血清分析
ＥＬＩＳＡ。ＭａｘｉｓｏｒｐＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、精製したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５（３μｇ／ｍｌ）５０μｌで、４℃で１４時間被覆した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに溶かした２％ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。５倍希釈した血清を、２％ＢＳＡ、０．１％ＦＣＳをＰＳＢに溶かしたものに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを引き続きＰＢＳで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧをＨＲＰに結合させたもの（希釈１：１０００）と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの展開溶液（０．０６６ＭＮａ２ＨＰＯ４、０．０３５Ｍクエン酸、０．０３２％Ｈ_２Ｏ_２、０．４％１，２−フェニレンジアミン２塩酸塩）を添加した。室温で２分間反応させた後、ＥＬＩＳＡをウェル当たり５０μｌの５％Ｈ_２ＳＯ_４で停止させた。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍで測定した。 H. Serum analysis ELISA. Maxisorp ELISA plates (Nunc) were coated with 50 μl of purified His-C-IL-5 (3 μg / ml) at 4 ° C. for 14 hours. Plates were washed 3 times with PBS, blocked with 2% BSA in PBS for 2 hours at 37 ° C. and then washed twice with PBS. Serum diluted 5 times was added to 2% BSA and 0.1% FCS dissolved in PSB and incubated at room temperature for 1 hour. The plate was subsequently washed 3 times with PBS and incubated for 1 hour at room temperature with anti-mouse IgG conjugated to HRP (dilution 1: 1000). The plate was again washed 3 times with PBS and 100 μl / well of developing solution (0.066 M Na ₂ HPO 4, 0.035 M citric acid, 0.032% H ₂ O ₂ , 0.4% 1,2-phenylenediamine dihydrochloride. ) Was added. After reacting for 2 minutes at room temperature, the ELISA was stopped with 50 μl of 5% H ₂ SO ₄ per well. Absorbance was measured at 450 nm with a Spectramax spectrophotometer (Molecular Devices).

Ｑβ−ＩＬ５で免疫化したマウスの血清によるウェスタンブロット染色。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５、Ｑβ、および対照をＳＤＳ＿ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜上に電気ブロットした。膜を、ＰＢＳに溶かした５％（ｗ／ｖ）粉乳で１時間ブロックし、次いで、ＰＢＳに溶かした１％（ｗ／ｖ）粉乳１０ｍｌ中に、ワクチン接種したマウスからの第２１日目の血清を溶かしたもの２０μｌと共にインキュベートした。膜をＰＢＳで１５分間洗浄し、次いで抗マウスＩｇＧ抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に１：１０００の希釈率で結合させたものを含有するＰＢＳに溶かした１％（ｗ／ｖ）粉乳１０ｍｌと共に、１時間インキュベートした。膜をＰＢＳ中で１５分間洗浄し、ＥＣＬ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）で現像して、写真フィルムに露光した。 Western blot staining with serum of mice immunized with Qβ-IL5. His-C-IL5, Qβ, and control were separated by SDS_PAGE and electroblotted onto a nitrocellulose membrane. Membranes were blocked with 5% (w / v) milk powder in PBS for 1 hour and then on day 21 from vaccinated mice in 10 ml of 1% (w / v) milk powder in PBS. Incubated with 20 μl of lysed serum. The membrane was washed with PBS for 15 minutes and then with 10 ml of 1% (w / v) milk powder dissolved in PBS containing anti-mouse IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) at a dilution of 1: 1000. Incubated for 1 hour. The membrane was washed in PBS for 15 minutes, developed with ECL (Amersham Pharmacia, Sweden) and exposed to photographic film.

Ｉ．好酸球増加症モデル
アレルギー性気道炎症の実験喘息モデルを使用して、好酸球増加症に対するワクチン接種の効果について評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たり４匹）を、上述のＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５で免疫化した。ワクチン接種プログラムの第２３日目に、マウスに対し、Ａｌｕｍｎ（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ）に溶かした５０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を腹膜内注射した。免疫化されていない４匹のマウスの第３のグループにも注射をした。１０日が経過した後（すなわち第３３日目）、マウスは４日間にわたり毎日、ＰＢＳに溶かしたＯＶＡ１００μｇの鼻内投与を受けた。最後の投与から２４時間後、マウスを屠殺して、肺をＰＢＳで洗浄した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）に含有される細胞をＭａｉｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、カウントした（ＴｒｉｆｉｌｉｅｆｆＡ他、ＣｌｉｎＥｘｐＡｌｌｅｒｇｙ、２００１年６月；３１（６）：９３４〜４２）。 I. Eosinophilia model An experimental asthma model of allergic airway inflammation was used to evaluate the effect of vaccination against eosinophilia. Balb / c mice (4 per group) were immunized with Qβ-His-C-IL-5 as described above. On day 23 of the vaccination program, mice were injected intraperitoneally with 50 μg ovalbumin (OVA) dissolved in Alumn (Alu-Gel-S). A third group of 4 unimmunized mice was also injected. After 10 days (ie, day 33), mice received 100 μg of OVA in PBS intranasally daily for 4 days. Twenty-four hours after the last dose, the mice were sacrificed and the lungs were lavaged with PBS. Cells contained in bronchoalveolar lavage fluid (BAL) were stained with Maigrungwald-Giemsa and counted (Trifilieff A et al., Clin Exp Allergy, June 2001; 31 (6): 934-42).

結果および考察
発現。ＢＬ２１−ＤＥ２細胞での構成体ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５の発現について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１）。クーマシーブルー染色したゲルは、１７ｋＤａタンパク質のＩＰＴＧ誘導型発現が、ＩＬ−５の質量に対応するものであることを実証した。対照として、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５を含有するＢＬ２１−ＤＥ２細胞を、ＩＰＴＧが存在しない状態で増殖させ、抽出物を、上述のように不溶性細胞画分から調製した。予想通り、これらの条件下では、１７ｋＤａの誘導はなかった。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、不溶性封入体画分に局在化した。 Results and Discussion Expression. Expression of the construct pMODC6-IL5 in BL21-DE2 cells was analyzed by SDS-PAGE (FIG. 1). The Coomassie blue stained gel demonstrated that IPTG-induced expression of the 17 kDa protein corresponds to the mass of IL-5. As a control, BL21-DE2 cells containing pMODC6-IL5 were grown in the absence of IPTG and extracts were prepared from the insoluble cell fraction as described above. As expected, there was no induction of 17 kDa under these conditions. His-C-IL5 was localized in the insoluble inclusion body fraction.

抽出、精製、およびリフォールディング。不溶性Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、６Ｍ塩酸グアニジンを用い、洗浄剤で洗浄した封入体から抽出した。溶解したタンパク質を、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２）。組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、この手順によって非常に濃縮されたことがわかった。変性したタンパク質を、上述のように尿素中でのリフォールディング手順にかけ、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーで精製した。これらの工程では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されたように、可溶性で高純度のＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５が得られ（図５、レーン１）、回収率２３％、収量６．９ｍｇであった。 Extraction, purification, and refolding. Insoluble His-C-IL5 was extracted from inclusion bodies washed with detergent using 6M guanidine hydrochloride. The solubilized protein was purified by metal chelate affinity chromatography and analyzed by SDS-PAGE (FIG. 2). Recombinant His-C-IL5 was found to be highly enriched by this procedure. The denatured protein was subjected to a refolding procedure in urea as described above and further purified by anion exchange chromatography. In these steps, as determined by SDS-PAGE, soluble and highly pure His-C-IL5 was obtained (FIG. 5, lane 1), with a recovery of 23% and a yield of 6.9 mg.

生物学的に活性な未処理のＩＬ−５はジスルフィド結合ホモダイマーであるので、精製された組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５がダイマーを形成する能力について、非還元条件下で実施されるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図３）。３７ｋＤａの分子質量により判断されるように、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５は、未処理の４次構造が保存されている状態を示す性質からダイマーであることが実証された。 Since biologically active untreated IL-5 is a disulfide bond homodimer, the ability of purified recombinant His-C-IL5 to form dimers is determined by SDS-PAGE performed under non-reducing conditions. Evaluation was made (FIG. 3). As judged by the molecular mass of 37 kDa, His-C-IL5 was demonstrated to be a dimer due to its property of preserving untreated quaternary structure.

組換えＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の生物活性を、マウスＢ細胞系の増殖を刺激する能力を決定することによって評価した（図４）。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の存在下で培養されたＢＣＬ１細胞は、培地単独またはその他のタンパク質に比べて増殖速度が高められたことを示した。さらに、増殖が高まったことは、市販のマウスＩＬ−５で観察された場合に類似している。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５が、おそらくはその同族のレセプターとの相互作用によってＢ細胞の増殖を刺激することができ、またダイマー構造の形態をとることができることは、いずれも、組換えタンパク質が未処理の構造形態をとることを示している。 The biological activity of recombinant His-C-IL5 was assessed by determining its ability to stimulate the proliferation of mouse B cell lines (FIG. 4). BCL1 cells cultured in the presence of His-C-IL5 showed an increased growth rate compared to medium alone or other proteins. Furthermore, the increased proliferation is similar to that observed with commercially available mouse IL-5. The ability of His-C-IL5 to stimulate B cell proliferation, possibly by interacting with its cognate receptor, and take the form of a dimeric structure, both of which the recombinant protein is untreated It shows that it takes a structural form.

ワクチンの生成および分析。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５とウイルス様粒子Ｑβとの共有化学結合を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。この連結反応のクーマシーブルー染色ゲルは、分子量が、Ｑβに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５に関して予測されるものに相当するバンドが現れることを実証した（図５）。さらにウェスタンブロット分析によれば、抗Ｈｉｓ抗体または抗Ｑβ抗体で染色した場合にこれらのバンドが共存することが示された（図６）。連結効率［すなわちモルＱβ−ＩＬ５／モルＱβモノマー（総量）］は、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定分析によって評価し、４０．６％であった。 Vaccine generation and analysis. Covalent chemical binding between His-C-IL5 and virus-like particle Qβ was assessed by SDS-PAGE and Western blot analysis. The Coomassie blue stained gel of this ligation demonstrated that a band corresponding to the molecular weight expected for His-C-IL5 covalently bound to Qβ appeared (FIG. 5). Furthermore, Western blot analysis showed that these bands coexisted when stained with anti-His antibody or anti-Qβ antibody (FIG. 6). The ligation efficiency [i.e. molar Qβ-IL5 / mol Qβ monomer (total)] was evaluated by densitometric analysis of Coomassie blue stained SDS-PAGE and was 40.6%.

Ｑβに共有架橋したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５がＢ細胞増殖を刺激することができる能力は、前述のように評価した。図５は、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５によって、無関係のサイトカインに連結したＱβよりも増殖を高めることができることを示す。 The ability of His-C-IL-5 covalently crosslinked to Qβ to stimulate B cell proliferation was assessed as described above. FIG. 5 shows that Qβ-His-C-IL5 can enhance proliferation over Qβ linked to unrelated cytokines.

Ｑβに連結したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の構造について、４重ＥＬＩＳＡを使用してさらに分析した（図７ａ）。図７ｂは、Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５がＩＬ−５中和モノクローナル抗体ＴＲＦＫ４およびＴＲＦＫ５によって認識されることを実証している。反応を、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５ではなくＱβと共に行った場合、シグナルは検出されなかった。モノクローナル抗体ＴＲＦＫ４は、ＩＬ−５内の中和エピトープを認識する。ＩＬ−５特異的モノクローナル抗体が、共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５を認識できることは、中和エピトープがワクチン製剤中に保存されることを示している。 The structure of His-C-IL5 linked to Qβ was further analyzed using a quadruple ELISA (FIG. 7a). FIG. 7b demonstrates that His-C-IL5 is recognized by IL-5 neutralizing monoclonal antibodies TRFK4 and TRFK5. When the reaction was performed with Qβ but not Qβ-His-C-IL-5, no signal was detected. Monoclonal antibody TRFK4 recognizes a neutralizing epitope within IL-5. The ability of IL-5 specific monoclonal antibodies to recognize covalently bound His-C-IL-5 indicates that neutralizing epitopes are preserved in the vaccine formulation.

血清の分析。マウスの免疫前血清と、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種したマウスの第２１日目の血清を回収し、ＥＬＩＳＡで分析した（図８）。その結果は、自己抗原ＩＬ−５に対する免疫寛容が、アジュバントのない状態で、かつマウス（４／４）にワクチン接種した後にのみ、克服されたことを示している。最大半減力価は、１：２０００〜１：６０００の範囲になるように計算した。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と混合したＱβを受け取った対照グループでは、有意な抗ＩＬ−５力価が検出されなかった。しかし５匹のうち３匹のマウスでは、低抗体力価＜１：５０がもたらされた。Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種したマウスからの免疫血清を、ウェスタンブロット分析によってさらに試験した。すべての場合において、免疫血清はマウスＩＬ−５を特異的に認識した。 Serum analysis. Mouse pre-immune serum and day 21 serum of mice vaccinated with Qβ-His-C-IL5 were collected and analyzed by ELISA (FIG. 8). The results show that immune tolerance to the autoantigen IL-5 was overcome only in the absence of adjuvant and after vaccination of mice (4/4). The maximum half-power was calculated to be in the range of 1: 2000 to 1: 6000. In the control group that received Qβ mixed with His-C-IL5, no significant anti-IL-5 titer was detected. However, 3 out of 5 mice resulted in low antibody titers <1:50. Immune sera from mice vaccinated with Qβ-His-C-IL5 were further tested by Western blot analysis. In all cases, immune sera specifically recognized mouse IL-5.

