JP2005508216A - インプラント近傍の血管形成を維持するためのデバイス及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インプラント、特にバイオ人工血液濾過器近傍において血管形成を維持するデバイス及び方法。血管新生誘導因子を分泌する細胞をこのようなインプラントと組み合わせることにより、インプラントの周囲の組織への血管形成が維持できる。バイオ人工血液濾過器においては、これにより、体外へ排出するための収集ファイバーへの濾液の輸送が促進される。細胞には、例えば血管内皮成長因子をコードするアデノウィルスベクターを用いて遺伝子工作を行うことができる。筋芽細胞や筋管を本発明の一実施形態において用いることができる。
Description
【0001】
本発明は、限外濾過液の生成を促進するために且つインプラント内の細胞への/からの酸素や栄養、代謝産物の輸送を促進するために、インプラントの近傍で血管形成を誘導し且つ維持するデバイス及び方法に関する。より詳細には、本発明は、バイオ人工血液濾過器の近傍で血管形成を維持するデバイス及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオ人工濾過デバイスを開発するための一つの従来の方法として、濾液を取出すための機構の近くでin vivoで部位特異的血管新生を促進する方法がある(例えば、J.A.トンプソン(Thompson)ら、Science 241、1349〜1352頁、1988参照、この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)。この方法では、埋め込まれた生体適合中空ファイバーの周囲や中に標的とした血管新生を誘導するために、血管新生誘導因子(J.フォークマン(Folkman)とY.シン(Shing)、J Biol.Chem.267(16)、10931〜10934頁、1992、この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)を外因性、内因性の経路によって運ぶ。この中空ファイバーは、血管新生誘導因子により誘導され新しく形成された毛細血管ネットワークが産生した限外濾過液を収集する(排液する)通路として機能することを企図したものである。この構成は、毛細血管床に圧力差を与えたときに限外濾過液を生成する毛細血管床すべてに共通の本質的特性に基づいている。この濾液即ち浸出液は、間質空間やリンパ系からなる通常の生理的部位ではなく、中空ファイバーネットワークに集まる。言い換えると、方向性の濾液は、毛細血管から間質を経由し中空ファイバーに流れる。これは、中空ファイバーシステムが排液・収集システムに接続しているときには毛管腔と中空ファイバーとの間の水圧差が20mmHgを超える場合もあることによる。濾液は一旦中空ファイバーネットワークに集められると、体外へと排出させることができる。このようにして例えば腎臓等の濾過特性の一部を模倣したものとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明者は、このようなシステムへの血管新生誘導因子(血管新生を刺激する化合物)の投与が一旦中断されると、新しく形成された毛細血管床が、限外濾過液を収集する中空ファイバーから退縮してしまうことを見出した。退縮により、中空ファイバーネットワークへ流れる血流が減少し、毛管腔から中空ファイバーへの経路に沿う流れの実効抵抗値が上昇する。その結果、この経路に沿った濾液の流速が低下し、体からの各種化合物の一掃が減ってしまう。
【0004】
他のタイプのインプラントにおいては、その周囲において血管形成を誘導することも重要である。例えば、カプセル化細胞を用いたインプラントではしばしば、栄養の供給及び/又はインプラントからの代謝産物の除去が十分でなくなってしまうことがよくある。これは、一般に、カプセル化細胞の壊死や細胞産物の産生低下を惹き起こす。インプラントの輸送特性が悪いことの主な理由は、正常細胞とは対照的に典型的な組織工学インプラントの物質輸送プロセスは、対流性というよりもむしろ主に拡散性であることを特徴とするためである。設計者が、血管にインプラントをグラフトすることにより対流性輸送(ピラレラ(Pillarella)とジドニー(Zydney),J Biomech Eng 112(2):220〜8、1990参照、この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)を組み込んだとしても、輸送速度はまだネイティブな組織の輸送速度を引きずっている。というのは、後者は、膨大な微細血管ネットワークを有しているからである。しかしながら、このようなインプラントの内部や周囲において血管形成を刺激することにより、インプラントへの或いはインプラントからの代謝産物及び/又は栄養の輸送をより容易に行うことができる。
【0005】
更に、本発明者は、本発明で記載した血管形成したインプラント等の血液濾過器で生成した限外濾過液は、イムノグロブリンや免疫細胞、補体タンパク質を移植細胞に近づかせないようにしながら、対流性輸送により細胞インプラントに栄養や酸素を供給し、これにより移植細胞に血液が接触する免疫学的帰結を防止することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【0006】
従って、本発明の一目的は、インプラント、特にバイオ人工濾過デバイスの近傍において血管新生を誘導し且つ維持するための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0007】
本発明の別の目的は、インプラント近傍の部位に、より具体的にはバイオ人工濾過デバイス近傍の部位に注入等によって血管新生誘導因子を投与する必要を最小限にするための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0008】
本発明の更に別の目的は、インプラント近傍、より具体的にはバイオ人工濾過デバイス近傍において、少なくとも一種の血管新生誘導因子の分泌を維持するための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0009】
本発明の更に別の目的は、カプセル化細胞インプラントからの他の(即ち非−血管新生誘導因子)細胞産物のアウトプットを最大限にするための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0010】
本発明の更に別の目的は、自己維持性バイオ人工血液濾過デバイスを提供するための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0011】
本発明の更に別の目的は、移植された細胞に酸素及び栄養を運ぶための新規な方法及びデバイスを提供することである。
【0012】
本発明の更に別の目的は、栄養の対流(convective flow)への培養細胞の接近を与えるための表面の新規な配置を提供することである。
【0013】
本発明の更に別の目的は、上に述べたデバイスを調製するための方法を提供することである。
【0014】
本発明の更に別の目的は、上に述べたデバイスをレシピエント(受容者)(例えば患者)に埋込む方法を提供することである。
【0015】
本発明の更に別の目的は、濾過デバイスにより得られた限外濾過液を使用する方法を提供することである。
【0016】
本発明のこれらの及び他の目的は、まず、少なくとも一種の血管新生誘導因子をバイオ人工濾過デバイスに供給するにあたり該因子の供給量の少なくとも一部を提供するために用いることができる筋芽細胞等の細胞(好ましくは、レシピエントと同源のもの)を単離することにより達成できる。必要であれば、単離した細胞(好ましくは筋芽細胞)を、選択した血管新生誘導因子に対応する遺伝子でトランスフェクションすることができる。次に、どの血管新生誘導因子を選択するかにかかわらず、細胞を、必要に応じて例えば封入(encapsulating)中空ファイバーに播種することができる。一旦播種すると、細胞を必要に応じて封入中空ファイバーの管腔空間等へ拡げていくことができる。一実施形態においては、細胞成長及び/又は細胞付着を促進する一以上の有機成分を、管腔空間に与えることができる。播種及び/又は増殖(expansion)の後、細胞を分化細胞に変換する(筋芽細胞から筋管への変換等)ことができ、これにより細胞の成長が停止する。
【0017】
従って、得られたデバイスは、バイオ人工濾過デバイス等のインプラントに対し、適切な細胞からの血管新生誘導因子を供給できる。これにより、デバイスからの毛細血管床の退縮を防止でき、よってインプラントから或いはインプラントへの代謝産物及び/又は栄養のデバイスを介したクリアランス、及び/又は輸送を十分に維持できる。好ましい実施形態においては、細胞は、選択した血管新生誘導因子をコードする遺伝子でトランスフェクションされた筋芽細胞か筋管である。デバイスは、細胞付着を容易にするためのフィブリングルー層を含むこともできる。
【0018】
限外濾過液はデバイス内に集められる。本発明の別の実施形態においては、デバイスは一以上のポートを含み、このポートから生成された限外濾過液を尿系統やex vivoでの収集用の単一の経皮口に送ることができる。或いは、埋込み可能なバイオ人工尿細管等により更に処理するため、或いはバイオ人工膵臓やバイオ人工肝臓等の別のインプラントの物質輸送特性を改善するために、限外濾過液を一以上の組織工学インプラントにin vivoで送ることができる。実際、血液濾過器は、合成血液濾過器かバイオ人工血液濾過器かに関わらず、水、電解質、低分子量の炭水化物やタンパク質、酸素、二酸化炭素を通過させるが、移植された細胞に、細胞やイムノグロブリン、凝血因子、補体非含有血漿を流すことができるであろう。
【0019】
栄養や酸素の流れに対する細胞の直接的なアクセスは、小体積の閉じた領域内においては微小な各種幾何形状により実現できる。このような幾何形状は、従来の細胞固定技法や微小加工等のより新しい技法により容易に得ることができる。プレートやポストを微小加工して得た好ましいアレイによれば、細胞が単層として付着する広い表面積が提供され、各細胞はプレートやポストを流れる栄養の流れにアクセスできる。
【0020】
従って本発明は、
インプラント本体と、
第一の細胞と
を含み、第一の細胞が少なくとも一種の血液新生誘導産物を産生する埋込み可能な血液濾過デバイスを提供するものである。
【0021】
また、本発明は、上に述べた埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、第一の細胞とインプラント本体を結合する段階を含む方法を提供する。また、本発明は、埋込まれたときに血管形成を維持することができる埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、
血管新生誘導産物を放出できる第一の細胞を得る段階と、
第一の細胞とインプラント本体を組み合わせる段階と
を含み、第一の細胞は、埋込み可能な血液濾過デバイスを埋込んだ後、該デバイスの周囲に血管新生誘導産物を放出できるものである方法を提供する。
【0022】
また、本発明は、血液濾過インプラントを製造する方法であって、
上に述べた埋込み可能な血液濾過デバイスを被験者(subject)に埋込む段階を含み、第一の細胞により産生された血管新生誘導産物が、インプラント近傍で血管組織の形成を誘導する方法を提供する。
【0023】
また、本発明は、濾過デバイスにより得られた限外濾過液を使用する方法であって、
被験者内に埋込まれた濾過デバイスにより産生された限外濾過液を、同じく該被験者内に埋込まれた組織工学構築物に送る段階を含む方法を提供する。
【0024】
