JP2005506084A

JP2005506084A - In vitro micro-organs and uses related thereto

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Publication number: JP2005506084A
Application number: JP2003538352A
Authority: JP
Inventors: エデュアルド，エヌ．ミトラニ，
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2001-10-23
Filing date: 2001-10-23
Publication date: 2005-03-03
Also published as: KR100970195B1; CA2464460A1; IL161472A0; KR20090060381A; KR20040070343A; CN1582330A

Abstract

特殊な特性を有する細胞の単離された集団を含むマイクロ器官培養物が記載される。本発明のマイクロ器官培養物の顕著な特徴としては、比較的長時間、培養中で維持される能力、ならびに例えば、供給源の器官に存在する器官微小構造と類似の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用を容易にする器官微小構造の保存が挙げられる。本発明のマイクロ器官培養物はレシピエント被検体に遺伝子産物を送達する方法において、細胞増殖及び細胞分化剤を同定する方法において、及び前駆体及び幹細胞を同定して単離する方法において用いられることができる。加えて、本発明のマイクロ器官培養物は細胞増殖、細胞分化及びウイルス感染性の阻害剤を同定する方法において用いられることができる。他の実施態様において、マイクロ器官培養物は移植のために用いられることができる。A micro-organ culture is described that contains an isolated population of cells with special properties. The salient features of the micro-organ cultures of the present invention include the ability to be maintained in culture for a relatively long period of time, and, for example, cell-cell and matrix-cells similar to the organ microstructure present in the source organ The preservation of organ microstructure that facilitates the interaction. The micro-organ cultures of the invention are used in methods of delivering gene products to recipient subjects, in methods of identifying cell proliferation and cell differentiation agents, and in methods of identifying and isolating progenitors and stem cells. Can do. In addition, the micro-organ cultures of the present invention can be used in methods of identifying inhibitors of cell proliferation, cell differentiation and viral infectivity. In other embodiments, micro-organ cultures can be used for transplantation.

Description

【０００１】
発明の背景
真核生物細胞培養は、１９５０年代初頭に初めて達成された。それ以来、広範な形質転換細胞および初代細胞が、広範な種々の培地および規定された補充物、例えば、増殖因子およびホルモン、ならびに規定されていない補充物、例えば、血清および他の身体の抽出物を用いて培養されている。例えば、動物の皮膚から得られた線維芽細胞は、多くの細胞継代を通じて、核型で二倍体細胞としてまたは不定性で樹立された細胞株として、慣用的に培養されている。しかし上皮細胞は、線維芽細胞とは異なる形態学的特性および増殖特性を有しており、培養することがさらに困難である。さらに、上皮細胞および線維芽細胞を同じ培養物中で培養する場合、上皮細胞は一般に線維芽細胞によって過剰増殖される。
【０００２】
２次元での細胞の増殖は、培養中で細胞を調製、観察および研究するために便利な方法であって、高速の細胞増殖を可能にするが、インビボにおける組織全体の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用の特徴を欠く。
【０００３】
このような機能的相互作用および形態学的相互作用を研究するため、少数の研究者が以下のような３次元の基質の使用を探究している：コラーゲンゲル（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９８０）ＩｎＶｉｔｒｏ１６：３０６〜３１２；Ｙａｎｇら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：３４０１；Ｙａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：２０８８〜２０９２；Ｙａｎｇら（１９８１）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４１：１０２１〜１０２７）；セルローススポンジ単独（Ｌｅｉｇｈｔｏｎら（１９５１）Ｊ．ＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．１２：５４５〜５６１）、またはコーティングされたコラーゲン（Ｌｅｉｇｈｔｏｎら、（１９６８）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２８：２８６〜２９６）；ゼラチンスポンジ、Ｇｅｌｆｏａｍ（Ｓｏｒｏｕｒら（１９７５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．４３：７４２〜７４９）。
【０００４】
クローンコンピテントな方式で上皮細胞を増殖するために、種々の培養条件が使用されている。例えば、上皮細胞および詳細には皮膚上皮細胞（ケラチノサイト）は、以下の上で培養される：致死的に照射した線維芽細胞の支持細胞層（Ｒｈｅｉｎｈａｒｄｔら（１９７５）Ｃｅｌｌ６：３３１〜３４３）および半合成コラーゲンマトリックス（米国特許第５２８２８５９号；欧州特許出願第０３６１９５７号）。いくつかの場合に、このような細胞を増殖させるために用いられる培地は、下垂体抽出物および血清、ならびに増殖補充物、例えば、上皮増殖因子およびインスリンを含む生物学的抽出物を添加することによって操作される（Ｂｏｉｓｓｅａｕら（１９９２）Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ３（２）：１１１〜１２０；米国特許第５２９２６５５号）。
【０００５】
インビトロにおいて皮膚増殖の際に多くの試みが行なわれている。これらの試みは代表的には、真皮の線維芽細胞および脂肪細胞から表皮のケラチノサイトを分離する工程を包含する。分離後、ケラチノサイトは一般に、層化された表皮の形成を可能にする方式で増殖される。しかし、この方式で調製された表皮は、毛包および汗腺を欠く。さらに、このような培養物においては、表皮と真皮との間の自然な関係は保存されていない。生存不能な線維芽細胞におけるケラチノサイトの増殖を含む培養方法（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄら（１９７５）Ｃｅｌｌ６：３３１〜３４３）、または合成であるか、もしくは表皮の真皮基質由来の別の供給源に由来する、コラーゲンおよび線維芽細胞の真皮基質上へのケラチノサイトの配置（Ｓｕｇｉｈａｒａら（１９９１）Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１４２〜１４６；Ｐａｒｅｎｔｅａｕら（１９９１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．４５（３）：２４５−２５１）も行なわれている。しかし、いくつかの場合、ケラチノサイトの分離は、実施されておらず、そして器官全体が培養中に置かれる。インビトロにおける培養器官に対する試みは、血清含有培地における器官のインキュベートに限定されている（Ｌｉら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８（５）：１０８〜１１２）。
【０００６】
表皮の既存のインビトロモデルのほとんどは、毛包、汗腺および皮脂腺を欠く（表皮細胞培養の概説については、Ｃｏｕｌｏｍｂら（１９９２）Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ４０（２）：１３９〜１４６を参照のこと）。例外としては、２×５ｍｍ^２の寸法および２．０ｍｍの厚みを有する皮膚外植体が血清含有培地の存在下で数日間生存したままである、Ｌｉらのゲル支持皮膚モデルが挙げられる（（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ８９：８７６４〜８７６８）。
【０００７】
細胞損傷の欠点に加えて、哺乳動物細胞を培養するバイオリアクターおよび他の方法はまた、インタクトな生物体における実際の組織の空間的な三次元形態をシミュレートする、細胞が組織に構築される条件を提供する能力において極めて限定されている。従来の組織培養プロセスは、同様の理由のせいで、哺乳動物細胞の分化、ならびに研究および薬学的な目的の専門的な生物学的に活性な分子の分泌に重要であると考えられる、高度に機能的に特殊化されたかまたは分化された状態を培養された組織が表現する能力を、制限する。微生物と異なり、哺乳動物のような高等生物の細胞はそれ自体が、高次の多細胞組織を形成する。この自己構築の正確な機構は未知であるが、今までに研究された状況では、細胞の組織への発達は、細胞のお互い（同じかまたは異なるタイプの細胞）に対する位置関係、または他の固着基質、および／またはホルモンのような特定の物質（因子）の有無、自己分泌、またはパラ分泌に依存していることが見出されている。要するに従来は、インビボの組織構造の優れたモデリングを可能にするのに十分な低い剪断応力、十分な３次元の空間自由度、および十分に長い期間の臨界の細胞相互作用（お互いとまたは基質との相互作用）を同時に達成することが可能である培養プロセスは、なかった。
【０００８】
従って、細胞培養が長期間にわたってその天然の細胞間の関係を保存する、培養中で器官の一部を生成しかつ維持するインビトロ方法が必要である。有効な組織および器官のモデルであって、細胞分化、細胞増殖および細胞機能がインビボにおいて組織全体で見出されるものを模倣するモデルは、器官が健常状態で維持され、結果としてどのようにして異常な事象が逆転され得るかという機構を理解するのに有用である。
【０００９】
発明の要約
本発明は、上述の必要性に取り組むインビトロのマイクロ器官（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ）培養物を提供する。本発明のマイクロ器官培養物の顕著な特徴としては、比較的長時間、例えば少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも７日間以上、培養中で維持される能力、ならびに例えば、供給源の器官に存在する細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用と類似の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用を容易にする器官微小構造の保存が挙げられる。
【００１０】
代表的には、マイクロ器官培養物の細胞の集団の少なくとも１つの細胞は、増殖する能力を有する。マイクロ器官培養物における細胞の集団は全体として平衡の状態にあってもよい。すなわち細胞の集団において細胞の損失に対する細胞増殖の比率が約１であるか、またはマイクロ器官培養物における細胞は、それらが損失されるよりも大きい速度で増殖され得、結果として細胞の集団における細胞損失に対する細胞増殖の比率は、例えば、新生物組織から得られた細胞の集団、または例えば、外植体中で増殖するように誘導された前駆体細胞集団におけるように、１より大きくなる。
【００１１】
マイクロ器官培養物の細胞を単離することができる好ましい器官としては、以下が挙げられる：リンパ器官、例えば、胸腺および脾臓；消化器官、例えば、腸、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管；肺；生殖器官、例えば、前立腺および子宮；***、例えば、乳腺；皮膚；尿路器官、例えば、膀胱および腎臓；角膜；および骨髄のような血液関連器官。マイクロ器官増殖の単離された細胞集団は、特定の実施形態において、例えば、被験体への細胞または細胞産物（例えば遺伝子産物）の送達のために、高分子デバイス内に封入されてもよい。本発明はまた、本発明のマイクロ器官培養物から単離された馴化培地に関する。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、マイクロ器官培養物は、器官の一部である細胞の集団を含む。好ましくは、このマイクロ器官外植体は、上皮および結合組織細胞を含む。本発明の１つの実施形態において、器官外植体は、膵臓から得られ、例えば、細胞集団の微小構造は実質的に、この外植体が由来する、もとの膵臓の微小構造と同じであり、膵臓の上皮細胞、例えば、島細胞および膵臓結合組織細胞を含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、マイクロ器官外植体は、皮膚から得られ、例えば、集団細胞の微小構造は、インビボにおける皮膚の微小構造と実質的に同じであり、そして皮膚上皮、例えば、表皮細胞および皮膚結合組織細胞、例えば、真皮細胞を含む。皮膚外植体から得られるマイクロ器官培養物はまた、表皮細胞を支持する基底膜、真皮細胞を含む細胞外マトリックス、および少なくとも１つの陥入、例えば、少なくとも１つの毛包または腺を備えてもよい。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、マイクロ器官培養物は、肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、またはヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（ＨＰＶ）、例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−８もしくはＨＰＶ−３３のようなウイルスに感染された細胞の単離された集団を含む。ウイルスに感染された場合、マイクロ器官培養物は、ウイルス感染力のインヒビターを特定するための方法において用いることができる。この方法は、本発明の方法によってマイクロ器官外植体を単離する工程を包含するが、この外植体は、ウイルス感染された器官由来であるか、または引き続きインビトロでウイルスに感染されて、この移植体においてウイルス感染した細胞の集団を生じる。次いでこの外植体は、例えば、抗ウイルス活性について試験されている因子である、候補の因子と接触されてもよく、そしてこの候補因子の存在下における感染性のレベル（例えば、ウイルス負荷、新感染性など）が測定されて、候補因子の非存在下におけるこのウイルスによる感染性のレベルに対して比較される。候補因子の存在下におけるこのウイルスの感染性のレベルの低下は、ウイルス感染性のインヒビターの指標である。
【００１５】
本発明はまた、マイクロ器官培養物を生成するための方法に関する。この方法は、哺乳動物のドナー被験体から、最小培地中で少なくとも約２４時間維持可能な細胞の単離された集団を提供する寸法を有する、マイクロ器官外植体を単離する工程を包含する。次いで、このマイクロ器官外植体を培養中に置く。代表的にはこの外植体は、この外植体が単離される器官の微小構造を有する細胞の単離された集団を含む。本発明の１つの実施形態において、この外植体の少なくとも１つの細胞は、増殖する能力を有する。被験体のマイクロ器官培養物の細胞は、平衡の状態であってもよく、すなわち、細胞の集団における細胞損失に対する細胞増殖の比率は１であるか、またはマイクロ器官培養物における細胞は、それらが損失されるよりも大きい速度で増殖することが可能であって、結果として細胞の集団において、細胞損失の集団における細胞の損失に対する細胞増殖の比率は１より大きくなり、例えば、マイクロ器官外植体は、新生物組織から得られた細胞の集団を含む。
【００１６】
マイクロ器官培養物の細胞を単離することができる好ましい器官としては、リンパ器官、例えば、胸腺および脾臓；消化管器官、例えば、腸、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管；肺；生殖器官、例えば、前立腺および子宮；***；皮膚；尿管器官、例えば、膀胱；腎臓；角膜；および骨髄のような血液関連器官が挙げられる。これらの各々の例において、器官の微小構造は、培養された外植体によって維持される。マイクロ器官培養物は、組織切片、例えば、β島細胞を含む膵臓組織切片、例えば、表皮細胞および真皮細胞および他の皮膚特異的構造特徴、例えば毛包を備える皮膚組織切片であってもよい。
【００１７】
マイクロ器官外植体における細胞はまた、組み換えタンパク質を発現するように改変されてもよい。このタンパク質は、この外植体が由来する器官によって通常発現されてもされなくてもよい。例えば、膵臓によって通常生成され、本発明のトランスジェニック方法によって増大され得る、例えば、欠乏症を補正するための遺伝子産物としては、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ_２、エラスターゼ、およびアミラーゼが挙げられる；同様に、肝臓によって通常生成され、遺伝子補充療法によって補完され得る遺伝子産物としては、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、およびチトクロームｐ４５０酵素が挙げられる；胸腺によって通常生成される遺伝子産物としては、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、サイモポイエチンおよびサイモシンα１が挙げられる。
【００１８】
本発明のマイクロ器官培養物は、レシピエント被験体に対して遺伝子産物を送達するための方法において用いることができる。この方法は、ドナー被験体から単離された細胞の集団を提供する工程を包含する。この細胞の集団は、この細胞が単離される組織または器官の微小構造、および少なくとも約２４時間、最小培地中で維持可能な細胞の単離された集団を提供する表面積対容積を有する。次いで、所望の遺伝子産物をコードしかつ発現を指向する組み換え核酸を細胞の集団に導入して、マイクロ器官外植体、例えば、トランスジェニック外植体においてトランスジェニック細胞の集団を生成することができる。トランスジェニック外植体はレシピエント被験体に投与されてもよい。ドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ種の被験体であっても、異なる種の被験体であってもよい。
【００１９】
本発明のマイクロ器官培養物はまた、前駆細胞を含む、所定の器官の細胞の増殖を誘導する因子を同定するための方法において用いることができる。この方法は、本発明によるマイクロ器官外植体培養を生成する工程を包含するが、この外植体は、増殖する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。培養物に入れられた後、この外植体は、候補化合物、例えば、細胞増殖能について試験されるべき化合物と接触され、そしてこの候補化合物の存在下での細胞増殖のレベルが測定される。次いで、この候補化合物の存在下での細胞増殖の測定されたレベルを、候補化合物の非存在下での細胞増殖のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの増大は、細胞増殖因子の指標である。細胞増殖のインヒビターは、同様の方法を用いて同定することができる。詳細には、候補化合物の存在下で測定された細胞増殖のレベルが、上記の方法を用いて決定される場合、候補化合物の非存在下での細胞増殖のレベルに対してこれを比較することができる。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの減少は、細胞増殖のインヒビターの指標である。
【００２０】
本発明のマイクロ器官培養物を、所定の器官における１つ以上の細胞タイプの分化を誘導もしくは阻害する因子、または特定の分化した状態を維持する（脱分化を防止する）因子を同定するための方法において用いることができる。この方法は、目的の器官からマイクロ器官外植体生成する工程を包含する。この外植体を構成する細胞の集団は、本明細書において以下に記載されるように、その器官の微小構造、少なくとも約１．５ｍｍ^−１のアレフを有し、そして分化する能力を有するか、または分化されて脱分化する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。一旦培養されれば、細胞の集団は、候補化合物と接触されて、この化合物の存在下での細胞分化のレベルが測定される。候補化合物の存在下における細胞分化の測定されたレベルは、候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルと比較される。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの増大は、細胞分化因子の指標である。細胞分化のインヒビターは、同様の方法を用いて同定することができる。詳細には、候補化合物の存在下における細胞分化の測定されたレベルを、上記の方法を用いて決定する場合、これを候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルに対して比較することができる。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの低下は、細胞分化のインヒビターの指標である。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、器官から幹細胞または前駆体細胞集団を同定および単離するための方法を提供する。この方法は一般に、器官由来の細胞の集団の外植体を培養中で単離する工程を提供する。本明細書において記載されるとおり、この外植体は、以下によって特徴付けられる：（ｉ）この外植体が由来する器官の微小構造をこの培養中で維持すること、（ｉｉ）少なくとも約１．５５ｍｍ^−１の表面積対容積指数（アレフ）、および（ｉｉｉ）増殖する能力を有する少なくとも１つの前駆細胞または幹細胞。この外植体は、この外植体において細胞の別個の集団を増殖するために、前駆体または幹細胞の増殖を誘導する因子、例えば、増殖因子または他のマイトジェンと接触させられる。引き続き、この増殖された前駆細胞は、外植体から単離されてもよい。この外植体のこのような亜集団は、それらの増殖応答のおかげで同定することができる。他の実施形態では、前駆体／幹細胞は、外因性の因子の追加がなくても培養中で同時に増殖する。他の実施形態では、例えば、この外植体の残りから新たに出現する芽の直接の機械的分離によって、またはこの外植体の全てもしくは一部の分離および増幅された細胞集団の引き続く単離によって、この因子に応答して増殖する外植体から、前駆体または幹細胞を単離することができる。
【００２２】
本発明のマイクロ器官培養物を用いることができるさらに別の方法は、レシピエント被験体において創傷治癒を促進するための方法において用いることができる。この方法は、少なくとも約１．５ｍｍ^−１のアレフを有する細胞の集団であるドナー被験体から単離する工程、およびレシピエント被験体の創傷に対して細胞の集団を付加する工程を包含する。このドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ種の被験体であっても異なる種の被験体であってもよい。１つの実施形態においては、細胞を単離した組織は皮膚であり、そしてレシピエント被験体の創傷は潰瘍、例えば、糖尿病関連の潰瘍である。
【００２３】
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献中に詳細に説明される。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓによる、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３１９５号；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌＡｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白である。
図面の簡単な記述
図１は、アレフ（Ａｌｅｐｈ）を決定する寸法を描写するマイクロ器官の図表示であり、ここでｘ＝組織の厚みであり、ａ＝組織の幅である。
図２は、異なる時間のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、モルモットのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
図３は、１〜８日間の培養物のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、ヒトのバックスキンのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
図４Ａ〜４Ｄは、マウス皮膚（倍率５０×）（図４Ａ）、モルモット皮膚（倍率７５×）（図４Ｂ）、ヒト***（倍率５０×）（図４Ｃ）およびヒト***（倍率７５×）（図４Ｄ）の複製している細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
図５Ａ〜５Ｃは、ヒト表皮マイクロ器官外植体の横断面（倍率７５×）であって、培養の０日目（図５Ａ）、３日目（図５Ｂ）、および６日目（図６Ｄ）の組織構造を示す。
図６は、ＢｒｄＵ取り込みを用いて、モルモット皮膚のマイクロ器官培養物の種々の厚み（×）の表皮増殖に対する影響を実証する棒グラフであり、ここで（ａ）は、４ｍｍで一定に保たれている。
図７Ａ〜７Ｂは、膵臓由来のマイクロ培養物における増殖中の細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である（倍率７５×）。
図８は、成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物によって放出されたインスリンの量を示す棒グラフである。
図９は、培養の３日目、４日目、および６日目の結腸、肝臓、腎臓、十二指腸および食道のマイクロ器官培養物における増殖中の細胞への^３Ｈチミジン取り込みを示す棒グラフである。
図１０Ａ〜１０Ｃは、免疫蛍光によって決定されたマイクロ器官培養物における毛包の活性な増殖を示す顕微鏡写真である。倍率は４０×（図１０Ａ）、４０×（図１０Ｂ）、および７５×（図１０Ｃ）である。
図１１は、マイクロ培養の開始および終了の時点での毛幹のサイズ分布を示す棒グラフである。
図１２は、モルモット皮膚培養物において、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下でのマイクロ器官培養物における有糸***誘発の阻害を示す棒グラフである。
図１３は、慢性皮膚潰瘍の処置のためのマイクロ器官外植体の図表示であって、インビボで容易に操作可能な構造を維持するような組織切片の不完全な切り出しを示す。
図１４は、マイクロ器官培養物による正常な皮膚の切片の置き換え後のマウスの表面の写真である；治癒、このインプラントにおける新しい毛幹の発生、および正常なマウス皮膚へのこのインプラントの組み込みを観察することができる（倍率１０×）。
図１５は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のトランスフェクション後のモルモット皮膚マイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼレポーターの発現のグラフ表示である。
図１６は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のカチオン性脂質媒介トランスフェクション後のラット肺および胸腺のマイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
図１７は、本発明のマイクロ器官培養物におけるＦＧＦでの処置の際のテロゲン毛包の活性化のグラフ表示である。
図１８は、本発明のマイクロ器官外植体におけるトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
【００２５】
発明の詳細な記述
本発明は、３次元の器官外植体培養システムに関する。この培養システムは、インビボにおいて器官全体において見出される環境に密接に近似する環境における、インビトロでのマイクロ器官外植体の長期増殖のために用いることができる。本明細書において記載される培養システムは、インビボにおいて器官の対応物に対して類似の構造を維持するように増殖および適切な細胞成熟を提供する。
【００２６】
本発明のマイクロ器官培養物は、インビトロ培養システムを提供するが、ここでは組織または器官切片を長期間、維持し、そしてそれらの機能を保存することができる。これらの培養システムは、インビトロモデルを提供するが、ここでは細胞分化、細胞増殖、細胞機能、ならびにこのような細胞の特徴および機能を変更する方法を便利にかつ正確に試験することができる。得られた培養物は、インビボにおける移植から、インビトロにおける細胞傷害性化合物および薬学的化合物をスクリーニングすること、「バイオリアクター」における生物学的に活性な分子の産生、ならびに組織からの前駆体細胞の単離、までにおよぶ種々の用途を有する。
【００２７】
例えば、限定はしないが、本発明の特定の実施形態としては、以下が挙げられる：（ｉ）化学療法処置の間に破壊された骨髄を置換するために用いられたマイクロ器官骨髄培養物インプラント；（ｉｉ）肝硬変患者において肝臓機能を増強するために用いられるマイクロ器官肝臓インプラント；（ｉｉｉ）被験体のマイクロ器官培養物において増殖した遺伝子的に変化した細胞（例えば、インスリンをコードする組み換え遺伝子を発現する膵臓のマイクロ器官）；および（ｉｖ）口腔粘膜のマイクロ器官培養物に結合された歯科補綴物。
【００２８】
なお他の例示的な非限定的実施形態において、本発明のマイクロ器官培養物は、広範な種々の化合物、例えば、細胞傷害性化合物、増殖因子／調節因子、薬学的因子などをスクリーニングするためにインビトロで用いることができる。この目的を達成するために、マイクロ器官培養物をインビトロで維持して、試験されるべき化合物に曝露する。細胞傷害性化合物の活性を、例えば、それがこの外植体中の細胞を損傷するかまたは殺傷する能力によって測定することができる。
【００２９】
これは、生体染色技術によって容易に評価することができる。増殖因子／調節因子の効果は、例えば総細胞含量および異なる細胞含量によって、この外植体の細胞含量を解析することにより、評価することができる。これは、タイプ特異的な細胞抗原を規定する抗体を使用して免疫細胞科学技術の使用を含む、標準的な細胞学的技術および／または組織化学的技術を用いて達成することができる。三次元システムにおいて、培養された正常な細胞に対する種々の薬物の効果を評価することができる。例えば、赤血球形成を増大する薬物は、骨髄マイクロ器官培養物に対して試験することができる。例えば、コレステロール産生を低下させることによってコレステロール代謝に影響する薬物は、肝臓マイクロ器官に対して試験することができる。過剰増殖障害または新生増殖障害の研究を容易にするなどのためにも異常な組織のマイクロ器官培養物を用いることができる。例えば、増殖した腫瘍細胞に侵入された器官のマイクロ器官外植体は、例えば、抗腫瘍因子の有効性を試験するためにモデルシステムとして用いることができる。
【００３０】
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用した特定の用語を、ここに収集する。
【００３１】
「外植体」という用語は、身体から採取され人工的な培地中で増殖された、ある器官由来の細胞の集合をいう。間質性成分および上皮成分の両方を有する器官由来の外植体をいう場合、この用語は一般に、その器官由来の単一の外植体において両方の成分を含む外植体をいう。
【００３２】
「組織」という用語は、一緒になって特定の専門的な機能を実施する類似の特殊化された細胞の群または層をいう。
【００３３】
「器官」という用語は、組織の２つ以上の隣接する層であって、この組織の層が細胞間および／または細胞−マトリックスの相互作用のいくつかの形態を維持して、微小構造を生成する層をいう。本発明において、マイクロ器官培養物は、例えば、哺乳動物の皮膚、哺乳動物の膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道、膀胱、角膜、前立腺、骨髄、胸腺および脾臓のような器官から調製した。
【００３４】
「間質」という用語は、器官の支持組織またはマトリックスをいう。
【００３５】
「マイクロ器官培養物（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞の単離された集団、例えば、細胞が単離される器官または組織の微小構造を有する外植体をいう。すなわち、単離された細胞は一緒になって、空間的相互作用、例えば、細胞間、細胞−マトリックスおよび細胞−間質の相互作用、ならびにこの外植体が由来した現実の組織およびインタクトな生物体の配向をシミュレート／保持する三次元構造を形成する。従って、間質層と上皮層との間のこのような相互作用は、外植された組織において保存され、その結果、臨界の細胞相互作用が、例えば、自己分泌およびパラ分泌因子、ならびにこの外植体の生物学的機能を維持する他の細胞外刺激を提供し、そして十分な栄養および廃棄物輸送がそのサンプル全体にわたって生じる条件下で長期の生存を提供する。
【００３６】
本発明のマイクロ器官培養物は、細胞または組織外植体が単離される器官または組織の微小構造を有する。本明細書において用いる場合、「微小構造（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」という用語は、細胞または組織の外植体の単離された集団であって、ここでこの細胞の集団の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％以上が、インビトロにおいて、少なくとも１つの細胞または非細胞性物質とのそれらの物理的および／または機能的な接触を維持しており、この物質とそれらの細胞は、インビボで物理的および／または機能的に接触しており、そして少なくとも約１つ、より好ましくは少なくとも約５つ、そして最も好ましくは少なくとも約１０以上の層の細胞培養物を形成する、集団をいう。好ましくは、この外植体の細胞は、それが単離される器官または組織の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００３７】
「単離された」という用語は、本明細書において用いる場合、生物体におけるその天然の環境から分離された外植体をいう。この用語は、その天然の環境からの全体的な物理的分離、例えば、ドナー動物、例えばヒトまたはミニブタのような哺乳動物からの取り出しを包含する。例えば、「単離された」という用語は、外植体である細胞の集団、外植体の一部として培養されている細胞の集団、または外植体の形態で移植されている細胞の集団をいう。細胞の集団について言及するために用いられる場合、「単離された」という用語は、本発明のマイクロ器官培養物における細胞の増殖から生じる細胞の集団を包含する。
【００３８】
「外胚葉」という用語は、胚の３つの原始胚層の最外側をいう；表皮および表皮組織、例えば、爪、髪、および皮膚の汗腺、神経系、外的感覚器官、ならびに口および肛門の粘膜は、それに由来する。
【００３９】
「上皮」および「上皮組織」という用語は、身体の内面および外面の細胞被覆（皮膚、粘膜、および漿液）をいい、これには、それに由来する腺および他の構造、例えば、角膜、食道、表皮および毛包上皮細胞が含まれる。他の例示的な上皮組織としては、以下が挙げられる：鼻腔の嗅部を裏打ちし、臭いの感覚のためのレセプターを含む偽重層上皮である嗅上皮；腺上皮（これは、分泌細胞から構成される上皮組織をいう）；扁平上皮（これは、扁平な板状細胞から構成される上皮組織をいう）。上皮組織という用語はまた、移行性の上皮をいうこともあるが、これは、収縮および膨張に起因する大きな機械的変化にさらされる中空の器官、例えば、層化した扁平上皮と円柱上皮との間の移行を示す組織を裏打ちすることが特徴的に見出されている。「上皮形成」という用語は、剥皮された表面を覆う上皮組織の増殖による治癒をいう。
【００４０】
「皮膚（ｓｋｉｎ）」という用語は、真皮および上皮から構成される身体の外側の防御的被覆をいい、そして汗腺および脂腺、ならびに毛包構造を含むことが理解される。本出願を通じて、付加的な「皮膚の（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」を用いてもよく、それらが用いられる状況に応じて、一般に皮膚の属性をいうと理解されるべきである。
【００４１】
「表皮」という用語は、胚期の外胚葉由来の皮膚の最外層および導管のない層をいい、これは０．０７〜１．４ｍｍの厚みに及ぶ。手の平および足の裏の表面において、これは、外側から以下の５つの層を含む：垂直に配列された円柱状細胞から構成される基底層；短突起または針を有する平坦な多角形の細胞から構成される有棘細胞または突起のある層；平坦な顆粒細胞から構成される顆粒層；核が不明瞭であるかまたは存在しない、いくつかの層の透明な透過的な細胞から構成される透明な層；および平坦な角化された非有核細胞から構成される角層。全身の体表の表皮において、透明な層は通常存在しない。「類表皮」は、表皮を模倣する細胞または組織であるがまた、非皮膚反応部位において生じる任意の腫瘍をいうために用いてもよく、そして表皮エレメントの封入によって形成されてもよい。
【００４２】
「真皮（ｃｏｒｉｕｍまたはｄｅｒｍｉｓ）」とは、脈管の結合組織の濃密な層からなり、かつ感覚の神経および末端器官を含む、表皮に対して真下の深部の皮膚の層をいう。毛根、ならびに皮脂腺および汗腺は表皮の構造であって、真皮に深く包埋されている。
【００４３】
「腺」という用語は、細胞の普通の代謝要件に関連しない物質を分泌または***するように特殊化された細胞の集合をいう。例えば「皮脂腺」は、脂性の物質および皮脂を分泌する真皮のホロクリン腺である。「汗腺」という用語は、汗を分泌する腺であって、真皮または皮下組織に位置し、体表上の管によって開口している腺をいう。通常の汗腺またはエクリン汗腺は、ほとんどの体表にわたって分布しており、そして分泌物の蒸発による冷却を促進する；アポクリン汗腺は、皮膚上に直接ではなく、毛包の上部に入り、そして肛門周囲および腋下のような特定の身体領域にのみ見出される。
【００４４】
「毛（髪）」（または「線毛」）という用語は、糸状の構造であって、特に特殊化した表皮構造をいう。これは、ケラチンからなり、真皮に落ち込んだ乳頭から発達しており、哺乳動物によってのみ生成されて、その群の動物の特徴である。この用語はまたこのような毛（髪）の集合をいう。「毛包」とは、毛（髪）を内包している表皮の管状の陥入であって、これから毛（髪）が成長する管状の陥入の１つをいう；そして「毛包上皮細胞」とは、毛包において真皮によって囲まれている上皮細胞、例えば、幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリックス細胞および内毛根鞘細胞をいう。このような細胞は、正常な非悪性細胞であってもよいし、または形質転換細胞／不死化細胞であってもよい。
【００４５】
「脱毛症」という用語は、一般に禿頭、例えば、通常は毛（髪）が存在する皮膚領域から毛（髪）がなくなることをいう。種々の形態の脱毛症が当該分野で知られている。例えば、円形脱毛症は、はっきりと規定された領域の、通常は可逆性の毛（髪）の喪失をいうが、これは通常、あごひげまたは頭髪を含む；薬物性脱毛症とは、薬物の摂取に起因する毛（髪）の喪失をいう；そして男性型脱毛症、または男性型禿頭とは、遺伝的に決定されたアンドロゲン依存性の頭髪の喪失をいい、これは一般に前頭部の後退で開始して、対称的に進行して、最終的には、まばらな周辺の縁の毛（髪）のみが残る。
【００４６】
本出願を通じて、「増殖性皮膚障害」という用語は、皮膚組織の無用であるかまたは異常な増殖によって特徴付けられる皮膚の任意の疾患／障害をいう。これらの状態は代表的には、表皮細胞増殖または不完全な細胞分化によって特徴づけられ、そしてこれらの状態としては例えば、Ｘ連鎖型魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症および脂漏性皮膚炎が挙げられる。例えば、表皮異形成は、表皮の不完全な発育の形態、例えば、「疣贅状表皮発育異常症」であり、これは尋常性疣贅のウイルスと同一のウイルスまたは密接に関連するウイルスに起因する状態である。別の例は、「表皮剥離」であって、これは自然にまたは外傷の部位のいずれかで水疱の形成を伴う表皮の弛緩した状態をいう。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「乾癬」という用語は、皮膚の調節機構を変更する過剰増殖性皮膚障害をいう。詳細には、表皮増殖における一時的変更および二次的変更、皮膚の炎症性応答、ならびにリンホカインおよび炎症性因子のような調節分子の発現を含む病変が形成される。乾癬皮膚は、表皮細胞の代謝回転の増大、肥厚した表皮、異常な角質化、真皮層への炎症性細胞浸潤、および表皮層への多形核白血球浸潤（基底細胞周期の増大を生じる）によって形態学的に特徴付けられる。さらに、角化性細胞およびパラ角化細胞が存在する。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」とは、有糸***を受けている細胞をいう。
【００４９】
「前駆細胞」という用語は、増殖可能であり、かつ多数の母細胞（次に分化するかまたは分化可能である娘細胞を生じ得る）を生じる能力を有するより多くの前駆細胞を生じることが可能な未分化の細胞をいう。本明細書において用いる場合、「前駆細胞」という用語はまた、当該分野で時に「幹細胞」と呼ばれる細胞を包含することを意図する。好ましい実施形態において、「前駆細胞」という用語は、一般化された母細胞であって、その子孫がしばしば、分化によって、例えば、胚細胞および組織の進行性の多様化において生じるような、完全に個々の特徴を獲得することによって、異なる方向に特殊化する母細胞をいう。例えば、「造血前駆細胞」（または幹細胞）とは、骨髄および他の血液関連器官において生じ、そして例えば、赤血球、リンパ球および他の血液細胞のような分化した子孫を生じる前駆細胞をいう。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「形質転換細胞」とは、無制限の増殖の状態に自然に変換した細胞をいい、すなわちそれらは、培養において無限な回数の***にわたって増殖する能力を獲得している。形質転換細胞は、増殖制御の喪失に関して、新生物、未分化、および／または過形成のような用語で特徴付けることができる。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「不死化した細胞（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｃｅｌｌｓ）」とは、細胞が培養において無限の回数の***によって増殖する能力を有するように、化学的および／または組み換え方法を介して変更された細胞をいう。
【００５２】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、かつ転移を生じる傾向である上皮細胞から構成される悪性の新増殖をいう。代表的な癌腫としては、「基底細胞癌腫」が挙げられる。これは、皮膚の上皮腫瘍であって、ただしほとんど転移はせず、局所的な浸潤および破壊の可能性を有する；「扁平上皮細胞癌」とは、扁平上皮から生じ、かつ立方体細胞を有する癌腫をいう；「癌肉腫」は、癌および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む；「腺細胞癌腫（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、乳腺および唾液腺、ならびに呼吸器管の粘液腺に存在する小上皮細胞の巣または索によって分離されるかまたは囲まれる硝子質または粘液性間質の円柱または帯によって印される癌腫である；「類表皮癌」は、表皮の方法と同じ方法で分化する傾向である癌細胞をいう；すなわち、それらは有棘細胞を形成し、角質化を受ける傾向である；「鼻咽頭癌」は、鼻の後ろの空間の上皮裏打ちにおいて生じる悪性腫瘍をいう；そして「腎細胞癌腫」は、種々の配列の管状細胞からなる腎柔組織の癌腫に関する。別の癌腫上皮増殖は、「乳頭腫」であり、これは、上皮に由来し、かつ原因因子としてパピローマウイルス（乳頭腫ウイルス）を有する良性腫瘍をいう；そして「類表皮腫」は、中央の溝の閉鎖の時点で外胚葉性エレメントの封入によって形成された脳腫瘍または髄膜の腫瘍をいう。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「トランスジェニック動物」は、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥または両生類であって、ここで動物の１つ以上の細胞は、人間の介入、例えば当該分野で周知のトランスジェニック技術によって誘導された異種核酸を含む。この核酸は、慎重な遺伝子操作の方法による、細胞の前駆体への導入によって、例えば、組み換えウイルスを用いたマイクロインジェクション、または感染などによって、直接または間接的に細胞に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な交差育種もインビトロの受精も含まず、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入に関する。この分子は、染色体の中に組み込まれてもよいし、または染色体外でＤＮＡを置換してもよい。この用語はまた、例えば、当該分野で記載されたＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構築物などの、組み換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物を包含する。トランスジェニック動物はまた、構成的な「ノックアウト」動物および条件的な「ノックアウト」動物の両方を含む。本発明の「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎａｎｉｍａｌｓ）」としては、げっ歯類、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような脊椎動物が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、ミニブタであるか、またはラットおよびマウス、最も好ましくはマウスを含むげっ歯類のファミリーから選択される。「キメラ動物（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｉｍａｌ）」という用語は本明細書において、組み換え遺伝子が見出される動物か、または組み換え体がその動物の全ての細胞ではないがいくつかの細胞で発現される動物をいうために用いられる。
【００５４】
Ｉ．マイクロ器官培養の確立
本発明のマイクロ器官培養の顕著な特徴および方法は、本発明によれば、特定の組織についてインビボで見出される細胞の微小環境を保存する能力である。本発明は、規定された環境下において、器官外植体の異なる組織層、例えば、間充織層および上皮層における細胞の増殖が、培養中で増殖しかつ成熟するように活性化され得るという発見に部分的には基づく。さらに、外植体自体において提供された細胞間の相互作用および細胞−マトリックス間の相互作用は、細胞のホメオスタシス、例えば、外植体培養における細胞の成熟、分化および分離を支持し、それによって組織の微小構造および機能を長期間維持するのに十分である。
【００５５】
細胞と非細胞基質（マトリックス）との間の物理的な接触の例は、上皮細胞とその基底膜との間の物理的な接触である。細胞と別の細胞との間の物理的な接触の例としては、例えば、ギャップ結合および密着結合のような細胞間の細胞結合によって維持される、実際の物理的な接触が挙げられる。１つの細胞と別の細胞との間の機能的な接触の例としては、細胞の間の電気的または化学的な連絡が挙げられる。例えば、心筋細胞は、電気的なインパルスを介して他の心筋細胞と連絡する。さらに、多くの細胞が化学的なメッセージ、例えば、局所的に拡散するか（パラクリンシグナル伝達および自己分泌シグナル伝達）または脈管系によってさらに遠隔の位置に輸送される（内分泌シグナル伝達）かのいずれかであるホルモンを介して他の細胞と連絡する。細胞の間のパラクリンシグナル伝達の例は、消化管の種々の細胞（腸内分泌細胞として公知）、例えば、幽門Ｄ細胞（ソマトスタチンを分泌し、これが次に近傍の幽門胃（Ｇ）細胞によってガストリンの放出を阻害する）によって生成されたメッセージである。
【００５６】
いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、この微小構造は、例えば、血清も増殖因子もその外因性の供給源なしに、最小培地における外植体の維持のために極度に重要であり得る。なぜならこの組織は、外植体内の特定の細胞相互作用から生じるパラクリンおよび自己分泌因子によって、このような最小培地中で維持され得るからである。
【００５７】
さらに、「インビトロにおいて、それらの物理的接触および／または機能的接触を維持する」という句は、細胞の単離された集団であって、少なくとも１つの細胞が少なくとも１つの細胞または非細胞物質と物理的接触および／または機能的接触を発達させ、この物質とそれらの細胞は、インビボで物理的および／または機能的に接触していない、細胞の単離された集団を排除することを意図しない。このような発達の例は、単離された細胞集団の少なくとも１つの細胞の増殖である。
【００５８】
好ましい実施形態において、外植体を構成する細胞の集団は、外植体に異なる細胞が存在する場合、例えば、この異なる細胞の層を保存するために、１つの細胞の別の細胞に対する天然の親和性を保存する方式で器官から単離される。例えば、皮膚のマイクロ器官培養において、表皮のケラチノサイトは、間質と会合したままであり、そして毛包および腺を含む正常な組織機構は、保存されている。この基礎的な構造は、例えば、上皮成分を含む全ての器官に共通である。さらに、このような会合によって細胞間の連絡が容易になる。多くのタイプの連絡が動物の細胞の間で生じる。これは、分化している細胞においては特に重要である。この分化している細胞では、誘導は、応答している細胞が分化の方向の変化を受ける結果として、１つの（誘導している）組織または細胞と別の（応答している）組織または細胞との間の相互作用として規定される。さらに、誘導性の相互作用は、胚細胞および成体細胞において生じ、そして形態形成的パターンを確立しかつ維持し、そして分化を誘導するように作用し得る（Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１８５〜１９９）。
【００５９】
さらに、本発明によって調製されたマイクロ器官培養物は、長期間培養された場合でさえ、正常な組織構造を保存する。これは、インビトロにおける皮膚マイクロ器官の毛包、汗腺および脂腺であって、インビボにおけるその正常な出現に従うもの（実施例ＶＩＩＩおよび図１０Ａ〜１０Ｃを参照のこと）、または膵臓におけるランゲルハンス島であって、インビボにおけるその正常な出現に従うもの（実施例ＩＶ、ＶおよびＶＩを参照のこと）の維持を含む。これらの培養物は、管理されかつ均一な条件、およびさらにインビボにおいて密接に類似した組織で維持することが可能であるので、それらによって、天然の現象ならびに疾患、加齢または外傷から生じる天然の現象の摂動を観察、測定および制御するための固有の機会が提供される。さらに、この培養物上の同定された部位において個々の細胞を研究するための技術は直ちに利用可能であるので、組織の個々の成分の機能がお互いにそして組織全体と相互作用する場合、この組織の個々の成分に対する洞察が提供される。
【００６０】
本発明によって調製されたマイクロ器官培養物の例は、添付の実施例に記載されており、そして１つの細胞の別の細胞に対する天然の親和性を保存するように複数の層を含み得る方式で分類された細胞の集団を含み得る。個々の細胞または細胞群の増殖は、オートラジオグラフィーまたは免疫蛍光によって観察し追跡することができる。
【００６１】
単にさらなる例示であるが、この添付の実施例によって、被験体の培養システムが、インビトロにおいて、生理学的な条件に匹敵するシステムにおいて、上皮および間質要素の複製を提供することが実証される。重要なことに、このシステムで複製する細胞は、適切に分離して、形態学的にかつ組織学的に正常な表皮および真皮成分を形成する。
【００６２】
もともとの組織の細胞間、細胞−マトリックス間および細胞−間質の構造を保持する外植体の単離に加えて、この外植体の寸法は、例えば、マイクロ器官培養物が長期間、例えば７〜２１日間以上の間、維持されることを意図する場所における、細胞の生存度に重要である。従って、組織外植体の寸法は、十分な栄養物およびガス、例えばＯ_２を３次元マイクロ器官におけるあらゆる細胞に拡散するように、そしてマイクロ器官における廃棄物の局在化に起因する細胞毒性および付随する死亡を最小限にするためにこの外植体の外側に細胞の廃棄物を拡散するように選択される。従って、この外植体のサイズは、特殊化された送達構造または合成基質の非存在下において各々の細胞に対する最小レベルの接近可能性についての要件によって決定される。本明細書に記載されるように、この外植体の厚みおよび幅から算出される指数であるアレフが少なくとも約１．５ｍｍ^−１より大きい場合、この接近可能性が維持され得るということが発見されている。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「アレフ」とは、式１／ｘ＋１／ａ≧１．５ｍｍ^−１によって与えられる、表面積対容積比をいう；ここでｘ＝組織の厚みであり、そしてａ＝組織の幅（ミリメートル）である。好ましい実施形態において、外植体のアレフは、１．５〜２５ｍｍ^−１の範囲、より好ましくは１．５〜１５ｍｍ^−１の範囲、そしてなおより好ましくは１．５〜１０ｍｍ^−１の範囲であるが、１．５〜６．６７ｍｍ^−１の範囲、１．５〜３．３３ｍｍ^−１の範囲のアレフが意図される。
【００６４】
従って、本発明によって、組織外植体の表面積対容積指数は、選択された範囲内に維持される。この表面積対容積の指数の選択された範囲によって、単層における細胞と類似の様式で拡散によって、栄養物に対しておよび廃棄物廃棄の通路に対する細胞の接近が得られる。このレベルの接近可能性は、本明細書において「アレフまたはアレフ指数」として規定された、表面積対容積の指数が少なくとも約１．５ｍｍ^−１である場合、達成しかつ維持することができる。３次元は表面積対容積指数を決定するのには無視された。なぜなら、３次元におけるバラツキは、容積および表面積の両方に放射測定のバラツキを生じるからである。しかし、アレフを決定する場合、ａおよびｘは、組織切片の最小の二次元として規定されるべきである。
【００６５】
アレフの例は、表Ｉに提供されており、ここでは例えば、０．１ｍｍの厚み（ｘ）および１ｍｍの幅（ａ）を有する組織が、１１のアレフ指数を有する。実施例Ｉにおいて、この組織はｘ＝０．３ｍｍおよびａ＝４ｍｍを有し、その結果アレフ＝３．４８である。実施例ＩＩＩにおいて、ｘは、変化して、ａは４ｍｍで一定である。図６に例示されるように、増殖性活性は、外植体の厚みの増大につれて実質的に低下される。従って、９００μｍの厚みでは、マイクロ器官培養物中の増殖している細胞の数は、３００μｍの厚みを有する同様の供給源由来の組織における数の約１０分の１である。９００μｍの厚みを有する組織のアレフ指数は、本明細書に記載された最小より下の１．３６ｍｍ^−１であるが、３００μｍの厚みを有する組織のアレフ指数は、本明細書に記載された範囲の十分内側である３．５８ｍｍ^−１である。
【表１】