実験的喘息の動物モデルでのワクチン効率。Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５によるワクチン接種が好酸球増加症に及ぼす影響について、喘息の重要な病態を模倣するアレルギー性気道炎症のマウスモデルで評価した。この実験では、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５のワクチン接種により生成された抗ＩＬ５抗体が、内因性ＩＬ−５のｉｎｖｉｖｏ動作をダウンレギュレーションする能力について試験した。対照実験では、ＯＶＡ感作および投与の前に、マウスにＰＢＳを接種した。この場合、多数の好酸球がＢＡＬでカウントされた。カウントされた細胞２００個当たりの好酸球の平均の数は、９６±１４Ｓ．Ｄ．であった。これとは対照的に、Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５をワクチン接種した４匹のマウスからのＢＡＬ好酸球の平均値は、細胞２００個当たり２７．５＋１１Ｓ．Ｄ．であることがカウントされた。これは７１．４％の減少であり、高度に配列された免疫アレイとして提示されるＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５による免疫化で生成された自己抗体が、内因性標的分子を認識し、それによって喘息の実験モデルで好酸球増加症をダウンレギュレートすることの証拠である。 Vaccine efficiency in an animal model of experimental asthma. The effect of vaccination with Qβ-His-C-IL5 on eosinophilia was evaluated in a mouse model of allergic airway inflammation that mimics the important pathology of asthma. In this experiment, anti-IL5 antibodies generated by vaccination with Qβ-His-C-IL-5 were tested for the ability to down-regulate the in vivo behavior of endogenous IL-5. In control experiments, mice were inoculated with PBS prior to OVA sensitization and administration. In this case, a large number of eosinophils were counted with BAL. The average number of eosinophils per 200 cells counted is 96 ± 14 S.D. D. Met. In contrast, the average value of BAL eosinophils from 4 mice vaccinated with Qβ-His-C-IL5 was 27.5 + 11 S.D. per 200 cells. D. It was counted to be. This is a 71.4% reduction, and autoantibodies generated upon immunization with His-C-IL-5 presented as a highly ordered immune array recognize endogenous target molecules, thereby Evidence for down-regulating eosinophilia in an experimental model of asthma.

ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸リンカーを備えるマウスｍＩＬ−１３の、分子のクローニング、発現、リフォールディング、および精製。マウスインターロイキン１３とＶＬＰおよび線毛との連結
Ａ．原核発現のためのＩＬ−１３のクローニング
ＩＬ−１３をクローニングするためのＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲでｉｎｖｉｔｒｏ活性化脾細胞から単離したが、これは以下のようにして得られたものである。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓細胞から単離し、事前に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で被覆した６ウェルプレートでＩＭＤＭ（＋５％ＦＣＳ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ４）中で３日間インキュベートした。これらの細胞からのＲＮＡを使用して、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（ＱｉａｇｅｎワンステップＰＣＲキット）により、ＩＬ１３をコードするｃＤＮＡを増幅した。プライマーＸｈｏＩＬ１３−ＲはＲＮＡの逆転写に使用し、プライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）は、ＩＬ１３ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＭＯＤベクターに、増幅したＩＬ１３ｃＤＮＡをライゲートした（ベクターｐＭＯＤＢ１−ＩＬ１３を与える）。得られたｃＤＮＡ配列の同一性を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。 Molecular cloning, expression, refolding, and purification of mouse mIL-13 with a C-terminal amino acid linker containing a cysteine residue for linking to VLP and pili. Coupling of mouse interleukin 13 with VLP and pili Cloning of IL-13 for prokaryotic expression DNA for cloning IL-13 was isolated from in vitro activated splenocytes by RT-PCR, which was obtained as follows. . That is, CD4 + T cells were isolated from mouse spleen cells and incubated in IMDM (+ 5% FCS + 10 ng / ml IL4) for 3 days in 6-well plates previously coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Using RNA from these cells, cDNA encoding IL13 was amplified by one-step RT-PCR (Qiagen one-step PCR kit). Primer XhoIL13-R was used for reverse transcription of RNA, and primers NheIL13-F (SEQ ID NO: 338) and XhoIL13-R (SEQ ID NO: 339) were used for PCR amplification of IL13 cDNA. The amplified IL13 cDNA was ligated into the pMOD vector using NheI / XhoI restriction sites (giving the vector pMODB1-IL13). The identity of the resulting cDNA sequence was determined by nucleotide sequencing.

同じプライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）を使用して、ｐＭｏｄＢ１−ＩＬ１３プラスミドからＩＬ−１３ｃＤＮＡを増幅し、ｐＭＯＤＧＳＴ−ＥＫ−Ｃｌベクターにライゲートし、それによってプラスミドｐＭｏｄＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌを得た。このプラスミドのｃＤＮＡ配列を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。エンテロキナーゼ切断部位に融合したグルタチオンＳトランスフェラーゼと、それに続くＣ末端リンカー１を備えたＩＬ−１３配列に対するコード配列を含むｃＤＮＡを、プラスミドｐＭｏｄＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌを鋳型として使用して、プライマーＧＳＴ−ＢａｍＨＩｓｓおよびＣｌ−ＢｓｍＢＩ／ＸｈｏＩを用いたＰＣＲにより増幅した。このｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＭｏｄＢ−Ｎ１ベクターにライゲートした。得られたプラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、エンテロキナーゼ切断部位、ＩＬ−１３、システイン含有リンカー、およびポリヒスジジンタグからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ）をコードする。この融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの同一性を、ヌクレオチド配列決定によって決定した。
オリゴヌクレオチドの配列：
ＧＳＴ−ＢａｍＨＩｓｓ：
５’−ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧ−３’
Ｃｌ−ＢｓｍＢＩ／ＸｈｏＩａｓ：
５’−ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡ−３’ Using the same primers NheIL13-F (SEQ ID NO: 338) and XhoIL13-R (SEQ ID NO: 339), the IL-13 cDNA was amplified from the pModB1-IL13 plasmid and ligated into the pMODGST-EK-Cl vector, thereby producing the plasmid pModGST. -EK-IL13-Cl was obtained. The cDNA sequence of this plasmid was determined by nucleotide sequencing. A cDNA containing glutathione S transferase fused to the enterokinase cleavage site followed by a coding sequence for the IL-13 sequence with a C-terminal linker 1 is used as a primer GST using plasmid pModGST-EK-IL13-Cl as a template. -Amplified by PCR with BamHI ss and Cl-BsmBI / XhoI. This cDNA was digested with the restriction enzymes BamHI and BsmBI and ligated into the pModB-N1 vector using BamHI / XhoI restriction sites. The resulting plasmid pMod-GST-EK-IL13-Cl-His is a fusion protein (GST-EK-IL13-) consisting of glutathione S transferase, enterokinase cleavage site, IL-13, cysteine-containing linker, and polyhistidine tag. Cl-His). The identity of the cDNA encoding this fusion protein was determined by nucleotide sequencing.
Oligonucleotide sequence:
GST-BamHI ss:
5'-CGCCGGATCCTATACTAGGTTTATTGG-3 '
Cl-BsmBI / XhoI as:
5′-GGGGCGCGTCTCTCTCGAGACCGCACACCACCACCA-3 ′

Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＬ−１３の発現
プラスミドｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓを、細菌宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。２％グルコース（事前培養物）を含有するＬＢ培地で回収した９０分後、０．２％グルコースおよび１００μｇアンピシリン／ｌを含有する２５０ｍｌのＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地に、２５０μｌの事前培養物を接種し、振盪プラットフォーム上で一晩３７℃でインキュベートした。翌朝、種培養物を、１００μｇアンピシリン／ｌを含有する７５０ｍｌの事前に温めたＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地で希釈し、振盪プラットフォーム上でさらに９０分間、ＯＤ_６００が４．５に達するまで１２５ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。１０００ｍｌの培養物を、１００μｇアンピシリン／ｌを含有する５００ｍｌのＭＯＰＳ緩衝ＳＢ培地で希釈し、２４℃のインキュベータに移し、プラットフォームを振盪させながら３０分間、ＯＤ_６００が３．７５に達するまでインキュベートした。ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質の発現は、０．７５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。４時間後、遠心分離によって細菌を収集し、超音波処理で破壊した。 B. E. Expression of IL-13 in E. coli Plasmid pMod-GST-EK-IL13-Cl-His was transformed into the bacterial host strain BL21 (DE3). After 90 minutes of recovery in LB medium containing 2% glucose (preculture), 250 ml of MOPS buffer SB medium containing 0.2% glucose and 100 μg ampicillin / l is inoculated with 250 μl of preculture, Incubated overnight at 37 ° C. on a shaking platform. The next morning, the seed culture is diluted with 750 ml of pre-warmed MOPS buffered SB medium containing 100 μg ampicillin / l and further 90 minutes on a shaking platform at 125 rpm, 37 ° C. until OD ₆₀₀ reaches 4.5. Incubated. 1000 ml culture was diluted with 500 ml MOPS buffered SB medium containing 100 μg ampicillin / l, transferred to a 24 ° C. incubator and incubated for 30 minutes with shaking the platform until OD ₆₀₀ reached 3.75. Expression of the GST-EK-IL13-Cl-His fusion protein was induced by adding 0.75 mM IPTG. After 4 hours, the bacteria were collected by centrifugation and disrupted by sonication.

Ｃ．変性条件下での、封入体からのＩＬ−１３の精製
溶解後、封入体を低速遠心分離（１００００ｇ、６０分、４℃）により沈降させた。上清を回収し、再び同じ条件下で遠心分離した。ペレットを粗製封入体画分として保持した。封入体を、以下の洗浄緩衝液、すなわち５０ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、２Ｍ尿素、２％トリトンＸ−１００、および１０Ｕベンゾナーゼ／ｍｌで４回洗浄した。封入体を遠心分離によって回収し、１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭトリスＨＣｌ、および６Ｍグアニジン−ＨＣｐＨ８．０を含有する変性緩衝液に再懸濁した。封入体を、１０Ｕベンゾナーゼ／ｍｌの存在下で超音波処理し、室温で２時間、回転ホイール上でインキュベートした。遠心分離後、上清を保持し、ペレットを再び変性緩衝液に再懸濁し、上述のように処理した。上清を溜め、変性緩衝液で平衡にしたＮｉ^２＋アガロースカラムに導入した。結合したタンパク質を、ｐＨ６．３およびｐＨ４．５の変性緩衝液を用いて２段階で溶出した。一定量の画分を、アミドブラック染色し、ＴＣＡ沈降後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１０）。 C. Purification of IL-13 from inclusion bodies under denaturing conditions After dissolution, the inclusion bodies were sedimented by low speed centrifugation (10000 g, 60 min, 4 ° C.). The supernatant was collected and centrifuged again under the same conditions. The pellet was retained as a crude inclusion body fraction. The inclusion bodies, following washing buffer, i.e. 50mM Tris _{HCL, pH7.6,250mM NaCl, 5mM MgCl 2} , 2M urea, and washed 4 times with 2% Triton X-100, and 10U Benzonase / ml. Inclusion bodies were collected by centrifugation and resuspended in denaturing buffer containing 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris HCl, and 6M guanidine-HC pH 8.0. Inclusion bodies were sonicated in the presence of 10 U benzonase / ml and incubated on a rotating wheel for 2 hours at room temperature. After centrifugation, the supernatant was retained and the pellet was resuspended again in denaturing buffer and processed as described above. The supernatant was pooled and introduced onto a Ni ²⁺ agarose column equilibrated with denaturing buffer. Bound protein was eluted in two steps using denaturation buffer at pH 6.3 and pH 4.5. An aliquot of the fraction was stained with amide black and analyzed by SDS-PAGE after TCA precipitation (Figure 10).

