JP2005507997A - Multi-parameter analysis of comprehensive nucleic acid and morphological features for the same sample - Google Patents

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Abstract

血液中で見出される稀な細胞および稀な転写体からのｍＲＮＡライブラリーの遺伝子特異的起点増幅用の方法を利用する高度に感度の良好なアッセイが開示される。該アッセイは、免疫磁気豊富化を介して単離された１ないし１０の細胞で見出される稀なｍＲＮＡ（１０コピー／細胞）の検出を可能とする。該アッセイは、多重ＰＣＲに対する改良であり、血液中の循環カルシノーマ細胞についての稀なコーディング配列の十分な検出を可能とする。該方法は、組織または体液から単離された細胞のプロファイリングで有用であり、循環腫瘍細胞の初期段階検出および分類を含めた多様なカルシノーマの臨床診断に対する付属物として働く。慣用的またはマイクロアレイ様式いずれかでの細胞の核酸および蛋白質のプロフィールのモニタリングは、ステージング、療法に対する応答のモニタリング、緩解の確認、および後退の検出を含めた治療的介入の確認を容易とする。A highly sensitive assay is disclosed that utilizes a method for gene specific origin amplification of mRNA libraries from rare cells and rare transcripts found in blood. The assay allows for the detection of rare mRNA (10 copies / cell) found in 1-10 cells isolated via immunomagnetic enrichment. The assay is an improvement over multiplex PCR and allows sufficient detection of rare coding sequences for circulating carcinoma cells in the blood. The method is useful in profiling cells isolated from tissues or fluids and serves as an adjunct to a variety of clinical diagnoses of carcinoma including early stage detection and classification of circulating tumor cells. Monitoring cellular nucleic acid and protein profiles in either conventional or microarray formats facilitates confirmation of therapeutic intervention, including staging, monitoring response to therapy, confirmation of remission, and detection of regression.

Description

【０００１】
本出願は、米国仮出願番号：６０／３６９，９４５（２００２年４月４日出願）および６０／３３０，６６９（２００２年１０月２６日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ０２／２６８６７（２００２年８月２３日出願）に対して合衆国第３５法典第１１９条（ｅ）の下に優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、腫瘍学および診断テストの分野で有用なサイトゾル生体分子の遺伝子特異的増幅、分析およびプロファイリングに関する。本発明は、化学療法処置または癌再発のための癌スクリーニング、選択およびモニタリングのごとき分野で特に有用である。さらに詳しくは、本発明は、計数および形態学的イメージ分析のために細胞完全性を同時に維持しつつ、腫瘍細胞からのｍＲＮＡおよびＤＮＡ、または生物学的試料からの他の稀な細胞の包括的分析を容易にするための方法、装置およびキットを提供する。これを達成するために、本発明は、引き続いてのまたは平行してのマルチパラメーターフローサイトメトリー、イメージ、および免疫細胞化学分析のために細胞の形態学的および抗原性特徴を依然として維持しつつ、放出された核酸の発現プロフィールを測定するための浸透化試薬によって、腫瘍細胞のごとき細胞から放出可能な可溶性サイトゾル生体分子の分析を可能とする方法も提供する（米国特許第６，３６５，３６２号参照）。また、本発明は、アルデヒドおよびアルデヒド−尿素誘導体系固定剤からの安定化された試料を用いる同包括的分析を可能とする方法を提供する。
【０００３】
関連技術の記載
いずれの与えられた細胞も、そのゲノムに存在する遺伝子の合計数のうち一部のみを発現するであろう。発現される遺伝子の合計数の一部が、発生および分化、ホメオスタシス、細胞周期調節、老化、アポトーシスなどのごとき細胞の機能の態様を決定する。遺伝子発現の改変は、正常な細胞の発生および癌のごとき病気状態の出現を決定する。特異的遺伝子の発現は、いずれかの与えられた細胞の性質に対して顕著な効果を有するであろう。従って、本発明によって提供されるもののごとき遺伝子発現を分析する方法は、基本的な分子生物学の研究および腫瘍生物学において重要である。特異的な遺伝子、特に稀な遺伝子の同定は、これらの発現レベルを反映する種々の病気についての診断、予後および治療に対する鍵を提供することができる（Ｌｅｖｓｋｙら、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９７：８３６−８４０（２００２））。
【０００４】
種々の遺伝子発現は、細胞における遺伝子発現を評価する通常に用いられる方法である。特に、ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、健康なおよび病気の個体からの細胞または器官から得られたｃＤＮＡ標的配列のレベルを比較する。次いで、これらの標的を、膜の上に固定化されたプローブ断片の組にハイブリダイズさせる。次いで、得られたハイブリダイゼーションパターンの差を検出し、二つの源の遺伝子発現の差に関連付ける（米国特許第６,３８３、749号）。この手法は、数十万の遺伝子−特異的プローブの遅いかつ時間のかかる分析を必要とする。加えて、標的配列における標的およびプローブと第二の構造との間の非相補的標的配列の非特異的結合の間の相互作用のごとき事象の比較は、信号ノイズ比の減衰をもたらすハイブリダイゼーションに干渉し得る。
【０００５】
遺伝子特異的プライマー組が、種々の発現のアッセイにおいて記載されている（米国特許第５,994,076号および米国特許第特許第６，３５２，８２９号）。ここに、遺伝子特異的プライマー組を用いて、複雑なライブラリー中のｍRNAライブラリーサブセットを特異的に増幅させ、全ライブラリー標識増幅と比較した場合に、ｃDNAアレイシグナルの改良が達成された。このタイプの分析の焦点は、遺伝子発見リサーチの一部としての試料アレイ発現プロフィールを比較するものであり、診断用途を持つ実践的な細胞RNA分析のための方法の開発を比較するものではなかった。
【０００６】
よって、遺伝子特異的プライマー組を用いて、ｍRNAライブラリーからのｍRNAの特異的サブセットを選択的に増幅させたが、定量的および定性的分析双方を含む診断療法のための稀な細胞検出で特に適用できる増幅プロセスにおいて信号ノイズ比を低下させる明らかな必要性が存在する。
【０００７】
今日、一般に、治療的介入に対する必要性の評価において初期検出システムを、患者の血液中の循環腫瘍細胞の存在が提供すると予測される。循環癌腫細胞の正確な計数を可能とするかなり感度の良いアッセイは、末梢血液腫瘍細胞負荷が病気状態と関連することを示している（Terstappenら Peripheral Blood Tumor Cell Load Reflects the Clinical Activity of the Disease in Patients with Carcinoma of the Breast International J. of Oncology, 17:573-578, 2000)。
【０００８】
加えて、細胞のタイプおよび起源の分類は、治療に対するより包括的な基本方針を提供するであろう。散在性の大きなB細胞リンパ腫（DLBCL)のごときいくつかの癌に対する緊急治療は、臨床的予後と関連する二つの異なる病気のタイプに基づく（Rosenwaldら, Use of Molecular Profiling to Predict Survival After Chemotherapy after Diffuse Large-B Cell Lymphoma, New England Journal of Medicine, 346: 1937-1947, (2002)）。DLBCLにおいて、胚中心B−細胞に由来する腫瘍は化学療法に対して感受性であり、より高い生存のチャンスを有するが、活性化されたB細胞からのものは治療するのがより困難な傾向にある。かくして、これらの細胞のサブタイプは腫瘍細胞の起源に依存する。
【０００９】
これらのサブタイプの層化は、腫瘍の起源細胞に依存する。サブタイプの差は単一遺伝子の分析によって決定することができるのは少ない場合であるが、遺伝子の組合せの全アレイはより決定的である。遺伝子発現レベルのマイクロアレイ分析を通じての遺伝子発現パターンのチャーティングは、リンパ腫、急性白血病、乳癌、肺癌および肝臓癌のごとき他の病気における腫瘍特性の望ましいインジケーターであろう。しかしながら、これを採用するためには、診断用途のための遺伝子情報は、現存の技術水準の技術においては固有のかなりの信号ノイズ比の分解を必要とする。
【００１０】
かくして、特に、そのような方法が速いハイブリダイゼーション、相補的プローブに対する標的の高度に特異的な結合、および実質的に改良された信号ノイズ比を供する場合、遺伝子発現を分析するための新しい方法の開発に対して大きな興味が持たれる。加えて、これらの方法は、遺伝子発現を評価する場合にさらなる重要性を有する。というのは、それは、癌および病気に関連する状態に関係するからである（ここに出典明示してその双方を本明細書の一部とみなす米国出願１０／０７９,９３９および米国出願０９／９０４，４７２参照）。
【００１１】
発明の概要
本発明は、前記した先行技術の不利を克服する、循環する稀な細胞から単離された増幅ｍRNAにおける遺伝子発現を評価するための方法、装置およびキットを提供する（図１参照）。本発明は、構造的細胞完全性または表現型特徴を維持しつつ、単一標的細胞または細胞集団からの可溶性または放出可能な細胞質生体分子を単離する方法を提供する。従って、細胞は新鮮であるか、または安定化されたものであり、かつ架橋剤で固定化され、ポア−形成性浸透組成物と接触させ、次いで、核酸を回収する。安定化された細胞からのRNA（PCT/US02/26867)は、増幅および引き続いての定性的および定量的PCR分析のための、または普遍的プライマーPCR増幅と融合させた、およびそれが続く逆転写（RT）プライマーの遺伝子特異的サブセットを介する定量的分析のために、プロテイナーゼおよび求核性逆行薬剤の組合せを介して回収される。かくして、本発明の１つの焦点は、浸透化に先立って細胞を安定化させ、固定し、次いで、同安定化された細胞から核酸を放出させることによって、細胞質生体分子分析および表現型細胞分析双方のための細胞を調製する。
【００１２】
また、本発明は、細胞または細胞集団を浸透化組成物と接触させ、核および／またはミトコンドリアＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、可溶性蛋白質、および他の標的物質のごとき１以上の構成要素につき放出されたおよび／または放出されていない画分を別々に分析することによって、標的細胞内の核および／またはミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質および他の可溶性成分を分離することにも指向される（米国出願60/330,669）。
【００１３】
本発明は、細胞（類）を浸透化組成物と接触させ、次いで、正常な細胞を形質転換細胞から区別するための遺伝子型および表現型細胞特徴に由来する特徴を含む機能的細胞プロフィールを生じさせる細胞質生体分子および表面生体分子を別々に分析することによって、同一細胞（類）または細胞集団から細胞質生体分子および膜または表面生体分子双方を分析することを一体化させる。
【００１４】
本発明の単離および稀な細胞分析を組合わせて、稀な細胞から獲得されたｍＲＮＡを包括的にプロファイリングすることを可能とする方法および試薬が供される。例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を規定する細胞の集団は、癌患者の末梢血液および骨髄で見出される稀な細胞のタイプであろう。ｍＲＮＡは本発明で記載した細胞調製物を介して得られるが、当該分野で通常用いられるいずれのプロトコルを取込むこともできる。
【００１５】
注目する細胞を含む試料からのｍＲＮＡの単離および精製の後、低いｍＲＮＡコピー数を伴う極端に稀な細胞事象の検出は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）ベースのプレ−増幅手法を用いまたは用いることなく遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲパネルを介して達成される（米国出願60/369,945）。プレ−増幅は、Eberwine aRNA方法（Van Gelderら,1990）の修飾法を用いる全ｍＲＮＡライブラリーの直線的増幅によって完了される。好ましい具体例において、アンチセンスｍＲＮＡライブラリー（ａＲＮＡ）ライブラリープレ増幅の創製の結果、フェロ流体豊富化循環細胞から単離された元のｍＲＮＡに存在する全てのメッセージが少なくとも１０００倍増加する。次いで、遺伝子特異的プライマーを用いて、注目する遺伝子パネルのみを増幅する。これらのプライマーは、循環腫瘍細胞のような既知の稀な事象を示す転写体を増幅するように設計される。標的配列の数は、稀な事象を示すいくつかの特徴との相関を可能とするのに必要な２のように少なく、または多くすることができる。これは、別々の個体反応として、または単一反応バイアル内で起こり得る。引き続いての分析により標的配列の少なくとも定性的評価がなされ、限定されるものではないが、本発明者らがここに遺伝子特異的起点（ＧＳＰ）アレイおよび／またはＧＳＰ組−ＲＴ（普遍的ＰＣＲ）として呈する２つのタイプの多重遺伝子分析方法のうちの１つのごとき方法で達成される。
【００１６】
普遍的ＰＣＲは、ｍＲＮＡライブラリープレ増幅の有りまたは無しにて単一反応試験管中で試料回収ｍＲＮＡからの多重遺伝子分析を達成する。遺伝子の１つのパネルのみを一度に分析するのを可能とするプレ増幅はない。プレ増幅は１０００までの異なる反応における単一試料を分析する利点を付け加え、かくして、遺伝子の多くの異なるパネルを異なる時点で問うことができる。他の方法を利用することもできるが、普遍的ＰＣＲカクテルパネルの分析は、アレイまたはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって達成される。従って、該システムは、ｃＤＮＡマイクロアレイフォーマットで測定した場合に、１ないし数千の別々のｍＲＮＡタイプの同時定性および定量測定を可能とする。
【００１７】
かくして、本発明は、プレ浸透化組成物、架橋後のＲＮＡ回収、表面に共有結合したオリゴ（ｄＴ）プローブでの磁性マイクロスフィアー、および小さなまたは大きなミクロアレイ、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、ＨＰＬＣ、電気泳動および他の分析プラットフォームを用いる包括的ＲＮＡ分析の捕獲および分析用の他の遺伝子特異的磁性ミクロスフィアー−結合プローブを含めたいくつかまたは全ての必要な試薬を含むプロトコルおよびキットに指向される前記単離およびプロファイリング分析の組合せを含む。
【００１８】
好ましい具体例の詳細な記載
これまでの議論で示されたごとく、癌診断のより包括的かつ実践的形態は、細胞内および細胞外膜抗原の分析ならびに今日までに相互に排除するプロセスであった同一細胞または異なる細胞集団における細胞ＲＮＡ含有量およびＤＮＡ含有量の分析を含まなければならない（US 6,365,362）。この排除性は、細胞質生体分子を単離する方法と共に、細胞完全性を維持する主要目的を有する、構造的細胞内抗原を分析するプレ−分析細胞調製方法の基本的不適合性によるものであった。あるいは、プレ−分析細胞調製もまた、可溶性細胞内成分を放出するための細胞をホモゲナイズする主要目的を有する、可溶性細胞質ＲＮＡ、全細胞ＲＮＡ、全細胞ＤＮＡ、および／または蛋白質に制限された。特に、伝統的な表現型特徴付けは、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等のごとき架橋剤への細胞の曝露を介して達成される細胞構造の固定を必要とした。これらの厳しい細胞固定条件は、同時に、望ましくない共有結合架橋および／または単離されたＲＮＡ腫の断片化を引き起こす。同様の細胞内ＤＮＡ−蛋白質架橋が最近報告されている（QuieveynおよびZhitkovick, Loss of DNA-Protein Crosslinks from Formaldehyde-Exposed Cells Occurs Through Spontaneous Hydrolysis and an Active Repair Process Linked to Proteosome Function, Carcinogenesis, 21:1573-1580(2000)。いわゆる非−ホルムアルデヒドまたは非−パラホルムアルデヒド固定剤（例えば、Cyto-ChexTM Streck Labs, Omaha, NE）は、ホルムアルデヒド−尿素誘導体ドナー化合物を含む細胞−安定化添加剤である。それは、同時係属出願（ここに引用して一体化させるPCT/US02/26867）に開示された出荷または貯蔵の間に血液中の循環腫瘍細胞用の保存剤として用いられる。しかしながら、本発明者らによって行われた研究は、痕跡レベルの遊離ホルムアルデヒドを含むにすぎないCyto-ChexTMさえ、ホルムアルデヒドをゆっくりと放出するようであり、これは細胞内ＲＮＡを細胞内蛋白質に架橋させることができる。そのような架橋は本明細書の方法によって十分に逆行させて、包括的なＲＮＡ分析を可能とした。従って、細胞ＲＮＡおよびＤＮＡ分析は、未固定新鮮細胞、慣用的には、架橋しない、またはその架橋が細胞からのｍＲＮＡ放出の間に逆行させることができる試薬で保存される細胞で調製されるRNAlaterTM（Ambion）は商業的に入手可能なＲＮＡ安定化溶液であり、これはＲＮＡを安定化させるが、同一試料について免疫原性、免疫化学またはイメージ分析を可能とせず、血液では効果的ではない。PreAnalytiXは血液ＲＮＡ安定化剤を供するが、全ＲＮＡ単離のみに基づく伝統的なホモゲナイゼーション以外を可能としないVacutainerTM試験管中のカオトロピック剤であるグアニジンイソチオシアネート溶液（ＧＩＴＣ）溶液以外ではない。
【００１９】
一般に、固定された細胞から回収されたｍRNAは定量的ではなく、ひどく劣化しているか、または断片化されており、ほぼ２００塩基の高度に可変な平均サイズに対して１０倍も多いほぼ１７５０塩基の平均サイズを持つ無傷RNAのサイズを低下させ、よく理解されていない多くの複雑な化学的修飾を含む。しかしながら、固定剤由来RNAの正味の効果はひどく信頼を危うくするｍRNA分析である（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, (2002))。定量的ではなく定性的ではあるが、長さが１００塩基対未満のアンプリコンのために設計された逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR)分析と組合わせた退屈な非定量的ｍRNAサルベージ技術は限定された値を示す（US 5,346,994)。さらに、固定された細胞のこの限定されたRNA分析は表現型分析に従わなければならない。かくして、伝統的なRNA単離技術は、細胞の構造を破壊し、かつさらに細胞DNAおよびRNA集団を混ぜ合わせることによって分析を複雑とする完全な細胞溶解またはホモゲナイゼーションを必要とするので、二つのプロセスは同一細胞試料に対して順次に行うことができない（Maniatisら, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Press (1989))。従前の報告は、組織におけるRNA回収の方法を改良する必要性を示している（Godfrey ら, Quantitative mRNA Expression Analysis from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues Using 5' Nuclease Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, J. of Molecular Diagnostics, 2:84-91(2000))。血液からの回収可能で定量的な高品質全長無傷の全およびｍRNAを安定化させ、かくして、包括的な分割を可能とするホルムアルデヒドおよび尿素系固定剤の適用は本発明の１つの態様の基礎である。
【００２０】
かなり予期せぬことに、浸透化剤として用いるサポニンは、高度に選択的かつ効果的であって、細胞内細胞質RNAおよび他の生体分子のための剤を放出させ、それにより、細胞の溶解またはホモゲナイゼーションの必要性を軽減することが判明した。選択されたRNA放出剤としてのサポニンのこの新規な使用は、本発明の特に有利な構成要素である。サポニンのごとき界面活性剤は、伝統的には細胞膜を浸透化させ、細胞の完全性を維持しつつ染色試薬の取り込みを可能とすることによって、細胞内抗原の発現を調べるために用いられてきた。例えば、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（FISH)による、または核染料DAPIでの核中のDNAのごとき細胞内構成要素の染色における、あるいは特異的標識抗体でのサイトケラチンの免疫染色における染色体または遺伝子の分析は、非常に重要な役割を演じている。細胞質細胞内蛋白質RNAまたはDNAの放出は、一般に、トリトンX-100のごときより強い界面活性剤での細胞の可溶化または完全な溶解によってなされる。しかしながら、サポニンは以前には、同一検体における、RNAを含む可溶性細胞内抗原の発現、および個々の細胞または細胞集団の表現型分けの双方を調べるのに用いられてきた。従って、順次の表現型分析ならびに同一細胞検体の細胞質における無傷RNAおよび可溶性蛋白質の分析を可能とする方法がかなり望ましく、それは本発明の主題である。
【００２１】
従って、本発明は、生物学的試料中で見出される全ての細胞、特に標的化細胞の迅速かつ効果的なRNAプロファイリングのための有利な方法、装置およびキットを提供する。本発明は、表現型および遺伝子型双方の別々の分析を可能とする方法を提供する。表現型は、抗体抗原蛋白質および質量分析プロファイリング方法および同一細胞または細胞集団からの無傷細胞質RNAの包括的な分析を介して問われ、かつプロファイルされる。同一のゲノムおよびミトコンドリアDNAの遺伝子型分けは、当業者が利用できるいずれかの手段によって別々にプロファイルすることができる。ｍRNAライブラリーの増幅と同様に、各ゲノムおよびミトコンドリアライブラリーをあらかじめ増幅することができ、多数のアッセイを多重置換増幅（MDA）による臨床的感度の喪失なくして行うことを可能とし、該技術は第一の効果的な全ゲノム増幅方法を可能とする。MDAは数個の細胞から限定されないDNAを生じさせる迅速な信頼性のある方法である。
【００２２】
本明細書中に記載する発明は、細胞表面抗原、細胞質内抗原およびいずれかのタイプのRNAのごとき細胞表現型、および遺伝子型を単離し、それを特徴付けるのに効果的に用いることができる。表現型および遺伝子型分析は共に正確に同一の試料に対して順次に行うことができる。例えば、細胞表面分析およびRNA収穫の後に、残存する無傷の核およびミトコンドリアを、S1ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ保護、RT−PCR、SAGE、DD−RT−PCR、マイクロアレイｃDNAハイブリダイゼーション、ISH、FISH、SNP、全てのRNAおよび全てのゲノムベースのPCR技術およびいずれかの蛋白質分析系のごとき全ての標準的RNA（ｍｔ RNA、ｈRNA）、DNAおよび蛋白質ベースの分析によって下流分析することができる。
【００２３】
このタイプの細胞分析の多くの適用のうちの１つは、癌の診断におけるものである。多くの臨床家は、癌は、その初期の段階に封じ込めた場合、器官、特異的病気であると信じている。該病気は、それが現在利用できる方法を用いて最初に検出される時点までに全身的となる。従って、循環系における腫瘍細胞の存在を示唆する証拠は、前立腺特異的抗原のマモグラフィーまたは測定のごとき他のテストと組合わせて置換え、または機能する最初のライン検出メカニズムであろう。これらの細胞に対する特異的マーカーを介しての細胞表現型（蛋白質およびRNA）および表現型を分析することによって、そのような細胞の器官起源、例えば、***、前立腺、結腸、肺、卵巣、または非造血器官の癌を容易に決定することができる。蛋白質、RNAおよびゲノムを分析することができ、特に腫瘍の臨床的兆候が得られない状況において、特異的腫瘍の存在ならびに起源の器官を同定することが可能であろう。これらのプロフィールは細胞の機能を規定するので、それは、いずれのほとんどの適当な療法タイプおよびコースが癌細胞検出で用いられるべきかを示す。さらに、手術後外科処置または他の成功した療法に関する循環腫瘍細胞の検出可能な証拠がない場合のモニタリングにおいて、さらなる治療が必要か否かをさらなる臨床的実験から決定することができよう。
【００２４】
より包括的かつ初期の診断を提供するために、本発明の１つの具体例は、細胞または細胞の集団から細胞質生体分子を単離し、該細胞または複数細胞を浸透化化合物と接触させ、引き続いての表現型および形態学的分析のために細胞完全性を維持しつつ、細胞から注目する細胞質生体分子を単離する方法を含む。
【００２５】
本発明における標的化され稀な事象とは、少なくとも部分的に、公知の稀な事象を示すいずれかの生体物質の発現をいう。従って、ホルモン、蛋白質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬物、化学物質、（RNAおよび／またはDNAのごとき）核酸分子、および細胞、アポトーシス体、細胞デブリス、核、ミトコンドリア、ウィルス、細菌などのごとき生物の部分は本発明の具体例に含まれるであろう。
【００２６】
流体試料は、限定されるものではないが、細胞−含有体液、末梢血液、骨髄、尿、唾液、痰、組織ホモゲネート、***、およびヒト対象から得ることができる稀な細胞のいずれかの他の源を含む。
【００２７】
「細胞質生体分子」は、限定されるものではないが、細胞の細胞質区画に位置する蛋白質、ポリペプチド、糖蛋白質、オリゴ糖、脂質、電解質、RNA、DNA等のごとき注目する細胞標的分子を含む。細胞を浸透化化合物と接触させ、引き続いて細胞分離を行うと、細胞質生体分子は下流分析のために上澄みに存在する。全ての可溶性細胞質生体分子、例えば、膜ポアを横切ることができる全細胞質RNAライブラリーまたは標的構成要素を単離し、分析することができる。好ましい具体例において、焦点は、例えば、CTCにおいて、癌の診断および治療の管理において注目する腫瘍形成性トランスフォーメーションのインジケーターとしての転写されたmRNAおよび翻訳された蛋白質の分析に対するものである。
【００２８】
「膜生体分子」は、限定されるものではないが、外側細胞膜、核膜、ミトコンドリアおよび他の細胞オルガネラ膜を含めた、細胞膜と会合した、または細胞膜に埋もれた注目するいずれの細胞外、膜内または細胞内ドメイン分子も含む。本発明の浸透化化合物での浸透化に際し、標的膜生体分子は、通常は膜から可溶化されずまたは除去されず、すなわち膜生体分子は浸透化細胞と会合したままである。膜生体分子は、限定されるものではないが、外側膜の外部または細胞外表面に露出したもの、ならびに外側膜の内部表面に存在するもの、および核ミトコンドリアおよび全ての他の細胞内オルガネラ膜と会合した蛋白質を含めた、細胞膜に会合した蛋白質、糖蛋白質、脂質、炭水化物、核酸およびその組合せを含む。また、膜生体分子は細胞骨格蛋白質も含む。
【００２９】
「表現型」または「表現型分け」とは、細胞の生命および死滅の全ての態様を構築し、それを制御するための内部に暗号化された遺伝可能な指令を貯蔵するDNAのごとき細胞内遺伝子物質を同定するプロセスをいう。「表現型」または「表現型分け」は、観察可能な外向き構造エレメントおよびその生産に基づいて細胞を分類することと定義される（すなわち、中間的RNAを含む）。これらは、トポロジー、形態学および他の表面特性を含み、その全ては、本発明の方法に取込まれる内部に暗号化された遺伝子型情報に由来する。対照的に、細胞の構造および完全性は、少なくとも、通常は、カオトロピック塩処理の間の全ての細胞構造の崩壊および／または機械的な細胞ホモゲナイゼーションによって、NP-40の存在下における核およびミトコンドリアを除く全ての細胞構造の完全な溶解を含む慣用的RNA単離技術の間に維持されない。
【００３０】
細胞構造を参照する形態学的または形態学は、組織化学試薬での染色または抗体のごとき検出可能に標識された結合パートナーとの相互作用を可能とする細胞内もしくは表面のマーカーまたはエピトープを含めた、細胞および核のトポロジーおよび表面特徴に関して、慣用的に規定して用いられる。加えて、形態学は：核内のクロマチン分布の定量的測定と定義される「モルフォメトリー」の全分野を含む。
【００３１】
用語ゲノミックおよびプロテオミックは、慣用的に定義されるごとく用いられる。「機能的」は、より広くゲノミックおよびプロテオミック双方を含む「機能的セロミック」、ならびに限定されるものではないが炭水化物についての「グルコノミック」および細胞脂質についての「リポドミック」を含めた他の標的カテゴリーのごとき、細胞の経験的に検出可能な生物学的特徴または特性についての形容詞として本明細書中では用いられる。得られた細胞特徴は、形質転換された細胞からの正常細胞の区別を可能とするプロフィールを提供する。
【００３２】
「接触させる」は、化合物または試薬を細胞に直接的にまたは間接的に物理的に近接させることをいう。細胞および／または化合物はいずれかの数の緩衝液、塩、溶液などに存在することができる。接触させるは、例えば、試薬溶液を、細胞と接触させるために、試験管、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、細胞培養フラスコ等に入れることを含む。マイクロタイタープレートおよびマイクロアレイ様式は、さらに、限定されるものではないが、核酸および蛋白質を含めた多数の細胞標的化合物または構成要素を同時に分析するための多重アッセイを可能とする。
【００３３】
「浸透化化合物、試薬または組成物」は、引き続いての表現型分析を浸透化細胞で行うことができるように十分な膜、細胞質および核構造を維持しつつ、脂質−コレステロール二層を含む、細胞膜中に小さなポアを形成するいずれの試薬も意味する。例えば、サポニンは、細胞膜構成要素と複合体化し、それにより、細胞壁または膜中に約８ｎｍサイズの多数の膜貫通ポアを形成し、かくして、酵素、蛋白質、糖蛋白質、グロブリン、電解質等のごとき小さな可溶性サイトゾル構成要素の外向き拡散、および電解質のごとき細胞外試薬成分とも内部平衡化を可能とする公知の「ポア−形成性」化合物である。
【００３４】
「免疫磁性ビーズ」は、細胞上の表面マーカーまたはエピトープに対する実質的に選択的な親和性を持つ共有結合した結合試薬（例えば、抗体）を有し、それにより、高勾配磁気分離システム（AGMS）で生じたごとき磁場に曝露された場合に、磁気的に標識された細胞の選択的捕獲を達成する磁気的に標識されたナノ粒子またはミクロ粒子である。方法、試薬および装置に対して本明細書中で用いる他の用語は慣用的に定義されたものであり、当業者に公知のものである。
【００３５】
起源の組織、診断、予後、治療標的特徴付けおよびモニタリングを同定するための好ましい遺伝子発現標的（mRNAおよび蛋白質）は、限定されるものではないが、マノグロビン１（MGB1)、マノグロビン２（MGB2）、プロラクチン誘導性蛋白質（PIP）、カルシノ胚抗原（CEA）、前立腺特異的抗原（PSA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、腺カリクレイン２（hK2）、アンドロゲン受容体（AR）、プロスタシン、へスピン（HPN）、DD3、Her-2/Neu、BCL2、表皮成長因子受容体（EGFR）、チロシンキナーゼ−タイプ受容体（HER2）、チミジル酸シンテターゼ（TS）、血管内皮成長因子（VEGF）、膵臓ムチン（Muc1）、グアニリルシクラーゼｃ（GC-C）、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（PIK3CG）、プロテインキナーゼＢガンマ（AKT）、切除修復蛋白質（ERCC1）、アルファ−１グロビン（F6）、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（G6）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPYD)、インスリン成長因子受容体（IGF2）、エストロゲン受容体アルファおよびベータ（ER）、プロゲステロン受容体（PR)、アロマターゼ（cyp19）、テコメラーゼ（TERT）、一般的上皮組織特異的遺伝子、サイトケラチン１９（CK19）、サイトケラチン５（CK5）、サイトケラチン８（CK8）、サイトケラチン１０（CK10）、サイトケラチン２０（CK20）、上皮細胞接着因子（EpCAM）、ムチン１を含めたムチン（MUC1）、トポイソメラーゼ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（Upa）、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（Upar）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP)、一般的白血球細胞特異的mRNA、アルファ−１−グロビン、CD16、CD45およびCD31のごときマーカーを発現する感受性または抵抗性遺伝子を検出しモニタリングする目的で、***、前立腺、肺、結腸、卵巣、腎臓、膀胱の癌に由来する細胞を含む。このリストは、種々の起源、タイプおよび病気からの細胞を区別するために組立てることができるmRNA−特異的遺伝子のアレイの一般的多様性を説明することを意図し、包括的であることを意図しない。
【００３６】
安定化、放出および回収
（その双方をここに引用して一体化させる）共通に譲渡された米国特許第６，３６５，３６２号および米国特許出願シリアル番号１０／０７９，９３９の以前に開示された発明の方法を用い、少なくとも２，５００ないし約１０，０００倍の程度まで、白血球に対して循環上皮細胞を豊富化させることができる。血液中の循環上皮細胞の免疫磁気選択に続いて、本発明で具体化されたヌクレオチド分析を行う。該豊富化は、本発明の具体例で用いられる細胞の特異的集団を選択するための当該分野で知られた多くの方法のうちの１つの例にすぎない。
【００３７】
これらの細胞から無傷の細胞質全ＲＮＡおよびｎＲＮＡを放出し、それにより、それらを単離し、精製する方法は、予期せぬことに、かつ驚くべきことに、染色および免疫染色に先立って、細胞のサポニンでの慣用的浸透化の間に見出され、それにより、正確に同一の細胞、細胞の集団または検体についての細胞質ＲＮＡおよび細胞内抗原表現型分けおよびＤＮＡ遺伝子型分け双方の順序または並行した分析を可能とする。
【００３８】
浸透化は、３つのタイプの一般的界面活性剤または洗剤：サポニンのようなポア形成試薬またはＱＳ−２１のごときサポニン、エスシン、ジギチオニン、カルデノライドなどのうちの１つを用いてこの基準下で達成することができる。これらの剤の全ては、膜の多孔度を増加させ、小さな可溶性細胞内構成要素を放出する。もう１つの群の剤は界面活性剤である。これらの剤は、溶解なくして膜に浸透するための比較的高い親水性−親油性バランスを有する。より低い親水性−親油性バランスを持つたのより溶解性の界面活性剤は、ＲＮＡを放出するであろうが、膜を可溶化させる傾向がある。これらは、限定されるものではないが、（商業的にはＴｗｅｅｎ２０、４０または８０として知られた）ポリオキシエチレンソルビタン、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）など、ｔ−オクチルフェノキシエトキシエタノールまたはＳＤＳを含む。
【００３９】
細胞質ＲＮＡ（およびｍｔＲＮＡおよびｈｎＲＮＡのごとき他のＲＮＡ）、細胞表面ならびに可溶性細胞内抗原、ミトコンドリアのごとき細胞オルガネアおよび残りの指標化核の引き続いての分析はすべて標準的なＲＮＡ、ＤＮＡおよび蛋白質ベースの分析術によって下流分析することができる。これらは、全てのタイプのプロフィール分析用のｃＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質マイクロアレイ、質量分析、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）、ＰＣＲのごときすべてゲノムベースの増幅技術、マイクロサテライト分析、制限断片長多形（ＲＦＬＰ、ＡＬＦＰ）、ＳＡＧＥ、ＤＤＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００４０】
そのような分析は、各々についての少なくとも１ないし１０のＲＮＡ分子およびいずれかのＲＮＡ配列タイプについて行うことができるが、好ましくは、臨床的設定において病気状態のインジケーターとしての細胞翻訳または転写プロフィールにおいて微妙な改変の検出を可能とする数千ないし数百万までのコピーの標的について行うことができる。蛋白質、糖蛋白質、リポ蛋白質、オリゴグリコシドなどのごとき放出可能なおよび放出可能でない細胞構成要素の他の機能的細胞プロフィールは、同様に、慣用的なマイクロアレイ、ＨＰＬＣ、抗分解の２Ｄ電気泳動法を含めた電気泳動法、または抗体アレイプロファイリングにより２つの画分を分析することによって生じさせることができる。
【００４１】