【００６６】
ここでも、いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、この３次元培養システムによって提供される多数の要因が、その成功に寄与し得る：
（ａ）例えば、上記のアレフ計算の使用による外植体サイズの適切な選択によって、３次元マトリックスは、外植体の全ての細胞に対する栄養物の適切な拡散のための、およびこの外植体中の全ての細胞からの細胞性廃棄物の十分な拡散のための適切な表面積対容積比を提供する。
（ｂ）マトリックスの３次元性のおかげで、種々の細胞は、単層培養の細胞と対称的に活発に増殖を続ける。単層培養の細胞は、コンフルエンスまで増殖して接触阻害を示し、増殖および***を停止する。外植体の細胞を複製することによる、増殖および調節因子の同化作用は部分的に、培養中の細胞の増殖を刺激しかつ分化を調節することを、例えば、全体的容積に関して静止しているマイクロ器官培養についてさえ担う。
（ｃ）３次元マトリックスは、細胞性エレメントの空間的分布を保持しているがこれは、インビボにおける対応する組織において見出されるものに密接に近似する。
（ｄ）細胞間の相互作用および細胞−マトリックス間の相互作用によって、細胞成熟に対して誘導性の局所的な微小環境の確立が可能になり得る。分化した細胞表現型の維持には、増殖／分化因子が必要なだけでなく、適切な細胞相互作用も必要であることが認識されている。本発明は組織の微小環境を効率的に模倣する。
【００６７】
以下の例示的な実施例に記載されるように、動物（ヒトを含む）由来のマイクロ器官培養物、例えば、皮膚、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道、膀胱、骨髄、胸腺または脾臓由来の培養物を単離して、培養物中で２１日間にわたって増殖させた。しかし、２１日を上回って長期間培養物を維持することも、本発明の範囲内である。
【００６８】
ＩＩ．マイクロ器官培養のための外植体の供給源
本発明のマイクロ器官培養物は、例えば以下から単離された外植体を用いて誘導されてもよい：皮膚および粘膜（口腔粘膜、胃腸粘膜、鼻道、呼吸管、子宮頸部および角膜を含む）；膵臓；肝臓；膀胱；胆管；肺；前立腺；子宮；乳腺；膀胱組織；ならびに胸腺、脾臓および骨髄のような血液関連器官。従って、このような器官のインビトロ培養の等価物が生成され得る。外植体を形成する組織は、病的であっても正常（例えば、健常組織）であってもよい。例えば、本発明のマイクロ器官外植体を単離する器官は、以下によって影響され得る：過剰増殖性障害、例えば、乾癬または角化症；ウイルス感染した細胞、例えば、肝炎に感染したまたはパピローマウイルス感染した細胞の増殖；新生増殖性障害、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、肉腫またはウィルムス腫瘍；あるいは線維性組織、例えば、硬変した肝臓または膵炎を被っている膵臓。
【００６９】
本発明の細胞が単離され得る動物の例としては、ヒトおよび他の霊長類、ブタ、例えば、完全にまたは部分的に近交系のブタ（例えば、ミニブタおよびトランスジェニックブタ）、げっ歯類などが挙げられる。
【００７０】
ＩＩＩ．増殖培地
動物由来の細胞を培養するために存在する多数の組織培養培地がある。これらのいくつかは複雑であり、いくつかは単純である。マイクロ器官培養物は、複雑な培地中で増殖し得ることが期待されているが、その培養物は、ダルベッコの最小必須培地のような単純な培地中で維持され得ることが本明細書において示されている。さらに、この培養物は血清または下垂体抽出物のような他の生物学的抽出物を含む培地において増殖され得るが、血清も任意の他の生物学的抽出物も必要ではないことが本明細書において示されている。さらに、器官培養物は長期間、血清の非存在下で維持され得る。本発明の好ましい実施形態において、増殖因子は、インビトロにおける培養物の維持の間この培地中に含まれない。
【００７１】
最小培地における増殖に関するポイントは重要である。現在、哺乳動物細胞の長期増殖のためのほとんどの培地またはシステムは、不明確なタンパク質を組み込んでいるか、または支持細胞を用いて、このような増殖を維持するのに必要なタンパク質を提供する。このような不明確なタンパク質の存在は、本発明のマイクロ器官培養物の意図された最終用途を邪魔し得るので、不明確なタンパク質の存在を最小限にする条件下でこの外植体を培養することが一般に所望され得る。
【００７２】
本明細書において用いる場合、「最小培地」という言葉は、細胞が培養中で生存しかつ増殖するために必要である栄養物のみを含む、化学的に規定された培地をいう。代表的には、最小培地は生物学的抽出物、例えば増殖因子、血清、下垂体抽出物、または培養物における細胞集団の生存および増殖を支持するために必要でない他の物質を含まない。例えば、最小培地は一般に少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのビタミン、少なくとも１つの塩、少なくとも１つの抗生物質、少なくとも１つの指示薬、例えばフェノールレッド（水素イオン濃度を決定するために用いられる）、グルコース、ならびに細胞の生存および増殖のために必要な他の雑多な成分を含む。最小培地は血清を含まない。種々の最小培地が、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから最小必須培地として市販されている。
【００７３】
しかし、増殖因子および調節因子は、培地に添加される必要は無いが、このような因子の添加、または他の特殊化した細胞の接種を用いて、培養物中の増殖および細胞成熟を増強、変更または調節することができる。培養物中の細胞の増殖および活性は、インスリン、増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）および肝細胞増殖因子のような種々の増殖因子によって影響され得る。増殖および／または分化を調節する他の因子としては、プロスタグランジン、インターロイキンおよび天然に存在する負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびトランスフォーミング成長因子−βファミリーのメンバーが挙げられる。
【００７４】
マイクロ器官培養物は、２４ウェルまたは９６ウェルのマイクロプレートのような任意の適切な培養容器中で維持されてもよく、そして５％ＣＯ_２中で、３７℃で維持されてもよい。この培養物は、通気を改良するために振盪されてもよく、振盪の速度は例えば１２ｒｐｍである。
【００７５】
本発明のマイクロ器官培養物が（必要に応じて）（その中にまたは上に）提供される培養容器に関して、好ましい実施形態においてはこのような容器は一般に、任意の材料および／または形状の容器であってもよいことに注意すべきである。多数の異なる材料が容器を形成するために用いられ得、これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリビニルクロライド）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；テフロン）、サーマノックス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ネコ腸縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストランなど。これらの材料のいずれをメッシュに織ってもよい。マイクロ器官培養物がそれ自体、インビボで移植すべき場合、例えば、ポリグリコール酸、ネコ腸縫合糸材料、またはゼラチンのような生分解性マトリックスを使用することが好ましいかもしれない。この培養物を長期間維持するかまたは凍結保存すべき場合、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などのような非分解性の材料が好ましいかもしれない。本発明によって用いることができる従来のナイロンメッシュは、Ｎｉｔｅｘであり、これは平均孔径２１０μｍおよび平均ナイロン繊維直径９０μｍを有するナイロンろ過メッシュである（＃３−２１０／３６、Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）。なお他の実施形態を以下に考察する。
【００７６】
例示的な実施形態において、ランゲルハンス島を含む膵臓のマイクロ器官は、本発明の培養物として調製される。次いで、この培養物は、免疫拒絶を回避するためにカプセル化形態で提供される。カプセル化のための３つの一般的（例示的）アプローチが用いられ得る。第一に、管状膜はマイクロ器官外植体を含むハウジング中に巻かれる。この膜はポリマー移植片に接続されて、このポリマー移植片が次にこのデバイスを血管に接続する。膜を通る前後のグルコースおよびインスリンの自由な拡散を可能にし、さらに抗体およびリンパ球の通過をブロックするため、膜透過性の操作によって、このデバイスで処置された膵臓摘出動物において正常血糖を維持することができる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：７１８）。
【００７７】
第二のアプローチでは、膵臓外植体を含む中空のファイバーを（必要に応じて）アルギン酸ポリサッカライド中で固定する。このデバイスが糖尿病動物に腹腔内に入れられる場合、血糖値を、低くすることが可能で、そして良好な組織適合性が観察できる（Ｌａｃｅｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１７８２；また、実施例ＶＩも参照のこと）。従って、線維を予めスピンして引き続きマイクロ器官外植体とともに装填してもよい（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第４８９２５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第５１０６６２７号；Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９０）Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：３９〜４４；Ｊａｅｇｅｒら、（１９９０）Ｐｒｏｇ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．８２：４１〜４６；ならびにＡｅｂｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．ＢｉｏｍｅｃｈＥｎｇ．１１３：１７８〜１８３）。
【００７８】
第三に、マイクロ器官の島外植体は、アルギン酸またはポリアクリレートからなるマイクロカプセルに入れられてもよい（例えば、以下を参照のこと：Ｌｉｍら（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２１０：９０８；Ｏ’Ｓｈｅａら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ａｃｔａ８４０：１３３；Ｓｕｇａｍｏｒｉら、（１９８９）ＴｒａｎｓＡｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ３５：７９１；Ｌｅｖｅｓｑｕｅら（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３０：６４４；およびＬｉｍら（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５３：１１８０）。
【００７９】
最終的に、本発明のマイクロ器官培養物が維持される培養培地は、馴化培地の供給源として収集され得ることが注目される。「馴化培地」という用語は、例えば、培養された細胞／組織を含まない上清であって、培養細胞との接触のある時間後に生じ、その結果この培地が、細胞によって産生され、この培養物中に分泌された特定のパラクリン因子および／または自己分泌因子を含むように変更されている上清をいう。このような産物の例は、インスリン、種々の増殖因子、およびホルモンである。この馴化培地は、他のタイプの細胞培養および組織培養のための培養培地として用いられ得る。あるいは、この馴化培地は、増殖因子のような新規な細胞産物の供給源として使用されてもよい。このような産物は、この馴化培地から分画して精製または実質的に精製することができる。
【００８０】
ＩＶ．マイクロ器官培養物の生物学的特性の測定
正常な組織に由来する本発明のマイクロ器官培養物は、組織の全体的な増殖なしに構成細胞の増殖を伴いホメオスタシスの状態を維持することが示されている。
【００８１】
細胞増殖を測定する方法は当該分野で周知であり、そして最も通常には、細胞複製のＤＮＡ合成特徴を決定する工程を包含する。ＤＮＡ合成を測定するための多くの方法が当該分野に存在しており、そのいずれかが本発明に従って用いられ得る。本発明の実施形態において、免疫蛍光による検出のために放射性標識（^３Ｈ−チミジン）または標識されたヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を用いてＤＮＡ合成が決定された。
【００８２】
マイクロ器官培養物は、成熟細胞の増殖によってだけでなく、前駆体細胞（ある場合には胚性細胞を含む）の能動的な関与によっても形成されかつ維持され得る。マイクロ器官培養物は、これらの前駆体細胞の天然の進化を保存し、特定し、単離し、そして促進するために適切な環境を提示することが示されている。例えば、基底層の未成熟の細胞は、皮膚のマイクロ器官培養において成熟ケラチノサイトになることが観察されている。同様に、胚性膵臓細胞は、マイクロ器官培養物において成熟膵臓上皮を提供し得る。前駆体細胞の成熟および成体細胞としてのそれらの引き続く機能化は、表皮細胞における特定のケラチン、ならびに膵臓上皮におけるインスリン、Ｇｌｕｔ２およびグルカゴン、ならびに肝臓マイクロ器官培養物におけるアルブミンおよび第ＶＩＩＩ因子のような特殊化した産物の分泌を測定することによって、モニターすることができる。
【００８３】
本発明に従って調製されたマイクロ器官培養物は、インビボに存在する正常な組織構造を保存する。上述のように、これは、インビボにおいて、ならびに膵臓マイクロ器官におけるインスリンおよびグルカゴン分泌細胞の正常な出現に従う、インビトロでの皮膚マイクロ器官における毛包、汗腺および皮脂腺の維持を含む。これらの培養物は管理条件および均一な条件で維持されてもよく、さらにそれらはインビボにおいて器官の微小構造を密接に近似するので、それらによって、天然の現象ならびに疾患、加齢または外傷から生じる天然の現象の摂動を観察し、測定し、そして管理する固有の機会が得られる。さらに、この培養物上の特定の部位において個々の細胞を研究するための技術の入手し易さによって、この器官の個々の成分の機能化、およびそれらのお互いに対する相互作用ならびに器官全体についての洞察が得られる。
【００８４】
さらに、本発明のマイクロ器官培養物は、培養中で、長期間維持可能である。好ましくは、マイクロ器官培養物は、少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約２日間、さらにより好ましくは少なくとも約５日間、なおより好ましくは少なくとも約７日間、なおさらに好ましくは少なくとも約２週間以上、培養中で維持可能である。本発明のマイクロ器官培養物は代表的には、培養中で少なくとも７日間、維持される。例示するために、ヒト、マウス、モルモットおよびラットの皮膚由来の皮膚マイクロ器官培養物を、少なくとも約２１日間、培養中で維持している。
【００８５】
本明細書において用いる場合、「培養中で維持可能」という言葉は、組織外植体の細胞の集団であって、その細胞の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは９５％以上が、特定の期間後に培養中で生存可能である細胞の集団をいう。
【００８６】
好ましい実施形態において、マイクロ器官培養物における細胞の、例えば死亡または抜け落ちによる、細胞損失に対する細胞増殖の比は１に等しく、すなわち増殖した細胞の数は、損失した細胞の数に等しい。本発明の別の実施形態において、マイクロ器官培養物における細胞の細胞損失に対する細胞増殖の比は１より大きく、すなわち細胞が損失するよりも大きい率で細胞が増殖している。後者の場合には、マイクロ器官培養物は、増幅している細胞の集団を含むことが理解される。
【００８７】
Ｖ．マイクロ器官培養物の適用
本発明のマイクロ器官培養物の例示的な適用としては以下が挙げられる：
（ａ）組織および器官の正常なホメオスタシスに関与する因子の特定；
（ｂ）栄養物の変化および潜在的に毒性の因子の存在を含む環境の変化に関する、器官の組織および細胞の正常なホメオスタシスに対する影響を研究すること；
（ｃ）病因または外傷の開始およびその間に誘発される、器官の組織および細胞における変化の経路を理解すること；
（ｄ）病因または外傷に関連する環境の変化における有害な影響を逆転する修復機構の特定；
（ｅ）組織の正常なホメオスタシスの間に分化する細胞の発達調節。
（ｆ）毛包のような器官内の特殊化した構造の発達調節；
（ｇ）慢性の皮膚潰瘍、種々の形態の糖尿病または慢性肝不全を有する患者に生じるような、個々の器官の一部が残っているが損傷をうけた組織を置換または再生するには不十分である器官の補充／移植；
（ｈ）薬物スクリーニングおよび細胞毒性研究のための組織／器官等価物として；
（ｉ）増殖障害のための診断アッセイとして；
（ｊ）新規な増殖因子の供給源として；
（ｋ）幹細胞／前駆体細胞の供給源として；
（ｌ）分子を誘導する供給源として；
（ｍ）分子を誘導するためのスクリーニングとして；
さらなる例示のために、本発明の方法は、マイクロ器官培養物の形態で皮膚等価物を生成するために用いることができる。背景として、創傷処置の目的で、詳細には火傷の処置において、ヒト皮膚を模倣するような方式で上皮細胞を増殖するための多くの試みが記載されていることが注目される。皮膚は２つのタイプの組織からなる。以下が存在する：（１）高密度コラーゲンマトリックス内にまばらに分散される線維芽細胞、ならびに神経、血管および脂肪細胞を含む、間質または真皮；（２）密接に密集した、活発に増殖している未成熟の上皮細胞の表皮基底層を含む表皮。基底層の細胞が複製するにつれ、若い細胞のいくつかは、基底層に残り、一方その他は外側に遊走してサイズが増大し、最終的に界面活性剤および還元剤に対するエンベロープ耐性を発達させる。ヒトにおいては、基底層における細胞の誕生には、末端または外側の層に達するまで約２週間要し、その後、細胞は死んで剥がれ落ちる。皮膚は種々の構造を含むが、これには毛包、皮脂腺および汗腺が挙げられる。毛包は、表皮の高密度に並ぶ陥入である、分化しているケラチノサイトから形成される。このような陥入から形成された開口式の小胞は、分泌されたケラチンを収集して濃縮し、そして毛（髪）の長線維が生じる。あるいは、陥入を裏打ちする表皮細胞は、液体（汗腺）または皮脂（皮脂腺）を分泌し得る。これらの構造の形成および増殖の調節は未知である。健常な皮膚の一定の更新は、新しい細胞が生成されており、そして加齢した細胞が死ぬという平衡プロセスによって達成される。加齢において、そしてまた平衡を破壊する疾患および外傷を通じて生じる、異常な事象を相殺するために、この正確な調節が行なわれる方法を理解する必要がある。
【００８８】
本発明の１つの実施形態において、マイクロ器官培養物の微小構造は、インビボにおける皮膚の微小構造を模倣するかまたは実質的にそれと同じである。例えば、その微小構造は、上皮組織／結合組織の構造を有する。例えば、皮膚のマイクロ器官培養物において、表皮のケラチノサイトは、結合組織と会合したままであり、そして毛包を含む正常な組織構造は保存されている。皮膚組織切片から得られるマイクロ器官培養物はまた、表皮細胞を支持する基底層、真皮細胞を含む細胞外マトリックス、および少なくとも１つの陥入、例えば、少なくとも１つの毛包を含み得る。皮膚上皮組織と皮膚結合組織との間の会合によって、細胞間連絡が容易になる。さらに、完全な厚みの皮膚を、種々の方法で増殖させて、これによって空気との接触面を可能にすることができる。空気に対するこの外植体のケラチノサイトの曝露によって、ケラチノサイトのより急速な分化、およびケラチン層のさらに過剰な分泌が促進されるが、これは皮膚浸透研究において非常に重要であるかもしれない。
【００８９】
最終的に、最近の研究で、皮膚は免疫系の不可欠かつ能動的な要素であることが示されていることに注目のこと（Ｃｏｏｐｅｒら（１９８７）Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｏｂｕｌｌｏｕｓｄｉｓｅａｓｅ：ＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙｉｎＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，第３版、ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，ＮＹ（６１０〜６２６頁））。種々の免疫活性を担う皮膚の主な細胞型の１つはランゲルハンス細胞である。これらの細胞は、新鮮な皮膚サンプルから調製されて、３次元の皮膚培養物に添加されて、免疫学的に完全な組織系を生じる。培養中で長期間のこれらの細胞の増殖は、従来の組織培養手順によっては困難である。３次元システムにおいてこれらの細胞を増殖させる能力は、移植、細胞傷害性および疾患の機構を含む研究の全ての局面において重要性が大きいものである。このタイプの皮膚培養システムは、直接または間接的な皮膚反応の関与を有する自己免疫障害（紅斑性狼瘡、水疱性類天疱瘡など）に関する研究において最大の影響を有する。従って、本発明のマイクロ器官培養物は、疾患の免疫学的局面が最小化される条件下で増殖／分化の障害を研究するために用いることができる。過形成上皮細胞の増殖を阻害し得る因子を同定するために、乾癬の皮膚外植体を用いる例示的な薬物スクリーニングアッセイが誘導され得る。
【００９０】
皮膚は、間質性組織によって支持される上皮組織を有するマイクロ器官培養物として増殖され得る組織の単なる例である。上皮組織を含む他の組織は、本発明のマイクロ器官培養物として増殖されてもよい。上皮組織は、器官と環境との間の接触面が生じる、身体のあらゆる部分において見出される。上皮細胞の周期は、無傷の身体において連続的であり、そして皮膚を含む身体の全ての自由な表面について被覆組織を形成する。ある場合には、膵臓においてのように、上皮細胞は、多くの陥入を並べ、そして空間に酵素を分泌して、器官が機能することを可能にする。肺は、高度に陥入した器官の別の例であり、肺における各々の陥入は、上皮細胞にそって並べられ、これを通じて環境から身体中へ空気が拡散する。ここでもやはり、これらの上皮細胞は、特徴的な特性を有する。腸の裏打ちはまた、障壁を形成するだけでなく、食物を選択的に胃吸収するための特殊化した構造も含む、特殊化した上皮細胞からなる。上皮の全てが結合組織によって支持される。さらに、重要な細胞−間質の相互作用を含む別の器官は骨髄である。
【００９１】
従って、本発明の別の実施形態において、マイクロ器官の膵臓培養物の微小構造は、インビボにおける供給源の膵臓の微小構造を模倣するかまたはそれと実質的に同じであり、例えば、その微小構造は、上皮組織／結合組織の構造を有する。例えば、膵臓のマイクロ器官培養物は、膵臓上皮細胞、例えば、島細胞を含み、膵臓の結合組織と会合したままである。従って、膵臓のマイクロ器官培養物において、正常な組織構造は保存され、そして正常な膵臓上皮細胞産物、例えば、インスリンおよびグルカゴンが産生される。
【００９２】
別の実施形態において、本発明によって、骨髄に由来するマイクロ器官培養物の生成が得られるが、この培養物はインビボにおける器官の微小構造を保存している。実施例ＸＶに記載されるように、骨髄マイクロ器官は、生理学的条件に匹敵するシステムを誘導させるように培養中で単離されている。
【００９３】
本発明の骨髄培養物は、健常な骨髄細胞を破壊するかまたはその機能的能力を抑制する疾患または状態を処置するために用いることができる。本発明のマイクロ器官の移植は、骨髄に関与する、血液学的悪性度および他の新生物形成の処置において有効であり得る。本発明の局面はまた、骨髄が環境因子（例えば、放射線、毒素など）によって有害に影響されている患者を処置するのに有効である。患者自身の骨髄に由来する外植体の再移植が一般に好ましいが、このような外植体は、同種、例えば、同じ種の別のメンバー由来であっても、または異種、例えば、別の生物体由来であってもよいことに注意のこと。例示的な異種インプラントは、ヒトにおける移植のためのミニブタ由来のマイクロ器官培養物であり得る。
【００９４】
さらに、もしヒト造血前駆体が必要な間質由来増殖／調節因子とともに提供される場合、ヒト造血前駆体の長期成長が可能である。このような相互作用は、本発明のマイクロ器官によって提供され、これらの外植体を幹細胞および前駆体細胞の供給源とさせる。一般に、骨髄の造血前駆細胞は、骨髄マイクロ器官の間質性マトリックス中で形成された天然のパケットをコロニー形成（「播種」）する。骨髄間質細胞の増殖における主な律速因子は、骨髄の間質細胞の間に含まれる線維芽細胞の比較的低い***指数である。従って、これらの細胞の増殖および細胞外マトリックス成分のそれらの素因が強化されることが望ましい場合、この外植体は、ヒドロコルチゾンまたは他の線維芽細胞増殖因子のような因子と接触させられてもよい。
【００９５】
転移性疾患または血液学的悪性腫瘍を有する特定の患者を処置するために骨髄を培養すべき場合、患者から得られた骨髄は、培養の前に物理的手段または化学療法によって、異常に増殖している細胞を「除去される」べきである。
【００９６】
本発明の骨髄マイクロ器官培養からの馴化培地は、新規のまたは公知のリンホカインの供給源として、例えばインターロイキンの供給源として用いられてもよい。
【００９７】
本発明は、１つの局面において、生物体における移植のための本発明のマイクロ器官培養の使用を意図する。本明細書において用いる場合、「投与する」、「導入する」および「移植する」という用語は、互換可能に用いられて、所望の部位への細胞の局在化を生じる方法または経路による、被験体、例えば、同種被験体または異種被験体への本発明の細胞集団の配置をいう。細胞集団は、細胞の少なくとも一部が生存したままで、被験体における所望の位置への細胞の送達を生じる、任意の適切な経路によって被験体に投与され得る。少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、なおさらに好ましくは少なくとも約３０％、なおさらに好ましくは少なくとも約４０％、そして最も好ましくは少なくとも約５０％以上の細胞が被験体への投与の後に生存したままであることが好ましい。被験体への投与後の細胞の生存の期間は、数時間程度の短さから、例えば２４時間から２〜３日間、さらに２〜３週間から２〜３ヶ月程度の長さであってもよい。本発明の細胞の集団を投与する方法としては、内蔵または壁側腹膜へ、例えば、網の嚢への細胞の移植、レシピエント被験体の器官、例えば、膵臓、肝臓、脾臓、皮膚への細胞の移植が挙げられる。本発明のマイクロ器官はまた、例えば、腎臓カプセルとして、移植によって被験体に投与され得る。
【００９８】
本明細書において用いる場合、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトをいう。「異種被験体」とは、本明細書において用いる場合、別の種の細胞が導入されるかまたは導入されることになる被験体である。「同種被験体」とは、同じ種の細胞が導入されるかまたは導入されることになる被験体である。ドナー被験体とは、培養物中に配置されることになるか、および／またはレシピエント被験体に移植されることになる、細胞、組織または器官を提供する被験体である。レシピエント被験体は、異種被験体であっても、または同種被験体であってもよい。ドナー被験体はまた、それら自体への再導入のため、すなわち自家移植のための細胞、組織または器官を提供し得る。
【００９９】
宿主による免疫学的攻撃に対して供され得る細胞集団の移植（例えば、ブタ−ヒトの移植のような異種移植を用いる場合）を容易にするため、マイクロ器官を、再充填可能かまたは生分解性のデバイスに挿入するかまたはカプセル化して、次いでレシピエント被験体に移植してもよい。次いで、このような細胞によって生成される遺伝子産物は、例えば、徐放性の化合物、例えば、タンパク質性の生物製剤を含む薬物のために設計されたポリマー性デバイスを介して送達され得る。生分解性ポリマーおよび非分解性ポリマーの両方を含む、種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を用いて、特定の標的部位における本発明の細胞集団の遺伝子産物の徐放性の放出のためのインプラントを形成することができる。このようなインプラントの生成は一般に、当該分野で公知である。例えば、以下を参照のこと：ＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｅｄｉｃａｌ＆ＤｅｎｔａｌＭａｔｅｒｉａｌｓ，ＤａｖｉｄＷｉｌｌｉａｍｓ編（ＭＩＴＰｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９０）；Ｓａｂｅｌら、米国特許第４８８３６６６号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第４８９２５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第５１０６６２７号；Ｌｉｍ、米国特許第４３９１９０９号；およびＳｅｆｔｏｎ米国特許第４３５３８８８号。本発明の細胞集団は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、例えば、滅菌生理食塩水および水性緩衝液中で投与されてもよい。このようなキャリアおよび希釈剤の使用は当該分野で周知である。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明のマイクロ器官培養物は、創傷治癒のために使用することができる。皮膚病変の修復は、高度に複雑な過程であって、一次的な上皮細胞遊走、および基礎にある結合組織からの分子シグナルに応答する表皮細胞の複製を含む過程であることが公知である。皮膚マイクロ器官培養物は、創傷治癒のためのモデルとして本明細書に記載されている。管理された培養条件下で、治癒を制御する因子は、注意深くモニターされ得る。さらに、マイクロ器官培養物は、天然の血液供給から隔離されているので、治癒プロセスの解析は、血液由来因子または細胞のさらなる複雑性なしに行なうことができる。正常な表皮は、２００〜３００時間ごとの細胞周期を有する低い有糸***活性を有する。表皮が傷つけられる場合、有糸***活性のバーストが生じ、その結果細胞は、創傷の状態および重篤度に依存して１０倍まで早く***する（ＰｉｎｋｕｓＨ．（１９５１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１６：３８３〜３８６）。
【０１０１】
実施例ＩＩにおいて実証されたように、皮膚マイクロ器官培養物は、数日間で１０倍までの増殖の増大を示す。この実施例では、創傷の縁は、マイクロ器官培養物に匹敵する。この増殖の増大は、創傷に関連している事象を模倣して、創傷治癒の過程を研究するための固有の機会を提供する。さらに、添付の実施例によって、本発明の表皮外植体を慢性の創傷に適用することが可能であり（実施例ＩＸ）、そして毛（髪）を増殖し得る生存可能なインプラントを形成することが可能である（実施例ＸＩ）ことがインビボで実証される。
【０１０２】
さらに、被験体の表皮マイクロ器官は、火傷患者の処置に用いることができる。火傷患者には皮膚交換の必要性が証明されている。米国および欧州のいくつかの施設では、火傷の創傷および慢性潰瘍を永続的に被覆するため、培養されたヒトケラチノサイトの同種移植片および異種移植片が利用された（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：２８７〜２９３；Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：５６６５〜５６６８；Ｃｕｏｎｏら（１９８７）Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８０：６２６〜６３５）。これらの方法はしばしば失敗しており、近年の研究では、移植された表皮層のもとで形成された１つ以上の結合組織成分における異常のために、治癒した移植片に水疱形成および／または皮膚脆弱性が存在し得ることが示されている（Ｗｏｏｄｌｅｙら（１９８８）ＪＡＭＡ６：２５６６〜２５７１）。本発明の皮膚培養システムは、表皮および真皮の両方の皮膚等価物を提供し、そして現在用いられる培養されたケラチノサイト移植片の特徴的な問題を克服するはずである。
【０１０３】
なお別の実施形態において、本発明のマイクロ器官培養システムは、遺伝子治療における使用のためにインビボで遺伝子または遺伝子産物を誘導するためのビヒクルを産出し得る。例えば、組み換えＤＮＡ技術を用いて、患者が欠いている遺伝子を、ウイルスまたは組織特異的なプロモーターの制御下に置くことができる。組み換えＤＮＡ構築物を用いて、本発明のマイクロ器官培養システムにおける全ての細胞または特定の細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができる。活性な遺伝子産物を発現するマイクロ器官培養物を、その産物を欠く個体に移植することができる。
【０１０４】
遺伝子治療における本発明のマイクロ器官培養物の使用は、多数の利点を有する。第一に、培養物は真核生物細胞を含むので、遺伝子産物は、培養物中で適切に発現されてプロセシングされ、活性な産物を形成する。第二に、遺伝子治療技術は、トランスフェクトされた細胞の数が、臨床的な値、妥当性および有用性なものであるように実質的に増強され得る場合にのみ有用である；本発明の培養物によって、トランスフェクトされた細胞の数の増大および増幅が可能になる。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態において、トランスジェニックマイクロ器官培養物を用いて、遺伝子導入を容易にすることができる。例えば、限定はしないが、組み換えウイルス発現ベクターを含むマイクロ器官培養物は、例えば、移植によって、この培養物と接触させられた細胞に組み換えウイルスを移入して、これによってインビボにおけるウイルス伝達をシミュレートするために用いることができる。従って、このシステムは、ＤＮＡトランスフェクションのための現在の技術よりも遺伝子導入を達成するさらに有効な方法であり得る。
【０１０６】
従って、本発明のマイクロ器官培養物の細胞は、遺伝子産物を発現するために改変され得る。本明細書において用いる場合、「遺伝子産物」という句は、タンパク質、ペプチドおよび機能的なＲＮＡ分子をいう。一般に、核酸分子によってコードされる遺伝子産物は、被験体に供給されることが所望される遺伝子産物である。このような遺伝子産物の例としては、レシピエント被験体の器官によって正常に生成されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質が挙げられる。例えば、膵臓における欠損器官に対して遺伝子置換の方法で供給され得る遺伝子産物としては、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ_２、エラスターゼ、およびアミラーゼが挙げられる；肝臓によって通常生成される遺伝子産物としては、血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、およびチトクロームｐ４５０酵素、ならびにアデノシンデアミナーゼ（血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスのため）が挙げられる；胸腺によって生成される遺伝子産物としては、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、サイモポエチンおよびサイモシンα_１が挙げられる；消化管細胞によって生成される遺伝子産物としては、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチンおよびサブスタンスＰが挙げられる。あるいは、コードされた遺伝子産物は、細胞による所望の遺伝子産物の発現を誘導するものである（例えば、導入された遺伝子材料は、被験体に供給されるべき遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする）。なお別の実施形態において、組み換え遺伝子は、異種タンパク質（例えば、そのタンパク質が発現される細胞に対してネイティブでない）を提供し得る。例えば、種々のヒトＭＨＣ成分が、ヒトレシピエントにおける移植を支持する非ヒトマイクロ器官に提供されてもよい。あるいは、導入遺伝子は、マイクロ器官外植体において正常に発現されるドナーＭＨＣ遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。
【０１０７】
細胞に導入された核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞における発現に適切な形態である。従って、核酸分子は、遺伝子（またはその一部）の転写のために必要なコード配列および調節配列を含み、そして遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、核酸分子の翻訳は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびにコードされたタンパク質またはペプチドの輸送に必要な配列、例えば、細胞の表面へのタンパク質もしくはペプチドの輸送、または分泌のためのＮ末端シグナル配列を含む。
【０１０８】
遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列）は、この遺伝子産物が発現されるべき細胞のタイプ、およびこの遺伝子産物の発現の所望のレベルに基づいて選択される。例えば、そのプロモーターに連結された遺伝子の細胞型特異的な発現を付与することが公知のプロモーターを用いてもよい。筋芽細胞遺伝子発現に特異的なプロモーターは、目的の遺伝子に連結されて、その遺伝子産物の筋特異的な発現を付与することができる。当該分野で公知の筋特異的な調節エレメントとしては、ジストロフィン遺伝子の上流の領域（Ｋｌａｍｕｔら（１９８９）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子の上流の領域（ＢｕｓｋｉｎおよびＨａｕｓｃｈｋａ，（１９８９）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．９：２６２７）およびトロポニン遺伝子の上流の領域（ＭａｒおよびＯｒｄａｈｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：６４０４）、転写抑制を媒介するケラチン遺伝子における負の応答エレメント（ＪｈｏＳｈら（２００１）．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ）が挙げられる。他の細胞型に特異的な調節エレメントが当該分野で公知である（例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的発現のためのインスリン調節性エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびＡ４アミロイドプロモーターを含む、種々の神経細胞特異的調節エレメント）。あるいは、ウイルス調節エレメントのような、種々の異なる細胞型において遺伝子の構成的な発現を指向し得る調節エレメントを用いてもよい。遺伝子発現を駆動するために通常用いられるウイルスプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来のプロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲが挙げられる。あるいは、調節エレメントであって、そこに連結された遺伝子の誘導性の発現を提供する調節エレメントを用いてもよい。誘導性調節エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用によって、細胞における遺伝子産物の産生の調節が可能になる。真核生物細胞における使用のために潜在的に有用な誘導性調節システムの例としては、以下が挙げられる：ホルモン調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５６０３〜５６０７を参照のこと）、合成のリガンド調節性エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１０１９〜１０２４を参照のこと）、およびイオン化放射線調節性エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：１０６０７〜１０６１３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０１４〜１０１５３を参照のこと）。さらなる組織特異的または誘導性の調節システムが開発され得、これが本発明に従って用いられてもよい。
【０１０９】
本発明の細胞を改変するために適用することができる、細胞への遺伝物質を導入するための当該分野で公知の多数の技術が存在する。１つの実施形態において核酸は、裸の核酸分子の形態である。この状況では、改変されるべき細胞に導入された核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸および必要な調節エレメントのみからなる。あるいは、遺伝子産物をコードする核酸（必要な調節エレメントを含む）は、プラスミドベクター内に含まれる。プラスミド発現ベクターの例としては、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。別の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれる。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）に挿入される。遺伝子産物の発現を指向する調節エレメントは、ウイルスゲノム内に挿入された核酸内に含まれ（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結され）てもよいし、またはウイルスゲノム自体によって提供されてもよい。
【０１１０】
裸の核酸は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入、およびレセプター媒介取り込みを用いて細胞に導入されてもよい。
【０１１１】
裸の核酸、例えば、ＤＮＡは、核酸およびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成することによって細胞に導入されてもよい。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水溶液は、沈殿を形成するために、塩化カルシウムおよび核酸を含有する溶液とともに混合されてもよく、次いでこの沈殿物が細胞とともにインキュベートされる。グリセロールまたはジメチルスルホキシドショック工程を加えて、特定の細胞に取り込まれる核酸の量を増大することができる。ＣａＰＯ_４媒介トランスフェクションは、安定に（または一過性に）細胞をトランスフェクトするために用いることができ、そして細胞のインビトロ改変にのみ適用可能である。ＣａＰＯ_４媒介トランスフェクションのプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．１節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．３２節〜第１６．４０節、または他の標準的な実験室マニュアルから見つけることができる。
【０１１２】
裸の核酸は、核酸およびＤＥＡＥデキストランの混合物を形成すること、ならびにこの混合物と細胞とをインキュベートすることによって細胞に導入されてもよい。核酸取り込みの量を増大するためにジメチルスルホキシドまたはクロロキンショック工程を加えてもよい。ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションは、細胞のインビトロ改変のためにのみ適用可能であり、そしてＤＮＡを一時的に細胞に導入するために用いることはできるが安定にトランスフェクトされた細胞を作製するのには好ましくない。従ってこの方法は、遺伝子産物の短時間産生のためには用いることが可能であるが、遺伝子産物の長期間産生のためには選り抜きの方法ではない。ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションのプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．２節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．４１節〜第１６．４６節、または他の標準的な実験室マニュアルから見つけることができる。
【０１１３】
裸の核酸はまた、細胞および核酸を一緒に適切な緩衝液中でインキュベートすること、およびこの細胞を高電圧の電気パルスに供することによって、細胞中に導入することができる。核酸がエレクトロポレーションによって細胞に導入される効率は、印加された電場の強度、電気パルスの長さ、温度、ＤＮＡの構成および濃度、ならびに培地のイオン組成によって影響される。エレクトロポレーションは、広範な種々の細胞型を安定に（または一過性に）トランスフェクトするために用いることができる。細胞をエレクトロポレートするためのプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９），第９．３節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第二版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．５４〜１６．５５節、または他の標準的な実験室マニュアルから見出すことができる。
【０１１４】
裸の核酸を細胞に導入することができる別の方法としては、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクチン）が挙げられる。核酸を、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合する。次いで、ＤＮＡ／リポソーム複合体を細胞とインキュベートする。リポソーム媒介トランスフェクションを用いて、インビトロにおいて培養中の細胞を安定に（または一過性に）トランスフェクトすることができる。プロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ら（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．４節、および他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができる。さらに、インビボにおける遺伝子送達は、リポソームを用いて達成されている。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７〜１７６；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７８５１〜７８５５；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．ＪＭｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８；ならびにＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら（１９８９）Ｇｅｎｅ８４：４２９〜４３８を参照のこと。
【０１１５】
裸の核酸はまた、核酸を細胞に直接注入することによって細胞に導入されてもよい。細胞のインビトロ培養のために、マイクロインジェクションによってＤＮＡを導入してもよい。各々の細胞を、個々にマイクロインジェクションするので、このアプローチは、多数の細胞を改変する場合に非常に労働集約的である。しかし、マイクロインジェクションが選り抜きの方法である条件は、トランスジェニック動物の産生においてである（以下に詳細に考察される）。この状況では、ＤＮＡは、受精した卵母細胞に安定に導入され、これが次に動物へと発達させられる。得られた動物は、卵母細胞に導入されたＤＮＡを担持する細胞を含む。直接注入はインビボにおいて細胞に裸のＤＮＡを導入するためにも用いられている（例えば、Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３３２：８１５〜８１８；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５〜１４６８を参照のこと）。インビボにおける細胞へのＤＮＡの注入のための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を用いてもよい。このような装置は（例えば、ＢｉｏＲａｄから）市販されている。
【０１１６】
裸の核酸を、ポリリジンのような陽イオンと複合して、これを細胞表面レセプターのリガンドに結合させて、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって取り込ませることができる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ならびに米国特許第５１６６３２０号を参照のこと）。レセプターに対する核酸リガンド複合体の結合によって、レセプター媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みが容易になる。ＤＮＡリガンド複合体が標的とするレセプターとしては、トランスフェリンレセプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターが挙げられる。エンドソームを天然に破壊し、これによって細胞質中に材料を放出する、アデノウイルスキャプシドに連結されたＤＮＡ−リガンド複合体を用いて、細胞内リソソームによるこの複合体の分解を回避することができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９０：２１２２〜２１２６を参照のこと）。レセプター媒介ＤＮＡ取り込みを用いて、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞にＤＮＡを導入することができる。そしてさらに、このレセプター媒介ＤＮＡ取り込みは、目的の標的細胞上で選択的に発現されるレセプターに対して結合するリガンドの使用によって、ＤＮＡが特定の細胞型に選択的に標的され得るというさらなる特徴を有する。
【０１１７】
一般に、裸のＤＮＡを培養中の細胞に（例えば、上記のトランスフェクション技術の１つによって）導入する場合、細胞のわずかな画分（約１０^５分の１）が代表的には、トランスフェクトされたＤＮＡをそのゲノム中に組み込む（すなわち、このＤＮＡは細胞中でエピソームとして維持される）。従って、外因性ＤＮＡを取り込んでいる細胞を特定するためには、選択マーカーをコードする核酸を、目的の核酸とともに細胞にトランスフェクトすることが有利である。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択マーカーは、目的の遺伝子と同じプラスミド上に導入されてもよいし、または別のプラスミドに導入されてもよい。
【０１１８】
遺伝子産物をコードする核酸を細胞中に導入するための好ましいアプローチは、この遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染では、大きい割合の細胞が核酸を受容し、これによって、核酸を受容している細胞の選択の必要性を排除することができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内でコードされた分子、例えば、ウイルスベクター内に含まれたｃＤＮＡは、ウイルスベクター核酸を取り込んでおり、そしてウイルスベクター系をインビトロまたはインビボのいずれかで用いることができる細胞中で、効率的に発現される。
【０１１９】
欠損レトロウイルスは、遺伝子治療の目的の遺伝子移入における使用のために十分に特徴付けられる（概説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１を参照のこと）。組み換えレトロウイルスであって、このレトロウイルスゲノムに挿入された目的の遺伝子産物をコードする核酸を有するレトロウイルスを構築してもよい。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してこのレトロウイルスを複製欠損にさせてもよい。次いでこの複製欠損レトロウイルスをビリオン中にパッケージングし、これを用いて、標準的な技術によってヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させることができる。組み換えレトロウイルスを生成するためのプロトコール、およびこのようなウイルスを用いてインビトロまたはインビボにおいて細胞を感染させるためのプロトコールは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．１０節〜第９．１４節、および他の標準的なマニュアルにおいて見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。適切なパッケージングウイルス株の例としては、ψＣｒｉｐ、ψ２およびψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボにおいて、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む、多くの異なる細胞型へ種々の遺伝子を導入するために用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５〜１３９８；ＤａｎｏｓａｎｄＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｉら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２〜１８０５；ｖａｎＢｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙら（１９９２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１〜６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５；米国特許第４８６８１１６号；米国特許第４９８０２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（そして外来核酸がそこに挿入される）が宿主ゲノム中に組み込まれて細胞に核酸を安定に導入するためには標的細胞の***を必要とする。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要であるかもしれない。
【０１２０】
アデノウイルスのゲノムを、それが目的の遺伝子産物をコードしかつ発現するが、それが正常な細胞溶解性のウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力に関しては不活化されているように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルスの株であるＡｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが、当業者に周知である。組み換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ビヒクルであるために細胞の***の必要がなく、気道上皮（前に引用した、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２））、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６４８２〜６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ、およびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９０：２８１２〜２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：２５８１〜２５８４）を含む広範な種々の細胞型を感染させるために用いることができるという点で有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれを含む外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームを残しており、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれる状況で挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡがアデノウイルスゲノムを担持する能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８キロベースにおよぶ）（前に引用した、Ｂｅｒｋｎｅｒら；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄａｎｄＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全てまたは一部を欠いているが、アデノウイルス遺伝子材料の８０％程度を保持している。