Ｄ．ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓのリフォールディング
溶出したタンパク質にβメルカプトエタノールを添加して、最終濃度１０ｍＭにし、８．０Ｍ尿素、１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ βメルカプトエタノール（ｐＨ８．０）を含有する緩衝液２リットルに対し、１０ｋＤａのカットオフ膜を使用して４℃で一晩透析した。透析後、タンパク質濃度を決定し、そのタンパク質の濃度を透析緩衝液で希釈して０．２ｍｇ／ｍｌにした。この溶液を、２．０Ｍ尿素、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、０．５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液１（ｐＨ８．５）に対し、４℃で２４時間透析した。翌日このリフォールディング緩衝液１を、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、２．５ｍＭ還元グルタチオン、０．２５ｍＭ酸化グルタチオン、０．２５Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液２（ｐＨ８．５）に対して交換し、さらに２４時間、４℃で透析した。最後にこの溶液を、２０ｍＭエタノールアミン、１５０ｍＭＮａＣｌ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むリフォールディング緩衝液３（ｐＨ９．０）に対して４℃で透析した。リフォールディング緩衝液３を２時間後に一度交換し、透析をさらに１４時間続行した。透析物を、４℃で１５分間、２００００ｇで遠心分離した。上清を保持し、タンパク質を、５ｋＤａ分子量カットオフ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を備えた「バイオマックス遠心分離フィルタ装置」で遠心分離することにより濃縮して、最終的なタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌにした。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、ＧＳＴ、マウスＩＬ−１３、およびＨｉｓタグに対するそれぞれの単一特異性抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。 D. Refolding of GST-EK-IL13-Cl-His β-mercaptoethanol was added to the eluted protein to a final concentration of 10 mM, 8.0 M urea, 100 mM NaH ₂ PO ₄ , 10 mM Tris HCl, 10 mM β-mercaptoethanol (pH 8) 0.0) was dialyzed overnight at 4 ° C. using a 10 kDa cut-off membrane. After dialysis, the protein concentration was determined and the protein concentration was diluted to 0.2 mg / ml with dialysis buffer. This solution was added to refolding buffer 1 (pH 8.5) containing 2.0 M urea, 50 mM NaH ₂ PO ₄ , 5 mM reduced glutathione, 0.5 mM oxidized glutathione, 0.5 M arginine, 10% (v / v) glycerol. The solution was dialyzed at 4 ° C. for 24 hours. The next day the refolding buffer _{_{1, 50mM NaH 2 PO 4,}} 2.5mM reduced glutathione, 0.25 mM oxidized glutathione, 0.25M arginine, 10% (v / v) refolding buffer 2 containing glycerol (pH 8. Exchanged for 5) and dialyzed for an additional 24 hours at 4 ° C. Finally, this solution was dialyzed at 4 ° C. against refolding buffer 3 (pH 9.0) containing 20 mM ethanolamine, 150 mM NaCl, and 10% (v / v) glycerol. Refolding buffer 3 was changed once after 2 hours and dialysis continued for another 14 hours. The dialysate was centrifuged at 20000 g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was retained and the protein was concentrated by centrifugation on a “Biomax centrifugal filter device” equipped with a 5 kDa molecular weight cutoff (Millipore) to a final protein concentration of 2 mg / ml. Proteins were analyzed by Western blot using SDS-PAGE and respective monospecific antibodies to GST, mouse IL-13, and His tag.

Ｅ．エンテロキナーゼによるＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質の切断
ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓ融合タンパク質を、１×エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０、１０ｍＭＣａＣｌ_２、および１％Ｔｗｅｅｎ−２０）と、１２．５ｕｇの融合タンパク質当たり１Ｕのエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）と共に、４℃で２４時間インキュベートする。 E. Cleavage of GST-EK-IL13-Cl-His fusion protein by enterokinase GST-EK-IL13-Cl-His fusion protein was washed with 1 × enterokinase buffer (50 mM Tris HCl pH 8.0, 10 mM CaCl ₂ , and 1% Tween-20) and 1 U enterokinase (Invitrogene) per 12.5 ug fusion protein are incubated at 4 ° C. for 24 hours.

Ｆ．ＩＬ１３−Ｃｌ−Ｈｉｓの精製
エンテロキナーゼによる処理の後、切断されたＧＳＴを、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、およびアフィニティークロマトグラフィーの組合せによって分離する。ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を濃縮して、最終的なタンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌにする。 F. Purification of IL13-Cl-His After treatment with enterokinase, the cleaved GST is separated by a combination of ion exchange chromatography, gel filtration, and affinity chromatography. The IL-13-Cl-His protein is concentrated to a final protein concentration of 2 mg / ml.

Ｇ．連結反応のためのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質の調製
ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を連結するのに最適な条件を決定するため、タンパク質を、様々な濃度（０μＭ〜５００μＭ）の還元試薬（ＤＴＴまたはＴＣＥＰ）を用いた緩慢な還元条件下でプロセッシングされる。還元ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質を、誘導化したＶＬＰおよび線毛との効率的な連結に関して試験する。 G. Preparation of IL-13-Cl-His protein for ligation reaction To determine the optimal conditions for ligating IL-13-Cl-His protein, the protein was reduced at various concentrations (0 μM-500 μM). Processed under slow reducing conditions using (DTT or TCEP). Reduced IL-13-Cl-His protein is tested for efficient linkage with derivatized VLPs and pili.

Ｈ．ＩＬ−１３−Ｃｌ−ＨｉｓとＱβカプシドとの連結
１２０μＭのＱβカプシドを溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）などの異種２官能性架橋剤と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析した誘導体化Ｑβ反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と混合する。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化Ｑβカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。 H. Ligation of IL-13-Cl-His with Qβ capsid A solution of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) in 120 μM Qβ capsid was diluted from a stock solution in DMSO with a 25-fold molar excess of SMPH. React with a heterobifunctional cross-linking agent such as (Pierce) for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2. The dialyzed derivatized Qβ reaction mixture is then mixed with the prepared IL-13-Cl-His protein. In the ligation reaction, the IL-13-Cl-His protein is twice as many as the molar excess of the derivatized Qβ capsid. The ligation reaction is continued for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker. The ligated product is analyzed by SDS-PAGE and further analyzed by Western blot.

ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓとｆｒカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのｆｒカプシドを溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したｆｒカプシドタンパク質反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化ｆｒカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。 Ligation of IL-13-Cl-His and fr capsid protein A solution of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) dissolved in 120 μM fr capsid was diluted from a stock solution in DMSO with a 25-fold molar excess of SMPH. (Pierce) and react on a rocking shaker at 25 ° C. for 30 minutes. The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The dialyzed fr capsid protein reaction mixture is then reacted with the prepared IL-13-Cl-His protein. In the ligation reaction, the IL-13-Cl-His protein is twice as many as the molar excess of the derivatized fr capsid. The ligation reaction is continued for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker. The ligated product is analyzed by SDS-PAGE and further analyzed by Western blot.

ＩＬ−１３−Ｃｌ−ＨｉｓとＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドを溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ反応混合物を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドよりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。 Ligation of IL-13-Cl-His and HBcAg-Lys-2cyc-Mut A solution of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) in which 120 μM HBcAg-Lys-2cyc-Mut capsid was dissolved from a stock solution in DMSO. The diluted 25-fold molar excess of SMPH (Pierce) is reacted for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The dialyzed HBcAg-Lys-2cyc-Mut reaction mixture is then reacted with the prepared IL-13-Cl-His protein. In the ligation reaction, the IL-13-Cl-His protein is twice as many as the molar excess of the derivatized HBcAg-Lys-2cyc-Mut capsid. The ligation reaction is continued for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker. The ligated product is analyzed by SDS-PAGE and further analyzed by Western blot.

ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と線毛の結合
２０ｍＭＨｅｐｅｓに１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を加えた溶液（ｐＨ７．４）を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、室温のロッキングシェーカー上で６０分間反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）上で脱塩する。カラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、調製済みのＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質と反応させる。連結反応では、ＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓタンパク質が、誘導体化したＥ．ｃｏｌｉの１型線毛よりも２倍モル数が過剰である。連結反応を、ロッキングシェーカー上で２５℃で４時間続行する。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、さらにウェスタンブロット法で分析する。 Binding of IL-13-Cl-His protein to pili. 125 mM E. coli in 20 mM Hepes. The solution of E. coli type 1 pili (pH 7.4) is reacted with a 50-fold excess of the cross-linking agent SMPH diluted from a stock solution in DMSO for 60 minutes on a rocking shaker at room temperature. The reaction mixture is desalted on a PD-10 column (Amersham-Pharmacia Biotech). The protein-containing fraction eluted from the column is pooled and the desalted derivatized pilus protein is reacted with the prepared IL-13-Cl-His protein. In the ligation reaction, IL-13-Cl-His protein was derivatized E. coli. The molar number is twice as much as that of E. coli type 1 pili. The ligation reaction is continued for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker. The ligated product is analyzed by SDS-PAGE and further analyzed by Western blot.

Ｑβカプシドタンパク質に連結されたＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓによるマウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントを添加することなく、ＶＬＰに連結されたＩＬ−１３−Ｃｌ−Ｈｉｓをワクチン接種する。各サンプルの全タンパク質２５μｇをＰＢＳ中に希釈して２００ｕｌにし、第０日目と第１４日目に皮下注射する（両腹側部に１００μｌ）。第３１日目に、マウスを、眼窩後方から出血させ、その血清を、ＩＬ−１３特異的ＥＬＩＳＡを使用して分析する。 Immunization of mice with IL-13-Cl-His linked to Qβ capsid protein Female Balb / c mice are vaccinated with IL-13-Cl-His linked to VLP without addition of adjuvant . 25 μg of total protein for each sample is diluted to 200 ul in PBS and injected subcutaneously on days 0 and 14 (100 μl on both ventral sides). On day 31, the mice are bled from the retroorbital and the serum is analyzed using an IL-13 specific ELISA.

ｃｙｓ含有アミノ酸リンカー配列によるエオタキシンのクローニング、発現、精製、および連結
マウスエオタキシンを、そのＣ末端で融合しているアミノ酸リンカーＣ１により組換え発現させた。このリンカーは、ＶＬＰに連結するための１つのシステインを含有していた。 Cloning, expression, purification and ligation of eotaxin with a cys-containing amino acid linker sequence Mouse eotaxin was recombinantly expressed with the amino acid linker C1 fused at its C-terminus. This linker contained one cysteine for linking to the VLP.

ｐｍＥｏ−ＣｌおよびｐｍＨｉｓＥｏ−Ｃｌの構成体
アニールされたオリゴプライマーＭＣＳ−１ＦおよびプライマーＭＣＳ−１Ｒで当初の配列をＮｄｅＩ部位からＸｈｏＩ部位に置き換えることによって、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のＭＣＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）をＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＣに変えた（アニーリングは、１５ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８緩衝液で）。得られたプラスミドをｐＭｏｄ００とし、これはそのＭＣＳにＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を有するものであった。アニールされたＢａｍｈｉｓ６−ＥＫ−Ｎｈｅ−ＦとＢａｍｈｉｓ６−ＥＫＮｈｅ−Ｒのオリゴ対と、アニールされた１Ｆ−Ｃ−グリシン−リンカーと１Ｒ−Ｃ−グリシン−リンカーのオリゴ対を、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＭｏｄ００プラスミドに一緒にライゲートしてｐＭｏｄＥＣ１を得たが、これはＮ末端ヘキサヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位、および１つのシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸グリシンリンカーを有するものであった。以下のプライマーを使用して、すなわちｍエオタキシン−Ｆ、Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆ、およびｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒを使用して、マウスエオタキシンを、ＰＣＲによってＡＴＣＣクローン（ＡＴＣＣ番号３１４８３９４）から増幅した。ｍエオタキシン−Ｆは、内部ＮｄｅＩ部位を有し、Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆは、内部ＮｈｅＩ部位を有し、ｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒは内部ＸｈｏＩ部位を有していた。プライマー対ｍエオタキシン−Ｆとｍエオタキシン−Ｘｈｏ−ＲからのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＭｏｄＥＣ１にライゲートした。得られたプラスミドをｐｍＥｏ−Ｃ１としたが、これは、エオタキシンと、そのＣ末端にリンカーを含有するシステインとからなる融合タンパク質をコードするものである。プライマー対Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆとｍエオタキシン−Ｘｈｏ−ＲからのＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＭｏｄＥＣ１にライゲートした。得られたプラスミドをｐＨｉｓｍＥｏ−Ｃ１としたが、これは、Ｎ末端Ｈｉｓタグと、その後に続くエンテロキナーゼ切断部位、エオタキシン、およびシステインリンカーからなる融合タンパク質をコードするものである。 Construction of pmEo-Cl and pmHisEo-Cl By replacing the original sequence from the NdeI site to the XhoI site with annealed oligo primer MCS-1F and primer MCS-1R, the MCS (Novagen, Inc.) of pET22b (+). Was changed to GTTTAACTTTTAAGAAGGAGAATATACATGATCGCGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGGCGCCGCCATGCACC (annealing with 15 mM Tris HCl pH8 buffer). The resulting plasmid was designated pMod00, which had NdeI, BamHI, NheI, XhoI, PmeI, and NotI restriction sites in its MCS. An annealed Bamhis6-EK-Nhe-F and Bamhis6-EKNhe-R oligo pair, and an annealed 1F-C-glycine-linker and 1R-C-glycine-linker oligo pair were transformed into a BamHI-NotI digested pMod00 plasmid. Were ligated together to give pModEC1, which had an N-terminal hexahistidine tag, an enterokinase cleavage site, and a C-terminal amino acid glycine linker containing one cysteine residue. Mouse eotaxin was amplified from an ATCC clone (ATCC No. 3148394) by PCR using the following primers: m eotaxin-F, Nhe-m eotaxin-F, and m eotaxin-Xho-R. m eotaxin-F had an internal NdeI site, Nhe-m eotaxin-F had an internal NheI site, and m eotaxin-Xho-R had an internal XhoI site. PCR products from primer pair m eotaxin-F and m eotaxin-Xho-R were digested with NdeI and XhoI and ligated into pModEC1 digested with the same enzymes. The resulting plasmid was designated as pmEo-C1, which encodes a fusion protein consisting of eotaxin and a cysteine containing a linker at its C-terminus. PCR products from primer pair Nhe-m eotaxin-F and m eotaxin-Xho-R were digested with NheI and XhoI and ligated into pModEC1 digested with the same enzymes. The resulting plasmid was designated pHismEo-C1, which encodes a fusion protein consisting of an N-terminal His tag followed by an enterokinase cleavage site, eotaxin, and a cysteine linker.

