JP2005506050A - Micromonospora echinospora gene encoding calicheamicin biosynthesis and self-resistance to it - Google Patents

Abstract

カリケマイシン生合成をコードするミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の分離された遺伝子クラスター。生合成遺伝子クラスターは、カリケマイシンの生合成製造において使用されるタンパク質および酵素をコードする遺伝子を含み、アリール四糖およびアグリコンを包含する。遺伝子クラスターはまた、カリケマイシン耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。本発明はまた、生合成クラスターの分離された遺伝子およびそれらの対応するタンパク質を提供する。さらに本発明は、カリケマイシン遺伝子クラスターおよびそのクラスターの分離された遺伝子とのＤＮＡハイブリダイゼーションに関する。生合成遺伝子の遺伝子を含む発現ベクターおよびそれらの機能的変異体がまた提供される。本発明はまた、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）ゲノムから分離されたＤＮＡと接合された宿主細胞に関する。Isolated gene cluster of Micromonospora etinospora encoding calichemycin biosynthesis. The biosynthetic gene cluster includes genes encoding proteins and enzymes used in the biosynthetic production of calichemycin and includes aryl tetrasaccharides and aglycones. The gene cluster also includes genes encoding proteins that confer calichemycin resistance. The present invention also provides isolated genes for biosynthetic clusters and their corresponding proteins. The invention further relates to DNA hybridization with the calichemycin gene cluster and the isolated genes of the cluster. Also provided are expression vectors containing genes of biosynthetic genes and functional variants thereof. The present invention also relates to Micromonospora etinospora spp. It relates to a host cell conjugated with DNA isolated from the calicensis genome.

Description

【０００１】
本願は、１９９９年１２月７日に出願された米国特許出願０９／４５７，０４５（この出願はその全部を本明細書に援用する）の一部継続出願であり、その利益を請求する、２０００年１１月２８日に出願された米国特許出願Ｕ．Ｓ．０９／７２４，７９７のＰＣＴ出願である。本願はまた、１９９８年１２月７日に出願された仮特許出願６０／１１１，３２５（この出願は、その全部を本明細書に援用する）からの利益をも請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）の生合成遺伝子クラスターに関する。特に、カリケマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）生合成遺伝子クラスターは、カリケマイシンのアリール四糖およびアグリコンの生合成経路および構築に使用されるタンパク質および酵素をコードする遺伝子ならびに、カリケマイシン耐性を付与する遺伝子を含む。本発明はまた、生合成クラスターの単離された遺伝子およびその対応するタンパク質に関する。さらに、本発明は、カリケマイシン遺伝子クラスターおよびそのクラスターの分離された遺伝子を用いたＤＮＡハイブリダイズに関する。本発明はまた、生合成遺伝子クラスター、個々の遺伝子またはその機能的変異体を含む発現ベクターに関する。
【０００３】
発明の背景
１９８０年代に発見されたエネジン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗生物質は、その新規な分子構造、その著しい生物活性およびその魅力的な作用形式について長い間高く評価されてきた。エネジン抗生物質は元々、微生物（ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、アクチノマジュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む）の発酵に由来するものであった。ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、Ｄ．Ｍ．、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐ．２（１９９５）。等級として、エネジン抗生物質は、今まで発見された、最高の効力および非常に活性な抗腫瘍試薬と称されてきた。ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、Ｄ．Ｍ．、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、序文（１９９５）。
【０００４】
これまで、少なくとも１２種類のこのファミリーの抗生物質が発見され、そのすべてが、おおよそ２つの範疇に分けられる。エネジンの第１の範疇の構成員は、新規な９−員環の発色団コア構造を有するので、色素タンパク質エネジンとして分類され、それはまた、発色団の安定のために特定の会合したタンパク質を必要とする。エネジンの第２の範疇の構成員は、非色素タンパク質エネジンとして分類される。これらのエネジンは１０−員環を含み、これはさらなる安定化因子を必要としない。このエネジン環構造はしばしば「弾頭」と称される。この弾頭は、ＤＮＡ損傷を誘発し、それはしばしば二重鎖の開裂であり、回復できないようである。このタイプのＤＮＡ損傷は通常、細胞には修復不可能であり、ほとんどの場合致死的である。これらの著しい化学的および生物学的性質の故に、製薬工業および学究世界の両方による、新規な、臨床的に有用な治療用の抗腫瘍剤を開発することを目標としてこれらの物質を研究する著しい努力があった。
【０００５】
９−員環の色素タンパク質のエネジンサブファミリーは、次のものからなる：ストレプトミセス カルジノスタチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｃｕｓ）からのネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）（マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、Ａ．Ｇ．ら、Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１０， ７２１２−７２１４ （１９８８））；アクチノミセテ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）Ｌ５８５−６からのケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）（リート（Ｌｅｅｔ）Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１４， ７９４６−７９４８ （１９９２））；ストレプトミセス グロビスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）からのＮ１９９９Ａ２（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）Ｋ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３４， ２６３７−２６４０ （１９９３））；アクチノマジュラ マジュレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒｅａ）からのマジュロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）（シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）， Ｄ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１６， ９３５１−９３５２ （１９９４））；ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．ＡＪ９４９３からのＮ１９９９Ａ２（シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ）， Ｄ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１１６， ９３５１−９３５２ （１９９４））；アクチノミセス グロビスポラス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）からのアクチノキサンチン（ａｃｔｉｎｏｘａｎｔｈｉｎ）（コクロフ（Ｋｈｏｋｈｌｏｖ），Ａ．Ｓ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ＸＸＩＩ， ５４１−５４４ （１９６９））；ストレプトミセス プルリコロレッセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｕｒｉｃｏｌｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのラルゴマイシン（ｌａｒｇｏｍｙｃｉｎ）（ヤマグチ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ），Ｔ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ＸＸＩＩＩ， ３６９−３７２ （１９７０））；ストレプトミセス マクロモノミセチカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍａｃｒｏｍｏｎｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）からのオーロモマイシン（ａｕｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ），Ｔ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ＸＸＸＩＩ， ３３０−３３９ （１９７９））；およびストレプトスポランギウム シュードブルガレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｖｕｌｇａｒｅ）からのスポラマイシン（ｓｐｏｒａｍｙｃｉｎ）（コミヤマ（Ｋｏｍｉｙａｍａ），Ｋ．ら、Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．， ＸＸＸ， ２０２−２０８ （１９７７））。そのすべてが、生物活性のために不可欠な、新規なビシクロ［７．３．０．］ドデカジイネン発色団コア構造を有すると考えられる。さらに、Ｎ１９９９Ａ２を除いては、必要とされるアポタンパク質が、不安定な発色団のための、かつ標的ＤＮＡの輸送およびそれとの相互作用のための、安定剤および特定の担体として働く。
【０００６】
非発色団のエネジンサブファミリーは、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ） ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からのカリケマイシン；ポリシンクラトン リトストロタム（Ｐｏｌｙｓｙｎｃｒａｔｏｎ ｌｉｔｈｏｓｔｒｏｔｕｍ）からのナメナマイシン（ｎａｍｅｎａｍｉｃｉｎ）；アクチノマジュラ ベルコソスポラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｖｅｒｒｕｃｏｓｏｓｐｏｒａ）からのエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）；およびミクロモノスポラ ケルシナ （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｅｒｓｉｎａ）からのダイネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）からなる。
【０００７】
エネジン抗生物質は、ＤＮＡを開裂するその能力の故に、抗癌剤として効力を有する。しかしながら、これらの化合物の多くは、臨床研究において現在使用するには毒性が強すぎる。今日、カリケマイシンのみが臨床的試みにおいて現在使用されることが知られており、抗癌剤として約束された結果を提供している。例えば、ＣＭＡ−６７６としてまた知られているカリケマイシン−抗体接合体、ＭｙｌｏＴａｒｇ（商標）は、急性骨髄性白血病を治療することが、２０００年１月にＦＤＡによって認可された。エネジンはまた、毒性をなんとかできれば、抗感染剤として潜在的に有用性を有する。
【０００８】
カリケマイシンは、２つの区別できる構造領域を有する：アリール四糖およびアグリコン（弾頭としてまた知られている）。アリール四糖は、非常に珍しい一連のグリコシド、チオエーテルおよびヒドロキシルアミン結合を示し、薬剤を、主にＤＮＡの小溝内の特定の域（５’−ＴＣＣＴ−３’および５’−ＴＴＴＴ−３’）に、それらの配列が利用可能なときに、送るのに役立つ。しかしながら、特異性がまた状況依存性である。カリケマイシンのアグリコンは、誘発メカニズムとして役立つアリル性トリスルフィドを有する非常に官能化されたビシクロ［７．３．１．］トリデカジイネンコア構造からなる。マクガレン（ＭａｃＧａｈｒｅｎ），Ｗ．Ｊ．ら、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐｐ．７５−８６（１９９５）。アリール四糖がしっかりと合体すると、１，４−デヒドロベンゼン−ジラジカルによるビシクロ［７．３．１．］トリデカジイネンコア構造の芳香族化が、標的とするＤＮＡの部位特異的酸化的二重鎖切断を生じる。ゼイン（Ｚｅｉｎ），Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０， １１９８−１２０１ （１９８８）。アグリコンは、炭素−中心のジラジカルを生じる反応を生じ、それがＤＮＡ開裂の原因である。