【０１２１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖のライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスを要する、天然に存在する欠損ウイルスである（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓＩｎＭｉｃｒｏ．ＡｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９を参照のこと）。これはまた、そのＤＮＡを***していない細胞に組み込み得る、数少ないウイルスのうちの１つであって、高い頻度の安定な組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。３００塩基対程度の少ないＡＡＶを含むベクターをパッケージングすることが可能であり、組み込むことが可能である。内因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されるようなＡＡＶベクターを用いて、細胞にＤＮＡを導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて、種々の核酸を異なる細胞型に導入した（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０を参照のこと）。
【０１２２】
細胞に核酸を導入する特定の発現ベクター系および方法の効率は、当該分野で慣用的に用いられる標準的なアプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって決定することができる。そして導入されたＤＮＡの転写によって生成されたＲＮＡは、例えばノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイによって、例えば、生成されたタンパク質の免疫学的検出によって、例えば特定の抗体を用いて、またはこの遺伝子産物の機能的な活性を検出するための機能的なアッセイ、例えば酵素アッセイによって検出することができる。細胞によって発現されるべき、目的となる重要な遺伝子産物が容易にアッセイできない場合、用いられるべき調節エレメントおよびベクターに連結されたレポーター遺伝子を用いて、発現系を最初に最適化することができる。このレポーター遺伝子は、容易に検出可能であり、従って、このシステムの有効性を評価するために用いることができる遺伝子産物をコードする。当該分野で用いられる標準的なレポーター遺伝子としては、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ／ＥＧＦＰおよびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１２３】
細胞の集団に核酸を導入するために用いられる方法によって、細胞の大部分の改変および、この細胞による遺伝子産物の効率的な発現が生じる場合（例えば、ウイルス発現ベクターを用いる場合によくあるように）、細胞の改変された集団は、この集団内の個々の細胞のさらなる単離またはサブクローニングなしに用いることができる。すなわち、細胞の集団による遺伝子産物の十分な産生が存在し得、その結果さらなる細胞の単離が不要である。あるいは、単一の改変された細胞由来の、同一に改変された細胞の均一な集団を増殖させて、この遺伝子産物を効率的に発現する細胞を単離することが所望され得る。このような均一な細胞の集団は、限界希釈クローニングによって改変した単一の細胞を単離すること、続いて、標準的な技術により、この単一の細胞を培養中で細胞のクローン集団に増殖させることによって調製され得る。
【０１２４】
本明細書において用いる場合、「トランスジェニック細胞」という句は、細胞であって、部分的にまたは完全に異種の、すなわち外来の核酸配列がその細胞に挿入されるか導入されている細胞をいう。トランスジェニック細胞はまた、細胞であって、その細胞の内因性遺伝子に対して同種である核酸がそこに挿入されている細胞であってもよい。しかし、この場合、相同な核酸は、それが挿入される細胞のゲノムを変更するような方式で、その細胞のゲノムへ挿入されるように設計されるかまたは挿入される。例えば、同種の核酸は、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、または同種の核酸の挿入は、特定の表現型のノックアウトを生じる。細胞に挿入された核酸は、選択された核酸の至適の発現に必要であり得る、１つ以上の転写調節配列、およびイントロンのような任意の他の核酸を含んでもよい。
【０１２５】
本発明のなお別の局面において、被験体マイクロ器官培養物は、悪性腫瘍および疾患の診断および処置において補助するために用いることができる。例えば、器官（例えば、皮膚、腎臓、肝臓など）の生検は、過剰増殖障害または新生増殖障害を有することが疑われる患者から採取してもよい。生検の外植体が、本発明の方法によって培養される場合、この外植体の増殖性細胞は、培養の間にクローン培養される。これによって、このような障害を検出する機会が増大し、従って診断の正確度が増大する。さらに、患者のマイクロ器官培養物をインビトロで用いて、細胞傷害性化合物および／または薬学的化合物をスクリーニングし、最も有効である化合物（すなわち、悪性の細胞または疾患状態の細胞を殺傷するが正常な細胞に害を与えない化合物）を特定することができる。これらの作用剤を患者の治療的処置に使用することができる。
【０１２６】
本発明のさらなる局面は、広範な種々の化合物、例えば、細胞傷害性化合物増殖因子／調節因子、薬学的因子などをスクリーニングするために本発明のマイクロ器官培養物を用いる方法に関する。例えば、潜在的に毒性の性質の化合物の徹底的な試験の必要性が一般に認識されており、そして薬物、化粧品、食品添加物および殺虫剤の評価のための鋭敏でかつ再現性の短時間のインビトロアッセイを開発する必要が明らかである。本明細書において記載されるマイクロ器官培養物によって、アッセイ基質としての組織等価物の使用が可能になり、そしてインビボ状態を厳密に模倣するシステムにおける正常な細胞相互作用という利点が得られる。
【０１２７】
この目的を達成するために、培養物をインビトロで維持して、試験されるべき化合物に曝露する。細胞傷害性化合物の活性は、それが外植体における細胞の表現型を調節する（殺傷を含む）能力によって測定することができる。これは、生体染色技術、マーカーの発現などによって容易に評価され得る。例えば、増殖因子／調節因子の効果は、例えば、総細胞カウントおよび異なる細胞カウントによって、培養物の細胞含量を分析することによって評価できる。これは、型特異的な細胞抗原を規定する抗体を使用する免疫細胞科学技術の使用を含む、標準的な細胞学的技術および／または組織学的技術を用いて達成することができる。本発明のシステムにおいて培養された正常な細胞に対する種々の薬物の効果を評価することができる。例えば、乾癬組織の増殖を減少させる薬物を特定することができる。
【０１２８】
本発明の方法の例示的な実施形態において、外植体における細胞の増殖を刺激する因子を検出するために誘導されたこの方法は、被験体から組織外植体を単離する工程を包含する。ここで外植体の細胞の集団は、この外植体が単離された器官または組織の微小構造を保持し、例えば、この外植体は、少なくとも約１．５ｍｍ^−１のアレフによって特徴付けられ、そして増殖する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。この外植体は、候補化合物とともに培養されて接触されてもよい。次いで、候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルを測定して、候補化合物の非存在下における細胞増殖のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの実質的に有意な増大は、細胞増殖因子の指標である。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、「候補化合物」または「候補因子」という句は、増殖活性、抗増殖活性、分化活性、抗分化活性、または抗ウイルス活性について試験されるか、試験されるべき因子をいう。このような因子は、例えば、有機低分子、生物学的抽出物、および組み換え産物または組成物であってもよい。
【０１３０】
細胞増殖を測定する方法は、当該分野で周知であり、そしてほとんど共通して細胞複製のＤＮＡ合成特徴を決定する工程を包含する。ＤＮＡ合成を測定するためには当該分野には多くの方法が存在しており、そのいずれも本発明に従って用いることができる。本発明の１つの実施形態において、ＤＮＡ合成は、免疫蛍光による検出のために放射性標識（^３Ｈチミジン）または標識されたヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を用いて決定されている。
【０１３１】
なお別の実施形態によって、細胞増殖のインヒビターを特定するための方法が提供される。この方法は、上記のような組織外植体を提供する工程、その外植体を候補化合物と接触させる工程、およびこの候補化合物の存在下で細胞の増殖のレベルを測定する工程を包含する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの実質的に有意な低下は、細胞増殖のインヒビターの指標である。
【０１３２】
例示的な実施形態において、例えば、所望の効果に依存して毛（髪）成長を制御するために、細胞増殖の増強因子およびインヒビター（本明細書において、抗増殖因子をも呼ばれる）の両方を用いることができる。
【０１３３】
羊毛および毛（髪）のような硬性のケラチン繊維の成長は、真皮鞘細胞の増殖に依存する。鞘の毛包幹細胞は、高度に活性であり、そして急速な増殖および複雑な分化を通じて毛（髪）繊維を生じる。毛（髪）サイクルは、３つの明白な相を含む：発育期（成長する）、退行期（退行する）、および休止期（休止する）。毛包の表皮幹細胞は、後期休止期の間に皮膚乳頭によって活性化される。これは、「毛***部活性化」と命名される。さらに、このような幹細胞は、多能性幹細胞であると考えられ、毛（髪）および毛包構造を生じるだけでなく、脂腺および表皮も生じる。細胞増殖因子および細胞増殖のインヒビターは、例えば、毛包細胞、詳細には毛包の幹細胞の増殖の静止状態を誘導するような毛（髪）成長サイクルの動態を変更する手段を提供する。
【０１３４】
毛包細胞増殖のインヒビターは、切断、剃毛または脱毛によるヒトの毛（髪）の従来の除去に対して、ヒトの毛（髪）の成長を低下させる手段として使用することができる。例えば、本発明の方法を用いて同定された毛包細胞のインヒビターは、毛（髪）の異常に急速なまたは濃い成長によって特徴付けられる毛髪病、例えば多毛症の処置において用いることができる。例示的な実施形態において、このようなインヒビターを用いて、異常な毛深さによって特徴付けられる障害である多毛を管理することができる。このようなインヒビターの使用によってまた、脱毛の期間を延長するためのプロセスを提供することができる。
【０１３５】
毛包細胞増殖のインヒビターはまた、有効性のために細胞周期のＳ期への進行を要する細胞傷害性因子、例えば、放射線誘導性死から毛包細胞を保護するために用いることができる。このようなインヒビターを用いた処置は、例えば、Ｓ期に入ることから細胞を阻害することによって、毛包細胞を静止状態にさせることによって、そしてこれによって毛包細胞を有糸***の破局またはプログラムされた細胞死を受けることから防止することによって保護を提供する。例えば、毛包細胞増殖のインヒビターは、通常は毛（髪）の喪失を生じる、化学療法または放射線療法を受けている患者に用いることができる。このような治療の間の細胞周期の進行を阻害することによって、インヒビターでの処置は、毛包細胞を死亡（さもなければ細胞死プログラムの活性化から生じ得る）から防御することができる。治療が終了した後、インヒビター処置はまた、毛包細胞増殖の阻害の救済を伴って除去することができる。
【０１３６】
しかし、毛（髪）成長管理の基礎にある分子機構の特徴付けを開始し、そして潜在的な毛（髪）影響薬物を試験するためには、適切な毛（髪）成長のためのインビトロモデルが必要である。本発明の１つの局面において、本発明の方法を用いて、毛包の微小構造、例えば、毛包の毛包上皮層と間質成分（皮膚乳頭）との間の相互作用、例えば１つ以上の幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリックス細胞および内毛根鞘細胞を保持する毛包マイクロ器官外植体を生成する。添付の実施例において実証されるとおり、毛（髪）成長は、血清なしでさえ、例えば、最小培地においてさえ、これらのマイクロ器官培養物において観察することができる。重要なことに、本発明はまた、例えば、休止している、実質的に休止期における毛包を提供する、毛包培養物を提供する。以下に実証されるように、休止期の毛包外植体は、インビトロ培養物において、そして特定の実施形態において同調した様式で、増殖発育毛包に活性化され得る。毛包の表皮幹細胞の初期の一過性の増殖は、毛包器官の種々の組織によって生成される、例えばパラクリン因子および／または自己分泌因子によって媒介される発育期の活性化を理解するための固有の機会を提供する。
【０１３７】
さらに、本発明のマイクロ器官培養物は、例えば、毛（髪）成長を促進または阻害し得る因子を特定するために、毛包の活性化または不活性化を調節する因子を同定するためのシステムを供給する。１つの実施形態において、以下の実施例ＸＶＩＩＩに記載されるような休止期（休止している）毛包外植体が、種々の試験因子と接触され、そして毛包の刺激のレベルが検出される。例えば、毛包幹細胞の休止期から発育期への移行は、この毛包の細胞の有糸***指数を観察すること、または増殖を検出するいくつかの他の類似の方法によってモニターできる。例示するために、図１７は、チミジン取り込みを用いて、試験化合物（この図ではＦＧＦ）の有無におけるこの外植体の幹細胞活性化の相対的レベルを測定することができることを示す。ここでは、毛髪成長促進活性を有する試験因子の増殖指標が増大している。
【０１３８】
リバースアッセイにおいて、発育期のマイクロ器官移植体を、例えば、添付の実施例に記載される活性化Ｓｅｎｃａｒ外植体、または成長因子で刺激された外植体（例えば、ＦＧＦ刺激された外植体）のような培養物に提供する。毛包幹細胞の増殖を阻害する試験因子は、例えば、未処理の発育期の外植体に比して、毛（髪）成長を妨げる休止期の因子としての使用についてさらに考慮されてもよい。
【０１３９】
なお他の実施形態において、本発明のアッセイによって特定された細胞増殖のインヒビターは、新生細胞または過形成性細胞の増殖、例えば腫瘍形成および増殖を阻害するために使用することができる。本発明の好ましい実施形態は、上皮腫瘍形成および増殖の阻害に関する。皮膚上皮腫瘍形成の詳細な説明については、１９９５年２月７日に出願された米国特許出願第０８／３８５１８５号を参照のこと。腫瘍形成は、浸潤および転移を生じる、細胞とその周囲との間の相互作用における細胞増殖および障害の制御の変更の結果として生じる。細胞***から生じる細胞数の増大と、分化または細胞死に起因する細胞周期からの脱落との間の関係の破壊によって、細胞増殖の制御の妨害がもたらされる。正常な組織においては、各々の幹細胞が幹細胞区画中の残りの２つの娘細胞のうちの１つだけを***するとき、他方は分化の経路に方向付けされるということを確実にすることによってホメオスタシスが維持される（Ｃａｉｒｎｓ，Ｊ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５５：１９７〜２００）。従って、細胞増殖の制御は、これらのプロセスに影響するシグナルの結果である。これらのシグナルは、陽性であっても陰性であってもよく、腫瘍形成能の獲得は、これらのコントロールポイントに影響する遺伝子変化から生じる。
【０１４０】
実施例ＩＸに記載され、そして図１２に図示されるように、本発明の皮膚マイクロ器官培養物は、細胞増殖因子および細胞増殖のインヒビターを特定するために用いられている。実施例ＩＸに記載されるように、ＴＧＦ−βを試験したところ、細胞増殖のインヒビターとして作用することが見出された。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質であるアクチビンはまた、表皮細胞の増殖を阻害することが示されている。これらの結果によって、上皮細胞の増殖を阻害するのに役割を果たすＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーが存在し得ることが示される。このデータによって、表皮ホメオスタシスの重要な調節因子として、そしてインビボでの上皮腫瘍形成および増殖の阻害における、ＴＧＦ−βファミリーでのタンパク質の役割が示唆される。
【０１４１】
本発明の別の局面は、細胞分化因子、すなわち細胞分化を生じる化合物を特定するための方法に関する。この方法は、被験体から細胞の集団を単離する工程を包含するが、この細胞の集団は、この細胞が単離される器官または組織の微小構造、少なくとも約１．５ｍｍ^−１の表面積対容積指数を有し、そして分化する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。次いで、この細胞を少なくとも約２４時間培養中に配置して、候補化合物と接触させる。次いで、この候補化合物の存在における細胞分化のレベルを測定して、候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの実質的に有意な増大は、細胞分化因子の指標である。本明細書において用いる場合、分化とは、細胞がもともと保有している形態および／または機能とは異なるか、および／またはそれに加えて、獲得された形態および／または機能を有する細胞をいう。代表的には、これらの形態および機能は、成熟細胞に特徴的である。本発明の細胞の集団の分化は、特殊化した細胞産物の産生および／または分泌を測定することによってモニターすることができる。
【０１４２】
類似の方式で、本発明はまた細胞分化のインヒビターを特定するための方法に関する。上記と同じプロトコールに従って、候補化合物の存在における細胞分化のレベルを測定して、候補化合物の非存在下での細胞分化のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの実質的に有意な低下は、細胞分化のインヒビターの指標である。
【０１４３】
なお別の実施形態において、本発明の培養物によって、ウイルス感染のインビトロモデルの生成が可能になる。例えば、表皮または扁平上皮組織を単離して、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２；水疱瘡ウイルス；またはヒトパピローマウイルス、例えば、任意のヒトパピローマウイルス１−５８、例えば、ＨＰＶ−６、またはＨＰＶ−８のようなウイルスを用いて感染させてもよい。同様に、肝臓モデルが肝臓感染、例えば、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに感染された外植体のために提供され得る。ウイルス感染した組織外植体を用いて、本発明の方法によってウイルス感染性のインヒビターを特定することができる。上記のように、特定のマイクロ器官培養物が提供され、そして（必要に応じて）細胞に感染してウイルス感染細胞の集団を生成するウイルスと接触される。次いで、このウイルス感染細胞は、候補化合物と接触させられて、候補化合物の存在下におけるウイルスの感染性のレベルが測定される。次いで、候補化合物の存在下におけるウイルス感染性の測定されたレベルを、候補化合物の非存在下におけるウイルス感染性のレベルと比較する。候補化合物の存在下におけるウイルスの感染性のレベルの実質的に有意な低下は、ウイルス感染性のインヒビターの指標である。
【０１４４】
ウイルス感染性を測定する方法は、当該分野で公知であり、そして用いられるウイルスのタイプに依存して変化する。例えば、ウイルスの感染性のレベルを測定するために用いられ得る方法の１つは、マイクロ器官培養物の感染された細胞中において、またはマイクロ器官培養物の培地において、試験されている特定のウイルスに特異的な遺伝子産物の産生のレベルを測定することによる。例えば、マイクロ器官培養物において細胞の肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスの感染性のレベルを測定するために、肝炎ウイルスタンパク質産生および肝炎ウイルスＤＮＡを定量してもよい。概して、マイクロ器官培養物は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、ＥＬＩＳＡ上で、当該分野で公知の種々の方法によって分析される、選択されたウイルスタンパク質に対する抗体および免疫反応性タンパク質とともにインキュベートされてもよい。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原の産生を測定するため、Ｂ型肝炎ウイルスと事前にインキュベートしたマイクロ器官由来のマイクロ器官培養物培地を、毎日サンプリングして、製造業者によって記載されるＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ）方法によって表面抗原についてアッセイしてもよい。この方法は、連続希釈した標準の表面抗原（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）を用いる定量のために改変され得る。培養培地におけるＢ型肝炎表面抗原の蓄積の実質的に有意な減少によって、試験された候補化合物は肝炎ウイルス感染性のインヒビターであることが示される。
【０１４５】
マイクロ器官培養培地におけるＨＢｓＡｇのレベルを測定することに加えて、マイクロ器官培養物由来の細胞抽出物からの新たに合成されたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡは、ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、続いてプローブとしてＨＢＳプレＳ（ＨＢｓＡｇコード）領域中の標識されたプライマー対を用いるサザンブロット解析によって、検出しかつ定量することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，第二版，第２巻．ｐｐ１０．１４−１０．１５を参照のこと）。相対的定量は、デンシトメトリーによって得ることができ、そして対応するバンドのシンチレーションカウントによって確認することができる。新しく合成されたウイルスＤＮＡのレベルの低下によって、試験された候補化合物が肝炎ウイルス感染性のインヒビターであるということが示される。
【０１４６】
別の実施例において、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質産物をやはり、上記および当該分野で公知の他の標準的技術を用いて測定することができる。例えば、ＨＩＶに感染したマイクロ器官培養物の細胞におけるｐｏｌタンパク質発現は、細胞抽出物を抗ｐｏｌ抗体またはプールされたＡＩＤＳ患者血清とともにインキュベートすることによって測定することができ、そして免疫反応性タンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で解析することができる。本発明のマイクロ器官培養物中で、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン／バーウイルス（ＥＢＶ）の感染性を測定するために、ＥＢＶＤＮＡおよびＥＢＶ誘導性の核抗原産生を、本明細書に記載の方法を用いて解析することができる。
【０１４７】
本発明のマイクロ器官培養物はまた、被験体中の創傷治癒を促進するために用いることができる。従って、本発明はさらに、レシピエント被験体において創傷治癒を促進するための方法に関連する。この方法は、表面積対容積指数が少なくとも約１．５ｍｍ^−１である細胞の集団をドナー被験体から単離する工程を包含する。代表的には、細胞の集団は、少なくとも約２４時間培養中におかれる。次いで、細胞の集団は、レシピエント被験体の創傷に付与され得る。１つの実施形態において、創傷または病変は、治癒が遅いかまたは慢性、例えば、糖尿病関連の創傷、例えば、火傷、例えば、潰瘍である。実施例ＸおよびＸＩに実証されるように、本発明の皮膚マイクロ器官培養物は、慢性の創傷に付与されるべきマイクロ外植体として用いられてもよく（実施例Ｘ）、そして毛（髪）を成長させ得る生存インプラントを形成し得る（実施例ＸＩ）。
【０１４８】
なお別の実施形態において、本発明のマイクロ器官外植体は、細胞傷害性についてまたは刺激性について試験するためのアッセイに提供される。例示的な実施形態において、本発明の方法は、眼または皮膚の刺激物のインビトロ試験のための技術を提供する。このプロセスは、上記とまったく同様であり、本発明のマイクロ器官培養物に対する液体、固体顆粒またはゲル様物質（例えば、化粧品）の局所適用、続いてこの培養物中で生じた効果の検出を包含する。
【０１４９】
現在、多くの化学物質、家庭の掃除用品、化粧品、塗料および他の物質の可能性のある眼および皮膚の刺激性を、動物およびヒトの被験体に対する直接適用を通じて評価する。しかし、ほとんどの産業において評価されるように、このようなアプローチは、多大な公的サポートは受けない。本発明の方法は、動物の屠殺も永久的な身体の損傷も必要としない別のアッセイを提供し、また客観的な方式でデータを提供する。例示的な実施形態において、皮膚マイクロ器官培養物は、本発明によって誘導される。培養された外植体は、試験因子、例えば、化粧品と接触されて、曝露後同じ時点で細胞生存度が評価される。好ましい実施形態において、ＭＴＴアッセイ（機能的なミトコンドリアによるテトラゾリウム色素の減少に基づく）を用いて生存度についてスコア付けする。
【０１５０】
本出願のマイクロ器官培養物はさらに、以下のために用いることができる：組織および細胞の正常なホメオスタシスに関与する因子を特定するために、栄養物の変化および潜在的な毒性因子の存在を含む細胞の環境の変化の組織および細胞の正常なホメオスタシスに対する影響を研究するために、病因または外傷の開始およびその間に誘発される組織および細胞における変化の経路を研究するために；病因または外傷に関連する変更された環境における有害な影響を逆転する修復機構を特定するために；組織の正常なホメオスタシスの間に分化する細胞の発達調節および組織内の特殊化した構造（例えば、毛包）の発達調節を研究するため；そして不十分な血液供給によって生じる治癒の不全を有する、慢性の皮膚潰瘍の患者において生じるような、または局所の皮膚がＩ型もしくはＩＩ型糖尿病として公知の状態においてのように治癒できない、個々の器官の小片が残っているが損傷された組織を修復または再生するには不十分である器官の補充のために。
【０１５１】
（例示）
本発明は、ここで一般的に記載されているが、これは以下の実施例を参照してさらに容易に理解され、以下の実施例は本発明の特定の局面および実施形態の単なる例示の目的で含まれており、本発明の限定を意図しない。
【０１５２】
成体ヒト皮膚、マウス、モルモットおよびラットの皮膚を含む動物由来のマイクロ器官培養物を単離して、培養物中で２１日間増殖させた。しかし、２１日を上回る期間、培養物を維持することは、本発明の範囲内である。
【０１５３】
さらに、広範な動物由来のマイクロ器官培養物を形成することは、本発明の範囲内である。この動物の範囲は単に例示されているだけであり、以下に提供されるサンプルには限定されない。
【０１５４】
添付の実施例において記載されているとおり、マイクロ器官培養物を皮膚から、そして哺乳動物の膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道および膀胱を含む器官からも調製した。同様に、哺乳動物の角膜、腎臓、***組織由来、ならびに食道に加えて種々の腸由来の組織、例えば腸および結腸由来の上皮のマイクロ器官培養物をまた、本発明の方法を用いて調製してもよい。実際、身体内の上皮／間質の構造を含む任意の部位由来のマイクロ器官培養物を単離および維持することは本発明の範囲内である。
【０１５５】
上記にかかわらず、本発明のマイクロ器官培養物の技術を用いて、上皮／間質の構造を有さない組織、例えば特定のリンパ組織、例えば胸腺および脾臓の外植体からの長期培養物中で組織外植体を保存している。
【実施例１】
【０１５６】
（上皮のマイクロ器官培養物の調製）
新鮮な皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を除去して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いでこれを滅菌条件下で、組織チョッパーまたは他の適切な切断方法を用いて、３００μｍの切片に横断して切り出し、それによって最終組織セグメントは、４ｍｍ幅および０．３ｍｍ厚みの寸法を有することとなった（図１を参照のこと）。これらのマイクロ器官を、１〜８日間１２ｒｐｍで続けて振盪しながら、５％ＣＯ_２、３７℃のもとで、血清を含まない４００μｌのＤＭＥＭを含有する２４ウェルのマイクロプレート中に入れた。１ウェルごとに２０個のマイクロ外植体を増殖させた。
【実施例２】
【０１５７】
（マウス、モルモットおよびヒトの表皮マイクロ器官培養物の増殖の測定）
実施例Ｉに従ってマイクロ器官培養物を調製して、以下のようにＤＮＡ合成の量を解析することによって細胞の増殖を測定した。マウスの皮膚およびモルモットの皮膚を２日間増殖させて、ヒトの皮膚を４日間増殖させ、その後、３時間、最終濃度１００μＭに培地にＢｒｄＵを添加し、その後４％ホルムアミド中で細胞を固定した。固定後、培養物をヤギ抗ＢｒｄＵ抗体を用いて、続いて抗ヤギＦＩＣＴ標識したＩｇＧを用いて染色した。組織学的調製物を、その後４％ホルムアミド固定に包埋して、３μｍの切片に切断してメチレンブルーで染色した。
【０１５８】
インビトロにおいてＤＮＡを合成する細胞の画分は培養中で２〜４日間後、インビボで観察された値に比べて１０倍まで増大し、その後ＤＮＡ合成の速度は徐々に低下したが、培養の１０日までは高いままであったということが見出された（図２、３、および４Ａ〜４Ｄを参照のこと）。培養中での６日目でさえ、細胞は一定状態の増殖および分化を維持し、その結果組織構造は保存された（図５Ａ〜５Ｃ）。
【実施例３】
【０１５９】
（種々のサイズのマイクロ器官培養物における細胞の増殖）
モルモットマイクロ器官を、実施例Ｉのとおり調製した。４ｍｍ幅の全厚の皮膚ストリップを、種々の厚みの外植体に切り出した。これには３００、４５０、６００、７００、９００、１２００および３０００μｍの厚みの切片を含む。これらのスライスを２日間、血清なしの培地を含むウェル中に個々に入れた。最終濃度１００μＭでの終了の前に４時間ＢｒｄＵを添加した。次いで、この外植体を４％ホルムアミド中で固定して、ＢｒｄＵに対するヤギ抗体、続いて抗ヤギＩｇＧＦＩＴＣ標識二次抗体調製物を用いて染色した。この実験の結果を図６に図示する。細胞／単位組織の数の関数としてＢｒｄＵ取り込みの量は、外植体の厚みが増大するにつれて有意に減少した。
【実施例４】
【０１６０】
（膵臓マイクロ器官培養物の調製、および細胞増殖の測定）
モルモット膵臓を取り出して、次いで適切な組織チョッパーを用い、そして膵臓の微小構造が維持される方式で、３００μｍの厚み、４ｍｍの幅および２ｍｍの深さの切片に切断した。このマイクロ外植体を培養中で、２日〜１８日間におよぶいくつかの時間にわたって増殖させた。７つのマイクロ器官を、１２ｒｐｍで一定に振盪しながら５％ＣＯ_２、３７℃のもとで、血清を含まない１５０μｌのＤＭＥＭを含有する９６ウェルのプレート中に各々入れた。最終濃度１００μＭでの終了の３時間前にＢｒｄＵを添加し、次いで、この外植体を４％ホルムアミド中で固定して、ＢｒｄＵに対するヤギ抗体、続いて抗ヤギＦＩＴＣ標識ＩｇＧを用いて染色した。図７Ａ〜７Ｂは、膵臓由来のマイクロ器官において細胞が活発に増殖されたことを図示する。
【実施例５】
【０１６１】
（膵臓のマイクロ器官培養物の調製、およびこの培養培地中へのインスリン分泌の測定）
成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物を皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。膵臓を取り出して、ハサミを用いてほぼ２ｍｍの厚みに切断して、４ｍｍの幅を有する３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で１４日間増殖させた。２日間ごとに培地を取り出して、新鮮な培地を添加した。標準的なラジオイムノアッセイ法を用いてインスリン含量について収集した培地をアッセイした。
【実施例６】
【０１６２】
（異種被験体へのブタ膵臓マイクロ器官の移植）
成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物を皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。膵臓を取り出して、ハサミを用いてほぼ２ｍｍの厚みに切断して、４ｍｍの幅を有する３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で０〜５日間の種々の期間、増殖させ、培養後、膵臓のマイクロ器官を培養物から取り出して、ラット宿主の内臓および体壁中胚葉の両方へ移植した。このマイクロ器官は、インビボで少なくとも１ヶ月間生存し、そして十分に血管新生した。インビボにおいて３日、５日、７日および１４日後、過剰な細胞増殖が検出され得る。さらに、正のインスリン染色が、インビボにおいて移植の４日、７日および３０日後に観察された。
【実施例７】
【０１６３】
（肝臓、腎臓、十二指腸、食道および膀胱のマイクロ器官培養物の調製、ならびにこのマイクロ器官培養物における細胞増殖の測定）
いくつかの上皮組織を含む器官由来のモルモットマイクロ器官培養物を、皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。器官を取り出して、ハサミを用いて、ほぼ２ｍｍの幅、３ｍｍの長さに切断して、３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で３日間、４日間および６日間インキュベートした。実験終了の１２時間前に、^３Ｈチミジンを外植体の培養物に添加した。終了時、組織を固定して、数回リンスして、シンチレーションカウンターでカウントした。この実験の結果を図９に図示する。図９に示されるとおり、全ての組織が^３Ｈチミジンの取り込みによって決定されるとおり６日間続く活性な増殖を示した。
【実施例８】
【０１６４】
（マイクロ器官培養物における毛包の増殖）
皮膚マイクロ器官培養物を実施例Ｉに従って調製して、２日間インキュベートした。ＢｒｄＵをインキュベーション終了の３時間前に添加した。細胞を４％ホルムアミド中に固定して、ヤギ抗ＢｒｄＵ抗体、続いて抗ヤギＦＩＴＣ標識ＩｇＧを用いて染色した。インビボでそれらの正常な環境で存在したインタクトな毛包は、血清また任意の他の内因性因子を添加する必要なしに、正確に制御された培養条件下で維持することができた。これらのマイクロ器官における毛包細胞は、ＢｒｄＵを取り込んだ多数の毛包細胞によって示されるように、本発明の方法の条件下で数日間活発に増殖することが見出された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。マイクロ器官モルモット培養物の０時点および２週間後での毛幹のサイズ分布を図１１に示す。培地は２日ごとに交換した。毛幹のサイズは小、中、大として恣意的に分類された。培養中での９日間後、サイズ分布において、小の毛（髪）の割合が６４％〜２８％に低下するが、培養の開始の時点では存在しなかった大の毛幹が毛幹の集団の３０％を占めるような明確なシフトが存在した。
【実施例９】
【０１６５】
（細胞増殖に対する候補化合物の効果を測定するためのアッセイの準備）
実施例Ｉに記載したのと同様の増殖条件で、規定の培地中で培養物を調製して維持した。コントロールサンプルを免疫細胞化学によって解析して、インビボで生じるのと同様の方式でマイクロ器官培養物が維持されたことを確認した。
【０１６６】
皮膚マイクロ培養物の複製サンプルを、ＴＧＦ−βを２．５ｎｇ／ｍｌで用いて処理した。ＢｒｄＵ標識した細胞／外植体の数の定量解析を、実施例ＩＩに従って実施した。コントロールに比べて、ＴＧＦ−βの存在下で、ＤＮＡ合成の９０％より大きい阻害が観察された（図１２）。
【実施例１０】
【０１６７】
（慢性の非治癒皮膚潰瘍の治癒を促進する方法）
この方法によれば、正常な関与しない皮膚移植片の小領域を患者から取り出して、４ｍｍ幅でかつ０．３ｍｍ厚みの完全厚のマイクロ外植体を、実施例Ｉに記載のとおり調製する。しかしこの調製物は、０．３ｍｍの切片への断片化が、故意に不完全であり、その結果一連の切片が図１３に示されるように、角質層を含む上部表皮層と一緒に保持されるという点で実施例Ｉとは異なる。このインプラントの設計は、栄養物が全ての細胞に達することを可能にするが、ただし操作可能な様式で組織スライスを維持するように指向される。患者の創傷は、清浄化され、そして周囲の皮膚の末端が取り除かれる。次いで、皮膚を欠く領域は、マイクロ外植体によって注意深く被覆され、これが創傷上に置かれて、その結果切り出されていない末端は、外側に面して、対向する切り出された小片は、創傷内の液体に浮遊される。創傷領域を実質的に被覆するのに十分なマイクロ外植体を調製する。次いで、処置された領域を適切な包帯剤で被覆して、治癒させる。
【実施例１１】
【０１６８】
（インビボにおける毛包の増殖）
インビボにおける動物実験を実施したが、ここでは、上記のように皮膚領域全体の角質層がインタクトに残るように、皮膚の１ｃｍ^２の面積をマウスから取り出して、不完全に顕微鏡用に切り出した。マイクロ器官をマウスにおけるそのもとの位置に再移植して、縫い合わせ、治癒させた。このインプラントは生存したままであり、動物組織中に組み込まれ、そして新しい毛幹が、培養物中で１〜２週間後このインプラントから成長した（図１４を参照のこと）。
【実施例１２】
【０１６９】
（ヒト乾癬皮膚マイクロ器官培養物）
８２歳の高齢の患者からの中間層乾癬皮膚を、検死解剖後にデルマトーム（採皮刀）を用いて得た。次いで皮膚を０．５×５ｃｍの皮弁に切り出して、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。これらのマイクロ器官切片を、一定に振盪しながら５％ＣＯ_２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。いくつかの場合、増殖因子を培養培地に入れた。培地を２日毎に交換した。ヒト乾癬皮膚は、マイクロ器官培養物として広く増殖した。
【実施例１３】
【０１７０】
（肝炎ウイルスに感染した肝臓マイクロ器官培養物）
ヒト、ラット、マウスおよびモルモットの肝臓を切り出して、実施例ＶＩＩに記載のようにマイクロ器官培養物として培養した。これらのマイクロ器官培養物における活性な増殖を、本明細書に記載のようなＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。これらのマイクロ器官培養物における肝細胞は、培養物中で少なくとも１４日間後、尿素のアッセイ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ，尿素検出キット）およびアルブミン産生（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合、機能的であることが確認された。
【０１７１】
上記のように調製したヒト肝臓マイクロ器官培養物を、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに陽性の患者由来の血清とともにインキュベートした。２４時間後、培地を取り出して、１０％の正常なウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が有無の状態の新鮮なＤＭＥＭを添加した。２日毎に、培養培地を、ウイルスタンパク質ＨＢｓに対する抗体を用いてウイルス粒子について試験した新鮮な培地および馴化培地と交換した。ＦＣＳの存在下で培養されたマイクロ器官培養物中で４日後にウイルス粒子の数の有意な増大が検出された。
【実施例１４】
【０１７２】
（胸腺および脾臓のマイクロ器官培養物）
胸腺および脾臓からのマウスおよびラットのマイクロ器官培養物を本質的に、皮膚についての前の実施例のとおりに調製した。器官を取り出してハサミを用いてほぼ２ｍｍの幅および３ｍｍの長さに切断した。次いで、これらのサンプルを、適切な組織チョッパーを用いてこの器官の本質的な微小構造が保持される方式で、約３００μｍの厚みの外植体にスライスした。次いで、このマイクロ器官を無血清培地中で１日、３日、５日および１０日間インキュベートした。これらのマイクロ器官培養物における活性な増殖を、本明細書に記載のようにＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。
【実施例１５】
【０１７３】
（骨髄マイクロ器官培養物）
ラットおよびマウスの大腿骨からインタクトな骨髄を注意深く取り出すことによって、骨髄からマイクロ器官培養物を調製した。このような外植体における骨髄の直径は、約１〜２ｍｍしかないので、組織チョッパーを用いて３００μｍの厚みを有するマイクロ器官外植体へと骨髄を直接スライスした。この方法によって、骨髄の微小構造が保存されているが、同時に長期培養の影響を受けやすい表面／容積指数を保持していることが確実にされた。無血清培地中で３日間マイクロ器官をインキュベートした。これらのマイクロ器官培養物における骨髄細胞の活発な増殖を、本明細書に記載されるようなＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。
【実施例１６】
【０１７４】
（皮膚マイクロ器官培養物に対する遺伝子産物の送達）
本発明のマイクロ器官培養物に固有の高い表面積対容積比によって、種々の遺伝子移入技術のために組織に容易に接近することが可能になる。本実施例において、マイクロ器官培養物は、エレクトロポレーションおよびリポフェクチンを用いて外来遺伝子でトランスフェクトされる。このマイクロ器官培養物は、動物に移植されて、インビボで少なくとも約３０日間生存して、血管新生することができる。これによって、エキソビボにおける遺伝子治療プロトコールにおいて組織のＭＣ培養を用いることの実現可能性が実証される。ＭＣ培養物のさらなる利点は、ＭＣ培養物を身体の規定の位置に移植することが可能であり、その結果必要であれば、将来は容易に取り出すことができるということである。このことは、細胞が遊走可能であるかまたは正常な組織において「損失」され得る、身体への細胞懸濁物の移植とは対照的である。
【０１７５】
モルモットの皮膚を解剖して、２ｍｍの幅および３００μｍの厚みを有する切片にスライスした。製造業者の推奨する濃度でペニシリンおよびストレプトマイシンを有する無血清のダルベッコ最小基本培地中で、皮膚をマイクロ器官として培養した。３７℃および５％ＣＯ_２での培養中で１日後、皮膚マイクロ器官培養物を、抗生物質なしのＤＭＥＭを用いてリンスして、氷上で５００μｌの培地を有する０．４ｃｍのギャップのディスポーザルエレクトロポレーションキュベットに添加した。
【０１７６】
示されたレポーター遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡの１０μｇを、示されたとおり添加した（各々のプラスミドが、βガラクトシダーゼ（コントロール）またはルシフェラーゼレポーター遺伝子のいずれかの発現を駆動するサイトメガロウイルスプロモーターを有した）。ルシフェラーゼプラスミド骨格は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とインフレームで融合したｐＲＣ−ＣＭＶ（インビトロゲン）であった。
【０１７７】
このサンプルを２２０ｍＶで、そして図１５に示されるように変化させたキャパシタンスで（Ｈｉ＝９００μＦ、中＝５００μＦ、低＝２５０μＦ）、エレクトロポレーションした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２５０μＦでＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーションデバイスを用いて処置した。次いでこのサンプルをさらに、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン酸を含有するＤＭＥＭを用いて、２日間２４ウェル培養プレート中でインキュベートした。培地を取り出して、このサンプルを約７００μｌの細胞培養物溶解剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に懸濁した。組織切片をホモジナイズして、次に２０μｌを１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔを用いてルシフェラーゼを三連で検出した。陽性コントロールとして、７５ｃｍの培養フラスコからのＮＩＨ３Ｔ３細胞をトリプシン処理して、マイクロ器官培養物と同じく処理した。図１５に図示されるとおり、中（５００μＦ）および低（２５０μＦ）のキャパシタンス設定で、有意なルシフェラーゼ活性が検出された。比較のために、同様の量のＮＩＨ３Ｔ３不死の培養細胞を、２５０μＦで同じプラスミドを用いてエレクトロポレーションした。
【０１７８】
別の実験では、マイクロ器官移植体のトランスフェクションは、リポフェクションによって達成され、これは、エレクトロポレーションよりも効率的であることが観察された。詳細には、モルモット皮膚、新生仔マウス皮膚、およびラット肺由来のマイクロ器官培養物を、ルシフェラーゼレポーターを含有するプラスミドを用いてトランスフェクトした。要するに、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌグルタミンを有するＤＭＥＮ中で５．５％ＣＯ_２において３７℃で、マイクロ器官培養物をトランスフェクションの前に１日間増殖させた。外植体を、１ウェルあたり２０個の外植体を含み、かつ４００μｌの培地を含有する２４ウェルプレート上にプレートした。トランスフェクションのために、マイクロ器官培養物をＯｐｔｉｍｅｍで２回リンスし、そして１０μｌのリポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）＋２μｇのＤＮＡ＋Ｏｐｔｉｍｅｍを、各々のウェルに添加して、最終容積を５００μｌとした。Ｏｐｔｉｍｅｍ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ／ＤＮＡ溶液は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの製造業者の指示に従って作製した。次いで、この培養物を５．５％ＣＯ_２中で３７℃で５〜６時間インキュベートした。次いで、Ｏｐｔｉｍｅｍ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ／ＤＮＡ培地を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌグルタミンおよび１０％ＦＣＳを含有する４００μｌのＤＭＥＮと置換して、この培養物を５．５％ＣＯ_２中で３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、マイクロ器官培養物を取り出して、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして手動式のガラス組織グラインダー中で７５０μｌの１×細胞培養物溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で粉砕した。導入遺伝子からのルシフェラーゼ活性を、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、この結果を図１８に報告した。
【実施例１７】
【０１７９】
（マイクロ器官培養物への遺伝子産物の送達）
８週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット由来の肺および胸腺を解剖して、マイクロ器官のために処理して、実施例ＸＶに記載のとおり培養する。マイクロ器官培養物を培養ウェル中に入れて、カチオン性脂質／ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ複合体を用いて、３７℃でインキュベートしながら、５〜６時間トランスフェクトした。カチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ溶液を吸引し、次いで、この培養物を２日間、１０％血清を加えた培地中でインキュベートし、次いでルシフェラーゼレポーター遺伝子発現（恣意的な光強度で表現）についてアッセイした。この実験の結果を図１６に図示する。図１６において実証されるとおり、肺（ただし胸腺ではない）は、これらの条件下でトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子を発現する。予想どおり、陰性コントロールのβガラクトシダーゼでトランスフェクトした肺のマイクロ器官培養物（１０μｌのカチオン性脂質濃度）は、光産生について機械のバックグラウンドに近かった（２３光強度）。
【実施例１８】
【０１８０】
インビトロにおける毛幹成長
新生仔マウス皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を排除して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。このマイクロ器官を、一定に振盪しながら５％ＣＯ_２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。特定のマイクロ器官外植体を、培養培地中に添加した、増殖因子、例えばＦＧＦと接触させた。この培地を２日毎に交換した。
【０１８１】
新生の「毛のない」皮膚を導入してＭＣ培養物中で成長させた場合毛幹を生じることができる。１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で、３日間マイクロ器官培養物中で増殖させた、３０時間齢のマウス由来の皮膚の顕微鏡写真によって、培養期間の開始時には存在しなかった、この外植体における毛幹の発達が示された。
【０１８２】
実験の別の設定では、休止期の毛包の活性化が観察された。Ｓｅｎｃａｒマウスは、毛包活性化を研究するための有用なモデルを提供する。なぜなら、この毛包は、十分に同調されており、そして周期段階は十分特徴付けられているからである。Ｓｅｎｃａｒマウスは、発育期活性化のためのインビボモデルを提供する。休止期の毛包からの棍状毛（ｃｌｕｂ）の取り出しによって新しい毛の形成が誘導され得、その最初の兆候は、十分特徴付けられる。成体Ｓｅｎｃａｒマウス由来の皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を排除して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。このマイクロ器官を、一定に振盪しながら５％ＣＯ_２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。休止期の毛包の活性化は、棍状毛除去または成長因子処置のいずれによって誘導されても、毛包幹細胞の増殖によって明らかになった。図１７は、チミジン取り込みによって検出される場合の休止期外植体の活性化を図示する。
【実施例１９】
【０１８３】
（移植のための膵島の調製）
種々の哺乳動物供給源から島細胞を大量に調製するために、いくつかの技術が発展されている。なぜなら、それらは、潜在的に移植可能なβ細胞塊であって、それを用いて樹立された１型糖尿病を処置するためのβ細胞塊を構成するからである。今までに、２つの主な欠点に遭遇されている。β細胞を調製する再現可能な確実な方法を得ることは困難であることが証明されている。第二にインビトロおよびインビボの両方においてこれらの細胞の生存度は、かなり変動する。一部は第一の理由に起因し、そして一部は、β細胞が正常な膵臓における島の基礎にある間質からの支持を必要とする可能性が高いという事実に起因する。エキソビボにおいて膵臓器官を維持する試みはいままで、成功していない。本明細書に記載されるＭＣ培養技術を用いて、インビトロにおいて規定された培養培地中でマウス、ラット、モルモットおよびブタの膵臓のマイクロ器官培養物を樹立することが達成されている。
【０１８４】
膵臓のマイクロ器官培養物はここで、１ヶ月におよぶ期間、インビトロで増殖されている。培養物内では、外植体は、その組織微小構造を維持し、そして特定の細胞小集団がＢｒｄＵ取り込みおよび標識によって決定されるように活発に増殖する。さらに、島細胞は、インビトロ培養の１ヶ月後でさえ培地中にインスリンを分泌する。
【０１８５】
ブタのマイクロ器官膵臓培養物が、ラット宿主の内蔵および体壁中胚葉の両方に移植されている移植実験を実施した。外植体は、インビボにおいて数日間から１ヶ月におよぶ種々の期間、維持された。この外植体は十分に血管新生されて、組織宿主中に組み込まれる。
【実施例２０】
【０１８６】
（ヒト乾癬皮膚マイクロ器官培養物の調製）
患者から中間層乾癬皮膚を、検死解剖後にデルマトーム（採皮刀）を用いて得た。この皮膚を０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。これらのマイクロ器官外植体を、３７℃で５％ＣＯ_２マイクロプレート中で、ＤＭＥＭ（血清なし）中において１〜１４日間培養した。種々の時点でのマイクロ器官外植体の検査によって、この外植体の細胞が生存したままであり、増殖が生じていたことが示された。
【０１８７】
上記で引用された全ての引用文献および刊行物は、本明細書において参考として援用される。
【０１８８】
（等価物）
当業者は、たんに慣用的な実験を用いて、本明細書において記載される特定のアッセイおよび試薬に対する多くの等価物を認識しまたは確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内であり、そして添付の特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】アレフ（Ａｌｅｐｈ）を決定する寸法を描写するマイクロ器官の図表示である。
【図２】異なる時間のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、モルモットのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
【図３】１〜８日間の培養物のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、ヒトのバックスキンのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
【図４】マウス皮膚（図４Ａ）、モルモット皮膚（図４Ｂ）、ヒト***（図４Ｃ）およびヒト***（図４Ｄ）の複製している細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図５】ヒト表皮マイクロ器官外植体の横断面である。
【図６】ＢｒｄＵ取り込みを用いて、モルモット皮膚のマイクロ器官培養物の種々の厚み（×）の表皮増殖に対する影響を実証する棒グラフである。
【図７】膵臓由来のマイクロ培養物における増殖中の細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図８】成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物によって放出されたインスリンの量を示す棒グラフである。