本発明の浸透化化合物は限定されるものではないが、容易に水に分散して、球状ミセルを形成する脂肪酸および１以上の炭水化物に連結したコレステロール−様アグリコンまたはゲニン（いずれの炭水化物部位も保有しないトリテルペンまたはステロイド）から構築されたクラスの天然産物であるサポニン、ポア形成における活性種を含む。これらのおよび他の前記命名の適当なポア形成剤、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０、４０または８０として商業的に公知）、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、およびｔ−オクチルフェノキシエトキシエタノールは、細胞構成要素の望ましくない可溶化および膜溶解を最小化させるには、十分に低い濃度で用いなければならない高ＨＬＢ（親水性−親油性バランス）を有する。浸透化化合物の濃度範囲は、約１０％サポニゲンを含むサポニンを用いる場合、約０．０１ないし０．５％（ｗ／ｖ）である。好ましい浸透化化合物はサポニンである（Sigmaカタログ番号Ｓ−７９００）。例えば、サポニゲンとして約２０ないし２５％純度のサポニン（Ｓｉｇｍａ Ｓ−４５２１）およびＡｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡから入手可能な約９９％純度の高度に精製されたサポニンＱＳ−２１のごとき、他の源からのより高い純度のサポニンを用いることもできる。他の使用可能な化合物は、ともにセイヨウトチノキに由来するアルファ−エスシンおよびベーターエスシン（Ｓｉｇｍａ Ｅ−１３７８）浸透化化合物は、例えば、アジ化ナトリウム、Ｐｒｏｃｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡなど）のごとき抗微生物剤も含む、リン酸緩衝化溶液のごとき組成物中に存在させることができる。もう１つの好ましい浸透化剤は、ＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍＴＭであり、これは、それ自体が細胞質ＲＮＡの約５０％（細胞中の全ＲＮＡの８５％）を放出し、核またはミトコンドリアヌクレオチド当量に対して影響しない。固定された細胞における全細胞ＲＮＡおよび全ＤＮＡの残りの５０％ＳＤＳ、プロテアーゼ、ホルムアルデヒドスカベンジング剤、を含む放出性カクテルで放出させることができ、その組成物は、本発明の１つの具体例を構成する。個々のカクテル構成要素の正確な作用態様は知られていないが、ＳＤＳは、構造的細胞内蛋白質に架橋した細胞内ＲＮＡおよびＤＮＡを可溶化し、それにより、より効果的な蛋白質分解およびホルムアルでヒド架橋核酸の放出を可能とするように働くと考えられる。限定されるものではないが、ヒドロキシルアミン、カルボキシメチルアミン、ヒドラジン、アセドヒドラシドおよび他のヒドラシドなどまたはヒドラジン誘導体、トリスのごときアミンによって例示される新規なホルムアルデヒドスカベンジング試薬は、放出される核酸の量および「質」を増加させることが判明し、ここに、質は増大した増幅速度および収率によって測定される。Immunipermおよび放出性カクテルで放出された２つの画分は、個々に分析することができるか、あるいは分析に先立ってプールすることができる。
【００４２】
従って、細胞ヌクレオチドを放出することができる、ホルムアルデヒドスカベンジャーが添加されたまたは添加されていないいずれの界面活性剤またはプロテアーゼ（またはその組合わせ）も、同時分析のための必要な形態を保存し、維持し、これは本発明の範囲内に含まれるであろう。
【００４３】
かなり細胞RNAを断片化する傾向がある現在の細胞固定およびRNAサルベージプロトコルとは異なり、本発明は、細胞の完全性を維持しつつ、細胞膜に浸透するサポニンのごとき浸透化剤で処理した細胞からの無傷の細胞質全RNAおよびmRNAの９０％を超えての抽出および単離を可能とする。mRNA単離は、免疫磁気細胞豊富化および免疫蛍光細胞標識手法にも適合する。T7、SP6またはT3プロモーター、フローサイトメトリー、マイクロアレイおよびCell SpotterR（共にImmunicon Corp, PAによって製造された）またはCellTracksシステムを使用するRNAポリメラーゼプロモーターベースの直線的増幅方法のような細胞分析指針によって同定され特徴付けられた細胞の包括的RNA発現プロフィール分析を用いて、発現プロフィールを直接的に有効化し、それを補い、それを拡大し、ならびにそれから得られた情報を増強することができる。
【００４４】
特定の固定剤に限定するつもりはないが、浸透化細胞を架橋剤で処理して、前記したごとく、形態、および抗原、ヌクレオチドの完全性を維持する。Cyto-ChexTM、StabilCyteTMおよびTRANSfixTMは、血液検体中の血液細胞を長時間安定化させるにおいて有用性を示している３つの商業的に入手可能な安定化剤の例である。これらの安定化剤は、（主に、収縮を最小化することによって）細胞のサイズを維持し、フローサイトメトリーによって主として測定されるごとく細胞表面の抗原を保持するように最適化される。意図された適用は、一般に、直接的分析を含み、試料の広範な操作または特定の細胞集団の豊富化を必要としない。対照的に、本発明で単離され検出された循環腫瘍細胞、または他の稀な標的細胞は、非常に低い頻度で存在する病理学的に異常なまたは稀な細胞と定義され、かくして、検出に先立って実質的に豊富化を必要とする。
【００４５】
Cyto-ChexTM安定化剤は細胞安定化剤として、および、本発明の適用で証明されたごとく、細胞内蛋白質とでマクロ分子複合体の形成をもたらす細胞内RNAのアルデヒド放出性固定剤として用いることができる。本発明者らは、予期せぬことに、好ましくはCytochexTMのごときホルムアルデヒドドナーでの固定化は、引き続いての試料プロセッシングの間にRNAを保持し、それを保護するのに必須であること、および十分に機能的なRNAの全部のまたは最適な放出は前記した放出カクテルと組合わせてサポニンを必要とすることを見出した。
【００４６】
理想的な「安定化剤」または「保存剤」（本明細書においては、相互交換的に用いる）は、いずれにせよ、標的細胞の単離、検出および計数、および非標的細胞からのその区別を妨げる、生物学的検体中における干渉性凝集体および／または細胞デブリスの形成を最小化しつつ、生物学的検体に存在する注目する標的細胞を迅速に保存することができる組成物と定義される。換言すれば、抗凝固剤と組合わせた場合、安定化剤は抗凝固剤の性能に悪影響すべきでない。逆に、抗凝固剤は安定化剤の性能に干渉すべきでない。加えて、開示された安定化剤は固定という第３の機能も果たし、それにより、浸透化細胞を安定化させ、ここに、表現「浸透化された」または「浸透化」および「固定する」、「固定された」または「固定」は細胞生物学において慣用的に定義されている通りに用いられる。本明細書中における安定化剤の記載は、細胞生物学における当業者に容易に明らかな適当な濃度または量にてこられの剤を用いることを意味し、ここに、該濃度または量は損傷を引き起こすことなく標的細胞を安定化するのに効果的なものである。稀な細胞を保存する目的での本発明の組成物、方法および装置を用いる者は、それらをこれらの同一稀な細胞を損傷させまたは破壊するようには用いず、従って、適当な濃度または量を固有に選択するであろう。例えば、ホルムアルデヒドドナーであるイミダゾリジニル尿素は、当該検体の容量の０．１ないし１０％、より好ましくは０．５ないし５％、最も好ましくは約１ないし３％の好ましい濃度にて効果的であることが判明している。ポリエチレングリコールのごときさらなる剤もまた、約０．１％ないし５％の好ましい濃度で添加した場合に、細胞を安定化させるにおいて効果的であると判明している。PCT/US02/26867にそのような剤の使用が記載されており、ここに引用して一体化させる。
【００４７】
本発明の驚くべき態様は、マクロ分子複合体の一部としての細胞内RNAは増幅可能に、かつほとんど定量的な収率にて、細胞安定化剤および固定剤で既に処理した細胞から回収することができる。架橋されたRNAの十分な放出は、溶解性洗剤およびホルムアルデヒドスカベンジャーの存在下で酵素消化と組合わせたサポニンを必要とする。例えば、Cyto-ChexTM処理細胞のプロテイナーゼK、V8プロテイナーゼ、プロテイナーゼ消化の結果、完全な回収、または全長の包括的に分析可能なRNAが得られる。本発明で開示したホルムアルデヒドスカベンジャーの存在は、さらにRNA回収を改良することが見出された。
【００４８】
本発明の具体例において、循環癌細胞または胎児細胞のごとき標的細胞は、他の非標的細胞からそれを効果的に単離し、それらの核酸を精製し、次いで、マイクロアレイ分析のために注目する標的（類）を増幅することによってアッセイすることができる。
【００４９】
かくして、細胞質生体分子の単離は、まず、遠心または免疫磁気ビーズ豊富化を介して浸透化化合物から浸透化された細胞を分離することによって達成される。次いで、細胞質生体分子は上澄みに存在する。細胞質生体分子の単離は、磁性ビーズで捕獲することによって達成することができる。例えば、もし細胞質生体分子がｍRNAであれば、磁性ビーズまたは非磁性支持体に付着させたオリゴ（ｄT）を用いて、遠心と共に、またはそれなくして、細胞からｍRNAを捕獲し、それにより、分離することができる。もし細胞質生体分子が蛋白質であれば、特定の蛋白質に結合することができる抗体を用いることができ、ここに、該抗体は磁性ビーズまたは非磁性支持体に付着させることができる。標準蛋白質およびRNA化学抽出、電気泳動、クロマトグラフィー、免疫分離およびアフィニティー技術のごとき他の分離技術は当業者によく知られている。細胞および生体分子を分離するための免疫磁気豊富化試薬およびデバイスは、限定されるものではないが、Immunicon Corp.（Huntingdion Valley, Pa)、Dynal (New Hyde Park, NY およびMiltenyi Biotech Inc.(Aupurn, CA)を含めたいくつかの製造業者から入手できる。該細胞は細菌細胞のごとき原核生物、または哺乳動物細胞のごとき真核生物とすることができ、それらはヒト起源が最も好ましい。好ましい具体例において、細胞はカルシノーマまたは腫瘍細胞である。好ましい注目するカルシノーマは、限定されるものではないが、***、前立腺、肺、結腸、および卵巣組織に由来し、例えば、血液および骨髄中の循環腫瘍細胞として、組織片または体液中に見出されるものを含む。
【００５０】
各々、核酸または蛋白質の分析のための機能的ゲノミックスまたは機能的プロテオミックすいずれかと集合的に定義され、正確に同一試料に対する順次の細胞質および／または全細胞生体分子分析および膜生体分子分析のために細胞を調製する方法が開示される。前記したごとく、そのような分析は、以前には、本発明の方法に先立っては同一細胞（部位）では可能ではなかった。細胞を浸透化化合物と接触させて、構造的生体分子および膜生体分子を改変することなく、前記したごとく、細胞質生体分子を放出させる。
【００５１】
かくして、本発明においてここに開示するごとく、細胞を浸透化化合物と接触させ、安定化させ、細胞質生体分子を前記したごとく回収した後に、細胞試料からの細胞質生体分子を分析し、同一細胞試料からの膜生体分子を分析する方法が提供される。細胞質生体分子は関連する生体分子と共に、または順次に単離し、分析することができる。
【００５２】
また、本発明は、サイトゾルまたは全細胞RNA、特にｍRNAを単離するための試薬およびキットを提供する。該キットは、浸透化化合物、および、例えば、種々の長さのオリゴ（ｄT）または遺伝子−特異的配列またはランダム（縮重）オリゴヌクレオチドのごとき、RNAの単離および検出用のRNA抽出試薬またはハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。該キットは、膜生体分子に結合する抗体のごとき、細胞に会合した蛋白質に結合する抗体を含むこともできる。抗体およびプローブは酵素により標識し、蛍光標識し、または放射性標識して、検出を行うことができる。抗体およびプローブは、例えば、磁性ビーズなどに付着させて、分離を容易とすることができる。
【００５３】
分析
細胞質生体分子分析は、細胞の細胞質から単離され、生体分子を含むいずれのタイプの分析またはアッセイも含む。細胞質生体分子分析は、さらに、限定されるものではないが、ｍRNAプロファイリング、蛋白質発現プロファイリング、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列分析、遺伝子発現SAGEの系列的分析、競合的ゲノムハイブリダイゼーション（CGH)、電気泳動、２−D電気泳動、MALDIまたはSELDIによる質量分析、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴、赤外、原子吸光などを含めるがそれらに限定されない機能的ゲノミック発現プロファイリングを含む。ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおける配列分析は、蛋白質、DNA／ｃDNA、またはｍRNA配列中の突然変異の存在を示し、それを同定することができる。例えば、元の遺伝子または蛋白質のプロファイリング分析は、形質転換したまたは腫瘍細胞におけるオンコジーンの存在を示すことができる。適当な癌療法の後の引き続いての分析は、緩解の間により低い腫瘍負荷を示すことができ、またはオンコジーンのさらなる突然変異および薬物−耐性またはより攻撃的な腫瘍細胞の出現の結果としての後退を示す。
【００５４】
膜生体分子分析は、細胞内の細胞膜に結合した、またはそれに会合した生体分子、すなわち、細胞外および細胞内生体分子またはマーカーを含むいずれのタイプの分析またはアッセイも含む。適当な分析方法は、限定されるものではないが、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着検定法、形態学的染色、細胞ソーティングなどを含む。浸透化細胞は、例えば、特定の検出可能な蛋白質の発現に基づいて、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS)技術によってソーティングすることができる。細胞ソーティング技術は当業者によく知られており、例えば、癌の診断において検出可能に標識された細胞を簡単にカウントするのに用いられてきた。また、浸透化細胞は、特定の蛋白質、例えば、CD４またはCD8細胞の発現に基づいて分類することができる。また、膜生体分子分析は、下流膜画分について行い、続いて、限定されるものではないが蛋白質発現プロファイリングを含めた分析を行うこともできる。ウェスタンブロッティング、アミノ酸配列分析、質量分析、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴、赤外、原子吸光、表面プラズマ共鳴（SPR)および膜構成要素の分析に適したいずれかの他の技術。
【００５５】
機能的ゲノム分析またはアッセイは、浸透化細胞内に保持された遺伝物質について行うことができる。例えば、ゲノムDNA、核（ｈｎRNA）、ミトコンドリア（ｍｔRNA）および細胞の浸透化に際して細胞内に結合したままである、または固定したままであるオルガネラによって保有されるいずれかの他のRNAまたはDNAも評価することができる。かくして、細胞質生体分子についての前記したタイプの分析は、限定されるものではないが、イン・サイチュハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ鎖反応、差ディスプレイPCR、任意起点PCR、マイクロサテライト分析、単一ヌクレオチド多形（SNT)、競合的ゲノミックハイブリダイゼーション（CGH)、制限断片長多形分析、核およびミトコンドリア転写体ラン−オンアッセイ、イン・ビトロ蛋白質、翻訳アッセイを含めた方法またはアッセイを用いてゲノムDNA、ｈｎRNAおよびｍｔRNAについて行うことができる。しかしながら、ゲノムDNA、核ｈｎRNAおよびｍｔRNAを得るためには、浸透化細胞を本発明の放出カクテルに曝露し、完全に溶解させ、または当業者によく知られた慣用的手段によってさらに分画しなければならない。安定化された細胞では、プロテイナーゼおよび求核試薬の組合せを用いて、注目する核酸を含むマクロ分子複合体を逆行させ、除去し、RNAおよびDNA核酸成分を遊離させることができる。さらに、浸透化に際して保持された細胞オルガネラを、引き続いて、さらに分画し、例えば、ミトコンドリアなどの代謝機能的アッセイのために単離することができる。従って、本発明のもう１つの具体例は、サイトゾルRNAから核またはミトコンドリア遺伝物質を分離する方法を提供する。核またはミトコンドリア遺伝物質およびサイトゾルRNAを含有する細胞を、前記したごとく、浸透化化合物と接触させる。核またはミトコンドリア遺伝物質は、例えば、引き続いての適当な細胞下分画および分画された細胞物質の完全な細胞／オルガネラ溶解によって単離することができる。得られたオルガネラ特異的構成要素（DNA、RNA、蛋白質、脂質、炭水化物など）を、ホモゲネートから抽出するか、または単離し、分析することができる。また、単離は、前記したごとく、オルガネラ−特異的免疫磁性ビーズを用いて達成することもできる。
【００５６】
いくつかの重要な実践的自動化の利点は、本発明から生じる。例えば、浸透化溶液を細胞から除去した後、ｍRNAを、自動化下流操作およびマイクロアレイに似た包括的分析に理想的には適するオリゴ（ｄT）−磁気ビーズで捕獲することができる。加えて、蛋白質およびｍRNAプロフィール双方を生じさせ、かくして、時間および試薬の要件を減少させるためには、現在のｍRNA分析ではほんの少しの変化が必要なのに過ぎない。さらに、核およびミトコンドリアにおける対応する無傷細胞ゲノムDNAは依然として浸透化細胞に含まれており、それに接近可能であって、FISH、SNP、SAGE、DD-PCR、PCR、RFLP、RT-PCR、CGH、ｃDNAマイクロアレイ、質量分析および蛋白質アレイのごときDNA、RNAおよび蛋白質についての慣用的方法によって下流分析することができる。例えば、大きなマイクロアレイでの、DNA、RNA、蛋白質、脂質、炭水化物および（前躯体、代謝産物およびその補因子）の同時複数成分分析戦略は、かくして、いずれの真核生物細胞、組織試料または体液にも広く適用することができる。複数細胞構成要素による、または多重化（例えばマイクロアレイ）分析と組合わせたこのタイプの細胞発現プロファイリングは、薬物候補の高−スループットスクリーニングないし病気の診断および管理の範囲の技術においてエッジ切断目的である。
【００５７】
また、本発明は、サイトゾルまたは全細胞RNA、特にｍRNAを単離するための試薬およびキットも提供する。該キットは、浸透化化合物、および、例えば、種々の長さのオリゴｄTまたは遺伝子−特異的配列またはランダム（縮重）オリゴヌクレオチドのごとき、RNAの単離および検出用のRNA抽出試薬またはハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。または、該キットは、膜生体分子に結合する抗体のごとき、細胞に会合した蛋白質に結合する抗体を含むこともできる。抗体およびプローブは酵素を標識し、蛍光標識し、または放射性標識して検出を行うことができる。また、抗体およびプローブを、例えば、磁気ビーズなどに付着させて、分離を促進することもできる。
【００５８】
従って、無傷ライブラリーを、上皮細胞の存在を同定し、および／またはそれらの上皮細胞の起源の組織の存在を確認することに関与するいずれかのメッセージの存在につき問いかける。この目的では、試料に存在するmRNAの全ては、注目する各特定の遺伝子につき分析しなければならず、各々は、他のものと同一の感度／選択性を持ち、かつ一度に注目するmRNAを見る能力を持つ。
【００５９】
これまでの基準では、マイクロアレイによる全体的に遺伝子発現分析は稀な事象に対しては感度不良であったろう。特に、試料における信号対ノイズ比は、現実的ではなく、いずれかの与えられた豊富化試料において白血球細胞免疫磁気キャリーオーバー汚染のごとき問題のため低かった。例えば、免疫磁気選択による細胞の特定の標的集団で豊富化された流体試料において、潜在的に、１ないし１０細胞の標的集団に関して運び去られたほぼ１０，０００白血球細胞であろう。標的細胞（類）は、注目する稀な事象を発現しつつあり、白血球細胞で見出されるヌクレオチドによってマスクされるであろう。極端に稀なコピーレベルの標的mRNAとカップリングさせた過剰な白血球細胞由来バックグラウンドRNAノイズの結果、検出することができない潜在的シグナルがもたらされる。
【００６０】
該問題を回避するために、全RNA（または精製されたmRNA）は、SP6、T3またはT7 RNAポリメラーゼプロモーター−ベースのイン・ビトロ直線的プレ−増幅方法いずれかを使用することによってプレ−増幅される。典型的な例はT7 RNAポリメラーゼ（T7RNAP）、プロモーター（T7RNAPP）および酵素増幅システムであるが、当業者に明白なシステムによっていずれの同等システムを置換えることもできる。全てのメッセージの直線的プレ−増幅は、少なくとも１０００倍だけ元のmRNAライブラリー表示を増加させ、RNA集団内の個々にmRNA配列の相対的豊富さは最小限しか見られない。また、同一のプレ−増幅プロセスは、転写体増幅、直線的増幅、またはイン・ビトロ増幅としても知られている。従って、それは、本発明の具体例の１つの具体的特徴である全mRNAライブラリーの１０００倍直線的プレ−増幅である。一本鎖mRNAを、T7プロモーター含有オリゴヌクレオチドのオリゴ（dT）部分においてポリAテイル領域においてアニールする。RNAポリメラーゼは、全mRNAライブラリーのアンチセンスコピー（aRNA）を生じさせる。かくして、一般に、全ライブラリーにおいてポリAテイルを有するmRNAのコピーの数が少なくとも１０００倍増加し、いずれかの特定のmRNA配列タイプの感度がそれに伴って１０００倍増加する。
【００６１】
例えば、第一のストランドRTプライマーおよび引き続いてのT7RNAP増幅プライマーとして利用されるT7プロモーターオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の塩基配列の順序：
【００６２】
【化１】

Figure 2005507997
【００６３】
を有する５´T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む３´オリゴ（dT部分）を有する６７の塩基よりなる。プレ−増幅反応は逆転写反応、続いて、ランダム起点DNAポリメラーゼ依存性第二ストランド合成および最後のT7RNAPとの一晩のインキュベーションによって完了する。引き続いて、全反応ミックスの一部をPCR反応分析で用い、それは、注目する適切に設計された遺伝子特異的プライマー（GSP）と共に特異的単一バンドアンプリコンまたは選択されたいずれかの他の適切なRNA分析を生じさせる。
【００６４】
遺伝子特異的プライマーの設計および合成は、増幅すべき特定の標的配列に依存し、いずれかの公知の当該分野で受け入れられた手段によって設計することができることは当業者に認識されよう。例えば、遺伝子特異的プライマーは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLASTR（基本的局所的整列サーチツール）ソフトウエアーおよびGenBankヒトcDNA配列データベースを用いて設計される。プライマーは約５５℃ないし６５℃のアニーリング温度に対して最適化され、複雑なmRNAライブラリーからDNA−フリー、RT−PCR依存性単一バンドのみを生じることが示されており、これは、特定のmRNAに対して陽性であることが公知である。複雑なmRNAライブラリーは、しばしば、正常および癌性ヒト組織ならびにイン・ビトロ細胞系から抽出される。設計されたプライマーは、所望の標的配列特異的PCRバンドを生じ、これは全てアガロースゲルで電気泳動に付して、既知の標準と設計−予測分子量と比較する。ゲル分析ソフトウエアーで決定されたRf値を用いて計算を完了する。アンプリコン配列は直接的配列決定、ブロットプロービング、制限構想マッピング等によってさらに配列を確認することができる。
【００６５】
前記したごとくcDNAアレイ分析で固有の信号対ノイズ（S/N）制限を回避するために、RNAポリメラーゼプロモーター−駆動直線的増幅戦略の新規な修飾を開発した。あるいは、単一反応試験管中でのcDNAの多重遺伝子−特異的逆転写の普遍的PCR増幅に基づく単一試験管の多重遺伝子RT-PCR分析システムは、バックグラウンドノイズを実質的に低下させる。これらの２つの信号対ノイズ比の改良は、本発明で具体化された特異的構成要素である。
【００６６】
プレ−増幅されたライブラリーの第二ストランド合成は、選択された領域内のみである、単一試料についての注目する１ないし１０００の独立した領域を含み、依然として、元のライブラリーからの１００％感度を維持する。第二ストランド合成は、注目する遺伝子のみの選択的増幅によって完了する。従って、遺伝子特異的プライマー（GSP）は、注目する領域のみを含むように第二ストランド合成について設計される。該領域は、限定されるものではないが、前立腺抗原（PSA）、PSM、CK19、EpCAM、AR、HPN、F6、マノグロビンおよび／または全てのサイトケラチンを含むであろう。GSPは、そのテイル端部に普遍的プライマーを組み込むように設計される。
【００６７】
第一ストランド合成を遺伝子特異的プライマーの組で行う先行技術とは対照的に、本発明の新規な態様の一部は、CAPスイッチ.TM.オリゴヌクレオチドの使用なくして、第二ストランド合成のみのための遺伝子特異的プライマーの使用である（米国特許第6,352,829号）。先行技術は、遺伝子特異的プライマーは、CAPスイッチオリゴヌクレオチドを含むその５´末端に任意のアンカー配列を組み込むように設計することを教示する。従って、ここに開示する本発明では驚くべきことに、プライマーの普遍的部分はCAPスイッチ部位を含まない。
【００６８】
遺伝子特異的プライマーの長さは、典型的には、約１５ないし３０ヌクレオチドの範囲であり、他方、普遍的プライマー部分は、典型的には、長さは約１５である。
【００６９】
T7増幅アンチセンスRNA（aRNA）ライブラリーの小さな部分の逆転写は、当該分野で知られたサイクリング条件を用いて行われる。全てのRT-PCR結果は、当該分野で知られた手法に従い、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルでまず分析する。
【００７０】
増幅されたaRNAライブラリーの選択された部分の増幅の後、次いで、アレイフォーマット、または当該分野で知られたいずれかの電気泳動フォーマットで分析される。
【００７１】
前記したプレ増幅後の第二ストランドの増幅に加えて、普遍的PCR多重遺伝子増幅を単一試験管で行い、同時第二ストランド合成のために、対向（P2）の適当な組を組合わせて同時逆転写構造のための遺伝子特異的プライマー（P1）の組を取込むことができる。一緒になって、それらは双方（アルファおよびベータ）末端を規定し、注目するGSP多重遺伝子パネルと等しい遺伝子特異的アンプリコンの完全な組を形成する。遺伝子特異的第一および第二ストランド双方の合成のためのGSP1およびGSP2プライミングを、当業者に知られている、適当な酵素にて、かつ高プライマー−標的アニーリング特異性の条件下で行う。適当なプライマー特異性を達成することに対するさらなるレベルおよびアプローチはrecAのごとき天然組換え細胞修復メカニズムからの蛋白質を用いて達成することができる。イン・ビトロでのこれらの修復系の適当な適用は、優れた、絶対的でさえある、プライマー鋳型の形成の特異性を可能とするであろう。鋳型の基準はmRNA、またはmRNA：cDNAヘテロデュプレックス、または二本鎖デュプレックスcDNAいずれかである。さらに、本出願に記載するごとき、細胞の天然修復メカニズムを利用する革新的アイデアは、稀な細胞事象についてのcDNAアレイ分析を可能とするシグナルからノイズへのシフティングのためのGSP-RTサブセットにつき後記するもののごとき他の遺伝子特異的プライマー方法に向けて適用することができる。PCRプライマーのいずれか１つのGSP多重遺伝子パネルにおける各P1およびP2プライマーは、すべての遺伝子特異的P1およびP2に共通する５’末端の普遍的プライマー配列（または丁度P1および全てのP2に共通する別々の普遍的配列）を含む。第二ストランド合成の全てのGSP1および2を所望の二本鎖アンプリコンパネルの組から除去して、下流プロセスに対するその非特異的インパクトを排除した後、不都合な副反応および競合的反応を制御するためには、SephadexおよびCentricon等によって供給される分子サイズベースの排除、クロマトグラフィー、固体支持体選択的付着、チミジン（Ｔ）の代わりにデオキシウリジン（Ｕ）で合成されるDNAオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせてウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（UNG）のごとき一本鎖特異的DNase（Mung Bean, S1等）プライマー配列特異的戦略のような多くの戦略が当業者に可能である。別法として、cDNAオリゴプライマーハイブリッドをDNA−ウラシルの代わりに用いることができ、同様に、DNase−フリーRNase処理を介して第一および／または第二ストランド合成の後に排除することができよう。UNG分解のPCR一体化の容易性と組み合わせた、DNA−プライマーを含むウラシルの容易な入手可能性は、望ましくない複雑なプライマー相互作用を排除する効果的な方法を供する。このUNG分解戦略は、選択されたPCRアニーリング温度下でアニーリングすることができるかなり小さなオリゴを生じるであろう。UNG処理に続き、cDNA鋳型混合物は、おそらくは高複雑性RNAによって引き起こされた全ての望ましくない副反応を排除するためのDNase−フリーRNaseでの処理から利益を受けるであろう。（全てのRNAを排除するための任意のRNase処理での）UNG処理に続き、残存する唯一の核酸を第一および相補的な第二ストランドとハイブリダイズさせ、デュプレックスを形成させ、これは、試料の試料可能なPCR鋳型を構成する。次に、後のPCRのために普遍的プライマー（１または２MAX）を含む非−UMPを添加する。正味の効果は、単一試験管中での定量的RT-PCR多重遺伝子同時増幅および引き続いての分析を可能とする、１または２のPCR適合高効率プライマーとともにmRNA（またはDNAマイナスRT）の捕獲である。プライマーは普遍的であるので、それらは正確に同一の効率にて各GSPアンプリコンを起点とし、混乱する多重GSPプライマー性能の問題を排除する。アンプリコンのパネルまたは組と共に各GSP規定アンプリコンは異なる所定の断片サイズを有することができ、各GSP配列が、垂直および水平PAGEおよびアガロースゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、SELDI、MALDI、cDNAアレイ等のごときサイズベースの分析系においてそのユニークなRf値によって分解し、同定することを可能とする。かくして、迅速な多重遺伝子RNA/DNAパネルを迅速に適用して、診断的療法およびモニタリング適用の多様な組につき非常に多数の試料に問うことができる。この方法は、mRNAライブラリープレ増幅と共に、またはそれなくして、単一反応試験管中でのmRNAの個々の試料からの多重遺伝子分析を達成する。１つの試料において１つのアッセイでただ１つの遺伝子のパネルを分析するのを可能とするプレ増幅はない。プレ増幅は、１０００までの異なるアッセイにおいて単一試料を分析する利点を付け加え、かくして、遺伝子の多くの異なるパネルを、１つの試料につき異なる時点で問いかけることができる。いずれかの特定の方法に限定されるものではないが、cDNAアレイまたはキャピラリーゲル電気泳動（CGE）による普遍的PCRパネルの分析は好ましい方法である。
【００７２】
かくして、先行技術の慣用的技術から本発明を区別する臨界的特徴は、稀な標的mRNA種の選択的増幅による信号対ノイズの改良であり、この方法を、現存の多種多様なmRNA分析から新規な開発とする。公知の多種多様な分析系、例えば、多重RT-PCRは、信号対ノイズを実質的に変化させるが、重要な多重系を設計し、最適化する挑戦は、それらを、反応容器中で２を超える標的サブセットにつき一般的に非現実的とした。
【００７３】
また、本発明は、代表的な転写体を選択し、検出すべき標的配列（類）の全組を１つの反応バイアル中で増幅するために高信号対ノイズ改良を利用する。
【００７４】
かくして、本発明は、以下の具体的な使用に限定されず、代表的な遺伝子特異的プライマーの組（類）を用いて、公知の病気状態で見出される標的遺伝子サブセット（類）を生じさせることができる。代表的な組は、注目する病気状態を示す少なくとも２つの異なる標的遺伝子を含む。各反応バイアルでは、遺伝子特異的プライマーの組の数は病気状態および該病気状態を規定する既知の特徴によって決定される。
【００７５】
開示された発明の実施を例示し、診断技術に対する本発明のインパクトを証明するために、以下の実施例を掲げる。これらの実施例は本発明の範囲を限定する意図のものではない。加えて、本書類において引用し、または記載した各特許、特許出願および刊行物の開示は、引用してその全体を一体化させる。これらの実施例を通じて、分子クローニング反応、および他の標準的組換え分子生物学技術はManiatisら, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)（以下、「Maniatisら」）、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002に記載されている方法に従い、特記する以外は、商業的に入手可能な試薬を用いて行った。
【００７６】
実施例１
細胞質RNAの単離
０．０５％サポニンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化溶液であるImmunipermで浸透化させたフェロ流体で選択した未固定細胞から得られた上澄みは、細胞の細胞質に存在する細胞の全RNAの８０％を超えて含有することが判明した。この上澄みから単離されたRNAは、天然および変性アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色で判断して、分解の証拠を示さなかった。フェロ流体で選択した細胞の細胞内染色の後に通常は捨てるこの上澄みは、予期せぬことに、完全なまたは分解していない全長形態でRNAを含み、かくして、形態学的分析でも用いた同一細胞のmRNAプロフィールを供することが判明した。図２は、１分未満で全RNA放出が起こり、細胞質全RNAの約９５％が容易かつ再現性良く単離されることを示すこれらの知見を示す。
【００７７】
劇的に対照的に、慣用的プロセス、すなわち、商業的に入手可能なフェノールベースのRNA溶解緩衝液TrizolR Reagent（Gibco BRL, Gaithersburg, MD, カタログ番号10296）による単離を用いて乳癌細胞系SKBR3の細胞から単離されたRNAは完全に溶解し、全細胞構造がホモゲナイズされ、それにより、ゲノムおよびミトコンドリアDNA、および細胞質、ミトコンドリアおよび核RNAが遊離された。EpCAMフェロ流体で選択されたＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ（サポニン）処理ＳＫＢＲ３細胞からの細胞ペレットの調査（詳細な手法については実施例に参照）は、同一数の非浸透化全細胞から予測されるすべての細胞全ＲＮＡのほぼ１５ないし２０％を占めるゲノムおよびミトコンドリアＤＮＡおよび核およびミトコンドリアほぼ１００％の存在を示した。予測される細胞質ＲＮＡの約９５％が、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ上澄み層から無傷で回収された。
【００７８】
図３に示すごとく乳癌細胞系ＳＫＢＲ３の約２５０，０００細胞を含む二連試験管をまず免疫磁気的に豊富化させ、ついで、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ（＋ＩＰ）の不存在下（ＰＢＳのみ）および存在下にて、室温で１５分間インキュベーとした。ついで、目に見える浸透化細胞ペレットとして８００×ｇＲＣＦにて５分間遠心することによって、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理浸透化細胞を分離した。全ての細胞質可溶性成分を含むＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ上澄み画分を第２の試験管に移した。全未処理細胞から単離した全ＲＮＡ、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理浸透化細胞ペレット、およびＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理細胞上澄み画分を、ＲＮｅａｓｙＲ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）シリカ結合方法を用いて単離した。ついで、これらの全ＲＮＡ画分をＢＮＡＳＥ処理して痕跡量のＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅｄ処理したＲＮＡの分光測定定量により、全細胞（＝１００％）について平均２０ピコグラムの全ＲＮＡ／細胞、ペレット画分からの４ピコグラムの全ＲＮＡ／浸透化細胞（２０％）、上澄み画分からの１６ピコグラムの全ＲＮＡ／細胞（８０％）が得られた。これらの３つのＤＮａｓｅ処理全ＲＮＡ画分から２．５×１０４細胞当量のマスを、図３に示すごとく、ホルムアミド変性し、１％アガロースゲルを通して電気泳動に付し、続いて、臭化エチジウムで染色した。アガロースゲルデンシトメトリーによる定量は分光学的回収値と合致した。また、図３におけるゲルのイメージは、ｒＲＮＡが全長であり、１８Ｓ ｒＲＮＡバンドと共に移動する２ＫＢＳＳＲＮＡマーカーと比較して、４．４ｑｂ ｓｓＲＮＡ共移動２８ＳｒＲＮＡバンドの相対的比率によって証明されるごとく高い完全性を有することを示す。一般に、ほぼ２の１８ｓ ＲＮＡに対する２８Ｓ ｒＲＮＡの観察された相対比は、図４に示すごとくこのゲルをノーザンブロッテイングし、それをオリゴ（ｄＴ）でプローブすることによってさらに示されるごとくｍＲＮＡ一体性の良好な表示である。核から寄与された全ＲＮＡのパーセントについての文献値は１５ないし２５％の範囲内である。かくして、２０％ＲＮＡを含むＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍＲ処理細胞画分は公表された核寄与と合致する。
【００７９】
結論として、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍベースの浸透化は、予期せぬことに、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理未固定細胞の上澄みで容易に回収できるサイトゾル全ＲＮＡのほぼ１００％にて核および細胞質全ＲＮＡの完全な分離を供した。さらに、全ＲＮＡの核画分は、驚くべきことに、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理の後に得られた浸透化細胞構造において依然として無傷であることが判明した。
【００８０】
ポリ−Ａテイルハイブリダイゼーションを用い、２つのＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍＲ細胞画分に由来するＲＮＡのｍＲＮＡ部分を、図３に示すゲルからの変性ＲＮＡの正に荷電したナイロンフィルターへのノーザンプロット移動によって全細胞に対して評価した。オリゴ（ｂＴ）２５−量体プローブを３２Ｐポリヌクレオチドキナーゼで標識し、ついで、ノーザンプロットにハイブリダイズさせた。ポリ−Ａテイルを含む一本鎖ＲＮＡサイズラダーを、ｍＲＮＡ集団の相同的定量的サイジングのために分子量バンディングラダーの形成を可能とするマーカーとして用いた。図４におけるオリゴ（ｄＴ）ハイブリダイゼーションの結果は、３つの試料の間でｍＲＮＡライブラリーにつきサイズ範囲の有意な差が観察されないことを示す。
【００８１】
全細胞ｍＲＮＡからの全ｍＲＮＡ−ブロッテッド領域（すなわち、全ｄＴハイブリッドシグナル）の比較定量的ホスホルイメージ分析は、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理浸透化細胞ペレット核画分）＋Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ−由来サイトゾル画分からの全合計とほとんど同一であった。さらに、ホスホルイメージングによって浸透して、ｄＴ−プローブシグナルからのｍＲＮＡの細胞画分パーセンテージは、アガロースゲルイメージのデンシトメトリー分析から測定した２８Ｓ／１８Ｓ ｒＲＮＡパーゼテージと同一である。これらのデータは、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ−由来サイトゾル全ＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ成分はともに定量的に単離され、高い完全性を呈し、かつ全長であることを証明する。Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ−由来ｍＲＮＡの放出は、転写体のサイズによって制限される。というのは、サイトゾルｍＲＮＡのほぼ１００％がＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ上澄みから検索可能であって、ｒＲＮＡ２８ Ｓ／１８Ｓの一体性はｍＲＮＡ一体性の十分な保持を示すからである。