次に記載する詳細な説明を添付図面と共に参照することによって本発明がより良く理解されるにつれ、本発明のより完全な理解と本発明に付随する多くの利点を容易に得ることができるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【0025】
本発明に係る埋込み可能な血液濾過デバイスは、限外濾過液を集めるため適切な方法で配置された多孔質の通路の回りの血管ネットワーク(毛細血管床)の補強(recruitment)と維持に基づくものである。これは、少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する第一の細胞により達成される。本明細書において、「血管新生誘導因子」という用語は、インプラントの周りで血管ネットワークを補強し維持できる物質をいう。第一の細胞は、血管新生誘導因子を連続的に分泌するものであってもよい。この細胞は、該因子を自然に分泌するものでもよいし、分泌するように遺伝子改変を行ったものでもよい。
【0026】
第一の細胞は、適切な支持構造体(足場)上に固定される。第一の細胞は、ファイバーや球等の中実或いは中空の支持要素の外側に置かれてもよい。また、これら細胞は、中空ファイバー、カプセル、ゲル等の中空或いは実質的に中空の構造体の内側に置かれてもよいが、これは構造体が栄養分や細胞産物、特に血管新生誘導産物を透過できる場合である。一実施形態においては、第一の細胞は、インプラント本体の外側に置かれていても良い。
【0027】
特定の一実施形態においては、インプラント本体は多孔質のカプセル化体又は捕捉体を含む。別の実施形態においては、多孔質のカプセル化体は管状である。
【0028】
インプラント本体は、ガラス、金属、セラミック、ポリマーの内の一以上の材料を含むことができる。ポリマーとしては、例えばポリプロピレン、ポリスルホン、セルロース系ポリマー、セルロースアセテート、レーヨン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフルオロエチレン、アルギネート、キトサン等が挙げられる。
【0029】
第一の細胞を支持構造体上に配置することにより、毛細血管床がインプラント全体に亘って形成される。毛細血管床を通って流れる血液により栄養分と酸素とが運ばれて第一の細胞に供給され、これにより第一の細胞は血管新生誘導因子を分泌し続ける。その結果、安定した血管形成ネットワークが形成される。分泌された血管新生誘導因子は、毛細血管床の透過性(リーク性)を調節するのにも用いることができる。
【0030】
透過壁を有する複数の中空ファイバー(小さな糸状管)をインプラントの全空間に亘って配置することができ、それらは一緒になって共通の通路或いは出口に接続される。これにより、インプラントの限外濾過液収集ネットワークが形成される。これら中空ファイバーは、第一の細胞を含む支持構造体に囲まれており、埋込み及び血管を補強した後は毛細血管床に囲まれる。一部の血液は毛細血管床により濾過され、限外濾過液収集ネットワークに拾い上げられる。限外濾過液は、経皮口から体外へ排出させることができる。限外濾過液は、膀胱等の体腔に送ることもできる。
【0031】
本インプラントは、血管新生誘導因子を産生する第一の細胞に加え、別の細胞を更に含んでもよい。実際、本発明のインプラントは、インプラント全体の有効性に寄与する機能に寄付する様々な種類の細胞を含むことができる。以下、「第二の細胞」と呼ぶが、これらの細胞は、治療に役立つ物質を産生する等、治療に有用な機能を果たすことができる。本明細書における「治療に有用な物質」という用語は、本発明のデバイスがレシピエントに埋込まれた後にレシピエントに好ましい作用を有する材料をいう。治療に有用な物質の具体的な例としてはホルモンが挙げられる。或いは、第二の細胞は代謝活性を有してもよい。本明細書における「代謝活性」という用語は、細胞が物質を異化する、分解する、又は変換し得ることをいう。このような細胞としては、肝臓細胞や近位尿細管細胞等が挙げられる。
【0032】
本インプラントは、バイオ人工糸球体として作用するように用いることもできる。この実施形態においては、インプラントは、慢性腎疾病患者の透析治療に替わるものとして或いは補充的な治療として用いられる。埋込み可能な血液濾過デバイスは、レシピエントに好ましい作用を及ぼす他の細胞と組み合わせることもできる。このような好ましい作用としては、レシピエントに有用な治療的分子の産生が挙げられる。これらの有用な分子はインスリン等のホルモンであろう。インプラントは、埋込み可能なバイオ人工糸球体として且つインスリンの産生等の追加的な治療デバイスとして機能させることができるし、この後者においてのみ機能させることもできる。また、他の細胞、例えば接着、成長及び/又は分化を支持する細胞をデバイスに組み込むこともできる。これら細胞は、代謝活性や分泌活性を有することができる、即ちインプラントに関連する生体物質のための栄養を産生することができる。
【0033】
このようなデバイスは次のようにして構成することができる。単一のインプラントにおいて第一の細胞を他の細胞(第二の細胞)と組み合わせる。例えば、2種の中空ファイバー群において、一方は第一の細胞を支持し、他方は限外濾過液を収集し第二の細胞を支持するようにする。あるいは、限外濾過液を血液濾過器の出口から第二のインプラントに送り栄養分を供給する場合には、2種の異なるインプラント要素を用いることができる。限外濾過液は、第二のインプラントを通過した後は、(経皮口から直接的に或いは膀胱などの体腔に送ることにより間接的に)廃棄してもよいし、一部又は全部を再調整して再利用してもよい(例えば、腹腔に送るか、或いは静脈に戻す)。また、本発明は濾過デバイスにより得られた限外濾過液を用いて細胞インプラントに栄養や免疫保護を提供する方法を提供する。限外濾過液は、上述の埋込み可能な血液濾過デバイスにより提供できる。或いは、限外濾過液は、完全非生命体血液濾過器(即ち、上述の実施形態とは異なり、細胞を含まない血液濾過器)等の任意の血液濾過器により提供できる。
【0034】
本発明の埋込み可能なデバイスは、レシピエントの任意の適切な位置に埋込むことができる。例えば、デバイスを皮下及び/又は腹腔に埋込むことができる。或いは、デバイスを後腹膜腔に埋込むことができる。例えば、後腹膜腔に埋込む場合、疾病組織により前に占有されていた場所に埋込むことにより、デバイスを古い/損傷を受けている腎臓と組み合わせることができる。この方法であれば、広汎な血管形成と限外濾過液収集ネットワークが存在することによる特別な部位に埋込みを行うことができるため有利であろう。
【0035】
本発明の更に別の実施形態においては、血液濾過デバイスは、レシピエントの第二のインプラントに接続できる。第二のインプラントが治療的機能を提供する第二の細胞を含む場合、これらの第二の細胞は、血液濾過により生成された限外濾過液から栄養を得る。
【0036】
レシピエントは、ヒトでも、ヒト以外の動物でもよい。ヒト以外の動物は好ましくは哺乳類である。例えば、イヌやネコ、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられる。
【0037】
図面を参照すると、数枚の図面に亘り、同一或いは対応する部分には同様の符号が示されている。より具体的には、図1Aは、本発明に係るバイオ人工濾過デバイスに用いるための透過性ダブル中空ファイバー100の一例を示す。透過性中空ファイバー100は、2個の空洞部、即ちカプセル化/捕捉体112と通路122とを有しており、これらは周囲(図示せず)を介して少なくとも間接的に、互いに直接流体連通している。透過性壁116を介して連通している可能性もある。これら周囲部としては、例えば、ファイバーの空洞部112により産生される血管新生誘導因子により血管形成が維持される組織が挙げられる。図示のように、透過性中空ファイバー100のカプセル化/捕捉体112は、通路122と同様に直方体である。更に、図示した例示的なカプセル化/捕捉体112と通路122は互いに連続している。勿論、カプセル化/捕捉体112と通路122は、この幾何配置(即ち、連続している)とする必要はない。実際、製造や埋込みの容易性や実行可能性からくる制約を考えなければ、数種類の別の形状が実際には好ましい。例えば、接触領域116を不透過性にすることができる。或いはカプセル化/捕捉体112を円筒形にして通路122から所定の距離だけ離して配置することができる。可能性のある別の形状としては、カプセル化/捕捉体112と通路122が隣接した配置や、これらが螺旋形状になって互いに接触している配置等が挙げられる。カプセル化/捕捉体112と通路122との間には適切な離間距離が保たれ、カプセル化/捕捉体112において産生された血管新生誘導因子が通路122近隣において血管形成を促進或いは維持することにより、通路を通る濾過液の総流量が最大限のものとなることが好ましい。
【0038】
カプセル化/捕捉体112は面113と面114とを含み、通路122は面123と面124とを含む。これらの面は開放されていてもよいし、蓋をすることもできる。各面113、114、123及び/又は124の「蓋をする」は、透過性中空ファイバー100の透過性膜材料を単純に延ばしてこれらの面を覆うことにより行うことができる(この場合、これらの面は、透過性膜の残りの部分とは基本的には区別できない)。或いは、別の物体を開放している面113、114、123及び/又は124に押し込むなどして蓋をすることができる。好ましい実施形態においては、例えば図4Aと図4Bに示すように、通路122は、透過性膜により覆われない面123を含み、この面123は別の通路122の面123と流体連通関係にある。
【0039】
透過性中空ファイバー100は、水に対して透過性があり細胞の成長及び/又は付着を維持できる任意の材料で形成できる。典型的には、透過性中空ファイバー100の限外濾過係数は20mL/hr,Torr,m2を超え、好ましくは20〜100mL/hr,Torr,m2である。透過性中空ファイバー100の分子量カットオフは実質的に60000g/モル程度以下が適している。このようなポリマーとしては、例えば、各種のポリプロピレン、ポリスルホン、セルロース系ポリマー(セルロースアセテート等)、レーヨン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフルオロエチレン、これらの各種共重合体を初めとするその他のポリマー種が挙げられる。カプセル化/捕捉体112と通路122の透過性は互いに同一であっても異なっていてもよいという点が重要である。
【0040】
透過性中空ファイバー100の内面及び/又は外面は、一部の実施形態においては、細胞成長及び/又はファイバー上への細胞の接着及び/又はファイバー内への細胞の接着を促進する有機成分(図示せず)で覆われている。この有機成分としては、従来の細胞外マトリックス成分が挙げられ、該成分としては、タイプIコラーゲン、タイプIVコラーゲン、ラミニン、マトリゲル(Matrigel)、ヘパリン硫酸やデルマタン硫酸等の各種プロテオグリカン、フィブロネクチン、これらを組合せたもの等が挙げられる。他の使用しうる有機成分としては、工作を施した成分、例えばプロネクチンFが挙げられる。プロネクチンFは、クモの糸由来の繰り返し構造ペプチドセグメント間に散在しているために非分解性で非常に安定な細胞付着用の基質を提供する、ヒトフィブロネクチンRGD細胞付着リガンドの複数のコピーを含む組換えタンパク質である。好ましい実施形態においては、フィブリングルーを、細胞成長及び/又は接着を促進するための有機成分として働くことができる。フィブリングルーは、in vivoにおいて傷の治癒を促進する天然の複合体である。更に、上皮細胞が血管形成をする可能性は、溶解性因子と不溶性因子の両方への依存度が非常に(critically)高い。溶解性因子としては成長因子が挙げられる。不溶性因子としては、複合細胞外マトリックス(コラーゲンゲル等)や、精製された細胞外マトリックス分子(フィブリングルーに含まれているラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンタイプI及びIV等)等が挙げられる。最後に、フィブリングルーは、レシピエントから同