【０００９】
カリケマイシンのこの活性は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのカリケマイシン−抗体接合体、ＭｙｌｏＴａｒｇ（商標）（ＣＭＡ−６７６）の近年のＦＤＡ認可に全盛をきわめている製薬工業において著しい興味を起こさせた。その上、胸部癌を治療するためのＩ相試験で同様の戦略が使用された。代替の配送系に接合されたカリケマイシンを試験するためのかなりのプログラムがまた近頃企てられた。ハマン（Ｈａｍａｎｎ），Ｐ．Ｒ．ら、アメリカ癌研究協会第８７回年次総会（Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ワシントン，Ｄ．Ｃ．、ｐｐ．４７１（１９９６）；ヒンマン（Ｈｉｎｍａｎ），Ｌ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３， ３３３６ （１９９３）；ヒンマン（Ｈｉｎｍａｎ），Ｌ．Ｍ．ら、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐｐ．８７−１０５（１９９５）；シーバーズ（Ｓｉｅｖｅｒｓ），Ｅ．Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ， ９３， ３６７８−３６８４ （１９９９）；シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ），Ｍ．Ｍ．ら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６９， ２７１６−２７２６ （１９９７）；エレスタッド（Ｅｌｌｅｓｔａｄ），Ｇ．個人的文書。
【００１０】
カリケマイシンの生物活性および分子構造はまた、潜在的に有用な類似体についての探索を促した。合成の類似体を製造している多くの実験室のうちで、１つのグループが、ネズミの神経芽腫の先天性モデルにおける肝臓転移の成長および広まりを有効に抑制することが示された、新規なカリケマイシンγ^Ｉを製造した。ロード（Ｌｏｄｅ），Ｈ．Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８， ２９２５−２９２８ （１９９８）；ラシドロ（Ｗｒａｓｉｄｌｏ），Ｗ．ら、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ， ３４， １５７−１６４ （１９９５）。カリケマイシン類似体の合成の他に、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の無作為変異誘発および、改善された生合成の可能性を有する変異体株のスクリーニングがまた遂行された。ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ），Ｄ，Ｍ．、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐｐ．１０７−１２６（１９９５）。
【００１１】
カリケマイシンの最初の全合成は、ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｏｕ）および共同研究者によって１９９２年に報告された。この複雑な抗生物質を合成するのはまったく、多くの不都合を示した。例えば、ナセル（Ｎａｃｅｌｌｅ）の手順は、およそ０．００７％の収率しか与えず、４７工程を要する。ハルコム（Ｈａｌｃｏｍｂ），Ｒ．Ｌ．、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐｐ．３８３−４３９（１９９５）。かくして、カリケマイシンの全合成は、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の大規模発酵からのカリケマイシンの分離に対して二次的なままである。したがって、大量のカリケマイシンおよび潜在的に有用な変異体を製造する方法がなお必要とされている。ファンティニ（Ｆａｎｔｉｎｉ），Ａ．ら、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、２９−４８（１９９５）。カリケマイシンＤＮＡを、細菌、例えば非限定例として、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、他のアクチノミセス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） の製造株へ形質転換することは、この必要性に取り組む。しかしながら、本発明者らの発見以前には、クローン化されたＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）遺伝子は入手可能でなく、推定のＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）プロモーターについての１組の限られた研究だけしか入手可能でなかった。リン（Ｌｉｎ），Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３８， １８８１−１８８５ （１９９２）；リン（Ｌｉｎ），Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７４， ３１１１−３１１７ （１９９２）；バウム（Ｂａｕｍ），Ｅ．Ｚ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ６５０３−６５１０ （１９８９）；バウム（Ｂａｕｍ），Ｅ．Ｚ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０， ７１−７７ （１９８８）。
【００１２】
その有用な生物活性および潜在的治療価値に関連するカリケマイシンの分子構造は、カリケマイシンを、天然の生成物の生合成の研究のための標的と印象づける。カリケマイシンによる酸化的ＤＮＡ開裂のラジカルに基づくメカニズム（すなわち、部位特異的酸化的二重鎖ＤＮＡ開裂を生じる、１，４−デヒドロベンゼン−ジラジカルによるビシクロ［７．３．１．］トリデカジイネンコア構造の芳香族化）はよく理解されているが、本発明の以前には、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）がいかにカリケマイシンを構築するかは知られていなかった。その結果、本発明以前には、カリケマイシン生合成を見出し、理解する必要があった。本発明者らのこの発見以前には、非色素タンパク質のエネジン生合成をエンコードする遺伝子の知識は完全に欠如していた。
【００１３】
カリケマイシンを含むエネジン化合物の毒性は、関心のあるＤＮＡ、例えば腫瘍細胞ＤＮＡのみを開裂し、宿主のＤＮＡは開裂しない化合物を目指すという問題に集中する。カリケマイシンのＤＮＡを開裂する有力な能力のために、科学者は、カリケマイシンを製造する生物がこの分子のＤＮＡ−開裂活性に対して自己を保護するメカニズムを研究した。ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、Ｄ．Ｍ．、抗腫瘍剤としてのエネジン抗生物質（Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｇｅｎｔｓ）、ｐ．７７（１９９５）。本発明以前には、非色素たんぱく質エネジンの自己耐性をエンコードする遺伝子の知識は完全に欠如していた。
【００１４】
発明の概要
本発明は、非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターの最初の同定、分離およびクローン化ならびに、クラスター中の遺伝子の地図作成およびヌクレオチド配列分析に関する。本発明は、全カリケマイシン生合成クラスターおよび、アリール四糖生合成の生化学的研究を提供する。さらに、カリケマイシンカスケード内の段階のための遺伝子および得られる酵素を有するように、カリケマイシンの自己耐性遺伝子およびタンパク質を分離した。本発明はまた、生物活性な二次的代謝産物の理にかなった生合成変性のため、新薬の手がかりのため、および、エネジンの組合せ生合成プログラムのための、エネジン過剰製造株の構築物を提供する。
【００１５】
本発明は、核酸分子、該一部がタンパク質をエンコードする該核酸分子の一部、該一部がタンパク質の生物活性な断片をエンコードする該核酸分子の一部を含む、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから分離された核酸分子を提供する。分離された核酸分子は、単鎖もしくは二重鎖であり得る。本明細書で使用されるように、例えば生物または遺伝子クラスター「から」のものとして記載される核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質は、そのような生物または遺伝子クラスターから分離されることができたか、あるいは、合成、化学、組換えまたは他のそのような方法を用いて製造された分子であることができ、そのような生物または遺伝子クラスターから分離されることができるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を含むことができる。
【００１６】
本発明は、４８個の遺伝子を提供し、そのうち２７個は構造遺伝子をエンコードし、残りは種々の機能をエンコードする。本発明は、以下の遺伝子または核酸に関心がある：
【化３】

【００１７】
本発明はまた、以下のタンパク質または推定タンパク質に関心がある：
【化４】

【００１８】
１つの態様においては、本発明は、ヌクレオチド分子がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つでハイブリッド形成する分離されたヌクレオチド分子または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つでハイブリダイズする単離されたヌクレオチド分子の機能的誘導体に関する。本発明の１つの実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する。すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと１００％相補性（配列同一性）を有する。本発明の別の実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％相補性（配列同一性）を有する。本発明のなお別の実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと少なくとも８０％相補性（配列同一性）を有する。
【００１９】
本発明のなお別の実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％相補性（配列同一性）を有する。本発明のなお別の実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと少なくとも６０％相補性（配列同一性）を有する。本発明のなお別の実施態様においては、単離されたヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つと実質的に相補的である。
【００２０】
本発明の別の実施態様においては、本明細書で先に記載したようにＤＮＡ分子によってコードされる分離されたタンパク質またはその機能的誘導体が提供される。好ましいタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列または、１つ以上のそれらのポリペプチドの機能的変異体もしくは誘導体を有する。
【００２１】
別の実施態様においては、本発明は、非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスター、タンパク質をエンコードする該遺伝子クラスターの一部、タンパク質の生物活性な断片をエンコードする該遺伝子クラスターの一部、該遺伝子クラスターから誘導される単鎖核酸分子または該遺伝子クラスターの一部から誘導される単鎖核酸分子を含む、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）から単離された核酸分子を提供する。
【００２２】
特に、本発明は、カリケマイシンの生合成に関連するミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）から分離された核酸分子を提供する。別の実施態様においては、本発明はまた、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから単離された１つ以上の核酸を用いてハイブリッド形成することができる核酸に関する。さらなる実施態様においては、本発明は、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。なおさらななる実施態様においては、本発明は、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから単離された核酸分子を含むコスミドを提供する。
【００２３】
好ましい実施態様においては、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３および９４の単離された核酸分子を提供する。
【００２４】
さらなる実施態様においては、本発明は、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから分離された核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意的に、細菌、酵母、菌類、昆虫、植物または哺乳動物由来のものであることができ、標準の方法に従って形質転換されることができる。好ましい実施態様においては、宿主細胞は、細菌の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．またはミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．であることができる。より好ましい実施態様においては、宿主細胞は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属またはミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属からの細菌である。
【００２５】
さらなる実施態様においては、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む発現ベクターまたはその一部またはその対立遺伝子で形質転換された宿主細胞に関する。好ましい実施態様においては、宿主細胞は、生物学的に機能性のタンパク質またはタンパク質の一部を製造し、そのタンパク質またはその一部は発現ベクターによってコードされる。
【００２６】