【００８２】
図４に示したノーザンブロットをストリップし、核特異的前駆体ｒＲＮＡプローブで再度プローブした。図５は、細胞のＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理が核およびサイトゾルの全ＲＮＡ集団の完全な分離を達成すること示す。かくして、核膜構造は、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理の間に依然として無傷であり、核はすべてのその可溶性成分を保持する。
【００８３】
図３におけるノーザンブロットをストリップし、ミトコンドリア−特異的１２Ｓ ｒＲＮＡで再度プローブした。図６に示す結果は、細胞のＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理がミトコンドリアおよびサイトゾルＲＮＡ集団の完全な分離を達成することを証明する。かくして、ミトコンドリア膜構造は、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理の間は依然として無傷である。
【００８４】
図３ないし６においてイメージを生じさせるために用いた同一の全ＲＮＡストック溶液をさらに用いて、同等質量および特異的活性の３２Ｐ−標識第一ストランドｃＤＮＡライブラリーを生じさせた。これらの３つの標識した第１ストランドライブラリープローブをハイブリダイズさせて図７に示すごとく、別々であるが同一に調製されたｃＤＮＡアレイドットプロットを得た。ここでは、目的は、各イメージングフィルタについて、各ｃＤＮＡハイブリッドシグナルパターンの相対的割合を比較することによって、各Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ由来細胞画分において表されるｍＲＮＡの相対的豊富さを評価することであった。鋳型についてのランダムに選択されたｃＤＮＡ遺伝子アレイの同一性を図７に示す。ドットの最も上の列は、略語２３ｋｄ＝２３キロダルソンタンパク質、ａ−ｔｕｂ＝アルファチューブリン、ｂ−ａｃｔ＝ベータアクチン、ｂ２ｍｉｃ＝ベータ−２−ミクログロブリン、ｐｈｏｓ＝ホスホリパーゼセＡ２によって命名されるハウスキーピング遺伝子の組である。第２の列はｆ６＝アルファ＝１−，グロビン、ＣＤ１６＝クラスター決定基１６，ＣＤ１２、ＣＤ３８，ＣＤ４５およびＣＤ３１として命名される。底側部の列は、ｄ６＝マクロファージ阻害サイトカイン１，ＣＫ８＝サイトケラチン８，ＣＫ１８＝サイトケラチン１８，ＣＫ１９＝サイトケラチン１９，ＥｐＣａｍ＝上皮細胞接着分子、ｕＰＡ＝ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターによって命名される一般的な上皮特異的遺伝よりなる。各画分の定性的および定量的ホスホルイメージングの比較は、アレイでの遺伝子の相対的豊富さの有意な差は示さなかった。興味深いことには、これらのデータは、全細胞からの相対的豊富さが、そのサイトゾル画分とおおまかに等しく、該画分は今度はその核画分と等しく、ここに、全ＲＮＡ質量は、核における約２０％からサイトゾルにおける約８０％まで変化することができることを示す。このｃＤＮＡアレイにおける転写体の各長さは、１ないし５ｋｂまで変化し、再度、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ処理細胞からの放出ｍＲＮＡにおいてサイズの偏りがみられないというノーザンブロットの知見を補強する。図７における同一の相対的表示パターンは、予期せぬことに、Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ−由来ＲＮＡが、伝統的な方法に由来する全細胞ｍＲＮＡと、第１ストランド合成につき、同程度に効果的な逆転写酵素鋳型であることを示す。
【００８５】
総じてのこれらのデータは、Immuniperm-由来サイトゾルRNAが、実質的には全てのサイトゾル全RNAの実質的に＞９５％であり、すなわち、全長である全ホモゲナイズ細胞における全ての細胞の全RNAの質量のほぼ８０％を生じ、およびそれは伝統的なフェノールおよびシリカ抽出方法によって単離された全RNAと逆転写の同一効率を有するという予期せぬ知見を示す。かくして、Immuniperm−由来サイトゾル全RNAおよびそれに伴う異種核RNA成分が、伝統的な全細胞高品質RNA単離方法と比較した場合に、全ての慣用的な下流RNA分析方法において同等に効果的な鋳型である。
【００８６】
図８は、約７７０のPC−３細胞をImmunipermで処理することによって得られたサイトゾルRNAのゲルイメージを示す。該データは、より少ない細胞数からのImmuniperm−由来サイトゾルｍRNAが、図３、４、５、６および７に示されるごとく、RNAの同一割合を与えることを示す。従って、サイトゾルRNAのImmuniperm−媒介細胞放出は細胞数依存性ではない。
【００８７】
実施例２
末梢血液からの循環腫瘍細胞の単離
末梢血液からの循環腫瘍細胞の単離、続いてのフローサイトメトリーによる細胞分析およびRT-PCRによる遺伝子発現分析は以下のごとく行うことができる：EDTA-抗凝固処理した血液（７．５ｍｌ）を１５ｍｌコニカル試験管に移し、６．５ｍｌのSystem緩衝液（０．０５％アジ化ナトリウムを含有するPBS、カタログ番号７００１、Immunicom Corp, Huntingdon Valley, PA)を添加する。該試験管を確実に蓋をし、数回逆転させることによって混合する。血液−緩衝液混合物を室温にて８００ｘｇで十分間遠心する。バフィーコーティングした層を乱さないように注意して吸引することによって、上澄みを注意深く取り出す。いくらかの上澄みは試験管に残すことができる。吸引した上澄みは捨てることができる。AB緩衝液（可逆的凝集試薬としてのストレプトアビジンを含有するSystem緩衝液、Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA)を１０ｍｌの最終容量まで試験管に添加する。試験管に蓋をし、数回逆転することによって混合する。VU/デスチオビオチンEpCAMフェロ流体粒子（ストレプトアビジンとのビオチン−可逆的凝集用のデスチオビオチンにコンジュゲートした抗−EpCAMモノクローナル抗体にカップリングした免疫磁気ナノ粒子（Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA)を、バイアルを数回温和に逆転させることによって再懸濁させる。AB緩衝液中の試料に１００μｌのVU/デスチオビオチンEpCAMフェロ流体を添加し、数回逆転させることによって試験管を混合した。発泡を避けるために震盪は避けるべきである。試験管をただちにQMS17（カタログ番号AS０１７, Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA)磁気セパレーターに挿入し、十分間放置する。試験管をセパレーターから取り出し、試験管を数回逆転させることによってその内容物を再懸濁させる。試験管をQMS17磁気セパレーターに再度挿入し、十分間放置する。試験管をセパレーターから取り出し、試験管を数回逆転させることによってその内容物を再懸濁させる。蓋を取り除き、試験管をQMS17セパレーターにさらに２０分間入れる。試験管の内部にQMS17を入れ、パスツールピペットを用いて細胞−緩衝液混合物を注意深く吸引し、吸引した上澄みを捨てる。その後直ちに、試験管をセパレーターから取り出し、３ｍｌのSystem緩衝液を加える。磁気により収集した細胞を軽く撹拌することによって再懸濁させる。頂部近くの細胞が洗浄されるように撹拌する間に、液体は試験管中を上昇する。蓋を外した試験管を再度QMS17セパレーターに１０分間入れ、上澄みをパスツールピペットで吸引する。吸引した上澄みを捨てる。
【００８８】
やはりRNase阻害剤（RNase OUT, カタログ番号10777019, Invitrogen Rockville, MD)を含有する２００μｌのImmuniperm/RNase阻害剤（浸透化試薬、Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA）中で撹拌することによって、磁気により収集した細胞を再懸濁させる。全ての細胞が洗浄されるように撹拌する間に、液体が試験管中を上昇する。２５μｌ容量中のモノクローナル抗−サイトケラチン抗体（C11-PE, 0.25μｇ）（R-フィコエリスリンにコンジュゲートしたサイトケラチン４．５．６．８．１０．１３．１８を認識する抗体のカクテル）のごとき抗体、および１０μｌのCD４５ PERCP（汎抗−白血球マーカー「カタログ番号３４７４６４、Becton Tickinson Sau Jose, CA)またはいずれかの他の適当な抗体を添加し、撹拌によって混合する。１５分間のインキュベーションの後、試験管の底を軽くたたくことによって、試料を温和に撹拌する。試験管を５分間でQMS17に戻す。上澄みを軽く吸引し、Immuniperm-RNA画分を適当に標識された試験管に移す。
【００８９】
実施例３
末梢血液からの循環腫瘍細胞の細胞分析
実施例２からの細胞を２０μｌのCellFix(脱−凝集試薬としてのビオチンおよび細胞保存成分を含有するPBSベースの緩衝液, Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA)に再懸濁させ、５分間インキュベートする。試料を１２ｘ７５ｍｍフロー試験管に移し、３００μｌのPDSと合わせ、続いて、核酸色素チオフラビンT(Sigma番号T3516, 10μｌ）および約１０μｌの蛍光ビーズ（１０,000ビーズ； Flow-Set Fluorospheres, カタログ番号６６０７００７ Coulter Miami, FL)を添加する。撹拌することによって試料を混合する。好ましくは、蛍光ビーズ試験管を、ビーズをピペットにより添加する前に撹拌することによって混合する。次いで、試料をフローサイトメトリーで分析する。
【００９０】
実施例４
末梢血液からの循環腫瘍細胞の遺伝子発現分析
磁気オリゴ（ｄT)標識ビーズ（Dynabeads R mRNA DirectR Micro Kit, Dynal, Prod.番号６１０．２１０, New Hyde Park, NY)を用いて、ポリ（A)+ｍRNAを単離する。別法として、シリカ結合、ポリマー結合、Trizol R試薬（Gibco Drl カタログ番号１０２９６）のようなより伝統的なフェノール抽出のごとき当業者に知られた適当ないずれかの他の手段を用いることによって全RNAを単離することもできる。DNase1(Zibco DRL)のごときDNase酵素での処理によってゲノミックDNAを排除する。２：１の１０ｘDNase1(1U/:1)、１：１のRNase阻害剤（クローン化）、５：１のｄH2O、および１０：１のRNAまたは対照（２５０1ngのゲノミックDNA）よりなる酵素ミックスを調製する。該酵素ミックスを３７℃で２０分間インキュベートする。磁気オリゴ（ｄT)標識ビーズまたはTrizolR単離によってDNase処理したRNAを再度精製し、１０：１RNase-フリー水に再懸濁させる。２％アガロースゲルで対照ゲノミックDNA（＋／−DNase処理）を泳動し、臭化エチジュール染色することによって、DNase酵素の活性を確認する。
【００９１】
rTth（Thermos thermophilis）RT-PCRを用い、特異的mRNA配列を増幅することができる。１０：１の５×EZ緩衝液１．５：１のmATP、１．５：１のdCTP、１．５：１のｄＣＴＰ、１．５：１のｄＧＴＰ、１．２５：１のdUTP、５：１のMn＋＋（２５ｍM)、２：１のrTth（２．５Ｕ／：１）、０．５：１のUNG（１Ｕ／：１）、１２．２５：１のdH2O、２．２５：１のセンスプライマー、および２．２５：１のアンチセンスプライマーよりなるマスターミックスを、特異的mRNA種の逆転写のために調製することができる。１０：１のDNase処理RNAを含有し、１０：１のH2Oを含有する対応する陰性対照試験管に対応する同一試験管に、４０：１容量のマスターミックスを添加する。PCRサーモサイクリングは以下のごとく４０サイクルにつき行う：２分間の５０℃（プレPCR）、３０分間の６２℃／６５℃（プレ−PCR）、１分間の９５℃（プレ−PCR）、１５秒間の９４℃（PCR）、３０秒間の６２℃／６５℃（PCR)、および７分間の６２℃／６５℃（ポスト−PCR）。サーモサイクリングが完了した後、試料試験管を直ちに２分間−２０℃ブロックに入れる。完了の後、試料試験管を、ゲル分析を行うまで４℃ブロックに入れる。２０：１の容量を２％アガロースゲルで泳動させ、臭化エチジウム染色する。特異的mRNA転写体の定性的および定量的遺伝子発現測定は予測される分子量におけるアンプリコンの存在につき、UVトランスイリュミネーターおよびアルファイメージャーを用いてゲルイメージの調査によって行う。
【００９２】
本明細書中に記載したのに加え、本発明の種々の変形はこれまでの記載から当業者に明らかであろう。そのような修飾もまた添付の請求の範囲の範囲内は入ることを意図する。
【００９３】
実施例５
末梢血液中の循環腫瘍細胞からの蛋白質の単離および分析
０．０５％サポニンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化溶液であるImmunipermで浸透化させた約１００万のフェロ流体−選択SKBR3細胞から得られた上澄みは、実施例１で分析された核酸成分に加え、細胞の細胞質に存在する放出された可溶性サイトゾル蛋白質も含有する。かくして、細胞の表面中または表面上に残存するこの上澄み溶液および不溶性蛋白質中の可溶性蛋白質は、全蛋白質発現プロフィールまたは細胞のプロテオミックスプロフィールならびに細胞形態を決定する手段を供する。
【００９４】
まず、Immuniperm処理により細胞質から遊離された全サイトゾル可溶性蛋白質の画分を、細胞からの全サイトゾル蛋白質放出のための好ましい試薬である界面活性剤であるNP-40で処理された二連細胞調製物から遊離された蛋白質の全量に対して決定する。双方の処理された細胞集団は、分光測定LowryおよびBradford方法のごとき慣用的方法による全可溶性蛋白質の測定に先立ち、遠心または磁気分離を介して膜デブリスから遊離させる。
【００９５】
第２に、２つの試料調製物のアリコットを４ないし２０％グラジエントSDSポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付して、（ａ）Immuniperm-由来サイトゾル蛋白質についての分子量カットオフを決定し、（ｂ）２つの調製物においてバンド当たりの蛋白質の蛋白質バンディングパターンおよび相対量を比較する。
【００９６】
第３に、２Ｄ電気泳動によってアリコットをさらに分析し、慣用的に染色するか、または検出可能に標識して、同定可能で同定されていない成分の定性的および定量的スポットパターンに基づいて、２つの画分における蛋白質のサイズおよび等電点についての「フィンガープリント」情報を得る。得られた情報は、正常および形質転換細胞の集団のサイトゾルおよび全蛋白質区画における相対的および絶対的蛋白質発現パターンのプロテオミック発現プロフィールを生じる。
【００９７】
実施例６
稀な細胞事象および稀な転写体のcDNAアレイ分析のごとき固有の信号対ノイズ（S/N）制限を伴う診断フォーマットを可能とするmRNAライブラリーサブセットの遺伝子特異的起点（ＧＳＰ）ＲＮＡポリメラーゼベースの増幅
【００９８】
RNA単離の後、いくつかのRNA分析方法を適用することができる。伝統的なRT-PCRまたはより望ましい定量的バージョンを適用することができるが、それらは、一般に、個々の試料の貧弱な使用と考えられる。というのは、これらの試料は非常に少量の出発物質しか生じないからである。その結果、臨床的感度は多重遺伝子分析と妥協する。かくして、増幅されていないmRNA／cDNAライブラリーを、臨床（および最大技術）感度と妥協することなく１つの遺伝子のみにつき一回分析できるに過ぎない。個々の試料はほとんどできないが、いくつかのより高いスループット方法を開発した。
【００９９】
ここに、我々は、全てただ１つの反応試験管におけるマイクロアレイフォーマットにおけるごとき高スループットフォーマットを介して同時に（２ないし１０００の）複数遺伝子の発現レベルを測定できるのが大いに望ましいことを示す。これは、作業量を有意に低下させることなく、かつ感度の喪失なくして達成される。稀な細胞事象およびそれらの稀なmRNA試料についての単一試験管cDNAマイクロアレイ分析に対する重要な障害は、出発mRNA試料におけるその固有の不都合なS/N比率である。
【０１００】
放射性標識cDNAアレイでは、これらの制限は、（a）１つの特異的公知の標的を、（ｂ）S/N比率のバックグラウンドフィルター（固体支持体）ノイズ成分を増加させることなく、一度にナイロンフィルターアレイシステムにハイブリダイズさせることができる最大量の標識された非特異的（バックグラウンドノイズ）標的（２０ｎｇ＝２×１０１１ライブラリーのランダムに標識された標的分子）にスパイクした場合の、溶液相で検出可能な標的コピー数（ほぼ５×１０５）のより低い制限に由来する。
【０１０１】
免疫磁気的に豊富化された試料では、有意なバックグラウンドノイズmRNAは、豊富化プロセスの間に不可避的行われるWBCの存在のためである。１つの解決は、所定の遺伝子のサブセットのみを選択する第二ラウンドのRNAポリメラーゼ増幅（RNAPA）を行うことによって、稀な細胞からの所望の稀なmRNAに好都合なようにS/N比率を１０００倍までシフトすることである。
【０１０２】
このGSPサブセットRNAPA選択プロセスを低下させて、臨床試料（ほぼ５０００WBC中１０ｎｇ全RNA）／CTC（ほぼ５０CTC中０．５ｎｇ全RNA）で見出される典型的なWBC mRNAコピー数の比率を反映するモデル形を用いてこの実施例で行う。５０CTCよりなるこの出発試料ストックの当量アリコットにおいて、リアルタイム定量RT-PCRによる数を、表１に示すごとく、前立腺特異的抗原（PSA=2650）、前立腺特異的膜抗原（PSM=1750）、アンドロゲン受容体（AR=100）および上皮細胞接着分子（EpCAM=1163）における全ての検出可能なmRNAについて決定した。非特異的バックグラウンドノイズに比例する出発WBC mRNA全コピー数はほぼ１０８ないし１０９であった。この特定の例では、出発全RNA/mRNAを、まず、リアルタイム定量RT-PCRによって測定して、全てのmRNA種をほぼ同等に比例的に増加させた１ラウンドの増幅に付した（表１）。引き続いて、第一ラウンドの増幅されたaRNAの２５ngアリコットを第二ラウンドのGSPサブセットRNAPAに付し、後記するごとく、４GSP標的の信号対ノイズをシフトさせた（表１）。
【０１０３】
第二ラウンドのGSP RNAPAにおいて、鍵となる選択工程は、単一RT反応中に起こり、そのうち遺伝子特異的RTプライマーは含まれる所定のmRNAライブラリーサブセットについてのみの第一ストランドを同時に形成する。本実施例においては、GSP RPプライマーのサブセットは、前記した４つのmRNA（PSA、PSM、AR、EpCAM）についてのものであった。GSP-RT選択的第一ストランド合成に続いて、適当なDNAポリメラーゼおよびオリゴ（dT）プライマー担持７RNAPプロモーターを用いて、相補的第二ストランドを合成し、かくして、二本鎖DNA鋳型T7RNAPの選択的サブセットを得た。
【０１０４】
かくして、RNAPA可能化鋳型の所望のサブセットは、GSPの第一および第二のストランド合成を介して選択されたものである。この時点において、第二ストランド反応ミックスをDNase-フリーRNaseのカクテルに曝露することによって、全ての残りのRNAを分解させる。別法として、いずれの残存する一本鎖RNA、およびdT依存的第二ストランド合成の間に形成されたいずれの外来性（非−ポリＵ/ポリＡ依存性）一本鎖dDNAも、マングビーンヌクレアーゼのごとき一本鎖特異的ヌクレアーゼによって排除することもできる。次いで、フェノール抽出および／またはシリカ結合によって、二本鎖cDNA鋳型サブセットを精製する。RNAPAレディー鋳型の選択された組を一晩RNAP増幅させて、WBC mRNA由来ノイズを表すF6（アルファ１グロビン配列）のごとき他の可能な鋳型よりもS/Nシフティングにおいて注目する４つのみの遺伝子のほぼ１０００倍増加が得られる。表１は、Ｆ６がＷＢＣでかなり豊富であって、上皮細胞で検出できないこの系で見出されたアルファ１グロビン配列と定義される、引き続いてのGSP-第二ラウンドS/Nシフティングを含めたプロセスを通じて注目するこれらの４つの遺伝子についてのリアルタイム定量的RT-PCRの結果を示す。これらの結果は、選択されたGSP標的の４つが平均を８４４倍増加させ、他方、非標的F6WBCノイズが５．９倍増加させたに過ぎないことを明瞭に示す。かくして、増加GSP標的シグナルをF6WBCノイズで割ると、各GSP標的についての最終的な信号対ノイズ改良が得られた。前記したマングビーンヌクレアーゼおよびGSP-RTプライマー配列の選択／最適化のような修飾を使用することによって、さらなる改良が期待されるであろうことを認識するのが重要である。
【０１０５】
【表１】
Figure 2005507997
【０１０６】
実施例７
固定された試料からの細胞RNAのプロテイナーゼおよび求核試薬ベースの回収により、下流RT依存性分析で高品質のRNA鋳型が得られる。
【０１０７】
驚くべきことに、アルデヒドおよび尿素ベースの安定化剤または固定剤に曝露された試料では、Cyto-ChexTMおよび他のホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド−尿素誘導体系固定剤は、マッチした非固定対照と比較した場合、全血で見出される全ての細胞において全長全RNA、mRNAおよび他の核酸のほぼ１００％を安定化させる。マクロ分子複合剤として安定化された無傷RNAはそのRNA化学的特徴を変化させ、フェノール抽出、シリカ結合およびオリゴ（dT）ハイブリダイゼーションのごとき、現在の伝統的な細胞溶解およびカオトロピック塩ベースのRNA単離方法によって影響されない。
【０１０８】
これらのマクロ分子複合体（共有結合および非共有結合双方）を解離させ、酵素消化および／または化学的求核試薬インキュベーションの組合せを介して逆行させる。その結果、核酸が遊離され、十分に無傷の元のDNAおよびRNAライブラリーのほぼ１００％の単離が可能となる。これらの固定剤−由来RNAライブラリーは、第一ストランドcDNAの逆転写酵素（RT）依存性形成のための高品質鋳型を提供する。
【０１０９】
包括的下流分析のために、または全およびmRNAライブラリーの一般的な機能的可能化のために、これらの固定剤回収RNAを、本出願で記載したaRNAプレ増幅または普遍的RNA方法と組合わせる。
【０１１０】
図９は、他のアルデヒドベースの固定剤のようにCyto-ChexTMが振舞うことを示す。２４時間の固定剤曝露に際して、１％未満のmRNAおよび比例しない量の18S-rRNAは回収可能である（ほぼ１０％）。極端なカオトロピック塩変性化学を適用した場合でさえ（すなわち、GITCおよびフェノール、シリカまたは（dT）ハイブリダイゼーション、BRLのTrizol Reagent, QiagenのRNAミニシリカ結合およびDynalのDynabeads mRNA直接的オリゴ（dT）ポリ（Ａ）＋キット）、回収は極端に低い。
【０１１１】
驚くべきことに、核酸を含む他のマクロ分子に共有結合した蛋白質およびポリペプチドの大部分を除去するプロテイナーゼＫのごときプロテイナーゼおよびトリス塩基のような求核試薬での処理により、十分に無傷な状態で元の全ＲＮＡおよびｎＲＮＡの９０％を超える回収を可能とする十分な核酸の化学的特性を回復した。図９に見出される全ＲＮＡの質量正規化アリコットに由来するａＲＮＡの２５ｇアリコット（図１２Ａ）を、ＣＫ１９およびＥｐＣＡＭ双方についての定量的なＲＴ−ＰＣＲ比較実験に付した。この比較は、非固定ＲＮＡに対する固定剤由来ＲＮＡからの３．８および３．９倍低いコピー数を示した。これは、ＲＴ−ＰＣＲ分析について最大ＲＴ鋳型活性の少なくとも約２５％を回復するための現在のプロテイナーゼＫ処理として理解される。この固定−回収系を介する最大ＲＴ−鋳型活性の２５％の回復は、異なるオペレーターが、非固定適合サンプルに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを介して特異的ＲＮＡ（アルファグロビン）につき、同一手法を行い、パーコール由来白血球細胞を分析する場合に再現性がある。
【０１１２】
さらに、ここで用いるＴｒａｎｓｆｉｘＴＭ処方は、単位容量血液当たりパラホルムアルデヒド固定剤の０．１％最終濃度を達成することが知られている。
【０１１３】
Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ曝露ＲＮＡの喪失および回収挙動はＴｒａｎｓｆｉｘＴＭおよび後に示す他のアルデヒドと同一であるので、Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭおよびＳｔａｄｉｌｃｙｔｅＴＭの処方で見出されるホルムアルデヒド尿素誘導体成分のホルムアルデヒドドナー成分が、核酸の蛋白質への共有結合を担うらしい。
【０１１４】
生物学的系（すなわち、蛋白質および核酸）で見出される多数のマクロ分子求核試薬の存在下でのホルムアルデヒド−尿素誘導体は、これらの誘導体の解離速度の増加に導く。解離は、生物学的求核試薬複合体、おそらくは、共有結合に導くＲＮＡに特異的に会合した調節蛋白質に近接して起こる。次いで、これらの結合および解離を除去し、引き続いてのプロテイナーゼおよびより強い求核試薬処理によって逆行させる。公知の架橋剤であるＴｒａｎｓｆｉｘＴＭは、２４時間安定化された連結細胞からの全長高完全性ｍＲＮＡライブラリーを生じるという事実は全てのアルデヒド系安定化剤が同様な高品質の核酸を生じるであろう。かくして、保存および回収後に核酸の再現可能な収率が得られる。
【０１１５】
全ＲＮＡおよびそれらの対応するｍＲＮＡライブラリーの９０ないし１００％の分析は、以下の図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃに示すごとく、これらおよびほとんどの他のアルデヒドおよび／または尿素誘導体固定剤で可能である。加えて、これらのタイプの固定された核酸のほとんどは、図１１に示すごとく６０℃のごとき高温で加熱されたプロテイナーゼおよび求核試薬カクテルの組合せを介して回収することができる。
【０１１６】
これらの結果は、高温での１時間の緩衝液単独中の固定ＲＮＡの加熱が、ｍＲＮＡライブラリーの一部を生じることを示す。この高温回収効果は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ＲＮＡ検索ですでに示されているが、全血においてはこの結果がどこにも報告されていない。さらに、本出願で回収されたｍＲＮＡライブラリーの質および量は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ＲＮＡ検索を用いるこれらの報告では得られていない。
【０１１７】
他の求核試薬（トリス、酢酸ヒドラジドおよびヒドロキシアミン）を用いて回収されたものとｍＲＮＡライブラリーを比較すると、各求核試薬についてのｍＲＮＡ転写体サイズ分布の割合は、試料のいずれもＲＮＡ分解を示すにもかかわらず異なっている。これは、異なるタイプのｍＲＮＡ配列が特異的求核試薬およびインキュベーション条件によって検索可能であることを示唆する（すなわち、異なるタイプのホルムアルデヒド修飾は逆行される）。また、用いた種々の酵素は、異なる回収割合を示す（図１１、ゲル底部）。
【０１１８】
異なる固定剤逆行剤は、異なる割合のｍＲＮＡライブラリーを生じるという観察と組合わせて、プロテイナーゼＫ消化単独が最大ＲＴ−鋳型活性の２５％を回復するという事実は、求核試薬および酵素の組合せを使用することによる有意に改良された回収が可能であることを強く支持する。
【０１１９】
特に、比較的非侵入的末梢血液モデルを用いて癌についてのｍＲＮＡ診断適用の可能性を証明するため、図１２Ａは、室温での２４時間Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭでの安定化後に７．５ｍｌ末梢血液への三連の１０および２０ＳＫＢＲ３細胞スパイクで単離された全ＲＮＡ／ｍＲＮＡの単一Ｔ７ＲＮＡＴプレ増幅からのｍＲＮＡからの得られた相対的質および量を示す。次いで、これらの連の各々を、免疫磁気的に豊富化させ、それから、細胞溶解物をプロテイナーゼ逆行条件で処理し、続いてシリカ結合全ＲＮＡ単離で処理した。ａＲＮＡの正規化された当量を、特異的遺伝子ＣＫ１９およびEpCAMについての定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応で用いた。結果は図１２Ｂおよび図１２Ｃに示す。図１２Ｂおよび１２Ｃから分かるように、ＣＫ１９によって測定された全てのスパイクはドナー−適合三連（スパイクなし対照）に対して強く陽性であった。同様に、EpCAMは、このドナーの三連のスパイクなし対照で観察された異所性の（内因性）および極端に低いレベルの発現にもかかわらず、全てのスパイクについて同一の１００％の陽性スコアを有する。事実、ＲＴ−ＰＣＲによるこの低いレベルのEpCAM ｍＲＮＡ検出は、この配列で通常観察され、偽陽性ＰＣＲ汚染によるものではない。
【０１２０】
図１２Ｄおよび１２Ｅは、三つの異なるアルデヒド系固定剤であるＣｙyo-ChexTM、StabilcyteTMおよびTransfixTMから得られた変化するｍＲＮＡ ＲＴ−鋳型の品質を示す。示したごとく、ＴｒｎｓｆｉｘＴＭはｍＲＮＡ鋳型を生じ、これは、Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭまたはＳｔａｂｉｌｃｙｔｅＴＭいずれかよりもかなり低いＲＴ品質のものであろう。さらに、これらのデータをスパイクされた細胞の数に対して正規化し、正確に同一フラスコのＳＫＢＲ３細胞における時刻＝０での修飾されていない細胞と比較すると、固定された−対−非固定ＣＫ１９およびEpCAM ｍＲＮＡの間の差は４倍に過ぎない（１９は示していないＲＮＡデータを導いた）。これは、ここにプロテイナーゼＫ回収単独およびａＲＮＡ増幅と組合わせた２４時間の安定化プロセスにより、ＲＴについて可能な鋳型の質の２５％を生じたことを意味すると解釈される。さらに、１００％未満のＲＴ質についての理由は、プロテイナーゼＫ単独は除去できないアルデヒド修飾によるものらしい。かくして、プロテイナーゼおよび求核試薬カクテルの組合せは、これらの実験で証明されるごとく、これらの鋳型のＲＴ−質を２５％を超えて有意に改良するであろう。同様な条件下での関連文献と比較すると、ホルマリン固定パラホルムアルデヒド包埋組織に由来するＲＴ ＲＮＡ鋳型質の同一パラメーターを評価する研究は、非固定化組織に対してＲＴ−鋳型質の１３ないし６０倍低下を示す（ＧＯＤＦＲＥＹら, Quantitative mRNA Expression Analysis from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues Using 5' Nuclease Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, J. of Molecular Diagnostics, 2:84-91(2000))。結果として、４倍の低下は先行技術よりも優れた有意な改良を提供する。
【０１２１】
図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ，１２Ｄ，および１２Ｅは、最もありそうには癌細胞である循環上皮細胞の血液ＲＮＡ試料の保存および包括的分析についての再現性のある生成物の有力な手法を確認する。高レベルのｍＲＮＡ保存は、少なくとも５０のｍＲＮＡ分子／細胞内のその細胞に存在する（すなわち、５０コピー／試料のみ）いずれかのｍＲＮＡについての７．５ｍｌの血液にスパイクされた単一細胞の存在を検出できる定量的分析に適用できる。
【０１２２】
まとめると、全血中の共有結合固定の速度およびタイプは固定剤のタイプに従って変化する。同様に、共有結合固定剤の逆行または回収の速度およびタイプは、用いるプロテイナーゼおよび求核試薬のタイプまたは組合せに従って変化するであろう。固定の速度は、注目するｍＲＮＡの半減期が固定の速度よりも速い適用のための臨界的論点であろう。順方向固定および逆方向回収反応（プロセス）の双方は、ＲＮＡのさらに高い質および量を生じるように最適化することができる。しかしながら、安定化され、回収されたＲＮＡの現在の質および量は血液中ではいずれの以前に調べていたものよりも優れていることがここに証明される。
【０１２３】
実施例８
新鮮な非固定血液におけるＣＴＣからのｍＲＮＡの豊富化および分析
ヒト血液を、進行したホルモン難治性前立腺癌（ＨＲＰＣ）を持つ９人の患者および１３人の健康なボランティアから単離し、循環上皮細胞に対して特異的な遺伝子発現ｍＲＮＡについて評価した。
【０１２４】
患者
進行したホルモン難治性前立腺癌（ＨＲＰＣ）を持つ９人の患者、および１３人の健康なボランティア、７名の男性（年齢は２４ないし７３歳の範囲、平均４５歳）、および６名の女性（年齢は２７歳ないし６１歳の範囲、平均３９歳）の血液を１０ｍｌのＥＤＴＡ ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲＴＭ試験管（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ, NJ)に吸い取った。９人のＨＲＰＣ患者のうち、２人の患者は５つのある期間にわたる血液試料を有し、一人の患者は４つの試料を有し、３人の患者は２つの試料を有し、３人の患者が１つの試料を有して、複数時点であった。患者の年齢の範囲は６０ないし８１歳（平均７４歳）であり、彼らの初期の診断は実験に先立って２ないし１０年であった。タキソール／エストラムスチンおよび／またはルプロンでの治療を受けつつあった３人の患者からの系列的試料を調製し、ある期間にわたる系列として分析した。患者および健康なボランティアは、認可された研究実験下での同意を署名して通知した。
【０１２５】
標的細胞の単離
血液試料を室温に維持し、特に示さない限り収集から２ないし３時間以内に処理した。１５ｍｌの血液を７．５ｍｌのアリコットに分け、内径１７ｍｍのディスポーザブル試験管（Ｆｉｓｈｅｒ Scientific)に移し、８００ｇにて１０分間遠心した。ウシ血清アルブミン（BSA)を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＤＳ）を加えて、１０ｍｌの容量とし、試料を逆転することによって混合した。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＮ）を認識するＭａｂ ＶＵ−１Ｄ９は、上皮細胞起源の組織と広く反応性であり、磁性ナノ粒子（フェロ流体、Immunicon, Huntingdon Valley, PA)にカップリングする。
【０１２６】
EpCAM-陽性細胞の磁気的負荷を増加させ、かつ細胞表面でのEpCAM密度の差による捕獲効率の変動性を減少させるために、共にここに引用して一体化させる出願番号０９／３５１，５１５および０９／７０２，１８８デスチオビオチンをEpCAM-標識磁気ナノ粒子にカップリングさせ、ＣＡ−EpCAMを形成させる。ついで、ＣＡ−EpCAMフェロ流体およびストレプトアビジンを含有する緩衝液を試料に添加して細胞の磁気標識の増加を達成する。引き続いて、ＣＡ−EpCAMフェロ流体上のデスチオビオチンをビオチンで置き換え、これを、後記する浸透化緩衝液に含ませる。それにより、ＣＡ−EpCAMフェロ流体粒子の間の架橋を逆行させる。試料を直ちに、１０分間、四極磁気セパレーター（ＱＭＳ１７，Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ）に入れた。１０分後、試験管をセパレーターから取り出し、５回反転し、さらに１０分間磁気セパレーターに戻した。この工程をさらに１回反復し、試験管を２０分間セパレーターに戻した。分離の後、上澄みを吸引し、捨てた。試験管を磁気セパレーターから取り出し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する３ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で再懸濁させ、容器の壁から画分を収集した。
【０１２７】
各試料からの２つの７．５ｍｌアリコットを別々に処理した。１つのアリコットを調製し、フローサイトメトリーによって分析し（実施例１２）、他のアリコットからのＲＮＡを記載したごとく分析した。
【０１２８】
ヌクレオチドの精製および増幅
好ましい具体例において本発明を利用する１つの方法は、まずヌクレオチド試料を精製することである。ここに、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを豊富化された細胞集団から単離する。単離は、ｍＲＮＡを無傷に維持し、かつ分解を妨げることができる当該分野で公知のいずれの手段によって達成することもできる。例えば、二連血液試料からの豊富化された循環腫瘍細胞を１００μｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（ＢＲＬ）または１００μｌのＲＮＡ抽出緩衝液（ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に溶解させ、撹拌−ホモゲナイズした試料をＲＮＡを用いるまで−８０℃で貯蔵した。ホモゲネートを用いて製造業者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。簡単に述べると、全ＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉで処理した。ＤＮａｓｅ活性は、ＤＮａｓｅ処理の後に、臭化エチジウムゲルで検出可能なゲノミックＤＮＡを生じないことが確認された。ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、反復したＴＲＩＺＯＬ単離手法で洗浄した。得られた全ＲＮＡの１／１０を、全ＲＮＡの質量およびサイズ標準に添って１％アガロースゲルでの電気泳動に付し、ついで、ノーザンブロットし、等モルのリボソーム１８Ｓおよび２８Ｓオリゴの混合物とハイブリダイズさせた。得られたハイブリッドブロットを３２Ｐで標識し、ホスホルイメージし（Packard Cyclone）、分析して、ＲＮＡの完全性および質量を決定した。ついで、各試料からの残存する全ＲＮＡ質量値（９０％）を、その試料の７．５ｍｌ血液ドナー当量の全ＲＮＡと命名し、その１．５％がｍＲＮＡであると計算された。
【０１２９】
実施例９
免疫磁気選択後における患者でのフローサイトメトリー分析
ヒト血液から採取した白血球のフローサイトメトリー分析は、循環上皮細胞における遺伝子発現について評価した。ついで、単離された細胞を記載されたごとく調製し、それにモノクローナル抗体（Ｍａｂ）−フルオロクロームコンジュゲートを飽和条件で添加した。ビオチン（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する２００μｌの浸透化緩衝液に再懸濁させた。該モノクローナル抗体は、サイトケラチン４、６、８、１０、１３および１８（Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ）を認識するフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲーテッド抗−サイトケラチンモノクローナル抗体（Ｍａｂ Ｃ１１）で、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）−標識抗−ＣＤ４５（Ｈｌｅ−１，ＢＤＩＳ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）よりなるものであった。Ｍａｂと共に細胞を１５分間インキュベートした後、２ｍｌの細胞緩衝液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、細胞懸濁液を１０分間で磁気的に分離した。分離されなかった懸濁液を捨てた後、それにＰｒｏｃｏｕｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＭで用いる核酸色素を添加した０．５ｍｌのＰＢＳに収集された細胞を再懸濁させた（Ｐｒｏｃｏｕｎｔ，ＢＤＩＳ）。加えて、１０，０００蛍光カウンティングビーズを懸濁液に添加して、分析された試料の容量を確認した。（Ｆｌｏｗ−Ｓｅｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ， Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ ＦＬ）。