源(autologous)材料として容易に生成され得る。
【0041】
透過性中空ファイバー100を有機成分でコーティングするための各種化学的手法は、本技術分野において知られており、透過性中空ファイバー100の化学的性質に依存している。これらの化学的手法は、透過性中空ファイバー100に対して有機成分を非特異的に吸着させて光架橋させるものから、特異的、中でも位置特異的な固定スキームまであり、例えば、還元的アミノ化や、例えば米国特許5858653号、第4973493号、第5002582号、第5414075号、及び第5580697号の各公報に記載されているものが挙げられ、これら公報全ての内容を本発明の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0042】
図1B及び図1Cの中空ファイバー100の例示的断面図に示すように、カプセル化/捕捉体112と通路122は必ずしも同一の構成要素からなるものである必要はない。図示の両実施形態においては、少なくとも一種の血管新生誘導因子を供給できる細胞200を、透過性中空ファイバー100のカプセル化/捕捉体112内に配置できる。カプセル化/捕捉体112から血管新生誘導因子を供給することにより、埋込まれた透過性中空ファイバー100の周りにおける血管新生が促進され、一旦定常状態に達すると、或いは血管新生誘導因子の外部投与が少なくなった後の毛細血管床の退縮を阻止するであろう。図示の細胞200は、カプセル化/捕捉体112の内壁(lumen)に沿って置かれているように示されている。最小径の空洞を除き、半透膜により画定された空洞に捕捉された及び/又は包まれた細胞は、それらの空洞の表面近傍に維持することが最も容易なことであることは本技術分野において知られている。これは、おそらく、半透膜を透過する物質輸送が、これらの空洞の表面付近で最も容易に行われるためであろうと思われる。この作用の起源に関わらず、カプセル化/捕捉体112の細胞集団はカプセル化/捕捉体112の全体に亘って分布していることが理想的である(図面にはそのようには示されていないが)ことがわかる。
【0043】
図1Bに示すように、通路122は細胞や細胞産物が実質的にない状態であることができる。一実施形態においては、通路122は、カプセル化/捕捉体112の細胞200により誘導された又は維持された血管形成部から一切の限外濾過液を送り出す働きをする。これは、通路122の開放面123を通して行われ、これについては図4A及び図4Bに関連して更に説明を行う。
【0044】
図1Cに示すように、通路122も細胞集団300を含むことができる。細胞集団300は、通路122の周囲に、数ある細胞産物のうちの任意のものを提供するように選択できる。細胞集団300としては、幹細胞、造血幹細胞、肝細胞、膵島細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような細胞集団300のカプセル化において好ましいこと、該カプセル化の使用、該カプセル化手順については、例えば米国特許第5639275号公報、第5656481号公報、第5550050号公報、第5653975号公報、第5676943号、第5773286号公報、第5795790号公報等に記載されており、これら全ての内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0045】
図2Aは、血管新生誘導因子を産生する細胞を含む一以上の球状のカプセル化/捕捉体112を周囲に有する例示的な透過性中空ファイバーの通路122を示す。この図では球状のカプセル化/捕捉体112が明示的に示されているように、図1Aに関して述べたのと同様、カプセル化/捕捉体112の形状は任意である。同様に、カプセル化/捕捉体112の通路122に対する配置において必要な要件は、カプセル化/捕捉体112から放出された細胞産物が通路122の近傍において血管形成を誘導及び/又は維持できることだけである。カプセル化/捕捉体112と通路122の離間距離は数種類のファクターに依存する。このファクターとしては、カプセル化/捕捉体112及び通路122を形成する膜の透過性、カプセル化/捕捉体112及び通路122が埋込まれる組織、カプセル化/捕捉体112内の細胞200により産生された血管新生誘導因子の輸送、血管新生誘導性(angiogenicity)及び/又はその他の特性が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の目的のためには、カプセル化/捕捉体112は、好ましくは通路122の10mm以内、より好ましくは1mm以内にある。
【0046】
図2Bは、図1Bと同様の状況を示し、カプセル化/捕捉体112は少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する細胞200を含み、通路122は細胞や細胞産物を実質的に有さない。
【0047】
同様に、図2Cは、図1Cと同様の状況を示す。カプセル化/捕捉体112は少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する細胞200を含み、通路122は、通路122の周囲に数ある細胞産物の内の任意のものを提供するように選択された細胞集団300を含む。
【0048】
図3Aは、少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する細胞200が通路122の外側に固定され、カプセル化/捕捉体112は全く用いない状況を示す。この実施形態においては、少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する同源の細胞200が好ましい場合もあろう。この場合、細胞成長及び/又は細胞付着を促進する有機成分(フィブリングルー等)が、細胞200の固定のために通路122の外側表面に設けられる。細胞200が同源のものでない場合、例えば、適切な半透膜で覆うことによりこれらの免疫保護を行うことができる。
【0049】
図3Bは、図1B及び図2Bと同様の状況を示し、通路122には細胞や細胞産物は実質的に存在していない。
【0050】
同様に、図3Cは図1C及び図2Cと同様の状況を示し、通路122は、通路122の周囲に数ある細胞産物の内の任意のものを提供するように選択された細胞集団300を含む。
【0051】
図4Aは、バイオ人工濾過デバイスに適切な一実施形態における、略平行の数本の透過性ダブル中空ファイバー100とマニホールド400の例示的な接続を示す。図4A及び図4Bは図1Aの例示的ダブル中空ファイバーを用いて示されているが、図2Aや図3Aに示したもの等、多くの他の実施形態のものを同様のマニホールド400に接続することができる。更に、図4A及び図4Bにおいて数本の通路122がマニホールド400を通じて互いに流体連通関係にあるが、必ずしもこのようにする必要はない。例えば、通路122を任意の形状の単なるカプセル化膜として機能させたまま、通路122の面123を単純に蓋をすることができる。
【0052】
マニホールド400はチャネル410を含む。チャネル410により、透過性ダブル中空ファイバー100の複数の通路122が互いに及びマニホールドポート420と、複数の開放面123を介して流体連通関係になる。マニホールド400は更に、透過性ダブル中空ファイバー100間の好ましい距離を保つように働く。透過性ダブル中空ファイバー100が可撓性であるのが一般的であるが、この場合、対向するマニホールド(図示せず)を透過性ダブル中空ファイバー100の端部124に設けることができる。一実施形態においては、この対向するマニホールドは、通路122の開放部分124やカプセル化/捕捉体112の開放部分114を蓋するように働くことができる。対向するマニホールドは、デバイスの作成中に第一の細胞を通路112に播種するための手段も提供できる。同様に、必要であれば、マニホールド400により、カプセル化/捕捉体112の開放部分113を蓋することができる。
【0053】
バイオ人工濾過デバイスが埋込まれている実施形態においては、マニホールドポート420は、他の自然組織やバイオ人工組織と体内で流体連通関係にあることができる、或いは、濾過液を体から除去するための経皮口によって体外と流体連通関係にあることもできる。
【0054】
図4Bは、埋込み用の例示的配置であり、図1Aのダブル中空ファイバーが複数配置されている。この図においては、複数の中空ファイバー通路が互いに流体連通関係にあると共に共通の出口450で結合されている。図示の実施形態においては、各面113、114、124は、膜材料自体により、或いは一以上の面113、114、124内にある第三の材料(例えば押されて嵌まり込む材料)により蓋されている。しかしながら、開放面123は、複数の中空ファイバー通路を結合している経路の一部となっている。また、透過性ダブル中空ファイバー100が可撓性である場合、ファイバー間の距離を適切に保つため、及び/又は通路122の開放部分124を蓋する或いはカプセル化/捕捉体112の開放部分114を蓋するために、これと対向するマニホールド(図示せず)を用いることができる。
【0055】
バイオ人工濾過デバイスが埋込まれている実施形態においては、共通の出口450は、他の自然組織やバイオ人工組織と体内で流体連通関係にあることができる、或いは、濾過液を体から除去するための経皮口によって体外と流体連通関係にあることもできる。
【0056】
血液濾過器のマニホールド400や出口450は、図5Aに概略的に示すように、通路により体内の天然組織又は人工組織に流入するように接続されていてもよい。例えば、マニホールド400や出口450は尿道に排出することができ、この場合、腎臓による濾過を補うために生成された限外濾過液は収集され尿と共に捨てられる。更に、排出する前に、限外濾過液を更に処理するために別の追加的バイオ人工組織に送ることができる。例えば、バイオ人工細管を血液濾過器に直列に接続し、非常に実物に即したバイオ人工腎臓を提供することができ、また、組織工学インプラント(例えばバイオ人工膵臓やバイオ人工肝臓)の酸素及び栄養の要求を容易にすることができる。
【0057】
図5Aは、組織工学構築物500(基本的には、肝細胞やインスリン分泌細胞、近位尿細管等の細胞を含む埋込み可能なバイオリアクター)に対する中空ファイバーと通路の例示的配置を示す。図示の実施形態においては、血管が形成された中空ファイバーが生成した限外濾過液は、視覚化された通路を通りバイオリアクター500に送られ、そこから中心循環や尿系統、体外における収集及び体外への排出を行うための経皮口に更に送ることもできる。
【0058】
一実施形態においては、バイオリアクターに固定された細胞は、グルコースホメオスタシス、例えばβTC系統やMIN系統のメンバー等のインスリノーマや膵島に応答してインスリンを産生することができる。これらの細胞に対して限外濾過液を対流させて流すことの実用性や利点については、これらの細胞が代謝において必要とする量と限外濾過液の流れによってもたらされ得る供給量についての定量的な説明によってより良く理解できるであろう。この例においては、計算のために膵臓組織由来のインスリン分泌細胞を用いたが、本発明の新規性や有用性はこれらの細胞に限定されるものではない。
【0059】