【図９】培養の３日目、４日目、および６日目の結腸、肝臓、腎臓、十二指腸および食道のマイクロ器官培養物における増殖中の細胞への^３Ｈチミジン取り込みを示す棒グラフである。
【図１０】免疫蛍光によって決定されたマイクロ器官培養物における毛包の活性な増殖を示す顕微鏡写真である。
【図１１】マイクロ培養の開始および終了の時点での毛幹のサイズ分布を示す棒グラフである。
【図１２】モルモット皮膚培養物において、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下でのマイクロ器官培養物における有糸***誘発の阻害を示す棒グラフである。
【図１３】慢性皮膚潰瘍の処置のためのマイクロ器官外植体の図表示である。
【図１４】マイクロ器官培養物による正常な皮膚の切片の置き換え後のマウスの表面の写真である。
【図１５】ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のトランスフェクション後のモルモット皮膚マイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼレポーターの発現のグラフ表示である。
【図１６】ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のカチオン性脂質媒介トランスフェクション後のラット肺および胸腺のマイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
【図１７】本発明のマイクロ器官培養物におけるＦＧＦでの処置の際のテロゲン毛包の活性化のグラフ表示である。
【図１８】本発明のマイクロ器官外植体におけるトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。[0001]
Background of the Invention
Eukaryotic cell culture was first achieved in the early 1950s. Since then, a wide range of transformed and primary cells have been used by a wide variety of media and defined supplements, such as growth factors and hormones, and undefined supplements, such as serum and other body extracts It is cultured using. For example, fibroblasts obtained from animal skin are routinely cultured through many cell passages, as diploid cells in karyotype or as cell lines established indefinitely. However, epithelial cells have morphological and proliferative characteristics that are different from fibroblasts and are more difficult to culture. Furthermore, when epithelial cells and fibroblasts are cultured in the same culture, the epithelial cells are generally overproliferated by fibroblasts.
[0002]
Cell growth in two dimensions is a convenient way to prepare, observe and study cells in culture, allowing for rapid cell growth, but in vivo between cells throughout the tissue and cell-matrix Lacks the features of the interaction between.
[0003]
To study such functional and morphological interactions, a few researchers are exploring the use of three-dimensional substrates such as: collagen gel (Douglas et al. (1980) In Vitro 16 Yang et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 3401; Yang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2088-2092; Yang et al. (1981) Cancer Res. : 1021-1027); cellulose sponge alone (Leighton et al. (1951) J. Natl Cancer Inst. 12: 545-561), or coated collagen (Leighton et al. (1968) Cancer Res. 28: 286-296); Zera Nsuponji, Gelfoam (Sorour et al. (1975) J.Neurosurg.43: 742~749).
[0004]
Various culture conditions have been used to grow epithelial cells in a clonal competent manner. For example, epithelial cells and in particular skin epithelial cells (keratinocytes) are cultured on: a lethally irradiated fibroblast feeder cell layer (Rheinhardt et al. (1975) Cell 6: 331-343) and Semi-synthetic collagen matrix (US Pat. No. 5,282,859; European Patent Application No. 0361957). In some cases, the media used to grow such cells is supplemented with pituitary extracts and serum, and biological supplements including growth supplements such as epidermal growth factor and insulin. (Boisseau et al. (1992) J. Dermatol. Sci3 (2): 111-120; US Pat. No. 5,292,655).
[0005]
Many attempts have been made during skin growth in vitro. These attempts typically involve the separation of epidermal keratinocytes from dermal fibroblasts and adipocytes. After separation, keratinocytes are generally grown in a manner that allows the formation of a stratified epidermis. However, epidermis prepared in this manner lacks hair follicles and sweat glands. Furthermore, in such cultures, the natural relationship between the epidermis and dermis is not preserved. Collagen methods derived from keratinocytes in non-viable fibroblasts (Rheinwald et al. (1975) Cell 6: 331-343), or synthetic or derived from another source derived from the dermal matrix of the epidermis And placement of keratinocytes on the dermal matrix of fibroblasts (Sugihara et al. (1991) Cell. Dev. Biol. 27: 142-146; Parenteau et al. (1991) J. Cell Biochem. 45 (3): 245-251) Has also been carried out. However, in some cases, keratinocyte separation has not been performed and the entire organ is placed in culture. Attempts to in vitro cultured organs are limited to incubating organs in serum-containing media (Li et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (5): 108-112).
[0006]
Most of the existing in vitro models of epidermis lack hair follicles, sweat glands and sebaceous glands (see Coulomb et al. (1992) Pathol. Biol. Paris 40 (2): 139-146 for a review of epidermal cell culture). . The exception is 2x5mm ² And a gel-supported skin model of Li et al. ((1992) Proc. Natl. Acad.), Where skin explants with dimensions of 2.0 mm and a thickness of 2.0 mm remain alive for several days in the presence of serum-containing medium. Sci 89: 8764-8768).
[0007]
In addition to the drawbacks of cell damage, bioreactors and other methods of culturing mammalian cells also simulate the spatial three-dimensional morphology of actual tissue in intact organisms, cells are built into tissue Very limited in ability to provide conditions. Traditional tissue culture processes are highly considered to be important for mammalian cell differentiation and for the secretion of professional biologically active molecules for research and pharmaceutical purposes, for similar reasons. It limits the ability of cultured tissue to express a functionally specialized or differentiated state. Unlike microorganisms, cells of higher organisms such as mammals themselves form higher order multicellular tissues. The exact mechanism of this self-assembly is unknown, but in the circumstances studied so far, the development of cells into tissue depends on the positional relationship of cells to each other (cells of the same or different types), or other sticking It has been found to be dependent on the presence of substrates, and / or specific substances (factors) such as hormones, autocrine or paracrine. In short, traditionally, low enough shear stress, enough three-dimensional spatial freedom, and long enough critical cell interactions (with each other or with the substrate) to allow good modeling of tissue structures in vivo. There was no culture process that was able to achieve this interaction simultaneously.
[0008]
Therefore, there is a need for an in vitro method for generating and maintaining part of an organ in culture where the cell culture preserves its natural cell relationship over time. An effective tissue and organ model that mimics what cell differentiation, cell proliferation and cell function are found throughout the tissue in vivo is how the organ is maintained in a healthy state and as a result Useful for understanding the mechanism by which events can be reversed.
[0009]
Summary of invention
The present invention provides in vitro micro-organ cultures that address the needs described above. Prominent features of the micro-organ cultures of the present invention include the ability to be maintained in culture for a relatively long time, eg, at least about 24 hours, preferably at least 7 days or more, as well as, for example, in the source organ Conservation of organ microstructure facilitating cell-cell and cell-matrix interactions similar to cell-cell and cell-matrix interactions.
[0010]
Typically, at least one cell of the population of cells of the micro-organ culture has the ability to proliferate. The population of cells in the micro-organ culture may be in equilibrium as a whole. That is, the ratio of cell proliferation to cell loss in a population of cells is about 1, or cells in a microorgan culture can be grown at a rate greater than they are lost, resulting in cells in the population of cells The ratio of cell proliferation to loss is greater than 1, for example, in a population of cells obtained from neoplastic tissue or in a precursor cell population induced to grow in explants, for example.
[0011]
Preferred organs from which cells of micro-organ cultures can be isolated include: lymphoid organs such as thymus and spleen; digestive organs such as intestine, liver, pancreas, gallbladder and bile duct; lung; reproduction Organs such as prostate and uterus; breasts such as mammary glands; skin; urinary tract organs such as bladder and kidney; cornea; and blood related organs such as bone marrow. An isolated cell population of micro-organ growth may be encapsulated in a polymeric device in certain embodiments, eg, for delivery of cells or cell products (eg, gene products) to a subject. The invention also relates to a conditioned medium isolated from the micro-organ culture of the invention.
[0012]
In one embodiment of the invention, the micro-organ culture includes a population of cells that are part of an organ. Preferably, the micro-organ explant includes epithelial and connective tissue cells. In one embodiment of the invention, the organ explant is obtained from the pancreas, for example, the microstructure of the cell population is substantially the same as the original pancreatic microstructure from which the explant is derived. Yes, including pancreatic epithelial cells, such as islet cells and pancreatic connective tissue cells.
[0013]
In another embodiment of the invention, the micro-organ explant is obtained from the skin, for example, the microstructure of the population cells is substantially the same as the skin microstructure in vivo, and the skin epithelium, for example, Includes epidermal cells and skin connective tissue cells, such as dermal cells. A micro-organ culture obtained from a skin explant may also comprise a basement membrane that supports epidermal cells, an extracellular matrix that includes dermal cells, and at least one invagination, eg, at least one hair follicle or gland. Good.
[0014]
In another embodiment of the invention, the micro-organ culture is a hepatitis virus, such as hepatitis B or C, or a human papilloma virus (HPV), such as HPV-6, HPV-8 or HPV- An isolated population of cells infected with a virus such as 33 is included. When infected with a virus, the micro-organ culture can be used in a method for identifying inhibitors of viral infectivity. The method includes the step of isolating the micro-organ explant by the method of the present invention, wherein the explant is derived from a virus-infected organ or is subsequently infected with the virus in vitro, This transplant produces a population of virus-infected cells. The explant may then be contacted with a candidate factor, eg, a factor being tested for antiviral activity, and the level of infectivity in the presence of the candidate factor (eg, viral load, new Infectivity etc.) is measured and compared against the level of infectivity by this virus in the absence of the candidate agent. A decrease in the level of infectivity of this virus in the presence of the candidate agent is indicative of a viral infectivity inhibitor.
[0015]
The present invention also relates to a method for producing a micro-organ culture. The method includes isolating a micro-organ explant from a mammalian donor subject having dimensions that provide an isolated population of cells that can be maintained in minimal medium for at least about 24 hours. . The micro-organ explant is then placed in culture. Typically, the explant includes an isolated population of cells having the microstructure of the organ from which the explant is isolated. In one embodiment of the invention, at least one cell of the explant has the ability to proliferate. The cells of the subject's micro-organ culture may be in equilibrium, ie the ratio of cell proliferation to cell loss in the population of cells is 1, or the cells in the micro-organ culture are It is possible to grow at a rate that is greater than lost, and as a result, in the population of cells, the ratio of cell proliferation to cell loss in the cell loss population is greater than 1, eg, micro-organ explants Includes a population of cells obtained from neoplastic tissue.
[0016]
Preferred organs from which cells of micro-organ cultures can be isolated include lymphoid organs such as thymus and spleen; gastrointestinal organs such as intestine, liver, pancreas, gallbladder and bile duct; lung; reproductive organs such as Examples include prostate and uterus; breast; skin; ureteral organs such as bladder; kidney; cornea; and blood-related organs such as bone marrow. In each of these examples, the organ microstructure is maintained by cultured explants. The micro-organ culture may be a tissue section, eg, a pancreatic tissue section containing β islet cells, eg, a skin tissue section comprising epidermal and dermal cells and other skin-specific structural features such as hair follicles.
[0017]
Cells in the micro-organ explants may also be modified to express the recombinant protein. This protein may or may not be normally expressed by the organ from which the explant is derived. For example, gene products that are normally produced by the pancreas and that can be augmented by the transgenic methods of the invention, for example, to correct deficiency include insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, ribonuclease, Deoxyribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase A ₂ Similarly, gene products that are normally produced by the liver and can be complemented by gene replacement therapy include blood coagulation factors such as factor VIII and IX blood coagulation factors, UDP glucuronyltransferase Ornithine transcarbamoylase, and cytochrome p450 enzymes; gene products normally produced by the thymus include serum thymic factor, thymic hormone factor, thymopoietin and thymosin α1.
[0018]
The micro-organ cultures of the present invention can be used in a method for delivering a gene product to a recipient subject. The method includes providing a population of cells isolated from a donor subject. The population of cells has a surface area to volume that provides the microstructure of the tissue or organ from which the cells are isolated and an isolated population of cells that can be maintained in minimal medium for at least about 24 hours. A recombinant nucleic acid encoding the desired gene product and directing expression can then be introduced into the population of cells to generate a population of transgenic cells in the micro-organ explant, eg, a transgenic explant. . The transgenic explant may be administered to the recipient subject. The donor subject and the recipient subject may be the same type of subject or different types of subjects.
[0019]
The micro-organ cultures of the present invention can also be used in methods for identifying factors that induce the proliferation of cells of a given organ, including progenitor cells. The method includes generating a micro-organ explant culture according to the present invention, the explant comprising at least one cell having the ability to proliferate. After being placed in culture, the explant is contacted with a candidate compound, eg, a compound to be tested for cell growth ability, and the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is measured. The measured level of cell proliferation in the presence of this candidate compound is then compared to the level of cell proliferation in the absence of the candidate compound. An increase in the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is an indication of cell growth factor. Inhibitors of cell proliferation can be identified using similar methods. Specifically, if the level of cell proliferation measured in the presence of the candidate compound is determined using the method described above, compare this to the level of cell proliferation in the absence of the candidate compound. Can do. A decrease in the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is indicative of an inhibitor of cell proliferation.
[0020]
For identifying micro-organ cultures of the present invention for factors that induce or inhibit differentiation of one or more cell types in a given organ, or factors that maintain a particular differentiated state (prevent dedifferentiation) It can be used in the method. The method includes generating a micro-organ explant from the organ of interest. The population of cells that make up this explant is the microstructure of the organ, at least about 1.5 mm, as described herein below. ^-1 And having at least one cell having the ability to differentiate or having the ability to differentiate and dedifferentiate. Once cultured, the population of cells is contacted with a candidate compound and the level of cell differentiation in the presence of this compound is measured. The measured level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. An increase in the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is an indication of a cell differentiation factor. Inhibitors of cell differentiation can be identified using similar methods. Specifically, when the measured level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is determined using the method described above, it can be compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. . A decrease in the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is indicative of an inhibitor of cell differentiation.
[0021]
Yet another aspect of the invention provides a method for identifying and isolating a stem cell or precursor cell population from an organ. This method generally provides for isolating explants of a population of cells from an organ in culture. As described herein, the explant is characterized by: (i) maintaining the microstructure of the organ from which the explant is derived in (ii) at least about 1 .55mm ^-1 At least one progenitor or stem cell having the surface area to volume index (Aleph), and (iii) the ability to proliferate. The explant is contacted with a factor that induces proliferation of precursors or stem cells, such as a growth factor or other mitogen, to grow a separate population of cells in the explant. Subsequently, the expanded progenitor cells may be isolated from the explants. Such subpopulations of this explant can be identified thanks to their proliferative response. In other embodiments, progenitor / stem cells grow simultaneously in culture without the addition of exogenous factors. In other embodiments, for example, by direct mechanical separation of newly emerging buds from the rest of the explant or by separation of all or part of the explant and subsequent isolation of the amplified cell population Can isolate precursors or stem cells from explants that proliferate in response to this factor.
[0022]
Yet another method that can use the micro-organ cultures of the present invention can be used in a method for promoting wound healing in a recipient subject. This method is at least about 1.5 mm ^-1 Isolating from a donor subject, which is a population of cells having a number of alleles, and adding the population of cells to the wound of the recipient subject. The donor subject and the recipient subject may be the same type of subject or different types of subjects. In one embodiment, the tissue from which the cells are isolated is skin, and the recipient subject's wound is an ulcer, eg, a diabetes-related ulcer.
[0023]
The practice of the present invention uses conventional techniques of cell biology, cell culture, molecular biology, transgenic biology, microbiology, recombinant DNA and immunology within the field unless otherwise indicated. Such techniques are explained fully in the literature. See, for example: Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and N. D. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed., 1984); Mullis et al., US Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. Jig. Translation (BD Hames & S. J. Higgins 1984); Culture of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc., NY); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (edited by J. Miller and M. P. Calos, 198). , Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Volume 154 and 155, Volume (Wu et al., eds.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds, Academic Press, London, 1987); and Handbook of Experimental Immunology, Vo lumes I-IV (DM Weir and CC Blackwell, 1986).
[0024]
Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description, and from the claims.
Brief description of the drawings
FIG. 1 is a diagrammatic representation of a micro-organ depicting the dimensions that determine the Aleph, where x = tissue thickness and a = tissue width.
FIG. 2 is a bar graph showing cell growth in guinea pig micro-organ cultures as determined by BrdU labeling after different time incubations.
FIG. 3 is a bar graph showing cell growth in human backskin micro-organ cultures as determined by BrdU labeling after 1-8 days of culture incubation.
4A-4D show mouse skin (50 × magnification) (FIG. 4A), guinea pig skin (75 × magnification) (FIG. 4B), human foreskin (50 × magnification) (FIG. 4C) and human foreskin (75 × magnification) ( FIG. 4D) is a photomicrograph showing immunofluorescence corresponding to the replicating cells.
FIGS. 5A-5C are cross-sections (75 × magnification) of human epidermal micro-organ explants at culture day 0 (FIG. 5A), day 3 (FIG. 5B), and day 6 (FIG. 6D). ).
FIG. 6 is a bar graph demonstrating the effect of various thicknesses (×) on epidermal proliferation of guinea pig skin micro-organ cultures using BrdU incorporation, where (a) is kept constant at 4 mm. Yes.
7A-7B are photomicrographs showing immunofluorescence corresponding to proliferating cells in pancreas-derived microcultures (magnification 75 ×).
FIG. 8 is a bar graph showing the amount of insulin released by adult porcine pancreatic micro-organ cultures.
FIG. 9 shows the growth of cells in the colon, liver, kidney, duodenum and esophagus micro-organ cultures on day 3, 4 and 6 of culture. ³ 3 is a bar graph showing H thymidine incorporation.
FIGS. 10A-10C are photomicrographs showing active proliferation of hair follicles in micro-organ cultures as determined by immunofluorescence. The magnification is 40 × (FIG. 10A), 40 × (FIG. 10B), and 75 × (FIG. 10C).
FIG. 11 is a bar graph showing the hair shaft size distribution at the start and end of microculture.
FIG. 12 is a bar graph showing inhibition of mitogenesis in micro-organ cultures in the presence of 2.5 ng / ml TGF-β in guinea pig skin cultures.
FIG. 13 is a diagrammatic representation of a micro-organ explant for the treatment of chronic skin ulcers, showing an incomplete excision of a tissue section that maintains a readily manipulatable structure in vivo.
FIG. 14 is a photograph of the surface of a mouse after replacement of a section of normal skin with a micro-organ culture; observed healing, development of a new hair shaft in the implant, and incorporation of the implant into normal mouse skin (Magnification 10 ×).
FIG. 15 is a graphical representation of luciferase reporter expression in guinea pig skin micro-organ cultures after transfection of cultures with a plasmid encoding a luciferase reporter gene.
FIG. 16 is a graphical representation of luciferase gene expression in rat lung and thymus micro-organ cultures after cationic lipid-mediated transfection of cultures with plasmids encoding luciferase reporter genes.
FIG. 17 is a graphical representation of telogen hair follicle activation upon treatment with FGF in a micro-organ culture of the present invention.
FIG. 18 is a graphical representation of the expression of the transgenic luciferase gene in the micro-organ explants of the present invention.
[0025]
Detailed description of the invention
The present invention relates to a three-dimensional organ explant culture system. This culture system can be used for long-term growth of micro-organ explants in vitro in an environment that closely approximates the environment found throughout the organ in vivo. The culture systems described herein provide for growth and proper cell maturation to maintain a similar structure relative to the organ counterpart in vivo.
[0026]
The micro-organ cultures of the present invention provide an in vitro culture system where tissue or organ sections can be maintained for long periods of time and preserve their function. These culture systems provide an in vitro model, where cell differentiation, cell proliferation, cell function, and methods for altering such cell characteristics and functions can be conveniently and accurately tested. The resulting cultures are screened for in vivo cytotoxic and pharmaceutical compounds from in vivo transplantation, production of biologically active molecules in a “bioreactor”, and of precursor cells from tissues. It has various uses ranging from isolation.
[0027]
For example, without limitation, specific embodiments of the invention include: (i) a micro-organ bone marrow culture implant used to replace bone marrow destroyed during chemotherapy treatment; (Ii) micro-organ liver implants used to enhance liver function in cirrhotic patients; (iii) genetically altered cells grown in a micro-organ culture of a subject (eg, expressing a recombinant gene encoding insulin) (Iv) a dental prosthesis coupled to a micro-organ culture of the oral mucosa.
[0028]
In still other exemplary non-limiting embodiments, the micro-organ cultures of the invention are used to screen a wide variety of compounds, such as cytotoxic compounds, growth factors / regulators, pharmaceutical factors, and the like. It can be used in vitro. To achieve this goal, micro-organ cultures are maintained in vitro and exposed to the compound to be tested. The activity of the cytotoxic compound can be measured, for example, by its ability to damage or kill cells in the explant.