特定の実施態様においては、本発明は、ＣａｌＣの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ｃａｌＣを含む発現ベクターまたはその一部もしくはその対立遺伝子で形質転換された宿主細胞に関する。別の特定の実施態様においては、本発明は、ＣａｌＨの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ｃａｌＨを含む発現ベクターまたはその一部もしくはその対立遺伝子で形質転換された宿主細胞を提供する。なおさらなる特定の実施態様においては、本発明は、ＣａｌＱの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ｃａｌＱを含む発現ベクターまたはその一部もしくはその対立遺伝子で形質転換された宿主細胞を提供する。同様に、本発明は、ＣａｌＧの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ｃａｌＧを含む発現ベクターまたはその一部もしくはその対立遺伝子で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２７】
なおさらなる実施態様においては、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドまたは、１つ以上のそれらのポリペプチドの機能性変異体をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。好ましい実施態様においては、宿主細胞は、生物学的に機能性のタンパク質またはタンパク質の一部を製造し、そのタンパク質またはその一部は発現ベクターによってコードされる。
【００２８】
特定の実施態様においては、本発明は、コードされたポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ＣａｌＣをコードする発現ベクターまたはその機能性誘導体で形質転換された宿主細胞に関する。別の特定の実施態様においては、本発明は、コードされたポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ＣａｌＨをコードする発現ベクターまたはその機能性誘導体で形質転換された宿主細胞を提供する。なお別の特定の実施態様においては、本発明は、コードされたポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ＣａｌＱをコードする発現ベクターまたはその機能性誘導体で形質転換された宿主細胞を提供する。同様に、本発明は、コードされたポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に結合された、ＣａｌＧをコードする発現ベクターまたはその機能性誘導体で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、タンパク質の発現を見込む時間および条件下で宿主細胞をインキュベートすることによってタンパク質を発現する方法を提供する。
【００３０】
なお別の実施態様においては、本発明は、アフィニテイークロマトグラフィーを用いてカリケマイシンを精製する方法を提供する。カリケマイシンを含む試料は、それに結合したタンパク質ＣａｌＣを有するアフィニティーマトリックスと、カリケマイシンをマトリックスに結合させる時間および条件下で接触され、マトリックスからカリケマイシンを溶出し、そしてカリケマイシンを回収する。
【００３１】
さらなる実施態様においては、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００３２】
なおさらなる実施態様においては、本発明は、以下の２種の新規なマクロライドの製造を提供する：
【００３３】
【化５】

本発明はさらに、対象にカリケマイシン耐性を与える方法であって、対象から細胞を得ること、細胞をカリケマイシン自己耐性遺伝子で形質転換すること、および細胞を対象に戻すことを含む方法を提供する。あるいは、カリケマイシン自己耐性遺伝子を、公知の遺伝子治療用送達系によって所望の宿主細胞を標的とし、それにデリバリーすることができる。
【００３４】
本発明はさらに、カリケマイシンまたはその生物活性な代謝産物を、ｃａｌＤ， Ｅ， Ｆ， Ｇ， Ｈ， Ｊ， Ｋ， Ｎ， Ｏ， Ｐ， Ｑ， Ｓ， Ｔ， Ｕ， Ｖ， Ｗ， Ｘ， ６ＭＳＡＳ， ａｃｔＩ−ＩＩＩ， ｏｒｆＩ， ｏｒｆＩＩＩ， ｏｒｆＶ， およびｏｒｆＶＩＩの発現の変性によって変えることによる、カリケマイシン類似体を製造する方法を提供する。そのような変性は、選択的「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ）」ならびに、これらの遺伝子およびその産物の非相同発現によって達成することができる。これらの変異させたかまたは野生型の遺伝子産物の種々の組合せを、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのカリケマイシン類似体の製造に使用できる。
【００３５】
本発明はさらに、正の制御因子および輸送体の多重複写の導入によって、または負の制御因子（例えばＣａｌＡ， Ｂ， Ｉ， Ｌ， Ｏｒｆ８）の発現を排除するか減少させることによって、カリケマイシンの製造を増加する方法を提供する。さらに、カリケマイシン耐性遺伝子ｃａｌＣ、ｃａｌＮおよびｏｒｆＸＩの上方制御を使用して、治療中健康な組織および細胞に対するカリケマイシンの毒性を減少させることができる。
なおさらなる実施態様においては、本発明は、トランスポゾン仲介変異誘発の方法または、ｏｒｆ３インテグラーゼおよびＩＳ挿入要素の発現によってイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での染色体ＤＮＡ断片を移動する方法を提供する。
【００３６】
本発明の利点は多い。カリケマイシンＤＮＡの分離およびクローン化の能力は、カリケマイシン生合成の遺伝解析のための扉を開く。というのは、そのような解析は、カリケマイシン生合成をコードする大量のＤＮＡを得る能力を必要とするからである。本発明の教示を用いると、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）の変異誘発によるカリケマイシン生合成を研究することができる。例えば、カリケマイシン生合成においてブロックされた変異体を分離し、特性決定した後、欠損があるかまたは部分的なカリケマイシン生成物を分析することができる。その上、特定の酵素を、その遺伝子を宿主、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）にサブクローン化した後に、過剰発現または不足発現させることができ、そのような過剰発現または不足発現の結果を、酵素の機能を明らかにするために研究することができる。さらには、生合成遺伝子のクローン化は結局、速度制限酵素をエンコードする生合成遺伝子を生産生物へ戻してクローン化し、発現させることによって遺伝子産物の収率の増加をもたらし得る。
【００３７】
さらに、関連化合物を作る株へ生合成遺伝子をクローン化することによって、新規な生成物を製造することがまた可能であり得る。そのような遺伝子は、宿主生物に、エネジン核で新たな反応を行い、かくして新規な薬剤を製造する能力を付与することができる。このように本発明はまた、エネジン組合せ生合成による生物活性な二次的代謝産物の生合成変性のための手段を提供する。ほとんどの製薬剤の前例は、天然に生じる化合物によってもたらされ、これらの代謝産物を合成することに挑戦が行われたので、代謝産物での糖付加物の遺伝子操作は、可能性のある新規な薬剤を作ることへの達成手段を与える。かくして、組合せ生合成の出現する分野は、変性された非天然の糖骨格のための豊富な新たな供給源になった。マースデン（Ｍａｒｓｄｅｎ）， Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８， ２７９， １９９−２０１。糖付加物の遺伝子操作に固有の問題は、天然に生じる生物活性な二次的代謝産物が異常な炭水化物リガンドを有し、これは生物活性のために不可欠の分子認識要素として働くという事実に関する。マクロライド抗生物質、化学、生物および実施（Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、１９８４。これらの必須の糖付加物なしには、ほとんどの臨床的に重要な二次的代謝産物の生物活性は、完全に破壊されるかまたは劇的に減少する。現今、与えられた代謝産物についての糖付加物の遺伝子操作のための技術は主に、それぞれの所望の糖部分を構成し、付加するのに必要とされる遺伝子の小さいサブセットの変更および／または欠失をあてにする。かくして、天然に生じない糖を構成し、付加するための代替の戦略を開発する必要がある。本発明は、この必要性に向けられる。本発明は、ある種の二次的代謝産物の最終的なグリコシル化の原因であるグリコシルトランスフェラーゼが、ヌクレオチド糖ドナーに対して高程度の***雑性を示すという事実を使用する。ザオ（Ｚｈａｏ），Ｌ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９８８， １２０， １２１５９−１２１６０。グリコシルトランスフェラーゼのこの非選択性は、組合せの形式での天然もしくは非天然の二次的代謝産物骨格の決定的なグリコシル化の型の変更を可能にする可能性を有する。本発明は、非天然の糖を作り付加する複合遺伝子クラスターを構成する種々の生合成経路から糖遺伝子の補充および協調的作用を用いる方法を開示する。
【００３８】
ミクロモノスポラ （Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）の自己耐性遺伝子および遺伝子産物がカリケマイシンの毒作用を制御するためにいかに働くかの洞察は、臨床的研究の新たな達成手段を与える。例えば、本発明の開示により提供されるように、カリケマイシン耐性の基礎となるメカニズムの知識は、より高い投与量のカリケマイシンを使用することを必要とする手段を、同時にこの薬剤の非癌細胞への毒性効果を抑制しながら、提供することができる。その上、カリケマイシン自己耐性の陰のメカニズムを理解することは、他のエネジン抗生物質での自己耐性の理解の助けになり、それによって、治療薬として可能に使用されるには毒性が大きすぎると一度は考えられたそれらのエネジンを有用なものにし得る。本発明を用いて解明されるカリケマイシン自己耐性メカニズムは、遺伝子治療のアプローチ、例えばエネジン耐性遺伝子を骨髄細胞へ導入し、それによって耐性を向上させ、カリケマイシンの化学療法投与量に耐性にするアプローチを提供する。バナージー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ），Ｄ．ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， １２， ３７８−３８５ （１９９４）。かくして、カリケマイシン自己耐性を理解することは、カリケマイシンおよびエネジンを伴う臨床研究の継続を有意に助けるであろう。本発明は、任意の非色素タンパク質エネジンのための耐性遺伝子およびその会合タンパク質の分離および特性決定を提供するので、この必要性と取り組むものである。
発明の詳細な説明
本発明は、カリケマイシン生合成クラスターの分離および特性決定に関する。このクラスターは、カリケマイシン合成のデオキシ糖合成（アリール四糖）、ポリケタイド生合成（アグリコンおよびアリール四糖の芳香族残基）、調節、輸送、クラスター移動およびカリケマイシン耐性に関連するタンパク質および酵素をエンコードする遺伝子をエンコードする。４８個の推定の遺伝子が同定され、そのうちの２７個が推定の構造タンパク質をエンコードし、残りが種々の機能をエンコードする。特異的に、アリール四糖部分をエンコードする１５個の遺伝子（２０，９２８ｂｐ；Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｎ、Ｏ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｘ、Ｗ、６ＭＳＡＳ）、アグリコンをエンコードする１２個の推定遺伝子（１３，２８４ｂｐ；Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、ＡｃｔＩ、ＡｃｔＩＩ、ＡｃｔＩＩＩ、ＯｒｆＩ、ＯｒｆＩＩＩ、ＯｒｆＶ、ＯｒｆＶＩ、ＯｒｆＶＩＩ）、膜輸送、調節、ＤＮＡ移動および／または耐性に関連する１３個の推定遺伝子（１９，７０４ｂｐ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ｏｒｆ４、ｏｒｆ８、ＯｒｆＶＩＩＩ、ＯｒｆＩＸ、ＯｒｆＸ、ＯｒｆＸＩ、ＩＳ−要素）ならびに、未知の機能の残部８個の遺伝子（７３８３ｂｐ；ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ＯｒｆＩＩ、ＯｒｆＩＶ）がある。
【００３９】
カリケマイシン生合成遺伝子クラスターは、以下の遺伝子を含む：ｃａｌＡ， ｃａｌＢ， ｃａｌＣ， ｃａｌＤ， ｃａｌＥ， ｃａｌＦ， ｃａｌＧ， ｃａｌＨ， ｃａｌＩ， ｃａｌＪ， ｃａｌＫ， ｃａｌＬ， ｃａｌＭ， ｃａｌＮ， ｃａｌＯ， ｃａｌＰ， ｃａｌＱ， ｃａｌＲ， ｃａｌＳ， ｃａｌＴ， ｃａｌＵ， ｃａｌＶ， ｃａｌＷ， ｃａｌＸ， ６ＭＳＡＳ， ＡｃｔＩ， ＡｃｔＩＩ， ＡｃｔＩＩＩ， ｏｒｆ１， ｏｒｆ２， ｏｒｆ３， ｏｒｆ４， ｏｒｆ５， ｏｒｆ６， ｏｒｆ７， ｏｒｆ８， ｏｒｆＩ， ｏｒｆＩＩ， ｏｒｆＩＩＩ， ｏｒｆＩＶ， ｏｒｆＶ， ｏｒｆＶＩ， ｏｒｆＶＩＩ， ｏｒｆＶＩＩＩ， ｏｒｆＩＸ， ｏｒｆＸ， ｏｒｆＸＩおよびＩＳ−要素遺伝子。ｏｒｆ８は、組換えベクターＬＰ４６および／またはＬＰ５４から全部または一部誘導されるＤＮＡを含み得ることに注意すべきである。先に挙げた遺伝子は次のポリペプチドをエンコードする：ＣａｌＡ（３２８アミノ酸）、ＣａｌＢ（５６１アミノ酸）、ＣａｌＣ（１８１アミノ酸）、ＣａｌＤ（２６３アミノ酸）、ＣａｌＥ（４２０アミノ酸）、ＣａｌＦ（２４５アミノ酸）、ＣａｌＧ（９９０アミノ酸）、ＣａｌＨ（３３８アミノ酸）、ＣａｌＩ（５６８アミノ酸）、ＣａｌＪ（３３２アミノ酸）、ＣａｌＫ（４４０アミノ酸）、ＣａｌＬ（５６２アミノ酸）、ＣａｌＭ（４１６アミノ酸）、ＣａｌＮ（３９８アミノ酸）、ＣａｌＯ（３３１アミノ酸）、ＣａｌＰ（約１７９アミノ酸）、ＣａｌＱ（４５３アミノ酸）、ＣａｌＲ（２６５アミノ酸）、ＣａｌＳ（１１１３アミノ酸）、ＣａｌＴ（２８０アミノ酸）、ＣａｌＵ（３７７アミノ酸）、ＣａｌＶ（１２５アミノ酸）、ＣａｌＷ（４４９アミノ酸）、ＣａｌＸ（１９７アミノ酸）、６ＭＳＡＳ（１９８アミノ酸）、ＡｃｔＩ（２０７アミノ酸）、ＡｃｔＩＩ（１３６アミノ酸）、ＡｃｔＩＩＩ（３０８アミノ酸）、Ｏｒｆ１（３２２アミノ酸）、Ｏｒｆ２（６５４アミノ酸）、Ｏｒｆ３（２０９アミノ酸）、Ｏｒｆ４（５２１アミノ酸）、Ｏｒｆ５（１７５アミノ酸）、Ｏｒｆ６（１３９アミノ酸）、Ｏｒｆ７（１８７アミノ酸）、Ｏｒｆ８（２６６アミノ酸）、ＯｒｆＩ（１２７アミノ酸）、ＯｒｆＩＩ（２４８アミノ酸）、ＯｒｆＩＩＩ（２９８アミノ酸）、ＯｒｆＩＶ（３６３アミノ酸）、ＯｒｆＶ（２８８アミノ酸）、ＯｒｆＶＩ（１０１２アミノ酸）、ＯｒｆＶＩＩ（２３６アミノ酸）、ＯｒｆＶＩＩＩ（４４１アミノ酸）、ＯｒｆＩＸ（５０４アミノ酸）、ＯｒｆＸ（５０４アミノ酸）、ＯｒｆＸＩ（２５１アミノ酸）およびＩＳ−要素（４０２アミノ酸）。