【０１３０】
４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザー（ＤＤＩＳ）を備えた、ＦＡＣＳＣａｌｉｄｕｒフローサイトメーターで試料を分析した。核酸色素の蛍光での閾値を用い、データ獲得はＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭ（ＢＤＩＳ）で行った。８０００のビーズまたは試料の８０％を分析した後、該獲得を停止した。マルチパラメーターデータ分析は、リストモードデータで行った（Ｐａｉｎｔ−Ａ−ＧａｔｅＴＭ，ＢＤＩＳ）。分析の基準は、順方向光散乱によって規定されるサイズ、直角方向光散乱によって規定される粒度を含んだ。ＰｅｒＣＰ−標識抗−ＣＤ４５ Ｍａｂでの染色と組み合わせた、核酸染色およびＰＥ−標識汎抗サイトケラチンＭａｂ Ｃ１１（ＣＡ４，５，６，８，１０，１３および１８）での陽性染色を、差分ＣＴＣ／ＷＢＣ蛍光染色および分析で用いた。ＣＴＣは、ＣＤ４５染色の不存在とカップリングさせた、核酸色素およびサイトケラチン抗体の存在によって同定した。各試料について、上皮細胞に典型的な領域に存在する事象の数に１．２５を掛けて、フローサイトメトリーによって分析されない試料容量を説明した。
【０１３１】
健康な非癌ドナーの試料においては、免疫磁気選択から運び去られた白血球は６５５ないし５，５６５の範囲であった（メジアン４，３５０，平均１，７５９）。ＨＲＰＣ患者の試料においては、運び去られた白血球は８１３ないし９２，０００の範囲であった（メジアン４，３５０，平均１，３５０）。健康な非癌対照群（７名の男性および６名の女性）からの血液試料はＣＴＣを示さず、他方、ＨＲＰＣからの血液試料は７．５ｍｌの血液中で４ないし２８３のＣＴＣ範囲を示した。
【０１３２】
実施例１０
増幅されたライブラリーからのｍＲＮＡ転写体の定量
まず、各々が免疫磁気的に豊富化された７．５ｍｌの血液試料容量から単離された全ＲＮＡ質量を定量することによって、ｍＲＮＡ／ａＲＮＡ質量の正規化を決定した。これは、各試料の全ＲＮＡの１０％をノーザンブロッティングし、続いて２８Ｓプラス１８Ｓ放射性標識オリゴプローブをハイブリダイゼーションし、および平行して既知の全ＲＮＡ質量細胞系標準にて行うことによって達成された。これに続き、ホスホイメージ定量を行った。（Ｃｙｃｌｏｎｅ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。得られた全ＲＮＡ質量は、１ドナー試料当量のｍＲＮＡ＝１ドナー試料当量のａＲＮＡ；
[(全ＲＮＡ質量)×(1.5％ｍＲＮＡ)]／３＊＝１ドナー試料当量のａＲＮＡで、＊ＲＮＡライブラリーの平均分子量は未増幅ｍＲＮＡの分子量よりも３倍低いことが判明した。
【０１３３】
０，１，２，３および４の相対的遺伝子発現レベルは、既知のコピー数のＣＮ１９イン・ビボ転写ＲＮＡ構築体（ＣＫ１９−ｃＲＮＡ）標準を含む未知ベースの増幅された産物のアガロースゲル速度曲線バンドの強度に帰属された。このＣＫ１９−ＣＲＮＡ標準は、ＣＫ１９野生型ｍＲＮＡ配列の最も３’側の８００の塩基を含んだ。１０００倍動的範囲をカバーした標準ＣＫ１９−ｃＲＮＡ曲線は、各々が、パーコール−由来ＷＤＣから単離した２ｎｇ全ＲＮＡにスパイクされた２０，０００；２，０００；２００；１００；５０；２５；および１２．５コピーにおいて三連で行った。４０サイクル行った標準速度直線は、１３ないし２０００コピーのＣＫ１９−ＣＲＮＡ転写体の間のＲＮＡコピー数に対する直線上シグナル応答ブロッティングバンドの強度を示した［図１３Ａおよび図１３Ｂ参照］。外部標準曲線は、三連で分析したいずれの標準についても２７％最大ＣＶを有した。多変数遺伝子分析ではＣＫ１９外部標準曲線に対して比較を行い、相対的遺伝子発現レベル０ないし４を割り当てた：
０−非−検出可能
１−ほぼ２５ないし５０コピーのCK19
２−ほぼ２５０ないし５００コピーのCK１９
３−ほぼ２，５００ないし５，０００コピーのCK１９、および
４−２５，０００を超えるコピーのCK１９。
【０１３４】
図１３Bは、標準曲線上のCK１９ ｃRNAの近似コピー数に対応する典型的なバンディング強度を示し、これを用いて相対的遺伝子発現レベル１ないし４を割り当てた。
【０１３５】
CTC計数および遺伝子転写体発現プロフィールは、１３人の健康なドナーおよび９人のHRPC患者のEp-CAMの免疫磁気的に豊富化した血液試料からの２３の異なるPCR増幅産物を用いて決定した。マイクロアレイは、免疫磁気豊富化プロセスの間に非特異的に運び去られたWBCに由来する信号対ノイズ不適合性のため、これらのタイプの試料を分析するのに効果的ではなかった。これらの試料におけるWBCキャリーオーバーノイズに対するCTC特異的信号の比率は、１０３ないし１０４WBC当たり１ないし１０００CTCの範囲である。これらのマイクロアレイの制限は、各免疫磁気的に豊富化された血液試料からの全ｍRNAライブラリーの９０％を用いて１０，０００倍浸透化工程を取込み、続いて、アレイの代わりに多重遺伝子RT−PCR分析を行うことによって克服した。この革新は、各７．５ｍｌ血液試料で行うべき数１００の個々のPCR反応のための十分な出発物質を提供する。かくして、各CTC ｍRNAライブラリーの各ｍRNAメンバーについてアッセイ感度または臨床感度に妥協することなく、個々の患者のCTC多変数RT-PCRプロフィール分析を行うことが可能となる。
【０１３６】
前記した容量正規化手法の後、各試料からの残存する９０％全RNAは、前記した６７塩基オリゴ（ｄT)プライマーを用いるのではなく、SMART PCR ｃDNA合成キットを用いて逆転写（RT)した。反応を４２℃にて９０分間インキュベートした。Advantage ｃDNA PCR キット（Clontech)を用い、全１０μｌ RTを５０μｌのPCR反応に移し、PE−９６００および熱サイクリングプログラム；１分間の９５℃、１０サイクルの１５秒間の９５℃、１秒間の６５℃、６分間の６８℃、続いての７２℃の２０分間を用い、P1−SMARTプライマーおよびP2−T7 １８塩基プライマーでのPCRに付した:
(5'-TCTAGTCGACGGCCAGTGAATT-3')。
全PCR反応容量をSephadex G-50 Quick Spin (TE)カラム(Roche Diagnostics)に付加し、製造業者の指示に従って溶出物を得た。
【０１３７】
溶出物を、６０℃にて、Vacufuge (Eppendorf)でほぼ３０分間真空濃縮して３μlとした。aRNAの代表的なライブラリーを生じたRNAポリメラーゼ転写体増幅反応は、２０μl容量にて、製造業者の指示に従い、AmpliScribeキット(Epicenter Technologies)を用いて組み立て、３７℃にて６ないし１２時間インキュベートした。Trizol単離手法を反復し、さらにRNA転写反応物を洗浄した。
【０１３８】
RNAサイズ標準、RNA質量標準、各試料からの転写反応産物の１／１０を６５℃にて１５分間ホルムアミド変性し、２%アガロースゲルに負荷し、５ボルト／CNにて１５分間泳動させ、AlphalmagerTM(Alpha Innotech Corp.)を用いるゲルイメージデンシトメトリーに従って、SYBR GoldTM(Moecular Probes)で１時間ポスト染色した。各転写体ライブラリーの質量を測定した。
【０１３９】
遺伝子特異的プライマーは記載したごとく設計した。全てのプライマー組は各特異的遺伝子標的の最も３'側の５００塩基対内(平均３４４bp、長さが２２６ないし５１３bpの範囲)の特異的遺伝子標的cDNAを増幅するように設計した。ゲノミックＤＮＡの増幅を回避するために、すべてのRNA試料を記載されているごとくにDnaseで処理した。表１は、相対的RT-PCRによって分析された各アンプリコンについてのプライマー対を示す。順方向プライマーP1は、各々のプライマー対において上側配列として示す。逆方向プライマーは下側配列である。全ての配列は５'側から３'側に向けて表す。
【０１４０】
【表２】
Figure 2005507997
【表３】
Figure 2005507997
【０１４１】
逆転写(RT)は、製造業者の指示に従い、ランダム９量体５０mg、１μlのSupersciptTM(BRL)を用いて、２５ナノグラムのＴ７プレ増幅ａＲＮＡライブラリーで行った。ＲＴは２５℃にて１０分間、３７℃にて１０分間、４２℃にて２０分間、５０℃にて６０分間インキュベートした。ａＲＮＡの試料当たり１０ドナー当量（５０ないし１３００ｐｇ）を、１単位の白金ｔａｑ（ＢＲＬ）を含有する各引き続いての５０μｌのＰＣＲ反応で用いた。ＰＥ−９６００サーモサイクラーを用いる熱サイクリングプログラム：１分間の９５℃および３１、３５および４０サイクルの１秒間の９５℃、１秒間の６５℃、１分間の７２℃；続いての７２℃での２０分間；の間の３１，３５および４０サイクルにおいて１５μｌをアリコットすることによって、個々のＰＣＲ曲線を各単一ＰＣＲ反応試験管から作成した。各ＰＣＲバッチ内の各アンプリコンは細胞系ｃＤＮＡ増幅陽性対照、ｃＤＮＡ試料を除いて全ての成分を含有したマスター混合ＰＣＲ試薬陰性対照を含んだ。ＢＲＬ低質量分子量およびＡｌｐｈａＥａｓｅ ＴＭソフトウェアバージョン５．０４でのスポットデンシトメトリー分析と平行して、全てのＲＴ−ＰＣＲの結果は、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルで分析した。
【０１４２】
遺伝子概観目標は、最高の臨床感度および上皮細胞を検出するための感度にて、ＣＴＣにおいてｍＲＮＡ発現プロフィールを同定することであった。また、ＷＢＣで見出された遺伝子発現レベルを健康なドナーの豊富化から評価した。遺伝子候補の選択は広い上皮特異的発現レベルを示した公知の文献データに基づくものであった。ＷＢＣにおいて陰性であった候補の同定は、３つの基本的な組織学的レベル、上皮起源（図１４ａ）、腫瘍／器官の起源（図１４ｂ）および腫瘍治療標的特徴付け（図１４ｃ）に対するカテゴリー化／特徴付けＣＴＣプロファイリングを可能とするであろう。
【０１４３】
ＲＴーＰＣＲプロファイリングは図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃにおけるアンプリコン組に従って、全ての試料で行った。図１４Ａは、上皮マーカーＣＫ１９がＨＲＰＣ試料についての本発明のシステムで１００％特異的であることを示し、ここに、１８／２３（７８％）に比較して、０／１３健康ドナーはＣＫ１９陽性であった。ＨＲＰＣ患者試料は、ＣＫ１９陰性のスコアであった、またおよびＴＲＯＰ２は１００％特異的である。しかしながら１／１３（４％） ２／２３（９％）のそれらの貧弱な感度は、各々、それらの使用を正当化するのに十分なプロフィール値を与えることができない。１００％特異的ではない遺伝子のうち（ＥｐＣＡＭ）、Ｍｕｃ−１およびＭＩＣ−１）、ＷＣバックグラウンド閾値をレベル１および２の間で適用することができ、それを超えては、１を超える患者由来のシグナルは真の陽性であると考えることができる。遺伝子のこの組での細胞上皮感度、ＣＫ１９，ＥｐＣＡＭ、およびＭｕｃ−１感度の組合せについてプロファイリングを行う場合、２３／２３（１００％）患者試料は上皮−陽性のスコアであった、すべての血液試料はフェロ流体豊富化プロセスからの低い非特異的結合のため、ＷＢＣのキャリオーバーを生じるので、ＷＢＣ特異的遺伝子（Ｆ１６＝アルファグロビン遺伝子）を、ＲＮＡプロセッシングおよび増幅用の総じてのシステム陽性対照として使用した。すべての３６の試料はレベル４を超える得点であった（図１４Ａ参照）。
【０１４４】
実施例１１
プレ増幅のより低い制限感度における再現性の評価
修飾されたＴ１７転写体プレプロセッシング増幅手法の再現可能なより低い制限感度性能を評価するために、臨床ＲＮＡ試料で行うすべての操作を組み込んでモデルシステムを構築した。乳癌および前立腺癌細胞系ＳＫＢＲ３およびＬＮＣａＰからの全ＲＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓｅｓ， ＶＡ）を製造業者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて単離した。第一ストランド合成の系列希釈を２、０．２、０．０２ ＳＫＢＲ−３細胞当量に対応させて作成する前に、各希釈をパーコール−由来ＷＢＣからの２ｍｇからの全ＲＮＡにスパイクした。ＲＴ−ＰＣＲ外部ＣＫ１９標準曲線の決定は、ＳＫＢＲ−３希釈曲線と平行して行い、その結果、ＳＫＢＲ−３細胞当量当たり存在する約１，０００野生型ＣＫ１９ｍＲＮＡコピーがもたらされた。ＣＫ１９特徴付けＳＫＢＲ−３希釈曲線を２つのタイプの特異的転写体の１つとして用いて、このＴ７−ベースのｍＲＮＡライブラリー増幅システムの全プロセスのより低い制限感度および再現性をモデル化した。第２の転写体が、外因性ラムダＤＮＡベースの構築体（Walker Biotech Publication）であり、１．２ｋｂ ポリＡ（３０）転写体を生じる。ＳＫＢＲ−３細胞でスパイクされたＷＢＣについての曲線を、２０００、２００および２０のＣＫ１９ ｍＲＮＡコピーレベルの各々にて三連でアッセイした。ラムダ曲線は、５００、５０および５のコピーレベルにてパーコール由来ＷＢＣからの２ｎｇ全ＲＮＡに三連でスパイクした。最後の分析において、再現可能なＲＴ−ＰＣＲ増幅は５０コピーよりより大きなレベル（Ｎ＝１２）から達成され、ここに、個々の試料は全Ｔ７−転写体プレ増幅を通じて行い、その各々の結果、測定可能な信号が得られた。さらに、いずれか１つの配列の５０ｍＲＮＡ転写体のみで出発し、検出のこの下限は、すべての６つの配列タイプ（ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＡＲ、ＨＰＮ、ＣＫ１９およびＥｐＣＡＭ）をａＲＮＡおよび定量的（ＲＴ−ＰＣＲ分析に先立って既知のコピーレベルまで系列的に希釈する引き続いての細胞系スパイクモデルで再現された（実施例６）。
【０１４５】
ＲＴ−ＰＣＲの後、分子量およびスポットデンシトメトリーゲル分析を、３１、３５および４０サイクルの動的曲線からのアリコットについてＡｌｐｈａｌｍａｇｅｒで行った。１９．２５％のＣＶは、１２のスパイクレベルの１１から計算した（９２％）。２００コピー試料のうちのただ一つ（８％）が予測されるよりも１４倍低い同一性を有したが、この試料は依然として定量的に検出可能であって、レベル１として割り当てられた。
【０１４６】
別々の実験において、相対的ｍＲＮＡ豊富さに対する本発明のＴ７プレ増幅方法の効果は、同定可能に調製された非−増幅ライブラリーとの比較によってモデル化した。１０００細胞当量のＷＢＣ全ＲＮＡ（２ｎｇ）にスパイクされた１５細胞当量の前立腺癌細胞系ＬＮＣａｐ＋１５細胞当量の乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３で出発した場合、Ｎ＝８遺伝子（ＰＣＡ、ＰＳＭ、ＭＧＢ１、ＭＧＢ２、ＰＩＰ、ＣＫ８、ＣＫ１９、およびＥｐＣＡＭ）についてのバンド強度比率の有意な差は検出されず、続いて、図１３Ｃに示すごとく、Ｔ７プレ増幅方法および引き続いての多重遺伝子ＲＴ−ＰＣＲ動的曲線分析を行った。各バッチで平行して行ったｃＤＮＡ鋳型陰性増幅制御は、これらの実験の間に検出可能な信号を示さなかった。
【０１４７】
本発明の修飾されたＴ７方法の１ラウンドを用いて全ＲＮＡライブラリーを比例して増幅し、元のｍＲＮＡ質量の１０，０００倍を超える平均増加でもってａＲＮＡライブラリーが得られた。これは、測定された全ＲＮＡ質量の１，５％の元のｍＲＮＡレベル評価に基づく。転写体増幅プロセスの結果、６００塩基のメジウム転写体長さのライブラリーが得られ、これは、５５０ないし８００塩基の間の範囲であり、各ライブラリー内の個々の転写体のサイズは３００ないし３０００塩基の範囲であった。個々のａＲＮＡライブラリーはＲＴにつきランダム起点とされ、それから、１０ドナー当量のａＲＮＡ／ｃＤＮＡを用いて個々のＰＣＲ反応の多重遺伝子パネルを行った。
【０１４８】
健康な非−癌試料における運び去られたＷＢＣからの全ＲＮＡの量は０．８ないし１１．１２ｎｇの範囲であった（平均３．５ｎｇ）。ＨＲＰＣ患者試料からの全ＲＮＡの量は０．８ないし３５．１２ｎｇの範囲であった（平均７．２ｎｇ）。全ての全ＲＮＡ試料は、引き続いて、出発の全ＲＮＡ値に直接比例した質量のａＲＮＡライブラリーを生じた。
【０１４９】
各試料の全ＲＮＡの１０％のノーザンブロットを、既知質量の細胞系標準からの全ＲＮＡと平行して２８Ｓ＋１８Ｓ放射性標識オリゴプローブとハイブリダイズさせ、続いて、量および質の測定のためにホスホイメージを行った。質は、１８Ｓを超える２８Ｓの量の比率によって評価し、ここに、ＳＫＢＲ−３細胞系標準は豊富化された試料については平均して１．５５であり（１．５０ないし１．６４の範囲）、１３人の健康なドナーは平均して１．３６であり（１．６６ないし１．６０の範囲）、ＨＲＰＣは平均して１．１０であった（０．５７ないし１．８０の範囲）。
【０１５０】
加えて、本発明者らは、ＨＲＰＣ患者からのフェロ流体豊富化ＣＴＣ／ＷＢＣ試料の８０％は、予測されるよりも６倍低い全ＲＮＡ質量を有することを観察した（１．５ないし１５倍の範囲）。これらの予測はＷＢＣ平均全ＲＮＡ質量＝細胞当たり２ｐｇおよび平均上皮細胞全ＲＮＡ質量＝細胞当たり２０ｐｇに基づくものであった。これは、特に、治療の間において、個体の診断および治療状態を評価するのに有意義であろう。
【０１５１】
実施例１２
組織特異的遺伝子を用いるＣＴＣ腫瘍起源組織の確認および患者特異的治療プロフィールの特徴付け
３６試料をＮ＝８アンプリコンでさらにプロフィールして、循環上皮腫瘍細胞の起源器官の同定のために最適な特異性および感度発現プロフィールを決定した。前立腺特異的同定では、我々は、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＨＫ２、ＨＰＮ、ＰＳＧＲ、ＤＤ３、ＭＧＢ１およびＭＧＢ２を評価した（図１４Ｂ参照）。これらのアンプリコンのいずれも、一つのＨｅｐｓｉｎ（Ｈｐｎ）を持つかけ離れた女性３名を除いてＷＢＣ群からのいずれの信号も示さなかった。図１４Ｂに示すごとく、ＰＳＡは２０／２３（８９％）試料の陽性得点にてこの前立腺群でもっとも感度がよく、続いて、ＰＳＭ １７／２３（７４％）、ＨＰＭ １３／２３（５７％）、ＨＫ２ ７／２３（３０％）、ＰＳＧＲ ２／２３（９％）、およびＤＤ３ １／２３（４％）であった。予期せぬことに、「***特異的」遺伝子、ママグロビン１および２は、共に健康なドナー集団ではなく前立腺において強い信号レベル陽性ＭＢＧ１ １／２３（４％）およびＭＢＧ２ ２／２３（９％）の得点であった。二つの最大感度のマーカーＰＳＡおよびＰＳＭを合わせると、２０／２３（８７％）の感度を生じる。ＨＰＮを加えると、感度は２１／２３（９１％）まで増加する。ＨｅｐｓｉｎおよびＰＳＭは二つのマーカーであり、これは、治療戦略において中枢的である。というのは、それら共に組織特異的であって、膜貫通特異的細胞標的送達戦略だからである。
【０１５２】
ＣＴＣ ＲＮＡプロファイリングに基づく潜在的治療プロフィールの個々の患者の特徴付けを行い、結果を図１４Ｃに示す。ここに、この試料の組における個々の特異性得点はＡＲ、ＮＫＸ３Ａ、ＥＧＦＲおよびＥＲが全て１００％であったことを示した。ＭＤＲ１、ＭＲＰ、およびＴｏｐｏ２ａは、全て、ＷＢＣ群からの有意なバックグラウンド信号を被った。ＨＲＰＣ ＣＴＣを検出するためのＡＲの感度は１６／２３（７０％）であり、続いて、ＮＫＸ３Ａ ４／２３（１７％）、Ｔｏｐｏ２ａ ５／２３（２２％）、ＭＤＲ１ ５／２３（２２％）、ＥＧＦＲ ４／２３（１７％）、およびＥＲ １／２３（４％）であった。予期せぬことに、ＭＤＲおよびＭＲＰはこれらの二つの群を層化のに有用なようには見えなかった。
【０１５３】
一定期間にわたる試料は三人の患者からの１８ないし２６週のコースの上に描かれた。一人の患者はルプロン単独で処置し、二人の患者はタキサン／エストラムスチンと組み合わせたルプロンで処置した。系列的試料は、治療感度／抵抗性関連遺伝子の発現の変化を示し、他方、その他の試料は未変化であった。図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃに示すごとく、これらの変化はＣＴＣおよび白血球カウントからは独立していた。０、５、１０および１８週において吸い取った４つの一定期間にわたる試料を有した、ルプロン単独で処置した患者では、ＭＤＲ１は検出可能ではなく（図１５Ａ）およびＡＲは比較的一定のままであったが、Ｈｅｓｐｉｎは変動した。図１５Ｂおよび１５Ｃは、さらに、ＴＸ／ＥＳ処置の間における健康ドナーに対するＭＤＲ１ ｍＲＮＡレベルの終始一貫した低下を示した。ＨＲＰＣの発生において中枢的な役割を果たすＡＲ発現レベルは、図１５Ｂに示すごとく、ＴＸ／ＥＳ処置の間に完全に排除された。対照的に、図１５Ｃは治療の同様な間に比較的影響されないＡＲを示した。図１５Ｂおよび１５Ｃにおける双方の患者のＴＸ／ＥＳ処置の間に、完全な排除に対する未処置についての高発現レベルからのＨｅｐｓｉｎ ｍＲＮＡで劇的な変化が検出された。
【０１５４】
実施例１３
ＣＴＣ−補充データを供する同一試料からの血漿−由来（非−ＣＴＣ）ＲＮＡでの病気状態のプロファイリング
これまで、血液試料から豊富化されたＣＴＣに由来するｍＲＮＡを分析するための方法が記載されている。この方法の重要な工程は、Ｔ７プレ−増幅工程であり、これは、１０００までの異なる個々の遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲ反応での転写体の数コピーの分析を可能とする。代表的なｍＲＮＡライブラリーのＴ７プレ−増幅は、制限された試料ｍＲＮＡ質量の主な制限を効果的に除去する。この同一プレ−増幅は非−ＣＴＣ ＲＮＡに適用することができる。事実、与えられた血液試料にはＲＮＡの多数の源があり、これらの非−ＣＴＣ ＲＮＡ転写体のいくつかは価値ある情報を提供するであろう。
【０１５５】
ＣＴＣ存在の確認および腫瘍起源組織の決定、ならびに病気メカニズムの包括的特徴付けは、フェロ流体豊富化プロセスの間に得られた血漿血液画分に由来するＲＮＡを用いて達成することができる。好ましくは、これには、豊富化されたＣＴＣについての前記実験で記載したＴ７プレ−増幅プロセスをカップリングさせる。フェロ流体豊富化プロセスは最初に、各試料の血漿画分を分離する。典型的には、この画分はＣＴＣが豊富化されれば捨てられていた。
【０１５６】
しかしながら、血漿−および血清−由来ｍＲＮＡおよびＤＮＡは最近、文献において、価値ある癌発現（表現型）および遺伝子型（ＤＮＡ分析）のデータを供することが示されている。血漿−由来ｍＲＮＡおよびＤＮＡは、下流分析のための伝統的な分子生物学的方法によって単離される。ｍＲＮＡは血漿から容易に入手でき、かつ価値あるＲＴ−ＰＣＲデータを供することが証明されているので、これらの同一ＲＮＡ転写体は、本明細書中に記載された修飾されたＴ７増幅手法を用いてより包括的にプロファイルすることができる。かくして、ＣＴＣ−独立および／またはＣＴＣ−相補的ｍＲＮＡ発現プロフィールは、各試料の血漿−由来画分からのＲＮＡを用いることによってＣＴＣについての同一プロファイリング手法で得ることができる。
【０１５７】
さらに、Ｔ７ベースの発現プロファイリングアプローチは前記した豊富化プロセスに適用することができ、ＣＴＣ−枯渇画分の分析を可能とすることは、ＷＢＣ発現プロフィールの寄与を区別するのに有用であり、これは、豊富化の間に非特異的に行われ、寄与はＣＴＣ−特異的プロフィールを形成する。これは、異なるパターンの比較および引き続いての引き算によって達成することができ、分析の間にＣＴＣを正しく同定するためのさらなるメカニズムを提供する。加えて、ＣＴＣ−枯渇プロフィールは、それ自体、特定の療法に対する応答および感度について価値ある患者−特異的情報を提供するであろう。
【０１５８】
本発明が関連する技術分野の当業者には、本発明が明細書中に開示した好ましい具体例の記載および議論に制限されず、以下の請求の範囲によってのみ定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく、手法の多くの修飾および変形を達成することができるのを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、単一試料についてのマルチパラメーター分析での本出願で記載した発明によって可能となる種々の可能性およびオプションを示すフローチャートを示す。表現型および遺伝子型分析は固定されたまたは固定されていない細胞で得られる。
【図２】図２は、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏ１＋ペレット塗料共沈殿を介して得られた上澄みから単離する前に、種々の回数Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍ−処理した約１６００のＳＫＢＲ３乳癌細胞のＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色後の２％アガロースゲル電気泳動によって分析された変性全ＲＮＡの逆イメージ（ネガティブ）を示す。
【図３】図３は、全細胞、細胞ペレット画分からのＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍ（サポニン）浸透化細胞、およびＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍＲ−浸透化ＳＫＢＲ３乳癌細胞の上澄み画分からの細胞を含む臭化エチジウムで染色した１％変性全ＲＮＡアガロースゲルを示す。
【図４】図４は、ポリヌクレオチドキナーゼ処理３２Ｐ−標識オリゴ（ｄＴ）（２５量体）プローブによってハイブリダイズさせた図３に示したゲルのノーザンブロットのホスホルイメージを示す。放射性信号は、全細胞、および図３に示したゲルからの二つのＩｍｍｕｎｉｐｅｒｍＲ−処理細胞画分に由来する全ＲＮＡの全てのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ転写体に対応する。
【図５】図５は、標識されたオリゴ（ｄＴ）プローブの慣用的解離および除去を介してストリップされ、核−特異的前駆対ｒＲＮＡプローブで再度プローブした図４からのノーザンブロットを示す。
【図６】図６は、ストリップされ、かつミトコンドリア−特異的１２Ｓ ｒＲＮＡプローブで再度プローブされた図５からのノーザンブロットを示す。
【図７】図７は、図３においてゲルイメージを対応するｍＲＮＡを第一ストランドオリゴ（ｄＴ）（起点ｃＤＮＡ合成の間にアルファ−３２Ｐ−ヌクレオチド標識した場合のｃＤＮＡアレイドットブロットハイブリダイゼーションバターンの比較を示す。ついで、標識された第一ストランドＤＮＡをハイブリダイゼーションとして用いた。パターン比較は、ｍＲＮＡの同一相対的豊富さがすべてのＲＮＡ細胞画分で存在することを示す。
【図８】図８は各々Ｉｍｍｕｎｉｐｅｒｍで約７７０のＰＣ−３細胞を含有する多重アリコットを別々に処理した後に得られた、定量的および定性的な相対的サイトゾル全ＲＮＡのゲルイメージを示す。
【図９】図９は、ＣｙｔｏＣｈｅｘＴＭおよび他のアルデヒドベースの固定剤、続いての酵素消化を用いる、全ＲＮＡライブラリーの９０ないし１００％の保存、回収およびＲＮＡ完全性分析を示す。この実験では、Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ、ＳｔｅｂｉｌｃｙｔｅＴＭおよびＴｒａｎｓｆｉｘＴＭである３つの異なる固定剤なくしての（リン酸緩衝化生理食塩水、ＰＢＳ）およびそれを用いた、双方の対照レーンにおける、新たに吸い取った７．５ｍｌの末梢血液（ＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管）に最初にスパイクされた３００，０００ＳＫＢＲ３細胞系の細胞の一部を質量が正規化した。混合の後、これらを室温にて（２０ないし２５℃で）インキュベートした。しかる後、ＶＵ−１Ｄ９（ＥｐＣＡＭ）−フェロ流体免疫磁気選択を用い、ＳＫＢＲ３細胞を血液から豊富化させた。各処理からの豊富化された細胞を３つの等しいアリコットに分け、プロテイナーゼＫ（「ポスト」で示したレーン）で処理し、プロテイナーゼＫ消化なくして処理した（即時のＲＮＡ単離では「ｐｒｅ」で示したレーン、および、ポストに対する細胞のみを意味する「Ｎｏ」で示されるレーンには、プロテイナーゼＫ成分が添加されず、全ての他の操作はポストに等しい）。得られた正規化されたＲＮＡ単離は、１％変性アガロースで分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで検出し、アルファイメージャーデンシトメトリーでイメージし、ついで、ノーザンブロットし、最後に、オリゴ（ｄＴ）プローブして、各回収された全ＲＮＡおよびｍＲＮＡライブラリー相対的質および量を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、１、２および４時間にわたるＣｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ、ＳｔａｂｉｌｃｙｔｅＴＭ、ＴｒａｎｓＦＩＸＴＭ、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサール固定の相対的速度を示す。この実験では、Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘTM、ＳｔａｂｉｌｃｙｔｅTM、ＴｒａｎｓｆｉｘTM、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール経時的相対速度を１、２および４時間において評価した。図９に記載したのと同一の方法によって、７．５ｍｌの血液の試料を単一ドナーから調製した。唯一の差は、それらを選択し、１，２および４時間の最終点でＲＮＡ単離のために処理したことである。得られた正規化ＲＮＡ単離を１％変性アガロースで分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、アルファイメージャーデンシトメトリーでイメージし、ついでノーザンブロットし、最後なオリゴ（ｄＴ）プローブして回収された各全ＲＮＡおよびｍＲＮＡライブラリーの相対的質および量を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、１５、３０および４５分にわたるＣｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ対パラホルムアルデヒドの相対的固定速度を示す。この実験においては、固定Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ対パラホルムアルデヒドの経時的相対速度は１５、３０、および４５分に評価した。図９に記載したのと同一の方法によって、７．５ｍｌの血液の試料を単一ドナーから調製した。唯一の差は、それらを１５，３０，４５分の最終点で選択したことである。相対的ｍＲＮＡライブラリーの質および量を示すオリゴ（ｄＴ）プローブドブロットのホスホイメージング定量は：ホルムアルデヒド＝パラホルムアルデヒド（〜４倍）＞ＴｒａｎｓｆｉｘＴＭ（〜２倍）＞ＳｔａｄｉｌｃｙｔｅＴＭ（〜１．５倍）＞Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ（〜１倍）＝グルタルアルデヒドの相対速度を示し、グリオキサールはランク付けするのにはあまりにも遅い。得られた正規化ＲＮＡ単離を１％変性アガロースで分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、アルファイメージャーデンシトメトリーでイメージし、ついで、ノーザンブロットし、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブして、回収された各全ＲＮＡおよびｍＲＮＡライブラリーの相対的質および量を示す。
【図１１】図１１は、Ｃｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ保存からのＲＮＡ回収の質および量に対する求核試薬および酵素の変動に対する効果を示す。これは、改良された配列分析で組み合わされた処置で用いる場合、質が同様であることを指示する。得られた正規化ＲＮＡ単離を１％変性アガロースで分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、アルファイメージャーデンシトメトリーでイメージし、ノーザンブロットし、最後にｄＴプローブして、回収された各全ＲＮＡおよびｍＲＮＡライブラリーの相対的質および量を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、プロテイナーゼ回収およびａＲＮＡプレ増幅と共にＣｙｔｏ−ＣｈｅｘＴＭ安定化血液における１０ＳＫＢＲ３細胞／７．５ｍｌ血液からの特異的ｍＲＮＡの検出によって示された診断適用の可能性を示す。診断適用の可能性は、ここでは、７．５ｍｌ末梢血液にスパイクされた三連１０または２０ＳＫＢＲ３細胞からの特異的ｍＲＮＡの感度のよいかつ再現性のある検出によって証明される。スパイクされた血液を直ちにＣｙｔｏ−Ｃｈｅｘで安定化して、細胞ＲＮＡを安定化させた。室温（２０ないし２５℃）にて１日インキュベーターでインキュベートした後、ＶＵ−１Ｄ９（ＥｐＣＡＭ）−フェロ球体免疫磁気選択を用いて安定化された細胞を選択的に豊富化した。豊富化につづき、シリカ結合ＲＮＡ単離、続いてのａＲＮＡプレ増幅および遺伝子特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲがＣＫ１９およびＥｐＣＡＭについて実行できるように、プロテイナーゼＫ消化を行ってＲＮＡを遊離させた。
【図１２Ｂ−Ｃ】図１２Ｂおよび図１２Ｃは、ＳＫＢＲ細胞スパイクフェロ流体選択およびＣｙｔｏＣｈｅｘＴＭ処理、続いてのプロテイナーゼ逆行からのＣＫ１９およびＥｐＣＡＭの各Ｑ−ＰＣＲを示す。この実験は、定量的なＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示し、これは、グラフ化する前に元の全ＲＮＡ質量に対して正規化した。かくして、示された値は、ａＲＮＡ増幅に先立って元のＲＮＡ単離に含まれた元のｍＲＮＡ集団と同等である。
【図１２Ｄ−Ｅ】図１２Ｄおよび図１２Ｅは、細胞安定性試薬で処理したＳＫＤＲに由来するＲＮＡについてのＣＤ１９およびＥｐＣＡＭでの各Ｑ−ＴＣＲを示す。これらの実験は、図９のCyto-ChexTM, StabilcyteTMおよびTransfixTMに示された３つの異なる固定剤に由来するＲＮＡを示す。これらのプロテイナーゼＫ回収ＲＮＡ試料を、各々、図１２Ｂおよび１２Ｃに示されたａＲＮＡプレ増幅および遺伝子特異的定量的ＣＫ１９およびＥｐＣＡＭについてのＲＴ−ＰＣＲの同一ｍＲＮＡ鋳型分析に付した。これらのここに示されたデータを双方の全ＲＮＡ質量に対して正規化し、これは本実験においてａＲＮＡ質量収率に等しい。かくして、この固定剤由来の相対的ＲＮＡの量および質の比較は双方のａＲＮＡ（図１２Ａ）および、続いてのここに示される定量的ＲＴ−ＰＣＲ双方の尺度である。これらの比較は、共に、プロテイナーゼＫ方法のみを用いてＲＮＡを回収した後における、各固定剤独立性ＲＮＡ鋳型の質の尺度である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＣＫ１９−ｃＲＮＡ転写体の最も３’側の８００塩基配列を含むＣＫ１９−ＣＲＮＡ標準ＲＴ−ＰＣＲ増幅効率を示す。２００、１００、５０、２５、１２、５コピーを含むＣＫ１９−ｃＲＮＡ標準の系列２倍希釈、それから３連の血液細胞が２７％の変動の最大係数で得られる２ｎｇのＣＫ１９陰性全ＲＮＡにスパイクした。標準偏差のバーを示す。１未満のコピーに対するｃＲＮＡの希釈および鋳型なし対照は検出可能な信号を生じなかった。
【図１３Ｂ】図１３Ｂはアガロースゲル電気泳動後における相対的ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現レベルを示す。各々、パネル１，パネル２，パネル３およびパネル４において２５コピー、２５０コピー、２，５００コピーおよび２５０００コピーのレベルにて、白血球細胞からの全ＲＮＡにＣＫ１９ＲＮＡをスパイクした。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、増幅されていないおよびＴ７プロモーター−ベースの増幅されたｍＲＮＡ転写体の同一ｍＲＮＡライブラリーにおいて相対的表示を比較する。相対的豊富さは、ＲＴ−ＰＣＲ動的曲線方法を用い、８つの異なるｍＲＮＡ転写体(ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＭＧＢ１、ＭＧＢ２、ＣＫ８、ＣＫ１９、ＰＩＰ、ＥｐＣＡＭ)を調べることによって評価した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、循環上皮細胞遺伝子の概観のバラツキプロット棒グラフを示す。それらの細胞表面でＥｐＣＡＭ抗原を発現する細胞につき、ヒト血液を免疫磁気的に豊富化し、試料をまずａＲＮＡプレ増幅し、ついで２５ｎｇを逆転写した。ついで、遺伝子の選択された群についてのＲＴ−ＰＣＲの後アリコットをアガロースゲル電気泳動によって分析した。１３人の健康なドナー（７名の男性、６名の女性）を測定した各遺伝子につきＮ欄として命名し、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含有する９つの系列的にサンプリングしたＨＰＲＣ患者をフローサイトメトリーによって測定し、測定された各遺伝子につきＰ欄として命名する。各欄における水平線は、それを越えて真の陽性がカウントされる閾値を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに記載したのと同一の方法を介する前立腺腫瘍の起源器官状態を示す遺伝子の概観を示す。
【図１４Ｃ】図１４ｃは図１４Ａに記載したのと同一の方法を介する治療標的状態の存在を示す概観を示す。
【図１５Ａ−Ｃ】図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃは、新しい系の化学療法前、中および後におけるＣＴＣおよびＲＴ−ＰＣＲ多重遺伝子分析の個々のＨＲＰＣ患者の一定期間にわたるモニタリングを示す。Ｘ−軸は週で表したサンプリング時間を示す。左の軸は塗りつぶした丸の記号でＣＴＣを示す。右のＹ−軸は、アンドロゲン受容体についての塗りつぶしていない四角、Ｈｅｐｓｉｎ（ＨＰＮ）についての塗りつぶしていない丸および多薬物抵抗性（ＭＤＲ１）についての塗りつぶしていない三角形の対応する記号で相対的ｍＲＮＡ発現を示す。図１５Ｂに示すごとく、相対的ｍＲＮＡレベルは、ルプロン単独の治療コースの間を示し、二人の患者は、図１５Ｂおよび図１５ＣにおいてＸ−軸上の垂直矢印の記号のタキソテールおよびエストラムスチン化学療法（Ｔｘ−Ｅｘ）の用量の投与と組み合わせたルプロンで治療される。頂部の棒線は、長期間ホルモン切除治療が行われつつあったことを示す。[0001]
This application is filed with US Provisional Application Nos. 60 / 369,945 (filed Apr. 4, 2002) and 60 / 330,669 (filed Oct. 26, 2002) and PCT / US02 / 26867 (August 23, 2002). Claims priority under 119 (e) of the 35th Code of the United States.