[0029]
This can be easily evaluated by vital staining techniques. The effects of growth factors / regulators can be assessed by analyzing the cell content of this explant, for example by total cell content and different cell content. This can be accomplished using standard cytological and / or histochemical techniques, including the use of immune cell technology using antibodies that define type-specific cellular antigens. In a three-dimensional system, the effect of various drugs on cultured normal cells can be evaluated. For example, drugs that increase erythropoiesis can be tested against bone marrow micro-organ cultures. For example, drugs that affect cholesterol metabolism by reducing cholesterol production can be tested against liver micro-organs. Abnormal tissue micro-organ cultures can also be used to facilitate studies of hyperproliferative or neoproliferative disorders. For example, micro-organ explants of organs that have been invaded by expanded tumor cells can be used as a model system, for example, to test the efficacy of anti-tumor factors.
[0030]
For convenience, certain terms used in the specification, examples, and appended claims are collected here.
[0031]
The term “explant” refers to a collection of cells from an organ that have been harvested from the body and grown in an artificial medium. When referring to an explant derived from an organ that has both an interstitial component and an epithelial component, the term generally refers to an explant that contains both components in a single explant derived from that organ.
[0032]
The term “tissue” refers to a similar specialized group or layer of cells that together perform a specific specialized function.
[0033]
The term “organ” refers to two or more adjacent layers of tissue that maintain some form of cell-cell and / or cell-matrix interaction to create a microstructure. Refers to the layer. In the present invention, micro-organ cultures were prepared from organs such as mammalian skin, mammalian pancreas, liver, kidney, duodenum, esophagus, bladder, cornea, prostate, bone marrow, thymus and spleen.
[0034]
The term “stroma” refers to the supporting tissue or matrix of an organ.
[0035]
The term “micro-organ culture” as used herein refers to an isolated population of cells, eg, an explant having the microstructure of the organ or tissue from which the cells are isolated. Say. That is, isolated cells come together to form spatial interactions, such as cell-cell, cell-matrix and cell-stroma interactions, as well as the actual tissue and intact organism from which the explant was derived. Create a three-dimensional structure that simulates / holds body orientation. Thus, such interactions between the stromal layer and the epithelial layer are preserved in the explanted tissue, so that critical cellular interactions occur, for example, autocrine and paracrine factors, and other It provides other extracellular stimuli that maintain the biological function of the plant and provides long-term survival under conditions where sufficient nutrient and waste transport occurs throughout the sample.
[0036]
The micro-organ cultures of the present invention have an organ or tissue microstructure from which cells or tissue explants are isolated. As used herein, the term “microarchitecture” refers to an isolated population of cells or tissue explants, wherein at least about 50% of this population of cells, preferably at least About 60%, more preferably at least about 70%, even more preferably at least about 80%, and most preferably at least about 90% or more of their physical with at least one cell or non-cellular material in vitro And / or maintaining functional contact, the substance and the cells are in physical and / or functional contact in vivo, and at least about 1, more preferably at least about 5, And most preferably refers to a population that forms at least about 10 or more layers of cell culture. Preferably, the explant cells maintain at least one biological activity of the organ or tissue from which it is isolated.
[0037]
The term “isolated” as used herein refers to an explant that has been separated from its natural environment in an organism. The term encompasses overall physical separation from its natural environment, eg removal from a donor animal, eg, a mammal such as a human or minipig. For example, the term “isolated” refers to a population of cells that are explants, a population of cells that are cultured as part of an explant, or a population of cells that are transplanted in the form of an explant Say. The term “isolated” when used to refer to a population of cells encompasses the population of cells resulting from the growth of the cells in the micro-organ culture of the present invention.
[0038]
The term “ectodermal” refers to the outermost of the three primitive germ layers of the embryo; the epidermis and epidermal tissues, such as the nail, hair, and skin sweat glands, the nervous system, external sensory organs, and the oral and anal mucosa Is derived from it.
[0039]
The terms “epithelium” and “epithelial tissue” refer to the cell coating (skin, mucous membrane, and serous) of the inner and outer surfaces of the body, including glands and other structures derived from it, such as the cornea, esophagus, The epidermis and hair follicle epithelial cells are included. Other exemplary epithelial tissues include: the olfactory epithelium, which is a pseudostratified epithelium that lines the olfactory portion of the nasal cavity and contains receptors for odor sensation; the glandular epithelium (which consists of secretory cells) Squamous epithelium (which refers to epithelial tissue composed of flat plate cells). The term epithelial tissue may also refer to transitional epithelium, which is a hollow organ that is exposed to large mechanical changes due to contraction and expansion, such as stratified squamous and columnar epithelium. It is characteristically found to line the organization that shows the transition between. The term “epithelialization” refers to healing by growth of epithelial tissue covering the peeled surface.
[0040]
The term “skin” refers to a protective covering outside the body composed of the dermis and epithelium and is understood to include sweat and sebaceous glands and hair follicle structures. Throughout this application, additional “cutaneous” may be used and should be understood to generally refer to skin attributes, depending on the context in which they are used.
[0041]
The term “epidermis” refers to the outermost layer of skin derived from the embryonic ectoderm and the layer without conduit, which ranges from 0.07 to 1.4 mm in thickness. On the palm and sole surface, it includes five layers from the outside: a basal layer composed of vertically arranged cylindrical cells; from flat polygonal cells with short processes or needles Consisting layer of spinous cells or processes; Granule layer composed of flat granule cells; Transparent composed of several layers of transparent permeable cells with obscured or absent nuclei Stratum corneum composed of flat keratinized non-nucleated cells. In the epidermis of the whole body surface, there is usually no transparent layer. An “epidermoid” is a cell or tissue that mimics the epidermis, but may also be used to refer to any tumor that occurs at a non-skin reaction site and may be formed by the inclusion of epidermal elements.
[0042]
“Corium or dermis” refers to a layer of skin deep beneath the epidermis that consists of a dense layer of connective tissue of the vasculature and contains sensory nerves and terminal organs. The hair root, as well as the sebaceous and sweat glands, are epidermal structures that are deeply embedded in the dermis.
[0043]
The term “gland” refers to a collection of cells specialized to secrete or excrete substances that are not related to the normal metabolic requirements of the cell. For example, a “sebaceous gland” is a dermal holocrine gland that secretes oily substances and sebum. The term “sweat gland” refers to a gland that secretes sweat and is located in the dermis or subcutaneous tissue and is open by a tube on the body surface. Normal sweat glands or eccrine sweat glands are distributed over most body surfaces and promote cooling by evaporating secretions; apocrine sweat glands enter the top of the hair follicle and not directly on the skin, and around the anus And is found only in certain body areas such as the armpit.
[0044]
The term “hair” (or “pili”) refers to a thread-like structure, in particular a specialized skin structure. It consists of keratin, develops from a teat that falls into the dermis, is produced only by mammals, and is characteristic of that group of animals. The term also refers to a collection of such hairs. “Hair follicle” refers to a tubular invagination of the epidermis enclosing hair (hair), from which the hair (hair) grows; and “follicular epithelial cells” "Refers to epithelial cells, such as stem cells, outer root sheath cells, matrix cells and inner root sheath cells, surrounded by the dermis in the hair follicle. Such cells may be normal non-malignant cells or may be transformed / immortalized cells.
[0045]
The term “alopecia” generally refers to the loss of hair (hair) from a bun, for example, the skin area where hair (hair) is usually present. Various forms of alopecia are known in the art. For example, alopecia areata is a loss of well-defined areas, usually reversible hair (hair), which usually includes beard or hair; drug alopecia is a drug intake Loss of hair (hair) due to cerebral dysfunction; and androgenetic alopecia, or androgenetic baldness, refers to genetically determined androgen-dependent loss of hair, which is generally a regression of the frontal region Start and proceed symmetrically, eventually leaving only sparse peripheral hair.
[0046]
Throughout this application, the term “proliferative skin disorder” refers to any disease / disorder of skin characterized by unwanted or abnormal growth of skin tissue. These conditions are typically characterized by epidermal cell proliferation or incomplete cell differentiation and include, for example, X-linked ichthyosis, psoriasis, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis , Exfoliative exfoliative keratopathy and seborrheic dermatitis. For example, epidermal dysplasia is a form of incomplete development of the epidermis, for example, “wart-like epidermal dysplasia”, which is caused by the same virus or closely related viruses of the vulgaris warts It is a state to do. Another example is “epidermal exfoliation”, which refers to a relaxed state of the epidermis with blister formation either spontaneously or at the site of trauma.
[0047]
As used herein, the term “psoriasis” refers to a hyperproliferative skin disorder that alters the skin's regulatory mechanisms. Specifically, lesions are formed that include temporary and secondary changes in epidermal proliferation, the inflammatory response of the skin, and the expression of regulatory molecules such as lymphokines and inflammatory factors. Psoriatic skin is caused by increased epidermal cell turnover, thickened epidermis, abnormal keratinization, inflammatory cell infiltration into the dermis layer, and polymorphonuclear leukocyte infiltration into the epidermis layer, resulting in increased basal cell cycle Characterized morphologically. In addition, there are keratinocytes and parakeratinocytes.
[0048]
As used herein, “proliferation and propagation” refers to cells undergoing mitosis.
[0049]
The term “progenitor cell” can give rise to more progenitor cells that can proliferate and have the ability to give rise to a large number of mother cells that can then differentiate or give rise to daughter cells that can differentiate An undifferentiated cell. As used herein, the term “progenitor cell” is also intended to encompass cells that are sometimes referred to in the art as “stem cells”. In a preferred embodiment, the term “progenitor cell” is a generalized mother cell whose progeny is often completely, such as occurs in progressive diversification of embryonic cells and tissues, by differentiation. A mother cell that specializes in different directions by acquiring individual features. For example, “hematopoietic progenitor cells” (or stem cells) refer to progenitor cells that occur in the bone marrow and other blood-related organs and give rise to differentiated progeny such as, for example, red blood cells, lymphocytes, and other blood cells.
[0050]
As used herein, “transformed cells” refer to cells that have spontaneously converted to an unrestricted state of growth, that is, they have acquired the ability to grow over an infinite number of divisions in culture. Transformed cells can be characterized in terms such as neoplasm, undifferentiated, and / or hyperplasia with respect to loss of growth control.
[0051]
As used herein, “immortalized cells” are modified through chemical and / or recombinant methods such that the cells have the ability to grow by an infinite number of divisions in culture. Cell.
[0052]
The term “carcinoma” refers to a malignant new growth made up of epithelial cells that tend to infiltrate the surrounding tissues and give rise to metastases. A representative carcinoma includes “basal cell carcinoma”. This is an epithelial tumor of the skin, but with little metastasis and the possibility of local invasion and destruction; “squamous cell carcinoma” is a carcinoma that originates from the squamous epithelium and has cubic cells “Carcinosarcoma” includes malignant tumors consisting of cancer and sarcoma tissue; “adenocystic carcinoma” refers to a nest of small epithelial cells present in the mammary and salivary glands and the mucous glands of the respiratory tract An epidermoid carcinoma that is marked by a vitreous or mucinous interstitial column or band separated or surrounded by a cord; “epidermoid carcinoma” refers to cancer cells that tend to differentiate in the same way as epidermal methods That is, they tend to form spinous cells and undergo keratinization; “nasopharyngeal carcinoma” refers to a malignant tumor that arises in the epithelial lining of the space behind the nose; And “renal cell carcinoma” relates to carcinoma of renal parenchyma composed of tubular cells of various arrangements. Another carcinoma epithelial growth is a “papilloma”, which refers to a benign tumor derived from the epithelium and having papillomavirus (papilloma virus) as the causative factor; A brain tumor or meningeal tumor formed by inclusion of an ectodermal element at the time of closing the groove.
[0053]
As used herein, a “transgenic animal” is any animal, preferably a non-human mammal, bird or amphibian, wherein one or more cells of the animal are human interventions such as those in the art. And heterologous nucleic acids derived by well-known transgenic techniques. This nucleic acid is directly or indirectly introduced into the cell by introduction into the precursor of the cell by a method of careful genetic manipulation, for example, by microinjection using a recombinant virus or infection. The term genetic engineering does not include classical cross-breeding or in vitro fertilization, but rather relates to the introduction of recombinant DNA molecules. This molecule may be integrated into the chromosome or may replace the DNA extrachromosomally. The term also encompasses transgenic animals in which the recombinant gene is silent, such as, for example, FLP or CRE recombinase dependent constructs described in the art. Transgenic animals also include both constitutive “knockout” animals and conditional “knockout” animals. “Non-human animals” of the present invention include vertebrates such as rodents, non-human primates, pigs, sheep, dogs, cows, chickens, amphibians, reptiles and the like. Preferred non-human animals are minipigs or are selected from the rodent family including rats and mice, most preferably mice. The term “chimeric animal” is used herein to refer to an animal in which a recombinant gene is found or an animal in which the recombinant is not all cells of the animal but is expressed in some cells. Used.
[0054]
I. Establishment of micro-organ culture
A salient feature and method of the micro-organ culture of the present invention is the ability to preserve the cellular microenvironment found in vivo for a particular tissue, according to the present invention. The present invention states that under defined circumstances, the proliferation of cells in different tissue layers of organ explants, such as the mesenchymal and epithelial layers, can be activated to grow and mature in culture. Based in part on the discovery. Furthermore, the cell-cell interactions and cell-matrix interactions provided in the explant itself support cell homeostasis, eg, cell maturation, differentiation and separation in explant cultures, and thereby tissue Is sufficient to maintain its microstructure and function for a long time.
[0055]
An example of physical contact between a cell and a non-cellular matrix (matrix) is physical contact between an epithelial cell and its basement membrane. Examples of physical contact between a cell and another cell include actual physical contact maintained by cell-to-cell cell junctions such as gap junctions and tight junctions. Examples of functional contact between one cell and another include electrical or chemical communication between cells. For example, cardiomyocytes communicate with other cardiomyocytes via electrical impulses. In addition, many cells are chemical messages such as either locally spreading (paracrine and autocrine signaling) or transported to more distant locations by the vascular system (endocrine signaling). It communicates with other cells through a hormone. Examples of paracrine signaling between cells include various cells of the gastrointestinal tract (known as enteroendocrine cells) such as pyloric D cells (secreting somatostatin, which is then secreted by nearby pyloric stomach (G) cells. Message generated by (inhibiting release).
[0056]
While not wishing to be bound by any particular theory, this microstructure is extremely important for the maintenance of explants in minimal medium, for example, without any exogenous sources of serum or growth factors. possible. Because this tissue can be maintained in such minimal medium by paracrine and autocrine factors that arise from specific cell interactions within the explant.
[0057]
Furthermore, the phrase “maintaining their physical and / or functional contact in vitro” refers to an isolated population of cells, wherein at least one cell and at least one cell or non-cellular material. Develop physical and / or functional contacts, and the substance and those cells are not intended to exclude isolated populations of cells that are not in physical and / or functional contact in vivo . An example of such development is the growth of at least one cell of an isolated cell population.
[0058]
In a preferred embodiment, the population of cells making up the explant is a natural population of one cell relative to another when there are different cells in the explant, eg, to preserve this different layer of cells. Isolated from organs in a manner that preserves affinity. For example, in skin micro-organ cultures, epidermal keratinocytes remain associated with the stroma, and normal tissue organization, including hair follicles and glands, is preserved. This basic structure is common to all organs including, for example, epithelial components. Furthermore, such association facilitates communication between cells. Many types of communication occur between animal cells. This is particularly important in differentiated cells. In this differentiating cell, induction occurs as a result of the responding cell undergoing a change in the direction of differentiation, one (inducing) tissue or cell and another (responsive) tissue or cell. Is defined as the interaction between. Furthermore, inducible interactions occur in embryonic and adult cells and can act to establish and maintain morphogenic patterns and induce differentiation (Gurdon (1992) Cell 68: 185-199). ).
[0059]
Furthermore, micro-organ cultures prepared according to the present invention preserve normal tissue structure even when cultured for long periods. This is the hair follicles, sweat glands and sebaceous glands of skin micro-organs in vitro, following their normal appearance in vivo (see Example VIII and FIGS. 10A-10C), or Langerhans islets in the pancreas. Maintenance of what follows its normal appearance in vivo (see Examples IV, V and VI). These cultures can be maintained in controlled and uniform conditions, and more closely in vivo, in similar tissues, so that they cause natural phenomena as well as natural phenomena arising from disease, aging or trauma Unique opportunities for observing, measuring and controlling the perturbation of are provided. In addition, techniques for studying individual cells at identified sites on the culture are readily available, so if the functions of the individual components of the tissue interact with each other and the entire tissue, the tissue Insight into the individual components of is provided.
[0060]
Examples of micro-organ cultures prepared in accordance with the present invention are described in the accompanying examples, and in a manner that can include multiple layers to preserve the natural affinity of one cell for another. It may include a sorted population of cells. The growth of individual cells or groups of cells can be observed and followed by autoradiography or immunofluorescence.
[0061]
By way of further illustration only, this accompanying example demonstrates that the subject's culture system provides epithelial and stromal element replication in vitro in a system comparable to physiological conditions. Importantly, the cells that replicate in this system will segregate properly to form morphologically and histologically normal epidermal and dermal components.
[0062]
In addition to the isolation of explants that retain the cell-to-cell, cell-matrix and cell-interstitial structures of the original tissue, the dimensions of the explants are, for example, long-term for micro-organ cultures, for example It is important for cell viability where it is intended to be maintained for more than 7-21 days. Thus, the size of the tissue explant is sufficient for nutrients and gases such as O ₂ Cell dispersal outside this explant to diffuse to all cells in the three-dimensional micro-organ and to minimize cytotoxicity and concomitant mortality due to waste localization in the micro-organ Selected to diffuse objects. Thus, the size of this explant is determined by the requirement for a minimum level of accessibility to each cell in the absence of specialized delivery structures or synthetic substrates. As described herein, Aleph, an index calculated from the thickness and width of the explant, is at least about 1.5 mm. ^-1 It has been discovered that if it is larger, this accessibility can be maintained.
[0063]
As used herein, “Aleph” refers to the formula 1 / x + 1 / a ≧ 1.5 mm ^-1 Is the surface area to volume ratio given by: where x = tissue thickness and a = tissue width (millimeters). In a preferred embodiment, the explant allele is 1.5 to 25 mm. ^-1 Range, more preferably 1.5 to 15 mm ^-1 Range, and even more preferably 1.5 to 10 mm ^-1 The range is 1.5 to 6.67 mm. ^-1 Range of 1.5 to 3.33 mm ^-1 Aleph in the range of is intended.
[0064]
Thus, according to the present invention, the tissue explant surface area versus volume index is maintained within a selected range. This selected range of surface area to volume index provides cell access to nutrients and to waste disposal channels by diffusion in a manner similar to cells in a monolayer. This level of accessibility has a surface area to volume index, defined herein as "Aleph or Aleph index" of at least about 1.5 mm. ^-1 Can be achieved and maintained. Three dimensions were ignored in determining the surface area versus volume index. This is because variations in three dimensions result in radiometric variations in both volume and surface area. However, when determining aleph, a and x should be defined as the minimum two dimensions of the tissue section.
[0065]
Examples of allefs are provided in Table I, where, for example, a tissue having a thickness (x) of 0.1 mm and a width (a) of 1 mm has an afflict index of 11. In Example I, the tissue has x = 0.3 mm and a = 4 mm, so that Aleph = 3.48. In Example III, x varies and a is constant at 4 mm. As illustrated in FIG. 6, the proliferative activity is substantially reduced with increasing explant thickness. Thus, at a thickness of 900 μm, the number of proliferating cells in the micro-organ culture is about one tenth of the number in tissue from a similar source having a thickness of 300 μm. The Aleph index for a tissue having a thickness of 900 μm is 1.36 mm below the minimum described herein. ^-1 However, the Aleph index of a tissue having a thickness of 300 μm is 3.58 mm which is well inside the range described herein. ^-1 It is.
[Table 1]