【００４０】
カリケマイシン生合成遺伝子クラスターを解明するにおいて、本発明者らは、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）のゲノムを含むゲノムライブラリーを用いて始めた。ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）の染色体ＤＮＡを分離し、その染色体ＤＮＡを断片化し、ＤＮＡをコスミドベクターに挿入し、当技術分野でよく知られている方法に従ってコスミドライブラリーを生成することによって、コスミドライブラリーを生成した。この手順は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）または他の適当な細菌の任意の種を用いて行うことができる。
【００４１】
従来のエネジン代謝標識化の研究に基づいて、カリケマイシンのアグリコンがポリケタイド由来であることが仮定された。ポリケタイド代謝産物は、生合成の通常のメカニズムをなお共にする莫大な構造的に種々雑多なものを含む。ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ），Ｃ．Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９７， ２５２５−２５３５ （１９９７）；ストロール（Ｓｔｒｏｈｌ），Ｗ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｐｐ． ５７７−６５７；フジイ（Ｆｕｊｉｉ），Ｉ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９７， ２５１１−２５２３ （１９９７）；ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ），Ｄ．Ａ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９７， ２４６５−２４９７ （１９９７）；ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ），Ｄ．Ａ．ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４， ３７−６６ （１９９０）；スタウントン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ），Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９７， ２６１１−２６２９ （１９９７）。最も重要なポリケタイドシンターゼ（「ＰＫＳ」）遺伝子は、高度の配列相同性を示し（経路から経路、生物から生物）、 しばしば自己耐性およびデオキシ糖リガンド生合成をエンコードする遺伝子と共に群生する。ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ），Ｄ．Ａ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９７， ２４６５−２４９７ （１９９７）；ホプウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ），Ｄ．Ａ．ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４， ３７−６６ （１９９０）；スタウントン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ），Ｊ．ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．， ９７， ２６１１−２６２９ （１９９７）。
【００４２】
ＰＫＳ内の保存領域に基づく縮重プライマーを、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に使用して、推定のＰＫＳ遺伝子を有するＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ゲノムライブラリーからクローンを同定した。サザンハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知の方法により行った。タイプＩ ＰＫＳ遺伝子（ＫＳ^Ｉ）を目標とするように設計されたＤＮＡプローブを用いた、ゲノムＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）コスミドライブラリーのサザンハイブリダイゼーション（カカバス（Ｋａｋａｖａｓ），Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９， ７５１５−７５２２ （１９９７））は、クローン４ｂ、１０ａ、１３ａ、５６および６０と呼ばれる５つの正のクローンを明らかにした。図１参照。タイプＩＩＤＮＡプローブ（ａｃｔＩ）を用いてゲノムライブラリーを再スクリーニングすると、同じ５個のクローンがまた同定された。この予備的な分析は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）ＰＫＳ遺伝子の相同体の存在を明らかに証明したが、二次的なスクリーニングを行った。というのは、ＰＫＳハイブリダイゼーション分析はしばしば、胞子の顔料生合成をエンコードする遺伝子クラスターへの間違ったハイブリダイゼーションによって困らされるからである。
【００４３】
第２のスクリーニングは、カリケマイシンの生合成クラスターがまた、デオキシ糖リガンド合成をエンコードする遺伝子を含むという仮定に基づいていた。さらに、多くの生物における高分子−糖合成が同様の共通中間体で始まるので、カリケマイシンの全てのヘキソピラノシルリガンドは、共通中間体４−ケト−６−デオキシＴＤＰ−Ｄ−グルコース（３０）（図５）から分かれた。かくして、カリケマイシン生合成をエンコードするクラスターは、ＰＫＳ−エンコード領域を有することの他に、共通グルコース−１−ホスフェートヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびＮＤＰ−α−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼ遺伝子（それぞれ、推定の酵素Ｅ_ｐｌおよびＥ_ｏｄをエンコードする）の両方を有すると思われた。図５参照。これらの酵素は、糖（１２）（図５）を、仮説を立てられた共通中間体４−ケト−６−デオキシＴＤＰ−Ｄ−グルコース（３０）へ転化するために必要である。４，６−デヒドラターゼの類似体は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から以前に特性決定されていた。その上、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からのヌクレオチドトランスフェラーゼは、アルファ−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼとして特性決定された。二次的スクリーニングは、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）のカリケマイシン合成は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）で見出された同様の前駆体から始まり、この前駆体は、共通中間体４−ケト−６−デオキシＴＤＰ−Ｄ−グルコース（３０）へと転化するのにデヒドラターゼを必要とするという前提に基づいてプローブを用いて行われた。特に、ＤＮＡプローブ（Ｅ_ｏｄ ^Ｉと呼ばれる）は、細菌のＮＤＰ−α−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼの保存されたＮＡＤ^＋−結合部位から設計された。ヒー（Ｈｅ），Ｘ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３５， ４７２１−４７３１ （１９９６）。Ｅ_ｏｄ ^Ｉプローブを用いたゲノムＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）コスミドライブラリーのサザンハイブリダイゼーションは、クローン４ｂ、１０ａ、１３ａ、５６および６０との交差ハイブリダイゼーションを示した。２つの追加のクローン（５８および６６と呼ばれる）がまた、このスクリーンイングで同定された。図１参照。この二次的ハイブリダイゼーションは、ポリケタイドおよびデオキシ糖生合成の両方をエンコードする遺伝子の群生化を示した。
【００４４】
最終的な確証のために、二次的代謝産物生合成は典型的にはアクチノミセテスにおける耐性遺伝子と群生化するので、すべてのハイブリダイゼーション−正のクローンが、種々の濃度のカリケマイシンの存在下で増殖する能力について試験された。この最終的スクリーニングにおいては、７つのハイブリッド形成クローンのうちの６つが、異なるレベルのカリケマイシン耐性を示した（４ｂ＝１０ａ＝１３ａ≧５６≧６６＞６０）（図１参照）が、一方、クローン５８は、カリケマイシンの存在下で増殖する能力を欠いていた。さらに、これらの耐性のスクリーニングは、クローン４ｂ、１０ａ、１３ａが他のクローンよりはるかに高いレベルのカリケマイシン耐性を与えることを示した。カリケマイシン耐性のクローンについてゲノムライブラリーを再スクリーニングすると、３つの追加のクローン（３ａ、４ａおよび１６ａ）が、同様のレベルの耐性を与えることが見出された。漸増的に、結果は、クローン４ｂ、１０ａ、１３ａ、５６および６０がＰＫＳＩおよびＩＩ相同体およびデオキシ糖生合成遺伝子を有し、ならびにカリケマイシン自己耐性を付与する原因である遺伝子をエンコードすることを証明した。
【００４５】
ＰＫＳＩおよびＩＩおよびデオキシ糖生合成相同性ならびにカリケマイシン耐性について正のクローンが、生合成クラスターの位置を決めるために使用された。サザンハイブリダイゼーションは、クローン３ａ、４ａ、４ｂ、１０ａ、１３ａ、１６ａおよび５６間の類似性を確立した。さらに、ヌクレオチド配列の重複が、クローン４ｂ、１３ａおよび５６間に見出された。図１参照。これらのクローンの制限地図作成およびサザンハイブリダイゼーションは、正のコスミドクローンが、＞１００ｋｂの範囲にわたるＭ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）染色体の連続領域に対応することを示した。かくして本発明は、非色素タンパク質エネジン生合成クラスターをエンコードする、ミクロモノスポラ エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの核酸分子を有するコスミドを提供する。
【００４６】
生合成遺伝子クラスターを分離し、配列を解明した後、オープンリーディングフレーム（「ｏｒｆ」）を帰属した。仮の遺伝子帰属は、アミノ酸レベルでの直接ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））データベース検索によって、公知の機能の遺伝子産物に対する翻訳されたｏｒｆのアミノ酸配列類似性から誘導された。カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７， ２２６４−２２６８ （１９９０）；カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０， ５８７３−５８７７ （１９９３）；アルチュル（Ａｌｔｃｈｕｌ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．， ６， １１９−１２９ （１９９４）。遺伝子クラスターの構成が図１に提供される。
ＢＬＡＳＴ分析に基づいて、仮の遺伝子帰属が行われた。特に、アリール四糖部分をエンコードする１５個の遺伝子（２０，９２８ｂｐ；Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｎ、Ｏ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｘ、Ｗ、６ＭＳＡＳ）、アグリコンをエンコードする１２個の推定の遺伝子（１３，２８４ｂｐ；Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、ＡｃｔＩ、ＡｃｔＩＩ、ＡｃｔＩＩＩ、ＯｒｆＩ、ＯｒｆＩＩＩ、ＯｒｆＶ、ＯｒｆＶＩ、ＯｒｆＶＩＩ）、膜輸送、調節、ＤＮＡ移動および／または耐性に関連する１３個の推定の遺伝子（１９，７０４ｂｐ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ｏｒｆ４、ｏｒｆ８、ＯｒｆＶＩＩＩ、ＯｒｆＩＸ、ＯｒｆＸ、ＯｒｆＸＩ、ＩＳ−要素）ならびに、未知の機能の残部８個の遺伝子（７３８３ｂｐ；ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ＯｅｆＩＩ、ＯｒｆＩＶ）がある。
【００４７】
本発明の１つの態様は、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換に関する。この方法は、ｐＫＣ１１３９に基づくベクターを用いて〜１０^３カナマイシン耐性形質転換体／ｇＤＮＡの再生可能な形質転換効率を提供する。本発明はさらに、宿主細胞が、限定されることはないが、細菌、酵母、菌類、昆虫、植物または哺乳動物であることができることを提供する。細菌、酵母、菌類、昆虫、植物または哺乳動物の細胞の形質転換は、当技術分野で公知の方法によって行われる。
【００４８】
本発明はまた、カリケマイシン耐性に関連するポリペプチドをエンコードする遺伝子、例えばｏｒｆＸＩおよびｃａｌＣの分離および特性決定を提供する。本発明の１つの態様は、遺伝子ｃａｌＣを有し、かつＤＮＡ配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ：１を有する、分離されたＤＮＡ鎖に関する。本発明はまた、アミノ酸配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．２を有する分離されたタンパク質ＣａｌＣに関する。本発明はさらに、生物活性なＣａｌＣポリペプチドをコードするｃａｌＣ遺伝子断片を提供する。ポリペプチドＣａｌＣはカリケマイシン耐性を付与し、１８１個のアミノ酸を有する。本発明はまた、カリケマイシン耐性を付与するＣａｌＣ断片を提供する。
【００４９】
アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）およびカリケマイシンを含むルリア ベルタニ（ｌｕｒｉａ ｂｅｒｔａｎｉ）（「ＬＢ」）寒天プレートで増殖することができたカリケマイシンゲノムコスミドクローンを同定することによって、ｃａｌＣ座が分離された。正のクローン（カリケマイシンを含むプレートで増殖したクローン）のＤＮＡを分離し、次の制限地図作成は、所望の表現型（カリケマイシン耐性）を局在化した。次にＤＮＡを配列決定し、オープンリーディングフレームを分析して、所望の表現型をエンコードするｏｒｆを確かめた。イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の研究をまた行い、ＤＮＡ開裂を抑制するＣａｌＣの能力を確認した。
