JP2005506971A - Mrp1に基づいたがんの改善治療の手段及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、イリノテカン又はその誘導体の、本発明によるポリヌクレオチドを含む変異アレルのある遺伝子型を有する患者において、がん、特に結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製への使用に関する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルに比べて、変異アレルの発現を改変させるか、又は対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて、変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる。最後に、本発明は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんに罹患している被検者に適正な療法を選択する方法に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、イリノテカン(CPT−11)又はその誘導体のようなカンプトテシン薬物の、本発明によるポリヌクレオチドを含む変異アレルのある遺伝子型を有する患者において、がん、特に結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製への使用に関する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルに比べて、変異アレルの発現を改変させるか、又は対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて、変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる。最後に、本発明は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんに罹患している被検者に適正な療法を選択する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
イリノテカンは、細胞傷害性アルカロイド、カンプトテシン(CPT)の半合成類似体であり、これは、東洋の樹木である Camptotheca acuminate より得られる。カンプトテシンは、可逆性の一本鎖断裂を引き起こすことによりDNA中の捩れたひずみを解放するトポイソメラーゼI酵素を特異的に阻害することによって抗新生物活性を示す[D'Arpa, et al., 1989, Biochim Biophys Acta 989: 163-77, Horwitz et al., 1973, Cancer Res 33: 2834-6]。イリノテカンとその活性代謝物、SN−38は、トポイソメラーゼI−DNA複合体へ結合し、これら一本鎖断裂の再連結を妨げる[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンは、カンプトテシン部分とジピペリジノ側鎖の間にあるカルバメート結合のカルボキシルエステラーゼ仲介性の切断によりイリノテカンから生じる、親油性代謝物、SN−38(7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン)の水溶性プロドラッグとして役立つ[Tsuji, et al., 1991, J Pharmacobidyn 14: 341-9]。カルボキシエステラーゼ−2は、薬理学的濃度でこの加水分解に関与する主要酵素である[Humerickhouse, et al., 2000, Cancer Res 60: 1182-92]。トポイソメラーゼ阻害とイリノテカンに関連した一本鎖断裂は、主にSN−38により引き起こされる[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンの投与は、齧歯動物由来のがんを担うマウスと様々な組織型のヒトがん異種移植片において抗腫瘍効果をもたらした[Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Giovanella, et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7]。
【0003】
イリノテカンはまた、CYP3A4及びCYP3A5により酸化される[Haaz et al., 1998, Drug Metab Dispos 26: 769-74, Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Rivory, et al., 1996, Cancer Res 56: 3689-94]。SN−38の主要な消失経路はグルクロン酸との抱合であり、対応するグルクロニド(SN−38G)を生じる[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69]。SN−38Gは、腸の微生物叢により脱抱合され、SN−38を生じると報告されている[Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20]。SN−38のグルクロン酸抱合(glucuronidation)は、MRP1及びUGT1A7により仲介される[Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun 260: 199-202]。物質収支試験は、全体投薬量の64%が糞中***され、胆汁***の重要な役割を確認した[Slatter, et al., 2000, Drug Matab Dispos 28: 423-33]。種々の試験は、多剤耐性タンパク質1(MRP1)がイリノテカンとその代謝物の主要な輸送体であり[Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14]、その胆汁***を促進し、そこで副作用を引き起こすが、イリノテカンの***にはP−糖タンパク質も参画する[Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al., 1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]ことを示唆している。
【0004】
カンプトテシンへの細胞抵抗性と、即ち、イリノテカンの治療応答性は、細胞内カルボキシルエステラーゼ活性とトポイソメラーゼIの切断活性に関連付けられてきた[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70]。
【0005】
こうしたカンプトテシン薬物、例えばイリノテカンの使用は、明らかに用量依存性の骨髄抑制と、嘔吐、吐気、腹部疼痛、及び下痢を含む胃腸毒性により制限されていて、これら副作用は致命的となる場合がある。イリノテカン療法の主要な用量制限毒性は下痢であり、これは88%までの患者に起こり、その程度がSN−38グルクロン酸抱合により決定されるSN−38の胆汁***[Gupta, et al., 1994, Cancer Res 54: 3723-5, Gupta, et al., 1997, J Clin Oncol 15: 1502-10]に従属する、腸のSN−38蓄積に依存する[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70, Araki, et al., 1993, Jpn J Cancer Res 84: 697-702]。骨髄抑制は、イリノテカンとSN−38の両方の濃度−時間曲線下面積に関連付けられた[Sasaki, et al., 1995, Jpn J Cancer Res 86: 101-10]。
【0006】
イリノテカンは、1997年に5−フルオロウラシル療法へ抵抗性の転移性結直腸がん患者に対して承認されたものの、その治療利益は依然として疑わしいままである。最近、2000名を超える患者が関わる結直腸がんに関する2つの大規模臨床試験が国立がん研究所(NCI)により中止させられたのは、治療の最初の60日間のうちにイリノテカンの毒性に関連した死亡率がほとんど3倍増加したためである。死因は、下痢及び吐気に関連した脱水症状と好中球減少症に関連した敗血症であった[2001, arznei-telegramm 32: 58]。イリノテカンががんそのものに対して有効であることは証明されたが、短期の毒性のために、すべての患者が長期生存の恩恵を受けられるわけではない。従って、イリノテカン毒性に罹患する可能性が最も高い患者を同定することがきわめて望ましい。
【0007】
現在、患者は、はじめは60〜125mg/m2のイリノテカンの標準用量で、他の抗新生物薬と組み合わせて3〜4週投薬のいくつかのクールで投与されるほとんどの治療スケジュールに従って治療され、後続の用量は、治療に対する個々の患者の忍容性に基づいて、25〜50mg/m2の増量で調整される。イリノテカン関連の毒性からの回復のために1〜2週間治療が遅延してよいが、患者が回復しなければ、治療を中断しなければならない。忍容不能な毒性が発現しなければ、患者が治療利益を体験し続ける限りにおいて、追加クールを伴う治療を際限なく継続する。応答率は、腫瘍の種類により、10%未満〜ほぼ90%まで変動する。しかしながら、治療応答を評価し、代替療法を考慮するには少なくとも6〜8週を要する。従って、患者に適正な投与量を見出すことは、単調で、時間の浪費であり、生命を脅かす有害効果のリスクを招くことになる。治療から恩恵を受けない患者がこうしたリスクを受けることは不必要であろうし、さらに、これらの患者が適切な治療を受けないうちに貴重な時間が浪費される。
【0008】
さらに、多くの化学療法剤で観察されるように、療法に対する細胞の耐性を発現するリスクは、細胞がイリノテカンのような化学療法剤へ次善の曝露を受けているときに増加する。
【0009】
胆汁***の阻害剤(例えば、MRP及びP−糖タンパク質)やUGT1A1の誘発剤を用いた薬物動態モジュレーションがカンプトテシン関連毒性を抑制するためのツールとして示唆された[Gupta, et al., 1996, Cancer Res 56: 1309-14, Gupta, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 39: 440-4]。シクロスポリンA及びフェノバルビタールと組み合わせたイリノテカンの臨床試験の予備データは、カンプトテシン関連の下痢を制限することに関してはいくらかの有望な結果を示すが[Ratain, 2000, Clin Cancer Res 6: 3393-4]、シクロスポリンA及びフェのバルビタールのような薬物との併用治療は、有害事象及び薬物相互作用の追加リスクを招く。
【0010】
SN−38及びSN−38Gのいずれの薬物動態にも、おそらくはイリノテカンの代謝経路における患者間の差異に起因する[Rivory, et al., 1997, Clin Cancer Res 3: 1261-6]、大きな患者間の変動性が存在する[Canal, et al., 1996, J Clin Oncol 14: 2688-95]。さらに、ギルバート症候群を有する患者では重篤なイリノテカン毒性が報告されている[Wasserman, et al., 1997, Ann Oncol 8: 1049-51]。必然的に、UGT1A1活性が低い患者ではイリノテカン毒性のリスクが高まるという、イリノテカンの代謝への遺伝素質が示唆されてきた[Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ando, et al., 1998, Ann Oncol 9: 845-7]。UGT1A1プロモーターにおける共通の多型[Monaghan, et al., 1996, Lancet 347: 578-81]が、SN−38の in vitro グルクロン酸抱合に関連付けられ[Iyer, et al., 1999, Clin Pharmacol Ther 65: 576-82]、症例コントロール試験からその可能な臨床使用が示唆された[Ando, et al., 2000, Cancer Res 60: 6921-6]。しかしながら、イリノテカン関連の毒性がUGT1A1遺伝子型により予測されたのは、冒された患者の少数(<15%)でしかなかった。
【0011】
まとめると、カンプトテシンをベースとする療法の治療効果及び安全性を有意に向上させて治療に起因する致命的なことを回避すること、不必要な耐性の発現を回避すること、そして有害事象や治療遅延に関連した入院コストを低下させることは、きわめて望ましいであろう。しかしながら、イリノテカンの毒性を抑制して治療効果を高めるための受容された機序は、現在1つも利用可能でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
このように、本発明の根底にある技術課題は、がん、好ましくは結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの有効な治療のために改善された手段及び方法を提供することであり、それにより上記の望ましくない副作用を回避することができる。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の根底にある技術課題は、特許請求の範囲に特徴づけられる態様により解決される。
従って、本発明は、
(a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む変異アレルがあるゲノムを有する被検者において、がん、特に、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製へのイリノテカン又はその誘導体の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
本発明により使用される用語「イリノテカン又はその誘導体」は、好ましくは、一般構造式:
【0015】
【化1】
【0016】
を特徴とし、米国特許US05106742、US05340817、US05364858、US05401747、US05468754、US05559235、及びUS05663177にさらに記載される物質を意味する。さらに、用語「イリノテカン又はその誘導体」には、カンプトテシンの類似体及び誘導体も含まれる。利用可能なカンプトテシン類似体の種類及び範囲は当業者に周知であり、数多くのテキスト、例えば、[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Burris, et al., 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-55, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7]に記載されている。活性カンプトテシン類似体の具体例は、六環式カンプトテシン類似体、9−ニトロカンプトテシン、9−若しくは10−置換アミノ、ハロゲン、又はヒドロキシル基を有する20S配置のカンプトテシン類似体、7−置換水溶性カンプトテシン、9−置換カンプトテシン、(RS)−20−デオキシアミノ−7−エチル−10−メトキシカンプトテシンのようなE環修飾カンプトテシン、及び10−置換カンプトテシン類似体である[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury, et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107]。同様の治療活性を有する様々な他のカンプトテシン類似体が記載されている[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Burris and Fields, 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-55, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7]。カンプトテシン類似体を合成するのに適した方法が記載されている[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury, et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107, Sugasawa, et al., 1976, J Med Chem 19: 675-9]。
【0017】
前記物質は、記載されるように、例えば、結直腸がん、非小細胞及び小細胞肺がん、食道がん、腎細胞がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、扁平細胞がん、白血病、及びリンパ腫に治療上有用であることが知られている[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Wiseman, et al., 1996, Drugs 52: 606-23, Gottlieb, et al., 1970, Cancer Chemother Rep 54: 461-70, Negoro, et al., 1991, J Natl Cancer Inst 83: 1164-8, Rowinsky et al., 1994, Cancer Res 54: 427-36]。また、本発明の使用に含まれるのは、化学修飾により得ることができる、上記物質の誘導体であり、ここで前記誘導体は、本発明の使用に治療上同等によく適している。本発明の物質の誘導体が本発明の使用に治療上同等によく適しているかどうかを決定するには、当該技術分野で周知の生物学的アッセイを行うことができる。そうしたアッセイは、例えば、[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Giovanella, et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Burris, et al., 1992, J Natl Cancer Inst 84: 1816-20, Friedman et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: 171-4]に記載されている。
【0018】
上記の出版物に記載される化合物はいずれも本発明に使用可能であると考えられる。
イリノテカンは、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの治療に特によく適していることが示されてきた。従って、最も好ましくは、本発明により使用される物質は、イリノテカンである。
【0019】
本明細書に使用される用語「医薬組成物」は、本発明の物質と、場合により1以上の製剤的に許容される担体を含む。本発明の物質は、製剤的に許容される塩として製剤化してもよい。許容される塩は、酢酸塩、メチルエステル、HCl、硫酸塩、塩化物、等を含む。医薬組成物は、薬物投与に慣用的に使用される経路、例えば、経口、局所、非経口、又は吸入により簡便に投与することができる。該物質は、慣用法に従って薬物を標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製される慣用の剤形で投与してよい。これらの手順は、諸成分を適宜所望の調製物へ混合、造粒及び圧縮、又は溶解することを伴う場合がある。製剤的に許容される担体又は希釈剤の形状及び特性は、それと組み合わされる有効成分の量、投与の経路、並びに他の周知のパラメータにより指定されると理解される。担体は、製剤の他の成分と融和して、そのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容」されなければならない。利用される医薬担体は、例えば、固体でも液体でもよい。固形担体の例は、乳糖、白陶土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、等である。液体担体の例は、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、シロップ、落花生油及びオリーブ油のようなオイル、水、乳濁液、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液、等である。同様に、担体又は希釈剤には、当該技術分野で周知の、単独か又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を含めてよい。本発明による物質は、所望の効果を達成するために様々な手段で投与可能である。前記物質は、単独でか又は医薬調製物として製剤化されて、治療される被検者へ経口、局所、非経口、又は吸入のいずれかで投与可能である。さらに、該物質は、共通の医薬組成物中の又は個別の医薬組成物として他の物質と組み合わせて投与可能である。
【0020】
希釈剤は、上記組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。さらに、医薬組成物若しくは製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は無毒、非治療的、非免疫原性の安定化剤、等を含めてよい。治療有効量は、症状又は状態を改善する、本発明による物質の量を意味する。こうした化合物の治療効力及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な製薬上の方法、例えば、ED50(集団の50%に治療上有効な用量)とLD50(集団の50%に対して致死性の用量)により決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、それは、LD50/ED50の比として表すことができる。
【0021】
投与量方式は、担当医と、他の臨床上の要因により、好ましくは上記の方法のいずれか1つに従って、決定される。医療技術において周知のように、どの患者の投与量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、一般健康状態、及び同時投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。進行は、定期的な評価によりモニターすることができる。
【0022】
典型的な用量は、例えば、5〜100mgの範囲であってよいが、この例示範囲未満か又はそれを超える用量も、特に上記の因子を考慮すれば、想定される。一般に、医薬組成物の定期的な投与としての治療方式は、1μg〜10mg単位/日の範囲であるべきである。治療方式が連続注入であれば、それはまた、それぞれ1μg〜10mg単位/kg体重/分の範囲であるべきである。進行は、定期的な評価によりモニターすることができる。しかしながら、被検者や投与の形式によって、投与物質の量は、体表m2あたり約1mg〜約500mg、通常20〜200mgを提供するために、広い範囲にわたり変動してもよい。
【0023】
本明細書に言及される医薬組成物及び製剤は、本発明の使用により少なくとも1回投与される。しかしながら、前記医薬組成物及び製剤は、1回より多く、例えば週1回、隔週〜非限定的数の週まで投与してよい。
【0024】
本発明による物質の特定の製剤は、製剤技術の分野で周知のやり方で調製され、通常、本明細書の上記に言及される少なくとも1つの活性物質を、混合物中に含むか、又は製剤的に許容される担体若しくは希釈剤と一緒にする他のやり方で含む。そのような製剤を作製するには、通常、活性物質を担体と混合するか又は希釈剤により希釈する、あるいはカプセル、サシェ、カシェ、紙、又は他の好適な容器若しくはビヒクルに封入するか又は被包化する。担体は、固体、半固体、ゲルベース若しくは液体の材料であってよく、有効成分には、ビヒクル、賦形剤、又は媒体として役立つ。前記好適な担体は、上記のものと、当該技術分野に周知の他のものを含む。例えば、「レミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストン、を参照のこと。製剤は、錠剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、懸濁液剤、等の形態を含む投与の様式に利用することができる。
【0025】
投薬上の奨励事項を、間違った薬物を間違った患者へ間違った用量で処方することを回避する情報とともに製品ラベルに示しておけば、考慮される患者群に応じた用量調整を処方者が予め行うことができる。
【0026】
用語「治療する」は、治療された被検者又は疾患集団における、疾患症状の緩和、即ち、症状の退縮又はそのような症状の進行阻害を意味する。前記疾患の緩和は、疾患に随伴する臨床症状(例えば、腫瘍サイズ)の度合いによりモニターすることができる。本発明は治療される患者の100%において有効ではないかもしれないが、統計的に有意な(p値は0.05以下)数の患者を治療するのに有効である。前記の被検者数が有意であるかどうかは、スチューデントのt検定、χ2検定、MannとWhitneyによるU検定、Kruskal−Wallis検定(H検定)、Jonckheere−Terpstra検定、又はWilcoxon検定のような統計検定により判定することができる。
【0027】
本発明にはまた、米国特許、US05106742、US05340817、US05364858、US05401747、US05468754、US05559235、及びUS05663177にある医薬組成物に関連して記載されるすべての態様が含まれる。
【0028】
用語「結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん」は、がんに関連した疾患及び調節異常を含む。本発明の使用に含まれる好ましい疾患は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんである。前記疾患及び調節異常は、当該技術分野で周知であり、随伴症状が例えば「ステッドマン」のような標準の教科書に記載されている。
【0029】
本発明の意味で使用される用語「被検者」は、動物、好ましくは本明細書において以下に特定されるもの、及びヒトを含む。
本明細書に使用される用語「変異アレル」は、本明細書において以下に記載される、MRP1遺伝子に対応する1以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。それぞれの個別被検者は、MRP1遺伝子の少なくとも2つのアレルを保有し、ここで前記アレルは、識別可能であるか又は同一である。本発明の使用によれば、変異アレルは、本明細書において以下に特定される少なくとも1以上のポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、第一の変異アレルの調節又は機能に対して相乗的な影響を及ぼす場合がある。好ましくは、本発明の使用による変異アレルは、本明細書において特定される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む。
【0030】
本発明の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」又は「ポリペプチド」は、本発明の使用により特定されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの様々な変異体を意味する。前記変異体は、本明細書において特定されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの基準(reference)又は野生型配列、及び構造又は組成においてそれと異なる変異体を含む。ポリヌクレオチドについての基準若しくは野生型配列は、Genbank受入番号:GI:8850235、GI:11118740、GI:10281451、GI:11177452、GI:10281451、GI:6706037、U91318、GI:7209451、AC026452、AC003026、U91318、AF022830、GI:7209451、AC026452、AC003026、AC025277、AF022828、AF022829、AF022831、U07050、AC003026、AC002457、AC005068、M29445、及びGI:11225259であるか、又はポリペプチドについては受入番号(Pid No):G8850236、G2828206、G2506118、及びG12644118である。構造又は組成における差異は、通常、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加、及び/又は欠失により生じる。
【0031】
好ましくは、本発明の使用により言及される前記ヌクレオチド置換、付加、又は欠失は、ポリヌクレオチドの対応アミノ酸に1以上の変化をもたらす。変異ポリヌクレオチド又はポリペプチドはまた、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの断片を含む。このポリヌクレオチド又はポリペプチド、及びその上記断片は、例えば、不十分な、及び/又は改変した薬物取込みを含む、MRP1機能不全又は調節異常に関連することを特徴とする。本発明による好ましい欠失は、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置でのT又はATの欠失であり、好ましい挿入は、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置でのTCCTTCC、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置でのTGGGGCの挿入である。
【0032】
本発明にはまた、WO9957322、WO0109183、又はUS5786344にあるポリヌクレオチドに関連して記載されるあらゆる態様が包含される。
本明細書に使用される用語「ハイブリダイズする」は、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する、上記ポリヌクレオチド又はその部分へハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを意味する。従って、前記ハイブリダイズするポリヌクレオチドも前記機能不全及び調節異常に関連する。好ましくは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する上記ポリヌクレオチド又はその部分へハイブリダイズすることが可能な前記ポリヌクレオチドは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連するポリヌクレオチド又はその部分と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%、又は少なくとも100%同一である。故に、前記ポリヌクレオチドは、RNA調製物のノーザンブロット解析又はDNA調製物のサザンブロット解析におけるプローブとして有用であり得るか、又はそのそれぞれのサイズに応じて、PCR解析におけるオリゴヌクレオチドプライマーとして使用可能である。また、本発明の使用にしたがい含まれるのは、例えば電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によりDNA−タンパク質相互作用を解析するのに有用である、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。好ましくは、前記ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、長さが少なくとも10、より好ましくは少なくとも15のヌクレオチドを含むが、プローブとして使用されるハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは、長さが少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、又は最も好ましくは少なくとも500のヌクレオチドを含む。