培地で成長させた場合のインスリノーマの細胞109個あたりの酸素消費量は、1μモル/分であり(ムクンダン(Mukundan)ら、Biochem Biophys Res Commun.210(1):113−8,1997)、細胞が占める面積は100μm2のオーダー、即ち1×10-10m2/細胞である。一成人のインスリン必要量を供給するのに十分な合成をするのに必要な細胞数は2×109個のオーダーであると推算される。よって、これらの細胞を含むバイオリアクター500の酸素(oxygenation)要求量は約2μモル/分である。無細胞限外濾過液はヘモグロビンを運ばないため、その酸素含有量は濾過された血液の酸素分圧で決まる。臨床的プラクティスでは、血中酸素は通常50mmHgを超える。この値から限外濾過液の酸素含有量は774μモル/Lであるということがわかる。従って、理想的な条件下では、インスリン分泌細胞を含むバイオリアクター500の酸素要求量を供給するのに必要な限外濾過液の量は2.58mL/分に過ぎない。
【0060】
上の計算により、本発明者らは、埋植された細胞に栄養と酸素を供給するこの方法の実用性や新規性、利点を現実のものとした。更に、本発明者らは、バイオリアクター内の細胞を血流中の細胞由来要素や免疫学的要素から守る必要があることにより、埋込み可能なバイオリアクター内の細胞要素の生存の維持は一層難かしくなっていることを見出した。この問題への対処は、従来は、血液や間質液に囲まれた半透膜を用いて行ってきた。この場合、栄養と酸素は、それぞれの濃度勾配による受動的輸送により拡散する。同様に、細胞からの老廃物もバイオリアクターから拡散する。典型的な配置については、S.K.ヒュンター(Hunter)ら、Am.J.Obstet Gynecol 1997;177:746〜52、H.オーガワラら、Artif Organs 1998;22:788〜794、H.ハヤシら、Transplantation Proceedings 1996;28:1428、R.カラフィオーレ(Calafiore)ら、Transplantation Proceedings 1996;28:812〜813、C.デローニ(Delaunay)ら、Artif Organs 1998;22:291〜299、K.ナルセら、Artif Organs 1998;22:1031〜1037、B.ブッセ(Busse)ら、Ann NY Acad Sci 1999;875:326〜39、V.ディキシット(Dixit)ら、Eur J Surg 1998;Suppl 582:71〜76に記載されており、これらの内容及び記載を本発明の一部を構成するものとしてここに援用する。栄養と酸素の供給において栄養と酸素が拡散により通過しなければならない障壁に必要な条件は、細胞を含まない限外濾過液の対流によって行うことにより緩和される。本発明者らは、各細胞要素が対流にアクセスできるように且つ体積が最少となるように細胞要素を一個のバイオリアクター内に配置することが有利であることを見出した。また、本発明者らは、これらの条件は、小容積且つ大表面積という特徴を有する構造体を創出するために利用可能な技法、例えば中空ファイバーモジュールの使用や微小加工の使用によって達成できることを見出した。特に、シリコン等の材料で微小加工により形成される構造体の実用性や利点については、下記の説明によってより容易に理解できるであろう。
【0061】
図5Bは例示的バイオリアクター500を示す。このリアクター500は、微細加工により得られた平行プレート550を含み、該プレートの上に足場依存性細胞が成長することができる。好ましい実施形態においては、細胞は同源の、同種移植、同系移植又は異種移植された哺乳類細胞とすることができる。この細胞は、事前に特定された物質を産生或いは吸収するように改変されていてもよいし、改変されていなくてもよい。表面微細加工やバルク微細加工による高アスペクト比の小構造体の加工については、本技術分野においてよく知られ理解されており、Jボールドマン(Voldman)ら、Annu.Rev.Biomed.Eng.1999;1:401〜425にも記載されている。この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。好ましい実施形態においては、これら平行プレートの加工に用い得る材料としては、珪素、ポリアミド、二酸化珪素又は窒化珪素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上に述べたバイオリアクターに培養細胞の付着を行い且つ容易にするために、各種化学物質を用いることができると理解される。このような物質としては、例えば、ポリ−L−リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。有機化学物質の基質への付着を容易にするためにこのような物質や他の物質を使用することは、本技術分野においてよく認識されており、組織工学の原則(Principles of Tissue Engineering)、ランザ(Lanza)ら(編)、第二版、アカデミックプレス(Academic Press)、サンディエゴ、カリフォルニア州、2000にも記載されている。この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0062】
図5Bのアレイが長さ6cm、そして高さ500μm、厚さ50μm、プレート間の距離20μmのプレートから成ると仮定すると、細胞付着に利用できる面積は6×10-5m2/プレートである。従って、フットプリントが100μm2の細胞を2×109個収容するのに必要なプレート数は8.3×103枚である。このようなアレイが占める総面積は340cm2である。これは6.8cm2のアレイを50個使用することと等価であり、よって全体が占める体積は3.39mLより少なく、非常に小さな体積である。
【0063】
図6は、図1B、2B、3Bの実施形態等を製造するのに適した、本発明の一実施形態に係る例示的なプロセスフローである。ステップS6100では、少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生できる或いは産生するように工作された細胞を単離する。少なくとも一種の血管新生誘導因子を供給できる或いは供給するように作られる細胞は数種類あるが、本発明の好ましい実施形態においては、量的に血管新生誘導因子を提供するために筋芽細胞を単離した後に工作する。
【0064】
一実施形態においては、筋芽細胞を次のようにして単離する。視認できる結合組織を有しない新鮮なヒト筋肉組織(0.1〜0.5g)をPBS+AA(ギブコ(Gibco)社)で3回洗浄し、約1〜2mm3の断片に細断し、35〜40mLの細胞カクテル(コラゲナーゼタイプII 0.1%;トリプシン 0.025%;ディスパーゼ 1ユニット/mL)中で穏やかに振とうしながら37℃で20分間分解させる。分解後、組織断片を緩やかな遠心分離(例えば100rpmで2分)によりペレット化する(pelleted)。次に、上清を新しいチューブに移し、トリプシン阻害剤(PBS中0.25mg/mL)を加え、得られた溶液を氷冷下保管する。次に、上清中の細胞を500g、10分間の遠心分離により得る。得られた細胞ペレットをMCDB131に再度懸濁させ、800gで5分間スピンダウンする。再び、細胞ペレットをMCDB131に懸濁させ、800gで5分間スピンダウンする。次に、細胞ペレットを5mL骨格筋芽細胞成長培地(EGF 5μg/500mL;インスリン 50mg/500mL;BSA 250mg/500mL;フェチュイン 250mg/500mL;デキサメタゾン 0.2mg/500mL;AA(ギブコ) 5mL/500mL)に懸濁させ、総細胞数を細胞計数により測定する。その後、細胞をゼラチンコートした25mmTフラスコ(T−25フラスコ)に入れ、1〜1.5時間37℃でインキュベートする。次に、付着していない細胞を含む培地を新鮮な骨格筋芽細胞成長培地と交換する。細胞が80%コンフルエントになるまで3日置きに培地交換を行う。通常、これに約3週間必要である。一般に、この方法で単離した細胞の95%は筋芽細胞である。必要であれば、得られた細胞を、繊維芽細胞特異的モノクローナル抗体を用いてセルソーティングにより更に精製することができる。
【0065】
筋芽細胞は、例えば胎児組織から単離することもできるし、市販の装置(例えば、米国特許第5437994号、第5605822号、第5763266号、第5459069号公報に記載されているAASTROMREPLICELLシステム等、これら公報全ての内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)を用いて、米国特許第5733727号公報(この公報の内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)に記載の技法によりex vivoで産生された幹細胞から誘導することもできる。
【0066】
これに替わる筋芽細胞の単離方法については米国特許第5919449号公報に記載されており、この公報の内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0067】
ステップS6200では、単離細胞は血管新生誘導因子を供給するようにされる。これは、例えば、血管新生誘導因子を分泌するように単離細胞に形質導入することにより行うことができる。ベクターは、ウィルス性でも非ウィルス性でもよく、任意の種類のベクターを用いることができる。ウィルス性のベクターとしては、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター等が挙げられる。一実施形態においては、MoMLVの誘導体であるLXSNレトロウィルスベクターを用いることができる。ヒトVEGF165完全長cDNA(995bp、EcoR I 断片)は、LXSNのMCS内のEcoR I部位に挿入できる。ヒトVEGFの発現は、MoMLVの長い5’末端反復配列により制御できる。ネオマイシン遺伝子は、哺乳類細胞の選択マーカーとしてSV40の下流にクローニングすることができる。ヒトVEGF完全長cDNAを含むphVEGF.21プラスミドはジェネンテック(Genentech)社から入手できる。図7にこれを示す。プラスミドLhVEGF165SNは、DOTAPリポソームトランスフェクション試薬(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim))と共に一晩インキュベーションすることにより、アンフォトロピック細胞株PA317にトランスフェクションすることができる。耐性クローンはG418(1mg/mL)中で選択することができ、最終クローンは高いウィルス力価とhVEGFの産生に基づいて選ばれる。最も高力価のアンフォトロピック産生株(約1×106コロニー形成単位/mL)を、ヒト筋芽細胞の感染に用いることができる。初期培養し50%コンフルエントとなったヒト筋芽細胞を、上記の組換えウィルスを用いて形質導入(6回まで)に付すことができる。各T−25フラスコを、8μg/mLのポリブレン存在下、5mLのウィルス含有無血清筋芽細胞成長培地に曝露することができる。最終感染後、細胞を1:3に分け500μg/mLのG418中で選択できる。G418耐性筋芽細胞は、無血清筋芽細胞成長培地において増殖できる。ヒトVEGF抗原はELISAにより測定でき、その機能はin vitroの血管新生誘導アッセイにより測定できる。この方法では、hVEGF産生速度は、約500〜1000ng/106細胞/日である。
【0068】