【００５０】
公知の方法を用いて、ｃａｌＣを含むＤＮＡを誘発性ベクターへクローン化し、ｃａｌＣの過剰発現を生じた。次にポリペプチド生成物（ＣａｌＣ）を分離し、精製して均質化した。精製したＣａｌＣの分析は、カリケマイシン誘導のイン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＤＮＡ開裂の抑制によって機能する非ヘム鉄金属タンパク質であることを示した。本発明の別の態様は、ｃａｌＣまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＣの断片を含む発現ベクターである。ｃａｌＣまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＣの断片を含む、形質転換された宿主細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）がまた提供される。そのようなｃａｌＣのトランスジェニック発現は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）において１０^５倍のカリケマイシン耐性の増加、Ｓ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）において１００倍の耐性の増加、および酵母において５０倍の耐性の増加をもたらす。
【００５１】
本発明は、ｃａｌＣ遺伝子を用いたヒト細胞の形質転換を提供する。ＨＴ１０８０（ヒト）細胞系におけるｃａｌＣのトランスジェニック発現は、そのカリケマイシンに対する耐性を１０倍増加させた。この技術は、例えば骨髄細胞を、カリケマイシンで治療されている患者から除去し、これらの細胞をｃａｌＣで形質転換し、形質転換した細胞を患者に戻すことを可能にする。戻されたヒト−ｃａｌＣ−形質転換細胞がカリケマイシン耐性を有するので、このことは、患者をカリケマイシンでの治療に耐性にし、患者がより高い投与量のカリケマイシンを受けるのを可能にする。形質転換は当技術分野で公知の方法によって行われる。本発明の実施態様は、カリケマイシンで治療される多くの疾患に適用可能であろう。
【００５２】
本発明はさらに、カリケマイシン誘導のＤＮＡ開裂をアッセイする方法および分子破壊光アッセイを用いたそのＣａｌＣが仲介する抑制の方法を提供する。実験のために２つの分子破壊光（ＭＬＢ）が実施例７に記載されている。破壊光Ａは、公知のカリケマイシン認識配列５’−ＴＣＣＴ−３’を含む１０−塩基対幹からなり、一方、破壊光Ｂは、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ認識配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。両プローブの５’−蛍光運搬体は、フルオレセイン（ＦＡＭ、吸収_極大＝４８５ｎｍ、放射_極大＝５１７ｎｍ）であり、対応する３’−消光剤は、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であった。一般に、ＭＬＢは蛍光運搬体−消光剤対の分離により作動し、対応する蛍光信号を生じる。分子破壊光は、図１３に示されるように、特異的な酵素的もしくは非酵素的ヌクレアーゼ活性による幹の開裂によって作動し、蛍光運搬体−消光剤対の分離および対応する蛍光信号を生じる（図１４参照）。２倍モル過剰のカリケマイシンのＣａｌＣは、破壊光アッセイによって監視されるように、カリケマイシンが仲介するＤＮＡ開裂を完全に破壊する（図１５参照）。
【００５３】
ＣａｌＣは「開裂シンク（ｓｉｎｋ）」として働く。本質において、タンパク質は、所望のＤＮＡ標的に対する代替として開裂される。かくして、本発明は、開裂剤に対する耐性のための最初のそのような証明されたメカニズムを提供し、なぜＣａｌＣが、ある程度まで試験した全ての生物（すなわち、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、Ｓ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）、酵母およびヒト）において機能することができるかを説明する。
本発明はさらに、その製造中にカリケマイシンの力価を決定するために破壊光アッセイの使用を提供する。その上、分子破壊光アッセイは、本発明の技術を用いて生成されるカリケマイシン類似体のＤＮＡ開裂活性を決定するために使用できる。
【００５４】
本発明の別の態様は、ＤＮＡ配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ：３を有するｃａｌＨ遺伝子を含む分離されたＤＮＡ鎖に関する。本発明はまた、アミノ酸配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．４を有するポリペプチドＣａｌＨに関する。本発明はさらに、生物活性なＣａｌＨをコードするｃａｌＨ遺伝子断片を提供する。ＣａｌＨは、アリール四糖４，６−ジデオキシ−４−ヒドロキシルアミノ−Ｄ−グルコース部分の形成に関連する。ＣａｌＨは、中間体（３０）の中間体（３９）への転化を触媒する（図５）。ＣａｌＨは、ＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グリセロール−Ｌ−トレオ−４−ヘキスロース４−トランスアミナーゼであり、これは、グルタメートからのピリドキサールホスフェート（「ＰＬＰ」）−依存性アミノ基転移を触媒して、４−アミノ−６−デオキシＴＤＰ−Ｄグルコース（中間体３９）（図５）を提供する。本発明はまた、生物活性を保持するＣａｌＨ断片を提供する。ｃａｌＨ遺伝子または生物活性なポリペプチドをエンコードするｃａｌＨ遺伝子の断片を含む発現ベクターがまた提供される。ＣａｌＨは、（ヒスチジン）_１０−融合タンパク質として過剰発現され、次いでニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
【００５５】
ＢＬＡＳＴ分析によれば、ＣａｌＨは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）におけるＴＤＰ−ペロサミン（ＴＤＰ−４，６−ジデオキシ−４−アミノ−Ｄ−マンノース）の生合成の途上で、化合物３０を化合物３９へと転化する（図５）酵素であるペロサミン（ｐｅｒｏｓａｍｉｎｅ）シンターゼに非常に似ている。ワン（Ｗａｎｇ），Ｌ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６６， ３５４５−３５５１ （１９９８）。かくして、ＣａｌＨは、４−ケトヘキソースアミノトランスフェラーゼであると考えられる。仮のＢＬＡＳＴ帰属した機能を確認するために、組合せ生合成を行った。特に、カリケマイシンからのｃａｌＨ遺伝子を、ストレプトミセス ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）の変異体株へ組み込んだ。メチマイシン／ピクロマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ／ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）経路における４−デヒドラーゼ遺伝子（ｄｅｓ１）を、この変異体株において欠損させた。Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）からのプロモーター配列メチマイシン／ピクロマイシンクラスターを発現ベクターに組み込んで、Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）において外来遺伝子（カリケマイシンのｃａｌＨ）を発現させた。野生型Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）においては、メチマイシン／ピクロマイシン経路は、メチマイシン、ネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）、ピクロマイシンおよびナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｓｉｎ）を生じることが知られている。図６参照。変異体株におけるｄｅｓ１遺伝子の欠損は、ＣａｌＨ基質、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース（化合物３０、図６）の蓄積をもたらした。Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）のプロモーターを用いて構築された発現ベクターは、ｃａｌＨ遺伝子を発現して、ＣａｌＨタンパク質を作った。ＣａｌＨは基質３０に作用して、化合物３９を生成した（図６）。化合物３９は今度は、Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）のＤｅｓＶＩＩ（グリコシルトランスフェラーゼ）の作用で、２つのメチマイシン／ピクロマイシン−カリケマイシンハイブリッド化合物を生成した。図６、化合物４０および４１参照。これらのハイブリッド化合物は、カリケマイシンの４−アミノヘキソースリガンドを有する。この研究は、カリケマイシン経路のＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｌ−トレオ−４−ヘキスロース４−アミノトランスフェラーゼをエンコードするように、ｃａｌＨ遺伝子の帰属に明白な支持を提供する。ＣａｌＨは、ＴＤＰ−４−ケト−デオキシグルコース基質（化合物３０）に作用して、化合物３９を生じた（図５）。
【００５６】
さらに、ＣａｌＨは、生成物のＨＰＬＣ分離および高分解能マススペクトル法による確認によって証明したように、生成物ＴＤＰ−４，６−ジデオキシ−アルファ−Ｄ−グルコースの合成を直接仲介することができる。その上、この化合物は、化学的に合成されたＴＤＰ−４−アミノ−４，６−ジデオキシ−アルファ−Ｄ−グルコースと同時溶出されることがわかった。
【００５７】
さらに、これらの結果は、Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、その構造が本来のアミノ糖基質ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンとは著しく異なる代替の糖基質を認識することができることを示したので、対応するグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）の雑多な性質を補強する。結果はまた、遺伝子の組合せの理にかなった選択によって二次的代謝産物のグリコシル化を操作する能力を明らかに証明する。新たに構築された発現ベクターによるＳ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）におけるＣａｌＨタンパク質の成功裏の発現は、この株において他の外来の遺伝子を発現するためにこの系を使用することの可能性を強調する。
【００５８】
かくして、本発明の１つの態様はさらに、非天然の糖を作り、付加する能力を有する複合遺伝子クラスターの構築に関する。本発明はさらに、カリケマイシンタンパク質の発現を制御するために、調節配列に動作可能に結合されたカリケマイシン遺伝子を有する発現ベクターを提供し、好ましくは、調節配列はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーターである。本発明はまた、２つの新たに合成された糖、化合物（１１）および化合物（１２）（図７）に関する。化合物（１１）は式：
【化６】

を有する。
【００５９】
化合物（１１）のスペクトルデータは、以下のようであった：
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ ＣＤＣｌ_３、ヘルツで表したＪ）δ６．７５ （ＩＩＩ， ｄｄ， Ｊ＝１６．０， ５．５， ９−Ｈ）， ６．４４（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．０， １．２， ８−Ｈ）， ５．３４（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．０， Ｎ−Ｈ）， ４．９６（１Ｈ， ｍ， １１−Ｈ）， ４．２７（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．５， １−Ｈ）， ３．６６（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．５， ８．０， ４’−Ｈ）， ３．６０（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１０．５， ３−Ｈ）， ３．５０（１Ｈ， １， Ｊ＝９．５， ３’Ｈ）， ３．^ｄ（１Ｈ， ｍ， ５’−Ｈ）， ３．４（１Ｈ， ｍ， ２’−Ｈ）， ２．８４（１Ｈ， ｄｑ， Ｊ＝１０．５， ７．５， ２−Ｈ）， ２．６４（１Ｈ， ｍ， １０−Ｈ）， ２．５３（１Ｈ， ｍ， ６−Ｈ）， ２．０６（３Ｈ， ｓ， Ｍｅ−Ｃ＝Ｏ）， １．７（１Ｈ， ｍ， １２−Ｈ）， １．６６（１Ｈ， ｍ， ５−Ｈ）， １．５６（１Ｈ， ｍ， １２−Ｈ）， １．４（１Ｈ， Ｍ， ５−Ｈ）， １．３６（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．５， ２−Ｍｅ）， １．２５（３１１， ｄ， Ｊ＝６．５， ５’−Ｍｅ）， １．２４（１Ｈ， ｍ， ４−Ｈ）， １．２１（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．５， ６Ｍｅ）， １．１０（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．５， １０−Ｍｅ）， ０．９９（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．０， ４−Ｍｅ）， ０．９１（３Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．２， １２−Ｍｅ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ２０５．３（Ｃ−７）， １７５．１（Ｃ−１）， １７１．９（Ｍｅ−Ｃ−Ｏ）， １４７．１（Ｃ−９）， １２６．１（Ｃ−８）， １０３．０（Ｃ−１’）， ８５．８（Ｃ−３）， ７５．８（Ｃ−５’）， ７５．８（Ｃ−３’）， ７４．１（Ｃ−１１）， ７０．８（Ｃ−２’）， ５７．６（Ｃ−４’）， ４５．３（Ｃ−６）， ４４．０（Ｃ−２）， ３８．１（Ｃ−１０）， ３４．２（Ｃ−５）， ３３．６（Ｃ−４）， ２５．４（Ｃ−１２）， ２３．７（Ｍｅ−Ｃ−Ｏ）， １８．１（Ｃ−６’）， １７．９（６Ｍｅ）， １７．６（４−Ｍｅ）， １６．４（２−Ｍｅ）， １０．５（１２−Ｍｅ）， ９．８（１０−Ｍｅ）。
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；Ｃ_２５Ｈ_４２−ＮＯ_８（Ｍ＋Ｈ^＋）についての計算値４８４．２９１０、測定値４８４．２３０３。