[0066]
Again, without wishing to be bound by any particular theory, a number of factors provided by this 3D culture system can contribute to its success:
(A) By appropriate selection of the explant size, for example by using the above-mentioned Aleph calculation, the three-dimensional matrix can be used for proper diffusion of nutrients to all cells of the explant and to this explant. Provide an appropriate surface to volume ratio for sufficient diffusion of cellular waste from all cells in it.
(B) Thanks to the three-dimensional nature of the matrix, the various cells continue to proliferate actively symmetrically with the cells in monolayer culture. Monolayer culture cells grow to confluence, exhibit contact inhibition, and stop growing and dividing. The assimilation of growth and regulatory factors by replicating explant cells is partly quiescent with respect to overall volume, for example, stimulating the growth of cells in culture and regulating differentiation Even responsible for micro-organ culture.
(C) The three-dimensional matrix retains the spatial distribution of cellular elements, which closely approximates that found in the corresponding tissue in vivo.
(D) Cell-cell interactions and cell-matrix interactions may allow the establishment of a local microenvironment that is inducible to cell maturation. It has been recognized that maintaining a differentiated cell phenotype not only requires growth / differentiation factors, but also proper cell interactions. The present invention effectively mimics the tissue microenvironment.
[0067]
Micro-organ cultures derived from animals (including humans) such as skin, pancreas, liver, kidney, duodenum, esophagus, bladder, bone marrow, thymus or spleen as described in the following illustrative examples Cultures were isolated and grown in culture for 21 days. However, it is also within the scope of the invention to maintain the culture for longer than 21 days.
[0068]
II. Explant source for micro-organ culture
The micro-organ cultures of the present invention may be derived, for example, using explants isolated from: skin and mucosa (oral mucosa, gastrointestinal mucosa, nasal passage, respiratory tract, cervix and cornea). Pancreas; liver; bladder; bile duct; lung; prostate; uterus; breast gland; bladder tissue; and blood related organs such as thymus, spleen and bone marrow. Thus, an equivalent of in vitro culture of such organs can be generated. The tissue forming the explant may be pathological or normal (eg, healthy tissue). For example, the organ that isolates the micro-organ explants of the present invention can be affected by: hyperproliferative disorders such as psoriasis or keratosis; virus-infected cells such as hepatitis-infected or papillomavirus Proliferation of infected cells; neoplastic proliferative disorders such as basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, sarcoma or Wilms tumor; or pancreas suffering fibrotic tissue such as cirrhotic liver or pancreatitis.
[0069]
Examples of animals from which the cells of the invention can be isolated include humans and other primates, pigs, such as fully or partially inbred pigs (eg, minipigs and transgenic pigs), rodents Etc.
[0070]
III. Growth medium
There are a number of tissue culture media that exist for culturing animal-derived cells. Some of these are complex and some are simple. Although micro-organ cultures are expected to be able to grow in complex media, it is shown herein that the cultures can be maintained in simple media such as Dulbecco's minimal essential media. Has been. In addition, the culture can be grown in media containing other biological extracts such as serum or pituitary extracts, but neither serum nor any other biological extract is required. Shown in the book. Furthermore, organ cultures can be maintained in the absence of serum for extended periods of time. In a preferred embodiment of the invention, growth factors are not included in this medium during culture maintenance in vitro.
[0071]
Points regarding growth in minimal media are important. Currently, most media or systems for long-term growth of mammalian cells incorporate ambiguous proteins or use supporting cells to provide the proteins necessary to maintain such growth. Since the presence of such ambiguous protein can interfere with the intended end use of the micro-organ culture of the present invention, the explant is cultured under conditions that minimize the presence of ambiguous protein. It may generally be desirable to do so.
[0072]
As used herein, the term “minimal medium” refers to a chemically defined medium that contains only the nutrients necessary for the cells to survive and grow in culture. Typically, minimal media does not contain biological extracts such as growth factors, serum, pituitary extracts, or other substances that are not necessary to support the survival and growth of a cell population in culture. For example, a minimal medium is generally at least one amino acid, at least one vitamin, at least one salt, at least one antibiotic, at least one indicator, such as phenol red (used to determine hydrogen ion concentration), glucose, As well as other miscellaneous components necessary for cell survival and proliferation. The minimal medium does not contain serum. Various minimal media are commercially available as minimal essential media from Gibco BRL, Gathersburg, MD.
[0073]
However, growth factors and regulators do not need to be added to the medium, but the addition of such factors or other specialized cell inoculations can be used to enhance growth and cell maturation in culture, Can be changed or adjusted. Cell growth and activity in culture is affected by various growth factors such as insulin, growth hormone, somatomedin, colony-stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoiesis factor (hepatopoietin) and hepatocyte growth factor Can be done. Other factors that regulate growth and / or differentiation include prostaglandins, interleukins and naturally occurring negative growth factors, fibroblast growth factors, and transforming growth factor-β family members.
[0074]
The micro-organ culture may be maintained in any suitable culture vessel such as a 24-well or 96-well microplate and 5% CO ₂ In, it may be maintained at 37 ° C. The culture may be shaken to improve aeration, the speed of shaking being for example 12 rpm.
[0075]
With respect to culture vessels in which the micro-organ cultures of the present invention are provided (if necessary) (in or on), in preferred embodiments such vessels are generally containers of any material and / or shape. Note that it may be. A number of different materials can be used to form the container, including but not limited to: nylon (polyamide), dacron (polyester), polystyrene, polypropylene, polyacrylate, polyvinyl compounds (eg, Polyvinyl chloride), polycarbonate (PVC), polytetrafluoroethylene (PTFE; Teflon), thermonox (TPX), nitrocellulose, cotton, polyglycolic acid (PGA), feline intestinal suture, cellulose, gelatin, dextran Such. Any of these materials may be woven into a mesh. If the micro-organ culture is itself to be implanted in vivo, it may be preferable to use a biodegradable matrix such as, for example, polyglycolic acid, feline intestinal suture material, or gelatin. Non-degradable materials such as nylon, dacron, polystyrene, polyacrylate, polyvinyl, teflon, cotton, etc. may be preferred if the culture is to be maintained for a long time or stored frozen. A conventional nylon mesh that can be used in accordance with the present invention is Nitex, which is a nylon filtration mesh having an average pore diameter of 210 μm and an average nylon fiber diameter of 90 μm (# 3-210 / 36, Tetko, Inc., N .; Y.). Other embodiments are discussed below.
[0076]
In an exemplary embodiment, pancreatic micro-organs containing islets of Langerhans are prepared as cultures of the present invention. This culture is then provided in encapsulated form to avoid immune rejection. Three general (exemplary) approaches for encapsulation can be used. First, the tubular membrane is rolled into a housing containing a micro-organ explant. The membrane is connected to a polymer graft that in turn connects the device to a blood vessel. Maintaining normoglycemia in pancreatectomized animals treated with this device by membrane-permeable manipulation to allow free diffusion of glucose and insulin before and after the membrane and to block the passage of antibodies and lymphocytes (Sullivan et al. (1991) Science 252: 718).
[0077]
In the second approach, hollow fibers containing pancreatic explants are immobilized in alginate polysaccharide (if necessary). When this device is placed intraperitoneally in a diabetic animal, blood glucose levels can be lowered and good histocompatibility can be observed (Lacey et al. (1991) Science 254: 1782; also Example VI See Thus, the fibers may be pre-spun and subsequently loaded with micro-organ explants (Aebischer et al., US Pat. No. 4,892,538; Aebischer et al., US Pat. No. 5,106,627; Hoffman et al. (1990) Exp. Neurobiol. 110: Jaeger et al. (1990) Prog. Brain Res. 82: 41-46; and Aebischer et al. (1991) J. Biomech Eng. 113: 178-183).
[0078]
Third, the micro-organ island explants may be placed in microcapsules consisting of alginic acid or polyacrylate (see, eg, Lim et al. (1980) Science 210: 908; O'Shea et al. (1984) Biochim. Biochys. Acta 840: 133; Sugamori et al., (1989) Trans Am. Soc. Artif. : 1180).
[0079]
Finally, it is noted that the culture medium in which the microorgan cultures of the present invention are maintained can be collected as a source of conditioned medium. The term “conditioned medium” is, for example, a cultured cell / tissue free supernatant that occurs after some time of contact with cultured cells so that the medium is produced by the cells and the culture A supernatant that has been modified to contain certain paracrine factors and / or autocrine factors secreted therein. Examples of such products are insulin, various growth factors, and hormones. This conditioned medium can be used as a culture medium for other types of cell and tissue culture. Alternatively, this conditioned medium may be used as a source of new cell products such as growth factors. Such products can be purified or substantially purified by fractionation from the conditioned medium.
[0080]
IV. Measurement of biological properties of micro-organ cultures
The micro-organ cultures of the invention derived from normal tissue have been shown to maintain homeostasis with the growth of constituent cells without the overall growth of the tissue.
[0081]
Methods for measuring cell proliferation are well known in the art and most commonly involve determining the DNA synthesis characteristics of cell replication. Many methods exist in the art for measuring DNA synthesis, any of which can be used according to the present invention. In an embodiment of the invention, a radioactive label (for detection by immunofluorescence ( ³ DNA synthesis was determined using H-thymidine) or labeled nucleotide analogs (BrdU).
[0082]
Micro-organ cultures can be formed and maintained not only by the growth of mature cells, but also by the active involvement of precursor cells (including embryonic cells in some cases). Micro-organ cultures have been shown to present a suitable environment for preserving, identifying, isolating and promoting the natural evolution of these precursor cells. For example, immature cells of the basal layer have been observed to become mature keratinocytes in skin micro-organ cultures. Similarly, embryonic pancreatic cells can provide mature pancreatic epithelium in micro-organ cultures. The maturation of progenitor cells and their subsequent functionalization as adult cells are specific for specific keratins in epidermal cells and specialities such as insulin, Glut2 and glucagon in pancreatic epithelium, and albumin and factor VIII in liver micro-organ cultures. Can be monitored by measuring secreted product secretion.
[0083]
Micro-organ cultures prepared according to the present invention preserve the normal tissue structure present in vivo. As mentioned above, this involves the maintenance of hair follicles, sweat glands and sebaceous glands in the skin micro-organ in vitro and in accordance with the normal appearance of insulin and glucagon secreting cells in the pancreatic micro-organ. These cultures may be maintained in controlled and homogeneous conditions, and moreover they closely approximate the organ's microstructure in vivo, thereby allowing for natural phenomena and natural effects arising from disease, aging or trauma. There is a unique opportunity to observe, measure and manage the perturbation of this phenomenon. In addition, the availability of techniques for studying individual cells at specific sites on the culture allows the functionalization of the individual components of the organ and their interaction with each other and insight into the entire organ. Is obtained.
[0084]
Furthermore, the micro-organ culture of the present invention can be maintained for a long time in culture. Preferably, the micro-organ culture is at least about 24 hours, more preferably at least about 2 days, even more preferably at least about 5 days, even more preferably at least about 7 days, even more preferably at least about 2 weeks or more, It can be maintained in culture. The micro-organ cultures of the present invention are typically maintained in culture for at least 7 days. To illustrate, skin micro-organ cultures from human, mouse, guinea pig and rat skin have been maintained in culture for at least about 21 days.
[0085]
As used herein, the term “sustainable in culture” refers to a population of cells of a tissue explant that is at least about 60%, preferably at least about 70%, more preferably at least about 80%, still more preferably at least about 90%, most preferably 95% or more refers to a population of cells that are viable in culture after a specified period of time.
[0086]
In a preferred embodiment, the ratio of cell proliferation to cell loss, eg due to death or loss of cells in the micro-organ culture, is equal to 1, ie the number of cells grown is equal to the number of cells lost. In another embodiment of the invention, the ratio of cell growth to cell loss of cells in the microorgan culture is greater than 1, ie, cells are growing at a rate greater than cell loss. In the latter case, it is understood that the micro-organ culture includes a population of cells that is being amplified.
[0087]
V. Application of micro-organ culture
Exemplary applications of the micro-organ cultures of the present invention include:
(A) identification of factors involved in normal homeostasis of tissues and organs;
(B) study the effect on normal homeostasis of organ tissues and cells with respect to changes in the environment, including changes in nutrients and the presence of potentially toxic factors;
(C) understanding the path of change in organ tissues and cells induced during and during the pathogenesis or trauma;
(D) identification of repair mechanisms that reverse adverse effects in environmental changes associated with pathogenesis or trauma;
(E) Developmental regulation of cells that differentiate during normal homeostasis of tissues.
(F) developmental regulation of specialized structures in organs such as hair follicles;
(G) Insufficient to replace or regenerate tissue that remains part of individual organs but which has been damaged, such as occurs in patients with chronic skin ulcers, various forms of diabetes or chronic liver failure Replacement / transplantation of organs that are:
(H) as a tissue / organ equivalent for drug screening and cytotoxicity studies;
(I) as a diagnostic assay for proliferative disorders;
(J) as a source of new growth factors;
(K) as a source of stem / progenitor cells;
(L) as a source for inducing molecules;
(M) as a screening to induce molecules;
By way of further illustration, the method of the present invention can be used to produce skin equivalents in the form of micro-organ cultures. By way of background, it is noted that many attempts have been described to proliferate epithelial cells in a manner that mimics human skin, for wound treatment purposes, and in particular in the treatment of burns. Skin consists of two types of tissue. The following exist: (1) stroma or dermis, including fibroblasts sparsely distributed within a high density collagen matrix, and nerves, blood vessels and adipocytes; (2) closely packed, actively proliferating The epidermis containing the epidermal basal layer of immature epithelial cells. As the basal layer cells replicate, some of the young cells remain in the basal layer, while others migrate outward to increase in size and ultimately develop envelope resistance to detergents and reducing agents. In humans, the birth of cells in the basal layer takes about two weeks to reach the terminal or outer layer, after which the cells die and detach. The skin contains various structures, including hair follicles, sebaceous glands and sweat glands. Hair follicles are formed from differentiated keratinocytes, which are densely invaded in the epidermis. Open-type vesicles formed from such invaders collect and concentrate secreted keratin and produce hair (hair) long fibers. Alternatively, the epidermal cells lining the invagination can secrete fluid (sweat glands) or sebum (sebaceous glands). The regulation of the formation and growth of these structures is unknown. A constant renewal of healthy skin is achieved by an equilibrium process in which new cells are generated and aging cells die. It is necessary to understand how this precise regulation is made to offset abnormal events that occur in aging and also through diseases and trauma that disrupt balance.
[0088]
In one embodiment of the invention, the microstructure of the microorgan culture mimics or is substantially the same as the skin microstructure in vivo. For example, the microstructure has an epithelial / connective tissue structure. For example, in skin micro-organ cultures, epidermal keratinocytes remain associated with connective tissue, and normal tissue structures including hair follicles are preserved. Micro-organ cultures obtained from skin tissue sections can also include a basal layer that supports epidermal cells, an extracellular matrix that includes dermal cells, and at least one invagination, such as at least one hair follicle. The association between skin epithelial tissue and skin connective tissue facilitates cell-cell communication. Furthermore, full thickness skin can be grown in a variety of ways, thereby allowing an air contact surface. Exposure of this explant keratinocyte to air promotes more rapid differentiation of keratinocytes and more excessive secretion of the keratin layer, which may be very important in skin permeation studies.
[0089]
Finally, note that recent studies have shown that the skin is an essential and active component of the immune system (Cooper et al. (1987) The mechanical disease: Dermatology in General Medicine, 3rd. Edition, McGraw Hill, NY (pages 610-626)). One of the main cell types of skin responsible for various immune activities is Langerhans cells. These cells are prepared from fresh skin samples and added to a three-dimensional skin culture to produce an immunologically complete tissue system. Proliferation of these cells for long periods in culture is difficult by conventional tissue culture procedures. The ability to grow these cells in a three-dimensional system is of great importance in all aspects of research, including transplantation, cytotoxicity and disease mechanisms. This type of skin culture system has the greatest impact in research on autoimmune disorders (erythema lupus, bullous pemphigoid, etc.) that involve direct or indirect skin reactions. Thus, the micro-organ cultures of the present invention can be used to study proliferation / differentiation disorders under conditions where the immunological aspects of the disease are minimized. To identify factors that can inhibit the growth of hyperplastic epithelial cells, an exemplary drug screening assay using psoriatic skin explants can be derived.
[0090]
Skin is merely an example of tissue that can be grown as a micro-organ culture with epithelial tissue supported by stromal tissue. Other tissues, including epithelial tissues, may be grown as microorgan cultures of the present invention. Epithelial tissue is found in every part of the body where the interface between the organ and the environment occurs. The cycle of epithelial cells is continuous in the intact body and forms covering tissue for all free surfaces of the body, including the skin. In some cases, as in the pancreas, epithelial cells line many invades and secrete enzymes into the space, allowing the organ to function. The lung is another example of a highly invaded organ, where each invagination in the lung is arranged along epithelial cells through which air diffuses from the environment into the body. Again, these epithelial cells have characteristic properties. The intestinal lining also consists of specialized epithelial cells that not only form a barrier, but also include specialized structures for selective gastric absorption of food. All of the epithelium is supported by connective tissue. In addition, another organ that contains important cell-stromal interactions is the bone marrow.
[0091]
Thus, in another embodiment of the invention, the microstructure of the pancreatic culture of the micro-organ mimics or is substantially the same as the source pancreatic microstructure in vivo, eg, the microstructure is , Having an epithelial / connective tissue structure. For example, pancreatic micro-organ cultures contain pancreatic epithelial cells, such as islet cells, and remain associated with the connective tissue of the pancreas. Thus, in pancreatic micro-organ cultures, normal tissue structure is preserved and normal pancreatic epithelial cell products such as insulin and glucagon are produced.
[0092]
In another embodiment, the present invention provides for the production of micro-organ cultures derived from bone marrow, which preserve the organ microstructure in vivo. As described in Example XV, bone marrow micro-organs have been isolated in culture to induce a system comparable to physiological conditions.
[0093]
The bone marrow cultures of the present invention can be used to treat diseases or conditions that destroy healthy bone marrow cells or suppress their functional ability. Transplantation of the micro-organs of the present invention can be effective in the treatment of hematological grade and other neoplasias involving the bone marrow. Aspects of the invention are also useful for treating patients whose bone marrow is adversely affected by environmental factors (eg, radiation, toxins, etc.). Although replantation of explants derived from the patient's own bone marrow is generally preferred, such explants may be from the same species, eg, from another member of the same species, or from a different species, eg, another organism. Note that it may be derived from the body. An exemplary heterogeneous implant can be a micro-organ culture from minipigs for transplantation in humans.
[0094]
Furthermore, long-term growth of human hematopoietic progenitors is possible if human hematopoietic progenitors are provided with the necessary stromal-derived growth / regulators. Such interactions are provided by the micro-organs of the present invention, making these explants a source of stem and progenitor cells. In general, bone marrow hematopoietic progenitor cells colonize ("seed") natural packets formed in the stromal matrix of bone marrow micro-organs. The main rate-limiting factor in bone marrow stromal cell proliferation is the relatively low mitotic index of fibroblasts contained between bone marrow stromal cells. Thus, if it is desired that the growth of these cells and their predisposition to extracellular matrix components be enhanced, the explant can be contacted with factors such as hydrocortisone or other fibroblast growth factors. Good.
[0095]
If bone marrow is to be cultured to treat certain patients with metastatic disease or hematological malignancy, the bone marrow obtained from the patient will grow abnormally by physical means or chemotherapy prior to culture. Cells should be “removed”.
[0096]
Conditioned media from bone marrow micro-organ cultures of the present invention may be used as a source of new or known lymphokines, for example as a source of interleukins.
[0097]
The present invention, in one aspect, contemplates the use of the micro-organ cultures of the present invention for transplantation in an organism. As used herein, the terms “administering”, “introducing” and “transplanting” are used interchangeably and refer to a test according to a method or route that results in the localization of cells to a desired site. Refers to the placement of a cell population of the present invention in a body, eg, a homologous or heterogeneous subject. The cell population can be administered to the subject by any suitable route that results in delivery of the cells to the desired location in the subject while at least some of the cells remain alive. At least about 5%, preferably at least about 10%, more preferably at least about 20%, even more preferably at least about 30%, even more preferably at least about 40%, and most preferably at least about 50% or more of the cells Preferably it remains alive after administration to a subject. The duration of cell survival after administration to the subject may be as short as a few hours, such as from 24 hours to 2-3 days, and further from 2-3 weeks to 2-3 months. . Methods for administering a population of cells of the invention include implantation of cells into the visceral or parietal peritoneum, eg, into the sac of the net, cells into the organ of the recipient subject, eg, pancreas, liver, spleen, skin. Transplantation. The micro-organs of the invention can also be administered to a subject by transplantation, for example, as a kidney capsule.
[0098]
As used herein, the term “subject” refers to a mammal, eg, a primate, eg, a human. A “heterologous subject”, as used herein, is a subject into which cells of another species are or will be introduced. A “homologous subject” is a subject into which cells of the same species are or will be introduced. A donor subject is a subject that provides cells, tissues or organs that will be placed in culture and / or transplanted into a recipient subject. The recipient subject may be a heterologous subject or an allogeneic subject. Donor subjects can also provide cells, tissues or organs for reintroduction into themselves, ie, for autologous transplantation.
[0099]
The micro-organ can be refilled or biodegraded to facilitate transplantation of cell populations that can be subjected to immunological attack by the host (eg, when using xenografts such as porcine-human transplants). It may be inserted or encapsulated into a sex device and then implanted into the recipient subject. The gene product produced by such cells can then be delivered via polymeric devices designed for drugs including, for example, sustained release compounds, eg, proteinaceous biologics. For sustained release of gene products of the cell population of the present invention at specific target sites using a variety of biocompatible polymers (including hydrogels), including both biodegradable and non-degradable polymers Implants can be formed. The generation of such implants is generally known in the art. For example, see: Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials, edited by David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); Sabel et al., US Pat. Lim, U.S. Pat. No. 4,391,909; and Sefton U.S. Pat. No. 4,353,888. The cell populations of the present invention may be administered in pharmaceutically acceptable carriers or diluents such as sterile saline and aqueous buffers. The use of such carriers and diluents is well known in the art.
[0100]
In one embodiment, the micro-organ culture of the present invention can be used for wound healing. Skin lesion repair is known to be a highly complex process involving primary epithelial cell migration and epidermal cell replication in response to molecular signals from the underlying connective tissue. Skin micro-organ cultures are described herein as a model for wound healing. Under controlled culture conditions, factors that control healing can be carefully monitored. Furthermore, since micro-organ cultures are sequestered from the natural blood supply, analysis of the healing process can be performed without the additional complexity of blood-derived factors or cells. Normal epidermis has low mitotic activity with a cell cycle every 200-300 hours. When the epidermis is injured, a burst of mitotic activity results, and the cells divide up to 10 times faster depending on the wound condition and severity (Pinkus H. (1951) J. Invest. Dermatol. 16: 383-386).
[0101]
As demonstrated in Example II, skin micro-organ cultures show an increase in proliferation of up to 10-fold over several days. In this example, the wound edges are comparable to micro-organ cultures. This increased proliferation provides a unique opportunity to study the wound healing process, mimicking the events associated with wounds. Furthermore, according to the appended examples, it is possible to apply the epidermal explants of the present invention to chronic wounds (Example IX) and to form viable implants capable of growing hair (hair) (Example XI) is demonstrated in vivo.
[0102]
Furthermore, the subject's epidermal micro-organ can be used to treat burn patients. The need for skin changes has been demonstrated for burn patients. In some centers in the United States and Europe, cultured human keratinocyte allografts and xenografts have been utilized to permanently cover burn wounds and chronic ulcers (Eisinger et al. (1980) Surgary 88: Green et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5665-5668; Cuono et al. (1987) Plast. Reconstr. Surg. 80: 626-635). These methods are often unsuccessful, and recent studies have shown that blister formation and / or healing grafts are due to abnormalities in one or more connective tissue components formed under the transplanted epidermal layer. It has been shown that skin fragility may be present (Woodley et al. (1988) JAMA 6: 2566-2571). The skin culture system of the present invention provides both epidermal and dermal skin equivalents and should overcome the characteristic problems of currently used cultured keratinocyte grafts.
[0103]
In yet another embodiment, the micro-organ culture system of the present invention can produce a vehicle for inducing a gene or gene product in vivo for use in gene therapy. For example, using recombinant DNA technology, a gene that a patient is missing can be placed under the control of a viral or tissue specific promoter. Recombinant DNA constructs can be used to transform or transfect all cells or specific cells in the micro-organ culture system of the present invention. A micro-organ culture that expresses an active gene product can be transplanted into an individual lacking that product.
[0104]
The use of the micro-organ cultures of the present invention in gene therapy has a number of advantages. First, since the culture contains eukaryotic cells, the gene product is properly expressed and processed in the culture to form an active product. Second, gene therapy techniques are only useful when the number of transfected cells can be substantially enhanced so that they are of clinical value, validity and utility; The culture allows for an increase and amplification of the number of transfected cells.
[0105]
In a further embodiment of the invention, transgenic micro-organ cultures can be used to facilitate gene transfer. For example, without limitation, a micro-organ culture containing a recombinant virus expression vector can be used to transfer the recombinant virus to cells contacted with the culture, for example by transplantation, thereby simulating viral transmission in vivo. Can be used to Thus, this system may be a more effective way to achieve gene transfer than current techniques for DNA transfection.
[0106]
Thus, the cells of the micro-organ culture of the present invention can be modified to express the gene product. As used herein, the phrase “gene product” refers to proteins, peptides and functional RNA molecules. Generally, a gene product encoded by a nucleic acid molecule is a gene product that is desired to be supplied to a subject. Examples of such gene products include proteins, peptides, glycoproteins and lipoproteins normally produced by the recipient subject's organs. For example, gene products that can be supplied to defective organs in the pancreas by gene replacement methods include insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, ribonuclease, deoxyribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase A ₂ Gene products normally produced by the liver include blood coagulation factors such as blood coagulation factor VIII and factor IX, UDP glucuronyltransferase, ornithine transcarbanoylase, and cytochrome. p450 enzymes, and adenosine deaminase (for serum adenosine processing or low-density lipoprotein endocytosis); gene products produced by the thymus include serum thymic factor, thymic hormone factor, thymopoietin and thymosin alpha ₁ Gene products produced by gastrointestinal cells include gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin and substance P. Alternatively, the encoded gene product is one that induces expression of the desired gene product by the cell (eg, the introduced genetic material contains a transcription factor that induces transcription of the gene product to be supplied to the subject. Code). In yet another embodiment, the recombinant gene can provide a heterologous protein (eg, not native to the cell in which the protein is expressed). For example, various human MHC components may be provided in non-human micro-organs that support transplantation in human recipients. Alternatively, the transgene inhibits the expression or action of a donor MHC gene product that is normally expressed in micro-organ explants.
[0107]
A nucleic acid molecule introduced into a cell is in a form suitable for expression in the cell of the gene product encoded by the nucleic acid. Thus, a nucleic acid molecule contains coding and regulatory sequences necessary for transcription of a gene (or part thereof), and when the gene product is a protein or peptide, the translation of the nucleic acid molecule is a promoter, enhancer and polyadenyl As well as sequences necessary for transport of the encoded protein or peptide, eg, an N-terminal signal sequence for transport or secretion of the protein or peptide to the surface of a cell.
[0108]
Nucleotide sequences that regulate expression of the gene product (eg, promoter and enhancer sequences) are selected based on the type of cell in which the gene product is to be expressed and the desired level of expression of the gene product. For example, a promoter known to confer cell type specific expression of a gene linked to the promoter may be used. A promoter specific for myoblast gene expression can be linked to the gene of interest to confer muscle-specific expression of the gene product. Muscle-specific regulatory elements known in the art include regions upstream of the dystrophin gene (Klamut et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9: 2396), regions upstream of the creatine kinase gene (Buskin and Hauschka, (1989). ) Mol. Cell Biol. 9: 2627) and the upstream region of the troponin gene (Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 6404), a negative in the keratin gene that mediates transcriptional repression. A response element (Jho Sh et al. (2001). J Biol Chem). Regulatory elements specific to other cell types are known in the art (eg, albumin enhancers for liver-specific expression; insulin regulatory elements for islet cell-specific expression; neurodystrophin, neuroenolase and A4 Various neuron-specific regulatory elements, including the amyloid promoter). Alternatively, regulatory elements that can direct constitutive expression of genes in a variety of different cell types, such as viral regulatory elements, may be used. Examples of viral promoters commonly used to drive gene expression include promoters from polyoma virus, adenovirus 2, cytomegalovirus and simian virus 40, and retroviral LTRs. Alternatively, a regulatory element that provides inducible expression of a gene linked thereto may be used. The use of inducible regulatory elements (eg, inducible promoters) allows for regulation of gene product production in the cell. Examples of potentially useful inducible regulatory systems for use in eukaryotic cells include the following: hormone regulatory elements (eg, Mader, S. and White, JH (1993) Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90: 5603-5607), synthetic ligand regulatory elements (see, eg, Spencer, DM et al., 1993) Science 262: 1019-1024), and Ionizing radiomodulatory elements (see, eg, Manome, Y. et al. (1993) Biochemistry 32: 10607-10613; Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153). Additional tissue specific or inducible regulatory systems may be developed and used in accordance with the present invention.
[0109]
There are a number of techniques known in the art for introducing genetic material into cells that can be applied to modify the cells of the present invention. In one embodiment, the nucleic acid is in the form of a naked nucleic acid molecule. In this situation, the nucleic acid molecule introduced into the cell to be modified consists only of the nucleic acid encoding the gene product and the necessary regulatory elements. Alternatively, the nucleic acid encoding the gene product (including the necessary regulatory elements) is contained within a plasmid vector. Examples of plasmid expression vectors include CDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman, et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). In another embodiment, the nucleic acid molecule introduced into the cell is contained within a viral vector. In this situation, the nucleic acid encoding the gene product is inserted into the viral genome (or partial viral genome). A regulatory element that directs the expression of the gene product may be contained within a nucleic acid inserted into the viral genome (ie, linked to a gene inserted into the viral genome) or provided by the viral genome itself. Also good.
[0110]
Naked nucleic acids may be introduced into cells using calcium phosphate mediated transfection, DEAE dextran mediated transfection, electroporation, liposome mediated transfection, direct injection, and receptor mediated uptake.
[0111]
Naked nucleic acid, such as DNA, may be introduced into the cell by forming a precipitate containing the nucleic acid and calcium phosphate. For example, HEPES buffered saline solution may be mixed with a solution containing calcium chloride and nucleic acid to form a precipitate, which is then incubated with the cells. A glycerol or dimethyl sulfoxide shock step can be added to increase the amount of nucleic acid taken up by a particular cell. CaPO ₄ Mediated transfection can be used to stably (or transiently) transfect cells and is only applicable to in vitro modification of cells. CaPO ₄ The protocol for mediated transfection is described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F .; M.M. (Eds.) Green Publishing Associates, (1989), Section 9.1, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Section 198-32. It can be found in Section 16.40, or other standard laboratory manuals.
[0112]
Naked nucleic acid may be introduced into cells by forming a mixture of nucleic acid and DEAE dextran and incubating the mixture with cells. A dimethyl sulfoxide or chloroquine shock step may be added to increase the amount of nucleic acid incorporation. DEAE dextran transfection is applicable only for in vitro modification of cells and can be used to temporarily introduce DNA into cells, but is preferred for generating stably transfected cells. Absent. Therefore, this method can be used for short-term production of gene products, but is not a selective method for long-term production of gene products. The protocol for DEAE dextran-mediated transfection is described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F .; M.M. (Eds.) Green Publishing Associates, (1989), Section 9.2, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Section 198-41. It can be found in Section 16.46, or other standard laboratory manuals.
[0113]
Naked nucleic acid can also be introduced into a cell by incubating the cell and nucleic acid together in a suitable buffer and subjecting the cell to a high voltage electrical pulse. The efficiency with which nucleic acids are introduced into cells by electroporation is affected by the strength of the applied electric field, the length of the electric pulse, the temperature, the composition and concentration of the DNA, and the ionic composition of the medium. Electroporation can be used to stably (or transiently) transfect a wide variety of cell types. The protocol for electroporating cells is described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F .; M.M. (Eds.) Green Publishing Associates (1989), Section 9.3, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), 16-1989. Can be found in sections or other standard laboratory manuals.
[0114]