【0033】
当該技術分野では、核酸分子を用いたハイブリダイゼーション実験の実施方法は周知であるので、当業者には、本発明にしたがいどのようなハイブリダイゼーション条件を使用すべきかがわかる。こうしたハイブリダイゼーション条件は、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」コールドスプリングハーバーラボラトリー(1989)N.Y.のような標準の教科書に言及されている。本発明の使用にしたがい好ましいのは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する上記ポリヌクレオチド又はその部分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることが可能である、即ち、本発明のMRP1ポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのような関連のないポリヌクレオチドへは交差ハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドである。
【0034】
さらに、被検者が本明細書の上記により言及されるポリヌクレオチドを含むかどうかを決定する方法は、当該技術分野で周知である。前記方法を行うには、単離細胞又は組織のような生体材料を含む試料を前記被検者から取ることが必要であろう。さらに、当該技術分野で公知の方法は、例えば、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術を含む。1以上の上記特定ポリヌクレオチドが存在するか否かを決定するために使用すべき好ましくて簡便な方法は、被検者から血液細胞を単離して、その血液細胞から単離されるゲノムDNAについてPCRベースのアッセイを実施し、それにより、PCRを使用して、本明細書の上記に特定される前記ポリヌクレオチド又はその部分が存在しているか又は非存在であるかを決定することである。前記方法は、以下及び「実施例」において、より詳しく記載する。
【0035】
本明細書に使用される用語「対応する」は、ある位置が、それぞれ前述のヌクレオチド及びアミノ酸の番号だけでは決定されないことを意味する。欠失、置換されているか、又は1以上の追加ヌクレオチドを含む場合がある、本発明の使用による所定のヌクレオチド又はアミノ酸の位置は、遺伝子又はポリペプチドの他の場所での欠失やヌクレオチド又はアミノ酸の付加により変動する場合がある。従って、本発明による「対応する位置」では、ヌクレオチド又はアミノ酸が指定の番号においては異なるかもしれないが、それでも類似の隣接ヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合があると理解すべきである。交換されているか、欠失されているか、又は追加のヌクレオチド又はアミノ酸を含む場合がある、前記ヌクレオチド又はアミノ酸も、用語「対応する位置」により含まれる。前記ヌクレオチド又はアミノ酸は、例えば、その隣接物と一緒に、遺伝子発現の調節、対応するRNAの安定性、又はRNA編集に関与し得る配列を生じるとともに、本発明のタンパク質の機能性ドメイン若しくはモチーフをコードする場合がある。
【0036】
例えば、「17970位〜17970位」は、前記ポリヌクレオチドが、17970位と前記ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの17970位との間で欠失している1以上の欠失ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、必要な変更を加えて、同じフォーマットで作成される上記態様において言及される他のすべての位置へ適用される。
【0037】
例えば、「1222位/1223位」は、前記ポリヌクレオチドが、1222位と前記ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの1223位との間に挿入される1以上の追加ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、必要な変更を加えて、同じフォーマットで作成される上記態様、即ち、スラッシュ(/)により分離された2つの連続した位置番号において言及される他のすべての位置番号へ適用される。
【0038】
本発明により、MRP1遺伝子の遺伝変異(MRP1遺伝子の異なるアレル)の形式及び集団分布が、多くの異なる個体に由来するヒトの前記遺伝子の関連領域の配列解析により解析されている。MRP1遺伝子を含む、あらゆる遺伝子の個々の遺伝子構成をもつ個体のゲノムDNAが個体の血液試料から容易に精製可能であることは、周知の事実である。そこで、これらの個別DNA試料を使用して、該血液試料を提供した個体中に存在するMRP1遺伝子のアレルの配列組成を解析する。配列解析は、前記遺伝子の関連領域のPCR増幅、次にPCR産物の精製、それに続く、確立した方法(例えば、ABIダイターミネーターサイクル配列決定法)での自動化DNA配列決定により行った。
【0039】
ヒト血液ゲノムDNA由来のPCR産物の直接DNA配列決定により個々の遺伝子型を決定し、MRP1遺伝子の新規変異体を同定する試みにおいて考慮しなければならない1つの重要なパラメータは、それぞれのヒトが(通常、ごくわずかな異常な例外を除き)それぞれの常染色体遺伝子に2つの遺伝子コピーをもつ(二倍性)という事実である。そのために、配列の評価においては、ホモ接合配列変異だけでなくヘテロ接合変異も明白に同定することができるように十分配慮しなければならない。MRP1遺伝子の多型(ホモ接合及びヘテロ接合)の同定及び特性決定における異なる工程の詳細は以下の「実施例」に記載する。
【0040】
過去20年にわたり、遺伝的不均一性は、薬物応答における変動の重要な根源としてますます認識されている。多くの科学通信(Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 及び West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648)は、ある薬物がある患者では他の患者よりよく効くか、又はきわめて有毒になる場合さえあり、薬物に対する患者の応答のそのような変動は、分子ベースのことに相関している可能性があることを明瞭に示している。この「ゲノム薬理」の概念は薬物への応答と患者の遺伝子プロフィールとの間の相関性に注目する(Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252)。薬物療法に関する集団変異の背景において、ゲノム薬理は、特定薬物に対して副作用を伴わずに応答することができる患者の同定及び選択に有用なツールとして提唱されてきた。この同定/選択は、例えば患者の血液中の白血球由来DNAの遺伝子型を決定することによる遺伝的多型性の分子診断と疾患の特性決定に基づいてよい(Bertz, Ckin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103)。米国の健康維持組織や多くのヨーロッパ諸国の政府医療サービスのような医療の創設者にとって、このゲノム薬理学のアプローチは、医療を改善することと、不要な医薬品の開発、無効な医薬品、及び薬物投与による副作用により引き起こされる、医療に関連したコストを削減することの両方の方法になり得る。
【0041】
本発明の変異遺伝子における突然変異は、アミノ酸の欠失、挿入、及び特に置換を、単独又は組み合わせてもたらすことがある。当然ながら、野生型や他の突然変異型においてそのような突然変異を遺伝子工学的にもたらすことも可能である。前記遺伝子のDNA配列にそうした修飾を導入する方法は当業者に周知である;例えば、Sambrook,「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、コールドスプリングハーバーラボラトリー(1989)N.Y.を参照のこと。
【0042】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における改変の種類の検討には、インターネットから入手可能であるBRASMOLのようなプログラムが使用可能である。さらに、他の適正なコンピュータ・プログラムを使用して、折り畳みのシミュレーションや構造モチーフのコンピュータ再設計を行うことができる(Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679)。詳細なタンパク質モデルのコンホメーションやエネルギーの解析にコンピュータが使用可能である(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45)。これらの解析は、特別な突然変異が薬物の代謝、結合、阻害、治療作用の仲介、及び/又は輸送に及ぼす影響の同定に使用することができる。さらに、本発明の使用において特定されるポリペプチドによりコードされるポリペプチドの改変された構造に関する知識に基づいて、より効率的に代謝、修飾、輸送、消失、及び/又は結合させることができる、上記に言及される物質の誘導体を設計して合成することができる。それにより、本明細書に言及される物質に基づいて、本発明の1以上のポリヌクレオチドの存在を特徴とする遺伝子型を有する被検者における結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの治療により有効である薬物又はプロドラッグを設計することができる。
【0043】
通常、本発明の使用により言及されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の前記アミノ酸の欠失、付加、又は置換は、1以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失、又はこれらの組合せによる。好ましくは、前記ヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失は、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへ、433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又は723位に対応する位置でArgからGluへのMRP1遺伝子のアミノ酸置換をもたらす場合がある。本明細書に記載の使用により言及されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により言及される突然変異により改変された生物学的特性を有する。前記改変された特性の例は、実効化され得るポリペプチドの安定性又はポリペプチドの量であり、例えば、改変された薬物代謝又は改変された薬物輸送又は改変された基質特異性又は改変された触媒活性(例えば、薬物代謝の不足や薬物を代謝する能力の完全な喪失、又は薬物を代謝する能力の亢進を特徴とする)、又は改変された輸送活性(例えば、薬物輸送の不足や薬物を輸送する能力の完全な喪失を特徴とする)、又は改変された基質結合性(例えば、改変された薬物作用を特徴とする)、又は改変された輸送の阻害若しくは誘導、又は受容体や他の標的分子への改変された結合性(例えば、シグナル伝達経路の改変された活性化を特徴とする)、又は改変されたタンパク質若しくは酵素機能をもたらす。これらの改変された特性は、本発明の使用により治療される被検者の、上記に言及される物質への損なわれた薬理学的応答をもたらす。さらに、本明細書に特定される変異アレルによりコードされるポリペプチドの前記改変された特性により、該物質は、被検者にとって危険又は有害であるか、又は望ましくない副作用を引き起こす物質の誘導体をもたらすように化学修飾される場合がある。
【0044】
本発明により検出されるMRP1遺伝子中の突然変異を表1及び2に列挙する。当業者に明らかであるように、本明細書に特定されるポリヌクレオチドに関する遺伝的知識を使用して、患者の遺伝子型を正確で信頼し得るほどに特性決定することができる。
【0045】
有利には、イリノテカン又はその誘導体に基づいた予防若しくは治療の手段は、前記遺伝的知識を考慮するときに、より有効に適用することができる。被検者の遺伝子構成に関する知識により、前記物質の望ましくない副作用は回避することができて、有効であるが有害ではない投与量を個別に計算することができる。さらに、上記によれば、ある既定の薬物が異常な効果を引き起こす症例において、被検者の個別の遺伝子構成に関する知識に基づいて適切な個別の療法を設計することができる。この個別設計(tailored)療法は、治療耐性の出現を回避するにも適しているだろう。前記耐性は、様々な化学療法剤を用いるがん化学療法における1つの重大な問題であり、このことは当該技術分野で周知である。故に、本発明の使用は、本明細書の上記に言及される物質の既知の治療上望ましい効果に基づいた治療適用の改善をもたらすが、これは前記物質の適正な投与量及び/又は適正な誘導体で被検者を個別に治療することが可能だからである。それにより、望ましくない、有害又は有毒な効果が有効に回避される。さらに、本発明の使用は、本明細書の上記に言及される物質の既知の治療上望ましい効果に基づいた治療適用の改善をもたらすが、これは、前記物質を用いた療法から利益を受ける可能性が最も高い被検者を薬物療法の開始に先立って同定し、そういう患者だけを前記物質の適正な投与量及び/又は適正な誘導体で治療することが可能だからである。それにより、前記物質を用いた治療に反応しない被検者(無応答者)の不要で潜在的に有害な治療と、次善の薬物投薬による薬剤耐性の発現を回避することができる。
【0046】
本発明により、驚くべきことに、MRP1遺伝子に対応する変異アレルがイリノテカン又はその誘導体の投与に対する前記被検者の薬理学的応答を改変させることを見出した。故に、本発明の使用により、本明細書に言及される疾患及び障害をより有効に治療することができて、それによる前記療法の手段は被検者にとってより簡便である。さらに、本明細書の上記に言及される物質の投与を含む治療手段の適用可能性を効率的に予測することができる。
【0047】
本発明の使用の好ましい態様において、前記変異アレルは:
(a)配列番号181、209、217、205、277、281、301、325、229、193、313、293、又は253のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381、440、1625位、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1625位に対応する位置にA、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む。
【0048】
より好ましくは、前記変異アレルは:
(a)配列番号209、205、277、281、301、又は325のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;並びに
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む。
【0049】
上記になされた用語の説明及び解釈は、必要な変更を加えて、適用することができる。
本発明はまた:
(a)本明細書に言及されるポリヌクレオチドを含む変異アレルが存在するか否かを決定すること;及び
(b)治療に有効な投与量のイリノテカンを被検者へ投与すること
を含む、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療する方法に関する。
【0050】
本発明の使用に従って使用される定義は、必要な変更を加えて、上記の方法へ適用される。さらに、本発明の使用により記載されるすべての態様は、必要な変更を加えて、本発明の方法へ適用してよい。さらに、本発明の方法にまた含まれるのは、当業者がその知識と本明細書全体で言及される文書のような先行技術に基づいて造作なくなし得る前記方法のさらなる発展のすべてである。
【0051】
本発明の使用の好ましい態様において、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルに比べて、変異アレルの発現を改変させる。上記に論じたように、本発明の使用により言及されるアレルは、MRP1遺伝子に対応する。当該技術分野では、遺伝子がアミノ酸配列をコードする構造要素だけでなく、前記遺伝子の発現の調節に関与する調節要素を含むことが周知である。構造要素は、アミノ酸配列をコードするか、又はアミノ酸配列をコードしないが、それでも、例えばRNAの安定性やRNAの核内輸送を調節することによってRNA機能に関わるRNAをコードする場合があるエクソンにより表される。
【0052】
遺伝子の調節要素は、プロモーター要素又はエンハンサー要素を含む場合があり、このいずれも遺伝子発現の転写制御に関わる可能性がある。当該技術分野では、プロモーターが遺伝子の構造要素の上流に見出されることが周知である。しかしながら、エンハンサー要素のような調節要素は、遺伝子の座全体にわたり分布していることがわかる場合がある。前記要素は、例えば、イントロン、つまり遺伝子のエクソンを分離するゲノムDNAの領域に存在する場合がある。プロモーター若しくはエンハンサー要素は、前記プロモーター若しくはエンハンサー要素を含む遺伝子の調節に関与するポリペプチドを誘引又は結合することが可能であるポリヌクレオチド断片に対応する。例えば、前記遺伝子の調節に関与するポリペプチドは、いわゆる転写因子を含む。
【0053】
前記イントロンは、適切な遺伝子発現に必要とされるさらなる調節要素を含む場合がある。イントロンは、通常、遺伝子のエクソンと一緒に転写され、エクソンとイントロンの両方の配列を含有する新生(nascent)RNA転写物を生じる。イントロンにコードされるRNA配列は、通常、RNAスプライシングとして知られるプロセスにより除去される。しかしながら、前記プロセスはまた、RNA転写物上に存在する調節配列を必要とし、前記調節配列はイントロンによりコードされる場合がある。
【0054】
さらに、転写制御と適切なRNAプロセシング及び/又は安定性の制御における機能の他に、遺伝子の調節配列は、遺伝子座の遺伝的安定性の制御にも関与する場合がある。前記要素は、例えば、組換え事象を制御するか、又はDNAのある種の構造や染色体中のDNAの配置を維持するのに役立つ。
【0055】
故に、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)は、上記のようにアミノ酸配列をコードする遺伝子のアレルのエクソン中だけでなく、上記に論じたプロセスに関与する調節領域中でも起こり得る。本発明の使用により言及されるポリヌクレオチドに含まれる多型は、MRP1遺伝子の亢進又は抑制された発現、遺伝子のRNA転写物の安定化、及び一次RNA転写物のプロセシングの改変を伴う機序によりMRP1タンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことができる。
【0056】
その野生型対照物へ比較したときの変異アレルの発現の改変を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、特に本明細書の上記に言及したもの、例えば、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖コンホメーション多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術を含む。野生型及び変異体のアレルの発現レベルをそれぞれ決定するための前記方法を実施するに先立って、単離細胞又は組織のような生物学的材料を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。本発明の使用による「発現の改変」は、野生型アレルの発現が変異アレルの発現と有意に異なることを意味する。有意差は、スチューデントのt検定、χ2検定、又はMannとWhitneyによるU検定といった標準の統計手法により決定してよい。さらに、当業者は、上記や当該技術分野で知られた他の統計手法を個別に造作なく採用してよい。
【0057】
本発明の使用のより好ましい態様において、前記発現の改変は、発現の増加又は低下である。
本発明に言及されるアレルの発現が、対応する野生型アレルに比べて増加しているか又は減少しているかを決定するには、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖コンホメーション多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術のような周知の方法を適用してよい。上記に論じたように、本発明の使用において言及される変異アレルの発現レベルを決定するには、細胞又は組織を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。発現の減少又は増加は、上記アッセイにおける変異体対野生型のアレルの発現レベルの有意差を特徴とする。変異アレルの検出可能発現の非存在も、発現低下に含まれる。
【0058】
本発明の使用のさらに好ましい態様において、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて、変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる。
【0059】
上記に論じたように、本明細書に特定され、MRP1遺伝子のコード領域に対応するポリヌクレオチドを含む変異アレルは、前記変異アレルによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼす。故に、変異ポリペプチドは、その対応する野生型対照物に比べて、改変した生物学的及び/又は免疫学的特性を示す。本発明の使用による好ましい変異ポリペプチドは、改変された生物学的活性(即ち、低下、亢進、又は完全に喪失した触媒活性をもたらす改変された酵素機能、又は低下、亢進、又は完全に喪失した輸送機能をもたらす改変された輸送機能、又は、シグナル伝達経路の改変された活性化、又は輸送体若しくは酵素の機能の阻害を改変させる、受容体や他の薬物標的への改変された結合性)を示すものである。野生型及び変異体のポリペプチドの活性をそれぞれ決定するための前記方法を実施するに先立って、単離細胞又は組織のような生物学的材料を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。変異ポリペプチドがその野生型の対応する対照物に比べて活性又は発現レベルが改変されているかどうかは、当該技術分野で周知の標準技術により決定することができる。そのような標準技術は、例えば、ELISAベースのアッセイ、RIAベースのアッセイ、HPLCベースのアッセイ、質量分析法をベースとするアッセイ、ウェスタンブロット解析、又は、MRP1について当該技術分野で知られ、[Keppler, et al., 1997, Biol Chem 378: 787-91, Suzuki, et al., 1994, Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 22: 83-9, Scheffer, et al., 2000, Cancer Res 60: 5269-77, Konig, et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1461: 377-94, Kool, et al., 1997, Cancer Res 57: 3537-47, Bakos, et al., 2000, Mol Pharmacol 57: 760-8, Keppler, et al., 1998, Chem Biol Interact 112: 153-61, Leier, et al., 2000, Kidney Int 57: 1636-42, Evers, et al., 2000, Br J Cancer 83: 366-74, Evers, et al., 2000, Br J Cancer 83: 375-83]に記載されているアッセイを含む場合がある。
【0060】
本発明の使用による「活性の改変」は、野生型ポリペプチドの活性が変異ポリペプチドから有意に異なることを意味する。有意差は、上記に言及される標準的な統計手法により決定することができる。
【0061】
最も好ましくは、前記活性の改変は、活性の低下又は増加である。
発現の増加又は減少について論じたように、活性の減少又は増加は、本明細書に言及されるアッセイにおける、野生型ポリペプチドに対する変異体の活性の有意差を特徴とする。変異アレルの検出可能な活性の非存在も、減少した活性に含まれる。
【0062】
さらに、本発明の使用のさらに好ましい態様において、前記被検者は動物である。
上記のように、本発明の使用による被検者には動物が含まれる。本明細書に使用される用語「動物」にはすべての動物、好ましくは脊椎動物科に属する動物、より好ましくは哺乳動物が含まれる。さらに、動物は、遺伝子導入(transgenesis)及び相同的組換えを含む周知の技術により遺伝子工学的に処理し、上記に言及される1以上のポリヌクレオチドを前記動物のゲノムへ取込ませてよい。遺伝子工学処理動物を含む前記動物は、本明細書に言及される物質又はその誘導体、好ましくはイリノテカンに基づいた薬物又はプロドラッグの薬理学的効果を研究するために使用することができる。
【0063】
上記により、最も好ましくは、前記動物はマウス又はラットである。前記動物は、Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7, Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20 に詳しく記載されるように、本発明の使用により言及される物質又は誘導体の薬理特性をアッセイするのに特によく適している。
【0064】
好ましくは、前記マウスは、機能性MRP1を欠いている。当該技術分野では、機能性シトクロムP450、MRP1、又はMDR1を欠く前記マウスがいかにして入手可能であるかが周知である。例えば、前記マウスは、MRP1については Rappa, et al., 2000, Biochemistry 39: 3304-10, Schinkel, 1998, Int J Clin Pharmacol Ther 36: 9-13, Schinkel, et al., 2000, Pharmacogenetics 10: 583-90 に記載されるように相同的組換えにより産生してよい。
【0065】
さらに、本発明の使用の別の好ましい態様において、前記被検者はヒトである。
特に、本発明は、上記から明らかであるように、ヒトへ適用可能である。本発明の使用は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん罹患患者において副作用を治療又は予防するために適用することが可能である。上記の物質又はその誘導体の薬理効果はヒトにおいて周知である。しかしながら、従来の療法は患者の個別の遺伝子組成を考慮しない。人種集団は異なる遺伝的背景を有し、それは変異アレルの機能又は調節に影響を及ぼし、それにより、本発明による薬物又はプロドラッグの基礎として使用される物質又は誘導体に対する患者の薬理学的応答を改変させる場合がある。
【0066】
上記のことに照らし、最も好ましくは、前記ヒトがアフリカ人又はアジア人である。
アジアの人口集団(16%)は、白人(39%)に比べて、より低い頻度のUGT1A1低発現体(low expressor)遺伝子型(UGT1A1遺伝子(受入番号:GI:11118740)の174990〜174993位に対応する位置でのホモ接合野生型)を示すので、イリノテカン毒性に罹患する可能性がより少ない。一方、このアレルは、アフリカ人(43%)においてより一般的であるが、彼らは、そのホモ接合遺伝子型が7%で起こる別の低発現体のアレル(UGT1A1遺伝子(受入番号:GI:11118740)の174989/174990位に対応する位置でのTA挿入)を追加的に有する。故に、アフリカ人は、イリノテカン関連の有害事象により感受性がある([Beutler, et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95: 8170-4, Lampe, et al., 1999, Pharmacogenetics 9: 341-9, Hall, et al., 1999, Pharmacogenetics 9: 591-9]からの人口頻度データ)。
【0067】
本発明はまた、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん罹患患者に適正な療法を選択する方法に関し、前記方法は:
(a)被検者から入手した試料中の前記被検者のゲノムにおける上記に言及される変異アレルが存在するか否かを決定すること;及び
(b)(a)で得られた結果に基づいて前記被検者に適正な療法を選択すること
を含む。
【0068】
上記になされた用語の定義及び説明は、必要な変更を加えて、上記の方法へ適用される。
本明細書に使用される用語「適正療法」は、本発明により物質が選択され、前記物質が一定の投与量で被検者へ投与されることを意味し、ここで前記物質と前記投与量は、本明細書の使用により言及される変異アレルが存在するか否かに関する知識に基づいて選択される。前記物質と該物質の前記投与量は、一方では、それらが結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するのに最も有効であるように、他方では、それらが有毒又は望ましくない副作用を引き起こさないように選択される。
【0069】
上記から明らかであるように、適正療法を選択するための前提条件は、本発明の使用により言及される変異アレルが存在するか否かに関する知識である。故に、本発明の方法には、前記被検者から入手した試料における前記変異アレルが存在するか否かの決定が含まれる。被検者により入手される試料は、単離細胞又は組織のような、前記変異アレルが存在するか否かの決定に適している生物学的材料を含む。本発明の方法の変異アレルが存在するか否かの決定の方法は、本明細書の上記に言及される方法を含む。