[0002]
Background of the Invention
Field of Invention
The present invention relates generally to gene-specific amplification, analysis and profiling of cytosolic biomolecules useful in the fields of oncology and diagnostic tests. The present invention is particularly useful in fields such as cancer screening, selection and monitoring for chemotherapy treatment or cancer recurrence. More particularly, the present invention provides comprehensive coverage of mRNA and DNA from tumor cells or other rare cells from biological samples while simultaneously maintaining cell integrity for counting and morphological image analysis. Methods, apparatus and kits are provided to facilitate analysis. To accomplish this, the present invention maintains the morphological and antigenic characteristics of cells for subsequent or parallel multi-parameter flow cytometry, imaging, and immunocytochemical analysis, while Also provided is a method that allows analysis of soluble cytosolic biomolecules that can be released from cells such as tumor cells by means of permeabilizing reagents for measuring the expression profile of the released nucleic acid (US Pat. No. 6,365,362). Issue). The present invention also provides a method that allows the same comprehensive analysis using stabilized samples from aldehydes and aldehyde-urea derivative based fixatives.
[0003]
Description of related technology
Any given cell will express only a portion of the total number of genes present in its genome. Some of the total number of genes expressed determines aspects of cell function such as development and differentiation, homeostasis, cell cycle regulation, senescence, apoptosis, and the like. Altered gene expression determines the development of normal cells and the appearance of disease states such as cancer. The expression of a specific gene will have a profound effect on the properties of any given cell. Thus, methods for analyzing gene expression, such as those provided by the present invention, are important in basic molecular biology research and tumor biology. The identification of specific genes, particularly rare genes, can provide a key to diagnosis, prognosis and treatment for various diseases that reflect these expression levels (Levsky et al., Single-Cell Gene Expression Profiling, Science. 297: 836-840 (2002)).
[0004]
Various gene expressions are commonly used methods for assessing gene expression in cells. In particular, cDNA microarray analysis compares the levels of cDNA target sequences obtained from cells or organs from healthy and diseased individuals. These targets are then hybridized to a set of probe fragments immobilized on the membrane. The resulting hybridization pattern difference is then detected and correlated to the difference in gene expression of the two sources (US Pat. No. 6,383,749). This approach requires slow and time consuming analysis of hundreds of thousands of gene-specific probes. In addition, a comparison of events such as interactions between the target in the target sequence and the non-specific binding of the non-complementary target sequence between the probe and the second structure can lead to hybridization resulting in an attenuation of the signal to noise ratio. Can interfere.
[0005]
Gene specific primer sets have been described in various expression assays (US Pat. No. 5,994,076 and US Pat. No. 6,352,829). Here, gene-specific primer sets were used to specifically amplify a subset of mRNA libraries in a complex library, and improved cDNA array signals were achieved when compared to total library label amplification. The focus of this type of analysis was to compare sample array expression profiles as part of gene discovery research and not to develop methods for practical cellular RNA analysis with diagnostic applications. .
[0006]
Thus, gene-specific primer sets were used to selectively amplify specific subsets of mRNA from mRNA libraries, but in particular for rare cell detection for diagnostic therapies including both quantitative and qualitative analysis. There is a clear need to reduce the signal to noise ratio in applicable amplification processes.
[0007]
Today, it is generally expected that the presence of circulating tumor cells in the patient's blood will provide an early detection system in assessing the need for therapeutic intervention. A fairly sensitive assay that allows accurate enumeration of circulating carcinoma cells indicates that peripheral blood tumor cell load is associated with disease status (Terstappen et al. Peripheral Blood Tumor Cell Load Reflects the Clinical Activity of the Disease in Patients with Carcinoma of the Breast International J. of Oncology, 17: 573-578, 2000).
[0008]
In addition, the classification of cell types and origins will provide a more comprehensive basic strategy for treatment. Emergency treatment for some cancers, such as large diffuse B-cell lymphoma (DLBCL), is based on two different disease types associated with clinical prognosis (Rosenwald et al., Use of Molecular Profiling to Predict Survival After Chemotherapy after Diffuse Large-B Cell Lymphoma, New England Journal of Medicine, 346: 1937-1947, (2002)). In DLBCL, tumors derived from germinal center B-cells are more susceptible to chemotherapy and have a higher chance of survival, but those from activated B cells tend to be more difficult to treat is there. Thus, the subtype of these cells depends on the origin of the tumor cell.
[0009]
The stratification of these subtypes depends on the tumor origin cell. Although subtype differences can only be determined by single gene analysis, the entire array of gene combinations is more critical. Charting gene expression patterns through microarray analysis of gene expression levels would be a desirable indicator of tumor characteristics in other diseases such as lymphoma, acute leukemia, breast cancer, lung cancer and liver cancer. However, to employ this, genetic information for diagnostic applications requires a significant signal-to-noise ratio resolution inherent in existing state of the art technology.
[0010]
Thus, a new method for analyzing gene expression, particularly when such methods provide fast hybridization, highly specific binding of a target to a complementary probe, and a substantially improved signal to noise ratio. Great interest in development. In addition, these methods have additional importance when assessing gene expression. This is because it relates to conditions related to cancer and disease (US application 10 / 079,939 and US application 09/904, both of which are hereby expressly incorporated herein by reference). 472).
[0011]
Summary of the Invention
The present invention provides methods, devices and kits for assessing gene expression in amplified mRNA isolated from circulating rare cells that overcome the disadvantages of the prior art described above (see FIG. 1). The present invention provides a method for isolating soluble or releasable cytoplasmic biomolecules from a single target cell or cell population while maintaining structural cell integrity or phenotypic characteristics. Thus, the cells are fresh or stabilized and are immobilized with a cross-linking agent, contacted with a pore-forming osmotic composition, and then the nucleic acid is recovered. RNA from stabilized cells (PCT / US02 / 26867) is fused for amplification and subsequent qualitative and quantitative PCR analysis, or fused with universal primer PCR amplification and followed by reverse transcription Recovered via a combination of proteinase and nucleophilic retrograde drug for quantitative analysis via a gene specific subset of (RT) primers. Thus, one focus of the present invention is to stabilize and fix cells prior to permeabilization, and then release nucleic acids from the stabilized cells, thereby allowing both cytoplasmic biomolecule analysis and phenotypic cell analysis. Prepare cells for.
[0012]
The present invention also contacts cells or cell populations with the permeabilizing composition and has been released for one or more components such as nuclear and / or mitochondrial DNA, total RNA, mRNA, soluble proteins, and other target substances. And / or by separately analyzing unreleased fractions, it is also directed to isolate nuclear and / or mitochondrial DNA, RNA, proteins and other soluble components within the target cell (US application 60 / 330,669).
[0013]
The present invention produces a functional cell profile that includes features derived from genotypic and phenotypic cell characteristics for contacting the cell (s) with the permeabilizing composition and then distinguishing normal cells from transformed cells. Analyzing both cytoplasmic biomolecules and membrane or surface biomolecules from the same cell (s) or cell population is integrated by separately analyzing the cytoplasmic biomolecules and surface biomolecules to be made.
[0014]
A combination of isolation and rare cell analysis of the present invention provides methods and reagents that allow comprehensive profiling of mRNA obtained from rare cells. For example, a population of cells defining circulating tumor cells (CTC) may be a rare cell type found in the peripheral blood and bone marrow of cancer patients. The mRNA is obtained via the cell preparation described in the present invention, but any protocol commonly used in the art can be incorporated.
[0015]
After isolation and purification of mRNA from a sample containing cells of interest, detection of extremely rare cellular events with low mRNA copy number should use or use a T7 RNA polymerase (T7RNAP) based pre-amplification technique Rather than via a gene-specific RT-PCR panel (US application 60 / 369,945). Pre-amplification is completed by linear amplification of the entire mRNA library using a modification of the Eberwine aRNA method (Van Gelder et al., 1990). In a preferred embodiment, the creation of an antisense mRNA library (aRNA) library pre-amplification results in an increase in all messages present in the original mRNA isolated from ferrofluid-enriched circulating cells by at least 1000-fold. The gene panel of interest is then amplified using gene-specific primers. These primers are designed to amplify transcripts that exhibit known rare events such as circulating tumor cells. The number of target sequences can be as low or as high as 2 required to allow correlation with several features indicative of rare events. This can occur as a separate individual reaction or within a single reaction vial. Subsequent analysis will at least qualitatively evaluate the target sequence and include, but are not limited to, gene-specific origin (GSP) arrays and / or GSP suite-RT (universal PCR). As one of two types of multigene analysis methods presented as:
[0016]
Universal PCR achieves multigene analysis from sample recovered mRNA in a single reaction tube with or without mRNA library pre-amplification. There is no pre-amplification that allows only one panel of genes to be analyzed at a time. Pre-amplification adds the advantage of analyzing a single sample in up to 1000 different reactions, thus many different panels of genes can be interrogated at different times. Analysis of universal PCR cocktail panels is accomplished by array or capillary gel electrophoresis (CGE), although other methods can be utilized. Thus, the system allows simultaneous qualitative and quantitative measurement of one to thousands of separate mRNA types when measured in a cDNA microarray format.
[0017]
Thus, the present invention provides pre-permeabilized compositions, RNA recovery after cross-linking, magnetic microspheres with oligo (dT) probes covalently attached to the surface, and small or large microarrays, capillary gel electrophoresis (CGE), Oriented to protocols and kits containing some or all necessary reagents, including capture and analysis of comprehensive RNA analysis using HPLC, electrophoresis and other analytical platforms, and other gene-specific magnetic microsphere-binding probes A combination of said isolation and profiling analysis.
[0018]
Detailed description of preferred embodiments
As shown in previous discussions, a more comprehensive and practical form of cancer diagnosis is the analysis of intracellular and extracellular membrane antigens as well as in the same cell or different cell populations that have been mutually exclusive processes to date Analysis of cellular RNA content and DNA content must be included (US 6,365,362). This exclusion was due to the fundamental incompatibility of pre-analytical cell preparation methods that analyze structural intracellular antigens, with the primary purpose of maintaining cell integrity, along with methods of isolating cytoplasmic biomolecules . Alternatively, pre-analytical cell preparation has also been limited to soluble cytoplasmic RNA, total cellular RNA, total cellular DNA, and / or protein, with the primary purpose of homogenizing cells to release soluble intracellular components. In particular, traditional phenotypic characterization required immobilization of cellular structures achieved through exposure of cells to crosslinkers such as paraformaldehyde, formaldehyde, glutaraldehyde and the like. These stringent cell fixation conditions simultaneously cause undesirable covalent cross-linking and / or fragmentation of isolated RNAomas. Similar intracellular DNA-protein cross-linking has recently been reported (Quieveyn and Zhitkovick, Loss of DNA-Protein Crosslinks from Formaldehyde-Exposed Cells Occurs Through Spontaneous Hydrolysis and an Active Repair Process Linked to Proteosome Function, Carcinogenesis, 21: 1573- 1580 (2000) So-called non-formaldehyde or non-paraformaldehyde fixatives (eg Cyto-Chex ™ Streck Labs, Omaha, NE) are cell-stabilizing additives comprising formaldehyde-urea derivative donor compounds. Used as a preservative for circulating tumor cells in the blood during shipping or storage disclosed in a co-pending application (PCT / US02 / 26867, which is incorporated herein by reference). Our research has shown that Cyto-Chex contains only trace levels of free formaldehyde TM Even seems to slowly release formaldehyde, which can cross-link intracellular RNA to intracellular proteins. Such cross-linking was sufficiently reversed by the methods herein to allow comprehensive RNA analysis. Cellular RNA and DNA analysis is therefore RNAlaterTM prepared in unfixed fresh cells, cells that are conventionally stored in reagents that do not crosslink or that crosslinks can be reversed during mRNA release from the cell. (Ambion) is a commercially available RNA stabilization solution that stabilizes RNA but does not allow immunogenicity, immunochemistry or image analysis on the same sample and is not effective in blood. PreAnalytiX provides blood RNA stabilizers but does not allow for anything other than traditional homogenization based solely on total RNA isolation TM Other than guanidine isothiocyanate solution (GITC) solution which is a chaotropic agent in a test tube.
[0019]
In general, mRNA recovered from fixed cells is not quantitative, is severely degraded or fragmented, and is approximately 1750 bases 10 times higher than the highly variable average size of nearly 200 bases. Reduces the size of intact RNA with an average size of and includes many complex chemical modifications that are not well understood. However, the net effect of fixative-derived RNA is a severely untrustworthy mRNA analysis (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, (2002)). A tedious, non-quantitative mRNA salvage technique combined with reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis designed for amplicons that are qualitative rather than quantitative but less than 100 base pairs in length Indicates a limited value (US 5,346,994). Furthermore, this limited RNA analysis of fixed cells must follow phenotypic analysis. Thus, traditional RNA isolation techniques require complete cell lysis or homogenization that disrupts cellular structures and further complicates analysis by mixing cellular DNA and RNA populations. Two processes cannot be performed sequentially on the same cell sample (Maniatis et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)). Previous reports have shown the need for improved methods of RNA recovery in tissues (Godfrey et al., Quantitative mRNA Expression Analysis from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues Using 5 'Nuclease Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, J of Molecular Diagnostics, 2: 84-91 (2000)). Application of formaldehyde and urea-based fixatives that stabilize recoverable and quantitative high quality full-length intact whole and mRNA from blood, thus enabling comprehensive resolution, is the basis of one aspect of the present invention. is there.
[0020]
Quite unexpectedly, saponins used as penetrants are highly selective and effective, releasing agents for intracellular cytoplasmic RNA and other biomolecules, thereby lysing cells or It has been found to reduce the need for homogenization. This novel use of saponins as selected RNA releasing agents is a particularly advantageous component of the present invention. Surfactants such as saponins have traditionally been used to examine the expression of intracellular antigens by permeabilizing the cell membrane and allowing uptake of staining reagents while maintaining cell integrity. . For example, chromosomes or genes in fluorescent in situ hybridization (FISH) or in staining of intracellular components such as DNA in the nucleus with the nuclear dye DAPI, or in immunostaining of cytokeratins with specific labeled antibodies The analysis plays a very important role. Release of cytoplasmic intracellular protein RNA or DNA is generally accomplished by solubilization or complete lysis of the cells with a stronger detergent such as Triton X-100. However, saponins have previously been used to examine both the expression of soluble intracellular antigens, including RNA, and the phenotyping of individual cells or cell populations in the same specimen. Thus, a method that allows sequential phenotypic analysis and analysis of intact RNA and soluble proteins in the cytoplasm of the same cell specimen is highly desirable and is the subject of the present invention.
[0021]
Thus, the present invention provides advantageous methods, devices and kits for rapid and effective RNA profiling of all cells found in biological samples, particularly targeted cells. The present invention provides a method that allows separate analysis of both phenotype and genotype. The phenotype is interrogated and profiled through comprehensive analysis of antibody antigen protein and mass spectrometric profiling methods and intact cytoplasmic RNA from the same cell or cell population. The genotyping of the same genomic and mitochondrial DNA can be profiled separately by any means available to those skilled in the art. Like the amplification of mRNA libraries, each genomic and mitochondrial library can be pre-amplified, allowing multiple assays to be performed without loss of clinical sensitivity due to multiple displacement amplification (MDA), Enables the first effective whole genome amplification method. MDA is a rapid and reliable method for generating unlimited DNA from a few cells.
[0022]
The invention described herein can be used effectively to isolate and characterize cell phenotypes, such as cell surface antigens, cytoplasmic antigens, and any type of RNA, and genotypes. Both phenotype and genotype analysis can be performed sequentially on exactly the same sample. For example, after cell surface analysis and RNA harvest, remaining intact nuclei and mitochondria can be transformed into S1 nuclease, ribonuclease protection, RT-PCR, SAGE, DD-RT-PCR, microarray cDNA hybridization, ISH, FISH, SNP, all RNA and all genome based PCR techniques and any standard RNA (mt RNA, hRNA), DNA and protein based analysis such as any protein analysis system can be analyzed downstream.
[0023]
One of the many applications of this type of cell analysis is in the diagnosis of cancer. Many clinicians believe that cancer is an organ-specific disease when contained in its early stages. The disease becomes systemic by the time it is first detected using currently available methods. Thus, evidence suggesting the presence of tumor cells in the circulatory system may be the first line detection mechanism that replaces or functions in combination with other tests such as mammography or measurement of prostate specific antigen. By analyzing the cell phenotype (protein and RNA) and phenotype via specific markers for these cells, the organ origin of such cells, eg, breast, prostate, colon, lung, ovary, or non- Cancers of hematopoietic organs can be easily determined. Proteins, RNAs and genomes can be analyzed, and it will be possible to identify the presence of specific tumors as well as the organ of origin, especially in situations where clinical signs of tumors are not available. Since these profiles define the function of the cells, it indicates which most appropriate therapy type and course should be used in cancer cell detection. Furthermore, in monitoring where there is no detectable evidence of circulating tumor cells for post-surgical surgery or other successful therapies, it may be possible to determine from further clinical experiments whether further treatment is necessary.
[0024]
In order to provide a more comprehensive and early diagnosis, one embodiment of the present invention comprises isolating a cytoplasmic biomolecule from a cell or population of cells, contacting the cell or cells with a permeabilizing compound, followed by A method of isolating a cytoplasmic biomolecule of interest from a cell while maintaining cell integrity for phenotypic and morphological analysis.
[0025]
A targeted rare event in the present invention refers to the expression of any biological material that exhibits, at least in part, a known rare event. Therefore, hormones, proteins, peptides, lectins, oligonucleotides, drugs, chemicals, nucleic acid molecules (such as RNA and / or DNA), and organisms such as cells, apoptotic bodies, cell debris, nuclei, mitochondria, viruses, bacteria, etc. These parts will be included in the embodiments of the present invention.
[0026]
Fluid samples include, but are not limited to, cell-containing body fluids, peripheral blood, bone marrow, urine, saliva, sputum, tissue homogenates, semen, and any other rare cells that can be obtained from a human subject. Including sources.
[0027]
“Cytoplasmic biomolecules” include, but are not limited to, cell target molecules of interest such as proteins, polypeptides, glycoproteins, oligosaccharides, lipids, electrolytes, RNA, DNA, etc. located in the cytoplasmic compartment of cells. . When the cell is contacted with the permeabilizing compound followed by cell separation, the cytoplasmic biomolecule is present in the supernatant for downstream analysis. All soluble cytoplasmic biomolecules can be isolated and analyzed, for example, a total cytoplasmic RNA library or target component that can cross the membrane pore. In a preferred embodiment, the focus is on the analysis of transcribed mRNA and translated proteins as indicators of oncogenic transformations of interest, for example, in CTC, in the management of cancer diagnosis and therapy.
[0028]
A “membrane biomolecule” is any extracellular, membrane of interest associated with or buried in a cell membrane, including but not limited to outer cell membranes, nuclear membranes, mitochondria and other cellular organelle membranes. Also includes internal or intracellular domain molecules. Upon permeabilization with the permeabilizing compounds of the present invention, the target membrane biomolecule is normally not solubilized or removed from the membrane, ie, the membrane biomolecule remains associated with the permeabilized cells. Membrane biomolecules include, but are not limited to, those exposed on the exterior or extracellular surface of the outer membrane, and those present on the inner surface of the outer membrane, and nuclear mitochondria and all other intracellular organelle membranes Includes proteins associated with cell membranes, including associated proteins, glycoproteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids and combinations thereof. Membrane biomolecules also include cytoskeletal proteins.
[0029]
A “phenotype” or “phenotyping” is an intracellular such as DNA that stores all the genetically encoded instructions to build and control all aspects of cell life and death. The process of identifying genetic material. “Phenotype” or “phenotyping” is defined as classifying cells based on observable outward structural elements and their production (ie, including intermediate RNA). These include topology, morphology and other surface properties, all of which are derived from internally encoded genotype information that is incorporated into the methods of the invention. In contrast, the structure and integrity of cells is at least usually determined by the disruption of all cell structures and / or mechanical cell homogenization during chaotropic salt treatment, and in the presence of NP-40 in the presence of NP-40. It is not maintained during conventional RNA isolation techniques involving complete lysis of all cellular structures except mitochondria.
[0030]
Morphology or morphology that refers to cell structure included intracellular or surface markers or epitopes that allow for interaction with detectably labeled binding partners such as staining with histochemical reagents or antibodies. , Used routinely in terms of cell and nuclear topology and surface characteristics. In addition, morphology includes: all areas of “morphometry” defined as quantitative measurement of chromatin distribution in the nucleus.
[0031]
The terms genomic and proteomic are used as conventionally defined. "Functional" broadly includes "functional cellomics", including both genomic and proteomics, and other targets including, but not limited to, "gluconomics" for carbohydrates and "lipodomics" for cellular lipids It is used herein as an adjective for an empirically detectable biological characteristic or property of a cell, such as a category. The resulting cellular characteristics provide a profile that allows differentiation of normal cells from transformed cells.
[0032]
“Contacting” refers to bringing a compound or reagent into physical proximity directly or indirectly to a cell. The cells and / or compounds can be present in any number of buffers, salts, solutions, and the like. Contacting includes, for example, placing the reagent solution into a test tube, microtiter plate, microarray, cell culture flask, etc., for contacting the cells. Microtiter plate and microarray formats further allow for multiplex assays to simultaneously analyze multiple cellular target compounds or components, including but not limited to nucleic acids and proteins.
[0033]
“Permeabilizing compounds, reagents or compositions” comprise a lipid-cholesterol bilayer, while maintaining sufficient membrane, cytoplasm and nuclear structure so that subsequent phenotypic analysis can be performed on the permeabilized cells. Any reagent that forms small pores in the cell membrane is meant. For example, saponins complex with cell membrane components, thereby forming a large number of transmembrane pores of about 8 nm size in the cell wall or membrane, thus small such as enzymes, proteins, glycoproteins, globulins, electrolytes, etc. Known "pore-forming" compounds that allow outward diffusion of soluble cytosolic components and internal equilibration with extracellular reagent components such as electrolytes.
[0034]
“Immunomagnetic beads” have covalently bound binding reagents (eg, antibodies) with substantially selective affinity for surface markers or epitopes on cells, thereby providing a high gradient magnetic separation system (AGMS) Magnetically labeled nanoparticles or microparticles that achieve selective capture of magnetically labeled cells when exposed to a magnetic field such as that generated in Other terms used herein for methods, reagents and equipment are routinely defined and are known to those skilled in the art.
[0035]
Preferred gene expression targets (mRNA and protein) for identifying tissue of origin, diagnosis, prognosis, therapeutic target characterization and monitoring include, but are not limited to, manoglobin 1 (MGB1), manoglobin 2 (MGB2), Prolactin-inducible protein (PIP), Carcino embryo antigen (CEA), prostate specific antigen (PSA), prostate specific membrane antigen (PSMA), glandular kallikrein 2 (hK2), androgen receptor (AR), prostasin Spin (HPN), DD3, Her-2 / Neu, BCL2, epidermal growth factor receptor (EGFR), tyrosine kinase-type receptor (HER2), thymidylate synthetase (TS), vascular endothelial growth factor (VEGF), pancreas Mucin (Muc1), guanylyl cyclase c (GC-C), phosphatidylinositol 3 kinase (PIK3CG), protein kinase B gamma (AKT), excision repair protein (ERCC1), al A-1 globin (F6), macrophage inhibitory cytokine-1 (G6), dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD), insulin growth factor receptor (IGF2), estrogen receptor alpha and beta (ER), progesterone receptor (PR) , Aromatase (cyp19), tecomerase (TERT), general epithelial tissue specific gene, cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin 5 (CK5), cytokeratin 8 (CK8), cytokeratin 10 (CK10), cytokeratin 20 (CK20), epithelial cell adhesion factor (EpCAM), mucin including mucin 1 (MUC1), topoisomerase, urokinase plasminogen activator (Upa), urokinase plasminogen activator receptor (Upar), matrix metalloproteinase ( MMP), general white blood cell specific mRNA, alpha-1 -Includes cells from breast, prostate, lung, colon, ovary, kidney, and bladder cancers for the purpose of detecting and monitoring sensitive or resistant genes that express markers such as globin, CD16, CD45 and CD31. This list is intended to explain the general diversity of mRNA-specific gene arrays that can be assembled to distinguish cells from different origins, types and diseases, and is intended to be comprehensive do not do.
[0036]
Stabilization, release and recovery
Using the inventive method previously disclosed in commonly assigned US Pat. No. 6,365,362 and US patent application serial number 10 / 079,939, both of which are incorporated herein by reference, Circulating epithelial cells can be enriched for leukocytes to a degree of at least 2,500 to about 10,000 times. Following immunomagnetic selection of circulating epithelial cells in the blood, the nucleotide analysis embodied in the present invention is performed. The enrichment is only one example of the many methods known in the art for selecting the specific population of cells used in embodiments of the invention.
[0037]
The method of releasing intact cytoplasmic total RNA and nRNA from these cells, thereby isolating and purifying them, unexpectedly and surprisingly, precedes staining and immunostaining. Found during conventional permeabilization with saponins, whereby both cytoplasmic RNA and intracellular antigen phenotyping and DNA genotyping for the exact same cell, population of cells or specimens in order or in parallel Enable analysis.
[0038]
Permeabilization is achieved under this standard using one of three types of common surfactants or detergents: pore-forming reagents such as saponins or saponins such as QS-21, escin, digitionine, cardenolide, etc. can do. All of these agents increase membrane porosity and release small soluble intracellular components. Another group of agents are surfactants. These agents have a relatively high hydrophilic-lipophilic balance to penetrate the membrane without dissolution. More soluble surfactants with a lower hydrophilic-lipophilic balance will release RNA but tend to solubilize the membrane. These include, but are not limited to, t-octylphenoxyethoxyethanol, such as polyoxyethylene sorbitan (commercially known as Tween 20, 40 or 80), nonylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) or Includes SDS.
[0039]
Subsequent analysis of cytoplasmic RNA (and other RNAs such as mtRNA and hnRNA), cell surfaces and soluble intracellular antigens, cellular organelles such as mitochondria and the remaining indexing nuclei are all standard RNA, DNA and protein based It can be analyzed downstream by analytical techniques. These are all genome-based amplification technologies such as cDNA, RNA and protein microarrays, mass spectrometry, fluorescence in situ hybridization (FISH), single nucleotide polymorphism (SNP), and PCR for all types of profile analysis , Microsatellite analysis, restriction fragment length polymorphism (RFLP, ALFP), SAGE, DDRT-PCR.
[0040]
Such an analysis can be performed for at least 1 to 10 RNA molecules and any RNA sequence type for each, but is preferably subtle in cell translation or transcription profiles as an indicator of disease state in a clinical setting. This can be done for thousands to millions of copies of the target that allows detection of such alterations. Other functional cell profiles of releasable and non-releasable cell components such as proteins, glycoproteins, lipoproteins, oligoglycosides, etc. can be similarly obtained using conventional microarray, HPLC, anti-degradation 2D electrophoresis methods. It can be generated by analyzing the two fractions by included electrophoresis or antibody array profiling.
[0041]
The permeabilizing compounds of the present invention are not limited but include cholesterol-like aglycones or genins (which possess any carbohydrate moiety) that are readily dispersed in water to form spherical micelles and linked to one or more carbohydrates. Saponins, a class of natural products built from triterpenes or steroids), include active species in pore formation. These and other suitable named pore formers, polyoxyethylene sorbitan (commercially known as Tween 20, 40 or 80), nonylphenoxy polyethoxyethanol (NP-40), and t-octylphenoxyethoxyethanol are It has a high HLB (hydrophilic-lipophilic balance) that must be used at sufficiently low concentrations to minimize unwanted solubilization and membrane lysis of cellular components. The concentration range of the permeabilizing compound is about 0.01 to 0.5% (w / v) when using saponin containing about 10% saponigen. A preferred permeabilizing compound is saponin (Sigma catalog number S-7900). For example, saponin of about 20-25% purity saponin (Sigma S-4521) and about 99% purity highly purified saponin QS-21 available from Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, Mass. Higher purity saponins can also be used. Other usable compounds are both alpha-escin and beta-escin (Sigma E-1378) permeabilizing compounds derived from horse chestnut, such as sodium azide, Proclin 300 (Rohm & Haas, Philadelphia, PA, etc.) It can be present in a composition such as a phosphate buffered solution that also contains a microbial agent. Another preferred penetrant is Immunoperm TM Which itself releases approximately 50% of cytoplasmic RNA (85% of total RNA in the cell) and has no effect on nuclear or mitochondrial nucleotide equivalents. In a fixed cell can be released in a releasable cocktail comprising total cellular RNA and the remaining 50% SDS of total DNA, protease, formaldehyde scavenging agent, the composition comprising one embodiment of the present invention Constitute. Although the exact mode of action of the individual cocktail components is not known, SDS solubilizes intracellular RNA and DNA cross-linked to structural intracellular proteins, thereby enabling more effective proteolysis and formaldehyde. It is believed to work to allow release of hydr cross-linked nucleic acids. Novel formaldehyde scavenging reagents exemplified by amines such as, but not limited to, hydroxylamine, carboxymethylamine, hydrazine, acetohydraside and other hydracides, or hydrazine derivatives, tris, and the amount of nucleic acid released and It has been found to increase "quality", where quality is measured by increased amplification rate and yield. The two fractions released with Immuniperm and the releasable cocktail can be analyzed individually or pooled prior to analysis.
[0042]
Thus, any detergent or protease (or combination thereof) that can release cellular nucleotides, with or without formaldehyde scavengers, preserves and maintains the required form for simultaneous analysis. However, this would be included within the scope of the present invention.
[0043]
Unlike current cell fixation and RNA salvage protocols, which tend to fragment cellular RNA considerably, the present invention is based on cells treated with penetrants such as saponins that penetrate the cell membrane while maintaining cell integrity. Allows extraction and isolation of more than 90% of intact cytoplasmic total RNA and mRNA. mRNA isolation is also compatible with immunomagnetic cell enrichment and immunofluorescent cell labeling techniques. T7, SP6 or T3 promoter, flow cytometry, microarray and cell spotter R Using comprehensive RNA expression profile analysis of cells identified and characterized by cell analysis guidelines such as RNA polymerase promoter-based linear amplification methods (both manufactured by Immunicon Corp, PA) or using the CellTracks system The expression profile can be directly validated, supplemented, augmented, and the information obtained from it can be enhanced.
[0044]
While not intending to be limited to a particular fixative, permeabilized cells are treated with a cross-linking agent to maintain morphology and antigen, nucleotide integrity as described above. Cyto-Chex TM , StabilCyte TM And TRANSfix TM Are examples of three commercially available stabilizers that have shown utility in stabilizing blood cells in blood samples for extended periods of time. These stabilizers are optimized to maintain cell size (mainly by minimizing contraction) and retain cell surface antigens as measured primarily by flow cytometry. Intended applications generally involve direct analysis and do not require extensive manipulation of samples or enrichment of specific cell populations. In contrast, circulating tumor cells isolated or detected by the present invention, or other rare target cells, are defined as pathologically abnormal or rare cells present at a very low frequency, thus detecting Needs substantial enrichment prior to.
[0045]
Cyto-Chex TM The stabilizer can be used as a cell stabilizer and as an aldehyde-releasing fixative of intracellular RNA that results in the formation of macromolecular complexes with intracellular proteins, as demonstrated by the application of the present invention. The inventors unexpectedly preferred that Cytochex TM Immobilization with a formaldehyde donor such as is necessary to retain and protect the RNA during subsequent sample processing, and the total or optimal release of fully functional RNA is It was found that saponin was required in combination with the released cocktail.
[0046]
An ideal “stabilizer” or “preservative” (used interchangeably herein) in any case is the isolation, detection and counting of target cells and their distinction from non-target cells Defined as a composition that can rapidly preserve target cells of interest present in a biological specimen while minimizing the formation of interfering aggregates and / or cell debris in the biological specimen. . In other words, when combined with an anticoagulant, the stabilizer should not adversely affect the performance of the anticoagulant. Conversely, anticoagulants should not interfere with the performance of the stabilizer. In addition, the disclosed stabilizers also perform a third function of immobilization, thereby stabilizing the permeabilized cells, where the expressions “permeabilized” or “permeabilized” and “fixed”. “Fixed” or “fixed” is used as conventionally defined in cell biology. The description of stabilizers herein means the use of these agents in appropriate concentrations or amounts readily apparent to those skilled in cell biology, where the concentrations or amounts are damaging. It is effective to stabilize the target cell without causing it. Those who use the compositions, methods and devices of the present invention for the purpose of preserving rare cells do not use them to damage or destroy these same rare cells, and therefore do not use the appropriate concentration or amount. Will be chosen uniquely. For example, the formaldehyde donor imidazolidinyl urea is effective at a preferred concentration of 0.1 to 10%, more preferably 0.5 to 5%, most preferably about 1 to 3% of the volume of the analyte. Is known. Additional agents such as polyethylene glycol have also been found to be effective in stabilizing cells when added at a preferred concentration of about 0.1% to 5%. PCT / US02 / 26867 describes the use of such agents and is incorporated herein by reference.
[0047]
The surprising aspect of the present invention is that intracellular RNA as part of the macromolecular complex is recovered from cells already treated with cell stabilizers and fixatives in an amplifiable and almost quantitative yield. be able to. Adequate release of cross-linked RNA requires saponins combined with enzymatic digestion in the presence of soluble detergents and formaldehyde scavengers. For example, Cyto-Chex TM Proteinase K, V8 proteinase, proteinase digestion of treated cells results in complete recovery or full length, comprehensively analyzable RNA. The presence of the formaldehyde scavenger disclosed in the present invention has been found to further improve RNA recovery.
[0048]
In embodiments of the present invention, target cells such as circulating cancer cells or fetal cells effectively isolate it from other non-target cells, purify their nucleic acids, and then target of interest for microarray analysis. It can be assayed by amplifying (s).
[0049]
Thus, isolation of cytoplasmic biomolecules is accomplished by first separating the permeabilized cells from the permeabilized compound via centrifugation or immunomagnetic bead enrichment. Cytoplasmic biomolecules are then present in the supernatant. Isolation of cytoplasmic biomolecules can be achieved by capturing with magnetic beads. For example, if the cytoplasmic biomolecule is mRNA, the mRNA can be captured from the cell by using oligo (dT) attached to a magnetic bead or non-magnetic support, with or without centrifugation, and thereby separated. can do. If the cytoplasmic biomolecule is a protein, an antibody capable of binding to a specific protein can be used, and the antibody can be attached to a magnetic bead or a non-magnetic support. Other separation techniques such as standard protein and RNA chemical extraction, electrophoresis, chromatography, immunoseparation and affinity techniques are well known to those skilled in the art. Immunomagnetic enrichment reagents and devices for separating cells and biomolecules include, but are not limited to, Immunicon Corp. (Huntingdion Valley, Pa), Dynal (New Hyde Park, NY and Miltenyi Biotech Inc. (Aupurn The cells can be prokaryotic, such as bacterial cells, or eukaryotic, such as mammalian cells, most preferably of human origin. In the examples, the cells are carcinomas or tumor cells Preferred preferred carcinomas include, but are not limited to, breast, prostate, lung, colon, and ovarian tissues, such as circulating tumors in blood and bone marrow Cells include those found in tissue pieces or body fluids.