筋芽細胞をトランスフェクションする別の方法、即ちVEGFの165個のアミノ酸のアイソフォームをコードするネーキッドプラスミドDNAをIM注入する方法が、Y.ツルミらにより基礎科学レポート94(Basic Science Reports 94)、3281〜3290頁、1996に記載されている。この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。簡単に説明すると、組換えヒトVEGF165のための相補的DNAクローンをHL−60白血病細胞から調製されたcDNAライブラリーから単離し、真核性発現プラスミドに組込む。このプラスミドは、VEGF発現を推進するために736bpのCMVプロモーター/エンハンサーを用いるものである。SV40ポリアデニレーション配列をVEGFのcDNAの下流に配置できる。幾つかの実施形態においては、このプラスミドの中に、72bpの繰り返し部を含むSV40起源の複製物を含む断片が含まれ得るが、この配列はSV40T抗原の非存在下では(自律的複製に)機能的に関連していない。これら断片は、pUC18ベクター内に存在する。pUC18ベクターは、大腸菌起源の複製物とアンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。この構成(phVEGF165)でトランスフェクションした細胞から分泌されたVEGFの生物学的活性は、トランスフェクションした293個のヒト細胞で調整した培地が毛細血管内皮細胞の増殖を促進するという証拠により確認できる。
【0069】
これとは別の方法として、血管内皮成長因子121cDNAをコードするアデノウィルス(Ad)ベクター(AdGV VEGF121.10)を用いて筋芽細胞をトランスフェクションする方法が、S.R.ペーテル(Patel)らによりヒト遺伝子治療(Human Gene Therapy)10、1331〜1348頁、1999に記載されている。この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0070】
筋芽細胞をトランスフェクションする更に別の方法が、米国特許第5733727号公報に記載されており、この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0071】
好ましい実施形態においては、形質導入された筋芽細胞により産生される血管新生誘導因子はVEGF165である。これには幾つかの理由がある。例えば、ヒトVEGF遺伝子は血管形成のための幾つかの哺乳類モデルにおいてin vivoで使用されたことがあるが、免疫原性応答については報告されていない。更に、VEGFの受容体は殆ど血管内皮細胞のみに存在するため、VEGFは非常に高い特異性を有することが示されている。当然他の血管新生成長因子も本発明において使用でき、例えば、血管内皮成長因子(VEGF)の他のアイソフォーム、アンジオポエチン、繊維芽細胞成長因子(FGF)等が挙げられる。VEGFは、内皮に対する作用の特異性や血管透過性を高める能力を有するため、好ましい因子である。ヒトVEGF遺伝子は8個のエクソンで構成されており、選択的エクソンスプライシングにより121個、165個、189個及び206個のアミノ酸の4種類の分子種が作られる。VEGF165は、正常な細胞が産生する優勢な分子基であり、各種VEGFの最も良い(分泌され拡散可能であるという点で)ブレンドであるが、細胞外マトリックス(ECM)に対しては適度に結合するだけである。
【0072】
本発明に用いるための他の血管新生誘導因子としては、血小板由来内皮細胞成長因子、アンギオゲニン(angiogenin)、塩基性及び酸性の繊維芽細胞成長因子(それぞれヘパリン結合成長因子I及びIIとしても知られている)、形質転換成長因子β、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子−18、ブチリルグリセロール、プロスタグランジンPGE1及びPGE2、ニコチンアミド、アデノシン、(12R)−ヒドロキシエイコサトリエン酸、オカダ酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0073】
ステップS6300では、形質導入した細胞を、図1A、2A、3Aの例示的カプセル化/捕捉体112等のカプセル化/捕捉体内に播種する。播種は次のようにして行うことができる。ゼラチンコートした皿上に成長した感染ヒト筋芽細胞をPBSですすぎ洗いし、トリプシン処理して血球計数器で計数した後、遠心分離を行い、0.3%フィブリノゲンを含有する無血清筋芽細胞成長培地5mLに再懸濁する。これにより、これまで得られた濃度は約1×107細胞/mLであった。その後、このような細胞懸濁液を濃縮することができる。濃縮は、カプセル化/捕捉体112の開放部113及び/又は114を通して懸濁液を加圧押出す(pressure driving)ことにより成長培地を除去することにより行う。このとき、他の開放部は蓋をされているものとする。
【0074】
十分な供給量の血管新生誘導因子を提供できる細胞がカプセル化されていない図3A、3B、3Cに記載した実施形態等の実施形態では、通路122を単純に細胞懸濁液の中に置くことができる。
【0075】
濾過及び/又はゲル化の後、得られたカプセル化/捕捉体112にトロンビン(0.3ユニット/mL)を含む無血清筋芽細胞成長培地を補充する及び/又はカプセル化/捕捉体112を該培地で濯ぐ。その後、37℃のインキュベータ中に30分間置き、カプセル化/捕捉体112の内側及び/又は外側にフィブリングルーを形成する。
【0076】
上に述べたように、バイオ人工濾過デバイスの他の幾何配置でも使用できるため、細胞を固定及び/又は捕捉するための他のプロトコルが必要となる場合がある。例えば、113部分及び/又は114部分が閉止している場合には、懸濁液を、例えば押出成形したポリマーカプセル、コラーゲンゲルモノリス及び/又は所望の幾何形状に注入成形された微小球体に入れることができる。市販のコラーゲンゲル製品としてはGELFOAM(アップジョン(UpJohn)から入手可能)が挙げられる。
【0077】
ステップS6400では、播種した細胞を必要に応じて増殖させる(expanded)。これは、カプセル化/捕捉体112に、開放部123に接続している管を通して筋芽細胞成長培地を灌流させることにより行うことができる。培地の循環は、カプセル化/捕捉体112の性質や幾何形状に応じた流速でポンプにより行うことができる。カプセル化/捕捉体112は、一実施形態では、37℃、5%CO2の加湿インキュベータ内で保管しておき、培地を3日毎に取り替える。細胞の生存性の監視は、所望であれば、乳酸塩生成を測定することにより行うことができる。
【0078】
ステップS6500では細胞を分化させる。一実施形態においては、細胞は筋芽細胞であり、形態学的分化(単核筋芽細胞の多核筋管への融合)を、顕微鏡下で生細胞で見ることができるか或いは必要な場合は細胞を固定して染色した後に見ることができる。更に、培地において筋管の単収縮が自発的に観察されるが、単収縮はアセチルコリンにより増加させることができる。まず細胞を増殖培地内のゼラチンコートしたディッシュ上に約105細胞/35mmディッシュの密度で置く。細胞を数日間成長させる。自発的な分化は、増殖培地中で約5〜8日間成長させた後に頻繁に見られるが、4〜5日間成長させた後、細胞に48〜72時間分化培地を与えることにより分化を刺激することができる。よく使用されている分化培地は2%ウマ血清及び10μg/mLのインスリンを添加したDMEM培地である。インスリンはこの濃度において、分化に対して積極的なIGFの作用を擬似する。筋芽細胞から筋管への転化は、ルーコスタット(Leucostat)染色キット(Cat.CS430D、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific))を用いた染色により記録できる。自然発生的に単収縮(筋芽細胞の分化に特有の挙動)が観察できるが、アセチルコリンの酢酸緩衝液(pH4.0)を終濃度1mMになるまで加えることによりこの単収縮は典型的なものとなる。
【0079】
ステップS6600では、デバイスをレシピエントに埋め込む。一例示的実施形態においては、図4Aや図4Bに示したもので50組を超える中空ファイバーを含むプロトタイプが調製され、同源のフィブリンクロットに包まれ、レシピエントの皮下、腹腔又は後腹膜腔に設けられる。いくつかの実施形態においては、通路122は、皮下でトンネルを形成し、腹腔透析チューブや回収バッグと流体連通関係になるように設けられる。これは好ましい。というのは、腹腔透析チューブは、バッグの交換における殺菌性を保ち感染を最小限にするために腹腔透析用に設計されたUVフラッシュ技法を用いて24時間毎に回収され新しい排液バッグと交換されるためである。別の例示的実施形態においては、インプラントに用いる形質導入された筋芽細胞から排出口を介してVEGF含有培養上清を毎日注入することにより、毛細血管の内部成長を誘導することができる。培養液は多量のVEGFを含むため、デバイスに筋芽細胞を導入する前にインプラントの血管形成を最大のものとするのを助けることができる。これは、未準備の皮下床への埋込みや腹腔への埋込みにより、低酸素状態による筋細胞壊死が起こってしまうような場合に好ましい。
【0080】
インプラントの機能についての性能評価は、濾過液の体積を24時間毎或いは必要に応じて測定することにより行うことができる。濾過液の解析は更に、タンパク質電気泳動により電解質やBUN、クレアチニン、アルブミンの含量についても行われる。アルブミンに対する選択透過性は、デバイスに用いる排液中空ファイバーの種類を評価するための重要なファクターとなる。例えば、アルブミンが多量に失われていることが観察された場合には、通路122を、MWCOが40000〜60000のポリスルホンやポリアクリロニトリル製の従来の血液濾過ファイバーに換えることができる。大型動物において達成される濾過液の流速は約2〜4mL/分である。
【0081】
本発明に係るインプラント近傍において血管形成を誘導及び/又は維持するために細胞200により供給される血管新生誘導因子の十分な供給は数種類のファクターに依存している。このようなファクターとしては、血管新生誘導因子の性質や数、バイオ人工濾過デバイスの幾何形状、透過性中空ファイバー100の通路122及びカプセル化/捕捉体112の透過性や化学的構造、透過性中空ファイバー100内及び透過性中空ファイバー100上における細胞成長及び/又は細胞付着を促進するための有機成分の性質、体内に埋め込まれたバイオ人工濾過デバイスの位置(J.A.トンプソン(Thompson)ら、Science241、1349〜1352頁、1988、この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)、バイオ人工濾過デバイスを埋込む前の領域に血管新生誘導因子を事前に投与したか否か、透過性中空ファイバー100の通路122に濾過液を至らしめる圧力勾配がある場合はその圧力勾配等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0082】
血管内皮成長因子(VEGF)を用いる例示的実施形態においては、周囲の組織における該因子の好ましい濃度は生理学的に有効な範囲0.01〜10ng/mL、更に好ましくは0.1〜5ng/mLである。
【0083】
hVEGFの好ましい供給速度は、ヴァイア(Weir),G.C.らにより細胞移植(Cell Transplantation)9,115〜124頁、2000(この内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する)に記載されているように、5〜50000ng/日、より好ましくは50〜5000ng/日、最も好ましくは100〜1000ng/日である。
【0084】