Another method by which naked nucleic acid can be introduced into cells includes liposome-mediated transfection (lipofectin). The nucleic acid is mixed with a liposome suspension containing a cationic lipid. The DNA / liposome complex is then incubated with the cells. Liposome mediated transfection can be used to stably (or transiently) transfect cells in culture in vitro. The protocol is described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. et al. M.M. (Eds.) Green Publishing Associates, (1989), Section 9.4, and other standard laboratory manuals. Furthermore, gene delivery in vivo has been achieved using liposomes. See, for example, Nicolau et al. (1987) Meth. Enz. 149: 157-176; Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851-7855; Brigham et al. (1989) Am. J Med. Sci. 298: 278; and Gould-Fogerite et al. (1989) Gene 84: 429-438.
[0115]
Naked nucleic acid may also be introduced into the cell by injecting the nucleic acid directly into the cell. For in vitro culture of cells, DNA may be introduced by microinjection. Since each cell is individually microinjected, this approach is very labor intensive when modifying a large number of cells. However, the condition under which microinjection is the preferred method is in the production of transgenic animals (discussed in detail below). In this situation, DNA is stably introduced into fertilized oocytes, which are then developed into animals. The resulting animal contains cells carrying the DNA introduced into the oocyte. Direct injection has also been used to introduce naked DNA into cells in vivo (see, eg, Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818; Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468). ). A delivery device (eg, a “gene gun”) for injecting DNA into cells in vivo may be used. Such devices are commercially available (eg, from BioRad).
[0116]
Naked nucleic acid can be complexed with a cation such as polylysine that binds to a ligand for a cell surface receptor and can be taken up by receptor-mediated endocytosis (eg, Wu, G. and Wu, CH (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; and U.S. Patent No. 5,166,320). Binding of the nucleic acid ligand complex to the receptor facilitates DNA uptake by receptor-mediated endocytosis. Receptors targeted by the DNA ligand complex include transferrin receptor and asialoglycoprotein receptor. A DNA-ligand complex linked to an adenovirus capsid that naturally destroys the endosome, thereby releasing material into the cytoplasm, can be used to avoid degradation of this complex by intracellular lysosomes (e.g. Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850; Crisiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 2122-2126). Receptor-mediated DNA uptake can be used to introduce DNA into cells either in vitro or in vivo. And further, this receptor-mediated DNA uptake has the additional feature that DNA can be selectively targeted to specific cell types through the use of ligands that bind to receptors that are selectively expressed on the target cells of interest. Have.
[0117]
In general, when naked DNA is introduced into cells in culture (eg, by one of the transfection techniques described above), a small fraction of cells (approximately 10%). ⁵ A fraction) typically incorporates the transfected DNA into its genome (ie, this DNA is maintained as an episome in the cell). Therefore, in order to identify cells that have taken up exogenous DNA, it is advantageous to transfect cells with a nucleic acid encoding a selectable marker together with the nucleic acid of interest. Preferred selectable markers include markers that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate. The selectable marker may be introduced on the same plasmid as the gene of interest or may be introduced on a separate plasmid.
[0118]
A preferred approach for introducing a nucleic acid encoding a gene product into a cell is by use of a viral vector containing a nucleic acid encoding the gene product (eg, cDNA). Infection of cells with a viral vector has the advantage that a large proportion of cells receive the nucleic acid, thereby eliminating the need for selection of cells receiving the nucleic acid. In addition, molecules encoded within a viral vector, eg, cDNA contained within a viral vector, incorporate a viral vector nucleic acid and can be used in cells where the viral vector system can be used either in vitro or in vivo. Is expressed efficiently.
[0119]
Defective retroviruses are well characterized for use in gene transfer for gene therapy purposes (see Miller, AD (1990) Blood 76: 271 for a review). A retrovirus having a nucleic acid encoding a gene product of interest inserted into the retrovirus genome may be constructed. In addition, a portion of the retroviral genome may be removed to render this retrovirus defective. This replication defective retrovirus can then be packaged into virions and used to infect target cells through the use of helper viruses by standard techniques. Protocols for generating recombinant retroviruses and protocols for infecting cells in vitro or in vivo using such viruses are described in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F .; M.M. (Eds.) Green Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14, and other standard manuals. Examples of suitable retroviruses include pLJ, pZIP, pWE and pEM, which are well known to those skilled in the art. Examples of suitable packaging virus strains include ψCrip, ψ2 and ψAm. Retroviruses have been used to introduce various genes into many different cell types in vitro and / or in vivo, including epithelial cells, endothelial cells, lymphocytes, myoblasts, hepatocytes, bone marrow cells (Eg, Eglitis et al. (1985) Science 230: 1395-1398; Danosand Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141-6145; Feri et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89. 7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104-. U.S. Patent No. 4,868,116; U.S. Patent No. 4,980,286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/053. 5; and see PCT application WO92 / 07573). Retroviral vectors require target cell division in order for the retroviral genome (and foreign nucleic acid inserted therein) to integrate into the host genome and stably introduce nucleic acid into the cell. Therefore, it may be necessary to stimulate replication of target cells.
[0120]
The adenovirus genome can be engineered so that it encodes and expresses the gene product of interest but is inactivated with respect to its ability to replicate in the normal cytolytic virus life cycle. . See, for example, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155. Suitable adenoviral vectors derived from adenovirus strains Ad5 dl324 or other adenovirus strains (eg, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) are well known to those skilled in the art. Recombinant adenoviruses do not require cell division because they are effective gene delivery vehicles, and airway epithelium (cited earlier, Rosenfeld et al. (1992)), endothelial cells (Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 89: 6482-6486), hepatocytes (Herz, and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 2812-1816) and myocytes (Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad.Sci.USA 89: 2581-2584) can be used to infect a wide variety of cell types. In addition, the introduced adenoviral DNA (and foreign DNA containing it) is not integrated into the host cell genome, but leaves an episome, whereby the introduced DNA is transformed into the host genome (eg, retrovirus). Avoid potential problems that may arise as a result of insertional mutations in the context of integration into DNA). In addition, the ability of foreign DNA to carry the adenovirus genome is large (up to 8 kilobases) compared to other gene delivery vectors (previously cited Berkner et al .; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57: 267). Most replication-deficient adenoviral vectors currently in use lack all or part of the viral E1 and E3 genes, but retain as much as 80% of the adenoviral genetic material.
[0121]
Adeno-associated virus (AAV) is a naturally occurring defective virus that requires another virus, such as adenovirus or herpes virus, as a helper virus for efficient replication and propagation life cycle (for review, see , Muzyczka et al., Curr. Topics In Micro. And Immunol. (1992) 158: 97-129). This is also one of the few viruses that can integrate its DNA into non-dividing cells, showing a high frequency of stable integration (eg, Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell Mol.Biol.7: 349-356; See Samulski et al. (1989) J. Virol.63: 3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J. Virol.62: 1963-1973). Vectors containing as little as 300 base pairs of AAV can be packaged and can be integrated. Space for endogenous DNA is limited to about 4.5 kb. Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 can be used to introduce DNA into cells. Various nucleic acids were introduced into different cell types using AAV vectors (see, eg, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. CellBiol. 4: Wondoford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619; and Flotte et al. (1993) J. Biol.Chem.268: 3781. 3790).
[0122]
The efficiency of particular expression vector systems and methods for introducing nucleic acids into cells can be assessed by standard approaches routinely used in the art. For example, DNA introduced into cells can be determined by filter hybridization techniques (eg, Southern blotting). The RNA produced by transcription of the introduced DNA can be detected by, for example, Northern blotting, RNase protection or reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The gene product can be obtained by a suitable assay, for example by immunological detection of the protein produced, for example using a specific antibody, or a functional assay for detecting the functional activity of the gene product, for example It can be detected by enzyme assay. If the gene product of interest to be expressed by the cell cannot be easily assayed, the expression system can be first optimized using the regulatory elements to be used and the reporter gene linked to the vector. This reporter gene encodes a gene product that is readily detectable and can therefore be used to assess the effectiveness of the system. Standard reporter genes used in the art include genes encoding β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, luciferase, GFP / EGFP and human growth hormone.
[0123]
If the method used to introduce the nucleic acid into a population of cells results in the modification of the majority of the cell and efficient expression of the gene product by this cell (eg, as is often the case with viral expression vectors) ), A modified population of cells can be used without further isolation or subcloning of individual cells within this population. That is, there may be sufficient production of the gene product by the population of cells so that no further cell isolation is required. Alternatively, it may be desirable to grow a uniform population of identically modified cells from a single modified cell to isolate cells that efficiently express this gene product. Such a uniform population of cells can be isolated by isolating single cells that have been modified by limiting dilution cloning, and subsequently expanded into a clonal population of cells in culture by standard techniques. Can be prepared.
[0124]
As used herein, the phrase “transgenic cell” refers to a cell that is partially or completely heterologous, ie a cell into which foreign nucleic acid sequences have been inserted or introduced. . A transgenic cell may also be a cell into which is inserted a nucleic acid that is homologous to the endogenous gene of the cell. In this case, however, the homologous nucleic acid is designed or inserted to be inserted into the genome of the cell in such a way as to alter the genome of the cell into which it is inserted. For example, a homologous nucleic acid is inserted at a location different from that of the natural gene, or the insertion of a homologous nucleic acid results in a knockout of a particular phenotype. The nucleic acid inserted into the cell may include one or more transcriptional regulatory sequences and any other nucleic acid such as an intron that may be necessary for optimal expression of the selected nucleic acid.
[0125]
In yet another aspect of the invention, subject micro-organ cultures can be used to assist in the diagnosis and treatment of malignancies and diseases. For example, a biopsy of an organ (eg, skin, kidney, liver, etc.) may be taken from a patient suspected of having a hyperproliferative disorder or a neoproliferative disorder. When a biopsy explant is cultured by the method of the present invention, the proliferating cells of the explant are clonal cultured during culture. This increases the chances of detecting such a failure and thus increases the accuracy of the diagnosis. In addition, the patient's micro-organ cultures are used in vitro to screen for cytotoxic and / or pharmaceutical compounds and kill the most effective compounds (ie, malignant or diseased cells but normal) Compounds that do not harm cells) can be identified. These agents can be used for therapeutic treatment of patients.
[0126]
Further aspects of the invention relate to methods of using the microorgan cultures of the invention to screen a wide variety of compounds, such as cytotoxic compound growth factors / regulators, pharmaceutical agents, and the like. For example, the need for thorough testing of potentially toxic compounds is generally recognized and a sensitive and reproducible short-term for the evaluation of drugs, cosmetics, food additives and pesticides. There is a clear need to develop in vitro assays. The micro-organ cultures described herein allow the use of tissue equivalents as assay substrates and provide the advantage of normal cell interactions in a system that closely mimics the in vivo state.
[0127]
To accomplish this goal, the culture is maintained in vitro and exposed to the compound to be tested. The activity of a cytotoxic compound can be measured by its ability to modulate the cell phenotype (including killing) in the explant. This can be easily assessed by vital staining techniques, marker expression, and the like. For example, the effects of growth factors / regulators can be assessed by analyzing the cell content of the culture, for example, by total cell count and different cell counts. This can be accomplished using standard cytological and / or histological techniques, including the use of immune cell technology using antibodies that define type-specific cellular antigens. The effect of various drugs on normal cells cultured in the system of the present invention can be evaluated. For example, drugs that reduce the growth of psoriatic tissue can be identified.
[0128]
In an exemplary embodiment of the method of the present invention, the method induced to detect a factor that stimulates cell growth in the explant comprises the step of isolating the tissue explant from the subject. . Here, the explant cell population retains the microstructure of the organ or tissue from which the explant was isolated, eg, the explant is at least about 1.5 mm. ^-1 And at least one cell having the ability to proliferate. This explant may be cultured and contacted with the candidate compound. The level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is then measured and compared to the level of cell proliferation in the absence of the candidate compound. A substantially significant increase in the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is an indication of cell growth factor.
[0129]
As used herein, the phrase “candidate compound” or “candidate factor” refers to a factor to be tested or to be tested for proliferative activity, antiproliferative activity, differentiation activity, anti-differentiation activity, or antiviral activity. Say. Such factors may be, for example, small organic molecules, biological extracts, and recombinant products or compositions.
[0130]
Methods for measuring cell proliferation are well known in the art and involve, in common, determining the DNA synthesis characteristics of cell replication. There are many methods in the art for measuring DNA synthesis, any of which can be used according to the present invention. In one embodiment of the invention, DNA synthesis is performed using a radioactive label (for detection by immunofluorescence ( ³ H thymidine) or labeled nucleotide analogs (BrdU).
[0131]
Yet another embodiment provides a method for identifying inhibitors of cell proliferation. The method includes providing a tissue explant as described above, contacting the explant with a candidate compound, and measuring the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound. A substantially significant decrease in the level of cell proliferation in the presence of the candidate compound is indicative of an inhibitor of cell proliferation.
[0132]
In an exemplary embodiment, both cell growth enhancing factors and inhibitors (also referred to herein as anti-proliferative factors) are used, for example, to control hair growth depending on the desired effect. Can be used.
[0133]
Growth of hard keratin fibers such as wool and hair (hair) depends on the proliferation of dermal sheath cells. Sheath follicular stem cells are highly active and produce hair (hair) fibers through rapid proliferation and complex differentiation. The hair (hair) cycle includes three distinct phases: the growth phase (growing), the regression phase (regressing), and the resting phase (resting). Hair follicle epidermal stem cells are activated by the dermal papilla during the late resting phase. This is termed “hair bulge activation”. Furthermore, such stem cells are considered to be pluripotent stem cells and not only produce hair (hair) and hair follicle structures, but also sebaceous glands and epidermis. Cell growth factors and inhibitors of cell growth provide a means of altering the dynamics of the hair (hair) growth cycle, such as inducing the quiescent state of hair follicle cells, particularly hair follicle stem cells.
[0134]
Inhibitors of hair follicle cell proliferation can be used as a means of reducing human hair (hair) growth relative to conventional removal of human hair (hair) by cutting, shaving or hair removal. For example, inhibitors of hair follicle cells identified using the methods of the present invention can be used in the treatment of hair diseases characterized by abnormally rapid or dense growth of hair (hair), such as hirsutism. In an exemplary embodiment, such inhibitors can be used to manage hirsutism, a disorder characterized by abnormal hair depth. The use of such inhibitors can also provide a process for extending the duration of hair loss.
[0135]
Inhibitors of hair follicle cell proliferation can also be used to protect hair follicle cells from cytotoxic factors that require progression to the S phase of the cell cycle for efficacy, such as radiation-induced death. Treatment with such inhibitors can be performed, for example, by inhibiting cells from entering S phase, by making hair follicle cells quiescent, and thereby making hair follicle cells mitotic catastrophes or programs. Provides protection by preventing from undergoing cell death. For example, inhibitors of hair follicle cell proliferation can be used in patients undergoing chemotherapy or radiation therapy, usually resulting in hair (hair) loss. By inhibiting cell cycle progression during such therapy, treatment with an inhibitor can protect hair follicle cells from death (otherwise resulting from activation of the cell death program). After treatment is complete, the inhibitor treatment can also be removed with relief of inhibition of hair follicle cell proliferation.
[0136]
However, to begin characterizing the molecular mechanisms underlying hair growth management and to test potential hair-influenced drugs, an in vitro model for proper hair growth is required. In one aspect of the present invention, the method of the present invention is used to interact with the microstructure of the hair follicle, for example, the interaction between the follicular epithelial layer of the hair follicle and the interstitial component (skin papillae), such as one or more. Hair follicle micro-organ explants that retain stem cells, outer root sheath cells, matrix cells and inner root sheath cells. As demonstrated in the accompanying examples, hair growth can be observed in these micro-organ cultures even without serum, for example, even in minimal medium. Significantly, the present invention also provides hair follicle cultures that provide, for example, hair follicles that are quiescent and in quiescence. As demonstrated below, quiescent hair follicle explants can be activated into proliferating hair follicles in in vitro cultures and in a synchronized manner in certain embodiments. Early transient proliferation of epidermal stem cells of hair follicles is used to understand developmental activation generated by various tissues of the hair follicle organ, eg mediated by paracrine and / or autocrine factors Offer unique opportunities.
[0137]
Furthermore, the micro-organ culture of the present invention is a system for identifying factors that modulate hair follicle activation or inactivation, for example, to identify factors that can promote or inhibit hair (hair) growth. Supply. In one embodiment, a resting (resting) hair follicle explant as described in Example XVIII below is contacted with various test factors and the level of hair follicle stimulation is detected. The For example, the transition of hair follicle stem cells from resting phase to developmental phase can be monitored by observing the mitotic index of the cells of the hair follicle or by some other similar method of detecting proliferation. To illustrate, FIG. 17 shows that thymidine incorporation can be used to measure the relative level of stem cell activation of this explant in the presence or absence of a test compound (FGF in this figure). Here, the proliferation index of the test factor having hair growth promoting activity is increasing.
[0138]
In a reverse assay, a developing micro-organ transplant can be transformed into, for example, an activated Sencar explant as described in the appended examples, or a growth factor-stimulated explant (eg, an FGF-stimulated explant). ). Test factors that inhibit hair follicle stem cell proliferation may be further considered for use as, for example, quiescent factors that prevent hair (hair) growth as compared to untreated explants.
[0139]
In still other embodiments, inhibitors of cell proliferation identified by the assays of the invention can be used to inhibit neoplastic or hyperplastic cell proliferation, such as tumor formation and proliferation. Preferred embodiments of the invention relate to inhibition of epithelial tumor formation and growth. For a detailed description of skin epithelial tumor formation, see US patent application Ser. No. 08 / 385,185, filed Feb. 7, 1995. Tumor formation occurs as a result of altered control of cell proliferation and damage in the interaction between cells and their surroundings, resulting in invasion and metastasis. Disruption of the relationship between the increase in cell number resulting from cell division and loss from the cell cycle due to differentiation or cell death results in impaired control of cell proliferation. In normal tissue, homeostasis by ensuring that when each stem cell divides only one of the remaining two daughter cells in the stem cell compartment, the other is directed to the pathway of differentiation. (Cairns, J. (1975) Nature 255: 197-200). Thus, control of cell proliferation is the result of signals that affect these processes. These signals may be positive or negative, and the acquisition of tumorigenicity results from genetic changes that affect these control points.
[0140]
As described in Example IX and illustrated in FIG. 12, the skin micro-organ culture of the present invention has been used to identify cell growth factors and inhibitors of cell growth. As described in Example IX, TGF-β was tested and found to act as an inhibitor of cell proliferation. Activin, a protein that is a member of the TGF-β superfamily, has also been shown to inhibit epidermal cell proliferation. These results indicate that there may be other members of the TGF-β family that play a role in inhibiting epithelial cell proliferation. This data suggests a role for proteins in the TGF-β family as important regulators of epidermal homeostasis and in inhibiting epithelial tumorigenesis and growth in vivo.
[0141]
Another aspect of the invention relates to a method for identifying cell differentiation factors, ie compounds that cause cell differentiation. The method includes the step of isolating a population of cells from a subject, wherein the population of cells comprises an organ or tissue microstructure from which the cells are isolated, at least about 1.5 mm. ^-1 And has at least one cell with the ability to differentiate. The cells are then placed in culture for at least about 24 hours to contact the candidate compound. The level of cell differentiation in the presence of this candidate compound is then measured and compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. A substantially significant increase in the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is indicative of a cell differentiation factor. As used herein, differentiation refers to a cell that is different from and / or in addition to the morphology and / or function originally possessed by the cell. Typically, these forms and functions are characteristic of mature cells. Differentiation of a population of cells of the invention can be monitored by measuring the production and / or secretion of specialized cell products.
[0142]
In a similar manner, the present invention also relates to a method for identifying inhibitors of cell differentiation. Following the same protocol as above, the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is measured and compared to the level of cell differentiation in the absence of the candidate compound. A substantially significant decrease in the level of cell differentiation in the presence of the candidate compound is indicative of an inhibitor of cell differentiation.
[0143]
In yet another embodiment, the culture of the present invention allows the generation of an in vitro model of viral infection. For example, the epidermis or squamous epithelial tissue can be isolated to obtain a herpes virus, such as herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2; varicella virus; Or you may infect using viruses, such as HPV-8. Similarly, liver models can be provided for explants infected with a liver infection, eg, hepatitis virus, eg, hepatitis A virus, hepatitis B virus, or hepatitis C virus. Viral-infected tissue explants can be used to identify viral infectious inhibitors by the methods of the present invention. As described above, specific micro-organ cultures are provided and contacted (if necessary) with a virus that infects the cells to produce a population of virus-infected cells. The virus-infected cell is then contacted with a candidate compound and the level of viral infectivity in the presence of the candidate compound is measured. The measured level of viral infectivity in the presence of the candidate compound is then compared to the level of viral infectivity in the absence of the candidate compound. A substantially significant reduction in the level of viral infectivity in the presence of the candidate compound is indicative of an inhibitor of viral infectivity.
[0144]
Methods for measuring viral infectivity are known in the art and will vary depending on the type of virus used. For example, one of the methods that can be used to measure the level of infectivity of a virus is the specific virus being tested in the infected cells of the micro-organ culture or in the culture medium of the micro-organ culture. By measuring the level of gene product production specific for For example, hepatitis virus protein production and hepatitis virus DNA may be quantified to determine the level of infectivity of cellular hepatitis viruses, such as hepatitis B virus, in microorgan cultures. In general, micro-organ cultures can be incubated with antibodies to selected viral proteins and immunoreactive proteins that are analyzed by various methods known in the art, eg, on SDS-polyacrylamide gels, ELISAs. Good. For example, to measure the production of hepatitis B surface antigen, a micro-organ culture medium derived from micro-organs pre-incubated with hepatitis B virus is sampled daily and the ELISA (Abbott) method described by the manufacturer May be assayed for surface antigens. This method can be modified for quantification using serially diluted standard surface antigens (CalBiochem). A substantially significant decrease in the accumulation of hepatitis B surface antigen in the culture medium indicates that the tested candidate compound is an inhibitor of hepatitis virus infectivity.
[0145]
In addition to measuring the level of HBsAg in the micro-organ culture medium, newly synthesized hepatitis B virus DNA from cell extracts derived from micro-organ cultures was obtained by PCR amplification of DNA followed by HBS as a probe. Can be detected and quantified by Southern blot analysis using labeled primer pairs in the pre-S (HBsAg coding) region (eg, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Laboratory, 2nd edition, volume 2. See pp 10.14-10.15). Relative quantification can be obtained by densitometry and confirmed by scintillation counting of the corresponding bands. A decrease in the level of newly synthesized viral DNA indicates that the candidate compound tested is an inhibitor of hepatitis virus infectivity.
[0146]
In another example, the gag, pol and env protein products of retroviruses such as human immunodeficiency virus (HIV) can also be measured using the above and other standard techniques known in the art. For example, pol protein expression in cells of micro-organ cultures infected with HIV can be measured by incubating cell extracts with anti-pol antibodies or pooled AIDS patient sera and immunoreactive proteins in SDS. / Can be analyzed on polyacrylamide gels. In order to measure the infectivity of herpesviruses, such as Epstein / Barr virus (EBV), in the micro-organ cultures of the present invention, EBV DNA and EBV-induced nuclear antigen production are performed as described Can be used for analysis.
[0147]
The micro-organ cultures of the present invention can also be used to promote wound healing in a subject. Accordingly, the present invention further relates to a method for promoting wound healing in a recipient subject. This method has a surface area to volume index of at least about 1.5 mm. ^-1 Isolating a population of cells from a donor subject. Typically, the population of cells is in culture for at least about 24 hours. The population of cells can then be applied to the wound of the recipient subject. In one embodiment, the wound or lesion is a slow healing or chronic, eg, diabetes related wound, eg, burn, eg, ulcer. As demonstrated in Examples X and XI, the skin micro-organ cultures of the present invention may be used as micro-explants to be applied to chronic wounds (Example X) and hair (hair) ) Can be grown (Example XI).
[0148]
In yet another embodiment, the micro-organ explants of the invention are provided in an assay to test for cytotoxicity or irritancy. In an exemplary embodiment, the methods of the invention provide a technique for in vitro testing of eye or skin irritants. This process is exactly as described above and involves the topical application of a liquid, solid granule or gel-like material (eg, cosmetics) to the microorgan culture of the present invention, followed by detection of the effect produced in this culture. To do.
[0149]
Currently, the potential eye and skin irritation of many chemicals, household cleaning products, cosmetics, paints and other substances is evaluated through direct application to animal and human subjects. However, as appreciated in most industries, such an approach does not receive much public support. The method of the present invention provides another assay that does not require animal sacrifice or permanent body damage, and provides data in an objective manner. In an exemplary embodiment, a skin micro-organ culture is induced according to the present invention. Cultured explants are contacted with a test agent, such as a cosmetic product, and cell viability is assessed at the same time after exposure. In a preferred embodiment, the MTT assay (based on functional mitochondrial tetrazolium dye reduction) is used to score for viability.
[0150]
The micro-organ cultures of the present application can further be used for: including nutritional changes and the presence of potential virulence factors to identify factors involved in normal homeostasis of tissues and cells To study the effects of changes in the cellular environment on tissue and normal homeostasis of the cell, to study the pathogenesis or initiation of trauma and the pathway of changes in tissues and cells induced during that time; related to pathogenesis or trauma To identify repair mechanisms that reverse adverse effects in the altered environment; developmental regulation of cells that differentiate during normal homeostasis of tissues and development of specialized structures within tissues (eg, hair follicles) To study modulation; and occurs in patients with chronic skin ulcers with healing failure caused by inadequate blood supply Organs where the local skin cannot heal as in conditions known as type I or type II diabetes, small pieces of individual organs remain but insufficient to repair or regenerate damaged tissue For replenishment.
[0151]
(Example)
Although the present invention has been generally described herein, it will be more readily understood with reference to the following examples, which are merely illustrative of certain aspects and embodiments of the present invention. And is not intended to limit the invention.
[0152]
Micro-organ cultures from animals including adult human skin, mouse, guinea pig and rat skin were isolated and grown in culture for 21 days. However, maintaining the culture for a period exceeding 21 days is within the scope of the present invention.
[0153]
Furthermore, it is within the scope of the present invention to form microorgan cultures from a wide range of animals. This animal range is merely exemplary and is not limited to the samples provided below.
[0154]
Micro-organ cultures were prepared from skin and from organs including mammalian pancreas, liver, kidney, duodenum, esophagus and bladder as described in the accompanying examples. Similarly, microorgan cultures of mammalian cornea, kidney, breast tissue, and esophagus plus various intestinal tissues such as epithelium from the intestine and colon can also be prepared using the methods of the invention. May be. Indeed, it is within the scope of the present invention to isolate and maintain micro-organ cultures from any site containing epithelial / stromal structures within the body.
[0155]
Notwithstanding the above, using the microorgan culture techniques of the present invention, in long-term cultures from explants of epithelial / stromal structures such as certain lymphoid tissues such as thymus and spleen Preserving tissue explants.
[Example 1]
[0156]
(Preparation of micro-organ culture of epithelium)
Fresh skin is obtained after surgery, the underlying adipose tissue is removed and cut into 0.4 × 5 cm flaps, which are then subjected to sterile conditions using a tissue chopper or other suitable cutting method. And cut across a 300 μm section, so that the final tissue segment had dimensions of 4 mm width and 0.3 mm thickness (see FIG. 1). These micro-organs were shaken continuously at 12 rpm for 1-8 days with 5% CO ₂ Placed in a 24-well microplate containing 400 μl of DMEM without serum at 37 ° C. Twenty microexplants were grown per well.
[Example 2]
[0157]
(Measurement of proliferation of mouse, guinea pig and human epidermal micro-organ cultures)
Microorgan cultures were prepared according to Example I, and cell proliferation was measured by analyzing the amount of DNA synthesis as follows. Mouse skin and guinea pig skin were grown for 2 days and human skin was grown for 4 days, after which BrdU was added to the medium to a final concentration of 100 μM for 3 hours, after which the cells were fixed in 4% formamide. After fixation, the cultures were stained with goat anti-BrdU antibody followed by anti-goat FICT labeled IgG. The histological preparation was then embedded in 4% formamide fixation, cut into 3 μm sections and stained with methylene blue.
[0158]
The fraction of cells that synthesize DNA in vitro increased to 10-fold after 2-4 days in culture compared to the values observed in vivo, after which the rate of DNA synthesis gradually decreased, It was found that it remained high until day (see Figures 2, 3, and 4A-4D). Even on day 6 in culture, the cells maintained steady growth and differentiation, resulting in preservation of the tissue structure (FIGS. 5A-5C).
[Example 3]
[0159]
(Cell proliferation in micro-organ cultures of various sizes)
Guinea pig micro-organs were prepared as in Example I. 4 mm wide full thickness skin strips were cut into various thickness explants. This includes sections with thicknesses of 300, 450, 600, 700, 900, 1200 and 3000 μm. These slices were placed individually in wells containing medium without serum for 2 days. BrdU was added for 4 hours prior to termination at a final concentration of 100 μM. The explants were then fixed in 4% formamide and stained with a goat antibody against BrdU followed by an anti-goat IgG FITC labeled secondary antibody preparation. The results of this experiment are illustrated in FIG. The amount of BrdU incorporation as a function of the number of cells / unit tissue decreased significantly with increasing explant thickness.
[Example 4]
[0160]
(Preparation of pancreatic micro-organ culture and measurement of cell proliferation)
Guinea pig pancreas were removed and then cut into sections of 300 μm thickness, 4 mm width and 2 mm depth in a manner that preserved the pancreatic microstructure using an appropriate tissue chopper. The microexplants were grown in culture for several hours ranging from 2 to 18 days. 7 micro-organs with 5% CO2 with constant shaking at 12 rpm ₂ Each was placed in a 96-well plate containing 150 μl of DMEM without serum at 37 ° C. BrdU was added 3 hours prior to termination at a final concentration of 100 μM, then the explants were fixed in 4% formamide and stained with a goat antibody to BrdU followed by anti-goat FITC labeled IgG. 7A-7B illustrate that cells were actively proliferating in pancreatic-derived micro-organs.
[Example 5]
[0161]
(Preparation of pancreatic micro-organ culture and measurement of insulin secretion into this culture medium)
Adult porcine pancreatic micro-organ cultures were prepared as in previous examples for skin. The pancreas was removed, cut with scissors into a thickness of approximately 2 mm, and cut into 300 μm thick sections having a width of 4 mm. The microculture was grown for 14 days in serum-free medium. The medium was removed every two days and fresh medium was added. Media collected for insulin content was assayed using standard radioimmunoassay methods.
[Example 6]
[0162]
(Transplantation of porcine pancreatic micro-organs to heterologous subjects)
Adult porcine pancreatic micro-organ cultures were prepared as in previous examples for skin. The pancreas was removed, cut with scissors into a thickness of approximately 2 mm, and cut into 300 μm thick sections having a width of 4 mm. The microculture was grown in serum-free medium for various periods of 0-5 days, after which the pancreatic micro-organs were removed from the culture and transplanted into both the viscera and body wall mesoderm of the rat host. . The micro-organ survived for at least 1 month in vivo and was fully vascularized. Excess cell proliferation can be detected after 3, 5, 7, and 14 days in vivo. In addition, positive insulin staining was observed in vivo at 4, 7, and 30 days after transplantation.
[Example 7]
[0163]
(Preparation of micro-organ cultures of liver, kidney, duodenum, esophagus and bladder, and measurement of cell proliferation in these micro-organ cultures)
Organ-derived guinea pig micro-organ cultures containing several epithelial tissues were prepared as in previous examples for skin. The organ was removed and cut into pieces of approximately 2 mm width and 3 mm length using scissors and cut into sections having a thickness of 300 μm. The microculture was incubated in serum free medium for 3 days, 4 days and 6 days. 12 hours before the end of the experiment, ³ H thymidine was added to the explant cultures. At the end, the tissue was fixed, rinsed several times and counted in a scintillation counter. The results of this experiment are illustrated in FIG. As shown in Figure 9, all organizations ³ It showed active growth lasting 6 days as determined by H thymidine incorporation.
[Example 8]
[0164]
(Proliferation of hair follicles in micro-organ cultures)
Skin micro-organ cultures were prepared according to Example I and incubated for 2 days. BrdU was added 3 hours before the end of incubation. Cells were fixed in 4% formamide and stained with goat anti-BrdU antibody followed by anti-goat FITC labeled IgG. Intact hair follicles that existed in their normal environment in vivo could be maintained under precisely controlled culture conditions without the need to add serum or any other endogenous factor. Hair follicle cells in these micro-organs were found to proliferate actively for several days under the conditions of the method of the present invention, as shown by the large number of hair follicle cells that incorporated BrdU (FIGS. 10A-10C). ). The hair shaft size distribution at