ＰＣＲ反応では、各オリゴ１５ｐｍｏｌと鋳型ＤＮＡ１ｎｇを、５０μｌの反応混合物（２単位のＰＦＸポリメラーゼ、０．３ｍＭｄＮＴＰ、および２ｍＭＭｇＳＯ_４）中で使用した。温度サイクルは下記の通りであった：９４℃ ２分間、その後、９４℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、６８℃（３０秒）を３０サイクル、その後、６８℃ ２分間。その他すべての工程は、標準的な分子生物学的プロトコルによって実施した。
オリゴヌクレオチドの配列：
ｍエオタキシン−Ｆ：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ３’
Ｎｈｅ−ｍエオタキシン−Ｆ：５’ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣ３’
ｍエオタキシン−Ｘｈｏ−Ｒ：５’ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴ３’ For PCR reactions, 15 pmol of each oligo and 1 ng of template DNA were used in 50 μl of reaction mixture (2 units of PFX polymerase, 0.3 mM dNTP, and 2 mM MgSO ₄ ). The temperature cycle was as follows: 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. (30 seconds), 60 ° C. (30 seconds), 68 ° C. (30 seconds), then 68 ° C. for 2 minutes. All other steps were performed by standard molecular biological protocols.
Oligonucleotide sequence:
m Eotaxin-F: 5 ′ GGAATTCCATATGCACCCAGCTCTCCATCCCAAC3 ′
Nhe-m eotaxin-F: 5′CCTAGCTAGCGCACCCAGCTCTCCATCCCAAC3 ′
m Eotaxin-Xho-R: 5′CCCGCTCGAGTGGTTTTGGAGTTTGGAGTT3 ′

ｐｍＥｏ−Ｃｌの発現
コンピテントＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、プラスミドｐｍＥｏ−Ｃｌで形質転換した。アンピシリン（Ａｍｐ）含有寒天平板からの単一コロニーを液体培養（１５０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１００ｕｇ／ｍｌＡｍｐ、０．５％グルコースを含むＳＢ）で拡張し、３０℃で一晩、２２０ｒｐｍで振盪させながらインキュベートした。次いでＳＢ（１５０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１００ｕｇ／ｍｌＡｍｐ）１ｌに、一晩培養したものを１：５０ｖ／ｖ接種し、１５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃でＯＤ６００＝１．７になるまで増殖させた。１ｍＭＩＰＴＧで発現を誘導した。９時間誘導した後、６０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を収集した。細胞ペレットを、０．８ｍｇ／ｍｌのリゾチームを加えた溶解緩衝液（１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、３０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、および０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に懸濁し、超音波処理し、ベンゾナーゼで処理した。４８０００ＲＣＦで２０分間遠心分離した後、上清を１６％ＰＡＧＥゲル上で分離させ、マウスエオタキシンの発現を、ウェスタンブロット法で抗マウスエオタキシン抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）により確認した（図１２）。これは、予測される分子量８．８ＫＤで実験したときのエオタキシン−Ｃｌの発現を明らかに示していた。 Expression of pmEo-Cl Competent E. coli E. coli BL21 (DE3) cells were transformed with the plasmid pmEo-Cl. Single colonies from ampicillin (Amp) -containing agar plates were expanded in liquid culture (SB with 150 mM MOPS, pH 7.0, 100 ug / ml Amp, 0.5% glucose) and shaken at 30 ° C. overnight at 220 rpm. Incubated while allowing. Next, 1 liter of overnight cultured SB (150 mM MOPS, pH 7.0, 100 ug / ml Amp) 1 l is inoculated and grown at 30 ° C. until OD600 = 1.7 while shaking at 150 rpm. It was. Expression was induced with 1 mM IPTG. After induction for 9 hours, cells were collected by centrifugation at 6000 rpm for 5 minutes. The cell pellet was suspended in lysis buffer (10 mM Na ₂ HPO ₄ , 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, and 0.25% Tween-20) supplemented with 0.8 mg / ml lysozyme, sonicated, and with benzonase. Processed. After centrifugation at 48000 RCF for 20 minutes, the supernatant was separated on a 16% PAGE gel, and the expression of mouse eotaxin was confirmed by anti-mouse eotaxin antibody (R & D system) by Western blotting (FIG. 12). This clearly showed the expression of eotaxin-Cl when experimented with the expected molecular weight of 8.8 KD.

マウスエオタキシン−ＣｌとマウスＨｉｓ−エオタキシン−Ｃｌのタンパク質配列を、ｃＤＮＡ配列から翻訳した。
マウスエオタキシン−Ｃｌ：
ＭＨＰＧＳＩＰＴＳＣＣＦＩＭＴＳＫＫＩＰＮＴＬＬＫＳＹＫＲＩＴＮＮＲＣＴＬＫＡＩＶＦＫＴＲＬＧＫＥＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＡＴＫＨＬＤＱＫＬＱＴＰＫＰＬＲＧＧＧＧＧＣＧ
マウスＨｉｓ−エオタキシン−Ｃｌ：
ＭＤＰＨＨＨＨＨＨＧＳＧＤＤＤＤＫＡＬＡＨＰＧＳＩＰＴＳＣＣＦＩＭＴＳＫＫＩＰＮＴＬＬＫＳＹＫＲＩＴＮＮＲＣＴＬＫＡＩＶＦＫＴＲＬＧＫＥＩＣＡＤＰＫＫＫＷＶＱＤＡＴＫＨＬＤＱＫＬＱＴＰＫＰＬＲＧＧＧＧＧＣＧ The protein sequences of mouse eotaxin-Cl and mouse His-eotaxin-Cl were translated from the cDNA sequence.
Mouse eotaxin-Cl:
MHPGSIPTSCCFIMTSKIPNTLLKSSYKRITNRNRCTLKAIVFKTRLGKEICADPKKKKVVQDATKHLDQKLQTPKPLRGGGGGCG
Mouse His-eotaxin-Cl:
MDPHHHHHHGSGDDDDKALAHPGSIPPTSCCFIMTSKIPNTLLKSYKRITNRNRCTLKAIVFKTRLGKEICADPKKKWVQDATKHLDQKLQTPKPLRGGGGGCG

マウスエオタキシン−ＣｌとＱβカプシドタンパク質の連結
６ｍｇ／ｍｌのＱβカプシドタンパク質を、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした１．４８ｍｌの溶液を、２５℃で、ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）（ＤＭＳＯに溶解した１００ｍＭ保存溶液から）１４．８μｌと６０分間反応させる。その後、この反応溶液を、２ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して４℃で３時間にわたり、２回透析する。３．６ｍｇ／ｍｌのマウスエオタキシン−Ｃｌタンパク質を２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２に溶かした１．３ｍｌの溶液を、２５℃で、ＴＣＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｈ_２Ｏに溶解した３６ｍＭ保存溶液から）９．６μｌと１時間反応させる。次いで誘導化し透析されたＱβ １３０μｌを、還元エオタキシン−Ｃｌ１２９μｌを２４１μｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶かしたものと、２５℃で一晩反応させる。抗Ｑβおよび抗エオタキシン抗体によるウェスタンブロット分析は、エオタキシンとＱβとが共有結合したことを示している。 Coupling of mouse eotaxin-Cl and Qβ capsid protein 1.48 ml of a solution of 6 mg / ml Qβ capsid protein dissolved in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) at 25 ° C. at SMPH (Pierce) (DMSO React with 14.8 μl (from a dissolved 100 mM stock solution) for 60 minutes. The reaction solution is then dialyzed twice for 2 hours at 4 ° C. against 2 l of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0. A 1.3 ml solution of 3.6 mg / ml mouse eotaxin-Cl protein dissolved in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2 was added at 25 ° C. from a TCEP (Pierce) (36 mM stock solution dissolved in H ₂ O). ) React with 9.6 μl for 1 hour. 130 μl of derivatized and dialyzed Qβ is then reacted overnight at 25 ° C. with 129 μl of reduced eotaxin-Cl dissolved in 241 μl of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0. Western blot analysis with anti-Qβ and anti-eotaxin antibodies shows that eotaxin and Qβ were covalently bound.

Ｂ．Ｑβカプシドタンパク質に連結したマウスエオタキシン−Ｃｌによるマウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウスに、アジュバントを添加することなく、Ｑβカプシドタンパク質に連結したマウスエオタキシン−Ｃｌをワクチン接種する。各サンプルのすべてのタンパク質２５μｇをＰＢＳに希釈して２００ｕｌとし、第０日目と第１４日目に皮下注射する（両腹側部に１００μｌ）。第３１日目にマウスの眼窩後方から出血させ、その血清を、エオタキシン特異的ＥＬＩＳＡを使用して分析する。 B. Immunization of mice with mouse eotaxin-Cl linked to Qβ capsid protein Female Balb / c mice are vaccinated with mouse eotaxin-Cl linked to Qβ capsid protein without the addition of adjuvant. All proteins of 25 μg of each sample are diluted in PBS to 200 ul and injected subcutaneously on days 0 and 14 (100 μl on both ventral sides). On day 31 the mice are bled from the retroorbital and their serum is analyzed using an eotaxin-specific ELISA.

Ｃ．ＥＬＩＳＡ
ＥｌＩＳＡプレートを、濃度５μｇ／ｍｌでマウスエオタキシン−Ｃｌで被覆する。このプレートをブロックし、次いで連続希釈したマウス血清と共にインキュベートする。結合した抗体を、酵素標識した抗マウスＩｇＧ抗体で検出する。対照として、同じマウスからの免疫前血清も試験する。 C. ELISA
ElISA plates are coated with mouse eotaxin-Cl at a concentration of 5 μg / ml. The plate is blocked and then incubated with serially diluted mouse serum. Bound antibody is detected with enzyme-labeled anti-mouse IgG antibody. As a control, preimmune serum from the same mouse is also tested.

ＶＬＰおよび線毛に連結するためのシステイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたインターロイキン５（ＩＬ−５）のクローニングおよび発現
Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ中の封入体として発現させるためのＩＬ−５のクローニング
以下の２つのプライマー、すなわちＳｐｅｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ１（配列番号３４０）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒ（配列番号３４２）を使用したＰＣＲによって、ＡＴＣＣクローン（ｐｍＩＬ５−４Ｇ；ＡＴＣＣ番号：３７５６２）からＩＬ−５を増幅した。このＰＣＲ産物を、プライマーＳｐｅＮｌｉｎｋｅｒ３−Ｆ２（配列番号３４１）およびＩｌ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒによる第２のＰＣＲ用鋳型として使用した。挿入物を、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。この挿入物を、事前にＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化した（脱リン酸化していない）ｐＥＴベクター誘導体（ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクター）にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に形質転換した。ｐＭＯＤＥＣ３−８ベクターへのクローニングによって生成されたＩＬ５構成体は、そのＮ末端にヘキサヒスチジンタグを含有し、その後にエンテロキナーゼ部位、システイン残基を含有するＮ末端γ３アミノ酸リンカーが続き、そのＣ末端側には配列ＡＳが隣接し、Ｎ末端側には配列ＡＬＶが隣接し、成熟形態のＩＬ５遺伝子となる。エンテロキナーゼを用いた切断によって遊離したタンパク質を、「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｅ」（配列番号３３２）と呼ぶ。得られたクローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５．２（ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５とも呼ぶ）のプラスミドＤＮＡは、その配列がＤＮＡ配列決定によって確認されたものであり、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１に形質転換した。 Cloning and expression of interleukin 5 (IL-5) with an N-terminal amino acid linker containing a cysteine residue for linking to VLP and pili. E. Cloning of IL-5 for expression as inclusion bodies in E. coli The ATCC clone (pmIL5- IL-5 was amplified from 4G; ATCC number: 37562). This PCR product was used as a second template for PCR with primers SpeNlinker3-F2 (SEQ ID NO: 341) and Il5StopXho-R. The insert was digested with SpeI and NotI. This insert was ligated to a pET vector derivative (pMODEC3-8 vector) previously digested with NheI and NotI (not dephosphorylated) (pMODEC3-8 vector). E. coli TG1 cells were transformed. The IL5 construct generated by cloning into the pMODEC3-8 vector contains a hexahistidine tag at its N-terminus, followed by an N-terminal γ3 amino acid linker containing an enterokinase site, a cysteine residue, and its C-terminus. The sequence AS is adjacent to the side and the sequence ALV is adjacent to the N-terminal side, resulting in the mature form of the IL5 gene. The protein released by cleavage with enterokinase is referred to as “mouse C-IL-5-E” (SEQ ID NO: 332). The resulting plasmid DNA of the clone pMODC6-IL5.2 (also referred to as pMODC6-IL5) has been confirmed by DNA sequencing. E. coli strain BL21 was transformed.

クローンｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５／ＢＬ２１を、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する５ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養物２ｍｌを、１ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌの富栄養培地（ＴＢ）で希釈した。培養は、培養によって光学密度がＯＤ６００＝０．７に達したときに、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１Ｍ溶液０．１ｍｌを添加することによって誘導した。２時間ごとに、サンプル１０ｍｌを採取した。これらのサンプルを、４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００（ｐＨ８）を含有する０．５ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。リゾチーム（４０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを添加してチューブを４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２分間超音波処理した。５０ｍＭＭｇＣｌ_２溶液１００μｌとベンゾナーゼ１ｍｌを添加した。次いで細胞を、室温で３０分間インキュベートし、１３０００×ｇで１５分間遠心分離した。 Clone pMODC6-IL5 / BL21 was grown overnight in 5 ml LB containing 1 mg / L ampicillin. 2 ml of this culture was diluted with 100 ml rich medium (TB) containing 1 mg / L ampicillin. The culture was induced by adding 0.1 ml of a 1M solution of isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) when the optical density reached OD600 = 0.7 by the culture. A sample of 10 ml was taken every 2 hours. These samples were centrifuged at 4000 × g for 10 minutes. The pellet was resuspended in 0.5 ml lysis buffer containing 50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, 0.1% Triton X-100 (pH 8). After adding 20 μl of lysozyme (40 mg / ml) and incubating the tube for 30 minutes at 4 ° C., the cells were sonicated for 2 minutes. 100 μl of 50 mM MgCl ₂ solution and 1 ml of benzonase were added. The cells were then incubated for 30 minutes at room temperature and centrifuged at 13000 × g for 15 minutes.

上清を捨て、ペレットを、ＳＤＳ導入緩衝液１００μｌ中、９８℃で５分間沸騰させた。導入緩衝液中のサンプル１０μｌを、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１７Ａ）。図１７Ａのゲルは、ＩＬ−５構成体の発現を明確に示している。図１７Ａのゲルに導入されたサンプルは、下記の通りであった。
レーンＭ：マーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ着色マーカー）
レーン１：誘導前の１ｍｌ培養の細胞抽出物
レーン２：誘導後４時間の１ｍｌ培養の細胞抽出物 The supernatant was discarded and the pellet was boiled at 98 ° C. for 5 minutes in 100 μl of SDS transfer buffer. A 10 μl sample in the transfer buffer was analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions (FIG. 17A). The gel of FIG. 17A clearly shows the expression of the IL-5 construct. Samples introduced into the gel of FIG. 17A were as follows.
Lane M: Marker (NEB, broad range colored marker)
Lane 1: Cell extract of 1 ml culture before induction Lane 2: Cell extract of 1 ml culture 4 hours after induction

Ｂ．哺乳動物細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ）中で発現させるためのＩＬ−５のクローニング
ａ）ＩＬ−５は、そのＮ末端でシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーに融合し、そのＣ末端でＦｃ断片に融合する。
（Ａ）（ＡＴＣＣクローン３７５６２）で述べた鋳型を、以下の構成体のクローニングに使用した。プラスミドｐＭＯＤＢ１−ＩＬ５（ｐＥＴ誘導体）をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化して、システインを含有するＮ末端アミノ酸リンカーに融合したＩＬ５をコードする小断片を得た。この断片を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで事前に消化されたベクターｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ^＊（ΔＸｈｏ）にライゲートした。ライゲーションをＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１に電気穿孔し、得られたクローンｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ５−Ｆｃ．２のプラスミドＤＮＡであって、その配列がＤＮＡ配列決定によって確認されたものを使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を形質移入した。このプラスミドによってコードされた、得られたＩＬ−５構成体は、ＩＬ−５成熟配列のＮ末端に融合したアミノ酸配列ＡＤＰＧＣＧＧＧＧＧＬＡを有していた。この配列は、システインを含有するアミノ酸リンカー配列ＧＣＧＧＧＧＧを含み、これはクローニング手順中に導入された追加のアミノ酸に隣接している。第Ｘａ因子による融合タンパク質の切断によって遊離したＩＬ−５タンパク質を、以下「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｆ」（配列番号３３３）と呼ぶ。 B. Cloning of IL-5 for expression in mammalian cells (HEK-293T) a) IL-5 is fused to an amino acid linker containing a cysteine residue at its N-terminus and to an Fc fragment at its C-terminus To do.
(A) The template described in (ATCC clone 37562) was used for cloning the following constructs. Plasmid pMODB1-IL5 (pET derivative) was digested with BamHI / XhoI to obtain a small fragment encoding IL5 fused to an N-terminal amino acid linker containing cysteine. This fragment was ligated into the vector pCEP-SP-XA-Fc ^* (ΔXho) previously digested with BamHI and XhoI. Ligation E. coli strain TG1 and the resulting clone pCEP-SP-IL5-Fc. Two plasmid DNAs, the sequences of which were confirmed by DNA sequencing, were used to transfect HEK-293T cells. The resulting IL-5 construct encoded by this plasmid had the amino acid sequence ADPGCGGGGGLA fused to the N-terminus of the IL-5 mature sequence. This sequence includes an amino acid linker sequence GCGGGGGG containing a cysteine, which is adjacent to additional amino acids introduced during the cloning procedure. The IL-5 protein released by cleavage of the fusion protein with factor Xa is hereinafter referred to as “mouse C-IL-5-F” (SEQ ID NO: 333).

ピューロマイシンに形質移入し選択した後、培養上清を、抗Ｈｉｓ（マウス）および抗マウスＩｇＧ抗体であってホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したものを使用して、ウェスタンブロットによって分析した（図１７Ｂ）。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧ抗体も、Ｆｃ融合タンパク質を検出する。タンパク質の精製は、プロテインＡ樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。図１７Ｂの結果は、ＩＬ−５構成体の発現を明瞭に示している。 After transfection and selection of puromycin, culture supernatants were analyzed by Western blot using anti-His (mouse) and anti-mouse IgG antibodies conjugated to horseradish peroxidase (FIG. 17B). Anti-mouse IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase also detects Fc fusion protein. Protein purification was performed by affinity chromatography on protein A resin. The results in FIG. 17B clearly show the expression of the IL-5 construct.

図１７Ｂのウェスタンブロットに導入されたサンプルは、下記の通りであった。レーン１：ＩＬ５−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元条件下で行った。レーン２：ＩＬ１３−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元条件下で行った。レーン３：ＩＬ５−Ｆｃを発現するＨＥＫ培養の上清（２０μｌ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元条件下で行った。 Samples introduced into the Western blot of FIG. 17B were as follows. Lane 1: supernatant of HEK culture expressing IL5-Fc (20 μl). SDS-PAGE was performed under reducing conditions. Lane 2: supernatant of HEK culture expressing IL13-Fc (20 μl). SDS-PAGE was performed under non-reducing conditions. Lane 3: supernatant of HEK culture expressing IL5-Fc (20 μl). SDS-PAGE was performed under non-reducing conditions.

Ｂ．ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）でクローニングされたＩＬ−５と、そのＮ末端で融合しているシステイン残基を含有するアミノ酸リンカー
ＩＬ−５（ＡＴＣＣ３７５６２）を、プライマーＮｈｅ−ｌｉｎｋ１−ＩＬ１３−ＦおよびＩＬ５ＳｔｏｐＸｈｏ−Ｒで増幅した。ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化した後、挿入物を、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで事前に消化されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＥＫにライゲートした。得られたプラスミドｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ５を配列決定し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに使用した。このプラスミドによってコードされた、得られたＩＬ−５構成体は、ＩＬ−５成熟配列のＮ末端で融合しているアミノ酸配列ＬＡＣＧＧＧＧＧを有していた。この配列は、システイン残基を含有するアミノ酸リンカー配列ＡＣＧＧＧＧＧを含み、これはクローニング手順中に導入された追加のアミノ酸に隣接している。エンテロキナーゼを用いた切断によって遊離したタンパク質を、以下「マウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ」（配列番号３３４）と呼ぶ。得られたタンパク質の精製は、グルタチオンアフィニティー樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーによって行った。 B. IL-5 cloned with GST (glutathione S transferase) and an amino acid linker IL-5 (ATCC 37562) containing a cysteine residue fused at its N-terminus were combined with primers Nhe-link1-IL13-F and IL5StopXho- Amplified with R. After digestion with NheI and XhoI, the insert was ligated into pCEP-SP-GST-EK previously digested with NheI and XhoI. The resulting plasmid pCEP-SP-GST-IL5 was sequenced and used for transfection of HEK-293T cells. The resulting IL-5 construct encoded by this plasmid had the amino acid sequence LACGGGGG fused at the N-terminus of the IL-5 mature sequence. This sequence contains the amino acid linker sequence ACGGGGGG containing a cysteine residue, which is adjacent to additional amino acids introduced during the cloning procedure. The protein released by cleavage with enterokinase is hereinafter referred to as “mouse C-IL-5-S” (SEQ ID NO: 334). The resulting protein was purified by affinity chromatography on glutathione affinity resin.

Ｃ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−ＳとＱβカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのＱβカプシドタンパク質を、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したＱβ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭＱβカプシドタンパク質、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。 C. Ligation of mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S and Qβ capsid protein A solution of 120 μM Qβ capsid protein in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) was stored in DMSO. React with 25-fold molar excess of SMPH (Pierce) diluted from solution for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice for 2 hours at 4 ° C. against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2. The dialyzed Qβ reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S solution on a rocking shaker at 25 ° C. for 4 hours (final concentration: 60 μM Qβ capsid protein, 60 μM mouse). C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｄ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓとｆｒカプシドタンパク質の連結
１２０μＭのｆｒカプシドタンパク質を、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したｆｒ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭｆｒカプシドタンパク質、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。 D. Ligation of mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S with fr capsid protein A solution of 120 μM fr capsid protein in 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) was stored in DMSO. React with 25-fold molar excess of SMPH (Pierce) diluted from solution for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice for 2 hours at 4 ° C. against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2. The dialyzed fr reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S solution on a rocking shaker at 25 ° C. for 4 hours (final concentration: 60 μM fr capsid protein, 60 μM mouse). C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｅ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液とＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔカプシドを、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と３０分間、２５℃でロッキングシェーカー上で反応させる。その後、この反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して４℃で２時間にわたり、２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｃ−Ｍｕｔ、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。 E. Ligation of mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S solution and HBcAg-Lys-2cyc-Mut 120 μM HBcAg-Lys-2cyc-Mut capsid was added to 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The solution dissolved in is reacted with a 25-fold excess of SMPH (Pierce) diluted from a stock solution in DMSO for 30 minutes at 25 ° C. on a rocking shaker. The reaction solution is then dialyzed twice for 2 hours at 4 ° C. against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2. The dialyzed HBcAg-Lys-2cyc-Mut reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S solution on a rocking shaker at 25 ° C. for 4 hours (final concentration: 60 μM). HBcAg-Lys-2cyc-Mut, 60 μM mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｆ．マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓと線毛の連結
１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４に溶かした溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと６０分間、室温でロッキングシェーカー上で反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、マウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ溶液と、２５℃のロッキングシェーカー上で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ線毛、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−５−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−５−Ｓ）。連結生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。 F. Ligation of mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S and pili 125 μM E. coli A solution of E. coli type 1 pili in 20 mM Hepes, pH 7.4 is reacted with a 50-fold excess of the cross-linking agent SMPH diluted from a stock solution in DMSO for 60 minutes on a rocking shaker at room temperature. The reaction mixture is desalted with a PD-10 column (Amersham-Pharmacia Biotech). The protein-containing fractions eluted from this column were pooled and the desalted derivatized pilus protein was transferred to the mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S solution on a rocking shaker at 25 ° C. Allow time reaction (final concentration: 60 μM pili, 60 μM mouse C-IL-5-F or mouse C-IL-5-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