【0070】
本発明の方法により、被検者、好ましくは、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんに罹患しているヒトへの適正療法を効率的に選択することが可能である。それにより、誤った医薬品に基づいた患者の誤った治療と、がん療法への耐性の発現のようなその結果、及びそれに続く医療費の増加を有効に回避することができる。さらに、高リスクである患者は、初回投薬に先立って治療から除外することが可能である、及び/又は、薬物療法の開始に先立って、投与量を個人の遺伝子組成に従って調整することが可能である。また、上記輸送体遺伝子(例、MRP1)の阻害剤を、遺伝的に規定される患者亜集団に適用してもよい。このように、時間浪費の高額な薬物モニタリングをベースとする用量決定をせずに、有害効果を回避して、最適な薬物レベルにより速やかに達することができる。これにより、疾患の医療コストと間接コストを抑えることができる(例えば、患者の入院の期間短縮と頻度低下)。
【0071】
本発明には以下の27項も含まれる。上記になされた定義と説明は、必要な変更を加えて、以下の特許請求の範囲を特徴付けるために使用される用語へ適用される。
1. がん罹患患者を治療するためにイリノテカンを使用する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルをがん性組織に有するかどうかを決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。
【0072】
2. がんが、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんである、第1項に記載の方法。
3. (a)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が毒性を避けるために減らされる;又は
(b)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が効力を高めるために増やされる、第2項に記載の方法。
【0073】
4. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にある、第3項に記載の方法。
5. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のコード領域にある、第3項に記載の方法。
【0074】
6. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にもコード領域にもない、第3項に記載の方法。
7. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域とコード領域の両方にある、第3項に記載の方法。
【0075】
8. 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、第3項に記載の方法。
【0076】
9. 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号181、209、217、205、277、281、301、325、229、193、313、293、又は253のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381、440、1625位、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1625位に対応する位置にA、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;並びに
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、第8項に記載の方法。
【0077】
10. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、第8項に記載の方法。
11. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、第8項に記載の方法。
【0078】
12. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、第9項に記載の方法。
13. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、第9項に記載の方法。
【0079】
14. 患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含む、患者がイリノテカンを用いた治療に対して中毒反応のリスクがあるかどうかを決定する方法。
【0080】
15. 患者へ投与するイリノテカンの量を減らすことをさらに含む、第14項に記載の方法。
16. がん罹患患者へイリノテカンを投与するための最適治療方式を決定する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、イリノテカンの量を、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やすか又は減らすことを含む、前記方法。
【0081】
17. MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より低いので、イリノテカンへの高い感受性を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、減らした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
【0082】
18. MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より高いので、イリノテカンへの耐性又は耐性素質を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、増やした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
【0083】
19. 耐性又は耐性素質を示す変異アレルを有する患者をMRP1阻害剤で治療する、第18項に記載の方法。
20. MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、第19項に記載の方法。
【0084】
21. MRP1遺伝子産物のがん性細胞における発現レベルの変化をアッセイすることによって治療の間に患者をモニターすることをさらに含み、それによりMRP1遺伝子産物の発現レベルの増加を、患者へ投与するイリノテカンの量の増加により補填する、第17項に記載の方法。
【0085】
22. 患者においてがんを治療する方法であって、有効量のイリノテカンを該患者へ体内投与することを含み、ここで治療方式は、患者のMRP1遺伝子の遺伝子型に基づいて変更される、前記方法。
【0086】
23. がんに罹患している患者の集団を治療する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを、患者一人一人のベースで決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。
【0087】
24. がん罹患患者においてイリノテカンへの感受性を予測する方法であって、該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含み、該アレルはがん性細胞が少量又は多量のMRP1遺伝子産物を発現することを示し、それにより低い発現はイリノテカンへの高い感受性を示し、高い発現はイリノテカンへの耐性又は耐性素質を示す、前記方法。
【0088】
25. 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者をMRP1阻害剤で治療する、第24項に記載の方法。
26. MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、第25項に記載の方法。
【0089】
27. 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者を、がん性細胞におけるMRP1遺伝子産物の発現レベルをアッセイすることによって、治療の間にモニターする、第26項に記載の方法。
【0090】
本明細書の上記に言及される「発現低下」には、機能性遺伝子産物をコードする転写物の有意に減少した量だけでなく、活性を有さないか又は有意に減少した活性を有する遺伝子産物をコードする転写物の正常量又は上昇量さえ含まれる。
【0091】
「MDR1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して」は、遺伝子型を考慮せずにその必要な患者へ標準量が定常的に投与されることを意味する。そうした一般的な患者の集団は、正常な遺伝子型、即ち野生型の遺伝子型を有するとみなされる。
【0092】
さらに、本発明には、MRP1の発現レベル(以下、発現プロフィールと呼ぶ)、又はMRP1タンパク質のタンパク質レベル(以下、タンパク質プロフィールと呼ぶ)、又は前記タンパク質の活性レベル(以下、活性プロフィールと呼ぶ)を決定することを含む、療法を改善及び/又は変更する方法が含まれる。
【0093】
本発明の文脈において言及される用語「発現レベル」は、PLA2のようなハウスキーピング遺伝子の転写物の量に対する、検出可能量のMRP1遺伝子の転写物の検出可能な量を意味する。転写物の量は、ノーザン解析、RNAアーゼ保護アッセイ、Taq−Man解析を含むPCRベースの技術を含む、標準的な分子生物学の技術によって決定することができる。好ましくは、この決定は、付帯の実施例4及び5に記載のように行ってよい。用語「発現プロフィール」は、MRP1遺伝子の発現レベルを決定し、該発現レベルを基準標準品と比べることを意味する。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織より転写物を入手する。
【0094】
用語「タンパク質レベル」は、PLA2のようなハウスキーピング遺伝子によりコードされるタンパク質の量に対する、検出可能量のMRP1を意味する。タンパク質の量は、ウェスタン解析、ELISA、RIA、又は当該技術分野で知られる他の抗体ベースの技術のような標準的な生化学の技術により決定することができる。用語「タンパク質プロフィール」は、上記タンパク質のパネルのタンパク質レベルを決定し、該タンパク質レベルを基準標準品と比べることを意味する。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織よりタンパク質を入手する。
【0095】
用語「活性レベル」は、(例えば、MRP1遺伝子の対応する野生型アレルによりコードされるタンパク質の)好適な基準標準品に比べた活性に対する、本発明に開示されるこれら遺伝子のアレル変異体によりコードされるMRP1の検出可能な生物学的活性を意味する。上記タンパク質についての生物学的アッセイは当該技術分野で周知であり、Hallo et al., Anticancer Res. 1998, 18: 2981-7 に記載されている。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織よりタンパク質を入手する。
【0096】
上記の方法は、好ましくは、(i)腫瘍療法の特定の段階の間に患者より腫瘍試料を入手する工程;及び(ii)MRP1の発現プロフィール、タンパク質プロフィール、又は活性プロフィールを決定する工程を含む。発現プロフィールに基づいて、臨床医は、効率的に療法を採択することができる。このことは、とりわけ、投与量の調整を含み、及び/又はMRP1阻害剤の投与が含まれる。好ましくは、前記阻害剤は、以下の阻害剤の群より選択される:SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾン、三環系イソオキサゾール(例、LY 402913)(http://bigfoot.med.unc.edu/watkinsLab/intesinfo.htm, Paul Watkins, ノースカロライナ大学)。
【0097】
最後に、本発明には、患者が、本発明の文脈において言及される薬物に対して耐性を発現したかどうかを決定する方法が含まれる。前記方法は、(i)腫瘍療法の特定の段階の間に患者より腫瘍試料を入手する工程;及び(ii)MRP1の発現レベルを決定する工程を含む。各遺伝子の発現は、実施例4及び5の記載又は上記の記載のように決定してよい。前記発現プロフィールの評価に基づいて、臨床医は、より効率的に療法を採択することができる。このことは、とりわけ、投与量の調整を含み、及び/又は上記のようなMRP1阻害剤の投与が含まれる。
【0098】
本明細書に引用される文書(製造業者の仕様書、指示書、等を含む)は、いずれも参照により本明細書に援用される。
本願において配列同定番号(配列番号)により言及される核酸配列及びアミノ酸配列を以下の表1、2に収載する。多型ヌクレオチドの位置について、以下の代用文字を核酸配列において使用する:R、G、又はA;Y、T又はC;M、A又はC;K、G又はT;S、G又はC;W、A又はT。
【0099】
アミノ酸配列は1文字記号で示す。多型アミノ酸位置の文字Xは、修飾アミノ酸又はその対応する野生型アミノ酸を示す(受入番号を参照のこと)。
さらに、GenBank受入番号を参照することにより本明細書に言及されるすべての核酸及びアミノ酸の配列を以下の図4〜29に示す。
【0100】
【表1−1】
【0101】
【表1−2】
【0102】
【表1−3】
【0103】
【表1−4】
【0104】
【表1−5】
【0105】
【表1−6】
【0106】
【表1−7】
【0107】
【表1−8】
【0108】
【表1−9】
【0109】
【表1−10】
【0110】
【表1−11】
【0111】
【表1−12】
【0112】
【表1−13】
【0113】
【表1−14】
【0114】
【表1−15】
【0115】
【表1−16】
【0116】
【表2−1】
【0117】
【表2−2】
【0118】
【表2−3】
【0119】
【表2−4】
【0120】
【表2−5】
【0121】
本発明を、以下の生物学的実施例を参照にして説明するが、これは単に例示であって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【実施例1】
【0122】
MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置でのCからTへの置換の表現型上の影響
MDR1エクソン26SNP C3435Tとも呼ばれるMDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置での単一ヌクレオチドCからTへの置換の、腸のP−糖タンパク質(PGP)発現に及ぼす影響を検討するために、シュツットガルトのマーガレット・フィッシャーボッシュ博士研究所の臨床薬理学部門で、21名の生検試料と十二指腸の小腸上皮細胞調製物を定量的免疫組織化学とウェスタンブロットにより検討した。この結果を図1に示す。Tアレルのホモ接合保有者(MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置にTを有する)は、Cアレルのホモ接合保有者(MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置にCを有する)に比べて、有意により高いPGPレベルを示した。ヘテロ接合遺伝子型を有する個体は、中間レベルのPGP発現を示した。
【0123】
さらに、ジゴキシンの腸取込みに関連する薬物動態に対するMDR1遺伝子型の影響をベルリン大学医療センター、Chariteでの臨床試験において検討した。定常状態での最大ジゴキシン血液レベル(Cmax)は、ジゴキシンの経口適用後の14名の健常ボランティアのMDR1 3435C>T遺伝子型に相関していた。図2は、Tアレルについてホモ接合であるボランティアがC/C遺伝子型を有するボランティアより統計的に有意に低いジゴキシンレベルを示すことを示し(p=0.006,Mann Whitney U検定)、ジゴキシン薬物動態に対するこの多型の影響を反映する。
【実施例2】
【0124】
MRP1基質を用いた治療中のMRP1発現及び副作用とMRP1多型の相関性
MRP1遺伝子における機能性の多型は輸送活性に影響を及ぼし、それが結果としてMRP1基質薬物の血漿レベル及び/又は細胞内濃度を変調させる。そのような薬物のレベルが増加すると副作用をもたらす場合があるのに対し、レベルが減少すると、治療以下の薬物レベルと治療の失敗をもたらす場合がある。MRP1多型は、MRP1基質薬物で治療される患者における薬物関連有害効果の発生と治療効力に相関した。症例コントロール試験において、MRP1 SNPの頻度分布を、シスプラチン関連の腎毒性に罹患した患者の群と抗がん剤により引き起こされる腎及び肝毒性を有する患者の群、健常対照者の群との間で比較した。さらに、既知のMRP1 mRNAレベルの試料をMRP1遺伝子型についてスクリーニングした。抗がん治療の間に腎及び肝毒性を示す患者の群における結果を、1つのMRP1 SNPについて以下の表に収載する:
【0125】
【表3】
【0126】
対照試料とは対照的に、Aアレル(MRP1遺伝子、受入番号:AC025277の150727位による位置でのGからAへの置換)は、健常対照に比べて、薬物関連の腎及び肝臓副作用に罹患している患者で統計的に有意に(p=0.044、χ2検定)過剰表出していたので、これにより上記副作用を予測した。
【0127】
さらに、2つのMRP1 SNP、95T>C(配列番号209、210、211、及び212、MRP1遺伝子、受入番号:AF0022831の96位に対応する位置でのTからCへのヌクレオチド置換)と259A>G(配列番号277、278、279、及び280、MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の259位に対応する位置でのAからGへのヌクレオチド置換)について、リファンピシン適用の前と後でのmRNA発現とMRP1遺伝子型の関連性を検出した。これらのSNPは連鎖していて、1つのアレルを形成する。図3に例示されるように、2つの独立した実験(リファンピシン誘導の有無)において、突然変異アレル(MRP1mut,MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の95位にC、259位にG)は、減少したMRP1 mRNA発現に、そして野生型アレル(MRP1wt,MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の95位にT、259位にA)は、増加したMRP1発現に統計的に有意に相関している。
【0128】
MRP1 mRNA含量におけるこの差異は、MRP1遺伝子型に関連した個体間の差異に基づくので、これらSNPの解析は、MRP1発現レベルについて、そしてMRP1基質薬物の治療アウトカムと有害効果を予測するのに、診断及び予後の上できわめて有用である。
【実施例3】
【0129】
投与量の算出
イリノテカンの治療効力と有害効果は、親化合物及び活性代謝物(例えば、SN−38)の血漿レベル及び細胞内濃度、即ち、CYP3A5及びMRP1に関連した代謝により制御されるプロセス、並びにMRP1及びMDR1に関連した輸送プロセスに依存する[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69, Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun 260: 199-202, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14; Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al., 1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]。例えば、MRP1は、細胞の解毒系の一部としてグルクロノシルトランスフェラーゼと緊密に作用し、SN−38Gのようなグルクロノシル抱合体を輸送することが知られている[Konig et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1461: 377-394, Kerb et al., 2001, Pharmacogenomics 2: 51-64]。例えば、SN−38Gが細胞から胆汁へ輸送される程度は、その形成の速度に大いに影響を及ぼす。SN−38の効率的な解毒には、MRP1による抱合とグルクロニドの輸送という両方のプロセスが必要である。
【0130】
CYP3A5遺伝子(受入番号:GI:10281451)の47518T>C(配列番号137、138、139、及び140)及び9736A>G(配列番号149、150、151、152)のヌクレオチド置換とCYP3A5遺伝子(受入番号:GI:11177452)の145601T>G(配列番号141、142、143、144)及び145929A>G(配列番号145、146、147、及び148)のヌクレオチド置換は、高いCYP3A5発現に関連したアレルを生じ、故に、イリノテカンのより高い代謝不活性化に関連する。このアレルを有する個体は、強い新陳代謝体(extensive metabolizers; EM)であるので、残りの弱い新陳代謝体(poor metabolizers; PM)とは対照的に、イリノテカンの毒性に罹患する可能性はより低い。1つの高発現体(high expresser)と1つの低発現体(low expresser)に関連したアレルを1つずつ有する人々は、中間の新陳代謝体(IM)とみなされる。
【0131】
MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176C>Tヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95T>C(配列番号209、210、211、及び212)及び259A>G(配列番号277、278、279、及び280)ヌクレオチド置換は低いmRNA発現に関連し、MRP1遺伝子(受入番号:M29445)の150727G>Aヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、そして、MRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727G>Aヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は有害効果に関連する。故に、低い輸送体の発現に関連したアレルを担う個体は、有毒化合物を細胞から一掃することがさほど可能ではない。輸送と代謝はいずれも遺伝子の量に依存したやり方で影響を受ける。それぞれの輸送タンパク質の低い発現に関連したアレルの数に従って、個体は、各遺伝子の強い輸送能力(ET)、中間の輸送能力(IT)又は弱い輸送能力(PT)のいずれかを有するとして分類することができる。
【0132】
イリノテカンでの治療の開始に先立つ遺伝子検査により、患者のMDR1及びMRP1に関連した輸送能力を予測することができる。有害効果への個別リスクは、PM及び/又はPTアレルの数に依存する。CYP3A5及びMRP1のPM関連のアレルとMDR1及びMRP1のPT関連のアレルを有する個体は、イリノテカンの毒性に罹患するリスクが最も高い。
【0133】
この知識に基づいて、CYP2D6、CYP2C9、及びCYP2C19の基質薬物について、Brockmoller et al. (2000, Pharmacogenomics 1: 125) に示されるように、初回投薬に先立って、初期用量を調整してよい。
【0134】
用量調整は、得点システムを使用して行うことができる。それぞれのPM又はPT関連アレルについて、ある一定のスコアを割り当てる。例えば、MRP1 PMアレルの226A(配列番号9、10、11、12、540、541)及び701A(配列番号25、26、27、28、554、555)には2のスコアを割り当て、CYP3A5 PM関連アレル(47523T+35649A+145601T+145929A、47523T+35649G+145601G+145929G、及び47523C+35649A+145601T+145929A)、MDR1低発現アレル176T(配列番号417、418、419、及び420)、MRP1低発現アレルの150727A(配列番号217、218、219、及び220)及び259G(配列番号277、278、279、及び280)、MRP1 150727Aアレル(配列番号217、218、219、及び220)には1のスコアを割り当てる。遺伝子型決定の後で、このスコアをまとめ、この総和によりイリノテカン投与量を調整する。それぞれの単一スコアが10%の用量低下に対応する。即ち、1のスコアは10%、2のスコアは20%、3のスコアは30%、等の用量低下に対応する。
【実施例4】
【0135】
培養条件と生物学的アッセイ
ヒト上皮子宮頚がん細胞系KB3−1と2つのサブクローン(KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5))、並びに膀胱がん細胞系RT112とサブクローン(RT112(MDR1+,MRP1))を、NaHCO3 3.7g/l、D−グルコース 4.5g/l、N−アセチル−L−アラニル−L−グルタミン 1.028g/lを含み、10%胎仔ウシ血清、1mMピルビン酸Na、及び1%非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)において培養した。ヒト結腸がん細胞系LS174Tは、L−グルタミン、塩酸ピリドキシン、及びフェノールレッドのない25mM Hepes緩衝液を含有し、10%胎仔ウシ血清、1mMピルビン酸Na、及び1%非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改良イーグル培地において培養した。すべての細胞を5% CO2を含む加湿空気において37℃でインキュベートした。
【0136】
薬物
イリノテカン(CPT−11)とその活性代謝物SN−38は、ファルマシアにより提供された。ストック溶液の調製のために、この物質をメタノールに溶かし、CPT−11については10mg/ml、SN−38については1mg/mlとし、4℃で遮光保存した。PBSと細胞培養基においてより低い濃度の希釈液を調製した。R−ベラパミルは、SIGMAより提供され、DMSOに溶かして50mg/mlとし、さらにPBSにおいて希釈した。
【0137】
薬物での細胞の処理
処理に先立つ24時間前に細胞を96ウェル培養プレートに播いた。異なる増殖速度を考慮して、KB3−1及びRT112の細胞は700細胞/ウェルで、RT112(MDR1+,MRP1)は1000細胞/ウェルで、KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は1200細胞/ウェルで播いた。LS174Tは、1.0x104細胞/ウェルで播いた。培養基の用時調製系列希釈液、CPT−11については0、0.5、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100、及び200μg/ml、SN−38については0、0.1、0.25、0.5、1.5、10、25、50、75、100、及び200ng/mlで細胞を処理した。4つのウェルを同じ薬物希釈液で処理した。5% CO2の加湿空気において細胞を37℃で3日間インキュベートした。
【0138】
MDR1阻害実験では、各薬物希釈液の2つのウェルに10μg/mlの最終濃度となるようにR−ベラパミルを加えた。
細胞毒性アッセイ
市販のMTSアッセイ系(プロメガ、マジソン、アメリカ)を使用し、製造業者の指示書に従って、増殖阻害と細胞死を判定した。薬物を加えてから3日後、96ウェル培養プレートの各ウェルへ20μlの複合MTS/PMS溶液を加えた。このプレートを5% CO2の加湿空気において37℃で少なくとも45分間インキュベートし、492nmでの吸光度を測定した。各プレートの未処理対照細胞の吸光度の値を100%増殖として設定し、残る薬物処理細胞の増殖を算出するために使用した。培養プレートの未処理細胞は、増殖及び生存が影響を受けない対照として役立った。
【0139】
細胞増殖の50%阻害をもたらす薬物濃度をIC50と定義した。
RNA調製とcDNA合成
上記の実験に使用するそれぞれの細胞バッチより、製造業者の指示書に従って、オリゴ−dT磁気ビーズ(μMACS mRNA単離キット;Miltenyi Biotech)により細胞溶解液からメッセンジャーRNAを単離した。各細胞系の250ng mRNAを、Superscript II逆転写酵素(ギブコBRL)を含む20μl cDNA合成反応液に適用した。このcDNAの希釈液は、転写物特異的な増幅反応の鋳型として役立った。
【0140】
PCRプライマーと反応条件
表3に示すように、0.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Qiagen)、200μMヌクレオチドミックス、5μl cDNA鋳型希釈液、及び0.2μM遺伝子特異的プライマーを有する25μl 反応液においてPCRを設定した。すべての反応は、サイクル数だけが異なる同一の増幅条件下(表3)、94℃で2分のプレ変性、次いで増幅には、94℃で45秒の変性、62℃で45秒のアニーリング、及び72℃で45秒の伸長で実行したが、MRP1は、2分間のより長い伸長を必要とした。
【0141】
【表4】
【実施例5】
【0142】
イリノテカン代謝に関与する遺伝子の発現
ヒト膀胱がん細胞系RT112、そのサブクローンRT112(MDR1,MRP1)、ヒト上皮子宮頚がん細胞系KB3−1と2つのサブクローン、KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)、並びに結腸がん細胞系LS174T(ATCC CL−188)よりメッセンジャーRNAを単離した。これらのmRNAをcDNAへ逆転写し、転写物特異的増幅反応における鋳型として適用し、イリノテカンの輸送及び代謝に関与する遺伝子(MDR1、MRP1、UGT1A、MRP1、CYP3A4、CYP3A5)の発現レベルを決定した。ハウスキーピング遺伝子、ホスホリパーゼA2(PLA2)の増幅を、この反応において比較可能なcDNA量の対照として使用した。
【0143】