time

0 and 2 weeks after the micro-organ guinea pig culture is shown in FIG. The medium was changed every 2 days. The hair shaft sizes were arbitrarily classified as small, medium and large. After 9 days in culture, in the size distribution, the proportion of small hair (hair) decreases to 64% to 28%, but the large hair shaft that did not exist at the start of the culture is a population of hair shafts. There was a clear shift accounting for 30% of the total.
[Example 9]
[0165]
(Preparation of assay to measure the effect of candidate compounds on cell proliferation)
Cultures were prepared and maintained in defined media under growth conditions similar to those described in Example I. Control samples were analyzed by immunocytochemistry to confirm that micro-organ cultures were maintained in a manner similar to that generated in vivo.
[0166]
Replicated samples of skin microcultures were treated with TGF-β at 2.5 ng / ml. Quantitative analysis of the number of BrdU labeled cells / explants was performed according to Example II. Compared to control, greater than 90% inhibition of DNA synthesis was observed in the presence of TGF-β (FIG. 12).
[Example 10]
[0167]
(How to promote healing of chronic non-healing skin ulcers)
According to this method, a small area of skin graft that is not normally involved is removed from the patient and a full-thickness microexplant 4 mm wide and 0.3 mm thick is prepared as described in Example I. However, this preparation was intentionally incompletely fragmented into 0.3 mm sections so that a series of sections were retained with the upper epidermal layer containing the stratum corneum as shown in FIG. This is different from Example I. This implant design allows nutrients to reach all cells, but is oriented to maintain tissue slices in an operable manner. The patient's wound is cleaned and the surrounding skin ends are removed. The area lacking the skin is then carefully covered by the microexplant, so that it is placed on the wound so that the uncut ends face outward and the opposite cut pieces are in the wound. Suspended in the liquid. Sufficient microexplants are prepared to substantially cover the wound area. The treated area is then covered with a suitable dressing and allowed to heal.
Example 11
[0168]
(Proliferation of hair follicles in vivo)
An in vivo animal experiment was performed, where 1 cm of skin was left so that the stratum corneum of the entire skin area remained intact as described above. ² Were removed from the mouse and incompletely cut out for microscopy. The micro-organ was reimplanted into its original position in the mouse, stitched and allowed to heal. The implant remained viable, incorporated into animal tissue, and new hair shafts grew from the implant after 1-2 weeks in culture (see FIG. 14).
Example 12
[0169]
(Human psoriasis skin micro-organ culture)
Interstitial psoriatic skin from an 82 year old patient was obtained using a dermatome after autopsy. The skin was then cut into 0.5 × 5 cm flaps, which were then cut across 300 μm sections using a tissue chopper or other suitable cutting device. These micro-organ sections were placed in 5% CO2 with constant shaking. ₂ Placed in a microplate containing serum-free DMEM at 37 ° C. for 1-14 days. In some cases, growth factors were placed in the culture medium. The medium was changed every 2 days. Human psoriatic skin has grown extensively as a micro-organ culture.
Example 13
[0170]
(Liver micro-organ culture infected with hepatitis virus)
Human, rat, mouse and guinea pig livers were excised and cultured as micro-organ cultures as described in Example VII. Active proliferation in these micro-organ cultures was detected using BrdU incorporation as described herein. Hepatocytes in these micro-organ cultures are confirmed to be functional after at least 14 days in culture, as measured by urea assay (Sigma Chemical, urea detection kit) and albumin production (ELISA). It was.
[0171]
Human liver micro-organ cultures prepared as described above were incubated with serum from patients positive for hepatitis B virus and hepatitis C virus. After 24 hours, the medium was removed and fresh DMEM with or without 10% normal fetal calf serum (FCS) was added. Every two days, the culture medium was replaced with fresh and conditioned medium that was tested for virus particles using antibodies against the viral protein HBs. A significant increase in the number of virus particles was detected after 4 days in micro-organ cultures cultured in the presence of FCS.
Example 14
[0172]
(Thymus and spleen micro-organ cultures)
Mouse and rat micro-organ cultures from thymus and spleen were prepared essentially as in the previous examples for skin. The organ was removed and cut with scissors to a width of approximately 2 mm and a length of 3 mm. These samples were then sliced into approximately 300 μm thick explants in a manner that preserved the intrinsic microstructure of the organ using a suitable tissue chopper. The micro-organs were then incubated in serum-free medium for 1, 3, 5 and 10 days. Active proliferation in these micro-organ cultures was detected using BrdU incorporation as described herein.
Example 15
[0173]
(Bone marrow micro-organ culture)
Microorgan cultures were prepared from bone marrow by carefully removing intact bone marrow from rat and mouse femurs. Since the bone marrow diameter in such explants is only about 1-2 mm, the bone marrow was directly sliced into micro-organ explants having a thickness of 300 μm using a tissue chopper. This method ensured that the bone marrow microstructure was preserved, but at the same time retained a surface / volume index that was susceptible to long-term culture. Microorgans were incubated for 3 days in serum-free medium. Active proliferation of bone marrow cells in these micro-organ cultures was detected using BrdU incorporation as described herein.
Example 16
[0174]
(Delivery of gene products to skin micro-organ cultures)
The high surface area to volume ratio inherent in the micro-organ cultures of the present invention allows easy access to tissues for various gene transfer techniques. In this example, micro-organ cultures are transfected with foreign genes using electroporation and lipofectin. The micro-organ culture can be implanted into an animal and survive in vivo for at least about 30 days to become vascularized. This demonstrates the feasibility of using tissue MC cultures in ex vivo gene therapy protocols. A further advantage of MC cultures is that MC cultures can be transplanted into a defined location on the body so that they can be easily removed in the future if necessary. This is in contrast to transplanting cell suspensions into the body, where cells can migrate or can be “lost” in normal tissue.
[0175]
Guinea pig skin was dissected and sliced into sections having a width of 2 mm and a thickness of 300 μm. Skin was cultured as micro-organs in serum-free Dulbecco's minimal basic medium with penicillin and streptomycin at the manufacturer's recommended concentrations. 37 ° C and 5% CO ₂ After 1 day in culture, skin micro-organ cultures were rinsed with DMEM without antibiotics and added to a 0.4 cm gap disposable electroporation cuvette with 500 μl medium on ice.
[0176]
10 μg of plasmid DNA containing the indicated reporter gene was added as indicated (each plasmid had a cytomegalovirus promoter driving expression of either β-galactosidase (control) or luciferase reporter gene) ). The luciferase plasmid backbone was pRC-CMV (Invitrogen) fused in-frame with the firefly luciferase gene.
[0177]
The sample was electroporated at 220 mV and with the capacitance varied as shown in FIG. 15 (Hi = 900 μF, medium = 500 μF, low = 250 μF). NIH3T3 cells were treated with a Bio-Rad electroporation device at 250 μF. This sample was then further incubated in 24-well culture plates for 2 days with DMEM containing 10% fetal calf serum, penicillin, streptomycin and glutamic acid. The medium was removed and the sample was suspended in about 700 μl of cell culture lysate (Promega). Tissue sections were homogenized, then 20 μl was added to 100 μl luciferase assay reagent (Promega) and luciferase was detected in triplicate using a Packard TopCount. As a positive control, NIH3T3 cells from a 75 cm culture flask were trypsinized and treated the same as the microorgan culture. As illustrated in FIG. 15, significant luciferase activity was detected at medium (500 μF) and low (250 μF) capacitance settings. For comparison, a similar amount of NIH3T3 immortal cultured cells was electroporated with the same plasmid at 250 μF.
[0178]
In another experiment, transfection of micro-organ transplants was achieved by lipofection, which was observed to be more efficient than electroporation. Specifically, guinea pig skin, neonatal mouse skin, and rat lung derived micro-organ cultures were transfected with a plasmid containing a luciferase reporter. In short, 5.5% CO in DMEN with 1% penicillin / streptomycin and 1% L glutamine. ₂ At 37 ° C., microorgan cultures were grown for 1 day prior to transfection. Explants were plated on 24-well plates containing 20 explants per well and containing 400 μl medium. For transfection, micro-organ cultures were rinsed twice with Optimem and 10 μl Lipofectin (Gibco BRL) +2 μg DNA + Optimem was added to each well to make a final volume of 500 μl. The Optimem / Lipofectin / DNA solution was made according to the instructions of the Lipofectin manufacturer. The culture is then treated with 5.5% CO2. ₂ Incubated at 37 ° C for 5-6 hours. The Optimem / Lipofectin / DNA medium was then replaced with 400 μl DMEN containing 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamine and 10% FCS, and the culture was replaced with 5.5% CO2. ₂ Incubated overnight at 37 ° C. The next morning, the micro-organ cultures were removed, washed twice with 1 × PBS, and ground in 750 μl of 1 × cell culture lysis buffer (Promega) in a manual glass tissue grinder. Luciferase activity from the transgene was detected using Luciferase Assay System (Promega) and the results are reported in FIG.
[Example 17]
[0179]
(Delivery of gene products to micro-organ cultures)
Lungs and thymus from 8 week old female Lewis rats are dissected and processed for micro-organs and cultured as described in Example XV. Micro-organ cultures were placed in culture wells and transfected with plasmid DNA complexes encoding cationic lipid / luciferase for 5-6 hours with incubation at 37 ° C. The cationic lipid / plasmid DNA solution was aspirated and the culture was then incubated for 2 days in medium supplemented with 10% serum and then assayed for luciferase reporter gene expression (expressed in arbitrary light intensity). The results of this experiment are illustrated in FIG. As demonstrated in FIG. 16, the lung (but not the thymus) expresses the luciferase gene transfected under these conditions. As expected, lung micro-organ cultures transfected with negative control β-galactosidase (10 μl cationic lipid concentration) were close to mechanical background for light production (23 light intensity).
Example 18
[0180]
Hair shaft growth in vitro
Neonatal mouse skin is obtained post-surgery, excluding the underlying adipose tissue and cut into 0.4 × 5 cm flaps, which are then cut into 300 μm using a tissue chopper or other suitable cutting device. Cut across the section. The micro-organ is shaken constantly with 5% CO ₂ Placed in a microplate containing serum-free DMEM at 37 ° C. for 1-14 days. Certain micro-organ explants were contacted with growth factors, such as FGF, added in the culture medium. The medium was changed every 2 days.
[0181]
When new born “hairless” skin is introduced and grown in MC culture, hair shafts can be produced. In this explant, which was not present at the start of the culture period, as shown by a micrograph of skin from a 30 hour old mouse grown in microorgan cultures for 3 days in the presence of 1 ng / ml EGF Hair shaft development was shown.
[0182]
In another set of experiments, telogen hair follicle activation was observed. Sencar mice provide a useful model for studying hair follicle activation. This is because the hair follicle is well tuned and the cycle stage is well characterized. Sencar mice provide an in vivo model for developmental activation. Removal of the crust from the resting hair follicle can induce the formation of new hair, the first indication of which is well characterized. Skin from adult Sencar mice is obtained post-surgery, excluding the underlying adipose tissue and cut into 0.4 × 5 cm flaps, which are then used with a tissue chopper or other suitable cutting device. A 300 μm section was cut across and cut. The micro-organ is shaken constantly with 5% CO ₂ Placed in a microplate containing serum-free DMEM at 37 ° C. for 1-14 days. Resting hair follicle activation was revealed by the proliferation of hair follicle stem cells, whether induced by rodent hair removal or growth factor treatment. FIG. 17 illustrates the activation of quiescent explants as detected by thymidine incorporation.
Example 19
[0183]
(Preparation of islets for transplantation)
Several techniques have been developed to prepare large quantities of islet cells from various mammalian sources. This is because they constitute a potentially transplantable beta cell mass, which constitutes a beta cell mass for treating type 1 diabetes established therewith. To date, two major drawbacks have been encountered. It has proven difficult to obtain a reproducible and reliable method of preparing β cells. Secondly, the viability of these cells varies considerably both in vitro and in vivo. Partly due to the first reason, and partly due to the fact that β cells are likely to require support from the stroma underlying the islets in the normal pancreas. Attempts to maintain pancreatic organs ex vivo have not been successful so far. Establishing micro-organ cultures of mouse, rat, guinea pig and pig pancreas in culture medium defined in vitro using the MC culture techniques described herein.
[0184]
The pancreatic micro-organ culture is now being grown in vitro for a period of one month. Within cultures, explants maintain their tissue microstructure and actively proliferate as specific cell subpopulations are determined by BrdU incorporation and labeling. Furthermore, islet cells secrete insulin into the medium even after one month of in vitro culture.
[0185]
Transplantation experiments were performed in which porcine micro-organ pancreas cultures were transplanted into both visceral and body wall mesoderm of the rat host. Explants were maintained in vivo for various periods ranging from several days to one month. This explant is fully vascularized and incorporated into the tissue host.
Example 20
[0186]
(Preparation of human psoriasis skin micro-organ culture)
Interstitial psoriatic skin was obtained from the patient using a dermatome after autopsy. The skin was cut into 0.4 × 5 cm flaps, which were then cut across 300 μm sections using a tissue chopper. These micro-organ explants were treated with 5% CO at 37 ° C. ₂ Incubated for 1-14 days in DMEM (without serum) in microplates. Examination of the micro-organ explants at various time points showed that the explant cells remained viable and proliferated.
[0187]
All references and publications cited above are hereby incorporated by reference.
[0188]
(Equivalent)
One of ordinary skill in the art can, using no more than routine experimentation, recognize or confirm many equivalents to the specific assays and reagents described herein. Such equivalents are considered to be within the scope of this invention and are covered by the appended claims.
[Brief description of the drawings]
[0189]
FIG. 1 is a diagrammatic representation of a micro-organ depicting the dimensions that determine an Aleph.
FIG. 2 is a bar graph showing cell growth in guinea pig micro-organ cultures as determined by BrdU labeling after different time incubations.
FIG. 3 is a bar graph showing cell growth in human backskin micro-organ cultures as determined by BrdU labeling after incubation of cultures for 1-8 days.
FIG. 4 is a photomicrograph showing immunofluorescence corresponding to replicating cells of mouse skin (FIG. 4A), guinea pig skin (FIG. 4B), human foreskin (FIG. 4C) and human foreskin (FIG. 4D).
FIG. 5 is a cross section of a human epidermal micro-organ explant.
FIG. 6 is a bar graph demonstrating the effect of various thicknesses (x) on epidermal proliferation of guinea pig skin micro-organ cultures using BrdU incorporation.
FIG. 7 is a photomicrograph showing immunofluorescence corresponding to proliferating cells in a pancreatic microculture.
FIG. 8 is a bar graph showing the amount of insulin released by an adult porcine pancreatic micro-organ culture.
FIG. 9 to growing cells in colon, liver, kidney, duodenum and esophageal micro-organ cultures on days 3, 4 and 6 of culture. ³ 3 is a bar graph showing H thymidine incorporation.
FIG. 10 is a photomicrograph showing active proliferation of hair follicles in microorgan cultures as determined by immunofluorescence.
FIG. 11 is a bar graph showing hair shaft size distribution at the start and end of microculture.
FIG. 12 is a bar graph showing inhibition of mitogenesis in microorgan cultures in the presence of 2.5 ng / ml TGF-β in guinea pig skin cultures.
FIG. 13 is a diagrammatic representation of a micro-organ explant for the treatment of chronic skin ulcers.
FIG. 14 is a photograph of the surface of a mouse after replacement of a normal skin section with a micro-organ culture.
FIG. 15 is a graphical representation of luciferase reporter expression in guinea pig skin micro-organ cultures after transfection of cultures with a plasmid encoding a luciferase reporter gene.
FIG. 16 is a graphical representation of luciferase gene expression in rat lung and thymus micro-organ cultures after cationic lipid-mediated transfection of cultures with plasmids encoding luciferase reporter genes.
FIG. 17 is a graphical representation of telogen hair follicle activation upon treatment with FGF in a micro-organ culture of the present invention.
FIG. 18 is a graphical representation of the expression of transgenic luciferase genes in the micro-organ explants of the present invention.

Claims

少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体であって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。A genetically modified micro-organ explant that expresses at least one recombinant gene product, the micro-organ explant comprising a population of cells, from which the micro-organ explant is derived At the same time, sufficient nutrients and gas are diffused into the cells in the micro-organ explants, and cell waste is diffused from the micro-organ explants, resulting in cytotoxicity and micro-organs. Having dimensions selected to minimize waste accumulation in the explant and concomitant death due to insufficient nutrients, said cells of the micro-organ explant A genetically modified micro-organ explant in which at least some of the cells of the population express at least one recombinant gene product.

前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein the at least one recombinant gene product is selected from the group consisting of a recombinant protein and a recombinant functional RNA molecule.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 2, wherein the recombinant protein is normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 2, wherein the recombinant protein is not normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 2, wherein the recombinant protein is a marker protein.

前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ_２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The recombinant protein is insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, ribonuclease, deoxyribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase A ₂ , elastase, amylase, blood coagulation factor, UDP glucuronyltransferase, ornithine Transcarbanoylase, cytochrome p450 enzyme, adenosine deaminase, serum thymus factor, thymic fluid factor, thymopoietin, thymosin α1, growth hormone, somatomedin, colony stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoiesis factor (hepatopoietin), liver Cell growth factor, interleukin, negative growth factor, fibroblast growth factor, transforming The genetically modified micro-organ explant according to claim 2, which is selected from the group consisting of long factor-β family, gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin, substance P and transcription factor.

培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, which can be maintained in culture for at least 24 hours.

式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ^−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。Having a surface area-volume index characterized by the formula 1 / x + 1 / a> 1.5 mm ⁻¹ , where x is the thickness of the tissue in millimeters and a is the width of the tissue in millimeters The genetically modified micro-organ explant of claim 1.

前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The organ is selected from the group consisting of a lymphoid organ, pancreas, liver, gallbladder, kidney, gastrointestinal organ, respiratory tract organ, reproductive organ, skin, urethral organ, blood-related organ, thymus and spleen. Item 2. The genetically modified micro-organ explant according to Item 1.

外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, comprising epithelial and connective tissue cells arranged in a microstructure similar to that of the organ from which the explant was obtained.

器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein the organ is pancreas and the population of cells comprises islets of Langerhans.

器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein the organ is skin and the explant comprises at least one hair follicle and gland.

器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein the organ is diseased skin and the explant comprises a population of hyperproliferative or neoproliferative cells from the diseased skin.

外植体が最小培地中で維持可能である請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein the explant can be maintained in a minimal medium.

外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The inheritance of claim 1, wherein the retained microstructure of the explant comprises one or more cell-cell and cell-matrix orientations between two or more tissues of the organ from which the explant was isolated. Modified micro-organ explants.

細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染されている請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, wherein at least a portion of the population of cells is infected with a recombinant virus carrying a recombinant gene encoding said recombinant gene product.

前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項１６に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。The recombinant virus is recombinant hepatitis virus, recombinant adenovirus, recombinant adeno-associated virus, recombinant papilloma virus, recombinant herpes virus, recombinant lentivirus, recombinant retrovirus, recombinant cytomegalovirus and recombinant simian The genetically modified micro-organ explant according to claim 16, which is a recombinant virus selected from the group consisting of viruses (SV).

細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換されたものである請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。Exogenous nucleic acid sequences via transformation methods wherein at least a portion of the population of cells is selected from the group consisting of calcium phosphate mediated transfection, DEAE dextran mediated transfection, electroporation, liposome mediated transfection, direct injection and receptor mediated uptake The genetically modified micro-organ explant according to claim 1, which has been transformed with the above.

請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体によってならされかつ前記組換え遺伝子産物を含む馴化培地。A conditioned medium smoothed by the genetically modified micro-organ explant of claim 1 and comprising the recombinant gene product.

請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体を含む医薬製剤。A pharmaceutical formulation comprising the genetically modified micro-organ explant according to claim 1.

以下のステップを含む、少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体の生産方法：
（ａ）動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離し（ただし、前記器官の一部分はそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有している）；そして
（ｂ）前記器官の一部分の細胞の集団の細胞の少なくともいくつかを組換え遺伝子で遺伝的に改変して少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現させる。A method for producing a micro-organ explant that expresses at least one recombinant gene product comprising the following steps:
(A) isolating a part of an organ containing a population of cells from an animal (provided that the part of the organ maintains the microstructure of the organ from which it is derived and at the same time sufficient for cells in the micro-organ explant; Diffuses nutrients and gases, and diffuses cellular waste from micro-organ explants, concomitantly caused by cytotoxicity and waste accumulation in parts of the organ and insufficient nutrients (B) a size selected to minimize death); and (b) at least some of the cells of the population of cells of a portion of the organ are genetically modified with a recombinant gene to at least A kind of recombinant gene product is expressed.

前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。The method of claim 21, wherein the at least one recombinant gene product is selected from the group consisting of a recombinant protein and a recombinant functional RNA molecule.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein the recombinant protein is normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項２２に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein the recombinant protein is not normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項２２に記載の方法。The method according to claim 22, wherein the recombinant protein is a marker protein.

前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ_２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項２２に記載の方法。The recombinant protein is insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, ribonuclease, deoxyribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase A ₂ , elastase, amylase, blood coagulation factor, UDP glucuronyltransferase, ornithine Transcarbanoylase, cytochrome p450 enzyme, adenosine deaminase, serum thymus factor, thymic fluid factor, thymopoietin, thymosin α1, growth hormone, somatomedin, colony stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoiesis factor (hepatopoietin), liver Cell growth factor, interleukin, negative growth factor, fibroblast growth factor, transforming The method according to claim 22, wherein the method is selected from the group consisting of long factor-β family, gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin, substance P and transcription factor.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the genetically modified micro-organ explant can be maintained in culture for at least 24 hours.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ^−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項２１に記載の方法。The surface area-volume index characterized by the genetically modified micro-organ explants by the formula 1 / x + 1 / a> 1.5 mm ⁻¹ , where x is the thickness of the tissue in millimeters, a 23. The method of claim 21, wherein is the width of the tissue in millimeters.

前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項２１に記載の方法。The organ is selected from the group consisting of a lymphoid organ, pancreas, liver, gallbladder, kidney, gastrointestinal organ, respiratory tract organ, reproductive organ, skin, urethral organ, blood-related organ, thymus and spleen. Item 22. The method according to Item 21.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が、外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項２１に記載の方法。23. The method of claim 21, wherein the genetically modified micro-organ explant includes epithelial and connective tissue cells arranged in a microstructure similar to that of the organ from which the explant was obtained.

器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the organ is a pancreas and the population of cells comprises islets of Langerhans.

器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the organ is skin and the explant comprises at least one hair follicle and gland.

器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the organ is diseased skin and the explant comprises a population of hyperproliferative or neoproliferative cells from the diseased skin.

外植体が最小培地中で維持可能である請求項２１に記載の方法。The method of claim 21, wherein the explant can be maintained in a minimal medium.

外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the retained microstructure of the explant comprises one or more cell-cell and cell-matrix orientations between two or more tissues of the organ from which the explant was isolated. .

細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染される請求項２１に記載の方法。24. The method of claim 21, wherein at least a portion of the population of cells is infected with a recombinant virus carrying a recombinant gene encoding the recombinant gene product.

前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項３６に記載の方法。The recombinant virus is recombinant hepatitis virus, recombinant adenovirus, recombinant adeno-associated virus, recombinant papilloma virus, recombinant herpes virus, recombinant lentivirus, recombinant retrovirus, recombinant cytomegalovirus and recombinant simian 37. The method of claim 36, wherein the virus is a recombinant virus selected from the group consisting of viruses (SV).

細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換される請求項２１に記載の方法。Exogenous nucleic acid sequences via transformation methods wherein at least a portion of the population of cells is selected from the group consisting of calcium phosphate mediated transfection, DEAE dextran mediated transfection, electroporation, liposome mediated transfection, direct injection and receptor mediated uptake The method of claim 21, wherein the method is transformed with.

以下のステップを含む、遺伝子産物をレシピエントに送達する方法：
（ａ）少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体であって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体を準備し；そして
（ｂ）マイクロ器官外植体をレシピエントに移植する。A method of delivering a gene product to a recipient comprising the following steps:
(A) a micro-organ explant that expresses at least one recombinant gene product, the micro-organ explant comprising a population of cells, wherein the micro-organ explant is the microstructure of the organ from which it is derived At the same time, sufficient nutrients and gases are diffused into the cells in the micro-organ explants, and cell waste is diffused out of the micro-organ explants, resulting in cytotoxicity and micro-organ explants. Cells of the population of micro-organ explant cells having dimensions selected to minimize the accumulation of waste in and concomitant death due to insufficient nutrients Providing a micro-organ explant in which at least some of the cells express at least one recombinant gene product; and (b) transplanting the micro-organ explant to a recipient.

前記マイクロ器官外植体がレシピエントから由来する請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the micro-organ explant is derived from a recipient.

前記マイクロ器官外植体がドナーから由来する請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the micro-organ explant is derived from a donor.

前記マイクロ器官外植体がヒトから由来する請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the micro-organ explant is derived from a human.

前記マイクロ器官外植体が非ヒト動物から由来する請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the micro-organ explant is derived from a non-human animal.

レシピエントがヒトである請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the recipient is a human.

レシピエントが非ヒト動物である請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the recipient is a non-human animal.

前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the at least one recombinant gene product is selected from the group consisting of a recombinant protein and a recombinant functional RNA molecule.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項４６に記載の方法。47. The method of claim 46, wherein the recombinant protein is normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項４６に記載の方法。47. The method of claim 46, wherein the recombinant protein is not normally produced by the organ from which the micro-organ explant is derived.

前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項４６に記載の方法。47. The method of claim 46, wherein the recombinant protein is a marker protein.

前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ_２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項４９に記載の方法。The recombinant protein is insulin, amylase, protease, lipase, trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, ribonuclease, deoxyribonuclease, triacylglycerol lipase, phospholipase A ₂ , elastase, amylase, blood coagulation factor, UDP glucuronyltransferase, ornithine Transcarbanoylase, cytochrome p450 enzyme, adenosine deaminase, serum thymus factor, thymic fluid factor, thymopoietin, thymosin α1, growth hormone, somatomedin, colony stimulating factor, erythropoietin, epidermal growth factor, hepatic erythropoiesis factor (hepatopoietin), liver Cell growth factor, interleukin, negative growth factor, fibroblast growth factor, transforming 50. The method of claim 49, wherein the method is selected from the group consisting of long factor-β family, gastrin, secretin, cholecystokinin, somatostatin, substance P, and transcription factor.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the genetically modified micro-organ explant can be maintained in culture for at least 24 hours.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ^−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項３９に記載の方法。The surface area-volume index characterized by the genetically modified micro-organ explant is represented by the formula 1 / x + 1 / a> 1.5 mm ⁻¹ , where x is the tissue thickness in millimeters, a 40. The method of claim 39, wherein is the width of the tissue in millimeters.

前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項３９に記載の方法。The organ is selected from the group consisting of a lymphoid organ, pancreas, liver, gallbladder, kidney, gastrointestinal organ, respiratory tract organ, reproductive organ, skin, urethral organ, blood-related organ, thymus and spleen. Item 40. The method according to Item 39.

前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が、外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the genetically modified micro-organ explant comprises epithelial and connective tissue cells arranged in a microstructure similar to that of the organ from which the explant was obtained.

器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the organ is a pancreas and the population of cells comprises islets of Langerhans.

器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the organ is skin and the explant comprises at least one hair follicle and gland.

器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the organ is diseased skin and the explant comprises a population of hyperproliferative or neoproliferative cells from the diseased skin.

外植体が最小培地中で維持可能である請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the explant can be maintained in a minimal medium.

外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein the retained microstructure of the explant comprises one or more cell-cell and cell-matrix orientations between two or more tissues of the organ from which the explant was isolated. .

細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染されている請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein at least a portion of the population of cells is infected with a recombinant virus carrying a recombinant gene encoding the recombinant gene product.

前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項６０に記載の方法。The recombinant virus is recombinant hepatitis virus, recombinant adenovirus, recombinant adeno-associated virus, recombinant papilloma virus, recombinant herpes virus, recombinant lentivirus, recombinant retrovirus, recombinant cytomegalovirus and recombinant simian 61. The method of claim 60, wherein the method is a recombinant virus selected from the group consisting of viruses (SV).

細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換されたものである請求項４９に記載の方法。Exogenous nucleic acid sequences via transformation methods wherein at least a portion of the population of cells is selected from the group consisting of calcium phosphate mediated transfection, DEAE dextran mediated transfection, electroporation, liposome mediated transfection, direct injection and receptor mediated uptake The method according to claim 49, wherein the method has been transformed with.

前記ステップ（ｃ）に先立って前記遺伝的に改変されたマイクロ器官培養物をカプセル化するステップをさらに含む請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, further comprising encapsulating the genetically modified micro-organ culture prior to step (c).

ステップ（ａ）が以下のステップにより行われる請求項３９に記載の方法：
（ｉ）動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離し（ただし、前記器官の一部分はそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有している）；そして
（ｉｉ）前記器官の一部分の細胞の集団の細胞の少なくともいくつかを組換え遺伝子で遺伝的に改変して少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現させる。40. The method of claim 39, wherein step (a) is performed by the following steps:
(I) isolating a part of an organ containing a population of cells from an animal (provided that the part of the organ maintains the microstructure of the organ from which it is derived and at the same time is sufficient for the cells in the micro-organ explant; Diffuses nutrients and gases, and diffuses cellular waste from micro-organ explants, concomitantly caused by cytotoxicity and waste accumulation in parts of the organ and insufficient nutrients (Ii) at least some of the cells of the population of cells that are part of the organ are genetically modified with a recombinant gene to have at least a size selected to minimize death); A kind of recombinant gene product is expressed.

前記ステップ（ａ）が前記組換え遺伝子産物を発現するトランスジェニック動物の器官から前記マイクロ器官外植体を得ることによって行われる前記請求項３９に記載の方法。40. The method of claim 39, wherein step (a) is performed by obtaining the micro-organ explant from an organ of a transgenic animal that expresses the recombinant gene product.

トランスジェニック動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離するステップを含む、少なくとも一種の遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体の生産方法であって、前記器官の一部分がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、器官の一部分の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する方法。A method of producing a micro-organ explant that expresses at least one gene product comprising the step of isolating a portion of an organ comprising a population of cells from a transgenic animal, wherein the portion of the organ is derived from At the same time, sufficient nutrients and gases are diffused into cells in the micro-organ explants, and cell waste is diffused out of the micro-organ explants, thus Cells of the population of cells of a portion of the organ having dimensions selected to minimize waste accumulation in the portion of the body and concomitant death due to insufficient nutrition A method wherein at least some of said expresses at least one recombinant gene product.

少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体をカプセル化したポリマーデバイスを含む医療デバイスであって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する医療デバイス。A medical device comprising a polymer device encapsulating a genetically modified micro-organ explant that expresses at least one recombinant gene product, the micro-organ explant comprising a population of cells, The organ explant maintains the microstructure of the organ from which it is derived, and at the same time, diffuses sufficient nutrients and gas to the cells in the micro organ explant, and the cell waste into the micro organ explant Has dimensions selected to diffuse from and minimize cytotoxicity and waste accumulation in micro-organ explants and concomitant death due to insufficient nutrients A medical device wherein at least some of the cells of the population of cells of the micro-organ explants express at least one recombinant gene product.