【００６０】
化合物１２は、式：
【化７】

を有する。
【００６１】
化合物（１２）のスペクトルデータは、以下のようであった：
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ ＣＤＣｌ_３、ヘルツで表したＪ）δ６．６９（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．０， ６．０， １１−Ｈ）， ６．０９（１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１６．０， １．５， １０−Ｈ）， ５．３５（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝８．５， Ｎ−Ｈ）， ４．９６（１Ｈ， ｍ， １３−Ｈ）， ４．３６（１Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．５， １’Ｈ）， ４．１９（１Ｈ， ｍ， ５−Ｈ）， ３．８３（１Ｈ−ｑ， Ｊ＝６．５， ２−Ｈ）， ３．６８（１Ｈ， ｄｔ， Ｊ＝１０．０， ８．５， ４’Ｈ）， ３．５２（１Ｈ， ｔ， Ｊ＝８．５， ３−‘Ｈ）， ３．５０（１Ｈ， ｍ， ５−Ｈ）， ３．４２（１Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．５， ２’−Ｈ）， ２．９２（１Ｈ， ｄｑ， Ｊ＝７．０， ５．０， ４−Ｈ）， ２．８１（１Ｈ， ｍ， ８−Ｈ）， ２．７３（１Ｈ， ｔ， Ｊ＝７．５， ２’−Ｈ）， ２．０６（３Ｈ， ａ， Ｍｅ−Ｃ−Ｏ）， １．８（１Ｈ， ｍ， ６−Ｈ）， １．６（１Ｈ， ｍ， １４−Ｈ）， １．５５（１Ｈ， ｍ， ７−Ｈ）， １．３７（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．５， ２−Ｍｅ）， １．３２（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７．０， ４−Ｍｅ）， １．３（１Ｈ， ｍ， Ｈ−１４）， １．２７（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．５， ５’−Ｍｅ）， １．２５（１Ｈ， ｍ， ７−Ｈ）， １．１２（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．０， ８−Ｍｅ）， １．１１（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．５， １２−Ｍｅ）， １．０７（３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．０， ６−Ｍｅ）， ０．９１（３Ｈ， １， Ｊ＝７．２， １＋Ｍｅ）；高分解能ＦＡＢ−ＭＳ；Ｃ_２８Ｈ_４６−ＮＯ_２（Ｍ＋Ｈ^＋）についての計算値５４０．３１７２、測定値５４０．３２０３。
【００６２】
本発明の１つの態様は、ｃａｌＧ遺伝子を含み、ＤＮＡ配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ：５を有する分離されたＤＮＡ鎖に関する。本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．６を有するタンパク質ＣａｌＧである。ＢＬＡＳＴ分析によれば、ｃａｌＧは、４，６−デヒドラターゼをエンコードする。デヒドラターゼは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびストレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から特性決定され（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ），Ｍ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １３８， ７７９−７８６ （１９９２）；バラ （Ｖａｒａ），Ｊ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３， １４９９２−１４９９５ （１９８８））、類似のＮＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼは種々の生物から特性決定された。リウ（Ｌｉｕ），Ｈ．−ｗ．，ら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｂｉｏｌ．， ４８， ２２３−２５６ （１９９４）；ハリス（Ｈａｌｌｉｓ），Ｔ．Ｍ．ら、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， 印刷中（１９９９）。これらの以前の研究に基づいて、４，６−デヒドラターゼにより触媒される全般的な形質転換は、分子内酸化−還元反応であり、ここでは、酵素−結合したＮＡＤ^＋が、酸化的半反応において水素化物として４−Ｈを受け取り、還元的半反応において脱水生成物のＣ−６に還元当量をわたすことが知られていた。かくして、アリール四糖４，６−ジデオキシ−４−ヒドロキシルアミノ−Ｄ−グルコース部分の形成にＣａｌＧが必要であることが明らかである。ＣａｌＧは、中間体１３の中間体３０への転化（図５参照）を触媒するＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼであると思われる。本発明の別の態様は、ｃａｌＧまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＧの断片を含む発現ベクターである。ｃａｌＧまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＧの断片を含む、形質転換された宿主細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）がまた提供される。
【００６３】
さらには、生成物が、塩基性条件下で３２０ｎｍにて吸収することが知られているアッセイによって証明されるように、ＣａｌＧは、生成物ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−アルファ−Ｄ−グルコースの合成を直接仲介することができる。その上、この化合物は、化学的に合成されたＴＤＰ−４−ケト−６−ジデオキシ−アルファ−Ｄ−グルコースと同時溶出されることがわかった。ＣａｌＧは、ＵＤＰ−グルコースを基質として使用することが証明された。
【００６４】
ｃａｌＳ遺伝子を含む分離されたＤＮＡ鎖がまた開示される。他のＰ４５０−オキシダーゼとの配列相同性に基づいて、ＣａｌＳは、中間体３９の中間体４２への酸化（図５）を行うＰ４５０−オキシダーゼ相同体であると思われる。酸化は、糖がアグリコンに変えられた後、ヌクレオチド糖レベルで、またはヒドロキシルアミン形成において生じ得る。ｃａｌＳ遺伝子または生物活性な分子をエンコードするｃａｌＳの断片を含む発現ベクターがまた提供される。ｃａｌＧまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＧの断片を含む、形質転換された宿主細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）がまた提供される。
【００６５】
ｃａｌＱ遺伝子を含む分離されたＤＮＡ鎖がまた開示される。配列相同性に基づいて、ＣａｌＱは、ＵＤＰ−Ｄ−グルコース−６デヒドロゲナーゼ相同体であると思われる。ＣａｌＱのアッセイは、活性のために２当量のＮＡＤ＋をこの酵素が必要とすることに基づく。かくして、アッセイは、（ＵＤＰ−アルファ−Ｄ−グルコースがＵＤＰ−アルファ−Ｄ−グルクロン酸へ転化されると、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの転化の結果としての）吸収の増加に基づいていた。生成物はまた、市販されていて入手可能なＵＤＰ−グルクロン酸と同時溶出されることがまた示され、高分解能マススペクトル法で別々に確認された。この酵素は、ＴＤＰ−グルコースを使用することがまた示された。
【００６６】
ｃａｌＱ遺伝子または生物活性な分子をエンコードするｃａｌＱの断片を含む発現ベクターがまた提供される。ｃａｌＱまたは生物活性な分子をエンコードするｃａｌＱの断片を含む、形質転換された宿主細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）がまた提供される。
【００６７】
本発明は、カリケマイシン類似体を製造するために、生合成遺伝子クラスターの遺伝子操作を可能にする。本発明は、アリール四糖の生合成に関連する遺伝子の欠損または置換を構成することによるカリケマイシン類似体の製造を提供する。本発明はさらに、さらなる類似体を製造するために、（グリコシルトランスフェラーゼにより）カリケマイシンのグリコシル化の型を変えることによって、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のグリコシル化を提供する。本発明はまた、弾頭の生合成をエンコードする遺伝子の遺伝子操作によるカリケマイシンのアグリコンの変更を提供する。遺伝子操作、例えば欠損または置換の生成は、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
【００６８】
本発明は、アフィニティクロマトグラフィーによってカリケマイシンを精製する方法を提供する。カリケマイシンとの相同性の故に、ＣａｌＣは、カリケマイシン−封鎖／結合タンパク質として機能する。アフィニティクロマトグラフィーは、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。
【００６９】
本発明は、遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子を調節配列に動作可能に結合して、挿入された遺伝子によりエンコードされるタンパク質を生成する遺伝子の発現を制御するために、当技術分野で公知の方法を用いることによる、生合成遺伝子クラスターに位置する遺伝子の発現に関する。本発明はまた、当技術分野で公知の方法を用いて、生物学的に活性なタンパク質をエンコードする生合成遺伝子クラスターから選択される遺伝子の断片を、適当な発現ベクターに挿入することによって、生物学的に活性なタンパク質の発現を提供する。遺伝子は、その発現を制御するために、調節配列に動作可能に結合される。
【００７０】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という語は一般に、プローブ配列および標的配列の性質に依存して、当業者に容易に明らかであろうストリンジェンシーの適当な条件下での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当技術分野でよく知られており、インキュベーション時間、温度および／または溶液のイオン強度を変えることによって、所望のストリンジェンシーに依存して、条件の調整が容易に達成される。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、分子クローニング：実験室便覧（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド スプリング ハーバー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド スプリング ハーバー （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８９年参照。条件の選択は、ハイブリッド形成される配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的Ｇ−Ｃ含量および許されるべきミスマッチの量によって決まる。少ない程度の相補性を有する鎖間で部分的ハイブリダイゼーションが望まれるときには、低ストリンジェンシー条件が望ましい。完全な、またはほぼ完全な相補性が望まれるときには、高ストリンジェンシー条件が望ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件のためには、ハイブリダイゼーション溶液は、６ｘ Ｓ．Ｓ．Ｃ．、０．０１ＭのＥＤＴＡ、１ｘ デンハート溶液および０．５％ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーションは、約６８℃にて、クローン化されたＤＮＡの断片については約３〜４時間、全真核生物のＤＮＡについては約１２〜１６時間行われる。低ストリンジェンシーのためには、ハイブリダイゼーションの温度は、二重鎖の溶融温度（ＴＭ）より約１２℃下に下げられる。ＴＭは、Ｇ−Ｃ含量および二重鎖の長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００７１】
本明細書で使用されるように、「実質的配列同一」または「実質的相同性」という語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、他のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列と実質的な構造もしくは機能の等価性を示すことを表すために使用される。実質的配列同一または実質的相同性を有する配列間の任意の構造もしくは機能の差異は些事であり、すなわち、所望の用途において示されるように配列が機能する能力に実質的に影響を及ぼさない。差異は、例えば異なる種間のコドン使用法における固有の変更によるものであり得る。２つ以上の異なる配列間に有意量の配列重複または類似性があるなら、または異なる配列が同様の物理的特徴を示すなら、配列の長さもしくは構造が異なるとしても、構造的な差異は些事であると考えられる。そのような特徴は、例えば、規定された条件下でハイブリッド形成を行う能力、またはタンパク質の場合には、免疫学的交差反応性、同様の酵素活性等を含む。
【００７２】
さらに、配列が、少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは約９０％の配列類似性をそれらの間に有するなら、２つのヌクレオチド配列は、「実質的に相補的」である。少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約７０％の類似性をポリペプチドの活性部分間に有するなら、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
【００７３】
本明細書で使用されるように、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の「対応部分にハイブリダイズする」という表現は、ハイブリッド形成する分子、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは任意のヌクレオチド配列が（センスまたはアンチセンス配向で）、ほぼ同じ大きさで、適当な条件下でハイブリダイゼーションを行うのに十分な配列類似性をそれに有する別の核酸分子の配列を認識し、かつハイブリッド形成することを意味する。「対応部分」がそれにハイブリッド形成する分子より小さいかまたは大きい、例えば２０〜３０％大きいか小さい、好ましくはわずか約１２〜１５％大きいか小さくあり得るように、「対応部分」の大きさは、ハイブリダイゼーションにおける幾らかのミスマッチを見込むことを理解すべきである。