[0050]
Respectively defined as either functional genomics or functional proteomics for the analysis of nucleic acids or proteins, for sequential cytoplasmic and / or whole cell biomolecule analysis and membrane biomolecule analysis on exactly the same sample Discloses a method for preparing cells. As noted above, such analysis has not previously been possible with the same cells (sites) prior to the method of the present invention. Cells are contacted with the permeabilizing compound to release cytoplasmic biomolecules as described above without altering structural and membrane biomolecules.
[0051]
Thus, as disclosed herein in the present invention, cells are contacted with a permeabilizing compound, stabilized, and after collecting cytoplasmic biomolecules as described above, the cytoplasmic biomolecules from the cell sample are analyzed and analyzed from the same cell sample. Methods for analyzing membrane biomolecules of the present invention are provided. Cytoplasmic biomolecules can be isolated and analyzed with the relevant biomolecules or sequentially.
[0052]
The present invention also provides reagents and kits for isolating cytosolic or total cellular RNA, particularly mRNA. The kit comprises an osmotic compound and an RNA extraction reagent for RNA isolation and detection, such as, for example, various length oligo (dT) or gene-specific sequences or random (degenerate) oligonucleotides. Hybridization probes can be included. The kit can also include an antibody that binds to a protein associated with the cell, such as an antibody that binds to a membrane biomolecule. Antibodies and probes can be labeled with enzymes, fluorescently labeled, or radioactively labeled for detection. The antibody and the probe can be attached to, for example, a magnetic bead to facilitate separation.
[0053]
analysis
Cytoplasmic biomolecule analysis includes any type of analysis or assay that is isolated from the cytoplasm of a cell and contains biomolecules. Cytoplasmic biomolecule analysis further includes, but is not limited to, mRNA profiling, protein expression profiling, reverse transcriptase polymerase chain reaction, northern blotting, western blotting, nucleotide or amino acid sequence analysis, gene expression SAGE serial analysis, Including but not limited to competitive genomic hybridization (CGH), electrophoresis, 2-D electrophoresis, mass spectrometry by MALDI or SELDI, gas chromatography, liquid chromatography, nuclear magnetic resonance, infrared, atomic absorption, etc. Includes functional genomic expression profiling. Sequence analysis at the nucleotide or amino acid level can indicate and identify the presence of a mutation in a protein, DNA / cDNA, or mRNA sequence. For example, profiling analysis of the original gene or protein can indicate the presence of an oncogene in transformed or tumor cells. Subsequent analysis after appropriate cancer therapy can indicate a lower tumor burden during remission, or regression as a result of further mutations of oncogene and the emergence of drug-resistant or more aggressive tumor cells Indicates.
[0054]
Membrane biomolecule analysis includes any type of analysis or assay involving biomolecules bound to or associated with intracellular cell membranes, ie, extracellular and intracellular biomolecules or markers. Suitable analytical methods include, but are not limited to, flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay, morphological staining, cell sorting and the like. Permeabilized cells can be sorted, for example, by fluorescence activated cell sorting (FACS) technology based on the expression of certain detectable proteins. Cell sorting techniques are well known to those skilled in the art and have been used, for example, to simply count detectably labeled cells in cancer diagnosis. Permeabilized cells can also be classified based on the expression of specific proteins, such as CD4 or CD8 cells. Membrane biomolecule analysis can also be performed on the downstream membrane fraction followed by analysis including but not limited to protein expression profiling. Western blotting, amino acid sequence analysis, mass spectrometry, gas chromatography, liquid chromatography, nuclear magnetic resonance, infrared, atomic absorption, surface plasma resonance (SPR) and any other technique suitable for analysis of membrane components.
[0055]
Functional genomic analysis or assays can be performed on genetic material retained in permeabilized cells. For example, genomic DNA, nucleus (hnRNA), mitochondria (mtRNA) and any other RNA or DNA carried by the organelle that remains bound or remains fixed in the cell upon cell permeabilization can do. Thus, the types of analysis described above for cytoplasmic biomolecules include, but are not limited to, in situ hybridization, polymerase chain reaction, differential display PCR, random origin PCR, microsatellite analysis, single nucleotide polymorphism Genomic DNA, hnRNA using methods or assays including (SNT), competitive genomic hybridization (CGH), restriction fragment length polymorphism analysis, nuclear and mitochondrial transcript run-on assays, in vitro proteins, translation assays And mtRNA. However, in order to obtain genomic DNA, nuclear hnRNA and mtRNA, permeabilized cells must be exposed to the release cocktail of the present invention, completely lysed, or further fractionated by conventional means well known to those skilled in the art. I must. In stabilized cells, a combination of proteinase and nucleophile can be used to reverse and remove the macromolecular complex containing the nucleic acid of interest to liberate RNA and DNA nucleic acid components. In addition, cellular organelles retained upon permeabilization can subsequently be further fractionated and isolated for metabolic functional assays such as, for example, mitochondria. Accordingly, another embodiment of the present invention provides a method for separating nuclear or mitochondrial genetic material from cytosolic RNA. Cells containing nuclear or mitochondrial genetic material and cytosolic RNA are contacted with the permeabilizing compound as described above. Nuclear or mitochondrial genetic material can be isolated, for example, by subsequent appropriate subcellular fractionation and complete cell / organelle lysis of the fractionated cellular material. The resulting organelle-specific components (DNA, RNA, proteins, lipids, carbohydrates, etc.) can be extracted from the homogenate or isolated and analyzed. Isolation can also be accomplished using organelle-specific immunomagnetic beads as described above.
[0056]
Several important practical automation benefits arise from the present invention. For example, after removing the permeabilization solution from the cells, the mRNA can be captured with oligo (dT) -magnetic beads that are ideally suited for automated downstream manipulation and global analysis similar to microarrays. In addition, only minor changes are required in current mRNA analysis to generate both protein and mRNA profiles, thus reducing time and reagent requirements. In addition, the corresponding intact cell genomic DNA in the nucleus and mitochondria is still contained in and accessible to permeabilized cells, FISH, SNP, SAGE, DD-PCR, PCR, RFLP, RT-PCR, CGH, Downstream analysis can be done by conventional methods for DNA, RNA and proteins such as cDNA microarrays, mass spectrometry and protein arrays. For example, a simultaneous multi-component analysis strategy for DNA, RNA, proteins, lipids, carbohydrates and (precursors, metabolites and their cofactors) in a large microarray can thus be applied to any eukaryotic cell, tissue sample or body fluid. Can also be widely applied. This type of cell expression profiling with multiple cell components or in combination with multiplexed (eg microarray) analysis is an edge-cutting purpose in technologies ranging from high-throughput screening of drug candidates to disease diagnosis and management.
[0057]
The present invention also provides reagents and kits for isolating cytosolic or total cellular RNA, particularly mRNA. The kit comprises an osmotic compound and an RNA extraction reagent or hybridization for isolation and detection of RNA, such as, for example, various lengths of oligo dT or gene-specific sequences or random (degenerate) oligonucleotides. A probe can be included. Alternatively, the kit can include an antibody that binds to a protein associated with the cell, such as an antibody that binds to a membrane biomolecule. Antibodies and probes can be detected by labeling the enzyme, fluorescently labeling, or radioactively labeling. In addition, antibodies and probes can be attached to, for example, magnetic beads to facilitate separation.
[0058]
Thus, an intact library is queried for the presence of any message involved in identifying the presence of epithelial cells and / or confirming the presence of tissue of origin of those epithelial cells. For this purpose, all of the mRNA present in the sample must be analyzed for each particular gene of interest, each with the same sensitivity / selectivity as the others and the mRNA of interest at a time. Has the ability to see.
[0059]
Based on previous criteria, overall gene expression analysis by microarray would have been insensitive to rare events. In particular, the signal-to-noise ratio in the sample was not realistic and was low due to problems such as white blood cell immunomagnetic carryover contamination in any given enriched sample. For example, in a fluid sample enriched with a specific target population of cells by immunomagnetic selection, it would potentially be approximately 10,000 white blood cells carried away for a target population of 1 to 10 cells. The target cell (s) are developing a rare event of interest and will be masked by nucleotides found in white blood cells. Excess white blood cell-derived background RNA noise coupled with extremely rare copy levels of target mRNA results in potential signals that cannot be detected.
[0060]
To circumvent the problem, total RNA (or purified mRNA) is pre-amplified by using either SP6, T3 or T7 RNA polymerase promoter-based in vitro linear pre-amplification methods. The Typical examples are T7 RNA polymerase (T7RNAP), promoter (T7RNAPP) and enzyme amplification systems, but any equivalent system can be replaced by systems apparent to those skilled in the art. Linear pre-amplification of all messages increases the display of the original mRNA library by at least 1000-fold, with minimal relative abundance of individual mRNA sequences within the RNA population. The same pre-amplification process is also known as transcript amplification, linear amplification, or in vitro amplification. Thus, it is a 1000-fold linear pre-amplification of the total mRNA library, which is one specific feature of embodiments of the present invention. Single-stranded mRNA is annealed in the poly A tail region in the oligo (dT) portion of the T7 promoter-containing oligonucleotide. RNA polymerase generates an antisense copy (aRNA) of the entire mRNA library. Thus, in general, the number of copies of mRNA with a poly A tail in the entire library is increased by at least 1000 fold, and the sensitivity of any particular mRNA sequence type is increased accordingly by a factor of 1000.
[0061]
For example, the T7 promoter oligonucleotide primer used as the first strand RT primer and the subsequent T7 RNAP amplification primer has the following base sequence order:
[0062]
[Chemical 1]
Figure 2005507997
[0063]
It consists of 67 bases with a 3 ′ oligo (dT portion) containing a 5 ′ T7 RNA polymerase promoter sequence having The pre-amplification reaction is completed by a reverse transcription reaction followed by random origin DNA polymerase dependent second strand synthesis and an overnight incubation with the final T7 RNAP. Subsequently, a portion of the entire reaction mix is used in the PCR reaction analysis, which is either a specific single band amplicon or any other suitable selected with an appropriately designed gene specific primer (GSP) of interest. Give rise to proper RNA analysis.
[0064]
One skilled in the art will recognize that the design and synthesis of gene-specific primers depends on the particular target sequence to be amplified and can be designed by any known art accepted means. For example, the gene-specific primer is NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST R (Basic Local Alignment Search Tool) Designed using software and GenBank human cDNA sequence database. Primers are optimized for annealing temperatures of about 55 ° C to 65 ° C and have been shown to generate only DNA-free, RT-PCR dependent single bands from complex mRNA libraries, It is known to be positive for mRNA. Complex mRNA libraries are often extracted from normal and cancerous human tissues and in vitro cell lines. The designed primers yield the desired target sequence specific PCR bands, all subjected to agarose gel electrophoresis and compared to known standards and design-predicted molecular weights. The calculation is completed using the Rf value determined by the gel analysis software. Amplicon sequences can be further confirmed by direct sequencing, blot probing, restriction concept mapping, and the like.
[0065]
As described above, a novel modification of the RNA polymerase promoter-driven linear amplification strategy was developed to circumvent inherent signal-to-noise (S / N) limitations in cDNA array analysis. Alternatively, a single tube multigene RT-PCR analysis system based on universal PCR amplification of multigene-specific reverse transcription of cDNA in a single reaction tube substantially reduces background noise. These two improvements in signal to noise ratio are specific components embodied in the present invention.
[0066]
The second strand synthesis of the pre-amplified library contains 1 to 1000 independent regions of interest for a single sample that are only within the selected region, and still 100% from the original library. Maintain sensitivity. Second strand synthesis is completed by selective amplification of only the gene of interest. Thus, gene specific primers (GSP) are designed for second strand synthesis to include only the region of interest. The region will include, but is not limited to, prostate antigen (PSA), PSM, CK19, EpCAM, AR, HPN, F6, manoglobin and / or all cytokeratins. A GSP is designed to incorporate a universal primer at its tail end.
[0067]
In contrast to the prior art, where the first strand synthesis is performed with a set of gene specific primers, some of the novel aspects of the present invention do not involve the use of CAP switches.TM. For the use of gene specific primers (US Pat. No. 6,352,829). The prior art teaches that a gene specific primer is designed to incorporate an optional anchor sequence at its 5 'end containing a CAP switch oligonucleotide. Thus, surprisingly in the presently disclosed invention, the universal portion of the primer does not contain a CAP switch site.
[0068]
The length of the gene specific primer is typically in the range of about 15-30 nucleotides, while the universal primer portion is typically about 15 in length.
[0069]
Reverse transcription of a small portion of a T7 amplified antisense RNA (aRNA) library is performed using cycling conditions known in the art. All RT-PCR results are first analyzed on a 2% agarose gel containing ethidium bromide according to techniques known in the art.
[0070]
After amplification of selected portions of the amplified aRNA library, it is then analyzed in an array format or any electrophoresis format known in the art.
[0071]
In addition to the amplification of the second strand after pre-amplification as described above, universal PCR multigene amplification is performed in a single tube, and the appropriate pair of opposing (P2) is combined for simultaneous second strand synthesis. A set of gene specific primers (P1) for simultaneous reverse transcription structures can be incorporated. Together, they define both (alpha and beta) termini and form a complete set of gene specific amplicons equal to the GSP multigene panel of interest. GSP1 and GSP2 priming for the synthesis of both gene-specific first and second strands is performed with suitable enzymes known to those skilled in the art and under conditions of high primer-target annealing specificity. Further levels and approaches to achieving appropriate primer specificity can be achieved using proteins from natural recombinant cell repair mechanisms such as recA. Appropriate application of these repair systems in vitro will allow excellent, even absolute, specificity of primer template formation. Template criteria are either mRNA, or mRNA: cDNA heteroduplex, or double stranded duplex cDNA. In addition, as described in this application, innovative ideas that utilize cellular natural repair mechanisms are based on GSP-RT subsets for signal-to-noise shifting that allow cDNA array analysis of rare cellular events. It can be applied to other gene-specific primer methods such as those described below. Each P1 and P2 primer in the GSP multigene panel of any one of the PCR primers is a universal primer sequence common to all gene-specific P1 and P2 (or just a common common to both P1 and all P2) Universal sequence). Control all unfavorable side reactions and competitive reactions after removing all GSP1 and 2 of the second strand synthesis from the set of desired double-stranded amplicon panels to eliminate their non-specific impact on downstream processes For molecular size-based exclusion, chromatography, solid support selective attachment supplied by Sephadex and Centricon et al., Combined with DNA oligonucleotide primers synthesized with deoxyuridine (U) instead of thymidine (T) Many strategies are possible for those skilled in the art, such as single-strand specific DNase (Mung Bean, S1, etc.) primer sequence specific strategies such as uracil-N-glycosylase (UNG). Alternatively, cDNA oligo primer hybrids can be used in place of DNA-uracil and can be eliminated after first and / or second strand synthesis via DNase-free RNase treatment as well. The easy availability of uracil containing DNA-primers combined with the ease of PCR integration of UNG degradation provides an effective way to eliminate unwanted complex primer interactions. This UNG degradation strategy will yield fairly small oligos that can be annealed at the selected PCR annealing temperature. Following UNG treatment, the cDNA template mixture will probably benefit from treatment with DNase-free RNase to eliminate all unwanted side reactions caused by high complexity RNA. Following UNG treatment (with any RNase treatment to eliminate all RNA), the only remaining nucleic acid is hybridized with the first and complementary second strands to form a duplex, which A sampleable PCR template is constructed. Next, add non-UMP containing universal primers (1 or 2MAX) for later PCR. The net effect is the capture of mRNA (or DNA minus RT) with one or two PCR-compatible high-efficiency primers that allow quantitative RT-PCR multigene simultaneous amplification and subsequent analysis in a single tube. It is. Since the primers are universal, they originate from each GSP amplicon with exactly the same efficiency, eliminating the confusing multiple GSP primer performance problem. Each GSP-defined amplicon with a panel or set of amplicons can have a different predetermined fragment size, each GSP sequence can be vertical and horizontal PAGE and agarose gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, SELDI, MALDI, cDNA array In a size-based analysis system such as, it is possible to resolve and identify by its unique Rf value. Thus, a rapid multigene RNA / DNA panel can be rapidly applied to query a very large number of samples for a diverse set of diagnostic therapies and monitoring applications. This method achieves multiplex gene analysis from individual samples of mRNA in a single reaction tube with or without mRNA library pre-amplification. There is no pre-amplification that makes it possible to analyze a panel of only one gene in one assay in one sample. Pre-amplification adds the advantage of analyzing a single sample in up to 1000 different assays, thus many different panels of genes can be interrogated at different time points per sample. Although not limited to any particular method, analysis of universal PCR panels by cDNA array or capillary gel electrophoresis (CGE) is the preferred method.
[0072]
Thus, a critical feature that distinguishes the present invention from the prior art of the prior art is the improvement of signal-to-noise by selective amplification of rare target mRNA species, and this method is novel from a wide variety of existing mRNA analyses. Development. A wide variety of known analytical systems, such as multiplex RT-PCR, substantially change signal-to-noise, but the challenge of designing and optimizing critical multiplex systems is to reduce them by 2 in a reaction vessel. It was generally unrealistic for the target subset to exceed.
[0073]
The present invention also utilizes a high signal to noise improvement to select a representative transcript and amplify the entire set of target sequence (s) to be detected in a single reaction vial.
[0074]
Thus, the present invention is not limited to the following specific uses, but uses representative gene-specific primer set (s) to generate target gene subset (s) found in known disease states Can do. A representative set includes at least two different target genes that indicate the disease state of interest. In each reaction vial, the number of gene-specific primer sets is determined by the disease state and the known characteristics that define the disease state.
[0075]
The following examples are provided to illustrate the practice of the disclosed invention and to demonstrate the impact of the invention on diagnostic techniques. These examples are not intended to limit the scope of the invention. In addition, the disclosure of each patent, patent application, and publication cited or described in this document is incorporated by reference in its entirety. Throughout these examples, molecular cloning reactions and other standard recombinant molecular biology techniques are described in Maniatis et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) (hereinafter "Maniatis et al." ), And Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, 2002, using commercially available reagents except as noted.
[0076]
Example 1
Isolation of cytoplasmic RNA
The supernatant from unfixed cells selected with ferrofluid permeabilized with Imuniperm, a phosphate buffered solution containing 0.05% saponin and 0.1% sodium azide, is present in the cytoplasm of the cell It was found to contain more than 80% of total cellular RNA. RNA isolated from this supernatant showed no evidence of degradation as judged by native and denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. This supernatant, which is normally discarded after intracellular staining of cells selected with ferrofluid, unexpectedly contains RNA in full or undegraded full-length form, thus the same cells used in morphological analysis Was found to provide an mRNA profile. FIG. 2 shows these findings showing that total RNA release occurs in less than 1 minute and that about 95% of total cytoplasmic RNA is easily and reproducibly isolated.
[0077]
In dramatic contrast, the conventional process, namely the commercially available phenol-based RNA lysis buffer Trizol R RNA isolated from cells of the breast cancer cell line SKBR3 using isolation by Reagent (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Cat. No. 10296) is completely lysed and the whole cell structure is homogenized, so that the genome and mitochondria DNA and cytoplasm, mitochondrion and nuclear RNA were released. Investigation of cell pellets from Immunoperm (SKONIN) -treated SKBR3 cells selected with EpCAM ferrofluid (see the Examples for detailed procedure) shows that all cellular total RNA predicted from the same number of non-permeabilized whole cells The presence of genomic and mitochondrial DNA and nuclear and mitochondrial nearly 100%, accounting for approximately 15-20% of Approximately 95% of the predicted cytoplasmic RNA was recovered intact from the Immunoperm supernatant layer.
[0078]
As shown in FIG. 3, a duplicate tube containing approximately 250,000 cells of the breast cancer cell line SKBR3 is first enriched immunomagnetically and then in the absence (PBS only) and in the presence of Immunoperm (+ IP). And incubating at room temperature for 15 minutes. The Immunoperm treated permeabilized cells were then separated by centrifuging at 800 × g RCF for 5 minutes as a visible permeabilized cell pellet. The Immunoperm supernatant fraction containing all cytosolic soluble components was transferred to a second tube. Total RNA isolated from total untreated cells, Immunoperm treated permeabilized cell pellets, and Immunoperm treated cell supernatant fractions were RNeasy. R (Qiagen Inc., Valencia, Calif.) Isolated using the silica binding method. Subsequently, these total RNA fractions were treated with BASE to remove trace amounts of DNA. By spectrophotometric quantification of DNased RNA, an average of 20 picograms of total RNA / cell for total cells (= 100%), 4 picograms of total RNA / permeabilized cells (20%) from the pellet fraction, 16 from the supernatant fraction. Picograms of total RNA / cell (80%) were obtained. From these three DNase-treated total RNA fractions, 2.5 × 10 4 Cell equivalent masses were formamide denatured and electrophoresed through a 1% agarose gel as shown in FIG. 3, followed by staining with ethidium bromide. Agarose gel densitometry quantification was consistent with spectroscopic recovery values. Also, the gel image in FIG. 3 shows a higher integrity as evidenced by the relative proportion of the 4.4qb ssRNA co-migrating 28S rRNA band compared to the 2KB BSSRNA marker where the rRNA is full length and migrates with the 18S rRNA band It shows having. In general, the observed relative ratio of 28S rRNA to approximately 2 of 18s RNA is shown to be that of mRNA integrity as further demonstrated by Northern blotting this gel and probing it with oligo (dT) as shown in FIG. It is a good display. Literature values for the percentage of total RNA contributed from the nucleus are in the range of 15-25%. Thus, Immunoperm containing 20% RNA R The treated cell fraction is consistent with the published nuclear contribution.
[0079]
In conclusion, Immunoperm-based permeabilization unexpectedly provided a complete separation of nuclear and cytoplasmic total RNA in almost 100% of the cytosolic total RNA that could be easily recovered in the supernatant of Immunoperm treated unfixed cells. . Furthermore, the nuclear fraction of total RNA was surprisingly found to remain intact in the permeabilized cell structure obtained after Immunoperm treatment.
[0080]
Two Immunoperms using poly-A tail hybridization R The mRNA portion of RNA derived from the cell fraction was evaluated on whole cells by Northern plot transfer of denatured RNA from the gel shown in FIG. 3 to a positively charged nylon filter. Oligo (bT) 25-mer probes were labeled with 32P polynucleotide kinase and then hybridized to a Northern plot. A single-stranded RNA size ladder containing a poly-A tail was used as a marker that allowed the formation of molecular weight banding ladders for homologous quantitative sizing of mRNA populations. The oligo (dT) hybridization results in FIG. 4 show that no significant difference in size range is observed for the mRNA library between the three samples.
[0081]
Comparative quantitative phosphor image analysis of total mRNA-blotted region (ie, total dT hybrid signal) from total cellular mRNA was performed with almost total and almost total from Immunoperm-treated permeabilized cell pellet nuclear fraction) + Immunoperm-derived cytosolic fraction It was the same. Furthermore, permeabilized by phosphor imaging, the cellular fractional percentage of mRNA from the dT-probe signal is identical to the 28S / 18S rRNA ptageage measured from densitometric analysis of agarose gel images. These data demonstrate that both the Immunoperm-derived cytosolic total RNA and its mRNA components are quantitatively isolated, exhibit high integrity, and are full length. Release of Immunoperm-derived mRNA is limited by the size of the transcript. This is because almost 100% of cytosolic mRNA can be retrieved from the Immunoperm supernatant, and the integrity of rRNA28 S / 18S shows sufficient retention of mRNA integrity.
[0082]
The Northern blot shown in FIG. 4 was stripped and reprobed with a nuclear specific precursor rRNA probe. FIG. 5 shows that immunoperm treatment of cells achieves complete separation of the nuclear and cytosolic total RNA population. Thus, the nuclear membrane structure is still intact during Immunoperm treatment, and the nucleus retains all its soluble components.
[0083]
The Northern blot in FIG. 3 was stripped and reprobed with a mitochondrial-specific 12S rRNA. The results shown in FIG. 6 demonstrate that the immunoperm treatment of cells achieves complete segregation of mitochondrial and cytosolic RNA populations. Thus, the mitochondrial membrane structure is still intact during Immunoperm treatment.
[0084]
The same total RNA stock solution used to generate the images in FIGS. 3-6 was further used to obtain equivalent mass and specific activity. 32 A P-labeled first strand cDNA library was generated. These three labeled first strand library probes were hybridized to obtain separate but identically prepared cDNA array dot plots as shown in FIG. Here, the objective was to assess the relative abundance of mRNA expressed in each Immunoperm-derived cell fraction by comparing the relative proportions of each cDNA hybrid signal pattern for each imaging filter. The identity of a randomly selected cDNA gene array for the template is shown in FIG. The top row of dots is named by the abbreviations 23 kd = 23 kilodalson protein, a-tub = alpha tubulin, b-act = beta actin, b2mic = beta-2-microglobulin, phos = phospholipase A2. A set of housekeeping genes. The second column is named as f6 = alpha = 1−, globin, CD16 = cluster determinant 16, CD12, CD38, CD45 and CD31. The bottom row is named by d6 = macrophage inhibitory cytokine 1, CK8 = cytokeratin 8, CK18 = cytokeratin 18, CK19 = cytokeratin 19, EpCam = epithelial cell adhesion molecule, uPA = urokinase plasminogen activator. It consists of general epithelial specific inheritance. Comparison of qualitative and quantitative phosphor imaging of each fraction showed no significant differences in the relative abundance of genes in the array. Interestingly, these data show that the relative abundance from whole cells is roughly equal to its cytosolic fraction, which in turn is equal to its nuclear fraction, where the total RNA mass is , Which can vary from about 20% in the nucleus to about 80% in the cytosol. The length of each transcript in this cDNA array varies from 1 to 5 kb, again reinforcing the Northern blot finding that there is no size bias in mRNA released from Immunoperm-treated cells. The same relative display pattern in FIG. 7 indicates that, unexpectedly, Immunoperm-derived RNA is a reverse transcriptase that is as effective as total cell mRNA from traditional methods and first strand synthesis. Indicates a template.
[0085]
Overall, these data show that Imuniperm-derived cytosolic RNA is substantially> 95% of all cytosolic total RNA, ie, total cellular total RNA in all homogenized cells that are full length. Resulting in an unexpected finding that it has the same efficiency of reverse transcription as total RNA isolated by traditional phenol and silica extraction methods. Thus, Imuniperm-derived cytosolic total RNA and the accompanying heterologous nuclear RNA components are equally effective in all conventional downstream RNA analysis methods when compared to traditional whole cell high quality RNA isolation methods It is a mold.
[0086]
FIG. 8 shows a gel image of cytosolic RNA obtained by treating about 770 PC-3 cells with Imuniperm. The data shows that Imuniperm-derived cytosolic mRNA from a lower cell number gives the same proportion of RNA as shown in FIGS. 3, 4, 5, 6 and 7. Therefore, Imuniperm-mediated cell release of cytosolic RNA is not cell number dependent.
[0087]
Example 2
Isolation of circulating tumor cells from peripheral blood
Isolation of circulating tumor cells from peripheral blood, followed by cell analysis by flow cytometry and gene expression analysis by RT-PCR can be performed as follows: EDTA-anticoagulated blood (7.5 ml) Transfer to a 15 ml conical tube and add 6.5 ml System buffer (PBS containing 0.05% sodium azide, catalog number 7001, Imunicom Corp, Huntingdon Valley, PA). Cap the tube securely and mix by inverting several times. The blood-buffer mixture is centrifuged at 800 × g for a sufficient period at room temperature. Carefully remove the supernatant by aspirating carefully without disturbing the buffy coated layer. Some supernatant can be left in the test tube. The aspirated supernatant can be discarded. AB buffer (System buffer containing streptavidin as a reversible agglutination reagent, Immunicon Corp, Huntingdon Valley, Pa.) Is added to the test tube to a final volume of 10 ml. Cap the tube and mix by inverting several times. VU / desthiobiotin EpCAM ferrofluid particles (biotin with streptavidin-immunomagnetic nanoparticles coupled to anti-EpCAM monoclonal antibody conjugated to desthiobiotin for reversible aggregation (Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA) Is resuspended by gently reversing the vial several times 100 μl of VU / desthiobiotin EpCAM ferrofluid was added to the sample in AB buffer and the tubes were mixed by reversing several times. Shake should be avoided to avoid foaming Immediately insert the test tube into a QMS17 (Catalog No. AS017, Immunicon Corp, Huntingdon Valley, PA) magnetic separator and leave for a while. Resuspend the contents by reversing the tube several times, reinsert the test tube into the QMS17 magnetic separator, Leave the test tube out of the separator and resuspend the contents by reversing the test tube several times Remove the lid and place the test tube in the QMS17 separator for another 20 minutes. Place QMS17 and carefully aspirate the cell-buffer mixture using a Pasteur pipette, discard the aspirated supernatant, then immediately remove the tube from the separator and add 3 ml of System buffer. Resuspend by agitating lightly, the liquid rises in the test tube while stirring so that the cells near the top are washed.The test tube with the lid off is again placed in the QMS17 separator for 10 minutes and the supernatant Aspirate with a Pasteur pipette and discard the aspirated supernatant.
[0088]
Magnetically by stirring in 200 μl Imuniperm / RNase inhibitor (permeabilizing reagent, Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA), which also contains an RNase inhibitor (RNase OUT, Cat. No. 10777019, Invitrogen Rockville, MD). Resuspend the collected cells. While stirring so that all cells are washed, liquid rises in the test tube. Monoclonal anti-cytokeratin antibody (C11-PE, 0.25 μg) in a volume of 25 μl (a cocktail of antibodies recognizing cytokeratin 4.5.5.6.8.10.13.18 conjugated to R-phycoerythrin) And 10 μl of CD45 PERCP (pan-anti-leukocyte marker “Catalog No. 347464, Becton Tickinson Sau Jose, Calif.) Or any other suitable antibody and mix by agitation. The sample is then gently agitated by tapping the bottom of the tube, returning the tube to QMS 17 in 5 minutes, aspirating the supernatant lightly and transferring the Imuniperm-RNA fraction to an appropriately labeled tube. .
[0089]
Example 3
Cell analysis of circulating tumor cells from peripheral blood
Cells from Example 2 are resuspended in 20 μl CellFix (PBS-based buffer containing biotin as de-aggregation reagent and cell storage components, Immunicon Corp., Huntingdon Valley, PA) and incubated for 5 minutes. . Samples are transferred to a 12 × 75 mm flow test tube and combined with 300 μl of PDS, followed by the nucleic acid dye Thioflavin T (Sigma # T3516, 10 μl) and approximately 10 μl of fluorescent beads (10,000 beads; Flow-Set Fluorospheres, catalog number 6607007 Coulter Add Miami, FL). Mix the sample by stirring. Preferably, the fluorescent bead test tubes are mixed by agitation before adding the beads by pipette. The sample is then analyzed by flow cytometry.
[0090]
Example 4
Gene expression analysis of circulating tumor cells from peripheral blood
Poly (A) + mRNA is isolated using magnetic oligo (dT) labeled beads (Dynabeads® mRNA DirectR Micro Kit, Dynal, Prod. No. 610.210, New Hyde Park, NY). Alternatively, all by using any other suitable means known to those skilled in the art, such as silica coupling, polymer coupling, more traditional phenol extraction such as Trizol R reagent (Gibco Drl catalog number 10296). RNA can also be isolated. Genomic DNA is eliminated by treatment with a DNase enzyme such as DNase1 (Zibco DRL). 2: 1 10 × DNase1 (1 U /: 1), 1: 1 RNase inhibitor (cloned), 5: 1 dH 2 Prepare an enzyme mix consisting of O, and 10: 1 RNA or control (2501 ng genomic DNA). Incubate the enzyme mix at 37 ° C. for 20 minutes. DNase treated RNA by magnetic oligo (dT) labeled beads or Trizol® isolation is purified again and resuspended in 10: 1 RNase-free water. Control genomic DNA (+/- DNase treatment) is run on a 2% agarose gel, and the activity of the DNase enzyme is confirmed by staining with ethidium bromide.
[0091]
rTth (Thermos thermophilis) RT-PCR can be used to amplify specific mRNA sequences. 10: 1 5 × EZ buffer 1.5: 1 mATP, 1.5: 1 dCTP, 1.5: 1 dCTP, 1.5: 1 dGTP, 1.25: 1 dUTP, 5 : 1 Mn ++ (25 mM), 2: 1 rTth (2.5 U /: 1), 0.5: 1 UNG (1 U /: 1), 12.25: 1 dH 2 A master mix consisting of O, 2.25: 1 sense primer, and 2.25: 1 antisense primer can be prepared for reverse transcription of specific mRNA species. Contains 10: 1 DNase-treated RNA and contains 10: 1 H 2 Add 40: 1 volume of master mix to the same test tube corresponding to the corresponding negative control tube containing O. PCR thermocycling is performed for 40 cycles as follows: 50 ° C (pre-PCR) for 2 minutes, 62 ° C / 65 ° C (pre-PCR) for 30 minutes, 95 ° C (pre-PCR) for 1 minute, 15 seconds 94 ° C. (PCR), 30 ° C. 62 ° C./65° C. (PCR), and 7 minutes 62 ° C./65° C. (post-PCR). After thermocycling is complete, place the sample tubes immediately in a -20 ° C block for 2 minutes. After completion, the sample tube is placed in a 4 ° C block until gel analysis is performed. Run a 20: 1 volume on a 2% agarose gel and stain with ethidium bromide. Qualitative and quantitative gene expression measurements of specific mRNA transcripts are made by examining gel images for the presence of amplicons at the expected molecular weight using a UV transilluminator and an alpha imager.
[0092]
In addition to those described herein, various modifications of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.
[0093]
Example 5
Isolation and analysis of proteins from circulating tumor cells in peripheral blood
The supernatant obtained from about 1 million ferrofluid-selected SKBR3 cells permeabilized with Imuniperm, a phosphate buffered solution containing 0.05% saponin and 0.1% sodium azide, is shown in Example 1. In addition to the analyzed nucleic acid components, it also contains released soluble cytosolic proteins present in the cytoplasm of the cells. Thus, the soluble protein in the supernatant solution and insoluble protein remaining in or on the surface of the cell provides a means to determine the total protein expression profile or cellular proteomic profile and cell morphology.
[0094]
First, a fraction of total cytosolic soluble protein released from the cytoplasm by Imuniperm treatment was treated with NP-40, a surfactant that is a preferred reagent for the release of total cytosolic protein from cells. Determination is based on the total amount of protein released from the preparation. Both treated cell populations are released from membrane debris via centrifugation or magnetic separation prior to measurement of total soluble protein by conventional methods such as spectrophotometric Lowry and Bradford methods.
[0095]
Second, aliquots of the two sample preparations were subjected to electrophoresis on a 4-20% gradient SDS polyacrylamide gel to determine (a) the molecular weight cutoff for Imuniperm-derived cytosolic protein, (b ) Compare protein banding patterns and relative amounts of protein per band in the two preparations.
[0096]
Third, aliquots are further analyzed by 2D electrophoresis and either stained routinely or detectably labeled, based on qualitative and quantitative spot patterns of identifiable and unidentified components. Obtain “fingerprint” information about the size and isoelectric point of the protein in one fraction. The information obtained yields a proteomic expression profile of relative and absolute protein expression patterns in the cytosol and total protein compartments of normal and transformed cell populations.
[0097]
Example 6
Gene-specific origin (GSP) RNA polymerase-based subsets of mRNA libraries that enable diagnostic formats with unique signal-to-noise (S / N) limitations such as rare cell events and rare transcript cDNA array analysis amplification
[0098]
After RNA isolation, several RNA analysis methods can be applied. Traditional RT-PCR or more desirable quantitative versions can be applied, but they are generally considered poor use of individual samples. This is because these samples produce very little starting material. As a result, clinical sensitivity compromises with multigene analysis. Thus, an unamplified mRNA / cDNA library can only be analyzed once per gene without compromising clinical (and maximum technology) sensitivity. Although individual samples are almost impossible, several higher throughput methods have been developed.
[0099]
Here we show that it is highly desirable to be able to measure the expression levels of multiple genes (2 to 1000) simultaneously via a high throughput format, such as in a microarray format, all in a single reaction tube. This is achieved without significantly reducing the amount of work and without loss of sensitivity. An important obstacle to single-tube cDNA microarray analysis for rare cellular events and their rare mRNA samples is their inherent disadvantageous S / N ratio in the starting mRNA sample.
[0100]
In radiolabeled cDNA arrays, these limitations are: (a) one specific known target, (b) background filter (solid support) with S / N ratio, without increasing the noise component, nylon at a time. Maximum amount of labeled non-specific (background noise) target (20 ng = 2 × 10 6) that can be hybridized to the filter array system 11 Target copy number detectable in solution phase (approximately 5 × 10 5) when spiked to a randomly labeled target molecule in the library 5 ) From the lower limit.