図29の増幅反応は、がん細胞系のRT112、KB3−1、及びLS174Tが、それぞれMDR1の無発現か、又はごく低い発現を有することを示す。RT112(MDR1,MRP1)はRT112のサブクローンであり、Seemann et al. (Urol Res 1995; 22: 353-360) に記載されるように、細胞傷害薬への抵抗性で選択されたものであり、中等度に増加したMDR1発現を特徴とする。薬剤抵抗性サブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、同様に、MDR1基質への曝露により元のKB3−1細胞系から派生した。これらのサブクローンは、高度に増加したMDR1発現を特徴とする。それらは、元のKB3−1細胞より20倍より多い転写物を示し、非常に高いMDR1活性を示唆する。MRP1はすべての細胞系で同一のレベルで発現される。UGT1A酵素の転写物は、RT112、RT112(MDR1,MRP1)、及びLS174T細胞においてのみ存在する。MRP1は、RT112においてごく弱く発現され、RT112(MDR1,MRP1)においてより強く発現され、LS174T細胞において最高の発現を示す。CYP3A4は、LS174Tにおいてのみごく少量検出された。RT112細胞、RT112(MDR1,MRP1)、及びLS174Tは、機能的に不活性なスプライス変異体と機能的に活性なCYP3A5の転写物のヘテロ接合発現を示す。対照的に、KB3−1及びKB3−1(MDR1+++)細胞は、活性CYP3A5転写物のみを有し、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、活性CYP3A5転写物の最高の発現を示し、後者が最高のCYP3A5活性を有することを示唆した。
【実施例6】
【0144】
MDR1及びCYP3A5活性がないか又は低い結腸及び他の表皮がん細胞系は、CPT−11及びSN−38に対して感受性である。
結腸がん細胞系LS174T、子宮頚がん細胞系KB3−1、及び膀胱がん細胞系RT112を、処理に先立つ24時間前に96ウェル培養プレートに播いた。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。図30は、CPT−11及びSN−38で処理すると、3つの表皮がん細胞系がいずれも増殖を停止して死滅することを示す。CPT−11が50%阻害をもたらす濃度(IC50)は、LS174T細胞で1.5μg/ml、RT112細胞で2.5μg/ml、そしてKB3−1細胞で5μg/mlである。CPT−11の活性代謝物、SN−38は、103倍低い濃度で同じ程度の増殖阻害と細胞死を引き起こすので、CPT−11より1000倍高い効力を示す。SN−38のIC50は、LS174T細胞で5ng/ml、RT112細胞で4ng/ml、そしてKB3−1細胞で25ng/mlである。
【0145】
上記の結果は、3つの表皮細胞系が、異なる組織から派生したのに、いずれもCPT−11及びSN−38の処理に同様に感受性があることを示す。このことはまた、MDR1を発現しないか又はきわめて低いレベルを発現するがん細胞(図29)がCPT−11及びSN−38により効率的に殺傷され得ることを示す(図30)。
【実施例7】
【0146】
MDR1活性は、CPT−11及びSN−38に対するがん細胞の抵抗性に相関する。
KB3−1と、その強くMDR1を発現するサブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)の細胞を、処理に先立つ24時間前に96ウェル培養プレートに播いた。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、処理した。MDR1の高発現体であるKB3−1サブクローン(KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5))の阻害曲線(図31)は、MDR1の低発現体であるKB3−1細胞系(KB3−1)に比べて、CPT−11及びSN−38に対して有意により高い抵抗性を示す(図29)。CPT−11のIC50は、KB3−1細胞での5μg/mlからKB3−1(MDR1+++)細胞での85μg/mlとKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞での200μg/mlへと、17〜40倍増加する。SN−38のIC50は、KB3−1細胞での25ng/mlからKB3−1(MDR1+++)細胞での200ng/mlとKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞での>200ng/mlへと、少なくとも8倍増加する。
【0147】
CPT−11及びSN−38はMDR1の基質であり、故に、MDR1活性により細胞から除去される。MDR1発現レベルは、CPT−11及びSN−38に対する腫瘍細胞の感受性に逆相関する。従って、高いMDR1発現体の表現型を有する細胞の殺傷には、ずっと高い濃度のCPT−11を必要とする。
【実施例8】
【0148】
MRP1活性は、SN−38に対する感受性に相関し、CPT−11に対する感受性に相関しない。
RT112細胞とそのサブクローンのRT112(MDR1,MRP1)との間でCPT−11及びSN−38感受性を比較した。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、処理した。
【0149】
CPT−11に対する感受性の違いは、図32Aに示されるように、ごくわずかである。RT112(MDR1,MRP1)細胞の4μg/ml CPT−11というIC50は、RT112細胞(2.5μg/mlのIC50)に比べて2倍高い。MDR1を発現しないRT112細胞とは対照的に、RT112(MDR1,MRP1)細胞は、中間量のMDR1を発現し、このことにより、CPT−11感受性のわずかであるが有意な増加を説明することができる。SN−38で処理後のRT112(4ng/mlのIC50)及びRT112(MDR1,MRP1)細胞(75ng/mlのIC50)の間にはずっと顕著な差異が存在する(図32B)。RT112(MDR1,MRP1)細胞系のこの19倍高い抵抗性は、RT112細胞よりもRT112(MDR1,MRP1)においてより高いレベルで発現されるMRP1の追加の解毒効果により説明することができる(図29)。SN−38とは対照的に、CPT−11は、UGTにより代謝されない。故に、CPT−11関連の毒性はMRP1発現により影響を受けず、RT112(MDR1,MRP1)細胞におけるUGTの抵抗性亢進能力は、SN−38の適用によってのみ検出される。
【実施例9】
【0150】
MDR1阻害は、MDR1低発現性ではなく、MDR1高発現性のがん細胞においてCPT−11及びSN−38に対する増感剤として役立つ。
KB3−1細胞とそのサブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)のCPT−11及びSN−38に対する感受性を、特異的な阻害剤のR−ベラパミルを使用してMDR1機能を遮断した後で評価した。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11、SN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。2つのウェルをMDR1阻害剤のR−ベラパミルで追加的に処理した。図33は、R−ベラパミルの追加が、MDR1の低発現体であるKB3−1細胞のCPT−11及びSN−38感受性に対してはごくわずかな効果しか及ぼさないことを示す(「R−ベラパミルなし」でのCPT−11及びSN−38のIC50がそれぞれ5μg/ml及び25ng/mlであるのに対し、「R−ベラパミルあり」でのCPT−11及びSN−38のIC50はそれぞれ4.5μg/ml及び15ng/mlである)。対照的に、MDR1発現細胞のKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)のCPT−11及びSN−38に対する感受性は、R−ベラパミルを用いたMDR1輸送機能の阻害の後で8倍及び10倍高くなった。KB3−1(MDR1+++)細胞でのCPT−11のIC50は、「R−ベラパミルなし」の85μg/mlから「R−ベラパミルあり」の10μg/mlへ減少し、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞においては、「R−ベラパミルなし」の200μg/mlから「R−ベラパミルあり」の25μg/mlへ減少した。SN−38処理の間のMDR1阻害の効果は、これらMDR1高発現体の細胞においてずっと強く、R−ベラパミルがMDR1輸送を完全に遮断すると、それらはKB3−1と同じくらい感受性になった。
【0151】
上記の結果は、MDR1活性ががん細胞のCPT−11及びSN−38抵抗性に関連していて、MDR1の阻害がこれらの細胞を感作するので、それらがより低い薬物濃度でより効率的に殺傷されることを明示する。
【実施例10】
【0152】
CYP3A5活性はCPT−11への抵抗性に影響を及ぼす。
KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)の細胞は、そのCYP3A5の量が異なる(図29)。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11、SN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。2つのウェルをMDR1阻害剤のR−ベラパミルで追加的に処理した。
【0153】
MDR1活性がCPT−11及びSN−38に対する細胞の感受性の主要な決定因子であるので、これらMDR1高発現体の細胞系におけるMDR1活性を特異的なMDR1阻害剤のR−ベラパミルの過剰量を使用して完全に遮断し、MDR1の干渉がない状態で、CPT−11及びSN−38感受性に対するCYP3A5の影響を解析した。
【0154】
高CYP3A5発現体の細胞系、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、25μg/mlのIC50であり、10μg/mlのIC50を示すKB3−1(MDR1+++)よりCPT−11に対して2.5倍抵抗する(図34)。SN−38に対するその感受性に関しては、これら2つの細胞系の間で差異を観察することができない。
【0155】
上記の実験は、SN−38とは対照的に、CPT−11への抵抗性に対するCYP3A5発現の有意な影響を明示する。SN−38ではなくてCPT−11がCYP3A5遺伝子により代謝されるので、CYP3A5活性がSN−38の毒性に何の影響も及ぼさなかったことにより、このCYP3A5の効果がさらに確かめられる。
【実施例11】
【0156】
MDR1遺伝子型決定は、遺伝子型に基づいた予測と薬剤抵抗性のモニタリングによりイリノテカンの治療効力を改善する。
イリノテカンの治療効力及び有害効果は、親化合物及び活性代謝物(例、SN−38)の血漿レベルと腫瘍細胞内濃度に依存する。MDR1遺伝子は、イリノテカンのPGP依存性膜浸透を制御し[Luo et al., Drug Metab Dispos 2002, 30: 763-770; Jansen et al., Br J Cancer 1998, 77: 359-65; Chu et al., J Pharmacol Exp Ther 1999, 288, 735-41; Sugiyama et al., Cancer Chemother Pharmacol 1998, 42 Suppl: S44-9]、故に、その全身アベイラビリティと細胞内蓄積の重要な決定因子である。MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176C>Tヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、この置換を担う患者は、2つの理由でイリノテカン治療へ応答する可能性がより高い:1)小腸上皮細胞中のPGP量がより少ないために、より多くのイリノテカンが腸障壁を通過して体内に入り、より多くのイリノテカンがその作用部位である腫瘍に到達することを引き起こす。2)腫瘍細胞膜中のPGP量がより少ないために、より多くのイリノテカンが腫瘍細胞中へ浸透し、その細胞傷害効果を発揮する。今日使用されている標準的なイリノテカンの用量は、化学療法の第一サイクルのうちにほとんどの腫瘍細胞をきわめて有効に殺傷し、薬剤抵抗性の腫瘍細胞がごくわずかに生存し、忍容し得る有害事象を伴うだけである。これらの患者においては、薬剤抵抗性の機序からは独立して、生存する細胞の数があまりに少ないので、イリノテカン療法へもはや応答しない薬剤抵抗性腫瘍へ進展することはない。
【0157】
高発現体のMDR1遺伝子型(MDR1遺伝子、受入番号:M29445の176位がヌクレオチドCである)を有する患者は、イリノテカン治療へ応答する可能性がより低い。十分に有効な腫瘍細胞の殺傷を達成して薬剤抵抗性腫瘍の発現を防ぐには、より高い用量が必要となろう。しかしながら、イリノテカン投与量の上昇は、忍容し得ない有害事象(例、下痢、好中球減少症、又は血栓塞栓性の合併症)の発生のために制限される。あるいは、イリノテカン治療の効力は、PGP阻害剤の追加により改善することができる。PGP阻害剤は、MDR1高発現体の患者においてPGP機能を有効に遮断し、イリノテカンが腫瘍細胞中に濃縮し、MDR1低発現体の患者と同じくらい有効な細胞毒性を発揮することを可能にする。必然的に、遺伝子型としてはMDR1高発現体の患者が、表現型としてはMDR1低発現体と同等になる。
【0158】
MDR1遺伝子の低いか又は高い発現体のアレルの数に従って、個体は、高い輸送能力(ET、2つの高発現体アレル)、中間の輸送能力(IT、一方が高発現体で他方が低発現体のアレル)又は弱い輸送能力(PT、2つの低発現体アレル)のいずれかを有するとして分類することができる。イリノテカンでの治療の開始に先立つ遺伝子検査により、患者をET、IT、又はPTとして分類し、患者のMDR1に関連した輸送能力を予測することができる。不十分な抗がん治療への個別リスクは、MDR1高発現体アレルの数とともに増加する。ET遺伝子型の個体はイリノテカンへの不十分な応答に罹患するリスクが最も高く、薬剤抵抗性腫瘍を発現させるリスクが最も高い。ET患者は、イリノテカンに加えてPGP阻害剤で治療し、有害事象と化学療法に関連した薬剤抵抗性の発現についてより綿密にモニターすべきである。さらに、薬剤抵抗性の腫瘍を発現するリスクがあるこれらの患者は、化学療法の各サイクルの間に腫瘍生検を採取し、引き続き腫瘍細胞を薬剤抵抗性について個別にプロファイリングすることから益する場合がある。
【図面の簡単な説明】
【0159】
【図1】21名のボランティアにおいて、ウェスタンブロット解析により決定した、腸のMDR1発現とエクソン26SNPの相関性を示す。ボックスプロットは、MDR1遺伝子(GenBank 受入番号:M29445)の176位に対応する位置でMDR1 3435C>Tにより集合した、MDR1発現の分布を示す。Tアレルは、p−糖タンパク質のより低い発現に関連していた。
【図2】臨床試験に参加した14名の健常ボランティアにおいて、定常状態でのジゴキシンのピーク血漿レベルをもたらすジゴキシン取込みとMDR1 3435C>Tの相関性を示す[Johne et al., 1999, Clin. Pharmacol. Ther 66: 338-345]。最大ジゴキシンレベルは、T及びCのアレルそれぞれのホモ接合である2群間で統計的に有意に異なっていた(p=0.006,Mann Whitney U検定)。
【図3】2つの独立した実験に由来する、健常ボランティアからの十二指腸生検における、リファンピシン適用の前後でのMRP1 mRNA含量と遺伝子型(wt/wt:1;wt/mut及びmut/mut:2)の相関性を示す。リファンピシンでの処理は、MRP1 mRNA発現に影響を及ぼさなかった(p<0.001,一対t検定)。MRP1遺伝子型のMRP1 mRNAレベルとの関連には強い傾向が検出された(p=0.086,Kruskal−Wallis検定)。
【図4】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図5】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図6】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図7】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図8】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図9】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図10】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図11】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図12】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図13】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図14】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図15】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図16】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図17】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図18】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図19】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図20】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図21】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図22】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図23】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図24】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図25】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図26】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図27】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図28】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図29】がん腫細胞系においてイリノテカン代謝に関連する遺伝子の発現プロフィールを示す。この半定量的RT−PCRは、アンプリコンに対して右に示す遺伝子の転写物の量を示す。PCR産物は、アガロース電気泳動により解析し、臭化エチジウムで染色した。各断片のサイズを左側に塩基対(bp)で示す。
【図30】上皮がん腫細胞系LS174T(結腸)、KB3−1(頚部)、及びRT112(膀胱)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値である。
【図31】上皮子宮頚がん腫細胞系KB3−1と多量のMDR1を発現する2つのサブクローン、KB3−1(MDR1)及びKB3−1(MDR1,CYP3A5)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値と標準偏差である。
【図32】膀胱がん細胞系RT112と、MDR1とより多い量のMRP1を発現するそのサブクローン、RT112(MDR1,MRP1)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値と標準偏差である。
【図33】R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。上皮子宮頚がん腫細胞系KB3−1と多量のMDR1を発現する2つのサブクローン、KB3−1(MDR1)及びKB3−1(MDR1,CYP3A5)について、R−ベラパミルによるMDR1阻害の薬物感受性に対する影響を試験した。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及び、R−ベラパミルは、10μg/ml(+V)の最終濃度となるように加えた。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、2つのウェルの平均値である。
【図34】R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。薬剤抵抗性に対するMDR1の効果を回避するために、細胞をR−ベラパミルで同時に処理した。そのCYP3A5発現において異なるKB3−1(MDR1)とKB3−1(MDR1,CYP3A5)について、MDR1の阻害後に残る抵抗性を試験した。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及び、R−ベラパミルは、10μg/ml(+V)の最終濃度となるように加えた。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、2つのウェルの平均値である。
【0001】
本発明は、イリノテカン(CPT−11)又はその誘導体のようなカンプトテシン薬物の、本発明によるポリヌクレオチドを含む変異アレルのある遺伝子型を有する患者において、がん、特に結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製への使用に関する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルに比べて、変異アレルの発現を改変させるか、又は対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて、変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる。最後に、本発明は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんに罹患している被検者に適正な療法を選択する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
イリノテカンは、細胞傷害性アルカロイド、カンプトテシン(CPT)の半合成類似体であり、これは、東洋の樹木である Camptotheca acuminate より得られる。カンプトテシンは、可逆性の一本鎖断裂を引き起こすことによりDNA中の捩れたひずみを解放するトポイソメラーゼI酵素を特異的に阻害することによって抗新生物活性を示す[D'Arpa, et al., 1989, Biochim Biophys Acta 989: 163-77, Horwitz et al., 1973, Cancer Res 33: 2834-6]。イリノテカンとその活性代謝物、SN−38は、トポイソメラーゼI−DNA複合体へ結合し、これら一本鎖断裂の再連結を妨げる[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンは、カンプトテシン部分とジピペリジノ側鎖の間にあるカルバメート結合のカルボキシルエステラーゼ仲介性の切断によりイリノテカンから生じる、親油性代謝物、SN−38(7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン)の水溶性プロドラッグとして役立つ[Tsuji, et al., 1991, J Pharmacobidyn 14: 341-9]。カルボキシエステラーゼ−2は、薬理学的濃度でこの加水分解に関与する主要酵素である[Humerickhouse, et al., 2000, Cancer Res 60: 1182-92]。トポイソメラーゼ阻害とイリノテカンに関連した一本鎖断裂は、主にSN−38により引き起こされる[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91]。イリノテカンの投与は、齧歯動物由来のがんを担うマウスと様々な組織型のヒトがん異種移植片において抗腫瘍効果をもたらした[Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Giovanella, et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7]。
【0003】
イリノテカンはまた、CYP3A4及びCYP3A5により酸化される[Haaz et al., 1998, Drug Metab Dispos 26: 769-74, Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Rivory, et al., 1996, Cancer Res 56: 3689-94]。SN−38の主要な消失経路はグルクロン酸との抱合であり、対応するグルクロニド(SN−38G)を生じる[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69]。SN−38Gは、腸の微生物叢により脱抱合され、SN−38を生じると報告されている[Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20]。SN−38のグルクロン酸抱合(glucuronidation)は、MRP1及びUGT1A7により仲介される[Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun 260: 199-202]。物質収支試験は、全体投薬量の64%が糞中***され、胆汁***の重要な役割を確認した[Slatter, et al., 2000, Drug Matab Dispos 28: 423-33]。種々の試験は、多剤耐性タンパク質1(MRP1)がイリノテカンとその代謝物の主要な輸送体であり[Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14]、その胆汁***を促進し、そこで副作用を引き起こすが、イリノテカンの***にはP−糖タンパク質も参画する[Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al., 1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]ことを示唆している。
【0004】
カンプトテシンへの細胞抵抗性と、即ち、イリノテカンの治療応答性は、細胞内カルボキシルエステラーゼ活性とトポイソメラーゼIの切断活性に関連付けられてきた[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70]。
【0005】
こうしたカンプトテシン薬物、例えばイリノテカンの使用は、明らかに用量依存性の骨髄抑制と、嘔吐、吐気、腹部疼痛、及び下痢を含む胃腸毒性により制限されていて、これら副作用は致命的となる場合がある。イリノテカン療法の主要な用量制限毒性は下痢であり、これは88%までの患者に起こり、その程度がSN−38グルクロン酸抱合により決定されるSN−38の胆汁***[Gupta, et al., 1994, Cancer Res 54: 3723-5, Gupta, et al., 1997, J Clin Oncol 15: 1502-10]に従属する、腸のSN−38蓄積に依存する[van Ark-Otte, et al., 1998, Br J Cancer 77: 2171-6, Guichard, et al., 1999, Br J Cancer 80: 364-70, Araki, et al., 1993, Jpn J Cancer Res 84: 697-702]。骨髄抑制は、イリノテカンとSN−38の両方の濃度−時間曲線下面積に関連付けられた[Sasaki, et al., 1995, Jpn J Cancer Res 86: 101-10]。
【0006】
イリノテカンは、1997年に5−フルオロウラシル療法へ抵抗性の転移性結直腸がん患者に対して承認されたものの、その治療利益は依然として疑わしいままである。最近、2000名を超える患者が関わる結直腸がんに関する2つの大規模臨床試験が国立がん研究所(NCI)により中止させられたのは、治療の最初の60日間のうちにイリノテカンの毒性に関連した死亡率がほとんど3倍増加したためである。死因は、下痢及び吐気に関連した脱水症状と好中球減少症に関連した敗血症であった[2001, arznei-telegramm 32: 58]。イリノテカンががんそのものに対して有効であることは証明されたが、短期の毒性のために、すべての患者が長期生存の恩恵を受けられるわけではない。従って、イリノテカン毒性に罹患する可能性が最も高い患者を同定することがきわめて望ましい。
【0007】
現在、患者は、はじめは60〜125mg/m2のイリノテカンの標準用量で、他の抗新生物薬と組み合わせて3〜4週投薬のいくつかのクールで投与されるほとんどの治療スケジュールに従って治療され、後続の用量は、治療に対する個々の患者の忍容性に基づいて、25〜50mg/m2の増量で調整される。イリノテカン関連の毒性からの回復のために1〜2週間治療が遅延してよいが、患者が回復しなければ、治療を中断しなければならない。忍容不能な毒性が発現しなければ、患者が治療利益を体験し続ける限りにおいて、追加クールを伴う治療を際限なく継続する。応答率は、腫瘍の種類により、10%未満〜ほぼ90%まで変動する。しかしながら、治療応答を評価し、代替療法を考慮するには少なくとも6〜8週を要する。従って、患者に適正な投与量を見出すことは、単調で、時間の浪費であり、生命を脅かす有害効果のリスクを招くことになる。治療から恩恵を受けない患者がこうしたリスクを受けることは不必要であろうし、さらに、これらの患者が適切な治療を受けないうちに貴重な時間が浪費される。
【0008】
さらに、多くの化学療法剤で観察されるように、療法に対する細胞の耐性を発現するリスクは、細胞がイリノテカンのような化学療法剤へ次善の曝露を受けているときに増加する。
【0009】
胆汁***の阻害剤(例えば、MRP及びP−糖タンパク質)やUGT1A1の誘発剤を用いた薬物動態モジュレーションがカンプトテシン関連毒性を抑制するためのツールとして示唆された[Gupta, et al., 1996, Cancer Res 56: 1309-14, Gupta, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 39: 440-4]。シクロスポリンA及びフェノバルビタールと組み合わせたイリノテカンの臨床試験の予備データは、カンプトテシン関連の下痢を制限することに関してはいくらかの有望な結果を示すが[Ratain, 2000, Clin Cancer Res 6: 3393-4]、シクロスポリンA及びフェのバルビタールのような薬物との併用治療は、有害事象及び薬物相互作用の追加リスクを招く。