【００７４】
ヌクレオチド配列（またはポリ−もしくはオリゴヌクレオチド）の「機能的誘導体」という語は、関心のあるヌクレオチド配列の、または関心のあるペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の断片、変異体、相同体または類似体を意味するためにここで使用される。機能的誘導体は、アミノ酸の代替コドンを含み得るか、またはヌクレオチドによってエンコードされたペプチドの関心のある機能を実質的に変えない異なるアミノ酸をコードし得る。機能的誘導体は、関心のあるヌクレオチド配列の、または関心のあるペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の機能の少なくとも一部を保持することができ、この機能は、本発明に従いその有用性を許容する。そのような機能は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つとハイブリッド形成する能力；ＤＮＡが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つまたはその機能的誘導体をエンコードする別の生物からの実質的に相同のＤＮＡと、またはそのｍＲＮＡ転写物とハイブリッド形成する能力；または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５等の機能的誘導体であるタンパク質をエンコードする能力を含み得る。
【００７５】
遺伝子またはヌクレオチド配列の「断片」は、分子の任意のサブセット、例えばより短いポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。「変異体」は、全遺伝子またはその断片と実質的に類似の分子、例えば１つ以上の置換されたヌクレオチドを有するヌクレオチド置換変異体であるが、特定の遺伝子とハイブリッド形成する能力または本来のＤＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡ転写物をエンコードする能力を維持する分子をいう。「相同体」は、異なる属または種からの断片または変異体配列をいう。「類似体」は、全分子、その変異体もしくは断片と実質的に同様であるか、またはそれに関連して機能する、非天然の分子をいう。
【００７６】
本明細書において記載されたタンパク質の「機能的誘導体」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つの断片、変異体、類似体または化学的誘導体であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つの活性の少なくとも一部を保持するものであるか、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つに特異的な抗体と免疫学的に交差反応性を保持するものである。本明細書で使用されるように、タンパク質の断片は、分子の任意のサブセットをいう。変異体ペプチドは、例えば当技術分野でよく知られている方法を用いて、直接化学合成によって作ることができる。タンパク質の類似体は、全タンパク質またはその断片と実質的に同様の非天然のタンパク質をいう。本明細書で使用されるように、タンパク質の化学的誘導体は、通常ペプチドの一部またはペプチド断片でない、さらなる化学的部分を含むことができる。ペプチドの目標とするアミノ酸残基を、選ばれた側鎖もしくは末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることによって、変性を、ペプチドまたはその断片に導入することができる。
【００７７】
本発明に従うタンパク質またはペプチドは、（センス配向で）本発明のヌクレオチド配列で形質転換された細胞を培養し、細胞にタンパク質を合成させ、次いで、使用したクローン化プロトコールに依存して遊離のタンパク質としてかまたは融合タンパク質として、培養培地もしくは細胞抽出物からタンパク質を分離することによって製造することができる。あるいは、タンパク質は、細胞を含まない系で製造することができる。ラヌ（Ｒａｎｕ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６０：４５９−４８４， （１９７９）。
【００７８】
上記の開示から認識できるように、本発明は、広範囲の適用を有する。したがって、以下の実施例は、説明のために与えられるものであり、限定のためではない。
【００７９】
実施例
実施例１
ヌクレオチド配列を迅速に解明するために、（Ｍ１３プライマーおよびプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ ｗａｌｋｉｎｇ）を用いた）ｐＵＣ−もしくはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくサブクローンから、ならびに（プライマーウォーキングにより）分離したコスミドから直接、熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅ）配列決定を達成した。ヌクレオチド配列データは、２つのアプライド バイオシステムズ オートメーテッド３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ３１０）遺伝子アナライザーを用いて得、次に配列をアプライド バイオシステムズ オートアセンブラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ）（商標）ＤＮＡ配列構築ソフトウェアを用いて構築した。ディア（Ｄｅａｒ），Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４， ３９０７−３９１１ （１９９１）；ファン（Ｈｕａｎｇ），Ｘ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １４， １８−２５ （１９９２）。Ｏｒｆの帰属は、コンピュータ使用プログラムＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）６．０およびブルージーン（Ｂｒｕｊｅｎｅ）の組合せを用いて達成した。ＭａｃＶｅｃｔｏｒは、（公知のミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）配列から）ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）コドンバイアス表を構築し、次いで、このコドンバイアス表を用いて最適ｏｒｆを検索する能力を提供する、市販されていて入手可能なソフトウェアパッケージである。フィケット（Ｆｉｃｋｅｔｔ），Ｊ．Ｗ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １０， ５３０３−５３１８ （１９８２）。あるいは、シェアウェアプログラムのブルージーン（Ｂｒｕｊｅｎｅ）は、ストレプトミセテス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）のために特に設計されたものであり、ゆらぎ位置に高整合性Ｇ／Ｃ％を示すｏｒｆに優先性を与える。
【００８０】
実施例２： ｃａｌＣ の分離および特性決定
ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）におけるカリケマイシン耐性の原因である遺伝子を分離するために、カリケマイシン耐性を付与するクローンを、アンピシリン（５０μｇ ｍｌ^−１）およびカリケマイシン（０．２５μｇ ｍｌ^−１）を含むＬＢプレートでの、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）ゲノム２価コスミドライブラリーの増殖によって選択した。この選択において、６つのクローン（３ａ、４ａ、４ｂ、１０ａ、１３ａおよび１６ａ）が、カリケマイシン耐性を示した。これらのクローンの制限地図作成によって、所望の表現型をＤＮＡの−２ｋｂ ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片に局在化させた（図２）。ＬＢプレートでのカリケマイシンの最大許容濃度を確かめた。結果は以下のようである：
【００８１】
【表１】

【００８２】
ＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片のヌクレオチド配列分析は、それが２つの可能なｏｒｆを含むことを示唆した。この断片の近位の１ｋｂは、単一のｏｒｆ ｃａｌＤを有しており、一方、遠位の１ｋｂはｏｒｆ ｃａｌＣを示した。ｃａｌＣのコンピュータを使用した翻訳およびその後のＢＬＡＳＴ分析は公知のタンパク質との相同性を示さず、一方、ｃａｌＤのそれぞれのタンパク質ＣａｌＤへの翻訳は、典型的にはＳ−アデノシルメチオネイン−使用Ｏ−メチルトランスフェラーゼに保存された３つのアミノ酸モチーフの存在を示した。したがって、ｃａｌＤはカリケマイシン耐性の原因でないという仮説が立てられた。カリケマイシン耐性の原因であるというｃａｌＤの可能性を除外するために、サブクローンを作って（ｐＪＴ１２２４）、無傷のｃａｌＤを含ませたが、端を切り取ったｃａｌＣ遺伝子は含ませなかった。このサブクローンは、カリケマイシン耐性を付与しなかった。次に、ｃａｌＣ領域を含むサブクローンを構築した（ｐＪＴ１２３２）。このクローンは、先のチャートに示したように、カリケマイシン耐性を付与した。
【００８３】
ＣａｌＣのアミノ酸配列を確かめ、その特性を知るために、ｃａｌＣをｐＭＡＬ−Ｃ２ベクターへクローン化した（ｐＭＡＬ−Ｃ２はそれ自体、カリケマイシン耐性を付与することができなかった。上記チャート参照）。ｃａｌＣを含む得られたプラスミドｐＲＥ７は、カリケマイシン耐性を付与した。上記チャート参照。次にプラスミドｐＲＥ７をイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）で誘導して、ＣａｌＣを過剰発現させた。誘導されたｐＲＥ７はカリケマイシン耐性を付与し、マルトース−結合タンパク質ＣａｌＣ融合タンパク質（ｍｂｐ−ＣａｌＣ）を生成した。この得られたＣａｌＣの過剰発現は、カリケマイシン耐性をイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で１０^２倍増加させた。上記チャート参照。
【００８４】
実施例３：タンパク質 ＣａｌＣ の発現
タンパク質ｍｂｐ−ＣａｌＣを過剰発現させ、さらなる分析のために精製した。ｍｂｐ−ＣａｌＣは、ｐＲＥ７／大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判定される均質性まで精製した。１晩のＬＢ培養物（新鮮なｐＲＥ７／大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）コロニーからの５０ｍｇｍｌ^−１のアンピシリンおよび５０ｎｇ ｍｌ^−１のカリケマイシンを含む）は、３７℃、２５０ｒｐｍにてＡ_６００＝０．５まで増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、増殖を１晩続けた。細胞を集め（４，０００ ｘ ｇ、４℃、２０分間）、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、超音波により破壊した。細胞破砕物を遠心分離（５，０００ ｘ ｇ、４℃、２０分間）により除去した。上清をアミロースアフィニティカラム（１．５ ｘ ７．０ ｃｍ、１ｍＬ 分^−１）に施用した。所望のｍｂｐ−ＣａｌＣタンパク質を、１０ｍＭのマルトースを含む緩衝液Ａで溶出した。溶出物を濃縮し、Ｓ−３００カラムでのクロマトグラフィーにかけた（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ）。活性画分を直ちに使用するか、または貯蔵のために−８０℃で凍結した。
【００８５】
実施例４： ＣａｌＣ のカリケマイシン耐性の検証
カリケマイシンが二重鎖ＤＮＡ開裂をもたらし、ＣａｌＣがイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でカリケマイシン耐性を提供することが与えられたので、ＣａｌＣをイン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のカリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂アッセイに添加すると、ＤＮＡ開裂を抑制することが予想された。この理論を試験するために、テンプレートとしてスーパーコイルｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ（「ｐＢＳ」）および、還元的開始剤としてジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）を用いて、予備的アッセイを行った。典型的アッセイにおいては、精製ｍｂｐ−ＣａｌＣ（１５．０ｎＭ）および３０．０ｎＭのカリケマイシンを、全容積２５μＬの４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５中で３７℃にて１５分間プレインキュベートした。次に、２．５μＬの１０ｍＭのＤＴＴストック溶液をアッセイ溶液に加え、アッセイをさらに１時間３７℃にてインキュベートした。臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲルでの電気泳動によって、ＤＮＡ断片化を評価した。このアッセイを用いると、ｍｂｐ−ＣａｌＣが、カリケマイシン１０^３倍過剰付近の濃度で、カリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂を完全に抑制できることがわかった。ｍｂｐ−ＣａｌＣおよびＤＴＴのプレインキュベーション、強制透析によるタンパク質除去および次の還元剤としてＤＴＴ溶液の使用は、ＤＮＡ開裂の量に顕著には影響を与えなかった。
【００８６】