ＶＬＰおよび線毛に対するＩＬ−１３のクローニング、発現、および精製
Ａ．ＶＬＰおよび線毛と連結するためのシステイン残基を含有するＮ末端アミノ酸リンカーを備えたインターロイキン（ＩＬ−１３）のクローニングおよび発現
ａ）Ｆｃ融合タンパク質として哺乳動物細胞中で発現させるためのマウスＩＬ−１３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のクローニング
ＩＬ−１３のクローニング用ＤＮＡを、ｉｎｖｉｔｒｏ活性化脾細胞からＲＴ−ＰＣＲにより単離したが、この細胞は、以下のようにして得られた。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞をマウス脾臓細胞から単離し、事前に抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で被覆された６ウェルプレートのＩＭＤＭ（＋５％ＦＣＳ＋１０ｎｇ／ｍｌＩＬ４）中で３日間インキュベートしたものである。これらの細胞からのＲＮＡを使用して、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ（ＱｉａｇｅｎワンステップＰＣＲキット）によりＩＬ１３を増幅した。プライマーＸｈｏＩＬ１３−ＲはＲＮＡの逆転写に使用し、プライマーＮｈｅＩＬ１３−Ｆ（配列番号３３８）およびＸｈｏＩＬ１３−Ｒ（配列番号３３９）はＩＬ１３ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用した。増幅したＩＬ１３ｃＤＮＡを、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を使用してｐＭＯＤベクターにライゲートした（ベクターｐＭＯＤＢ１−ＩＬ１３を得る）。ｐＭＯＤＢ１−Ｉｌ１３は、消化されたＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩであり、ＩＬ１３を含有する断片を、事前にＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ^＊（Δｘｈｏ）ベクターに、すなわちＦｃ配列の終わりのＸｈｏＩ部位が除去されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＸＡ−Ｆｃ^＊の類似体にライゲートした。このライゲーションから得られたプラスミド（ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ１３−Ｆｃ）を配列決定し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに使用した。このプラスミドでコードされた、得られたＩＬ１３構成体は、ＩＬ１３成熟配列のＮ末端で融合しているアミノ酸配列ＡＤＰＧＣＧＧＧＧＧＬＡを有していた。この配列は、クローニング手順中に導入された追加のアミノ酸が隣接しているアミノ酸リンカー配列ＧＣＧＧＧＧＧを含む。ＩＬ１３−Ｆｃは、ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＩＬ１３−Ｆｃが形質移入された細胞の上清から、プロテインＡ樹脂で精製することができる。発現の結果を図１７Ｂに示す（サンプルの詳細については実施例１０参照）。そのＮ末端で前述のアミノ酸配列に融合している成熟ＩＬ−１３は、第Ｘａ因子による融合タンパク質の切断によって遊離し、その結果、以下「マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ」と呼ばれかつ配列番号３２８を有するタンパク質が得られる。図１７Ｂの結果は、ＩＬ−１３構成体の発現を明確に示している。 Cloning, expression, and purification of IL-13 on VLPs and pili. Cloning and expression of interleukin (IL-13) with an N-terminal amino acid linker containing a cysteine residue for linking to VLP and pili a) Mouse IL for expression in mammalian cells as Fc fusion protein Cloning of -13 (HEK-293T) DNA for cloning of IL-13 was isolated from in vitro activated splenocytes by RT-PCR. The cells were obtained as follows. That is, CD4 + T cells were isolated from mouse spleen cells and incubated for 3 days in IMDM (+ 5% FCS + 10 ng / ml IL4) in a 6-well plate previously coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Using RNA from these cells, IL13 was amplified by one-step RT-PCR (Qiagen one-step PCR kit). Primer XhoIL13-R was used for reverse transcription of RNA, and primers NheIL13-F (SEQ ID NO: 338) and XhoIL13-R (SEQ ID NO: 339) were used for PCR amplification of IL13 cDNA. The amplified IL13 cDNA was ligated into the pMOD vector using NheI / XhoI restriction sites (obtaining the vector pMODB1-IL13). pMODB1-Il13 is a digested BamHI / XhoI, and the fragment containing IL13 is transferred to the pCEP-SP-XA-Fc ^* (Δxho) vector previously digested with BamHI / XhoI, ie XhoI at the end of the Fc sequence. Ligated to an analog of pCEP-SP-XA-Fc ^{* with} the site removed. The plasmid obtained from this ligation (pCEP-SP-IL13-Fc) was sequenced and used for transfection of HEK-293T cells. The resulting IL13 construct encoded by this plasmid had the amino acid sequence ADPGCGGGGGLA fused at the N-terminus of the IL13 mature sequence. This sequence contains the amino acid linker sequence GCGGGGGG, flanked by additional amino acids introduced during the cloning procedure. IL13-Fc can be purified with protein A resin from the supernatant of cells transfected with pCEP-SP-IL13-Fc. The expression results are shown in FIG. 17B (see Example 10 for sample details). Mature IL-13 fused at its N-terminus to the amino acid sequence described above is liberated by cleavage of the fusion protein by factor Xa, resulting in what is hereinafter referred to as “mouse C-IL-13-F” and the sequence A protein having the number 328 is obtained. The results in FIG. 17B clearly show the expression of the IL-13 construct.

ｂ）そのＮ末端で融合しているＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）を備えた、哺乳動物細胞中で発現させるためのマウスＩＬ−１３（ＨＥＫ−２９３Ｔ）のクローニング
Ｎ末端ＧＳＴを持つＩＬ−１３のクローニングに使用されるｃＤＮＡは、上記（ａ）のＴＨ２活性化Ｔ細胞のｃＤＮＡ由来のものである。ＩＬ−１３は、プライマーＮｈｅｌｉｎｋ１ＩＬ１３−ＦおよびＩＬ１３ＳｔｏｐＸｈｏＮｏｔ−Ｒを使用して、このｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、事前にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＥＫベクターにライゲートした。ライゲーション（ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ１３）から単離可能なプラスミドを使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を形質移入した。このプラスミドでコードされた、得られたＩＬ１３構成体は、ＩＬ−１３成熟配列のＮ末端に融合したアミノ酸配列ＬＡＣＧＧＧＧＧを有していた。この配列は、クローニング手順中に導入された追加のアミノ酸が隣接しているアミノ酸リンカー配列ＡＣＧＧＧＧＧを含む。ｐＣＥＰ−ＳＰ−ＧＳＴ−ＩＬ１３が形質移入された細胞の培養上清は、融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＬ１３を含有しており、これは、標準のプロトコルに従ってグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。そのＮ末端で前述のアミノ酸配列に融合する成熟ＩＬ−１３は、エンテロキナーゼによる融合タンパク質の切断によって遊離し、その結果、以下「マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ」と呼ばれかつ配列番号３２９の配列を有するタンパク質が得られる。 b) Cloning of mouse IL-13 (HEK-293T) for expression in mammalian cells with GST (glutathione S transferase) fused at its N-terminus Cloning of IL-13 with N-terminal GST The cDNA used in the above is derived from the cDNA of TH2-activated T cells of (a) above. IL-13 was amplified from this cDNA using primers Nhellink1IL13-F and IL13StopXhoNot-R. The PCR product was digested with NheI and XhoI and ligated into the pCEP-SP-GST-EK vector previously digested with NheI / XhoI. HEK-293T cells were transfected using a plasmid that can be isolated from ligation (pCEP-SP-GST-IL13). The resulting IL13 construct encoded by this plasmid had the amino acid sequence LACGGGGG fused to the N-terminus of the IL-13 mature sequence. This sequence contains the amino acid linker sequence ACGGGGGG flanked by additional amino acids introduced during the cloning procedure. The culture supernatant of cells transfected with pCEP-SP-GST-IL13 contains the fusion protein GST-IL13, which can be purified by glutathione affinity chromatography according to standard protocols. Mature IL-13 fused to the amino acid sequence described above at its N-terminus is released by cleavage of the fusion protein with enterokinase, and as a result is hereinafter referred to as “mouse C-IL-13-S” and of SEQ ID NO: 329. A protein having the sequence is obtained.

Ｂ．マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＳとＱβカプシドタンパク質との連結
１２０μＭのＱβカプシドを溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＱβ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭＱβカプシドタンパク質、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 B. Ligation of mouse C-IL-13-F, mouse C-IL-13-S and Qβ capsid protein A solution of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) in which 120 μM Qβ capsid was dissolved was stored in DMSO. The mixture is reacted for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. with a 25-fold excess of SMPH (Pierce) diluted from The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The dialyzed Qβ reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker (final concentration: 60 μM Qβ capsid protein, 60 μM mouse C -IL-13-F or mouse C-IL-13-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｃ．マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｆ、マウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓとｆｒカプシドタンパク質との連結
１２０μＭのｆｒカプシドタンパク質を溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したｆｒ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭｆｒカプシドタンパク質、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 C. Ligation of mouse C-IL-13-F, mouse C-IL-13-S and fr capsid protein A solution of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2) dissolved in 120 μM fr capsid protein was stored in DMSO. A 25-fold molar excess of SMPH (Pierce) diluted from the solution is reacted for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The dialyzed fr reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker (final concentration: 60 μM fr capsid protein, 60 μM mouse C -IL-13-F or mouse C-IL-13-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｄ．マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液とＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔとの連結
１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔカプシドを溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した２５倍モル数が過剰なＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）と、２５℃のロッキングシェーカー上で３０分間反応させる。その後、反応溶液を、１Ｌの２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して２時間にわたり４℃で２回透析する。次いで透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ反応混合物を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 D. Ligation of mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution with HBcAg-Lys-2cys-Mut 20 mM Hepes dissolved in 120 μM HBcAg-Lys-2cys-Mut capsid, 150 mM NaCl (pH 7. The solution of 2) is reacted with a 25-fold molar excess of SMPH (Pierce) diluted from a stock solution in DMSO for 30 minutes on a rocking shaker at 25 ° C. The reaction solution is then dialyzed twice at 4 ° C. for 2 hours against 1 L of 20 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7.2). The dialyzed HBcAg-Lys-2cys-Mut reaction mixture is then reacted with mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution for 4 hours at 25 ° C. on a rocking shaker (final concentration: 60 μM HBcAg -Lys-2cys-Mut, 60 [mu] M mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

Ｅ．マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と線毛の連結
１２５μＭのＥ．ｃｏｌｉの１型線毛を溶かした２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４の溶液を、ＤＭＳＯ中の保存溶液から希釈した５０倍モル数が過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、室温のロッキングシェーカー上で６０分間反応させる。反応混合物を、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）で脱塩する。このカラムから溶出したタンパク質含有画分を溜め、脱塩した誘導体化線毛タンパク質を、マウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ溶液と、ロッキングシェーカー上２５℃で４時間反応させる（最終濃度：６０μＭ線毛、６０μＭマウスＣ−ＩＬ−１３−ＦまたはマウスＣ−ＩＬ−１３−Ｓ）。連結生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 E. Ligation of mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution and pili 125 μM E. coli A solution of 20 mM Hepes, pH 7.4, in which E. coli type 1 pili is dissolved is reacted with a 50-fold molar excess of the cross-linking agent SMPH diluted from a stock solution in DMSO for 60 minutes on a rocking shaker at room temperature. The reaction mixture is desalted with a PD-10 column (Amersham-Pharmacia Biotech). The protein-containing fraction eluted from this column was pooled, and the derivatized pilus protein desalted was mixed with mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S solution at 25 ° C. for 4 hours on a rocking shaker. React (final concentration: 60 μM pili, 60 μM mouse C-IL-13-F or mouse C-IL-13-S). The ligation product is analyzed by SDS-PAGE.

明確な理解のため、例としていくらか詳細に本発明について十分に述べてきたが、当業者なら、本発明またはその任意の特定の実施形態に影響を及ぼすことなく、条件、配合物、およびその他のパラメータの広くかつ均等な範囲内で本発明を修正しまたは変更を加えることによって同様の事項を実施することができ、またそのような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが、明らかであろう。 Although the present invention has been fully described in some detail for purposes of clarity of understanding, those skilled in the art will recognize conditions, formulations, and other details without affecting the invention or any particular embodiment thereof. Similar matters may be practiced by modifying or modifying the present invention within the broad and equivalent range of parameters, and such modifications or changes are encompassed within the scope of the appended claims. It will be clear.

本明細書で述べたすべての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものであり、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれが参照により援用されるよう具体的にかつ個々に示されるかのように同様の程度まで参照により本明細書に援用する。 All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are indicative of the level of ordinary skill in the art to which this invention pertains, and each individual publication, patent, or patent application is incorporated by reference. To the same extent as if specifically and individually indicated to be incorporated herein by reference.

マウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の発現を示す図である。ＩＰＴＧと共にまたは無しで、ｐＭＯＤＣ６−ＩＬ５／ＢＬ２１−ＤＥ３を培養した後に得られた不溶性細胞画分からの抽出物を、上述のように調製した。等量の抽出物を、１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に導入し、電気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。レーンＭはサイズマーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ、染色前マーカー）、レーン１は非誘発（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ）培養からの抽出物、レーン２は、ＩＰＴＧで４時間誘発させた（ｉｎｄｕｃｅｄ）培養からの抽出物。It is a figure which shows the expression of mouse | mouth His-C-IL5. Extracts from the insoluble cell fraction obtained after culturing pMODC6-IL5 / BL21-DE3 with or without IPTG were prepared as described above. An equal volume of the extract was introduced onto a 16% SDS polyacrylamide gel, electrophoresed and stained with Coomassie blue. Lane M is a size marker (NEB, broad range, pre-staining marker), lane 1 is an extract from an uncultured culture, lane 2 is an extract from a culture induced with IPTG for 4 hours. Ｎｉ−ＮＴＡによるＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。様々な段階の精製から得られたサンプルを１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、還元条件下で実行した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。Ｍ：マーカー、１：可溶性封入体、２：フロースルー（非結合物質）、３：洗浄１ｐＨ６．５、４：洗浄２ｐＨ６．５、５：洗浄３ｐＨ５．９、６〜８：溶出液ｐＨ４．５、９：純粋な組換えマウスＩＬ−５。It is a figure which shows the SDS-PAGE analysis of His-C-IL-5 refinement | purification by Ni-NTA. Samples from various stages of purification were subjected to 16% SDS-PAGE and run under reducing conditions. The protein was stained with Coomassie blue. M: marker, 1: soluble inclusion body, 2: flow-through (non-binding substance), 3: wash 1 pH 6.5, 4: wash 2 pH 6.5, 5: wash 3 pH 5.9, 6-8: eluate pH 4.5, 9: pure recombinant mouse IL-5. 組換えマウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。一定分量５μｇの精製済みマウスＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を、ジチオスレイトールの存在下（左から第２レーン目）、または存在しない状態で（左から第３レーン目）、１６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に分離した。ゲルを、タンパク質に関してクーマシーブルーＲ−２５０で染色した。レーンＭはサイズマーカー（ＮＥＢ、ブロードレンジ、染色前マーカー）を含む。It is SDS-PAGE which shows purification of recombinant mouse His-C-IL5. An aliquot of 5 μg of purified mouse His-C-IL5 was run on a 16% SDS polyacrylamide gel in the presence of dithiothreitol (left to second lane) or in the absence (left to third lane). Separated. The gel was stained with Coomassie Blue R-250 for protein. Lane M contains size markers (NEB, broad range, pre-staining markers). Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５がＢＣＬ１細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。下記の物質の存在下、すなわちマウスＩＬ−５（３０ｎｇ／ｍｌ）Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５（３０ｎｇ／ｍｌ）；Ｑβ（２００ｎｇ／ｍｌ）；Ｑβ−無関係のサイトカインと化学的に架橋したもの（２００ｎｇ／ｍｌ）またはＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５（１０５ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＢＣＬ１細胞を^３Ｈ−チミジンと共にインキュベートした。希釈していない出発濃度を括弧内に示し、この示される出発濃度から５倍に連続希釈した。^３Ｈ−チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウントによって決定した。It is a figure which shows the influence which His-C-IL-5 has on the proliferation of BCL1 cell. In the presence of the following substances: mouse IL-5 (30 ng / ml) His-C-IL5 (30 ng / ml); Qβ (200 ng / ml); ml) or Qβ-His-C-IL5 (105 ng / ml), BCL1 cells were incubated with ³ H-thymidine. The undiluted starting concentration is shown in parentheses and serially diluted 5-fold from the indicated starting concentration. ³ H-thymidine incorporation was determined by liquid scintillation counting. クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる連結反応の分析を示す図である。レーンＭ：染色前分子量マーカー、レーン１：精製済みＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５、レーン２：化学架橋剤ＳＭＰＨで誘導化した後のＱβ、レーン３：連結反応、レーン４：透析後の連結反応。連結反応における種々の分子種の名称を図の右側に示す。It is a figure which shows the analysis of the ligation reaction by SDS-PAGE dye | stained with Coomassie blue. Lane M: molecular weight marker before staining, lane 1: purified His-C-IL-5, lane 2: Qβ after derivatization with chemical cross-linking agent SMPH, lane 3: ligation, lane 4: ligation after dialysis . The names of the various molecular species in the ligation reaction are shown on the right side of the figure. ウェスタンブロット法による連結反応の分析を示す図である。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：精製済みＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５、レーン２：化学架橋剤ＳＭＰＨによって誘導化した後のＱβ、レーン３：連結反応。Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５を検出するための一次抗体は、後にＨＲＰに結合する抗ラット抗体と共にインキュベートする、ラット抗Ｈｉｓ抗体であった。Ｑβに対してウサギポリクローナル抗血清で染色することによって、Ｑβを検出し、その後、ＨＲＰ結合抗ラビット抗体により検出した。同一のブロットは、図示のように染色された。It is a figure which shows the analysis of the ligation reaction by a Western blot method. Lane M: molecular weight marker, lane 1: purified His-C-IL-5, lane 2: Qβ after derivatization with chemical crosslinker SMPH, lane 3: ligation reaction. The primary antibody for detecting His-C-IL5 was a rat anti-His antibody that was subsequently incubated with an anti-rat antibody that binds to HRP. Qβ was detected by staining with rabbit polyclonal antiserum against Qβ, followed by detection with an HRP-conjugated anti-rabbit antibody. The same blot was stained as shown. ４段階のＥＬＩＳＡを示す図である。Ａ．捕捉ＥＬＩＳＡの概略図。アッセイの様々な成分は、１：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、２：ウサギ抗Ｑβポリクローナル抗血清、３：Ｑβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５、Ｑβ、またはＰＢＳ、４：抗ＩＬ５モノクローナルＡｂ、ＴＲＦＫ４または５、５：抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ。Ｂ．４段階ＥＬＩＳＡの結果。モノクローナル抗体を中和して、規則的抗体アレイに共有結合したＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５と相互に作用させることができる能力を、ＥＬＩＳＡによって決定した。It is a figure which shows 4 steps | paragraphs of ELISA. A. Schematic of capture ELISA. The various components of the assay are: 1: goat anti-rabbit IgG, 2: rabbit anti-Qβ polyclonal antiserum, 3: Qβ-His-C-IL5, Qβ, or PBS, 4: anti-IL5 monoclonal Ab, TRFK4 or 5, 5 : Anti-mouse IgG-HRP. B. Results of 4-stage ELISA. The ability of neutralizing monoclonal antibodies to interact with His-C-IL5 covalently bound to a regular antibody array was determined by ELISA. ＩＬ−５に対する血清のＥＬＩＳＡを示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ５で被覆し、免疫前のマウス、またはＱβ−Ｈｉｓ−Ｃ−ＩＬ５でワクチン接種し（４匹）またはＨｉｓ−Ｃ−ＩＬ−５と混合したＱβでワクチン接種して（５匹）２１日過ぎた後のマウスから採取した血清と共にインキュベートした。血清の出発希釈率は１：５０であり、５倍希釈を行った。ＩＬ−５特異的抗体の結合を、ＨＲＰに結合した抗マウスＩｇＧおよび色素生成基質で検出した。FIG. 2 shows serum ELISA for IL-5. ELISA plates were coated with His-C-IL5, pre-immunized mice, or vaccinated with Qβ-His-C-IL5 (4 mice) or vaccinated with Qβ mixed with His-C-IL-5. (5 animals) Incubated with serum collected from mice after 21 days. The starting dilution ratio of serum was 1:50, and 5-fold dilution was performed. Binding of IL-5 specific antibody was detected with anti-mouse IgG conjugated to HRP and a chromogenic substrate. ＢＬ２１での組換えＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ発現の誘導を示す図である。１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色。導入量は、示される細菌溶解産物の０．１ＯＤ_６００に相当する。ＩＬ−１３−融合タンパク質の発現を０．７５ｍＭＩＰＴＧで誘導し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４時間後にサンプルを分析した。対応するプラスミド（ｐＭｏｄ−ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ）で形質転換されかつＩＰＴＧで誘導された細菌には、ＩＬ−１３−融合タンパク質の強力な発現があることに留意されたい（矢印参照）。It is a figure which shows the induction | guidance | derivation of recombinant GST-EK-IL13-C1-His expression in BL21. Coomassie blue staining of 16% SDS-PAGE. The amount introduced corresponds to 0.1 OD ₆₀₀ of the indicated bacterial lysate. IL-13 fusion protein expression was induced with 0.75 mM IPTG and samples were analyzed 4 hours later by SDS-PAGE. Note that bacteria transformed with the corresponding plasmid (pMod-GST-EK-IL13-C1-His) and induced with IPTG have strong expression of the IL-13 fusion protein (see arrow). ). 変性下でのＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓの精製を示す図である。１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色。導入量は、示される画分の５μｌに相当する。ＩＬ−１３−融合タンパク質を封入体から得て、グアンジン−ＨＣｌ変性緩衝液に溶解し、Ｎｉ^２＋アガロースカラムに導入し、同じ緩衝液で平衡状態にした。結合したタンパク質を、異なるｐＨで２段階で溶出した。図は、ｐＨ４．５の第２の緩衝液で溶出された、図示される画分（＃５〜＃３０）の、ＴＣＡ沈殿による一定分量の分析を示す。Ｃ末端Ｈｉｓタグにより、ＩＬ−１３融合タンパク質がＮｉ^２＋アガロースカラムに効率的に結合し、ｐＨを下げることによって溶出されたことに留意されたい。FIG. 6 shows purification of GST-EK-IL13-C1-His under denaturation. Coomassie blue staining of 16% SDS-PAGE. The amount introduced corresponds to 5 μl of the indicated fraction. IL-13-fusion protein was obtained from inclusion bodies, dissolved in guanidine-HCl denaturing buffer, introduced into a Ni ²⁺ agarose column and equilibrated with the same buffer. The bound protein was eluted in two steps at different pH. The figure shows an aliquot analysis by TCA precipitation of the illustrated fractions (# 5- # 30) eluted with a second buffer at pH 4.5. Note that due to the C-terminal His tag, the IL-13 fusion protein was efficiently bound to the Ni ²⁺ agarose column and eluted by lowering the pH. リフォールディング後の可溶性ＩＬ−１３融合タンパク質の分析を示す図である。ＧＳＴ−ＥＫ−ＩＬ１３−Ｃ１−Ｈｉｓ融合タンパク質を、セクション１８Ｄで述べるようにリフォールディングした。リフォールディング反応が終了した後、一定分量のタンパク質溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後クーマシー染色（Ａ）またはウェスタンブロット（Ｂ）を行った。示される一次抗体は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ（α−ＩＬ１３、ＡＦ−４１３−ＮＡ）から、Ｑｉａｇｅｎ（α−ＰｅｎｔａＨｉｓ、３４６６０）およびＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（α−ＧＳＴ、２４−４５７７）によって、それぞれ購入した。抗体は、製造業者の取扱い説明書に従った濃度で使用した。FIG. 5 shows analysis of soluble IL-13 fusion protein after refolding. The GST-EK-IL13-C1-His fusion protein was refolded as described in section 18D. After the refolding reaction was completed, an aliquot of the protein solution was analyzed by SDS-PAGE followed by Coomassie staining (A) or Western blot (B). The primary antibodies shown were purchased from R & D System (α-IL13, AF-413-NA) by Qiagen (α-PentaHis, 34660) and Amersham Biosciences (α-GST, 24-4577), respectively. The antibody was used at a concentration according to the manufacturer's instructions. マウスエオタキシンＣ１の発現を示す図である。１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の９時間後、ｐｍＥｏ−Ｃ１で形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の細胞溶解産物からの上清について、１６％ＰＡＧＥゲル上で実験し、ニトロセルロース膜にブロットして、ヤギ抗マウスエオタキシン抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）と反応させた。レーン１：染色前タンパク質マーカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、レーン２：１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の９時間後、ｐｍＥｏ−Ｃ１で形質転換されたＢＬ２１／ＤＥ３細胞の細胞溶解産物の上清、レーン３：染色前タンパク質マーカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、レーン４：抗マウスエオタキシン抗体でプローブした、レーン２と同じ溶解産物のウェスタンブロット。It is a figure which shows the expression of mouse | mouth eotaxin C1. Nine hours after induction with 1 mM IPTG, supernatants from cell lysates of BL21 / DE3 cells transformed with pmEo-C1 were run on 16% PAGE gels, blotted onto nitrocellulose membranes, and goats. Reacted with anti-mouse eotaxin antibody (R & D System). Lane 1: pre-stained protein marker (New England Biolabs), lane 2: supernatant of cell lysate of BL21 / DE3 cells transformed with pmEo-C1, 9 hours after induction with 1 mM IPTG, lane 3: staining Pre-protein marker (New England Biolabs), lane 4: Western blot of the same lysate as in lane 2 probed with anti-mouse eotaxin antibody.