【0010】
SN−38及びSN−38Gのいずれの薬物動態にも、おそらくはイリノテカンの代謝経路における患者間の差異に起因する[Rivory, et al., 1997, Clin Cancer Res 3: 1261-6]、大きな患者間の変動性が存在する[Canal, et al., 1996, J Clin Oncol 14: 2688-95]。さらに、ギルバート症候群を有する患者では重篤なイリノテカン毒性が報告されている[Wasserman, et al., 1997, Ann Oncol 8: 1049-51]。必然的に、UGT1A1活性が低い患者ではイリノテカン毒性のリスクが高まるという、イリノテカンの代謝への遺伝素質が示唆されてきた[Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ando, et al., 1998, Ann Oncol 9: 845-7]。UGT1A1プロモーターにおける共通の多型[Monaghan, et al., 1996, Lancet 347: 578-81]が、SN−38の in vitro グルクロン酸抱合に関連付けられ[Iyer, et al., 1999, Clin Pharmacol Ther 65: 576-82]、症例コントロール試験からその可能な臨床使用が示唆された[Ando, et al., 2000, Cancer Res 60: 6921-6]。しかしながら、イリノテカン関連の毒性がUGT1A1遺伝子型により予測されたのは、冒された患者の少数(<15%)でしかなかった。
【0011】
まとめると、カンプトテシンをベースとする療法の治療効果及び安全性を有意に向上させて治療に起因する致命的なことを回避すること、不必要な耐性の発現を回避すること、そして有害事象や治療遅延に関連した入院コストを低下させることは、きわめて望ましいであろう。しかしながら、イリノテカンの毒性を抑制して治療効果を高めるための受容された機序は、現在1つも利用可能でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
このように、本発明の根底にある技術課題は、がん、好ましくは結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの有効な治療のために改善された手段及び方法を提供することであり、それにより上記の望ましくない副作用を回避することができる。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の根底にある技術課題は、特許請求の範囲に特徴づけられる態様により解決される。
従って、本発明は、
(a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む変異アレルがあるゲノムを有する被検者において、がん、特に、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製へのイリノテカン又はその誘導体の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0014】
本発明により使用される用語「イリノテカン又はその誘導体」は、好ましくは、一般構造式:
【0015】
【化1】
【0016】
を特徴とし、米国特許US05106742、US05340817、US05364858、US05401747、US05468754、US05559235、及びUS05663177にさらに記載される物質を意味する。さらに、用語「イリノテカン又はその誘導体」には、カンプトテシンの類似体及び誘導体も含まれる。利用可能なカンプトテシン類似体の種類及び範囲は当業者に周知であり、数多くのテキスト、例えば、[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Burris, et al., 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-55, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7]に記載されている。活性カンプトテシン類似体の具体例は、六環式カンプトテシン類似体、9−ニトロカンプトテシン、9−若しくは10−置換アミノ、ハロゲン、又はヒドロキシル基を有する20S配置のカンプトテシン類似体、7−置換水溶性カンプトテシン、9−置換カンプトテシン、(RS)−20−デオキシアミノ−7−エチル−10−メトキシカンプトテシンのようなE環修飾カンプトテシン、及び10−置換カンプトテシン類似体である[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury, et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107]。同様の治療活性を有する様々な他のカンプトテシン類似体が記載されている[Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Burris and Fields, 1994, Hematol Oncol Clin North Am 8: 333-55, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7]。カンプトテシン類似体を合成するのに適した方法が記載されている[Emerson, et al., 1995, Cancer Res 55: 603-9, Ejima, et al., 1992, Chem Pharm Bull (Tokyo) 40: 683-8, Sugimori, et al., 1994, J Med Chem 37: 3033-9, Wall, et al., 1993, J Med Chem 36: 2689-700, Wani, et al., 1980, J Med Chem 23: 554-60, Kingsbury, et al., 1991, J Med Chem 34: 98-107, Sugasawa, et al., 1976, J Med Chem 19: 675-9]。
【0017】
前記物質は、記載されるように、例えば、結直腸がん、非小細胞及び小細胞肺がん、食道がん、腎細胞がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、扁平細胞がん、白血病、及びリンパ腫に治療上有用であることが知られている[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Hawkins, 1992, Oncology (Huntingt) 6: 17-23, Slichenmyer, et al., 1993, J Natl Cancer Inst 85: 271-91, Slichenmyer, et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: S53-7, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Wiseman, et al., 1996, Drugs 52: 606-23, Gottlieb, et al., 1970, Cancer Chemother Rep 54: 461-70, Negoro, et al., 1991, J Natl Cancer Inst 83: 1164-8, Rowinsky et al., 1994, Cancer Res 54: 427-36]。また、本発明の使用に含まれるのは、化学修飾により得ることができる、上記物質の誘導体であり、ここで前記誘導体は、本発明の使用に治療上同等によく適している。本発明の物質の誘導体が本発明の使用に治療上同等によく適しているかどうかを決定するには、当該技術分野で周知の生物学的アッセイを行うことができる。そうしたアッセイは、例えば、[Kawato, et al., 1991, Cancer Res 51: 4187-91, Furuta, et al., 1988, 癌と化学療法 15: 2757-60, Giovanella, et al., 1989, Science 246: 1046-8, Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto, et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Tsuruo, et al., 1988, Cancer Chemother Pharmacol 21: 71-4, Burris, et al., 1992, J Natl Cancer Inst 84: 1816-20, Friedman et al., 1994, Cancer Chemother Pharmacol 34: 171-4]に記載されている。
【0018】
上記の出版物に記載される化合物はいずれも本発明に使用可能であると考えられる。
イリノテカンは、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの治療に特によく適していることが示されてきた。従って、最も好ましくは、本発明により使用される物質は、イリノテカンである。
【0019】
本明細書に使用される用語「医薬組成物」は、本発明の物質と、場合により1以上の製剤的に許容される担体を含む。本発明の物質は、製剤的に許容される塩として製剤化してもよい。許容される塩は、酢酸塩、メチルエステル、HCl、硫酸塩、塩化物、等を含む。医薬組成物は、薬物投与に慣用的に使用される経路、例えば、経口、局所、非経口、又は吸入により簡便に投与することができる。該物質は、慣用法に従って薬物を標準的な医薬担体と組み合わせることによって調製される慣用の剤形で投与してよい。これらの手順は、諸成分を適宜所望の調製物へ混合、造粒及び圧縮、又は溶解することを伴う場合がある。製剤的に許容される担体又は希釈剤の形状及び特性は、それと組み合わされる有効成分の量、投与の経路、並びに他の周知のパラメータにより指定されると理解される。担体は、製剤の他の成分と融和して、そのレシピエントにとって有害でないという意味で「許容」されなければならない。利用される医薬担体は、例えば、固体でも液体でもよい。固形担体の例は、乳糖、白陶土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、等である。液体担体の例は、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、シロップ、落花生油及びオリーブ油のようなオイル、水、乳濁液、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液、等である。同様に、担体又は希釈剤には、当該技術分野で周知の、単独か又はワックスと混合したモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を含めてよい。本発明による物質は、所望の効果を達成するために様々な手段で投与可能である。前記物質は、単独でか又は医薬調製物として製剤化されて、治療される被検者へ経口、局所、非経口、又は吸入のいずれかで投与可能である。さらに、該物質は、共通の医薬組成物中の又は個別の医薬組成物として他の物質と組み合わせて投与可能である。
【0020】
希釈剤は、上記組合せの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。さらに、医薬組成物若しくは製剤はまた、他の担体、アジュバント、又は無毒、非治療的、非免疫原性の安定化剤、等を含めてよい。治療有効量は、症状又は状態を改善する、本発明による物質の量を意味する。こうした化合物の治療効力及び毒性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な製薬上の方法、例えば、ED50(集団の50%に治療上有効な用量)とLD50(集団の50%に対して致死性の用量)により決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、それは、LD50/ED50の比として表すことができる。
【0021】
投与量方式は、担当医と、他の臨床上の要因により、好ましくは上記の方法のいずれか1つに従って、決定される。医療技術において周知のように、どの患者の投与量も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、一般健康状態、及び同時投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。進行は、定期的な評価によりモニターすることができる。
【0022】
典型的な用量は、例えば、5〜100mgの範囲であってよいが、この例示範囲未満か又はそれを超える用量も、特に上記の因子を考慮すれば、想定される。一般に、医薬組成物の定期的な投与としての治療方式は、1μg〜10mg単位/日の範囲であるべきである。治療方式が連続注入であれば、それはまた、それぞれ1μg〜10mg単位/kg体重/分の範囲であるべきである。進行は、定期的な評価によりモニターすることができる。しかしながら、被検者や投与の形式によって、投与物質の量は、体表m2あたり約1mg〜約500mg、通常20〜200mgを提供するために、広い範囲にわたり変動してもよい。
【0023】
本明細書に言及される医薬組成物及び製剤は、本発明の使用により少なくとも1回投与される。しかしながら、前記医薬組成物及び製剤は、1回より多く、例えば週1回、隔週〜非限定的数の週まで投与してよい。
【0024】
本発明による物質の特定の製剤は、製剤技術の分野で周知のやり方で調製され、通常、本明細書の上記に言及される少なくとも1つの活性物質を、混合物中に含むか、又は製剤的に許容される担体若しくは希釈剤と一緒にする他のやり方で含む。そのような製剤を作製するには、通常、活性物質を担体と混合するか又は希釈剤により希釈する、あるいはカプセル、サシェ、カシェ、紙、又は他の好適な容器若しくはビヒクルに封入するか又は被包化する。担体は、固体、半固体、ゲルベース若しくは液体の材料であってよく、有効成分には、ビヒクル、賦形剤、又は媒体として役立つ。前記好適な担体は、上記のものと、当該技術分野に周知の他のものを含む。例えば、「レミントン製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストン、を参照のこと。製剤は、錠剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、懸濁液剤、等の形態を含む投与の様式に利用することができる。
【0025】
投薬上の奨励事項を、間違った薬物を間違った患者へ間違った用量で処方することを回避する情報とともに製品ラベルに示しておけば、考慮される患者群に応じた用量調整を処方者が予め行うことができる。
【0026】
用語「治療する」は、治療された被検者又は疾患集団における、疾患症状の緩和、即ち、症状の退縮又はそのような症状の進行阻害を意味する。前記疾患の緩和は、疾患に随伴する臨床症状(例えば、腫瘍サイズ)の度合いによりモニターすることができる。本発明は治療される患者の100%において有効ではないかもしれないが、統計的に有意な(p値は0.05以下)数の患者を治療するのに有効である。前記の被検者数が有意であるかどうかは、スチューデントのt検定、χ2検定、MannとWhitneyによるU検定、Kruskal−Wallis検定(H検定)、Jonckheere−Terpstra検定、又はWilcoxon検定のような統計検定により判定することができる。
【0027】
本発明にはまた、米国特許、US05106742、US05340817、US05364858、US05401747、US05468754、US05559235、及びUS05663177にある医薬組成物に関連して記載されるすべての態様が含まれる。
【0028】
用語「結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん」は、がんに関連した疾患及び調節異常を含む。本発明の使用に含まれる好ましい疾患は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんである。前記疾患及び調節異常は、当該技術分野で周知であり、随伴症状が例えば「ステッドマン」のような標準の教科書に記載されている。
【0029】
本発明の意味で使用される用語「被検者」は、動物、好ましくは本明細書において以下に特定されるもの、及びヒトを含む。
本明細書に使用される用語「変異アレル」は、本明細書において以下に記載される、MRP1遺伝子に対応する1以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。それぞれの個別被検者は、MRP1遺伝子の少なくとも2つのアレルを保有し、ここで前記アレルは、識別可能であるか又は同一である。本発明の使用によれば、変異アレルは、本明細書において以下に特定される少なくとも1以上のポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、第一の変異アレルの調節又は機能に対して相乗的な影響を及ぼす場合がある。好ましくは、本発明の使用による変異アレルは、本明細書において特定される少なくとも2つのポリヌクレオチドを含む。
【0030】
本発明の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」又は「ポリペプチド」は、本発明の使用により特定されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの様々な変異体を意味する。前記変異体は、本明細書において特定されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの基準(reference)又は野生型配列、及び構造又は組成においてそれと異なる変異体を含む。ポリヌクレオチドについての基準若しくは野生型配列は、Genbank受入番号:GI:8850235、GI:11118740、GI:10281451、GI:11177452、GI:10281451、GI:6706037、U91318、GI:7209451、AC026452、AC003026、U91318、AF022830、GI:7209451、AC026452、AC003026、AC025277、AF022828、AF022829、AF022831、U07050、AC003026、AC002457、AC005068、M29445、及びGI:11225259であるか、又はポリペプチドについては受入番号(Pid No):G8850236、G2828206、G2506118、及びG12644118である。構造又は組成における差異は、通常、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加、及び/又は欠失により生じる。
【0031】
好ましくは、本発明の使用により言及される前記ヌクレオチド置換、付加、又は欠失は、ポリヌクレオチドの対応アミノ酸に1以上の変化をもたらす。変異ポリヌクレオチド又はポリペプチドはまた、前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドの断片を含む。このポリヌクレオチド又はポリペプチド、及びその上記断片は、例えば、不十分な、及び/又は改変した薬物取込みを含む、MRP1機能不全又は調節異常に関連することを特徴とする。本発明による好ましい欠失は、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置でのT又はATの欠失であり、好ましい挿入は、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置でのTCCTTCC、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置でのTGGGGCの挿入である。
【0032】
本発明にはまた、WO9957322、WO0109183、又はUS5786344にあるポリヌクレオチドに関連して記載されるあらゆる態様が包含される。
本明細書に使用される用語「ハイブリダイズする」は、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する、上記ポリヌクレオチド又はその部分へハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを意味する。従って、前記ハイブリダイズするポリヌクレオチドも前記機能不全及び調節異常に関連する。好ましくは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する上記ポリヌクレオチド又はその部分へハイブリダイズすることが可能な前記ポリヌクレオチドは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連するポリヌクレオチド又はその部分と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%、又は少なくとも100%同一である。故に、前記ポリヌクレオチドは、RNA調製物のノーザンブロット解析又はDNA調製物のサザンブロット解析におけるプローブとして有用であり得るか、又はそのそれぞれのサイズに応じて、PCR解析におけるオリゴヌクレオチドプライマーとして使用可能である。また、本発明の使用にしたがい含まれるのは、例えば電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によりDNA−タンパク質相互作用を解析するのに有用である、ハイブリダイズするポリヌクレオチドである。好ましくは、前記ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、長さが少なくとも10、より好ましくは少なくとも15のヌクレオチドを含むが、プローブとして使用されるハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましくは、長さが少なくとも100、より好ましくは少なくとも200、又は最も好ましくは少なくとも500のヌクレオチドを含む。
【0033】
当該技術分野では、核酸分子を用いたハイブリダイゼーション実験の実施方法は周知であるので、当業者には、本発明にしたがいどのようなハイブリダイゼーション条件を使用すべきかがわかる。こうしたハイブリダイゼーション条件は、「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」コールドスプリングハーバーラボラトリー(1989)N.Y.のような標準の教科書に言及されている。本発明の使用にしたがい好ましいのは、MRP1の機能不全又は調節異常に関連する上記ポリヌクレオチド又はその部分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることが可能である、即ち、本発明のMRP1ポリペプチドとは異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのような関連のないポリヌクレオチドへは交差ハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドである。
【0034】
さらに、被検者が本明細書の上記により言及されるポリヌクレオチドを含むかどうかを決定する方法は、当該技術分野で周知である。前記方法を行うには、単離細胞又は組織のような生体材料を含む試料を前記被検者から取ることが必要であろう。さらに、当該技術分野で公知の方法は、例えば、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術を含む。1以上の上記特定ポリヌクレオチドが存在するか否かを決定するために使用すべき好ましくて簡便な方法は、被検者から血液細胞を単離して、その血液細胞から単離されるゲノムDNAについてPCRベースのアッセイを実施し、それにより、PCRを使用して、本明細書の上記に特定される前記ポリヌクレオチド又はその部分が存在しているか又は非存在であるかを決定することである。前記方法は、以下及び「実施例」において、より詳しく記載する。
【0035】
本明細書に使用される用語「対応する」は、ある位置が、それぞれ前述のヌクレオチド及びアミノ酸の番号だけでは決定されないことを意味する。欠失、置換されているか、又は1以上の追加ヌクレオチドを含む場合がある、本発明の使用による所定のヌクレオチド又はアミノ酸の位置は、遺伝子又はポリペプチドの他の場所での欠失やヌクレオチド又はアミノ酸の付加により変動する場合がある。従って、本発明による「対応する位置」では、ヌクレオチド又はアミノ酸が指定の番号においては異なるかもしれないが、それでも類似の隣接ヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合があると理解すべきである。交換されているか、欠失されているか、又は追加のヌクレオチド又はアミノ酸を含む場合がある、前記ヌクレオチド又はアミノ酸も、用語「対応する位置」により含まれる。前記ヌクレオチド又はアミノ酸は、例えば、その隣接物と一緒に、遺伝子発現の調節、対応するRNAの安定性、又はRNA編集に関与し得る配列を生じるとともに、本発明のタンパク質の機能性ドメイン若しくはモチーフをコードする場合がある。
【0036】
例えば、「17970位〜17970位」は、前記ポリヌクレオチドが、17970位と前記ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの17970位との間で欠失している1以上の欠失ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、必要な変更を加えて、同じフォーマットで作成される上記態様において言及される他のすべての位置へ適用される。
【0037】
例えば、「1222位/1223位」は、前記ポリヌクレオチドが、1222位と前記ポリヌクレオチドの対応する野生型バージョンの1223位との間に挿入される1以上の追加ヌクレオチドを含むことを意味する。同じことが、必要な変更を加えて、同じフォーマットで作成される上記態様、即ち、スラッシュ(/)により分離された2つの連続した位置番号において言及される他のすべての位置番号へ適用される。
【0038】
本発明により、MRP1遺伝子の遺伝変異(MRP1遺伝子の異なるアレル)の形式及び集団分布が、多くの異なる個体に由来するヒトの前記遺伝子の関連領域の配列解析により解析されている。MRP1遺伝子を含む、あらゆる遺伝子の個々の遺伝子構成をもつ個体のゲノムDNAが個体の血液試料から容易に精製可能であることは、周知の事実である。そこで、これらの個別DNA試料を使用して、該血液試料を提供した個体中に存在するMRP1遺伝子のアレルの配列組成を解析する。配列解析は、前記遺伝子の関連領域のPCR増幅、次にPCR産物の精製、それに続く、確立した方法(例えば、ABIダイターミネーターサイクル配列決定法)での自動化DNA配列決定により行った。
【0039】
ヒト血液ゲノムDNA由来のPCR産物の直接DNA配列決定により個々の遺伝子型を決定し、MRP1遺伝子の新規変異体を同定する試みにおいて考慮しなければならない1つの重要なパラメータは、それぞれのヒトが(通常、ごくわずかな異常な例外を除き)それぞれの常染色体遺伝子に2つの遺伝子コピーをもつ(二倍性)という事実である。そのために、配列の評価においては、ホモ接合配列変異だけでなくヘテロ接合変異も明白に同定することができるように十分配慮しなければならない。MRP1遺伝子の多型(ホモ接合及びヘテロ接合)の同定及び特性決定における異なる工程の詳細は以下の「実施例」に記載する。
【0040】
過去20年にわたり、遺伝的不均一性は、薬物応答における変動の重要な根源としてますます認識されている。多くの科学通信(Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 及び West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648)は、ある薬物がある患者では他の患者よりよく効くか、又はきわめて有毒になる場合さえあり、薬物に対する患者の応答のそのような変動は、分子ベースのことに相関している可能性があることを明瞭に示している。この「ゲノム薬理」の概念は薬物への応答と患者の遺伝子プロフィールとの間の相関性に注目する(Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252)。薬物療法に関する集団変異の背景において、ゲノム薬理は、特定薬物に対して副作用を伴わずに応答することができる患者の同定及び選択に有用なツールとして提唱されてきた。この同定/選択は、例えば患者の血液中の白血球由来DNAの遺伝子型を決定することによる遺伝的多型性の分子診断と疾患の特性決定に基づいてよい(Bertz, Ckin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103)。米国の健康維持組織や多くのヨーロッパ諸国の政府医療サービスのような医療の創設者にとって、このゲノム薬理学のアプローチは、医療を改善することと、不要な医薬品の開発、無効な医薬品、及び薬物投与による副作用により引き起こされる、医療に関連したコストを削減することの両方の方法になり得る。
【0041】
本発明の変異遺伝子における突然変異は、アミノ酸の欠失、挿入、及び特に置換を、単独又は組み合わせてもたらすことがある。当然ながら、野生型や他の突然変異型においてそのような突然変異を遺伝子工学的にもたらすことも可能である。前記遺伝子のDNA配列にそうした修飾を導入する方法は当業者に周知である;例えば、Sambrook,「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」、コールドスプリングハーバーラボラトリー(1989)N.Y.を参照のこと。
【0042】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列における改変の種類の検討には、インターネットから入手可能であるBRASMOLのようなプログラムが使用可能である。さらに、他の適正なコンピュータ・プログラムを使用して、折り畳みのシミュレーションや構造モチーフのコンピュータ再設計を行うことができる(Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679)。詳細なタンパク質モデルのコンホメーションやエネルギーの解析にコンピュータが使用可能である(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45)。これらの解析は、特別な突然変異が薬物の代謝、結合、阻害、治療作用の仲介、及び/又は輸送に及ぼす影響の同定に使用することができる。さらに、本発明の使用において特定されるポリペプチドによりコードされるポリペプチドの改変された構造に関する知識に基づいて、より効率的に代謝、修飾、輸送、消失、及び/又は結合させることができる、上記に言及される物質の誘導体を設計して合成することができる。それにより、本明細書に言及される物質に基づいて、本発明の1以上のポリヌクレオチドの存在を特徴とする遺伝子型を有する被検者における結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんの治療により有効である薬物又はプロドラッグを設計することができる。
