JP2005510234A - ポリペプチドの定量 - Google Patents
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Abstract
Description
選択したポリペプチドは、任意のポリペプチド(すなわち、ペプチド結合により結合した2以上のアミノ酸)であってよく、そしてサンプルは、任意のポリペプチド含有サンプルであってよい。好適なサンプルは、細胞サンプル、組織サンプル、体液、及び環境サンプルを包含する。サンプルは、動物(例えば、ヒト)に由来するものであってよく、そして動物の細胞、組織又は器官でありうる。サンプルは、植物に由来するものであってよく、そして植物の細胞、組織又は器官であってもよい。サンプルはまた、真菌、細菌及びウイルスに由来するものであってもよい。サンプルは、環境サンプル(例えば、土壌、水、及び空気サンプル)であってもよい。ポリペプチドは、動物、植物、真菌、細菌及びウイルスに由来するものであってよい、ポリペプチドは、膜関連ポリペプチド(例えば、脂質二重層に存在するもの又は脂質二重層の表面に吸着したもの)であってよい。膜関連ポリペプチドは、例えば、形質膜、細胞壁、細胞内小器官膜、ウイルスキャプシドに関連したものであってよい。ポリペプチドは、細胞質又は細胞内小器官のものであってよい。ポリペプチドは、間質又は体液(例えば、血漿及び髄液)に存在する細胞外のものであってもよい。ポリペプチドは、生物学的触媒、種々の分子の輸送体又はキャリアー、細胞間及び細胞内シグナル伝達のための受容体、ホルモン、並びに細胞、組織及び器官の構造要素であってよい。いくつかのポリペプチドには腫瘍マーカーも含まれる。
特定の切断産物は、1以上の切断剤で処理することにより選択したポリペプチドから遊離させることができる。この処理は、1以上の切断剤をポリペプチド含有サンプルに添加する、in vitro又はin situ切断反応により行うことができる。切断剤は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸間のペプチド結合を切断し、それにより特定の切断ポリペプチドを遊離させる。切断剤は、選択したポリペプチドから特定の切断産物を遊離させるために、単独で又は組み合わせて用いることができる。いくつかの切断剤は、エンドプロテイナーゼArg−C、エンドプロテイナーゼGlu−C、エンドプロテイナーゼLys−C、及びトリプシンのような酵素である。これら特定のエンドプロテイナーゼは、商業販売業者から入手可能であり、そして狭い特異性を有し、そのためタンパク質定量に用いるための理想的な切断ツールとなっている。他の有用な切断剤は、臭化シアンのような化学物質である。
特定の切断産物の実際量は、当技術分野で公知の任意の方法により測定することができる。いくつかの実施形態において、特定の切断産物の量は、質量分光測定法(例えば、タンデム質量分光測定法又は高次質量分光測定法(例えば、MSN))を用いて測定される。他の実施形態において、特定の切断産物の量は、イムノアッセイ(例えば、ELISA、又はRIA)のようなアフィニティーアッセイにより測定される。イムノアッセイは競合的であってよく、又は競合的でなくてもよい。RIAを用いて測定するために、外因性ポリペプチドは、典型的にトレーサーとして用いられ、そして典型的に3H、14C、又は125Iのような放射性同位元素で標識される。他の実施形態において、特定の切断産物の量は、高速液体クロマトグラフィーにより測定される。いくつかの実施形態において、特定の切断産物の実際量の測定は、切断産物を検出可能に標識すること(例えば、蛍光、化学発光又は放射性分子の結合による)を含む。例えば、特定の切断産物は、質量分光測定法を用いて測定するために、2H、15N、13C又は18Oのような安定な同位元素で標識することができる。
リカバリーポリペプチドは、サンプルを調製、切断、及び/又は定量分析する間に生じる可能性のある、特定の切断産物の何らかの損失を補正するために用いることができる。リカバリーポリペプチドは、特定の切断産物に対応する標識した外因性ポリペプチドである。使用する場合には、リカバリーポリペプチドは、規定量が内部対照物としてサンプルに直接添加される。リカバリーポリペプチドの添加は、それをサンプルに添加する時点以後、及び該リカバリーポリペプチドを測定する時点までに生じる可能性のある損失の補正を可能にする。従って、サンプルを調製、切断、及び/又は定量分析する間に生じる全ての損失を補正するために、リカバリーポリペプチドの規定量をサンプル調製を始める前にサンプルに添加することができ、次いで、対応する特定の切断産物の量を測定するときに、リカバリーポリペプチドの量を測定する。リカバリーポリペプチド(及び、従って、対応する特定の切断産物)の損失を、サンプル調製の後に存在するリカバリーポリペプチドの量とサンプルに添加した規定量との比較によって測定することができる。次いで、特定の切断産物の測定量を、リカバリーポリペプチドの損失を反映させるために調節することができる。
任意の個々のサンプルについて、種々の異なる特定の切断産物を測定することができる。ある特定の選択したポリペプチドから遊離した複数の特定の切断産物を測定することにより、その特定の選択したポリペプチドの定量分析の感度を上昇させ、そして/又は精度を確証することができる。異なる選択したポリペプチドから遊離した特定の切断産物を測定することにより、ある特定のサンプルについて複数の選択したポリペプチドを定量することができる。特定の切断産物の各々は、対応する外因性ポリペプチドを基準として測定することができ、そしてリカバリーポリペプチドは、測定した特定の切断産物の何れか又は全ての損失の原因を説明するために用いることができる。