[0101]
In immunomagnetically enriched samples, significant background noise mRNA is due to the presence of WBC that is unavoidable during the enrichment process. One solution is to perform a second round of RNA polymerase amplification (RNAPA) that selects only a subset of a given gene, thereby increasing the S / N ratio to 1000 to favor the desired rare mRNA from rare cells. Is to shift up to twice.
[0102]
A model form that reduces this GSP subset RNAPA selection process to reflect the typical WBC mRNA copy number ratio found in clinical samples (approximately 10 ng total RNA in 5000 WBC) / CTC (approximately 0.5 ng total RNA in approximately 50 CTC) In this example. In an equivalent aliquot of this starting sample stock consisting of 50 CTCs, the numbers by real-time quantitative RT-PCR are shown in Table 1, as shown in Table 1, prostate specific antigen (PSA = 2650), prostate specific membrane antigen (PSM = 1750), androgen receptor All detectable mRNAs in the body (AR = 100) and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM = 1163) were determined. The total number of copies of starting WBC mRNA proportional to non-specific background noise is approximately 10 8 10 9 Met. In this particular example, starting total RNA / mRNA was first measured by real-time quantitative RT-PCR and subjected to a single round of amplification with all mRNA species increased approximately equally (Table 1). . Subsequently, a 25 ng aliquot of the first round of amplified aRNA was applied to the second round of GSP subset RNAPA to shift the signal to noise of the 4GSP target as described below (Table 1).
[0103]
In the second round of GSP RNAPA, the key selection step occurs during a single RT reaction, of which gene-specific RT primers simultaneously form first strands only for the given mRNA library subset involved. In this example, the subset of GSP RP primers was for the four mRNAs described above (PSA, PSM, AR, EpCAM). Following GSP-RT selective first strand synthesis, an appropriate DNA polymerase and oligo (dT) primer-carrying 7RNAP promoter is used to synthesize a complementary second strand, thus selective for the double-stranded DNA template T7RNAP. Got a subset.
[0104]
Thus, the desired subset of RNAPA enabling templates are those selected via first and second strand synthesis of GSP. At this point, all remaining RNA is degraded by exposing the second strand reaction mix to a DNase-free RNase cocktail. Alternatively, any remaining single stranded RNA and any exogenous (non-poly U / poly A dependent) single stranded dDNA formed during dT dependent second strand synthesis may be It can also be eliminated by single strand specific nucleases such as nucleases. The double stranded cDNA template subset is then purified by phenol extraction and / or silica binding. A selected set of RNAPA ready templates are RNAP amplified overnight, and only 4 of the S / N shifting features are noted in comparison to other possible templates such as F6 (alpha 1 globin sequence) representing WBC mRNA-derived noise An almost 1000-fold increase in genes is obtained. Table 1 includes the subsequent GSP-second round S / N shifting, defined as the alpha 1 globin sequence found in this system where F6 is highly abundant in WBC and is not detectable in epithelial cells 2 shows real-time quantitative RT-PCR results for these four genes of interest throughout the process. These results clearly show that four of the selected GSP targets increased the mean by 844 times, while the non-targeted F6WBC noise only increased by 5.9 times. Thus, dividing the increased GSP target signal by F6WBC noise resulted in a final signal-to-noise improvement for each GSP target. It is important to recognize that further improvements may be expected by using modifications such as the selection / optimization of the mung bean nuclease and GSP-RT primer sequences described above.
[0105]
[Table 1]
Figure 2005507997
[0106]
Example 7
Proteinase and nucleophile-based recovery of cellular RNA from fixed samples yields high-quality RNA templates for downstream RT-dependent analysis.
[0107]
Surprisingly, for samples exposed to aldehyde and urea based stabilizers or fixatives, Cyto-Chex TM And other formaldehyde and formaldehyde-urea derivative fixatives stabilize almost 100% of full length total RNA, mRNA and other nucleic acids in all cells found in whole blood when compared to matched non-fixed controls . Intact RNA stabilized as a macromolecular complex alters its RNA chemistry, such as phenol extraction, silica binding, and oligo (dT) hybridization, such as current traditional cell lysis and chaotropic salt-based RNA molecules. Unaffected by separation method.
[0108]
These macromolecular complexes (both covalent and non-covalent) are dissociated and reversed through a combination of enzymatic digestion and / or chemical nucleophile incubation. As a result, nucleic acids are released, allowing nearly 100% isolation of fully intact original DNA and RNA libraries. These fixative-derived RNA libraries provide high quality templates for reverse transcriptase (RT) dependent formation of first strand cDNA.
[0109]
These fixed agent recovered RNAs are combined with the aRNA pre-amplification or universal RNA methods described in this application for comprehensive downstream analysis or for general functionalization of whole and mRNA libraries .
[0110]
Figure 9 shows Cyto-Chex like other aldehyde-based fixatives. TM Indicates that behaves. Upon 24 hours of fixative exposure, less than 1% mRNA and an unequal amount of 18S-rRNA can be recovered (approximately 10%). Even when extreme chaotropic salt denaturation chemistry is applied (ie GITC and phenol, silica or (dT) hybridization, BRL Trizol Reagent, Qiagen RNA minisilica binding and Dynal Dynabeads mRNA direct oligo (dT) poly ( A) + kit), recovery is extremely low.
[0111]
Surprisingly, the condition is sufficiently intact by treatment with a nucleophile such as proteinase and Tris base, such as proteinase K, which removes most of the proteins and polypeptides covalently bound to other macromolecules including nucleic acids. Restored sufficient nucleic acid chemistry to allow over 90% recovery of the original total RNA and nRNA. A 25 g aliquot of aRNA (FIG. 12A) derived from the mass normalized aliquot of total RNA found in FIG. 9 was subjected to quantitative RT-PCR comparison experiments for both CK19 and EpCAM. This comparison showed 3.8 and 3.9 times lower copy numbers from fixative-derived RNA versus non-immobilized RNA. This is understood as the current proteinase K treatment to restore at least about 25% of maximum RT template activity for RT-PCR analysis. A 25% recovery of maximal RT-template activity via this fixation-recovery system indicates that different operators can use the same procedure for specific RNA (alpha globin) via quantitative RT-PCR on non-fixed matched samples. Performed and reproducible when analyzing Percoll-derived white blood cells.
[0112]
Furthermore, Transfix used here TM The formulation is known to achieve a 0.1% final concentration of paraformaldehyde fixative per unit volume of blood.
[0113]
Cyto-Cex TM Since the loss and recovery behavior of exposed RNA is identical to Transfix ™ and other aldehydes shown below, Cyto-Cex TM And Stadilcyte TM The formaldehyde donor component of the formaldehyde urea derivative component found in this formulation seems to be responsible for covalent binding of nucleic acids to proteins.
[0114]
Formaldehyde-urea derivatives in the presence of numerous macromolecular nucleophiles found in biological systems (ie proteins and nucleic acids) lead to an increased dissociation rate of these derivatives. Dissociation occurs in close proximity to a biological protein nucleophile complex, possibly a regulatory protein specifically associated with RNA that leads to covalent bonding. These binding and dissociation are then removed and reversed by subsequent proteinase and stronger nucleophile treatment. Transfix, a known crosslinking agent TM The fact that yields a full-length high integrity mRNA library from ligated cells that are stabilized for 24 hours, all aldehyde stabilizers will yield similar high quality nucleic acids. Thus, a reproducible yield of nucleic acid is obtained after storage and recovery.
[0115]
Analysis of 90-100% of total RNA and their corresponding mRNA libraries is possible with these and most other aldehyde and / or urea derivative fixatives, as shown in FIGS. 10A, 10B and 10C below. is there. In addition, most of these types of immobilized nucleic acids can be recovered via a combination of proteinase and nucleophile cocktail heated at a high temperature such as 60 ° C. as shown in FIG.
[0116]
These results indicate that heating of immobilized RNA in buffer alone for 1 hour at high temperature results in part of the mRNA library. This high temperature recovery effect has already been shown in formalin-fixed paraffin-embedded tissue RNA searches, but this result has not been reported anywhere in whole blood. Furthermore, the quality and quantity of the mRNA library recovered in this application has not been obtained in these reports using a formalin-fixed paraffin-embedded tissue RNA search.
[0117]
Comparing the mRNA library with those recovered using other nucleophiles (Tris, acetate hydrazide and hydroxyamine), the percentage of mRNA transcript size distribution for each nucleophile is determined by RNA degradation for all samples. Despite showing different. This suggests that different types of mRNA sequences can be searched by specific nucleophiles and incubation conditions (ie, different types of formaldehyde modifications are reversed). Moreover, the various enzymes used show different collection ratios (FIG. 11, gel bottom).
[0118]
The fact that proteinase K digestion alone restores 25% of maximal RT-template activity, combined with the observation that different fixative retrograde agents yield different proportions of the mRNA library, is a combination of nucleophile and enzyme. We strongly support that significantly improved recovery by use is possible.
[0119]
In particular, to demonstrate the potential application of mRNA diagnostics for cancer using a relatively non-invasive peripheral blood model, FIG. 12A shows a 24-hour Cyto-Chex at room temperature. TM Shows the relative quality and quantity obtained from mRNA from a single T7 RNAT preamplification of total RNA / mRNA isolated in triplicate 10 and 20 SKBR3 cell spikes into 7.5 ml peripheral blood after stabilization with . Each of these runs was then immunomagnetically enriched and then the cell lysate was treated with proteinase retrograde conditions followed by silica-bound total RNA isolation. Normalized equivalents of aRNA were used in quantitative RT-PCR reactions for the specific genes CK19 and EpCAM. The results are shown in FIGS. 12B and 12C. As can be seen from FIGS. 12B and 12C, all spikes measured by CK19 were strongly positive for donor-matched triplicates (no spike control). Similarly, EpCAM has the same 100% positive score for all spikes despite the ectopic (endogenous) and extremely low levels of expression observed in this donor's triplicate spikeless control. Have In fact, this low level of EpCAM mRNA detection by RT-PCR is usually observed with this sequence and is not due to false positive PCR contamination.
[0120]
Figures 12D and 12E show Cyyo-Chex, three different aldehyde-based fixatives. TM , Stabilcyte TM And Transfix TM The quality of the changing mRNA RT-template obtained from is shown. As shown, Trnsfix TM Produces an mRNA template, which can be either Cyto-Cex ™ or Stabilcyte TM It will be of much lower RT quality than either. Furthermore, when these data were normalized to the number of spiked cells and compared to the unmodified cells at time = 0 in SKBR3 cells in exactly the same flask, fixed-vs-unfixed CK19 and The difference between EpCAM mRNA is only 4 times (19 derived RNA data not shown). This is taken to mean that the 24 hour stabilization process here combined with proteinase K recovery alone and aRNA amplification resulted in 25% of the possible template quality for RT. Furthermore, the reason for less than 100% RT quality seems to be due to aldehyde modification that proteinase K alone cannot be removed. Thus, the combination of proteinase and nucleophile cocktail will significantly improve the RT-quality of these templates by more than 25%, as demonstrated in these experiments. Compared to related literature under similar conditions, studies evaluating the same parameters of RT RNA template quality derived from formalin-fixed paraformaldehyde-embedded tissues showed that RT-template quality of 13-60 for non-fixed tissues. It shows a fold decrease (GODFREE et al., Quantitative mRNA Expression Analysis from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues Using 5 'Nuclease Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, J. of Molecular Diagnostics, 2: 84-91 (2000)). As a result, a 4-fold reduction provides a significant improvement over the prior art.
[0121]
Figures 12A, 12B, 12C, 12D, and 12E confirm a powerful approach for reproducible products for storage and comprehensive analysis of blood RNA samples of circulating epithelial cells, most likely cancer cells . High level of mRNA conservation is present in that cell within at least 50 mRNA molecules / cell (ie only 50 copies / sample) Presence of a single cell spiked into 7.5 ml blood for any mRNA It can be applied to quantitative analysis that can detect.
[0122]
In summary, the rate and type of covalent fixation in whole blood varies according to the type of fixative. Similarly, the rate and type of reversal or recovery of a covalent fixative will vary according to the type or combination of proteinase and nucleophile used. The rate of fixation will be a critical issue for applications where the half-life of the mRNA of interest is faster than the rate of fixation. Both forward fixation and reverse recovery reactions (processes) can be optimized to yield higher quality and quantity of RNA. However, it is demonstrated here that the current quality and quantity of stabilized and recovered RNA is superior to any previously examined in blood.
[0123]
Example 8
Enrichment and analysis of mRNA from CTC in fresh non-fixed blood
Human blood was isolated from 9 patients with advanced hormone refractory prostate cancer (HRPC) and 13 healthy volunteers and evaluated for gene expression mRNA specific for circulating epithelial cells.
[0124]
patient
Nine patients with advanced hormonal refractory prostate cancer (HRPC), and 13 healthy volunteers, 7 men (age range 24 to 73 years, average 45 years), and 6 women ( Blood was aspirated into 10 ml EDTA VACUTAINER ™ test tubes (Becton-Dickinson, NJ), age ranged from 27 to 61 years, average 39 years. Of the 9 HRPC patients, 2 patients have blood samples over 5 periods, 1 patient has 4 samples, 3 patients have 2 samples, 3 The patient had one sample and was at multiple time points. Patients ranged in age from 60 to 81 years (average 74 years) and their initial diagnosis was 2 to 10 years prior to the experiment. Serial samples from 3 patients undergoing treatment with taxol / estramustine and / or lupron were prepared and analyzed as a series over a period of time. Patients and healthy volunteers signed and notified consent under an approved research experiment.
[0125]
Target cell isolation
Blood samples were maintained at room temperature and processed within 2-3 hours of collection unless otherwise indicated. 15 ml of blood was divided into 7.5 ml aliquots, transferred to a disposable test tube (Fisher Scientific) with an inner diameter of 17 mm, and centrifuged at 800 g for 10 minutes. Phosphate buffered saline (PDS) containing bovine serum albumin (BSA) was added to a volume of 10 ml and mixed by inverting the sample. Mab VU-1D9, which recognizes epithelial cell adhesion molecule (EpCAN), is widely reactive with tissues of epithelial cell origin and couples to magnetic nanoparticles (ferrofluid, Immunicon, Huntingdon Valley, PA).
[0126]
Application Nos. 09 / 351,515, both incorporated herein by reference to increase the magnetic loading of EpCAM-positive cells and reduce the variability of capture efficiency due to differences in EpCAM density at the cell surface. 09 / 702,188 Desthiobiotin is coupled to EpCAM-labeled magnetic nanoparticles to form CA-EpCAM. A buffer containing CA-EpCAM ferrofluid and streptavidin is then added to the sample to achieve increased magnetic labeling of the cells. Subsequently, desthiobiotin on the CA-EpCAM ferrofluid is replaced with biotin, which is included in the permeabilization buffer described below. Thereby, the cross-linking between the CA-EpCAM ferrofluid particles is reversed. Samples were immediately placed in a quadrupole magnetic separator (QMS17, Immunocon) for 10 minutes. After 10 minutes, the test tube was removed from the separator, inverted 5 times, and returned to the magnetic separator for an additional 10 minutes. This process was repeated once more and the test tube was returned to the separator for 20 minutes. After separation, the supernatant was aspirated and discarded. The test tube was removed from the magnetic separator and resuspended in 3 ml phosphate buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin (BSA) and fractions were collected from the vessel wall.
[0127]
Two 7.5 ml aliquots from each sample were processed separately. One aliquot was prepared and analyzed by flow cytometry (Example 12), and RNA from the other aliquot was analyzed as described.
[0128]
Nucleotide purification and amplification
One method utilizing the present invention in a preferred embodiment is to first purify the nucleotide sample. Here, total RNA or mRNA is isolated from the enriched cell population. Isolation can be accomplished by any means known in the art that can maintain the mRNA intact and prevent degradation. For example, enriched circulating tumor cells from duplicate blood samples are dissolved in 100 μl TRIZOL reagent (BRL) or 100 μl RNA extraction buffer (ZYMO Research) and stirred-homogenized samples until RNA is used—80 Stored at 0C. Total RNA was isolated using the homogenate according to the manufacturer's instructions. Briefly, total RNA was treated with DNase I. It was confirmed that DNase activity did not result in genomic DNA detectable with ethidium bromide gel after DNase treatment. DNase treated RNA was washed with repeated TRIZOL isolation procedures. One-tenth of the total RNA obtained was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel according to total RNA mass and size standards, then Northern blotted, and equimolar ribosome 18S and 28S oligo mixtures Hybridized. The resulting hybrid blot was labeled with 32P, phosphor imaged (Packard Cyclone) and analyzed to determine RNA integrity and mass. The remaining total RNA mass value (90%) from each sample was then named 7.5 ml blood donor equivalent of total RNA for that sample, 1.5% of which was calculated to be mRNA.
[0129]
Example 9
Flow cytometric analysis in patients after immunomagnetic selection
Flow cytometric analysis of leukocytes taken from human blood was evaluated for gene expression in circulating epithelial cells. The isolated cells were then prepared as described and the monoclonal antibody (Mab) -fluorochrome conjugate was added to it under saturated conditions. Resuspended in 200 μl permeabilization buffer containing biotin (Immunicon Corporation). The monoclonal antibody is a phycoerythrin (PE) conjugated anti-cytokeratin monoclonal antibody (Mab C11) that recognizes cytokeratins 4, 6, 8, 10, 13 and 18 (Immunicon), and peridinin chlorophyll protein (PerCP). ) -Labeled anti-CD45 (Hle-1, BDIS, San Jose, CA). After incubating the cells with the Mab for 15 minutes, 2 ml of cell buffer (PBS, 1% BSA, 50 mM EDTA) was added and the cell suspension was magnetically separated for 10 minutes. After discarding the unseparated suspension, the collected cells were resuspended in 0.5 ml PBS to which the nucleic acid dye used in Procount System ™ was added (Procount, BDIS). In addition, 10,000 fluorescent counting beads were added to the suspension to confirm the volume of the analyzed sample. (Flow-Set Fluorospheres, Coulter, Miami FL).
[0130]
Samples were analyzed on a FACS Calidur flow cytometer equipped with a 488 nm argon ion laser (DDIS). Data threshold is obtained using CellQuest fluorescence threshold. TM (BDIS). After analyzing 8000 beads or 80% of the sample, the acquisition was stopped. Multi-parameter data analysis was performed with list mode data (Paint-A-Gate TM , BDIS). Analytical criteria included size defined by forward light scatter, particle size defined by right angle light scatter. Combined with staining with PerCP-labeled anti-CD45 Mab, positive staining with nucleic acid staining and PE-labeled pan-anti-cytokeratin Mab C11 (CA4, 5, 6, 8, 10, 13, and 18) was performed using differential CTC / Used in WBC fluorescent staining and analysis. CTCs were identified by the presence of nucleic acid dyes and cytokeratin antibodies coupled with the absence of CD45 staining. For each sample, the number of events present in the area typical of epithelial cells was multiplied by 1.25 to account for the sample volume not analyzed by flow cytometry.
[0131]
In samples of healthy non-cancer donors, leukocytes carried away from immunomagnetic selection ranged from 655 to 5,565 (median 4,350, average 1,759). In samples of HRPC patients, leukocytes carried away ranged from 813 to 92,000 (median 4,350, average 1,350). Blood samples from a healthy non-cancer control group (7 men and 6 women) do not show CTC, while blood samples from HRPC show a CTC range of 4 to 283 in 7.5 ml of blood. It was.
[0132]
Example 10
Quantification of mRNA transcripts from amplified libraries
First, normalization of mRNA / aRNA mass was determined by quantifying the total RNA mass isolated from a 7.5 ml blood sample volume, each immunomagnetically enriched. This was accomplished by Northern blotting 10% of the total RNA in each sample, followed by hybridization with 28S plus 18S radiolabeled oligoprobe and in parallel with known total RNA mass cell line standards. . This was followed by phosphoimage quantification. (Cyclone, Packard Instruments). The total RNA mass obtained is 1 donor sample equivalent of mRNA = 1 donor sample equivalent of aRNA;
[(Total RNA mass) × (1.5% mRNA)] / 3 * = 1 donor sample equivalent of aRNA. * The average molecular weight of the RNA library was found to be 3 times lower than the molecular weight of unamplified mRNA.
[0133]
The relative gene expression levels of 0, 1, 2, 3 and 4 are agarose gel velocity curves of unknown based amplified products containing known copy number CN19 in vivo transcribed RNA construct (CK19-cRNA) standards. It was assigned to the intensity of the band. This CK19-CRNA standard contained 800 bases most 3 ′ of the CK19 wild type mRNA sequence. Standard CK19-cRNA curves covering 1000-fold dynamic range are 20,000; 2,000; 200; 100; 50; 25; each spiked with 2 ng total RNA isolated from Percoll-derived WDC Performed in triplicate at 12.5 copies. A standard speed line performed for 40 cycles showed the intensity of a linear signal response blotting band versus RNA copy number between 13 and 2000 copies of CK19-CRNA transcript [see FIGS. 13A and 13B]. The external standard curve had a 27% maximum CV for any standard analyzed in triplicate. For multivariate gene analysis, a comparison was made to the CK19 external standard curve and assigned a relative gene expression level of 0-4:
0-Non-detectable
1- 25 to 50 copies of CK19
2- CK19 with almost 250-500 copies
3-almost 2,500 to 5,000 copies of CK19, and
CK19 with more than 4-25,000 copies.
[0134]
FIG. 13B shows a typical banding intensity corresponding to an approximate copy number of CK19 cRNA on the standard curve, which was used to assign relative gene expression levels of 1-4.
[0135]
CTC counts and gene transcript expression profiles were determined using 23 different PCR amplification products from Ep-CAM immunomagnetically enriched blood samples of 13 healthy donors and 9 HRPC patients. Microarrays have not been effective in analyzing these types of samples due to signal-to-noise incompatibility derived from WBC carried nonspecifically during the immunomagnetic enrichment process. The ratio of CTC specific signal to WBC carryover noise in these samples ranges from 1 to 1000 CTC per 103 to 104 WBC. The limitations of these microarrays were to incorporate a 10,000-fold permeabilization step using 90% of the total mRNA library from each immunomagnetically enriched blood sample, followed by multigene RT instead of the array. -Overcame by performing PCR analysis. This innovation provides sufficient starting material for several hundred individual PCR reactions to be performed on each 7.5 ml blood sample. Thus, it is possible to perform CTC multivariate RT-PCR profile analysis of individual patients without compromising assay sensitivity or clinical sensitivity for each mRNA member of each CTC mRNA library.
[0136]
After the volume normalization procedure described above, the remaining 90% total RNA from each sample was reverse transcribed (RT) using the SMART PCR cDNA synthesis kit rather than using the 67 base oligo (dT) primer described above. . The reaction was incubated at 42 ° C. for 90 minutes. Using the Advantage cDNA PCR kit (Clontech), transfer all 10 μl RT to 50 μl PCR reaction, PE-9600 and thermal cycling program; 95 ° C. for 1 minute, 95 ° C. for 15 seconds for 1 cycle, 65 ° C. for 1 second, PCR with P1-SMART primer and P2-T7 18 base primer was performed using 68 minutes at 68 ° C followed by 20 minutes at 72 ° C:
(5'-TCTAGTCGACGGCCAGTGAATT-3 ').
The entire PCR reaction volume was added to a Sephadex G-50 Quick Spin (TE) column (Roche Diagnostics) and the eluate was obtained according to the manufacturer's instructions.
[0137]
The eluate was concentrated in vacuo with a Vacufuge (Eppendorf) at 60 ° C. for approximately 30 minutes to 3 μl. The RNA polymerase transcript amplification reaction that yielded a representative library of aRNA was assembled using the AmpliScribe kit (Epicenter Technologies) in 20 μl volume according to the manufacturer's instructions and incubated at 37 ° C. for 6-12 hours. . The Trizol isolation procedure was repeated and the RNA transcription reaction was washed.
[0138]
1/10 of RNA size standard, RNA mass standard, transcription reaction product from each sample was denatured with formamide at 65 ° C for 15 minutes, loaded on 2% agarose gel, run at 5 volts / CN for 15 minutes, and Alphamager TM SYBR Gold according to gel image densitometry using (Alpha Innotech Corp.) TM (Moecular Probes) was post-stained for 1 hour. The mass of each transcript library was measured.
[0139]
Gene specific primers were designed as described. All primer sets were designed to amplify specific gene target cDNA within 500 base pairs at the most 3 ′ side of each specific gene target (average 344 bp, length ranging from 226 to 513 bp). In order to avoid amplification of genomic DNA, all RNA samples were treated with Dnase as described. Table 1 shows the primer pairs for each amplicon analyzed by relative RT-PCR. The forward primer P1 is shown as the upper sequence in each primer pair. The reverse primer is the lower sequence. All sequences are represented from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
[0140]
[Table 2]
Figure 2005507997
[Table 3]
Figure 2005507997
[0141]
Reverse transcription (RT) is performed according to the manufacturer's instructions, random 9-mer 50 mg, 1 μl Superscipt TM (BRL) was used with a 25 nanogram T7 preamplified aRNA library. RT was incubated at 25 ° C. for 10 minutes, 37 ° C. for 10 minutes, 42 ° C. for 20 minutes, and 50 ° C. for 60 minutes. Ten donor equivalents (50-1300 pg) per sample of aRNA were used in each subsequent 50 μl PCR reaction containing 1 unit of platinum taq (BRL). Thermal cycling program using PE-9600 thermocycler: 95 ° C for 1 minute and 31, 35 and 40 cycles of 95 ° C for 1 second, 65 ° C for 1 second, 72 ° C for 1 minute; followed by 20 at 72 ° C Individual PCR curves were generated from each single PCR reaction tube by aliquoting 15 μl at 31, 35 and 40 cycles between minutes; Each amplicon in each PCR batch included a cell line cDNA amplification positive control, a master mixed PCR reagent negative control containing all components except the cDNA sample. BRL low mass molecular weight and AlphaEase TM In parallel with spot densitometry analysis with software version 5.04, all RT-PCR results were analyzed on 2% agarose gels containing ethidium bromide.
[0142]
The genetic overview goal was to identify mRNA expression profiles in CTCs with the highest clinical sensitivity and sensitivity to detect epithelial cells. In addition, gene expression levels found in WBC were evaluated from the enrichment of healthy donors. The selection of gene candidates was based on known literature data showing a wide range of epithelial specific expression levels. Identification of candidates that were negative in WBC was categorized for three basic histological levels, epithelial origin (Figure 14a), tumor / organ origin (Figure 14b), and tumor treatment target characterization (Figure 14c). / Characterization CTC profiling will be possible.
[0143]
RT-PCR profiling was performed on all samples according to the amplicon set in FIGS. 14A, 14B and 14C. FIG. 14A shows that the epithelial marker CK19 is 100% specific in the system of the invention for HRPC samples, where 0/13 healthy donors are CK19 positive compared to 18/23 (78%) Met. The HRPC patient sample had a CK19 negative score, and TROP2 is 100% specific. However, their poor sensitivity of 1/13 (4%) 2/23 (9%) can not give enough profile values to justify their use, respectively. Among genes that are not 100% specific (EpCAM), Muc-1 and MIC-1), a WC background threshold can be applied between levels 1 and 2 beyond which more than 1 patients The derived signal can be considered a true positive. When profiling for a combination of cell epithelial sensitivity, CK19, EpCAM, and Muc-1 sensitivity in this set of genes, all blood samples were 23/23 (100%) patient samples were epithelial-positive scores Uses WBC-specific gene (F16 = alpha globin gene) as an overall system positive control for RNA processing and amplification, as it causes WBC carryover due to low non-specific binding from the ferrofluid enrichment process did. All 36 samples scored above level 4 (see FIG. 14A).
[0144]
Example 11
Evaluation of reproducibility at lower limiting sensitivity of preamplification
In order to evaluate the reproducible lower limiting sensitivity performance of the modified T17 transcript preprocessing amplification procedure, a model system was constructed incorporating all operations performed on clinical RNA samples. Total RNA from the breast and prostate cancer cell lines SKBR3 and LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, Va.) Was isolated using Trizol reagent (Life Technologies Inc.) according to the manufacturer's instructions. Prior to making serial dilutions for first strand synthesis corresponding to 2, 0.2, 0.02 SKBR-3 cell equivalents, each dilution was spiked into 2 mg total RNA from Percoll-derived WBC. The determination of the RT-PCR external CK19 standard curve was performed in parallel with the SKBR-3 dilution curve, resulting in approximately 1,000 wild-type CK19 mRNA copies present per SKBR-3 cell equivalent. The CK19 characterization SKBR-3 dilution curve was used as one of two types of specific transcripts to model the lower limiting sensitivity and reproducibility of the entire process of this T7-based mRNA library amplification system. The second transcript is an exogenous lambda DNA-based construct (Walker Biotech Publication), resulting in a 1.2 kb poly A (30) transcript. Curves for WBC spiked with SKBR-3 cells were assayed in triplicate at each of 2000, 200 and 20 CK19 mRNA copy levels. Lambda curves were spiked in triplicate into 2 ng total RNA from Percoll-derived WBC at 500, 50 and 5 copy levels. In the final analysis, reproducible RT-PCR amplification was achieved from levels greater than 50 copies (N = 12), where individual samples were run through total T7-transcript pre-amplification, A measurable signal was obtained. Furthermore, starting with only 50 mRNA transcripts of any one sequence, this lower limit of detection is that all six sequence types (PSA, PSM, AR, HPN, CK19 and EpCAM) are aRNA and quantitative (RT-PCR Reproduced in a subsequent cell line spike model that serially dilutes to known copy levels prior to analysis (Example 6).
[0145]
Following RT-PCR, molecular weight and spot densitometry gel analysis was performed on an Alphamager for aliquots from 31, 35 and 40 cycle dynamic curves. 19.25% CV was calculated from 11 of 12 spike levels (92%). Although only one of the 200 copy samples (8%) had 14 times lower identity than expected, this sample was still quantitatively detectable and was assigned as level 1.
[0146]
In separate experiments, the effect of the T7 pre-amplification method of the present invention on relative mRNA abundance was modeled by comparison with an identifiably prepared non-amplified library. Starting with a 15 cell equivalent prostate cancer cell line LNCap + 15 cell equivalent breast cancer cell line SKBR-3 spiked with 1000 cell equivalents of WBC total RNA (2 ng), N = 8 genes (PCA, PSM, MGB1, MGB2, No significant differences in band intensity ratios for PIP, CK8, CK19, and EpCAM) were detected, followed by T7 pre-amplification method and subsequent multigene RT-PCR dynamic curve analysis as shown in FIG. 13C. went. A cDNA template negative amplification control performed in parallel in each batch showed no detectable signal during these experiments.
[0147]
The total RNA library was proportionally amplified using one round of the modified T7 method of the present invention, resulting in an aRNA library with an average increase of over 10,000 times the original mRNA mass. This is based on an original mRNA level assessment of 1.5% of the measured total RNA mass. The transcript amplification process resulted in a 600 base medium transcript length library, which ranged between 550 and 800 bases, with individual transcript sizes in each library ranging from 300 to 3000. A range of bases. Individual aRNA libraries were random starting points for RT, and then a multigene panel of individual PCR reactions was performed using 10 donor equivalents of aRNA / cDNA.
[0148]
The amount of total RNA from WBC carried away in healthy non-cancer samples ranged from 0.8 to 11.12 ng (average 3.5 ng). The amount of total RNA from HRPC patient samples ranged from 0.8 to 35.12 ng (average 7.2 ng). All total RNA samples subsequently yielded a mass of aRNA library that was directly proportional to the starting total RNA value.
[0149]
A 10% Northern blot of total RNA in each sample was hybridized with 28S + 18S radiolabeled oligoprobe in parallel with total RNA from a known mass cell line standard, followed by phosphoimage for quantity and quality measurements. Went. The quality is assessed by the ratio of the amount of 28S over 18S, where the SKBR-3 cell line standard averages 1.55 for enriched samples (range 1.50 to 1.64) ), 13 healthy donors averaged 1.36 (range 1.66 to 1.60) and HRPC averaged 1.10 (range 0.57 to 1.80) ).
[0150]
In addition, we observed that 80% of ferrofluid-enriched CTC / WBC samples from HRPC patients have a total RNA mass that is 6-fold lower than expected (1.5 to 15-fold) Range). These predictions were based on WBC mean total RNA mass = 2 pg per cell and mean epithelial cell total RNA mass = 20 pg per cell. This will be particularly useful for assessing an individual's diagnosis and treatment status during treatment.
[0151]
Example 12
Identification of CTC tumor-derived tissue using tissue-specific genes and characterization of patient-specific treatment profiles
36 samples were further profiled with N = 8 amplicons to determine the optimal specificity and sensitivity expression profile for identification of the source organ of circulating epithelial tumor cells. For prostate specific identification we evaluated PSA, PSM, HK2, HPN, PSGR, DD3, MGB1 and MGB2 (see FIG. 14B). None of these amplicons showed any signal from the WBC group, except for three distant women with a single Hepsin (Hpn). As shown in FIG. 14B, PSA is most sensitive in this prostate group with a positive score of 20/23 (89%) samples, followed by PSM 17/23 (74%), HPM 13/23 (57%). , HK2 7/23 (30%), PSGR 2/23 (9%), and DD3 1/23 (4%). Unexpectedly, the “breast specific” genes, mama globins 1 and 2, both had strong signal level positive MBG1 1/23 (4%) and MBG2 2/23 (9%) in the prostate rather than a healthy donor population It was a score. The combination of the two maximum sensitivity markers PSA and PSM results in a sensitivity of 20/23 (87%). When HPN is added, the sensitivity increases to 21/23 (91%). Hepsin and PSM are two markers, which are central in therapeutic strategies. This is because they are both tissue specific and transmembrane specific cell targeted delivery strategies.
[0152]
Individual patient characterizations of potential treatment profiles based on CTC RNA profiling were performed and the results are shown in FIG. 14C. Here, the individual specificity scores in this set of samples showed that AR, NKX3A, EGFR and ER were all 100%. MDR1, MRP, and Topo2a all suffered a significant background signal from the WBC group. The sensitivity of AR to detect HRPC CTC is 16/23 (70%), followed by NKX3A 4/23 (17%), Topo2a 5/23 (22%), MDR1 5/23 (22%) , EGFR 4/23 (17%), and ER 1/23 (4%). Unexpectedly, MDR and MRP did not appear to be useful for stratifying these two groups.
[0153]
Samples over a period of time were drawn on a 18 to 26 week course from three patients. One patient was treated with lupron alone and two patients were treated with lupron in combination with taxane / estramustine. Sequential samples showed changes in the expression of therapeutic sensitivity / resistance related genes, while the other samples were unchanged. As shown in FIGS. 15A, 15B, and 15C, these changes were independent of CTC and leukocyte count. In patients treated with lupron alone, with samples over 4 time periods aspirated at 0, 5, 10, and 18 weeks, MDR1 was not detectable (FIG. 15A) and AR remained relatively constant. However, Hespin fluctuated. FIGS. 15B and 15C further showed a consistent reduction in MDR1 mRNA levels for healthy donors during TX / ES treatment. AR expression levels that play a central role in the development of HRPC were completely eliminated during TX / ES treatment, as shown in FIG. 15B. In contrast, FIG. 15C showed AR that was relatively unaffected during similar treatments. During TX / ES treatment of both patients in FIGS. 15B and 15C, dramatic changes were detected in Hepsin mRNA from high expression levels for untreated versus complete exclusion.
[0154]
Example 13
Profiling disease states with plasma-derived (non-CTC) RNA from the same sample providing CTC-supplementation data
So far, methods have been described for analyzing mRNA derived from CTCs enriched from blood samples. An important step in this method is the T7 pre-amplification step, which allows analysis of several copies of the transcript in up to 1000 different individual gene specific RT-PCR reactions. The T7 pre-amplification of a representative mRNA library effectively removes the main restriction of restricted sample mRNA mass. This same pre-amplification can be applied to non-CTC RNA. In fact, there are multiple sources of RNA in a given blood sample, and some of these non-CTC RNA transcripts will provide valuable information.
[0155]
Confirmation of CTC presence and determination of tumor-derived tissue, and comprehensive characterization of disease mechanisms can be achieved using RNA derived from plasma blood fractions obtained during the ferrofluid enrichment process. Preferably this is coupled to the T7 pre-amplification process described in the previous experiment for enriched CTCs. The ferrofluid enrichment process first separates the plasma fraction of each sample. Typically, this fraction was discarded if the CTC was enriched.
[0156]
However, plasma- and serum-derived mRNA and DNA have recently been shown in the literature to provide valuable cancer expression (phenotype) and genotype (DNA analysis) data. Plasma-derived mRNA and DNA are isolated by traditional molecular biology methods for downstream analysis. Since mRNA is readily available from plasma and has proven to provide valuable RT-PCR data, these same RNA transcripts use the modified T7 amplification procedure described herein. And more comprehensive profiling. Thus, CTC-independent and / or CTC-complementary mRNA expression profiles can be obtained with the same profiling procedure for CTC by using RNA from the plasma-derived fraction of each sample.