【0043】
通常、本発明の使用により言及されるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の前記アミノ酸の欠失、付加、又は置換は、1以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失、又はこれらの組合せによる。好ましくは、前記ヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失は、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへ、433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又は723位に対応する位置でArgからGluへのMRP1遺伝子のアミノ酸置換をもたらす場合がある。本明細書に記載の使用により言及されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により言及される突然変異により改変された生物学的特性を有する。前記改変された特性の例は、実効化され得るポリペプチドの安定性又はポリペプチドの量であり、例えば、改変された薬物代謝又は改変された薬物輸送又は改変された基質特異性又は改変された触媒活性(例えば、薬物代謝の不足や薬物を代謝する能力の完全な喪失、又は薬物を代謝する能力の亢進を特徴とする)、又は改変された輸送活性(例えば、薬物輸送の不足や薬物を輸送する能力の完全な喪失を特徴とする)、又は改変された基質結合性(例えば、改変された薬物作用を特徴とする)、又は改変された輸送の阻害若しくは誘導、又は受容体や他の標的分子への改変された結合性(例えば、シグナル伝達経路の改変された活性化を特徴とする)、又は改変されたタンパク質若しくは酵素機能をもたらす。これらの改変された特性は、本発明の使用により治療される被検者の、上記に言及される物質への損なわれた薬理学的応答をもたらす。さらに、本明細書に特定される変異アレルによりコードされるポリペプチドの前記改変された特性により、該物質は、被検者にとって危険又は有害であるか、又は望ましくない副作用を引き起こす物質の誘導体をもたらすように化学修飾される場合がある。
【0044】
本発明により検出されるMRP1遺伝子中の突然変異を表1及び2に列挙する。当業者に明らかであるように、本明細書に特定されるポリヌクレオチドに関する遺伝的知識を使用して、患者の遺伝子型を正確で信頼し得るほどに特性決定することができる。
【0045】
有利には、イリノテカン又はその誘導体に基づいた予防若しくは治療の手段は、前記遺伝的知識を考慮するときに、より有効に適用することができる。被検者の遺伝子構成に関する知識により、前記物質の望ましくない副作用は回避することができて、有効であるが有害ではない投与量を個別に計算することができる。さらに、上記によれば、ある既定の薬物が異常な効果を引き起こす症例において、被検者の個別の遺伝子構成に関する知識に基づいて適切な個別の療法を設計することができる。この個別設計(tailored)療法は、治療耐性の出現を回避するにも適しているだろう。前記耐性は、様々な化学療法剤を用いるがん化学療法における1つの重大な問題であり、このことは当該技術分野で周知である。故に、本発明の使用は、本明細書の上記に言及される物質の既知の治療上望ましい効果に基づいた治療適用の改善をもたらすが、これは前記物質の適正な投与量及び/又は適正な誘導体で被検者を個別に治療することが可能だからである。それにより、望ましくない、有害又は有毒な効果が有効に回避される。さらに、本発明の使用は、本明細書の上記に言及される物質の既知の治療上望ましい効果に基づいた治療適用の改善をもたらすが、これは、前記物質を用いた療法から利益を受ける可能性が最も高い被検者を薬物療法の開始に先立って同定し、そういう患者だけを前記物質の適正な投与量及び/又は適正な誘導体で治療することが可能だからである。それにより、前記物質を用いた治療に反応しない被検者(無応答者)の不要で潜在的に有害な治療と、次善の薬物投薬による薬剤耐性の発現を回避することができる。
【0046】
本発明により、驚くべきことに、MRP1遺伝子に対応する変異アレルがイリノテカン又はその誘導体の投与に対する前記被検者の薬理学的応答を改変させることを見出した。故に、本発明の使用により、本明細書に言及される疾患及び障害をより有効に治療することができて、それによる前記療法の手段は被検者にとってより簡便である。さらに、本明細書の上記に言及される物質の投与を含む治療手段の適用可能性を効率的に予測することができる。
【0047】
本発明の使用の好ましい態様において、前記変異アレルは:
(a)配列番号181、209、217、205、277、281、301、325、229、193、313、293、又は253のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381、440、1625位、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1625位に対応する位置にA、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む。
【0048】
より好ましくは、前記変異アレルは:
(a)配列番号209、205、277、281、301、又は325のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;並びに
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む。
【0049】
上記になされた用語の説明及び解釈は、必要な変更を加えて、適用することができる。
本発明はまた:
(a)本明細書に言及されるポリヌクレオチドを含む変異アレルが存在するか否かを決定すること;及び
(b)治療に有効な投与量のイリノテカンを被検者へ投与すること
を含む、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療する方法に関する。
【0050】
本発明の使用に従って使用される定義は、必要な変更を加えて、上記の方法へ適用される。さらに、本発明の使用により記載されるすべての態様は、必要な変更を加えて、本発明の方法へ適用してよい。さらに、本発明の方法にまた含まれるのは、当業者がその知識と本明細書全体で言及される文書のような先行技術に基づいて造作なくなし得る前記方法のさらなる発展のすべてである。
【0051】
本発明の使用の好ましい態様において、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルに比べて、変異アレルの発現を改変させる。上記に論じたように、本発明の使用により言及されるアレルは、MRP1遺伝子に対応する。当該技術分野では、遺伝子がアミノ酸配列をコードする構造要素だけでなく、前記遺伝子の発現の調節に関与する調節要素を含むことが周知である。構造要素は、アミノ酸配列をコードするか、又はアミノ酸配列をコードしないが、それでも、例えばRNAの安定性やRNAの核内輸送を調節することによってRNA機能に関わるRNAをコードする場合があるエクソンにより表される。
【0052】
遺伝子の調節要素は、プロモーター要素又はエンハンサー要素を含む場合があり、このいずれも遺伝子発現の転写制御に関わる可能性がある。当該技術分野では、プロモーターが遺伝子の構造要素の上流に見出されることが周知である。しかしながら、エンハンサー要素のような調節要素は、遺伝子の座全体にわたり分布していることがわかる場合がある。前記要素は、例えば、イントロン、つまり遺伝子のエクソンを分離するゲノムDNAの領域に存在する場合がある。プロモーター若しくはエンハンサー要素は、前記プロモーター若しくはエンハンサー要素を含む遺伝子の調節に関与するポリペプチドを誘引又は結合することが可能であるポリヌクレオチド断片に対応する。例えば、前記遺伝子の調節に関与するポリペプチドは、いわゆる転写因子を含む。
【0053】
前記イントロンは、適切な遺伝子発現に必要とされるさらなる調節要素を含む場合がある。イントロンは、通常、遺伝子のエクソンと一緒に転写され、エクソンとイントロンの両方の配列を含有する新生(nascent)RNA転写物を生じる。イントロンにコードされるRNA配列は、通常、RNAスプライシングとして知られるプロセスにより除去される。しかしながら、前記プロセスはまた、RNA転写物上に存在する調節配列を必要とし、前記調節配列はイントロンによりコードされる場合がある。
【0054】
さらに、転写制御と適切なRNAプロセシング及び/又は安定性の制御における機能の他に、遺伝子の調節配列は、遺伝子座の遺伝的安定性の制御にも関与する場合がある。前記要素は、例えば、組換え事象を制御するか、又はDNAのある種の構造や染色体中のDNAの配置を維持するのに役立つ。
【0055】
故に、一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)は、上記のようにアミノ酸配列をコードする遺伝子のアレルのエクソン中だけでなく、上記に論じたプロセスに関与する調節領域中でも起こり得る。本発明の使用により言及されるポリヌクレオチドに含まれる多型は、MRP1遺伝子の亢進又は抑制された発現、遺伝子のRNA転写物の安定化、及び一次RNA転写物のプロセシングの改変を伴う機序によりMRP1タンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことができる。
【0056】
その野生型対照物へ比較したときの変異アレルの発現の改変を決定する方法は、当該技術分野で周知であり、特に本明細書の上記に言及したもの、例えば、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖コンホメーション多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術を含む。野生型及び変異体のアレルの発現レベルをそれぞれ決定するための前記方法を実施するに先立って、単離細胞又は組織のような生物学的材料を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。本発明の使用による「発現の改変」は、野生型アレルの発現が変異アレルの発現と有意に異なることを意味する。有意差は、スチューデントのt検定、χ2検定、又はMannとWhitneyによるU検定といった標準の統計手法により決定してよい。さらに、当業者は、上記や当該技術分野で知られた他の統計手法を個別に造作なく採用してよい。
【0057】
本発明の使用のより好ましい態様において、前記発現の改変は、発現の増加又は低下である。
本発明に言及されるアレルの発現が、対応する野生型アレルに比べて増加しているか又は減少しているかを決定するには、PCRベースの技術、PFLPベースの技術、DNA配列決定をベースとする技術、ハイブリダイゼーション技術、一本鎖コンホメーション多型(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、ミスマッチ切断検出、ヘテロ二本鎖解析、質量分析法に基づいた技術、HPLCベースの技術、プライマー伸長をベースとする技術、及び5’−ヌクレアーゼアッセイをベースとする技術のような周知の方法を適用してよい。上記に論じたように、本発明の使用において言及される変異アレルの発現レベルを決定するには、細胞又は組織を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。発現の減少又は増加は、上記アッセイにおける変異体対野生型のアレルの発現レベルの有意差を特徴とする。変異アレルの検出可能発現の非存在も、発現低下に含まれる。
【0058】
本発明の使用のさらに好ましい態様において、前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換は、対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて、変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる。
【0059】
上記に論じたように、本明細書に特定され、MRP1遺伝子のコード領域に対応するポリヌクレオチドを含む変異アレルは、前記変異アレルによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼす。故に、変異ポリペプチドは、その対応する野生型対照物に比べて、改変した生物学的及び/又は免疫学的特性を示す。本発明の使用による好ましい変異ポリペプチドは、改変された生物学的活性(即ち、低下、亢進、又は完全に喪失した触媒活性をもたらす改変された酵素機能、又は低下、亢進、又は完全に喪失した輸送機能をもたらす改変された輸送機能、又は、シグナル伝達経路の改変された活性化、又は輸送体若しくは酵素の機能の阻害を改変させる、受容体や他の薬物標的への改変された結合性)を示すものである。野生型及び変異体のポリペプチドの活性をそれぞれ決定するための前記方法を実施するに先立って、単離細胞又は組織のような生物学的材料を含む試料を被検者から入手することが必要であろう。変異ポリペプチドがその野生型の対応する対照物に比べて活性又は発現レベルが改変されているかどうかは、当該技術分野で周知の標準技術により決定することができる。そのような標準技術は、例えば、ELISAベースのアッセイ、RIAベースのアッセイ、HPLCベースのアッセイ、質量分析法をベースとするアッセイ、ウェスタンブロット解析、又は、MRP1について当該技術分野で知られ、[Keppler, et al., 1997, Biol Chem 378: 787-91, Suzuki, et al., 1994, Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res 22: 83-9, Scheffer, et al., 2000, Cancer Res 60: 5269-77, Konig, et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1461: 377-94, Kool, et al., 1997, Cancer Res 57: 3537-47, Bakos, et al., 2000, Mol Pharmacol 57: 760-8, Keppler, et al., 1998, Chem Biol Interact 112: 153-61, Leier, et al., 2000, Kidney Int 57: 1636-42, Evers, et al., 2000, Br J Cancer 83: 366-74, Evers, et al., 2000, Br J Cancer 83: 375-83]に記載されているアッセイを含む場合がある。
【0060】
本発明の使用による「活性の改変」は、野生型ポリペプチドの活性が変異ポリペプチドから有意に異なることを意味する。有意差は、上記に言及される標準的な統計手法により決定することができる。
【0061】
最も好ましくは、前記活性の改変は、活性の低下又は増加である。
発現の増加又は減少について論じたように、活性の減少又は増加は、本明細書に言及されるアッセイにおける、野生型ポリペプチドに対する変異体の活性の有意差を特徴とする。変異アレルの検出可能な活性の非存在も、減少した活性に含まれる。
【0062】
さらに、本発明の使用のさらに好ましい態様において、前記被検者は動物である。
上記のように、本発明の使用による被検者には動物が含まれる。本明細書に使用される用語「動物」にはすべての動物、好ましくは脊椎動物科に属する動物、より好ましくは哺乳動物が含まれる。さらに、動物は、遺伝子導入(transgenesis)及び相同的組換えを含む周知の技術により遺伝子工学的に処理し、上記に言及される1以上のポリヌクレオチドを前記動物のゲノムへ取込ませてよい。遺伝子工学処理動物を含む前記動物は、本明細書に言及される物質又はその誘導体、好ましくはイリノテカンに基づいた薬物又はプロドラッグの薬理学的効果を研究するために使用することができる。
【0063】
上記により、最も好ましくは、前記動物はマウス又はラットである。前記動物は、Giovanella, et al., 1991, Cancer Res 51: 3052-5, Kunimoto et al., 1987, Cancer Res 47: 5944-7, Kaneda, et al., 1990, Cancer Res 50: 1715-20 に詳しく記載されるように、本発明の使用により言及される物質又は誘導体の薬理特性をアッセイするのに特によく適している。
【0064】
好ましくは、前記マウスは、機能性MRP1を欠いている。当該技術分野では、機能性シトクロムP450、MRP1、又はMDR1を欠く前記マウスがいかにして入手可能であるかが周知である。例えば、前記マウスは、MRP1については Rappa, et al., 2000, Biochemistry 39: 3304-10, Schinkel, 1998, Int J Clin Pharmacol Ther 36: 9-13, Schinkel, et al., 2000, Pharmacogenetics 10: 583-90 に記載されるように相同的組換えにより産生してよい。
【0065】
さらに、本発明の使用の別の好ましい態様において、前記被検者はヒトである。
特に、本発明は、上記から明らかであるように、ヒトへ適用可能である。本発明の使用は、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん罹患患者において副作用を治療又は予防するために適用することが可能である。上記の物質又はその誘導体の薬理効果はヒトにおいて周知である。しかしながら、従来の療法は患者の個別の遺伝子組成を考慮しない。人種集団は異なる遺伝的背景を有し、それは変異アレルの機能又は調節に影響を及ぼし、それにより、本発明による薬物又はプロドラッグの基礎として使用される物質又は誘導体に対する患者の薬理学的応答を改変させる場合がある。
【0066】
上記のことに照らし、最も好ましくは、前記ヒトがアフリカ人又はアジア人である。
アジアの人口集団(16%)は、白人(39%)に比べて、より低い頻度のUGT1A1低発現体(low expressor)遺伝子型(UGT1A1遺伝子(受入番号:GI:11118740)の174990〜174993位に対応する位置でのホモ接合野生型)を示すので、イリノテカン毒性に罹患する可能性がより少ない。一方、このアレルは、アフリカ人(43%)においてより一般的であるが、彼らは、そのホモ接合遺伝子型が7%で起こる別の低発現体のアレル(UGT1A1遺伝子(受入番号:GI:11118740)の174989/174990位に対応する位置でのTA挿入)を追加的に有する。故に、アフリカ人は、イリノテカン関連の有害事象により感受性がある([Beutler, et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95: 8170-4, Lampe, et al., 1999, Pharmacogenetics 9: 341-9, Hall, et al., 1999, Pharmacogenetics 9: 591-9]からの人口頻度データ)。
【0067】
本発明はまた、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がん罹患患者に適正な療法を選択する方法に関し、前記方法は:
(a)被検者から入手した試料中の前記被検者のゲノムにおける上記に言及される変異アレルが存在するか否かを決定すること;及び
(b)(a)で得られた結果に基づいて前記被検者に適正な療法を選択すること
を含む。
【0068】
上記になされた用語の定義及び説明は、必要な変更を加えて、上記の方法へ適用される。
本明細書に使用される用語「適正療法」は、本発明により物質が選択され、前記物質が一定の投与量で被検者へ投与されることを意味し、ここで前記物質と前記投与量は、本明細書の使用により言及される変異アレルが存在するか否かに関する知識に基づいて選択される。前記物質と該物質の前記投与量は、一方では、それらが結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するのに最も有効であるように、他方では、それらが有毒又は望ましくない副作用を引き起こさないように選択される。
【0069】
上記から明らかであるように、適正療法を選択するための前提条件は、本発明の使用により言及される変異アレルが存在するか否かに関する知識である。故に、本発明の方法には、前記被検者から入手した試料における前記変異アレルが存在するか否かの決定が含まれる。被検者により入手される試料は、単離細胞又は組織のような、前記変異アレルが存在するか否かの決定に適している生物学的材料を含む。本発明の方法の変異アレルが存在するか否かの決定の方法は、本明細書の上記に言及される方法を含む。
【0070】
本発明の方法により、被検者、好ましくは、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんに罹患しているヒトへの適正療法を効率的に選択することが可能である。それにより、誤った医薬品に基づいた患者の誤った治療と、がん療法への耐性の発現のようなその結果、及びそれに続く医療費の増加を有効に回避することができる。さらに、高リスクである患者は、初回投薬に先立って治療から除外することが可能である、及び/又は、薬物療法の開始に先立って、投与量を個人の遺伝子組成に従って調整することが可能である。また、上記輸送体遺伝子(例、MRP1)の阻害剤を、遺伝的に規定される患者亜集団に適用してもよい。このように、時間浪費の高額な薬物モニタリングをベースとする用量決定をせずに、有害効果を回避して、最適な薬物レベルにより速やかに達することができる。これにより、疾患の医療コストと間接コストを抑えることができる(例えば、患者の入院の期間短縮と頻度低下)。
【0071】
本発明には以下の27項も含まれる。上記になされた定義と説明は、必要な変更を加えて、以下の特許請求の範囲を特徴付けるために使用される用語へ適用される。
1. がん罹患患者を治療するためにイリノテカンを使用する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルをがん性組織に有するかどうかを決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。
【0072】
2. がんが、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんである、第1項に記載の方法。
3. (a)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が毒性を避けるために減らされる;又は
(b)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が効力を高めるために増やされる、第2項に記載の方法。
【0073】
4. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にある、第3項に記載の方法。
5. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のコード領域にある、第3項に記載の方法。
【0074】
6. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にもコード領域にもない、第3項に記載の方法。
7. 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域とコード領域の両方にある、第3項に記載の方法。
【0075】
8. 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、第3項に記載の方法。
【0076】
9. 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号181、209、217、205、277、281、301、325、229、193、313、293、又は253のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381、440、1625位、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1625位に対応する位置にA、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;並びに
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、第8項に記載の方法。
【0077】
10. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、第8項に記載の方法。
11. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、第8項に記載の方法。
【0078】
12. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、第9項に記載の方法。
13. 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、第9項に記載の方法。
【0079】
14. 患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含む、患者がイリノテカンを用いた治療に対して中毒反応のリスクがあるかどうかを決定する方法。
【0080】
15. 患者へ投与するイリノテカンの量を減らすことをさらに含む、第14項に記載の方法。
16. がん罹患患者へイリノテカンを投与するための最適治療方式を決定する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、イリノテカンの量を、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やすか又は減らすことを含む、前記方法。
【0081】
17. MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より低いので、イリノテカンへの高い感受性を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、減らした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
【0082】
18. MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より高いので、イリノテカンへの耐性又は耐性素質を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、増やした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
【0083】
19. 耐性又は耐性素質を示す変異アレルを有する患者をMRP1阻害剤で治療する、第18項に記載の方法。
20. MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、第19項に記載の方法。
【0084】
21. MRP1遺伝子産物のがん性細胞における発現レベルの変化をアッセイすることによって治療の間に患者をモニターすることをさらに含み、それによりMRP1遺伝子産物の発現レベルの増加を、患者へ投与するイリノテカンの量の増加により補填する、第17項に記載の方法。
【0085】
22. 患者においてがんを治療する方法であって、有効量のイリノテカンを該患者へ体内投与することを含み、ここで治療方式は、患者のMRP1遺伝子の遺伝子型に基づいて変更される、前記方法。
【0086】
23. がんに罹患している患者の集団を治療する方法であって:
(a)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを、患者一人一人のベースで決定すること;
(b)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。
【0087】
24. がん罹患患者においてイリノテカンへの感受性を予測する方法であって、該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含み、該アレルはがん性細胞が少量又は多量のMRP1遺伝子産物を発現することを示し、それにより低い発現はイリノテカンへの高い感受性を示し、高い発現はイリノテカンへの耐性又は耐性素質を示す、前記方法。
【0088】
25. 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者をMRP1阻害剤で治療する、第24項に記載の方法。
26. MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、第25項に記載の方法。
【0089】
27. 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者を、がん性細胞におけるMRP1遺伝子産物の発現レベルをアッセイすることによって、治療の間にモニターする、第26項に記載の方法。
【0090】
本明細書の上記に言及される「発現低下」には、機能性遺伝子産物をコードする転写物の有意に減少した量だけでなく、活性を有さないか又は有意に減少した活性を有する遺伝子産物をコードする転写物の正常量又は上昇量さえ含まれる。
【0091】
「MDR1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して」は、遺伝子型を考慮せずにその必要な患者へ標準量が定常的に投与されることを意味する。そうした一般的な患者の集団は、正常な遺伝子型、即ち野生型の遺伝子型を有するとみなされる。
【0092】
さらに、本発明には、MRP1の発現レベル(以下、発現プロフィールと呼ぶ)、又はMRP1タンパク質のタンパク質レベル(以下、タンパク質プロフィールと呼ぶ)、又は前記タンパク質の活性レベル(以下、活性プロフィールと呼ぶ)を決定することを含む、療法を改善及び/又は変更する方法が含まれる。
【0093】
本発明の文脈において言及される用語「発現レベル」は、PLA2のようなハウスキーピング遺伝子の転写物の量に対する、検出可能量のMRP1遺伝子の転写物の検出可能な量を意味する。転写物の量は、ノーザン解析、RNAアーゼ保護アッセイ、Taq−Man解析を含むPCRベースの技術を含む、標準的な分子生物学の技術によって決定することができる。好ましくは、この決定は、付帯の実施例4及び5に記載のように行ってよい。用語「発現プロフィール」は、MRP1遺伝子の発現レベルを決定し、該発現レベルを基準標準品と比べることを意味する。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織より転写物を入手する。