本実施例は、膜関連プリン受容体であるヒトP2X3の定量を実証する。ヒトP2X3カルボキシ末端から遊離した切断産物を、対応する合成ポリペプチドを基準として測定した。切断産物は、アミノ酸配列:QSTDSGAFSIGH(配列番号2)を有する。対応する合成ポリペプチドは、ラットP2X3アミノ酸配列:VEKQSTDSGAYSIGH(配列番号3)を有する。合成ポリペプチドを、該合成ポリペプチド及び切断産物に対して特異的な免疫反応性を有する抗体を生じさせるために用いた。抗体もまた、選択したポリペプチドに対する特異的反応性を実証するために、免疫細胞化学及びウェスタンブロッティングにより検証した。
本実施例は、受容体に結合した膜貫通Gタンパク質であるロドプシンの定量を実証する。ロドプシンのカルボキシ末端から遊離した切断産物を、同一の合成ポリペプチドを基準として測定した。切断産物及び対応する外因性ポリペプチドは、次のアミノ酸配列:TETSQVAPA(配列番号1)を有した。
本発明を詳細な説明において説明してきたが、上記の記載は、例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって特定されるものである。他の態様、利点及び変更は、請求の範囲内にある。
Claims (24)
- サンプル中の1以上の選択したポリペプチドの実際量を測定するための方法であって、
1以上の選択したポリペプチドの各々から、少なくとも1つの切断剤を用いて少なくとも1つの特定の切断産物を遊離させること、及び
前記少なくとも1つの特定の切断産物の各々の実際量を、対応する外因性ポリペプチドの規定量と比較して測定すること、
を含み、前記少なくとも1つの特定の切断産物の各々の実際量は、該切断産物が遊離した前記選択したポリペプチドの実際量に直接関係する、上記方法。 - サンプルが1つの選択したポリペプチドを含有する、請求項1に記載の方法。
- 選択したポリペプチドから1つの特定の切断産物が遊離する、請求項2に記載の方法。
- 特定の切断産物と選択したポリペプチドとの直接の関係が1:1である、請求項1に記載の方法。
- 特定の切断産物と選択したポリペプチドとの直接の関係が1:1である、請求項3に記載の方法。
- 遊離ステップの前に対応する外因性ポリペプチドの規定量をサンプルに添加する、請求項1に記載の方法。
- 選択したポリペプチドから2〜5の特定の切断産物が遊離する、請求項2に記載の方法。
- サンプルが2〜5の選択したポリペプチドを含有する、請求項1に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの各々から1つの特定の切断産物が遊離する、請求項8に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの各々から2〜5の特定の切断産物が遊離する、請求項8に記載の方法。
- サンプルが6〜10の選択したポリペプチドを含有する、請求項1に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの各々から1つの特定の切断産物が遊離する、請求項11に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの各々から2〜5の特定の切断産物が遊離する、請求項11に記載の方法。
- 切断剤の少なくとも1つが酵素である、請求項1に記載の方法。
- 酵素がトリプシン、エンドプロテイナーゼLys−C、エンドプロテイナーゼArg−C、及びエンドプロテイナーゼGlu−Cからなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 切断剤の少なくとも1つが化学物質である、請求項1に記載の方法。
- 化学物質が臭化シアンである、請求項16に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの少なくとも1つが膜ポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 選択したポリペプチドの少なくとも1つが神経受容体である、請求項1に記載の方法。
- 測定ステップが、切断産物の少なくとも1つの実際量を測定するための抗体の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 測定ステップが、切断産物の少なくとも1つの実際量を測定するためのタンデム質量分光測定法又は高次質量分光測定法の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 遊離ステップの前にリカバリーポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、及び
遊離ステップの後にリカバリーポリペプチドの実際量を測定すること、
をさらに含み、上記測定ステップが、上記添加ステップの後に生じたリカバリーポリペプチドの損失を反映させるために、該リカバリーポリペプチドと対応する特定の切断産物の1つの量を調節することを含む、請求項1に記載の方法。 - 遊離ステップの前に切断可能な合成ポリペプチドの規定量をサンプルに添加すること、
切断可能な合成ポリペプチドから切断剤を用いて少なくとも2つの示差的に標識したポリペプチドを遊離させること、及び
上記示差的に標識したポリペプチドの各々の実際量を測定すること、
をさらに含み、上記測定ステップが、上記切断剤による切断の不完全性を反映させるために、特定の切断産物の各々の量を調節することを含む、請求項1に記載の方法。 - 示差的に標識したポリペプチドの1つが特定の切断産物の少なくとも1つに対応し、測定ステップが、添加ステップの後に生じた、対応する示差的に標識したポリペプチドの損失を反映させるために、特定の切断産物の少なくとも1つの量を調節することを含む、請求項23に記載の方法。
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