Claims

（ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子と、
（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基と
を含み、前記抗原または前記抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであり、
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に少なくとも一つの非ペプチド共有結合により結合している、組成物。 (A) RNA- like virus-like particles;
(B) at least one antigen or antigenic determinant;
Wherein the antigen or the antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide,
The composition wherein the at least one antigen or antigenic determinant is bound to the virus-like particle by at least one non-peptide covalent bond .

前記ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。The composition of claim 1, wherein the virus-like particle is a recombinant virus-like particle.

前記ウイルス粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the viral particle comprises a recombinant protein of RNA phage .

前記ＲＮＡ−ファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。 Before Symbol RNA- phage,
(A) bacteriophage Qβ,
(B) bacteriophage R17,
(C) bacteriophage fr,
(D) bacteriophage GA,
(E) bacteriophage SP,
(F) bacteriophage MS2,
(G) bacteriophage M11,
(H) bacteriophage MX1,
(I) bacteriophage NL95,
(K) bacteriophage f2,
(L) bacteriophage PP7, and
(M) Bacteriophage AP205
4. The composition of claim 3 , wherein the composition is selected from the group consisting of:

前記ウイルス様粒子がＲＮＡ−ファージＱβの組み換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。 The virus-like particle comprises recombinant proteins of RNA- phage Q [beta], A composition according to claim 1.

前記ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージｆｒまたはＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the virus-like particle comprises a recombinant protein of RNA phage fr or RNA phage AP205.

前記抗原または抗原決定基がＩＬ−５のタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the antigen or antigenic determinant is an IL-5 protein or peptide.

前記ＩＬ−５のタンパク質またはペプチドが、
（ａ）配列番号２３３のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２３４のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号２３３または２３４のいずれかの断片のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項７に記載の組成物。 The IL-5 protein or peptide is
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 233,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 234, and
(C) Amino acid sequence of any fragment of SEQ ID NO: 233 or 234
The composition according to claim 7 , comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of:

前記抗原または抗原決定基がＩＬ−１３のタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the antigen or antigenic determinant is an IL-13 protein or peptide.

前記ＩＬ−１３のタンパク質またはペプチドが、
（ａ）配列番号２３０のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２３１のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号２３０または２３１のいずれかの断片のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組成物。 The IL-13 protein or peptide is
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 230,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 231, and
(C) Amino acid sequence of any fragment of SEQ ID NO: 230 or 231
The composition according to claim 9 , comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of:

前記抗原または抗原決定基がエオタキシンのタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の組成物。 2. The composition of claim 1, wherein the antigen or antigenic determinant is an eotaxin protein or peptide.

前記エオタキシンのタンパク質またはペプチドが、
（ａ）配列番号２４２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２４３のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２４４のアミノ酸配列、および
（ｄ）配列番号２４２、２４３、または２４４のいずれかの断片のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の組成物。 The eotaxin protein or peptide is
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 242,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 243,
(C) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 244, and
(D) The composition according to claim 11 , comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of fragments of any of SEQ ID NOs: 242, 243, or 244.

前記ウイルス様粒子が少なくとも１つの第１の付着部位を含み、且つ
前記抗原または抗原決定基が、
（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び
（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択された少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含み、
前記第２の付着部位は第１の付着部位に会合することが可能であり、前記抗原又は抗原決定基及び前記ウイルス粒子は前記会合を介して相互作用して、規則正しい反復性抗原アレイを形成する、請求項１に記載の組成物。 The virus-like particle comprises at least one first attachment site, and the antigen or antigenic determinant comprises
At least one second selected from the group consisting of (i) a non-naturally occurring attachment site on the antigen or antigenic determinant ; and (ii) an attachment site naturally occurring on the antigen or antigenic determinant. Further including an attachment site of
The second attachment site can associate with the first attachment site, and the antigen or antigenic determinant and the viral particle interact through the association to form an ordered repetitive antigen array. the composition of claim 1.

前記抗原または抗原決定基がＩＬ−５のタンパク質またはペプチドであり、前記少なくとも第２の付着部位を備えた前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）配列番号３３５のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３３６のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３３７のアミノ酸配列、および
（ｄ）配列番号３３５〜３３７のいずれかの断片のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の組成物。 The antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-5, and the antigen or antigenic determinant provided with the at least second attachment site comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 335,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 336,
(C) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 337, and
(D) the amino acid sequence of any fragment of SEQ ID NOs: 335-337
14. The composition of claim 13 , comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of:

前記抗原または抗原決定基がＩＬ−１３のタンパク質またはペプチドであり、前記少なくとも第２の付着部位を備えた前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）配列番号３３０のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３３１のアミノ酸配列、および
（ｃ）配列番号３３０または３３１の断片のアミノ酸配列
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、あるいは当該アミノ酸配列からなる、請求項１３に記載の組成物。 The antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-13, and the antigen or antigenic determinant provided with the at least second attachment site comprises:
(A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 330,
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 331, and
(C) the amino acid sequence of the fragment of SEQ ID NO: 330 or 331
14. The composition of claim 13 , comprising or consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of:

前記抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドの少なくとも１つの抗原性部位を含むＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の組成物。 6. The antigen or antigenic determinant is an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide comprising at least one antigenic site of an IL-5, IL-13, or eotaxin protein or peptide. 2. The composition according to 1.

前記第１の付着部位がリジン残基である請求項１３に記載の組成物。The composition according to claim 13, wherein the first attachment site is a lysine residue.

前記第２の付着部位がスルフィドリル基又はシステイン残基である請求項１３に記載の組成物。The composition according to claim 13, wherein the second attachment site is a sulfhydryl group or a cysteine residue.

前記第１の付着部位がリジン残基であり、前記第２の付着部位がシステイン残基である請求項１３に記載の組成物。The composition according to claim 13, wherein the first attachment site is a lysine residue and the second attachment site is a cysteine residue.

（ａ）請求項１に記載の組成物、および
（ｂ）許容可能な医薬品担体
を含む医薬品組成物。 (A) the composition of claim 1, and
(B) Acceptable pharmaceutical carrier
A pharmaceutical composition comprising:

（ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子、および
（ｂ）少なくとも１つの抗原または抗原決定基
を含み、
前記抗原または抗原決定基がＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドであって、及び、前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に少なくとも１つの非ペプチド共有結合により結合している、組成物を含んでなるワクチン組成物。 (A) virus-like particles of RNA phage , and
(B) at least one antigen or antigenic determinant
Including
The antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin, and the at least one antigen or antigenic determinant is attached to the virus-like particle by at least one non-peptide covalent bond bonded to that, the vaccine composition comprising the composition.

更にアジュバンドを含む請求項２１に記載のワクチン組成物。The vaccine composition according to claim 21, further comprising an adjuvant.

前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージの組換えタンパク質である、請求項２１に記載のワクチン組成物。 The vaccine composition according to claim 21 , wherein the virus-like particle is a recombinant protein of RNA phage.

前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージＱβ、ＲＮＡファージｆｒ、又はＲＮＡファージＡＰ２０５の組換えタンパク質である、請求項２１に記載のワクチン組成物。The vaccine composition according to claim 21, wherein the virus-like particle is a recombinant protein of RNA phage Qβ, RNA phage fr, or RNA phage AP205.

（ａ）ＲＮＡファージのウイルス様粒子を提供し、
（ｂ）ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンのタンパク質またはペプチドである少なくとも１つの抗原または抗原決定基を提供し、及び
（ｃ）前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウイルス様粒子に少なくとも１つの非ペプチド共有結合により結合できるように、前記ウイルス様粒子と前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基とを組み合わせること
を含む、請求項１に記載の組成物を生成する方法。 (A) providing virus-like particles of RNA phage ;
(B) providing at least one antigen or antigenic determinant that is a protein or peptide of IL-5, IL-13, or eotaxin ; and
(C) the such that at least one antigen or antigenic determinant can be bound by at least one non-peptide covalent bond to said virus-like particles, the combination of the said virus-like particle at least one antigen or antigenic determinant
A method of producing a composition according to claim 1 comprising:

薬剤として使用される請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, which is used as a medicine.

アレルギー性好酸球疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項１に記載の組成物の使用。 Use of the composition according to claim 1 for the manufacture of a medicament for treating allergic eosinophil disease.

（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位をそれぞれ備えた少なくとも１つの第１のコア粒子および少なくとも１つの第２のコア粒子であって、前記少なくとも１つの第１のコア粒子及び／又は少なくとも１つの第２のコア粒子がＲＮＡファージのウィルス様粒子であるもの、および
（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位をそれぞれ備えた少なくとも１つの第１の抗原または抗原決定基および少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基
とを含む組成物であって、
前記少なくとも１つの第１の抗原または抗原決定基および前記少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基が、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、またはエオタキシンから選択され、前記第２の付着部位が、
（ｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位、及び
（ｉｉ）前記抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位
からなる群から選択され、
前記第２の付着部位が前記第１の付着部位に会合可能であり、前記少なくとも１つの第１および前記少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基と、前記少なくとも１つの第１および前記少なくとも１つの第２のコア粒子とが前記会合を介して相互に作用して規則正しい反復性抗原アレイを形成する、組成物。 (A) at least one first core particle and at least one second core particle each having at least one first attachment site , wherein the at least one first core particle and / or at least one One second core particle is a virus-like particle of an RNA phage, and (b) at least one first antigen or antigenic determinant and at least one second each with at least one second attachment site An antigen or an antigenic determinant, comprising:
The at least one first antigen or antigenic determinant and the at least one second antigen or antigenic determinant are selected from IL-5, IL-13, or eotaxin, and the second attachment site is:
(I) said antigen or attachment site not naturally occurring in the antigenic determinants, and (ii) is selected from the group consisting attachment site <br/> naturally present in the antigen or antigenic determinant,
The second attachment site is capable of associating with the first attachment site , the at least one first and the at least one second antigen or antigenic determinant, and the at least one first and the at least one. A composition wherein two second core particles interact through said association to form an ordered repetitive antigen array .

前記少なくとも１つの第１の抗原または抗原決定基がＩＬ−５のタンパク質またはペプチドであり、前記少なくとも１つの第２の抗原または抗原決定基がＩＬ−１３のタンパク質またはペプチドである、請求項２８に記載の組成物。 Said at least one first antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-5, wherein the at least one second antigen or antigenic determinant is a protein or peptide of IL-13, in claim 28 The composition as described.

前記少なくとも１つの第１のコア粒子と前記少なくとも１つの第２のコア粒子が組換えウイルス様粒子である、請求項２８に記載の組成物。 30. The composition of claim 28 , wherein the at least one first core particle and the at least one second core particle are recombinant virus-like particles.

前記少なくとも１つの第１のコア粒子と前記少なくとも１つの第２のコア粒子が同じ組換えウイルス様粒子である、請求項３０に記載の組成物。 32. The composition of claim 30 , wherein the at least one first core particle and the at least one second core particle are the same recombinant virus-like particle.

前記ウイルス様粒子がＲＮＡファージの組換えタンパク質を含む請求項３１に記載の組成物。 32. The composition of claim 31, wherein the virus-like particle comprises an RNA phage recombinant protein .

前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。 The RNA phage is
(A) bacteriophage Qβ,
(B) bacteriophage R17,
(C) bacteriophage fr,
(D) bacteriophage GA,
(E) bacteriophage SP,
(F) bacteriophage MS2,
(G) bacteriophage M11,
(H) bacteriophage MX1,
(I) bacteriophage NL95,
(K) bacteriophage f2,
(L) bacteriophage PP7, and
(M) Bacteriophage AP205
33. The composition of claim 32, selected from the group consisting of:

ＲＮＡファージＱβの組換えタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含むか、あるいは前記コートタンパク質から本質的になるか、あるいは前記コートタンパク質からなる、請求項５に記載の組成物。6. The composition of claim 5, wherein the RNA phage Qβ recombinant protein comprises, consists essentially of, or consists of the coat protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.

前記組成物を動物またはヒトへ投与することを含んでなる免疫化する方法に使用される請求項１−１９または２８−３４に記載の組成物。 The composition of claim 1 19 or 28-34 for use in a method of immunizing comprising administering said composition to an animal or human.

前記抗原または抗原決定基が自己抗原である、請求項３５に記載の組成物。 It said antigen or antigenic determinant is Ru der autoantigen composition of claim 35.

前記動物がヒトであり、前記抗原または抗原決定基がヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１３またはヒトエオタキシンのタンパク質またはペプチドである、請求項３６の組成物。38. The composition of claim 36, wherein the animal is a human and the antigen or antigenic determinant is a human IL-5, human IL-13 or human eotaxin protein or peptide.