【0094】
用語「タンパク質レベル」は、PLA2のようなハウスキーピング遺伝子によりコードされるタンパク質の量に対する、検出可能量のMRP1を意味する。タンパク質の量は、ウェスタン解析、ELISA、RIA、又は当該技術分野で知られる他の抗体ベースの技術のような標準的な生化学の技術により決定することができる。用語「タンパク質プロフィール」は、上記タンパク質のパネルのタンパク質レベルを決定し、該タンパク質レベルを基準標準品と比べることを意味する。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織よりタンパク質を入手する。
【0095】
用語「活性レベル」は、(例えば、MRP1遺伝子の対応する野生型アレルによりコードされるタンパク質の)好適な基準標準品に比べた活性に対する、本発明に開示されるこれら遺伝子のアレル変異体によりコードされるMRP1の検出可能な生物学的活性を意味する。上記タンパク質についての生物学的アッセイは当該技術分野で周知であり、Hallo et al., Anticancer Res. 1998, 18: 2981-7 に記載されている。基準標準品として、好ましくは、そのゲノムに各遺伝子の上記野生型アレルを有する被検者の細胞又は組織よりタンパク質を入手する。
【0096】
上記の方法は、好ましくは、(i)腫瘍療法の特定の段階の間に患者より腫瘍試料を入手する工程;及び(ii)MRP1の発現プロフィール、タンパク質プロフィール、又は活性プロフィールを決定する工程を含む。発現プロフィールに基づいて、臨床医は、効率的に療法を採択することができる。このことは、とりわけ、投与量の調整を含み、及び/又はMRP1阻害剤の投与が含まれる。好ましくは、前記阻害剤は、以下の阻害剤の群より選択される:SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾン、三環系イソオキサゾール(例、LY 402913)(http://bigfoot.med.unc.edu/watkinsLab/intesinfo.htm, Paul Watkins, ノースカロライナ大学)。
【0097】
最後に、本発明には、患者が、本発明の文脈において言及される薬物に対して耐性を発現したかどうかを決定する方法が含まれる。前記方法は、(i)腫瘍療法の特定の段階の間に患者より腫瘍試料を入手する工程;及び(ii)MRP1の発現レベルを決定する工程を含む。各遺伝子の発現は、実施例4及び5の記載又は上記の記載のように決定してよい。前記発現プロフィールの評価に基づいて、臨床医は、より効率的に療法を採択することができる。このことは、とりわけ、投与量の調整を含み、及び/又は上記のようなMRP1阻害剤の投与が含まれる。
【0098】
本明細書に引用される文書(製造業者の仕様書、指示書、等を含む)は、いずれも参照により本明細書に援用される。
本願において配列同定番号(配列番号)により言及される核酸配列及びアミノ酸配列を以下の表1、2に収載する。多型ヌクレオチドの位置について、以下の代用文字を核酸配列において使用する:R、G、又はA;Y、T又はC;M、A又はC;K、G又はT;S、G又はC;W、A又はT。
【0099】
アミノ酸配列は1文字記号で示す。多型アミノ酸位置の文字Xは、修飾アミノ酸又はその対応する野生型アミノ酸を示す(受入番号を参照のこと)。
さらに、GenBank受入番号を参照することにより本明細書に言及されるすべての核酸及びアミノ酸の配列を以下の図4〜29に示す。
【0100】
【表1−1】
【0101】
【表1−2】
【0102】
【表1−3】
【0103】
【表1−4】
【0104】
【表1−5】
【0105】
【表1−6】
【0106】
【表1−7】
【0107】
【表1−8】
【0108】
【表1−9】
【0109】
【表1−10】
【0110】
【表1−11】
【0111】
【表1−12】
【0112】
【表1−13】
【0113】
【表1−14】
【0114】
【表1−15】
【0115】
【表1−16】
【0116】
【表2−1】
【0117】
【表2−2】
【0118】
【表2−3】
【0119】
【表2−4】
【0120】
【表2−5】
【0121】
本発明を、以下の生物学的実施例を参照にして説明するが、これは単に例示であって、本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【実施例1】
【0122】
MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置でのCからTへの置換の表現型上の影響
MDR1エクソン26SNP C3435Tとも呼ばれるMDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置での単一ヌクレオチドCからTへの置換の、腸のP−糖タンパク質(PGP)発現に及ぼす影響を検討するために、シュツットガルトのマーガレット・フィッシャーボッシュ博士研究所の臨床薬理学部門で、21名の生検試料と十二指腸の小腸上皮細胞調製物を定量的免疫組織化学とウェスタンブロットにより検討した。この結果を図1に示す。Tアレルのホモ接合保有者(MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置にTを有する)は、Cアレルのホモ接合保有者(MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176位に対応する位置にCを有する)に比べて、有意により高いPGPレベルを示した。ヘテロ接合遺伝子型を有する個体は、中間レベルのPGP発現を示した。
【0123】
さらに、ジゴキシンの腸取込みに関連する薬物動態に対するMDR1遺伝子型の影響をベルリン大学医療センター、Chariteでの臨床試験において検討した。定常状態での最大ジゴキシン血液レベル(Cmax)は、ジゴキシンの経口適用後の14名の健常ボランティアのMDR1 3435C>T遺伝子型に相関していた。図2は、Tアレルについてホモ接合であるボランティアがC/C遺伝子型を有するボランティアより統計的に有意に低いジゴキシンレベルを示すことを示し(p=0.006,Mann Whitney U検定)、ジゴキシン薬物動態に対するこの多型の影響を反映する。
【実施例2】
【0124】
MRP1基質を用いた治療中のMRP1発現及び副作用とMRP1多型の相関性
MRP1遺伝子における機能性の多型は輸送活性に影響を及ぼし、それが結果としてMRP1基質薬物の血漿レベル及び/又は細胞内濃度を変調させる。そのような薬物のレベルが増加すると副作用をもたらす場合があるのに対し、レベルが減少すると、治療以下の薬物レベルと治療の失敗をもたらす場合がある。MRP1多型は、MRP1基質薬物で治療される患者における薬物関連有害効果の発生と治療効力に相関した。症例コントロール試験において、MRP1 SNPの頻度分布を、シスプラチン関連の腎毒性に罹患した患者の群と抗がん剤により引き起こされる腎及び肝毒性を有する患者の群、健常対照者の群との間で比較した。さらに、既知のMRP1 mRNAレベルの試料をMRP1遺伝子型についてスクリーニングした。抗がん治療の間に腎及び肝毒性を示す患者の群における結果を、1つのMRP1 SNPについて以下の表に収載する:
【0125】
【表3】
【0126】
対照試料とは対照的に、Aアレル(MRP1遺伝子、受入番号:AC025277の150727位による位置でのGからAへの置換)は、健常対照に比べて、薬物関連の腎及び肝臓副作用に罹患している患者で統計的に有意に(p=0.044、χ2検定)過剰表出していたので、これにより上記副作用を予測した。
【0127】
さらに、2つのMRP1 SNP、95T>C(配列番号209、210、211、及び212、MRP1遺伝子、受入番号:AF0022831の96位に対応する位置でのTからCへのヌクレオチド置換)と259A>G(配列番号277、278、279、及び280、MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の259位に対応する位置でのAからGへのヌクレオチド置換)について、リファンピシン適用の前と後でのmRNA発現とMRP1遺伝子型の関連性を検出した。これらのSNPは連鎖していて、1つのアレルを形成する。図3に例示されるように、2つの独立した実験(リファンピシン誘導の有無)において、突然変異アレル(MRP1mut,MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の95位にC、259位にG)は、減少したMRP1 mRNA発現に、そして野生型アレル(MRP1wt,MRP1遺伝子、受入番号:AF022831の95位にT、259位にA)は、増加したMRP1発現に統計的に有意に相関している。
【0128】
MRP1 mRNA含量におけるこの差異は、MRP1遺伝子型に関連した個体間の差異に基づくので、これらSNPの解析は、MRP1発現レベルについて、そしてMRP1基質薬物の治療アウトカムと有害効果を予測するのに、診断及び予後の上できわめて有用である。
【実施例3】
【0129】
投与量の算出
イリノテカンの治療効力と有害効果は、親化合物及び活性代謝物(例えば、SN−38)の血漿レベル及び細胞内濃度、即ち、CYP3A5及びMRP1に関連した代謝により制御されるプロセス、並びにMRP1及びMDR1に関連した輸送プロセスに依存する[Atsumi, et al., 1991, Xenobiotica 21: 1159-69, Iyer, et al., 1998, J Clin Invest 101: 847-54, Ciotti, et al., 1999, Biochem Biophys Res Commun 260: 199-202, Santos, et al., 2000, Clin Cancer Res 6: 2012-20, Kuhn, 1998, Oncology (Huntingt) 12: 39-42, Chen, et al., 1999, Mol Pharmacol 55: 921-8, Chu, et al., 1997, Cancer Res 57: 1934-8, Chu, et al., 1997, J Pharmacol Exp Ther 281: 304-14; Chu, et al., 1998, Cancer Res 58: 5137-43, Chu, et al., 1999, Drug Metab Dispos 27: 440-1, Chu, et al., 1999, J Pharmacol Exp Ther 288: 735-41, Mattern, et al., 1993, Oncol Res 5: 467-74, Hoki, et al., 1997, Cancer Chemother Pharmacol 40: 433-8, Sugiyama, et al., 1998, Cancer Chemother Pharmacol 42: S44-9]。例えば、MRP1は、細胞の解毒系の一部としてグルクロノシルトランスフェラーゼと緊密に作用し、SN−38Gのようなグルクロノシル抱合体を輸送することが知られている[Konig et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1461: 377-394, Kerb et al., 2001, Pharmacogenomics 2: 51-64]。例えば、SN−38Gが細胞から胆汁へ輸送される程度は、その形成の速度に大いに影響を及ぼす。SN−38の効率的な解毒には、MRP1による抱合とグルクロニドの輸送という両方のプロセスが必要である。
【0130】
CYP3A5遺伝子(受入番号:GI:10281451)の47518T>C(配列番号137、138、139、及び140)及び9736A>G(配列番号149、150、151、152)のヌクレオチド置換とCYP3A5遺伝子(受入番号:GI:11177452)の145601T>G(配列番号141、142、143、144)及び145929A>G(配列番号145、146、147、及び148)のヌクレオチド置換は、高いCYP3A5発現に関連したアレルを生じ、故に、イリノテカンのより高い代謝不活性化に関連する。このアレルを有する個体は、強い新陳代謝体(extensive metabolizers; EM)であるので、残りの弱い新陳代謝体(poor metabolizers; PM)とは対照的に、イリノテカンの毒性に罹患する可能性はより低い。1つの高発現体(high expresser)と1つの低発現体(low expresser)に関連したアレルを1つずつ有する人々は、中間の新陳代謝体(IM)とみなされる。
【0131】
MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176C>Tヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95T>C(配列番号209、210、211、及び212)及び259A>G(配列番号277、278、279、及び280)ヌクレオチド置換は低いmRNA発現に関連し、MRP1遺伝子(受入番号:M29445)の150727G>Aヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、そして、MRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727G>Aヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は有害効果に関連する。故に、低い輸送体の発現に関連したアレルを担う個体は、有毒化合物を細胞から一掃することがさほど可能ではない。輸送と代謝はいずれも遺伝子の量に依存したやり方で影響を受ける。それぞれの輸送タンパク質の低い発現に関連したアレルの数に従って、個体は、各遺伝子の強い輸送能力(ET)、中間の輸送能力(IT)又は弱い輸送能力(PT)のいずれかを有するとして分類することができる。
【0132】
イリノテカンでの治療の開始に先立つ遺伝子検査により、患者のMDR1及びMRP1に関連した輸送能力を予測することができる。有害効果への個別リスクは、PM及び/又はPTアレルの数に依存する。CYP3A5及びMRP1のPM関連のアレルとMDR1及びMRP1のPT関連のアレルを有する個体は、イリノテカンの毒性に罹患するリスクが最も高い。
【0133】
この知識に基づいて、CYP2D6、CYP2C9、及びCYP2C19の基質薬物について、Brockmoller et al. (2000, Pharmacogenomics 1: 125) に示されるように、初回投薬に先立って、初期用量を調整してよい。
【0134】
用量調整は、得点システムを使用して行うことができる。それぞれのPM又はPT関連アレルについて、ある一定のスコアを割り当てる。例えば、MRP1 PMアレルの226A(配列番号9、10、11、12、540、541)及び701A(配列番号25、26、27、28、554、555)には2のスコアを割り当て、CYP3A5 PM関連アレル(47523T+35649A+145601T+145929A、47523T+35649G+145601G+145929G、及び47523C+35649A+145601T+145929A)、MDR1低発現アレル176T(配列番号417、418、419、及び420)、MRP1低発現アレルの150727A(配列番号217、218、219、及び220)及び259G(配列番号277、278、279、及び280)、MRP1 150727Aアレル(配列番号217、218、219、及び220)には1のスコアを割り当てる。遺伝子型決定の後で、このスコアをまとめ、この総和によりイリノテカン投与量を調整する。それぞれの単一スコアが10%の用量低下に対応する。即ち、1のスコアは10%、2のスコアは20%、3のスコアは30%、等の用量低下に対応する。
【実施例4】
【0135】
培養条件と生物学的アッセイ
ヒト上皮子宮頚がん細胞系KB3−1と2つのサブクローン(KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5))、並びに膀胱がん細胞系RT112とサブクローン(RT112(MDR1+,MRP1))を、NaHCO3 3.7g/l、D−グルコース 4.5g/l、N−アセチル−L−アラニル−L−グルタミン 1.028g/lを含み、10%胎仔ウシ血清、1mMピルビン酸Na、及び1%非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)において培養した。ヒト結腸がん細胞系LS174Tは、L−グルタミン、塩酸ピリドキシン、及びフェノールレッドのない25mM Hepes緩衝液を含有し、10%胎仔ウシ血清、1mMピルビン酸Na、及び1%非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改良イーグル培地において培養した。すべての細胞を5% CO2を含む加湿空気において37℃でインキュベートした。
【0136】
薬物
イリノテカン(CPT−11)とその活性代謝物SN−38は、ファルマシアにより提供された。ストック溶液の調製のために、この物質をメタノールに溶かし、CPT−11については10mg/ml、SN−38については1mg/mlとし、4℃で遮光保存した。PBSと細胞培養基においてより低い濃度の希釈液を調製した。R−ベラパミルは、SIGMAより提供され、DMSOに溶かして50mg/mlとし、さらにPBSにおいて希釈した。
【0137】
薬物での細胞の処理
処理に先立つ24時間前に細胞を96ウェル培養プレートに播いた。異なる増殖速度を考慮して、KB3−1及びRT112の細胞は700細胞/ウェルで、RT112(MDR1+,MRP1)は1000細胞/ウェルで、KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は1200細胞/ウェルで播いた。LS174Tは、1.0x104細胞/ウェルで播いた。培養基の用時調製系列希釈液、CPT−11については0、0.5、1、2.5、5、7.5、10、25、50、75、100、及び200μg/ml、SN−38については0、0.1、0.25、0.5、1.5、10、25、50、75、100、及び200ng/mlで細胞を処理した。4つのウェルを同じ薬物希釈液で処理した。5% CO2の加湿空気において細胞を37℃で3日間インキュベートした。
【0138】
MDR1阻害実験では、各薬物希釈液の2つのウェルに10μg/mlの最終濃度となるようにR−ベラパミルを加えた。
細胞毒性アッセイ
市販のMTSアッセイ系(プロメガ、マジソン、アメリカ)を使用し、製造業者の指示書に従って、増殖阻害と細胞死を判定した。薬物を加えてから3日後、96ウェル培養プレートの各ウェルへ20μlの複合MTS/PMS溶液を加えた。このプレートを5% CO2の加湿空気において37℃で少なくとも45分間インキュベートし、492nmでの吸光度を測定した。各プレートの未処理対照細胞の吸光度の値を100%増殖として設定し、残る薬物処理細胞の増殖を算出するために使用した。培養プレートの未処理細胞は、増殖及び生存が影響を受けない対照として役立った。
【0139】
細胞増殖の50%阻害をもたらす薬物濃度をIC50と定義した。
RNA調製とcDNA合成
上記の実験に使用するそれぞれの細胞バッチより、製造業者の指示書に従って、オリゴ−dT磁気ビーズ(μMACS mRNA単離キット;Miltenyi Biotech)により細胞溶解液からメッセンジャーRNAを単離した。各細胞系の250ng mRNAを、Superscript II逆転写酵素(ギブコBRL)を含む20μl cDNA合成反応液に適用した。このcDNAの希釈液は、転写物特異的な増幅反応の鋳型として役立った。
【0140】
PCRプライマーと反応条件
表3に示すように、0.5ユニットのTaqポリメラーゼ(Qiagen)、200μMヌクレオチドミックス、5μl cDNA鋳型希釈液、及び0.2μM遺伝子特異的プライマーを有する25μl 反応液においてPCRを設定した。すべての反応は、サイクル数だけが異なる同一の増幅条件下(表3)、94℃で2分のプレ変性、次いで増幅には、94℃で45秒の変性、62℃で45秒のアニーリング、及び72℃で45秒の伸長で実行したが、MRP1は、2分間のより長い伸長を必要とした。
【0141】
【表4】
【実施例5】
【0142】
イリノテカン代謝に関与する遺伝子の発現
ヒト膀胱がん細胞系RT112、そのサブクローンRT112(MDR1,MRP1)、ヒト上皮子宮頚がん細胞系KB3−1と2つのサブクローン、KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)、並びに結腸がん細胞系LS174T(ATCC CL−188)よりメッセンジャーRNAを単離した。これらのmRNAをcDNAへ逆転写し、転写物特異的増幅反応における鋳型として適用し、イリノテカンの輸送及び代謝に関与する遺伝子(MDR1、MRP1、UGT1A、MRP1、CYP3A4、CYP3A5)の発現レベルを決定した。ハウスキーピング遺伝子、ホスホリパーゼA2(PLA2)の増幅を、この反応において比較可能なcDNA量の対照として使用した。
【0143】
図29の増幅反応は、がん細胞系のRT112、KB3−1、及びLS174Tが、それぞれMDR1の無発現か、又はごく低い発現を有することを示す。RT112(MDR1,MRP1)はRT112のサブクローンであり、Seemann et al. (Urol Res 1995; 22: 353-360) に記載されるように、細胞傷害薬への抵抗性で選択されたものであり、中等度に増加したMDR1発現を特徴とする。薬剤抵抗性サブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、同様に、MDR1基質への曝露により元のKB3−1細胞系から派生した。これらのサブクローンは、高度に増加したMDR1発現を特徴とする。それらは、元のKB3−1細胞より20倍より多い転写物を示し、非常に高いMDR1活性を示唆する。MRP1はすべての細胞系で同一のレベルで発現される。UGT1A酵素の転写物は、RT112、RT112(MDR1,MRP1)、及びLS174T細胞においてのみ存在する。MRP1は、RT112においてごく弱く発現され、RT112(MDR1,MRP1)においてより強く発現され、LS174T細胞において最高の発現を示す。CYP3A4は、LS174Tにおいてのみごく少量検出された。RT112細胞、RT112(MDR1,MRP1)、及びLS174Tは、機能的に不活性なスプライス変異体と機能的に活性なCYP3A5の転写物のヘテロ接合発現を示す。対照的に、KB3−1及びKB3−1(MDR1+++)細胞は、活性CYP3A5転写物のみを有し、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、活性CYP3A5転写物の最高の発現を示し、後者が最高のCYP3A5活性を有することを示唆した。
【実施例6】
【0144】
MDR1及びCYP3A5活性がないか又は低い結腸及び他の表皮がん細胞系は、CPT−11及びSN−38に対して感受性である。
結腸がん細胞系LS174T、子宮頚がん細胞系KB3−1、及び膀胱がん細胞系RT112を、処理に先立つ24時間前に96ウェル培養プレートに播いた。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。図30は、CPT−11及びSN−38で処理すると、3つの表皮がん細胞系がいずれも増殖を停止して死滅することを示す。CPT−11が50%阻害をもたらす濃度(IC50)は、LS174T細胞で1.5μg/ml、RT112細胞で2.5μg/ml、そしてKB3−1細胞で5μg/mlである。CPT−11の活性代謝物、SN−38は、103倍低い濃度で同じ程度の増殖阻害と細胞死を引き起こすので、CPT−11より1000倍高い効力を示す。SN−38のIC50は、LS174T細胞で5ng/ml、RT112細胞で4ng/ml、そしてKB3−1細胞で25ng/mlである。
【0145】
上記の結果は、3つの表皮細胞系が、異なる組織から派生したのに、いずれもCPT−11及びSN−38の処理に同様に感受性があることを示す。このことはまた、MDR1を発現しないか又はきわめて低いレベルを発現するがん細胞(図29)がCPT−11及びSN−38により効率的に殺傷され得ることを示す(図30)。
【実施例7】
【0146】
MDR1活性は、CPT−11及びSN−38に対するがん細胞の抵抗性に相関する。
KB3−1と、その強くMDR1を発現するサブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)の細胞を、処理に先立つ24時間前に96ウェル培養プレートに播いた。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、処理した。MDR1の高発現体であるKB3−1サブクローン(KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5))の阻害曲線(図31)は、MDR1の低発現体であるKB3−1細胞系(KB3−1)に比べて、CPT−11及びSN−38に対して有意により高い抵抗性を示す(図29)。CPT−11のIC50は、KB3−1細胞での5μg/mlからKB3−1(MDR1+++)細胞での85μg/mlとKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞での200μg/mlへと、17〜40倍増加する。SN−38のIC50は、KB3−1細胞での25ng/mlからKB3−1(MDR1+++)細胞での200ng/mlとKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞での>200ng/mlへと、少なくとも8倍増加する。
【0147】
CPT−11及びSN−38はMDR1の基質であり、故に、MDR1活性により細胞から除去される。MDR1発現レベルは、CPT−11及びSN−38に対する腫瘍細胞の感受性に逆相関する。従って、高いMDR1発現体の表現型を有する細胞の殺傷には、ずっと高い濃度のCPT−11を必要とする。
【実施例8】
【0148】
MRP1活性は、SN−38に対する感受性に相関し、CPT−11に対する感受性に相関しない。
RT112細胞とそのサブクローンのRT112(MDR1,MRP1)との間でCPT−11及びSN−38感受性を比較した。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11及びSN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、処理した。
【0149】
CPT−11に対する感受性の違いは、図32Aに示されるように、ごくわずかである。RT112(MDR1,MRP1)細胞の4μg/ml CPT−11というIC50は、RT112細胞(2.5μg/mlのIC50)に比べて2倍高い。MDR1を発現しないRT112細胞とは対照的に、RT112(MDR1,MRP1)細胞は、中間量のMDR1を発現し、このことにより、CPT−11感受性のわずかであるが有意な増加を説明することができる。SN−38で処理後のRT112(4ng/mlのIC50)及びRT112(MDR1,MRP1)細胞(75ng/mlのIC50)の間にはずっと顕著な差異が存在する(図32B)。RT112(MDR1,MRP1)細胞系のこの19倍高い抵抗性は、RT112細胞よりもRT112(MDR1,MRP1)においてより高いレベルで発現されるMRP1の追加の解毒効果により説明することができる(図29)。SN−38とは対照的に、CPT−11は、UGTにより代謝されない。故に、CPT−11関連の毒性はMRP1発現により影響を受けず、RT112(MDR1,MRP1)細胞におけるUGTの抵抗性亢進能力は、SN−38の適用によってのみ検出される。
【実施例9】
【0150】
MDR1阻害は、MDR1低発現性ではなく、MDR1高発現性のがん細胞においてCPT−11及びSN−38に対する増感剤として役立つ。
KB3−1細胞とそのサブクローンのKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)のCPT−11及びSN−38に対する感受性を、特異的な阻害剤のR−ベラパミルを使用してMDR1機能を遮断した後で評価した。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11、SN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。2つのウェルをMDR1阻害剤のR−ベラパミルで追加的に処理した。図33は、R−ベラパミルの追加が、MDR1の低発現体であるKB3−1細胞のCPT−11及びSN−38感受性に対してはごくわずかな効果しか及ぼさないことを示す(「R−ベラパミルなし」でのCPT−11及びSN−38のIC50がそれぞれ5μg/ml及び25ng/mlであるのに対し、「R−ベラパミルあり」でのCPT−11及びSN−38のIC50はそれぞれ4.5μg/ml及び15ng/mlである)。対照的に、MDR1発現細胞のKB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)のCPT−11及びSN−38に対する感受性は、R−ベラパミルを用いたMDR1輸送機能の阻害の後で8倍及び10倍高くなった。KB3−1(MDR1+++)細胞でのCPT−11のIC50は、「R−ベラパミルなし」の85μg/mlから「R−ベラパミルあり」の10μg/mlへ減少し、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)細胞においては、「R−ベラパミルなし」の200μg/mlから「R−ベラパミルあり」の25μg/mlへ減少した。SN−38処理の間のMDR1阻害の効果は、これらMDR1高発現体の細胞においてずっと強く、R−ベラパミルがMDR1輸送を完全に遮断すると、それらはKB3−1と同じくらい感受性になった。
【0151】
上記の結果は、MDR1活性ががん細胞のCPT−11及びSN−38抵抗性に関連していて、MDR1の阻害がこれらの細胞を感作するので、それらがより低い薬物濃度でより効率的に殺傷されることを明示する。
【実施例10】
【0152】
CYP3A5活性はCPT−11への抵抗性に影響を及ぼす。
KB3−1(MDR1+++)及びKB3−1(MDR1+++,CYP3A5)の細胞は、そのCYP3A5の量が異なる(図29)。上記のように、各細胞系の4つのウェルをCPT−11、SN−38の系列希釈液とともにインキュベートし、解析した。2つのウェルをMDR1阻害剤のR−ベラパミルで追加的に処理した。
【0153】