血管新生誘導因子として塩基性の筋芽細胞成長因子を用いる実施形態においては、周囲の組織における該因子の好ましい濃度は生理学的に有効な範囲0.01〜10ng/mL、より好ましくは0.1〜1ng/mLである。Amicon DIAFILTER MINIFILTERから形成され血液の入口が蓋をされているバイオ人工濾過デバイスの場合、該デバイスにより約10〜50mL/日の濾過液が回収されるときには、塩基性筋芽細胞成長因子の好ましい供給速度は、0.1〜1000ng/日、より好ましくは1〜500ng/日、最も好ましくは10〜100ng/日である。
【0085】
図8は、本発明の第二の実施形態に係る例示的プロセスフローである。ステップS8100では、血管形成を誘導及び/又は維持するために十分な量の血管新生誘導因子を供給できる細胞は簡単に入手される。例えば、ベンダーから購入した形質導入済みの細胞とすることができるし、本発明を実施するために十分な量の少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する細胞株とすることができる。ステップS8200では、細胞を播種する。これは実質的には図6のステップS6300に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。ステップS8300では、細胞を増殖させる。これは実質的には図6のステップS6400に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。ステップS8400では、細胞を分化できる。これは実質的には図6のステップS6500に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。ステップS8500では、デバイスを埋め込む。これは実質的には図6のステップS6600に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。
【0086】
図9は、本発明の第三の実施形態に係る例示的プロセスフローである。ステップS9100では、血管形成を誘導及び/又は維持するために十分な量の血管新生誘導因子を供給できる細胞は簡単に入手される。例えば、ベンダーから購入した形質導入済みの細胞とすることができるし、本発明を実施するために十分な量の少なくとも一種の血管新生誘導因子を産生する細胞株とすることができるし、或いは同じ特性を有する成熟細胞とすることもできる。ステップS9200では、細胞を播種する。これは実質的には図6のステップS6300に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。ステップS9300では、デバイスを埋め込む。これは実質的には図6のステップS6600に関して説明したプロトコルに適切な変更を加えて行う。従って、細胞の増殖がin vivoで起こるため本発明の使用者による特別の行動は必要ない場合がある。同様に、選択した細胞株及び/又は埋込み位置の場合には、分化は自発的に起こるか或いは必要でない場合さえある。
【0087】
図10は、例えば図1C、図2C、図3Cに示した実施形態を作成するのに適した、本発明の一実施形態にかかる例示的プロセスフローである。これらの実施形態では、第二の細胞産物を供給できる第二の細胞株を本発明に係るインプラント内又はインプラントの回りに固定する。ステップS10100では、第一の細胞(即ち、インプラント近傍において血管形成を誘導及び/又は維持するために十分な量の一以上の血管新生誘導因子を供給できる又は供給するようにされた細胞)を単離する。この単離は、実質的には図6のステップS6100に関する説明に従って行うことができる。次に、単離した細胞は、実質的にはステップS6200に関する説明に従って、少なくとも一種の血管新生誘導因子の産生を誘導するように形質導入される。ステップS10300では第二の細胞株を単離し、ステップS10400では第二の細胞による別の細胞産物の産生を誘導する。誘導は、例えば、第二の細胞産物をコードするDNAを第二の細胞に形質導入することにより行うことができる。本発明に係る、第二の細胞株の単離と細胞産物の産生誘導は本技術分野において知られており、例えば、米国特許第5639275号、第5656481号、第5550050号、第5653975号、第5676943号、第5773286号、第5795790号の各公報に記載されているものが挙げられる。これら各公報の内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。ステップS10500において、第一の細胞と第二の細胞の両方がインプラントに播種される。これは実質的には図6のS6300に関して説明したプロトコルに必要に応じて(例えば第二の細胞の挙動に応じて)変更を加えて行うことができる。ステップS10600では、必要に応じて両細胞を増殖させる。これは実質的には図6のS6400に関して説明したプロトコルに必要に応じて(例えば第二の細胞の挙動に応じて)変更を加えて行うことができる。ステップS10700では、細胞を分化させる。これは実質的には図6のS6500に関して説明したプロトコルに必要に応じて(例えば第二の細胞の挙動に応じて)変更を加えて行うことができる。ステップS10800では、デバイスを埋込む。これは実質的には図6のS6600に関して説明したように行うことができる。
【0088】
図11は、例えば図1C、図2C、図3Cに示した実施形態を作成するための、本発明の第二の実施形態にかかる例示的プロセスフローである。これらの実施形態では、第二の細胞産物の供給等の治療として有用な機能を提供できる種類の第二の細胞を本発明に係るインプラント内及び/又はインプラントの回りに固定する。この場合、第二の細胞は、ステップS11300において、例えば第三者のベンダーから簡単に入手するか及び/又はドナーから単離する。従って、図10のステップS10200に関して説明したような第二の細胞産物の産生誘導は、このベンダーにより実施されるか或いは必要でない場合さえある。第二の細胞がステップS11400において播種されてしまえば、第二の細胞の増殖及び/又は分化は必要でないか、in vivoで自発的に進み、本発明を実施する側では何ら特別な行動を必要とされないこともある。ステップS11200における第一の細胞の形質導入、ステップS11500における第一の細胞の増殖、ステップS11600における第一の細胞の分化、及びステップS11700におけるデバイスの埋込みは、実質的には図6のS6200、S6300、S6500及びS6600に関して説明したプロトコルに、第二の細胞の存在を考慮して必要に応じて変更を加えて行うことができる。
【0089】
図11のプロセスフローは、図8及び図9において説明したように埋込み前に第一の細胞が用意される場合を考慮して変更することもできる。
【実施例】
【0090】
本発明を概略的に説明してきたが、具体的な例を参照することにより更に理解が深まるであろう。該具体例は説明のためのものであって、特に記載のない限り本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1
【0091】
立体リソグラフィー(stereolithography)は、自由な形状の固体を製造する特有でパワフルな技法であり、埋込み可能な血液濾過デバイス(1)〜(5)の反復的な調査や開発に用いられる。立体リソグラフィー装置(SLA)を用いることにより、費用のかかる設備を必要とすることなく迅速に且つ正確に多くの異なる種類の血液濾過器の形状を設計し製造することが可能になるであろう。
【0092】
一般的な方法は、SLAにおいて、微細多孔質の中空ファイバーのはっきりと画定された配置を支持するための一連の可撓性バックボーンを構成することであろう。これらの中空ファイバーは、血管新生成長因子を含む遺伝子改変された細胞をカプセル化するのに役立つか、又は、血液濾過液収集ダクトとして役立つ。このようなデバイスの設計を図12に示す。複数の対のファイバーが互いに平行に配置され、薄いファイバーバックボーン上の所定の位置に固定されている。各交互のファイバーは接着剤により蓋をされ、図12に示すような血液濾過液・血管新生の組み合わせた指のような(interdigitated)形のアレイとなっている。
【0093】
2種類のデバイスの設計物を組合せたものを図13に示す。市販のコンピュータ補助製図パッケージ(CAD)を用いて、2種類の試作ファイバーバックボーン設計物の電子図面を作成した。これを図13に示す。どちらのCAD設計物も、ファイバーの正確な配置を確実にするためにバックボーンの端部に沿ってスペーサーブロックを用いている。図面の左側の設計は、血管新生・血液濾過ファイバーの端部を単一の収集点に注意深く経路指定することによるものである。図面の右側の設計は、両方の種類のファイバーに対してコンパクトなマニホールド組立体を使用している。これらの試作品は、UV硬化エポキシ樹脂で形成した。これに替わって使用できる材料としては数種類の材料が将来のデバイスの創作のために存在する。例えば、市販の医療グレードのシリコーンや医療グレードの硬化性ポリウレタン樹脂を用いて直接的なSLAを行うことが挙げられる。SLAマシーンには無限の用途と再現性があるため、バイオ人工腎臓インプラントの遂行を成功させるために重要な組織工学上の各種問題を見極め研究することが可能になるであろう。
【0094】
参考文献
(1)P.F.ヤコブス(Jacobs)、立体リソグラフィー及び他のRP&M技法、迅速なプロトタイプ化から迅速な設備化まで(Stereolithography and other RP&M Technologies、From Rapid Prototyping to Rapid Tooling)、ASME出版(ASME Press)、ニューヨーク、ニューヨーク、1996
(2)S.E.ファインバーグ(Feinberg)、S.J.ホリスター(Hollister)、J.W.ハロラン(Halloran)、G.チュー(Chu)、P.H.クレブスバック(Krebsbach)、「顎関節の再構成におけるバイオミメティックの役割(Role of Biomimetrics in Reconstruction of the Temporomandibular Joint)」、北米の口腔外科及び顎顔面外科の臨床(Oral and Maxillofacial Surgery Clinics of North America)、Vol.12、No.1、149〜160頁、2000年2月
(3)G.T−M.チュー(Chu)、G.A.ブラディ(Brady)、W.ミアオ(Miao)、J.W.ハロラン(Halloran)、S.J.ホリスター(Hollister)、D.ブレイ(Brei)、「直接的及び間接的立体リソグラフィーによるセラミックSFF(Ceramic SFF by Direct and Indirect Stereolithography)」、固体自由形状及び付加的製造(Solid Freeform and Additive Fabrication)、編集 D.ディモス(Dimos)、S.C.ダンフォース(Danforth)とM.J.シマ(Cima)、MRSシンポジウム講演集(MRS Symposia Proceedings)、Vol.542、119〜123頁、1999
(4)G.A.ブラディ(Brady)とJ.W.ハロラン(Halloran)、「立体リソグラフィーによるセラミックの固体自由形状の製造(Solid Freeform Fabrication of Ceramics via Stereolithography)」、海軍研究レビュー(Naval Research Reviews)、海軍研究事務所(Office of Naval Research)、39〜43頁、3/1998、Vol.L、1998