[0157]
Furthermore, the T7-based expression profiling approach can be applied to the enrichment process described above, and allowing the analysis of CTC-depleted fractions is useful for distinguishing WBC expression profile contributions. Is made non-specifically during enrichment and the contribution forms a CTC-specific profile. This can be achieved by comparing different patterns and subsequent subtraction, providing an additional mechanism for correctly identifying the CTC during analysis. In addition, the CTC-depletion profile will itself provide valuable patient-specific information about the response and sensitivity to a particular therapy.
[0158]
Those skilled in the art to which the present invention pertains will not be limited to the description and discussion of the preferred embodiments disclosed herein, but the spirit and scope of the present invention as defined only by the following claims. It will be appreciated that many modifications and variations of the approach can be achieved without departing from the invention.
[Brief description of the drawings]
[0159]
FIG. 1 shows a flow chart showing various possibilities and options enabled by the invention described in this application in a multi-parameter analysis on a single sample. Phenotype and genotype analysis is obtained on fixed or non-fixed cells.
FIG. 2 shows 2 after SYBR Gold staining of approximately 1600 SKBR3 breast cancer cells treated with various times Immunoperm-treatment before total RNA was isolated from supernatant obtained via Trizo1 + pellet paint coprecipitation. The reverse image (negative) of denatured total RNA analyzed by% agarose gel electrophoresis is shown.
FIG. 3 shows total cells, Immunoperm (saponin) permeabilized cells from cell pellet fractions, and Immunoperm. R -Shows a 1% denatured total RNA agarose gel stained with ethidium bromide containing cells from the supernatant fraction of permeabilized SKBR3 breast cancer cells.
FIG. 4 shows polynucleotide kinase treatment. 32 FIG. 4 shows a northern blot phosphor image of the gel shown in FIG. 3 hybridized with a P-labeled oligo (dT) (25-mer) probe. The radioactive signal is derived from whole cells, and two Immunoperms from the gel shown in FIG. R -Corresponds to all poly (A) + mRNA transcripts of total RNA from the treated cell fraction.
FIG. 5 shows a Northern blot from FIG. 4 stripped via conventional dissociation and removal of labeled oligo (dT) probes and reprobed with a nucleus-specific precursor rRNA probe.
FIG. 6 shows a Northern blot from FIG. 5 that has been stripped and reprobed with a mitochondrial-specific 12S rRNA probe.
FIG. 7 shows the corresponding mRNA in the gel image in FIG. 3 with first strand oligo (dT) (alpha- 32 A comparison of cDNA array dot blot hybridization patterns with P-nucleotide labeling is shown. The labeled first strand DNA was then used for hybridization. Pattern comparison shows that the same relative abundance of mRNA is present in all RNA cell fractions.
FIG. 8 shows quantitative and qualitative relative cytosolic total RNA gel images obtained after separate treatment of multiple aliquots each containing about 770 PC-3 cells with Immunoperm.
FIG. 9 shows CytoChex. TM Shows 90-100% storage, recovery and RNA integrity analysis of total RNA libraries using and other aldehyde-based fixatives followed by enzymatic digestion. In this experiment, Cyto-Cex TM , Stebilcyte TM And Transfix TM To 7.5 ml of freshly aspirated peripheral blood (EDTA Vacutainer tubes) in both control lanes (phosphate buffered saline, PBS) without and with 3 different fixatives Mass was normalized for some of the cells of the first spiked 300,000 SKBR3 cell line. After mixing, they were incubated at room temperature (20-25 ° C.). Thereafter, SKBR3 cells were enriched from blood using VU-1D9 (EpCAM) -ferrofluid immunomagnetic selection. Enriched cells from each treatment were divided into 3 equal aliquots, treated with proteinase K (lanes marked “post”) and treated without proteinase K digestion (“pre” for immediate RNA isolation). In the lanes shown and in the lanes marked “No”, which means only the cells for the post, no proteinase K component is added and all other operations are equal to the post). The resulting normalized RNA isolation was separated with 1% denatured agarose, detected with SYBR Gold, imaged with alpha imager densitometry, then Northern blotted, and finally oligo (dT) probe Thus, the relative quality and quantity of each recovered total RNA and mRNA library is shown.
Figures 10A and 10B show Cyto-Cex over 1, 2, and 4 hours. TM , Stabilcyte TM , TransFIX TM Shows the relative rates of paraformaldehyde, formaldehyde, glutaraldehyde and glyoxal fixation. In this experiment, Cyto-Cex TM , Stabilcyte TM , Transfix TM Paraformaldehyde, formaldehyde, glutaraldehyde, glyoxal over time relative rates were evaluated at 1, 2 and 4 hours. A 7.5 ml blood sample was prepared from a single donor by the same method described in FIG. The only difference was that they were selected and processed for RNA isolation at the end points of 1, 2 and 4 hours. The resulting normalized RNA isolation was separated with 1% denatured agarose, stained with SYBR Gold, imaged with alpha imager densitometry, then Northern blotted and recovered with the final oligo (dT) probe. The relative quality and quantity of each total RNA and mRNA library is shown.
FIG. 10C shows Cyto-Cex over 15, 30 and 45 minutes. TM The relative fixation rate of paraformaldehyde is shown. In this experiment, the relative rate over time of immobilized Cyto-Chex versus paraformaldehyde was evaluated at 15, 30, and 45 minutes. A 7.5 ml blood sample was prepared from a single donor by the same method described in FIG. The only difference is that they were selected at the final point of 15, 30, 45 minutes. Phosphoimaging quantification of oligo (dT) probed blot showing relative mRNA library quality and quantity is: formaldehyde = paraformaldehyde (˜4 fold)> Transfix TM (~ 2 times)> Stadilcyte TM (~ 1.5 times)> Cyto-Cex TM (~ 1x) = indicates the relative rate of glutaraldehyde, glyoxal is too slow to rank. The resulting normalized RNA isolation is separated with 1% denatured agarose, stained with SYBR Gold, imaged with alpha imager densitometry, then Northern blotted and finally oligo (dT) probed and recovered. The relative quality and quantity of each total RNA and mRNA library performed is shown.
FIG. 11 shows Cyto-Cex TM Figure 7 shows the effect on nucleophile and enzyme variation on the quality and quantity of RNA recovery from storage. This indicates that the quality is similar when used in a combined procedure with improved sequence analysis. The resulting normalized RNA isolation was separated with 1% denatured agarose, stained with SYBR Gold, imaged with alpha imager densitometry, Northern blotted, and finally dT probed to collect each total RNA. And the relative quality and quantity of the mRNA library.
FIG. 12A shows Cyto-Cex with proteinase recovery and aRNA pre-amplification. TM Figure 8 shows the potential diagnostic application indicated by the detection of specific mRNA from 10SKBR3 cells / 7.5ml blood in stabilized blood. The potential for diagnostic application is demonstrated here by the sensitive and reproducible detection of specific mRNA from triplicate 10 or 20SKBR3 cells spiked into 7.5 ml peripheral blood. Spiked blood was immediately stabilized with Cyto-Chex to stabilize cellular RNA. After incubation in an incubator at room temperature (20-25 ° C.) for 1 day, the stabilized cells were selectively enriched using VU-1D9 (EpCAM) -ferrosphere immunomagnetic selection. Following enrichment, proteinase K digestion was performed to release RNA so that silica-bound RNA isolation followed by aRNA pre-amplification and gene-specific quantitative RT-PCR could be performed for CK19 and EpCAM.
Figures 12B and 12C show SKBR cell spike ferrofluid selection and CytoChex. TM Shown are CK19 and EpCAM Q-PCR from treatment followed by proteinase retrograde. This experiment showed the results of quantitative RT-PCR analysis, which was normalized to the original total RNA mass before graphing. Thus, the values shown are equivalent to the original mRNA population included in the original RNA isolation prior to aRNA amplification.
Figures 12D and 12E show the respective Q-TCRs in CD19 and EpCAM for RNA derived from SKDR treated with cell stability reagents. These experiments were performed using Cyto-Chex in Figure 9. TM , Stabilcyte TM And Transfix TM RNA derived from three different fixatives shown in. These proteinase K recovered RNA samples were subjected to RT-PCR identical mRNA template analysis for aRNA preamplification and gene specific quantitative CK19 and EpCAM as shown in FIGS. 12B and 12C, respectively. These shown data are normalized to both total RNA masses, which is equal to the aRNA mass yield in this experiment. Thus, a comparison of the amount and quality of relative RNA from this fixative is a measure of both aRNA (FIG. 12A) and the subsequent quantitative RT-PCR shown here. Both of these comparisons are a measure of the quality of each fixative independent RNA template after recovering RNA using only the proteinase K method.
FIG. 13A shows CK19-CRNA standard RT-PCR amplification efficiency comprising the most 3 ′ 800 base sequence of the CK19-cRNA transcript. Two-fold serial dilutions of the CK19-cRNA standard containing 200, 100, 50, 25, 12, 5 copies, then triplicate blood cells were spiked into 2ng of CK19 negative total RNA obtained with a maximum coefficient of variation of 27%. . Standard deviation bars are shown. Dilution of cRNA for less than 1 copy and no template control produced no detectable signal.
FIG. 13B shows relative RT-PCR gene expression levels after agarose gel electrophoresis. Total RNA from white blood cells was spiked with CK19 RNA at levels of 25, 250, 2500 and 25000 copies in Panel 1, Panel 2, Panel 3 and Panel 4, respectively.
FIG. 13C compares relative representations in the same mRNA library of unamplified and T7 promoter-based amplified mRNA transcripts. Relative abundance was assessed by examining 8 different mRNA transcripts (PSA, PSM, MGB1, MGB2, CK8, CK19, PIP, EpCAM) using the RT-PCR dynamic curve method.
FIG. 14A shows a variation plot bar graph of an overview of circulating epithelial cell genes. For cells expressing the EpCAM antigen on their cell surface, human blood was enriched immunomagnetically and the sample was first aRNA preamplified and then 25 ng reverse transcribed. An aliquot was then analyzed by agarose gel electrophoresis after RT-PCR for a selected group of genes. Thirteen healthy donors (7 males, 6 females) were named N columns for each gene measured, and 9 serially sampled HPRC patients containing circulating tumor cells (CTC) were flow-sited Measured by measurement and named as P column for each measured gene. The horizontal line in each column indicates the threshold beyond which true positives are counted.
FIG. 14B shows an overview of genes that indicate the origin status of prostate tumors through the same method described in FIG. 14A.
14c shows an overview showing the presence of a therapeutic target state through the same method described in FIG. 14A.
Figures 15A, 15B and 15C show monitoring over time of individual HRPC patients for CTC and RT-PCR multigene analysis before, during and after chemotherapy of the new system. The X-axis shows the sampling time expressed in weeks. The left axis indicates a CTC with a filled circle symbol. Right Y-axis is relative mRNA expression with corresponding symbols in unfilled squares for androgen receptor, unfilled circles for Hepsin (HPN) and unfilled triangles for multi-drug resistance (MDR1) Indicates. As shown in FIG. 15B, relative mRNA levels are shown during the course of treatment with lupron alone, and two patients were treated with taxotere and estramustine chemistry with vertical arrow symbols on the X-axis in FIGS. 15B and 15C. Treated with Lupron combined with administration of a dose of therapy (Tx-Ex). The top bar indicates that hormonal resection was being performed for a long time.

Claims (76)

ａ．癌を有すると疑われるテスト対象の血液から、上皮を起源とする癌細胞を包含すると疑われる混合細胞集団を含む試料を得；
ｂ．該試料を、他の試料成分を実質的に除外するまで、該癌細胞に特異的に結合する免疫磁性粒子と混ぜ合わせ；
ｃ．磁性粒子−結合の癌細胞内で豊富化された、分離された細胞画分を生成するために、試料−免疫磁性粒子混合物を高勾配磁場に付し；次いで
ｄ．該癌細胞の存在、癌を示す該試料内の該癌細胞の存在の該豊富化された画分をアッセイする
ことを含むことを特徴とする、テスト対象における病気の重症度を診断する方法a. Obtaining a sample comprising a mixed cell population suspected of containing cancer cells of epithelial origin from blood of a test subject suspected of having cancer;
b. Combining the sample with immunomagnetic particles that specifically bind to the cancer cells until the other sample components are substantially excluded;
c. Subjecting the sample-immunomagnetic particle mixture to a high gradient magnetic field to produce an isolated cell fraction enriched in magnetic particle-bound cancer cells; then d. A method of diagnosing the severity of a disease in a test subject comprising assaying the presence of the cancer cells, the enriched fraction of the presence of the cancer cells in the sample indicative of cancer 該テスト対象における循環癌細胞の存在を評価する請求項１記載の方法。The method of claim 1, wherein the presence of circulating cancer cells in the test subject is evaluated. 該テスト対象の癌根絶手順への応答が、循環する癌細胞の該存在によって評価される請求項１記載の方法。The method of claim 1, wherein the response to the test subject's cancer eradication procedure is assessed by the presence of circulating cancer cells. 該テスト対象が、前立腺癌、乳癌、大腸癌 APUD系細胞種（apudoma）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌、例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアス（Brown-Pearce）癌、腺管癌、エールリヒ腫瘍、上皮内癌、クレブス２、メルケル細胞癌、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、スキルス癌、細気管支癌、気管支原性肺癌、扁平上皮細胞癌および移行細胞細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、繊維腫、繊維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、間葉腫、中腎種、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、歯牙腫、奇形腫、絨毛腫、腺癌、腺腫、胆管腫、胆脂種、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚腫、肝臓癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、脳室上衣腫、節神経腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経症上皮腫、神経繊維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、アンチオ角化腫（antiokeratoma）、硬化性血管腫、血管腫症、グロームス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、繊維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（カポジ肉腫および肥満細胞肉腫）、新生物（例えば、骨、消化器系、肝臓、膵臓、脳下垂体、睾丸、眼窩、頭頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤、呼吸管および泌尿生殖器）、神経繊維腫症および子宮頚部形成異常よりなる群から選択される癌であると診断される請求項１記載の方法。The test subject is prostate cancer, breast cancer, colon cancer, APUD cell type (apudoma), sebaceous tumor, atheroma, malignant carcinoid syndrome, carcinoid heart disease, cancer such as walker cancer, basal cell carcinoma, basal squamous cell carcinoma , Brown-Pearce cancer, ductal carcinoma, Ehrlich tumor, carcinoma in situ, Krebs 2, Merkel cell carcinoma, mucinous carcinoma, non-small cell lung cancer, oat cell carcinoma, papillary carcinoma, skill cancer, fine cell carcinoma Bronchial cancer, bronchogenic lung cancer, squamous cell carcinoma and transitional cell reticuloendotheliosis, melanoma, chondroblastoma, chondroma, chondrosarcoma, fibroma, fibrosarcoma, giant cell tumor, histiocytoma, lipoma , Liposarcoma, mesothelioma, myxoma, myxosarcoma, osteoma, osteosarcoma, Ewing sarcoma, synovial, adenofibroma, adenolymphoma, carcinosarcoma, chordoma, mesenchymal, mesorenal tumor, myoma , Ameloblastoma, cementoma, odontoma, teratoma, villi , Adenocarcinoma, adenoma, cholangiomas, cholangioma, columnar tumor, cystadenocarcinoma, cystadenoma, granulosa cell tumor, ovarian male embryo, liver cancer, sweat adenoma, islet cell tumor, Leydig cell tumor, papilloma , Sertoli cell tumor, follicular cell tumor, leiomyoma, leiomyosarcoma, myoblastoma, myoma, myoma, rhabdomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, ependymoma, nodal neuroma, glioma, marrow Blastoma, meningioma, schwannoma, neuroblastoma, neurotic epithelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, non-chromophilic paraganglioma, antiokeratoma , Sclerosing hemangioma, hemangiomatosis, glomus hemangioma, hemangioendothelioma, hemangioma, perivascular cell tumor, hemangiosarcoma, lymphangioma, lymphangiomyoma, lymphangiosarcoma, pineal tumor, carcinosarcoma, cartilage Sarcoma, phyllosarcoma, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leiomyosarcoma, leukosarcoma, liposarcoma, lymphangiosarcoma, myoma, mucous meat Tumor, ovarian cancer, rhabdomyosarcoma, sarcoma (Kaposi sarcoma and mast cell sarcoma), neoplasm (eg, bone, digestive system, liver, pancreas, pituitary gland, testicle, orbit, head and neck, central nervous system, The method according to claim 1, wherein the cancer is selected from the group consisting of hearing, pelvis, respiratory tract and genitourinary), neurofibromatosis and cervical dysplasia. 該癌細胞の存在につき、
ａ．該癌細胞から細胞質生体分子を放出し；
ｂ．該細胞質生体分子を単離し；次いで
ｃ．該細胞質生体分子を分析する
ことからなる該豊富化画分を該分析する請求項１記載の方法。For the presence of the cancer cell,
a. Release cytoplasmic biomolecules from the cancer cells;
b. Isolating said cytoplasmic biomolecule; then c. The method of claim 1 wherein said enriched fraction comprising analyzing said cytoplasmic biomolecule is analyzed. 該流体試料を得ることが細胞分画による請求項１記載の方法。The method according to claim 1, wherein the fluid sample is obtained by cell fractionation. 該放出が浸透化剤の添加により達成される請求項５記載の方法。6. A method according to claim 5, wherein the release is achieved by the addition of a penetrant. 該浸透化剤が洗剤、界面活性剤、およびその組合せよりなる群から選択される請求項７記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the penetrant is selected from the group consisting of detergents, surfactants, and combinations thereof. 該浸透化剤がサポニン、Immunipermおよびその組合せよりなる群から選択される請求項７記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the permeabilizing agent is selected from the group consisting of saponin, Imuniperm and combinations thereof. 該浸透化剤がImmunipermである請求項４記載の方法。The method of claim 4, wherein the penetrant is Imuniperm. 該流体試料を得ることが試料を細胞安定化剤で処理することを含む請求項１記載の方法。The method of claim 1, wherein obtaining the fluid sample comprises treating the sample with a cell stabilizer. 該安定化剤がアルデヒド、尿素、およびその組合せよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。The method of claim 11, wherein the stabilizer is selected from the group consisting of aldehydes, urea, and combinations thereof. 該アルデヒドがホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびその組合せよりなる群から選択される請求項１２記載の方法。13. The method of claim 12, wherein the aldehyde is selected from the group consisting of formaldehyde, paraformaldehyde, and combinations thereof. 該安定化剤がジアルデヒドである請求項１１記載の方法。The method of claim 11, wherein the stabilizer is a dialdehyde. 該ジアルデヒドがグルタルアルデヒド、グリオキサール、およびその組合せよりなる群から選択される請求項１４記載の方法。15. The method of claim 14, wherein the dialdehyde is selected from the group consisting of glutaraldehyde, glyoxal, and combinations thereof. 該安定化剤がCyto-chexTM、StabilocyteTM、およびTransfixTMよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。12. The method of claim 11, wherein the stabilizer is selected from the group consisting of Cyto-chex ™ , Stabilocyte ™ , and Transfix ™ . 該細胞質生体分子の放出が該安定化剤への曝露によって形成されるマクロ分子複合体を包含する請求項１１記載の方法。12. The method of claim 11, wherein the release of the cytoplasmic biomolecule comprises a macromolecular complex formed by exposure to the stabilizer. 該細胞からの該細胞質生体分子の該放出が酵素消化と共に起こる請求項１７記載の方法。18. The method of claim 17, wherein the release of the cytoplasmic biomolecule from the cell occurs with enzymatic digestion. 該酵素消化がプロテイナーゼ、求核試薬、およびその組合せからなる群を介して起こる請求項１８記載の方法。19. The method of claim 18, wherein said enzymatic digestion occurs through the group consisting of proteinases, nucleophiles, and combinations thereof. 該プロテイナーゼがプロテイナーゼＫ消化、Ｖ８プロテイナーゼ消化、プロナーゼ消化、およびその組合せよりなる群から選択される請求項１９記載の方法。20. The method of claim 19, wherein the proteinase is selected from the group consisting of proteinase K digestion, V8 proteinase digestion, pronase digestion, and combinations thereof. 該求核試薬が、リン酸系緩衝液、トリス系緩衝液、酢酸ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびその組合せよりなる群から選択される請求項１９記載の方法。20. The method of claim 19, wherein the nucleophile is selected from the group consisting of phosphate buffer, Tris buffer, acetic hydrazide, hydroxylamine, and combinations thereof. 該細胞質生体分子が蛋白質である請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the cytoplasmic biomolecule is a protein. 該蛋白質の該単離が化学的抽出、電気泳動法、クロマトグラフィー、免疫分離、およびアフィニティー技術よりなる群から選択される請求項２２記載の方法。23. The method of claim 22, wherein the isolation of the protein is selected from the group consisting of chemical extraction, electrophoresis, chromatography, immunoseparation, and affinity techniques. 該細胞質生体分子が核酸である請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the cytoplasmic biomolecule is a nucleic acid. 該核酸が、細胞質ＲＮＡ、核およびミトコンドリアのＲＮＡ、核およびミトコンドリアのＤＮＡ、およびその組合せよりなる群から選択される請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the nucleic acid is selected from the group consisting of cytoplasmic RNA, nuclear and mitochondrial RNA, nuclear and mitochondrial DNA, and combinations thereof. 該核酸が細胞質ｍＲＮＡである請求項２４記載の方法。The method according to claim 24, wherein the nucleic acid is cytoplasmic mRNA. 該核酸の該単離が、ＲＮＡまたはＤＮＡ化学的抽出、電気泳動法、クロマトグラフィー、免疫分離、およびアフィニティー技術よりなる群から選択される請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the isolation of the nucleic acid is selected from the group consisting of RNA or DNA chemical extraction, electrophoresis, chromatography, immunoseparation, and affinity techniques. 該核酸の該単離がオリゴ（ｄＴ）に加えられた磁性ビーズでの捕獲による請求項２４記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the isolation of the nucleic acid is by capture with magnetic beads added to oligo (dT). 該標的細胞を、該流体試料を得た後に、該細胞質生体分子による以外の表現型の発現につき評価する請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the target cells are evaluated for expression of a phenotype other than by the cytoplasmic biomolecule after obtaining the fluid sample. 該表現型発現が、形態学的な検査、細胞成分染色、免疫分析、およびその組合せよりなる群から選択される請求項２９記載の方法。30. The method of claim 29, wherein the phenotypic expression is selected from the group consisting of morphological examination, cell component staining, immunoassay, and combinations thereof. 該分析が、マルチパラメーターフローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、レーザー走査サイトメトリー、明視野ベースの画像解析（bright field base image anaysis）、毛細管容積測定（capillary volumetry）、スペクトル画像解析、マニュアル細胞分析および自動化細胞分析よりなる群から選択されるプロセスによることを特徴とする請求項１記載の方法。The analysis includes multi-parameter flow cytometry, immunofluorescence microscopy, laser scanning cytometry, bright field base image anaysis, capillary volumetry, spectral image analysis, manual cell analysis and 2. The method of claim 1, wherein said method is by a process selected from the group consisting of automated cell analysis. 該細胞質生体分子の該分析が機能的プロテオミックスによる請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the analysis of the cytoplasmic biomolecule is by functional proteomics. 該機能的プロテオミックスが、蛋白質発現プロフィール、ウェスタンブロット、アミノ酸配列分析、電気泳動法、２−Ｄ電気泳動法、質量分析、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー核磁気共鳴、赤外、原子吸光、およびその組合せよりなる群から選択される請求項３２記載の方法。The functional proteomics is a protein expression profile, Western blot, amino acid sequence analysis, electrophoresis, 2-D electrophoresis, mass spectrometry, gas chromatography, liquid chromatography nuclear magnetic resonance, infrared, atomic absorption, and 35. The method of claim 32, selected from the group consisting of the combination. 該細胞質生体分子の該分析が機能的ゲノミックスによる請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the analysis of the cytoplasmic biomolecule is by functional genomics. 該機能的ゲノミックスがｍＲＮＡプロフィール分析、蛋白質発現プロフィール分析、ポリメラーゼ鎖反応、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列分析、マイクロアレイ上の遺伝子発現、電気泳動法、２−Ｄ電気泳動法、質量分光測定、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー核磁気共鳴、赤外、および原子吸光よりなる群から選択される請求項３４記載の方法。The functional genomics is mRNA profile analysis, protein expression profile analysis, polymerase chain reaction, Northern blot, Western blot, nucleotide or amino acid sequence analysis, gene expression on microarray, electrophoresis, 2-D electrophoresis, mass spectrometry 35. The method of claim 34, selected from the group consisting of: gas chromatography, liquid chromatography nuclear magnetic resonance, infrared, and atomic absorption. 少なくとも２つの遺伝子マーカーの存在についての該細胞質ＲＮＡの該分析が多重遺伝子ＲＴ−ＰＣＲによる請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the analysis of the cytoplasmic RNA for the presence of at least two genetic markers is by multigene RT-PCR. 該遺伝子マーカーが該癌細胞の起源組織を同定する請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the genetic marker identifies the tissue of origin of the cancer cell. 該遺伝子マーカーが既知の癌を診断する請求項５記載の方法。The method according to claim 5, wherein the cancer is diagnosed with a known genetic marker. 該遺伝子マーカーが乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、腎臓癌、および膀胱癌よりなる群から選択される癌を規定する請求項５記載の方法。6. The method of claim 5, wherein the genetic marker defines a cancer selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, lung cancer, colon cancer, ovarian cancer, kidney cancer, and bladder cancer. 該遺伝子マーカーが、ＭＧＢ１、ＭＧＢ２、ＰＩＰ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ｈＫ２、ＡＲ、ＤＤ３、Ｈｅｒ−／Ｎｅｕ、ＢＣＬ２、ＥＧＦＲ、ＴＳ、ＤＰＹＤ、ＩＧＦ２、ＥＲ、ＰＲ、ｃｙｐ１９、ＴＥＲＴ、一般的上皮組織特異的遺伝子、ＣＫ１９、ＣＫ８、ＣＫ２０、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、トポイソメラーゼ、ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＭＭＰ、一般的白血細胞特異的ｍＲＮＡ、アルファ−１−グロビン、ＣＤ１６、ＣＤ４５、およびＣＤ３１よりなる群から選択される癌を規定する請求項５記載の方法。The gene marker is MGB1, MGB2, PIP, CEA, PSA, PSMA, hK2, AR, DD3, Her- / Neu, BCL2, EGFR, TS, DPYD, IGF2, ER, PR, cyp19, TERT, general epithelial tissue Cancer selected from the group consisting of specific genes, CK19, CK8, CK20, EpCAM, MUC1, topoisomerase, uPA, uPAR, MMP, general white blood cell specific mRNA, alpha-1-globin, CD16, CD45, and CD31 6. The method of claim 5, wherein: 該遺伝子マーカーについての該細胞質ＲＮＡの該分析が、
ａ．その全てが５’末端で普遍的プライマー伸長を有する遺伝子特異的プライマーの少なくとも１組で該遺伝子マーカーを逆転写し、
ｂ．該遺伝子特異的プライマーを除去し、
ｃ．遺伝子特異的アンプリコンをＰＣＲ増幅において該普遍的プライマー伸長で増幅し、次いで、
ｄ．該遺伝子特異的アンプリコンを同定する；
ことを含むことを特徴とする請求項５記載の方法。The analysis of the cytoplasmic RNA for the genetic marker comprises:
a. Reverse transcription of the genetic marker with at least one set of gene specific primers, all of which have a universal primer extension at the 5 ′ end,
b. Removing the gene specific primer;
c. Gene-specific amplicons are amplified with the universal primer extension in PCR amplification, then
d. Identifying the gene-specific amplicon;
6. The method of claim 5, comprising: 該遺伝子特異的プライマーの該除去が、分子サイズ排除、固体支持体選択性付着、一本鎖特異的ＤＮａｓｅよりなる群を用い、ウラシル-Ｎ-グリコシラーゼを、デオキシウリジンで合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーで取り込んで達成される請求項４１記載の方法。A DNA oligonucleotide primer obtained by synthesizing uracil-N-glycosylase with deoxyuridine using the group consisting of molecular size exclusion, solid support selective attachment, single-strand specific DNase for the removal of the gene-specific primer 42. The method of claim 41, wherein the method is accomplished by capture. 該遺伝子特異的プライマーの該除去が、デオキシウリジンで合成されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーのウラシル-Ｎ-グリコシラーゼ処理で達成される請求項４１記載の方法。42. The method of claim 41, wherein the removal of the gene specific primer is accomplished by uracil-N-glycosylase treatment of a DNA oligonucleotide primer synthesized with deoxyuridine. 該ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ処理後にＤＮａｓｅ−フリーＲＮａｓｅの取込みを行う請求項４３記載の方法。44. The method according to claim 43, wherein DNase-free RNase is incorporated after the uracil-N-glycosylase treatment. 該遺伝子特異的プライマーが、高プライマー−標的アニーリング特異性の条件下で用いられる請求項４１記載の方法。42. The method of claim 41, wherein the gene specific primer is used under conditions of high primer-target annealing specificity. 該高プライマー−標的アニーリング特異性が、天然組換え細胞修復メカニズムからの蛋白質で達成される請求項４５記載の方法。46. The method of claim 45, wherein the high primer-target annealing specificity is achieved with a protein from a natural recombinant cell repair mechanism. 該高プライマー−標的アニーリング特異性がｒｅｃＡで達成される請求項４６記載の方法。47. The method of claim 46, wherein the high primer-target annealing specificity is achieved with recA. 該遺伝子特異的アンプリコンの該同定が、サイズベースの分析系におけるそのユニークなＲｆ値による請求項４１記載の方法。42. The method of claim 41, wherein the identification of the gene-specific amplicon is by its unique Rf value in a size-based analytical system. 該サイズベースの分析系がＰＡＧＥ、アガロースゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、ＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、およびｃＤＮＡアレイよりなる群から選択される請求項４９記載の方法。50. The method of claim 49, wherein the size-based analysis system is selected from the group consisting of PAGE, agarose gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis, SELDI, MALDI, and cDNA array. 該分析が、
ａ．直線状の増幅によって抽出された該核酸をプレ増幅し、ここに、該プレ増幅の結果、ａＲＮＡの形態の全てのライブラリー転写体が少なくとも１０００倍増加し；
ｂ．１０００までの独立して選択された注目する遺伝子についてのみ該ａＲＮＡから第二ストランドを合成し；次いで
ｃ．アレイ分析、電気泳動、およびその組合せよりなる群を用いて増幅された生成物を認識する；
こと含む請求項５記載の方法。The analysis
a. Pre-amplifying the nucleic acid extracted by linear amplification, wherein the pre-amplification results in an increase of all library transcripts in the form of aRNA by at least 1000-fold;
b. Synthesizing a second strand from the aRNA only for up to 1000 independently selected genes of interest; then c. Recognizing the amplified product using the group consisting of array analysis, electrophoresis, and combinations thereof;
6. The method of claim 5, further comprising: 該プレ増幅が、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターよりなる群による請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein said pre-amplification is by the group consisting of SP6 RNA polymerase promoter, T3 RNA polymerase promoter, and T7 RNA polymerase promoter. 該プレ増幅がランダムプライマーを使用してＲＮＡポリメラーゼを用いることによる請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein said pre-amplification is by using RNA polymerase using random primers. 該第二ストランドの該合成が高プライマー−標的アニーリング特異性の条件下で行われる請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein the synthesis of the second strand is performed under conditions of high primer-target annealing specificity. 該高プライマー−標的アニーリング特異性が、天然組換え細胞修復メカニズムからの蛋白質によって達成される請求項５３記載の方法。54. The method of claim 53, wherein the high primer-target annealing specificity is achieved by a protein from a natural recombinant cell repair mechanism. 該高プライマー−標的アニーリング特異性がｒｅｃＡで達成される請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein said high primer-target annealing specificity is achieved with recA. 該認識がＤＮａｓｅ−フリーＲＮａｓｅでの前処理による請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein the recognition is by pretreatment with DNase-free RNase. 該前処理が、フェノール抽出、シリカ結合、およびその組合せよりなる群から選択される請求項５６記載の方法。57. The method of claim 56, wherein the pretreatment is selected from the group consisting of phenol extraction, silica linkage, and combinations thereof. 該認識が全ての二本鎖生成物の増幅による請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein the recognition is by amplification of all double stranded products. 該認識が、アレイ分析、電気泳動、およびその組合せよりなる群から選択される請求項５０記載の方法。51. The method of claim 50, wherein the recognition is selected from the group consisting of array analysis, electrophoresis, and combinations thereof. ａ．該粒子が癌細胞に特異的に結合する免疫磁性粒子；
ｂ．細胞浸透化剤；
ｃ．細胞安定化剤；
ｄ．核酸放出剤；
ｅ．核酸増幅剤；
ｆ．二本鎖生成物につき選択する精製剤；
ｇ．二本鎖生成物の確認を可能にするヌクレオチド特異的検出剤；および
ｈ．請求項１記載の方法を用いるためのプロトコル
を含む循環癌細胞の存在につき患者試料をスクリーニングするためのテストキット。a. Immunomagnetic particles that specifically bind to cancer cells;
b. A cell permeabilizing agent;
c. Cell stabilizers;
d. A nucleic acid releasing agent;
e. A nucleic acid amplification agent;
f. A purification agent selected for the double-stranded product;
g. A nucleotide-specific detection agent that allows confirmation of double-stranded product; and h. A test kit for screening patient samples for the presence of circulating cancer cells comprising a protocol for using the method of claim 1. さらに該癌細胞に対して結合特異性を有する免疫磁性粒子を含む請求項６０記載のキット。61. The kit according to claim 60, further comprising immunomagnetic particles having binding specificity for the cancer cells. 該細胞浸透化剤がサポニン、洗剤、界面活性剤、およびその組合せよりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the cell permeabilizing agent is selected from the group consisting of saponins, detergents, surfactants, and combinations thereof. 該浸透化剤がImmunipermである請求項６０記載のキット。61. A kit according to claim 60, wherein the permeabilizing agent is Imuniperm. 該安定化剤がアルデヒド、ジアルデヒド、尿素、およびその組合せよりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the stabilizer is selected from the group consisting of aldehydes, dialdehydes, urea, and combinations thereof. 該安定化剤がCyto-chexTM、StabilocyteTM、およびTransfixTMよりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the stabilizer is selected from the group consisting of Cyto-chex ™ , Stabilocyte ™ , and Transfix ™ . 該放出剤がプロテイナーゼ、求核試薬、およびその組合せよりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the release agent is selected from the group consisting of proteinases, nucleophiles, and combinations thereof. 該プロテイナーゼがプロテイナーゼＫ、Ｖ８プロテイナーゼ、プロナーゼ、およびその組合せよりなる群から選択される請求項６６記載のキット。68. The kit of claim 66, wherein the proteinase is selected from the group consisting of proteinase K, V8 proteinase, pronase, and combinations thereof. 該求核試薬が、リン酸系緩衝剤、トリス系緩衝剤、酢酸ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびその組合せよりなる群から選択される請求項６６記載のキット。68. The kit of claim 66, wherein the nucleophile is selected from the group consisting of a phosphate buffer, a Tris buffer, acetic hydrazide, hydroxylamine, and combinations thereof. 該精製剤が該核酸に対して結合特異性を有する免疫磁性粒子である請求項６０記載のキット。61. The kit according to claim 60, wherein the purification agent is an immunomagnetic particle having binding specificity for the nucleic acid. 該精製剤が、ＲＮＡまたはＤＮＡ化学的抽出剤、電気泳動剤、クロマトグラフィー剤、免疫分離剤およびヌクレオチド親和性剤よりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit according to claim 60, wherein the purification agent is selected from the group consisting of RNA or DNA chemical extractants, electrophoresis agents, chromatography agents, immunoseparation agents, and nucleotide affinity agents. 該増幅剤が、ＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ／プロモーター、Ｔ３ ＲＮＡ ポリメラーゼ／プロモーター、およびＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ／プロモーターよりなる群から選択され、該増幅剤が核酸含量を１０００倍増加させる請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the amplifying agent is selected from the group consisting of SP6 RNA polymerase / promoter, T3 RNA polymerase / promoter, and T7 RNA polymerase / promoter, and the amplifying agent increases nucleic acid content by a factor of 1000. 該増幅剤がＲＮＡポリメラーゼ／ランダムプライマーであり、該増幅剤が核酸含量を１０００倍増加させる請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the amplification agent is an RNA polymerase / random primer and the amplification agent increases the nucleic acid content by 1000 times. 該増幅剤が、高プライマー−標的アニーリング特異性を有するポリメラーゼ／プライマーである請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the amplification agent is a polymerase / primer with high primer-target annealing specificity. 該精製剤がＤＮａｓｅ−フリー ＲＮａｓｅである請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the purification agent is DNase-free RNase. 該精製剤がフェノール抽出剤およびシリカ結合剤よりなる群からのものである請求項６０記載のキット。61. The kit of claim 60, wherein the purification agent is from the group consisting of a phenol extractant and a silica binder. 該ヌクレオチド特異的検出剤が、二本−鎖ヌクレオチド増幅剤、アレイ検出剤、および電気泳動剤よりなる群から選択される請求項６０記載のキット。61. The kit according to claim 60, wherein the nucleotide-specific detection agent is selected from the group consisting of a double-stranded nucleotide amplification agent, an array detection agent, and an electrophoresis agent.
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