MDR1活性がCPT−11及びSN−38に対する細胞の感受性の主要な決定因子であるので、これらMDR1高発現体の細胞系におけるMDR1活性を特異的なMDR1阻害剤のR−ベラパミルの過剰量を使用して完全に遮断し、MDR1の干渉がない状態で、CPT−11及びSN−38感受性に対するCYP3A5の影響を解析した。
【0154】
高CYP3A5発現体の細胞系、KB3−1(MDR1+++,CYP3A5)は、25μg/mlのIC50であり、10μg/mlのIC50を示すKB3−1(MDR1+++)よりCPT−11に対して2.5倍抵抗する(図34)。SN−38に対するその感受性に関しては、これら2つの細胞系の間で差異を観察することができない。
【0155】
上記の実験は、SN−38とは対照的に、CPT−11への抵抗性に対するCYP3A5発現の有意な影響を明示する。SN−38ではなくてCPT−11がCYP3A5遺伝子により代謝されるので、CYP3A5活性がSN−38の毒性に何の影響も及ぼさなかったことにより、このCYP3A5の効果がさらに確かめられる。
【実施例11】
【0156】
MDR1遺伝子型決定は、遺伝子型に基づいた予測と薬剤抵抗性のモニタリングによりイリノテカンの治療効力を改善する。
イリノテカンの治療効力及び有害効果は、親化合物及び活性代謝物(例、SN−38)の血漿レベルと腫瘍細胞内濃度に依存する。MDR1遺伝子は、イリノテカンのPGP依存性膜浸透を制御し[Luo et al., Drug Metab Dispos 2002, 30: 763-770; Jansen et al., Br J Cancer 1998, 77: 359-65; Chu et al., J Pharmacol Exp Ther 1999, 288, 735-41; Sugiyama et al., Cancer Chemother Pharmacol 1998, 42 Suppl: S44-9]、故に、その全身アベイラビリティと細胞内蓄積の重要な決定因子である。MDR1遺伝子(受入番号:M29445)の176C>Tヌクレオチド置換(配列番号217、218、219、及び220)は低いPGP発現に関連した低い薬物流出に関連し、この置換を担う患者は、2つの理由でイリノテカン治療へ応答する可能性がより高い:1)小腸上皮細胞中のPGP量がより少ないために、より多くのイリノテカンが腸障壁を通過して体内に入り、より多くのイリノテカンがその作用部位である腫瘍に到達することを引き起こす。2)腫瘍細胞膜中のPGP量がより少ないために、より多くのイリノテカンが腫瘍細胞中へ浸透し、その細胞傷害効果を発揮する。今日使用されている標準的なイリノテカンの用量は、化学療法の第一サイクルのうちにほとんどの腫瘍細胞をきわめて有効に殺傷し、薬剤抵抗性の腫瘍細胞がごくわずかに生存し、忍容し得る有害事象を伴うだけである。これらの患者においては、薬剤抵抗性の機序からは独立して、生存する細胞の数があまりに少ないので、イリノテカン療法へもはや応答しない薬剤抵抗性腫瘍へ進展することはない。
【0157】
高発現体のMDR1遺伝子型(MDR1遺伝子、受入番号:M29445の176位がヌクレオチドCである)を有する患者は、イリノテカン治療へ応答する可能性がより低い。十分に有効な腫瘍細胞の殺傷を達成して薬剤抵抗性腫瘍の発現を防ぐには、より高い用量が必要となろう。しかしながら、イリノテカン投与量の上昇は、忍容し得ない有害事象(例、下痢、好中球減少症、又は血栓塞栓性の合併症)の発生のために制限される。あるいは、イリノテカン治療の効力は、PGP阻害剤の追加により改善することができる。PGP阻害剤は、MDR1高発現体の患者においてPGP機能を有効に遮断し、イリノテカンが腫瘍細胞中に濃縮し、MDR1低発現体の患者と同じくらい有効な細胞毒性を発揮することを可能にする。必然的に、遺伝子型としてはMDR1高発現体の患者が、表現型としてはMDR1低発現体と同等になる。
【0158】
MDR1遺伝子の低いか又は高い発現体のアレルの数に従って、個体は、高い輸送能力(ET、2つの高発現体アレル)、中間の輸送能力(IT、一方が高発現体で他方が低発現体のアレル)又は弱い輸送能力(PT、2つの低発現体アレル)のいずれかを有するとして分類することができる。イリノテカンでの治療の開始に先立つ遺伝子検査により、患者をET、IT、又はPTとして分類し、患者のMDR1に関連した輸送能力を予測することができる。不十分な抗がん治療への個別リスクは、MDR1高発現体アレルの数とともに増加する。ET遺伝子型の個体はイリノテカンへの不十分な応答に罹患するリスクが最も高く、薬剤抵抗性腫瘍を発現させるリスクが最も高い。ET患者は、イリノテカンに加えてPGP阻害剤で治療し、有害事象と化学療法に関連した薬剤抵抗性の発現についてより綿密にモニターすべきである。さらに、薬剤抵抗性の腫瘍を発現するリスクがあるこれらの患者は、化学療法の各サイクルの間に腫瘍生検を採取し、引き続き腫瘍細胞を薬剤抵抗性について個別にプロファイリングすることから益する場合がある。
【図面の簡単な説明】
【0159】
【図1】21名のボランティアにおいて、ウェスタンブロット解析により決定した、腸のMDR1発現とエクソン26SNPの相関性を示す。ボックスプロットは、MDR1遺伝子(GenBank 受入番号:M29445)の176位に対応する位置でMDR1 3435C>Tにより集合した、MDR1発現の分布を示す。Tアレルは、p−糖タンパク質のより低い発現に関連していた。
【図2】臨床試験に参加した14名の健常ボランティアにおいて、定常状態でのジゴキシンのピーク血漿レベルをもたらすジゴキシン取込みとMDR1 3435C>Tの相関性を示す[Johne et al., 1999, Clin. Pharmacol. Ther 66: 338-345]。最大ジゴキシンレベルは、T及びCのアレルそれぞれのホモ接合である2群間で統計的に有意に異なっていた(p=0.006,Mann Whitney U検定)。
【図3】2つの独立した実験に由来する、健常ボランティアからの十二指腸生検における、リファンピシン適用の前後でのMRP1 mRNA含量と遺伝子型(wt/wt:1;wt/mut及びmut/mut:2)の相関性を示す。リファンピシンでの処理は、MRP1 mRNA発現に影響を及ぼさなかった(p<0.001,一対t検定)。MRP1遺伝子型のMRP1 mRNAレベルとの関連には強い傾向が検出された(p=0.086,Kruskal−Wallis検定)。
【図4】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図5】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図6】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図7】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図8】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図9】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図10】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図11】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図12】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図13】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図14】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図15】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図16】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図17】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図18】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図19】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図20】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図21】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図22】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図23】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図24】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図25】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図26】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図27】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図28】本明細書に言及される核酸及びアミノ酸の配列を示す。
【図29】がん腫細胞系においてイリノテカン代謝に関連する遺伝子の発現プロフィールを示す。この半定量的RT−PCRは、アンプリコンに対して右に示す遺伝子の転写物の量を示す。PCR産物は、アガロース電気泳動により解析し、臭化エチジウムで染色した。各断片のサイズを左側に塩基対(bp)で示す。
【図30】上皮がん腫細胞系LS174T(結腸)、KB3−1(頚部)、及びRT112(膀胱)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値である。
【図31】上皮子宮頚がん腫細胞系KB3−1と多量のMDR1を発現する2つのサブクローン、KB3−1(MDR1)及びKB3−1(MDR1,CYP3A5)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値と標準偏差である。
【図32】膀胱がん細胞系RT112と、MDR1とより多い量のMRP1を発現するそのサブクローン、RT112(MDR1,MRP1)を用いた、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに及び、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及んだ。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、少なくとも3つのウェルの平均値と標準偏差である。
【図33】R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。上皮子宮頚がん腫細胞系KB3−1と多量のMDR1を発現する2つのサブクローン、KB3−1(MDR1)及びKB3−1(MDR1,CYP3A5)について、R−ベラパミルによるMDR1阻害の薬物感受性に対する影響を試験した。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及び、R−ベラパミルは、10μg/ml(+V)の最終濃度となるように加えた。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、2つのウェルの平均値である。
【図34】R−ベラパミルによるMDR1の阻害を伴う、CPT−11(A)及びSN−38(B)についての増殖阻害曲線を示す。薬剤抵抗性に対するMDR1の効果を回避するために、細胞をR−ベラパミルで同時に処理した。そのCYP3A5発現において異なるKB3−1(MDR1)とKB3−1(MDR1,CYP3A5)について、MDR1の阻害後に残る抵抗性を試験した。CPT−11の濃度は0〜200μg/mlに、SN−38の濃度は0〜200ng/mlに及び、R−ベラパミルは、10μg/ml(+V)の最終濃度となるように加えた。細胞は3日間処理した。それぞれの濃度のデータは、2つのウェルの平均値である。
Claims (37)
- がん罹患患者を治療するためにイリノテカンを使用する方法であって:
(1)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルをがん性組織有するかどうかを決定すること;
(2)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。 - がんが、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、又は膵臓がんである、請求項1に記載の方法。
- (1)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が毒性を避けるために減らされる;又は
(2)1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が効力を高めるために増やされる、請求項2に記載の方法。 - 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にある、請求項3に記載の方法。
- 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のコード領域にある、請求項3に記載の方法。
- 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域にもコード領域にもない、請求項3に記載の方法。
- 1以上の変異アレルがMRP1遺伝子のプロモーター領域とコード領域の両方にある、請求項3に記載の方法。
- 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項3に記載の方法。 - 1以上の変異アレルが:
(a)配列番号181、209、217、205、277、281、301、325、229、193、313、293、又は253のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381、440、1625位、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位に対応する位置に置換、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137647位、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の18067又は17900位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位、MRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位、MRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34218位、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1625位に対応する位置にA、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;並びに
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の329位に対応する位置でPheからCysへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項8に記載の方法。 - 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、請求項8に記載の方法。
- 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、請求項8に記載の方法。
- 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を低下させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が減らされる、請求項9に記載の方法。
- 1以上の変異アレルが患者のMRP1遺伝子産物の発現を増加させ、それにより患者へ投与されるイリノテカンの量が増やされる、請求項9に記載の方法。
- 患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含む、患者がイリノテカンを用いた治療に対して中毒反応のリスクがあるかどうかを決定する方法。
- 患者へ投与するイリノテカンの量を減らすことをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- がん罹患患者へイリノテカンを投与するための最適治療方式を決定する方法であって:
(1)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定すること;
(2)変異アレルの1以上を有する患者において、イリノテカンの量を、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やすか又は減らすことを含む、前記方法。 - MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より低いので、イリノテカンへの高い感受性を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、減らした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
- MRP1遺伝子産物の発現レベルが一般集団より高いので、イリノテカンへの耐性又は耐性素質を示すような、MRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有する患者においてがんを治療する方法であって、増やした量のイリノテカンを該患者へ投与することを含む、前記方法。
- 耐性又は耐性素質を示す変異アレルを有する患者をMRP1阻害剤で治療する、請求項18に記載の方法。
- MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、請求項19に記載の方法。
- MRP1遺伝子産物のがん性細胞における発現レベルの変化をアッセイすることによって治療の間に患者をモニターすることをさらに含み、それによりMRP1遺伝子産物の発現レベルの増加を、患者へ投与するイリノテカンの量の増加により補填する、請求項17に記載の方法。
- 患者においてがんを治療する方法であって、有効量のイリノテカンを該患者へ体内投与することを含み、ここで治療方式は、患者のMRP1遺伝子の遺伝子型に基づいて変更される、前記方法。
- がん罹患患者の集団を治療する方法であって:
(1)該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを、患者一人一人のベースで決定すること;
(2)変異アレルの1以上を有する患者において、変異アレルを有する患者を治療するのに十分であるイリノテカンの量を該患者へ投与することを含み、該量が、MRP1遺伝子中の患者のアレルを考慮せずに投与される量に比較して増やされるか又は減らされる、前記方法。 - がんに罹患している患者においてイリノテカンへの感受性を予測する方法であって、該患者がMRP1遺伝子の1以上の変異アレルを有するかどうかを決定することを含み、該アレルはがん性細胞が少量又は多量のMRP1遺伝子産物を発現することを示し、それにより低い発現はイリノテカンへの高い感受性を示し、高い発現はイリノテカンへの耐性又は耐性素質を示す、前記方法。
- 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者をMRP1阻害剤で治療する、請求項24に記載の方法。
- MRP1阻害剤が、SDZ−PSC 833、SDZ 280−446、MK571、MS209(キノロン誘導体)、PAK−104p、ベラパミル、ベンズブロマロン、ジピリダモール、フロセミド、γ−GS(ナフチル)システイニル−グリシンジエチルエステル、ゲニステイン、キニジン、リファンピシン、RU486、スルフィンピラゾンから成る群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 耐性又は耐性素質を示す遺伝子型を有する患者を、がん性細胞におけるMRP1遺伝子産物の発現レベルをアッセイすることによって、治療の間にモニターする、請求項26に記載の方法。
- (a)配列番号169、170、173、174、177、178、181、182、185、186、189、190、193、194、197、198、201、202、205、206、209、210、213、214、217、218、221、222、225、226、229、230、233、234、237、238、241、242、245、246、249、250、253、254、257、258、261、262、265、266、269、270、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、294、297、298、301、302、305、306、309、310、313、314、317、318、321、322、325、326、329、330、333、及び/又は334のいずれか1つの核酸配列を有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号600、602、及び/又は604のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)多剤耐性タンパク質1(MRP1)遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998、57853、53282、及び/又は39508位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667、137647、137710、124667、及び/又は38646位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258、27159、34218、34215、55472、及び/又は34206〜34207位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、18067、17970、17900、及び/又は18195位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79、88、及び/又は249位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95及び/又は259位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248及び/又は258位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、1163、381、233、189、440、及び/又は1720〜1723位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの置換又は欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926927、及び/又は437/438位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置に少なくとも1つのヌクレオチドの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(d)MRP1遺伝子へハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドであって、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の21133、14008、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27258及び/又は34218位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の79位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の57998及び/又は57853位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137667及び/又は137647位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC025277)の150727及び/又は33551位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の248位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1884、1625、233、及び/又は189位に対応する位置にA、MRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の39508位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17900、18067、及び/又は18195位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022828)の174位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の440及び/又は1163位に対応する位置にT、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の88位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の95位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の27159、55472、及び/又は34215位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の124667及び/又は38646位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:GI:7209451)の53282位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC026452)の137710位に対応する位置にC、MRP1遺伝子(受入番号:AF022830)の249位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022829)の258位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:AF022831)の259位に対応する位置、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の381位に対応する位置にG、MRP1遺伝子(受入番号:U91318)の17970位に対応する位置にTの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の34206〜34207位に対応する位置にATの欠失、又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の1720〜1723位に対応する位置にGGTAの欠失、MRP1遺伝子(受入番号:U07050)の926/927位に対応する位置にTの挿入、及び/又はMRP1遺伝子(受入番号:U07050)の437/438位に対応する位置にTCCTTCCの挿入、MRP1遺伝子(受入番号:AC003026)の55156/55157位に対応する位置にTGGGGCの挿入を有している、前記ポリヌクレオチド;
(e)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドあって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の600、602、及び/又は604位に対応する位置でアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
(f)MRP1ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、MRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の239位に対応する位置でPheからCysへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の433位に対応する位置でArgからSerへ、及び/又はMRP1ポリペプチド(受入番号:G2828206)の723位に対応する位置でArgからGlnへのアミノ酸置換を含む、前記ポリヌクレオチド;
から成る群より選択されるポリヌクレオチドを含む変異アレルがあるゲノムを有する被検者において、結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんを治療するための医薬組成物の調製へのイリノテカン又はその誘導体の使用。 - 前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換が、対応する野生型アレルに比べて変異アレルの発現を改変させる、請求項28に記載の使用。
- 前記発現の改変が発現の低下又は増加である、請求項29に記載の使用。
- 前記ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換が対応する野生型アレルによりコードされるポリペプチドに比べて変異アレルによりコードされるポリペプチドの活性を改変させる、請求項28に記載の使用。
- 前記活性の改変が活性の低下又は増加である、請求項31に記載の使用。
- 前記被検者が動物である、請求項28〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 前記被検者がマウスである、請求項33に記載の使用。
- 前記被検者がヒトである、請求項28〜32のいずれか1項に記載の使用。
- 前記ヒトがアフリカ人かアジア人である、請求項35に記載の使用。
- 結直腸がん、子宮頚がん、胃がん、肺がん、悪性神経膠腫、卵巣がん、及び膵臓がんに罹患している被検者に適正な療法を選択する方法であって:
(a)被検者から入手した試料中の前記被検者のゲノムにおける請求項28で特定される変異アレルが存在するか否かを決定すること;及び
(b)(a)で得られた結果に基づいて前記被検者に適正な療法を選択することを含む、前記方法。
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