(5)M.L.グリフィス(Griffith)、C.T−M、チュー(Chu)、W.ワグナー(Wagner)、J.W.ハロラン(Halloran)、「インベストメント注型法のためのセラミック立体リソグラフィーと生物医学的応用(Ceramic Stereolithography for Investment Casting and Biomedical Applications)」、固体自由形状製造手順(Solid Freeform Fabrication Proceedings)、編集J.J.ビーマン(Beaman)、J.W.バーロー(Barlow)、オースティン(Austin)、TX、SFFシンポジウム、31〜36頁、1996
【0095】
上の教示に照らすと、本発明の各種の変更や変形が可能であることは明らかである。従って、本発明は、添付の請求項の範囲内において、本明細書に具体的に記載したもの以外であっても実施できることと理解される。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1A】例示的なダブル中空ファイバーを示す。
【図1B】図1Aのダブル中空ファイバーの一実施形態の例示的断面図であり、二本のファイバーの内の一方が血管新生誘導因子を産生する細胞を含んでいる状態を示す。
【図1C】図1のダブル中空ファイバーの第二の実施形態の例示的断面図であり、一方の中空ファイバーは血管新生誘導因子を産生する細胞を含み、第二の中空ファイバーは治療的機能を果たす(例えば、別の分子産物を産生する等の)細胞を含んでいる状態を示す。
【図2A】血管新生誘導因子を産生する細胞を含む一以上のカプセル化/捕捉体に囲まれた例示的な中空ファイバー通路を示す。
【図2B】図2Aの中空ファイバー通路及びカプセル化/捕捉体の例示的断面図であり、カプセル化/捕捉体が血管新生誘導因子を産生する細胞を含んでいる状態を示す。
【図2C】図2Aの中空ファイバー通路及びカプセル化/捕捉体の例示的断面図であり、カプセル化/捕捉体は血管新生誘導因子を産生する細胞を含み、中空ファイバー通路は治療的機能を果たす(例えば、別の分子産物を産生する等の)細胞を含んでいる状態を示す。
【図3A】血管新生誘導因子を産生する細胞に囲まれている例示的中空ファイバー通路を示す。
【図3B】血管新生誘導因子を産生する細胞に囲まれている図3Aの中空ファイバー通路の例示的断面図を示す。
【図3C】図3Aの中空ファイバー通路の例示的断面図であり、該通路が、血管新生誘導因子を産生する細胞に囲まれていると共に、治療的機能を果たす(例えば、別の分子産物を産生する等の)細胞を含んでいる状態を示す。
【図4A】埋込み用に配置された複数の図1Aのダブル中空ファイバーの例示的配置を示し、複数の中空ファイバー通路がマニホールドを介して互いに流体連通関係にあり、該マニホールドはマニホールド出口孔に接続している状態を示す。
【図4B】埋込み用に配置された複数の図1Aのダブル中空ファイバーの例示的配置を示し、複数の中空ファイバー通路が互いに流体連通関係にあると共に共通の出口で一緒になる状態を示す。
【図5A】第二のインプラントと連続して配置されている例示的血液濾過ユニット(図4Bに示したもの等)を示し、第二のインプラントが、限外濾過液を処理する細胞や、産物の輸送媒体として或いは酸素や栄養の主要な供給源として限外濾過液を利用している細胞を含む状態を示す。
【図5B】図5Aに示した第二のインプラントの例示的詳細図であり、このインプラントでは、足場依存性細胞の付着のために平行プレートのアレイの表面積/体積比が高くなることを示している。
【図6】図1B、図2B、図3Bに示した実施形態のもの等を製造するための、本発明の一実施形態に係る例示的プロセスフローである。
【図7】本発明の一実施形態に係るヒトVEGF165cDNAを含む例示的SNレトロウィルスベクターを示す。LXSNレトロウィルスベクターはMoMLV由来のものである。ヒトVEFG165完全長cDNA(995bp、EcoR I断片)はLXSNのMCSのEcoR I部位に挿入した。ヒトVEGFの発現は、MoMLVの長い5’末端反復配列により制御される。ネオマイシン遺伝子は、哺乳類細胞の選択マーカーとしてSV40プロモーターの下流にクローニングされる。ヒトVEGF完全長cDNAを含むPhVEGF.21プラスミドは、ジェネンテック社(Genentech, Inc)から入手した。
【図8】図1B、図2B、図3Bに示した実施形態のもの等を製造するための、本発明の第二の実施形態に係る例示的プロセスフローである。
【図9】図1B、図2B、図3Bに示した実施形態のもの等を製造するための、本発明の第三の実施形態に係る例示的プロセスフローである。
【図10】図1C、図2C、図3Cに示した実施形態のもの等を製造するための、本発明の一実施形態に係る例示的プロセスフローである。
【図11】図1C、図2C、図3Cに示した実施形態のもの等を製造するための、本発明の第二の実施形態に係る例示的プロセスフローである。
【図12】血液濾過器設計手法(ファイバーバックボーン上に交互に設けられた微小多孔質の中空ファイバー)を示す。
【図13】立体リソグラフィーによるバックボーンと微小多孔質の中空ファイバーとから組み立てられた2種類のバイオ人工腎臓試作品を示す。
【符号の説明】
【0097】
100 透過性中空ファイバー
112 カプセル化/捕捉体
122 導管
450 マニホールド出口
500 組織工学構築物、バイオリアクター
Claims (95)
- 埋込み可能な血液濾過デバイスであって、
インプラント本体と、
第一の細胞と
を含み、第一の細胞が少なくとも一種の血管新生誘導産物を産生するデバイス。 - 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体が第一の表面を有し、第一の細胞が前記第一の表面に支持されているデバイス。
- 請求項2に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の表面がインプラント本体の外側にあるデバイス。
- 請求項2に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の表面がインプラント本体の内側にあるデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体が内部空間を有し、第一の細胞が前記内部空間内にあるデバイス。
- 請求項4に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体が、多孔質のカプセル化体又は捕捉体を含むデバイス。
- 請求項6に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質のカプセル化体が管状の形体であるデバイス。
- 請求項6に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質のカプセル化体が多孔質ポリマーで形成されているデバイス。
- 請求項8に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質ポリマーがポリプロピレン、ポリスルホン、セルロース系ポリマー、セルロースアセテート、レーヨン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフルオロエチレン、アルギネート及びキトサンからなる群から選択される少なくとも一種のものを含むデバイス。
- 請求項5に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体が多孔質のカプセル化体を含むデバイス。
- 請求項10に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質のカプセル化体が管状の形体であるデバイス。
- 請求項10に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質のカプセル化体が多孔質のポリマーで形成されているデバイス。
- 請求項12に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、多孔質のポリマーがポリプロピレン、ポリスルホン、セルロース系ポリマー、セルロースアセテート、レーヨン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフルオロエチレン、アルギネート及びキトサンからなる群から選択される少なくとも一種のものを含むデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体がガラス、金属、セラミック及びポリマーからなる群から選択される少なくとも一種の材料で形成されているデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体がポリプロピレン、ポリスルホン、セルロース系ポリマー、セルロースアセテート、レーヨン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリフルオロエチレン、アルギネート及びキトサンからなる群から選択される少なくとも一種のポリマーで形成されているデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、血管新生誘導産物が血管内因性成長因子であるデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の細胞が、血管新生誘導産物をコードする核酸配列でトランスフェクションされているデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の細胞が筋芽細胞であるデバイス。
- 請求項18に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、筋芽細胞が筋管を形成するデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の細胞が有機成分によりインプラント本体に支持されているデバイス。
- 請求項20に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、有機成分がフィブリングルーを含むデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、更に第二の細胞を含むデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞が、血管新生誘導産物の産生以外の機能を有するデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞が治療的機能を有するデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞が治療に有用な物質を産生するデバイス。
- 請求項25に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、治療に有用な物質がホルモンであるデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞がインスリンを産生するデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞が遺伝子改変されたものであるデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第二の細胞が代謝活性を有するデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体と流体連通関係にある少なくとも一個の通路を有するデバイス。
- 請求項30に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、前記通路を複数有するデバイス。
- 請求項31に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、前記複数の通路が共通の出口に接続されているデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、被験者に埋込まれているデバイス。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、被験者に埋込まれているデバイス。
- 請求項33に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の細胞が被験者と同源であるデバイス。
- 請求項34に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、第一の細胞が被験者と同源であるデバイス。
- 請求項33に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体と流体連通関係にある複数の通路を更に含み、該通路が共通出口と、経皮口と、前記共通出口を経皮口に接続している管とに接続しているデバイス。
- 請求項34に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラント本体と流体連通関係にある複数の通路を更に含み、該通路が共通出口と、経皮口と、前記共通出口を経皮口に接続している管とに接続しているデバイス。
- 請求項37に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、経皮口がポンプに取り付けられる構成となっているデバイス。
- 請求項38に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、経皮口がポンプに取り付けられる構成となっているデバイス。
- 請求項33に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラントと流体連通関係にある少なくとも一個の通路を更に含み、該通路は被験者の体腔に接続しているデバイス。
- 請求項34に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、インプラントと流体連通関係にある少なくとも一個の通路を更に含み、該通路は被験者の体腔に接続しているデバイス。
- 請求項41に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、体腔が腹腔又は尿管であるデバイス。
- 請求項42に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、体腔が腹腔又は尿管であるデバイス。
- 請求項33に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、患者内にある第二のインプラントに接続されているデバイス。
- 請求項34に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、患者内にある第二のインプラントに接続されているデバイス。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、第一の細胞とインプラント本体を結合(combining)する段階を含む方法。
- 請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、第一の細胞をインプラント本体の表面に支持する段階を含む方法。
- 請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、第一の細胞と、第二の細胞と、インプラント本体とを結合する段階を含む方法。
- 埋込まれたときに血管形成を維持することができる埋込み可能な血液濾過デバイスを製造する方法であって、
血管新生誘導産物を放出できる第一の細胞を得る段階と、
第一の細胞をインプラント本体に組み合わせる段階と
を含み、第一の細胞は、埋込み可能な血液濾過デバイスを埋込んだ後、該デバイスの周囲に血管新生誘導産物を放出できるものである方法。 - 請求項50に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
第一の細胞をインプラント本体の表面に播種する段階
を含む方法。 - 請求項50に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
第一の細胞をインプラント本体の表面に又はインプラント本体内に固定する段階
を含む方法。 - 請求項50に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
インプラント本体の表面を、該表面への第一の細胞の付着を容易にするように構成された有機成分で覆う段階と、
インプラントの表面に第一の細胞を付着させる段階と
を含む方法。 - 請求項50に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
第一の細胞を、分化した第一の細胞に変換する段階
を含む方法。 - 請求項54に記載の方法であって、分化した第一の細胞が筋管を形成するものである方法。
- 請求項50に記載の方法であって、得る段階が更に、
第一の細胞を単離する段階
を含む方法。 - 請求項50に記載の方法であって、得る段階が更に、
第一の細胞を、血管新生誘導産物をコードする核酸配列でトランスフェクションする段階
を含む方法。 - 請求項57に記載の方法であって、トランスフェクションする段階が、
血管新生誘導産物をベクターにコードさせる段階と、
第一の細胞をベクターに曝露する段階と
を含む方法。 - 請求項58に記載の方法であって、ベクターがウィルスベクターである方法。
- 請求項58に記載の方法であって、ベクターが非ウィルスのベクターである方法。
- 請求項58に記載の方法であって、ベクターがアデノウィルスベクターである方法。
- 請求項50に記載の方法であって、血管新生誘導産物が血管内皮成長因子である方法。
- 請求項50に記載の方法であって、更に、
第一の細胞を増殖させる段階
を含む方法。 - 請求項50に記載の方法であって、更に、
血液濾過デバイスをレシピエントに埋込む段階
を含む方法。 - 請求項64に記載の方法であって、血液濾過デバイスが皮下に及び/又は腹膜に埋込まれる方法。
- 請求項64に記載の方法であって、血液濾過デバイスが後腹膜腔に埋込まれる方法。
- 請求項50に記載の方法であって、更に、
血管新生誘導産物を産生する以外の機能を有する第二の細胞を得る段階と、
第二の細胞をインプラント本体と組み合わせる段階と
を含む方法。 - 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞を組み合わせる段階が、第二の細胞を、インプラント本体の第二の表面に播種する段階を含む方法。
- 請求項67に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
第二の細胞を、インプラント本体の第二の表面上に又はインプラント本体内に固定する段階
を含む方法。 - 請求項67に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
インプラント本体の第二の表面を、該表面への第二の細胞の付着を容易にするように構成された有機成分で覆う段階と、
第二の細胞をインプラントの第二の表面に付着させる段階と
を含む方法。 - 請求項67に記載の方法であって、組み合わせる段階が、
第二の細胞を、分化した第二の細胞に変換する段階
を含む方法。 - 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞が治療的機能を有する方法。
- 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞が治療的に有用な物質を産生する方法。
- 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞がホルモンを産生する方法。
- 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞がインスリンを産生する方法。
- 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞が代謝活性を有する方法。
- 請求項67に記載の方法であって、第二の細胞が遺伝子改変されている方法。
- 血液濾過インプラントを製造する方法であって、
請求項1に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを被験者に埋込む段階
を含み、第一の細胞により産生された血管新生誘導産物が、インプラント近傍において血管組織の形成を誘導する方法。 - 血液濾過インプラントを製造する方法であって、
請求項22に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを被験者に埋込む段階
を含み、第一の細胞により産生された血管新生誘導産物が、インプラント近傍において血管組織の形成を誘導する方法。 - 請求項78に記載の方法であって、血液濾過インプラントが、被験者内の第二のインプラントと流体接触関係にある方法。
- 請求項79に記載の方法であって、血液濾過インプラントが、被験者内の第二のインプラントと流体接触関係にある方法。
- 埋込み可能な血液濾過デバイスであって、
インプラントの周囲において血管形成を維持する手段
を含むデバイス。 - 請求項82に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、更に、
インプラント内に収集された限外濾過液に因子を供給する手段
を含むデバイス。 - 請求項82に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、更に、
インプラントから液体を除去する手段を含むデバイス。 - 請求項82に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスであって、更に、
インプラントの周囲に第二の細胞産物を供給する手段を含むデバイス。 - 血液濾過インプラントを製造する方法であって、
請求項82に記載の埋込み可能な血液濾過デバイスを被験者に埋込む段階
を含み、該手段がインプラント近傍において血管組織の形成を誘導するものである方法。 - 濾過デバイスにより生成された限外濾過液を使用する方法であって、
被験者内に埋込まれた濾過デバイスにより生成された限外濾過液を、同じく患者内に埋込まれた組織工学構築物に送る段階
を含む方法。 - 請求項87に記載の方法であって、濾過デバイスが、インプラント本体と、少なくとも一種の血管新生誘導産物を産生する細胞とを含む方法。
- 請求項87に記載の方法であって、組織工学構築物が細胞を含み、限外濾過液が細胞に酸素と栄養を提供する方法。
- 請求項87に記載の方法であって、濾過デバイスが非生命体である方法。
- 請求項87に記載の方法であって、組織工学構築物内の細胞が治療的機能を提供する方法。
- 請求項87に記載の方法であって、組織工学構築物内の細胞が細胞産物を産生する方法。
- 請求項92に記載の方法であって、細胞産物がホルモンである方法。
- 請求項93に記載の方法であって、ホルモンがインスリンである方法。
- 請求項91に記載の方法であって、組織工学構築物内の細胞が代謝活性を有する方法。
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