図４（ｂ）に示したように、ＤＴＴまたはカリケマシン不在下ではＤＮＡ開裂は観察されなかった（レーンａおよびｂ）が、一方、ＤＴＴおよびカリケマシンの存在下では有効な開裂が証明された（レーンｃ）。予想されたように、ｍｂｐ−ＣａｌＣの添加は、カリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂を完全に抑制し（レーンｆ）、対照としてｍｂｐ単独の添加（レーンｄ）は、カリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂の抑制に失敗した。さらに、ｍｂｐ−ＣａｌＣとＤＴＴ（示さず）、またはａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣ（Ｆｅ補因子を欠く）（レーンｅ）のプレインキュベーションはまた、カリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂の抑制に失敗した。しかしながら、Ｆｅ^＋２またはＦｅ^＋３のａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣアッセイへの添加は、ＣａｌＣ活性を再構成することができた（レーンｇ）。ａｐｏ−ｍｂｐ−ＣａｌＣの再構成は、先に記載したように、活性アッセイの前に１ｍＭのＦｅＳＯ_４（Ｆｅ^＋２）またはＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^＋３）とのプレインキュベーションによって達成した。
【００８７】
実施例５：メチマイシン／ピクロマイシン − カリケマイシンハイブリッド化合物の製造
コスミド１３ａの７．０ｋｂのＫｐｎＩ断片を含むサブクローンである、ｐＪＳＴ１１９２_ｋｐｎ７からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって１．２ｋｂのｃａｌＨ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、発現ベクターｐＤＨＳ６１７のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位へクローン化した。この発現ベクターは、アプラマイシン耐性マーカーを含む。プラスミドｐＤＨＳ６１７は、ｐＯＪ１４４６から誘導した（ビアマン（Ｂｉｅｒｍａｎ），Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ １９９２， １１６， ４３−４９）。Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）のメチマイシン／ピクロマイシンクラスターからのプロモーター配列をプラスミドに組み込んで、Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）で外来遺伝子を発現させた。得られたプラスミドｐＬＺ−Ｃ２４２（ｃａｌＨ遺伝子挿入断片およびプロモーター配列を含む）を、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１を用いた接合転移（ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって、先に構築したＳ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）の変異体ｄｅｓＩに導入した（ボリソバ（Ｂｏｒｉｓｏｖａ），Ｓ．ら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． １９９９．１．１３３−１３６）。ＤｅｓＩ変異体においては、ｄｅｓＩがネオマイシン耐性遺伝子で置き換えられ、これはカナマイシン耐性を付与する。ＰＬＳ−Ｃ２４２含有Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）ＤｅｓＩコロニーを、アプラマイシン抗生物質に対する耐性に基づいて同定した。これらの正のコロニーのうちの１つ、ＤｅｓＩ／ｃａｌＨ−１を、１００ｍｌの播種培地で２９℃にて４８時間増殖させ、次いで、５リットルの栄養培地に接種し、増殖させた。ケイン（Ｃａｎｅ），Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９３， １１５， ５２２−５２６。培養物を遠心分離して、細胞破砕物およびマイセラ（ｍｙｃｅｌｌａ）を除去した。上清を、濃ＫＯＨでｐＨ９．５に調整した後、クロロホルム抽出をした。粗生成物（７００ｍｇ）を、クロロホルム中１〜２０％のメタノールの濃度勾配を用いたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーに供した。主生成物である１０−デオキシメチノライド（約４００ｍｇ）および、２種の少量のマクロライド化合物の混合物を得た。２種のマクロライドを、アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ（１：１）のイソクラティック移動相を用いたＣ_１８カラムでのＨＰＬＣによってさらに精製した。それらは後に、スペクトル分析によって、化合物（１１）および化合物（１２）（図７）と同定された。
【００８８】
実施例６：分子破壊光アッセイ
本発明はさらに、分子破壊光アッセイを用いて、カリケマイシン誘導ＤＮＡ開裂およびそのＣａｌＣが仲介する抑制をアッセイする方法を提供する。実験のために２つの分子破壊光を図１３に示す。破壊光Ａは、公知のカリケマイシン認識配列５’−ＴＣＣＴ−３’を含む１０−塩基対幹から成っており、破壊光Ｂは、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ認識配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有していた。破壊光Ｂの長さはまた、ＢａｍＨＩ認識のために必要とされる３塩基対オーバーハングの必要条件を考慮し、破壊光Ａの幹は、匹敵する長さおよび溶融温度に調節された。両プローブの環は、非ハイブリッド形成相互作用を確実にするために、Ｔ_４環から成っていた。両プローブの５’−蛍光運搬体はフルオレセインであり（ＦＡＭ、吸光度_極大＝４８５ｎｍ、放射_極大＝５１７ｎｍ）、対応する３’−消光剤は、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であった。以前の研究は、ＤＡＢＣＹＬが分子標識に万能消光剤として役立つことを示し、ＦＡＭの放射スペクトルとＤＡＢＣＹＬの吸収スペクトルとの間には有意のスペクトル重複がある（１．０２ ｘ １０^−１５ Ｍ^−１ ｃｍ^３）。典型的な分子標識では、ＦＲＥＴによるこの対の消光効率は、本質的に完全（９９．９％）であることが示され、典型的な相補的オリゴヌクレオチド対のＦＲＥＴ−に基づくアッセイに比べて、ノイズ比に対する信号の有意の向上を与える。
【００８９】
原理の証明としての酵素的開裂。第１の試験は、酵素的開裂による設計された分子破壊光の特異性を証明するものであった。特に、破壊光Ｂのみが制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの存在下で開裂すべきであり、ＡおよびＢの両方が非特異的ヌクレアーゼＤＮａｓｅＩによって消化されるべきである。予想されたように、図１４ａは、Ｂでのみ、時間依存性および［ＢａｍＨＩ］依存性の蛍光の増加を示し、一方、Ａは、３７℃で変化を示さない。図１４ｂは、また［ＤＮａｓｅＩ］依存性であるＤＮａｓｅＩで消化されたときに、破壊光ＡまたはＢで時間にわたる蛍光の増加を示す。比較すると、破壊光のみまたはＢＳＡの存在下で破壊光を含む対照試料は、３７℃で＞２時間にわたって、蛍光に変化を与えなかった。酵素の不在下で蛍光を欠くと、設計された破壊光は、示されたアッセイ温度で認め得るほどの溶融を示さない。さらに、これらの実験は、ＢについてＢａｍＨＩによる開裂の特異性を明らかに証明し、初めて、ＤＮＡ開裂を評価するのに分子破壊光の原則適用を示す。
【００９０】
興味あることに、完全なＢａｍＨＩ開裂で得られた蛍光極大の強度はたった７５％であり、これは、同じ濃度の分子破壊光でＤＮａｓｅＩの存在下で観察された。さらに、ＢａｍＨＩ反応終了後、ＢａｍＨＩの添加は変化を示さなかったが、ＤＮａｓｅＩの添加は、さらなる開裂を生じて、予想された１００％蛍光極大を与えた。この観察は、ＢａｍＨＩ消化が蛍光信号を〜２５％だけ消光すると、ポリ−グアニジンテールがＦＡＭに付着したままになることを示唆する。この発見と一致して、反応生成物のＰＡＧＥ分析は、ＤＮａｓｅＩ消化すると完全に分解するＢａｍＨＩでの過剰処理後に、３−塩基オーバーハングの存在を確認した。その結果、過剰のＢａｍＨＩで観察された蛍光極大は、以下に記載するＢａｍＨＩ動的研究について、１００％開裂を示した。
【００９１】
エネジン−触媒開裂。ＤＮＡのエネジン開裂のための以前のアッセイは、放射能活性なＤＮＡプローブ、電気泳動およびその後のリン酸画像化剤（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）分析を用いた不連続アッセイによるものであった。それに比べて、破壊光を用いることによって、リアルタイムで高選択性で、特異的エネジンによるＤＮＡ開裂の範囲を直接追跡することができる。証明するために、図１５ａ、ｂおよび図１６ａ、ｃ、ｄは、過剰の還元的活性化剤ＤＴＴの存在下で、種々の濃度の（１）エスペラマイシンを含む天然に生じるエネジン、（２）非エネジン小分子剤（例えばブレオマイシン）、（３）メチジウムプロピル−Ｆｅ−ＥＤＴＡ、（４） Ｆｅ−ＥＤＴＡ、（５）ならびに、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用いて、破壊光Ａの開裂を説明する。記載された条件下で、このアッセイは、ｐＭの範囲で１の検出を可能にする。この感度は、生化学的誘発アッセイ（ＢＩＡ）であるＤＮＡ−損傷剤の検出における選択方法に匹敵する。さらに、感度は、鉄依存性の剤を用いて証明されたように、単にアッセイにおける分子破壊光の濃度を増すことによって、有意に上げることができる。１または２を用いて３．２ｎＭの破壊光Ａの開裂で得られた、観察された最大蛍光は、ＤＮａｓｅＩで観察されたものと同一であり、オリゴヌクレオチドの完全な分解と一致する。対照として、ＤＴＴまたはエネジン単独との、分子破壊光Ａのインキュベーションは、蛍光の変化を示さなかった。さらに、１の「特異性」に関して幾らか論争の余地があるが、分子破壊光Ｂは、同一速度で１によって開裂された。このことは、１の特異性が、より状況に依存し、おそらくＤＮＡ配列にそれほど依存しないという見解を支持する。１は主に二重鎖開裂に至り、２が単鎖のニックを提供し、現今の分子破壊光アッセイはこれら２つの現象を区別できないことをまた注意すべきである。
【００９２】
興味深いことに、エネジン分子破壊光アッセイにおいて、２つの別個の速度が観察された。第１の速度（０〜５０秒）は、エネジンの活性化に最も帰すると思われる遅延時間であり、第２の速度（５０〜２００秒）は、ＤＮＡ開裂の初期速度を示す。これを確認するために、ＤＴＴおよびエネジンをまず１〜５分間プレインキュベートした後、基質オリゴヌクレオチドの添加によって開始するアッセイをまた確立した。これらのプレインキュベーション実験において、活性化に帰する先に観察された「遅延時間」がもはや明らかではなく、ＤＮＡ開裂の初期速度は、標準アッセイで決定されたのと同一であった。長時間（＞３０分間）のプレインキュベーションは同じ現象を示し、「活性化された」エネジンがおそらく、以前に見積もられたより水性好気性環境で安定であることを示唆する。
【００９３】
ＣａｌＣはカリケマイシン仲介のＤＮＡ開裂を抑制する。図１７に示したように、ＣａｌＣは、破壊光アッセイにおいてカリケマイシン仲介のＤＮＡ開裂を直接抑制する。３．６ｐＭの破壊光Ａが、ＣａｌＣの量を増加（０．０ｎｍ、１．３ｎｍ、２．６ｎｍ、３．９ｎｍ、５．２ｎｍ）して、３．５ｎＭのカリケマイシンと同時インキュベートされる。およそ２倍過剰のＣａｌＣで、カリケマイシンの完全な抑制が達成される。ＣａｌＣは、エスペラマイシン誘導のＤＮＡ開裂に影響を及ぼさない（データを示さず）。
【００９４】
本明細書で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が引用することによってその全部が組み入れられると特に個々に示されたかのように、同じ範囲までその全部を、本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ゲノムライブラリーから分離したコスミドクローンの概要を示す。この図は、カリケマイシン生合成クラスターを有するクローンのためのゲノムライブラリーのスクリーニングの結果を示す。
【図２】
図２は、コスミドクローン４ｂ、１３ａおよび５６の一部ならびに、Ｍ． エチノスポラ（ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からのｃａｌ遺伝子の対応する場所の制限地図を示す。
【図３】
図３は、カリケマイシン生合成クラスターにおけるオープンリーディングフレーム（「ｏｒｆ」）の表である。この表は、遺伝子がエンコードするポリペプチドならびにその提唱されるかまたは実際に決定された生合成経路における機能を挙げる。^ａ他に記載がなければ、アミノ酸レベルでのＢＬＡＳＴ検索に基づく帰属。^ｂ得られる最高の確率評点。^ｃ生化学的研究に基づく帰属。^ｄｏｒｆの一部のみが解明された。
【図４】
図４は、精製したｍｂｐ−ＣａｌＣのＵＶ−可視吸収スペクトルのグラフである。精製したｍｐｂ−ＣａｌＣは、以下の溶液中で分析した：５２μＭのｍｐｂ−ＣａｌＣ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５。挿入図は、ＣａｌＣの低温（４．３Ｋ）Ｘ−帯ＥＰＲ分析の結果を示す。１モルのＣａｌＣ当たり０．５モルのＦｅを含む２５０μＭのｍｐｂ−ＣａｌＣは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で分析した。分光計の設定は次のようであった：領域設定＝２０５０Ｇ；走査範囲＝４，０００Ｇ；時間一定＝８２秒；変調幅＝１６Ｇ；マイクロ波電力＝３１μＷ；周波数＝９．７１Ｇｈｚ；ゲイン＝１０００；測定したスピン計量＝９０±１０μＭ Ｆｅ。
図４（ｂ）は、イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイでのｍｂｐ−ＣａｌＣの結果を提供する。
【図５】
図５は、必要とされるヌクレオチド糖の生合成のための仮定の経路を示す。酵素は以下のように示される：Ｅ_ｄｅｏｘ＝デオキシゲナーゼ；Ｅ_ａｍ＝アミノトランスフェラーゼ；Ｅ_ｅｐ＝エピメラーゼ；Ｅ_ｍｅｔ＝メチルトランスフェラーゼ；Ｅ_ｏｄ＝４，６−デヒドラターゼ；Ｅ_ｏｘ＝オキシダーゼ；Ｅ_ｐ＝ヌクレオチジルトランスフェラーゼ；Ｅ_ｒｅｄ＝レダクターゼ；Ｅ_ｓｈ＝スルフヒドリトランスフェラーゼ。
【図６】
図６は、ピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）／メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）−カリケマイシンハイブリッド代謝産物のイン ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）製造の概略表示を示す。
【図７】
図７は、ストレプトミセス ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａ） のメチマイシン／ピクロマイシン遺伝子クラスターを示す。このクラスター中の８つのオープンリーディングフレーム（ｄｅｓＩ−ｄｅｓＶＩＩＩ）が、デソサミン生合成に関連する遺伝子として帰属された。この図はまた、Ｓ． ベネズエラ（ｖｅｎｅｚｕｅｌａ）変異体におけるカリケマイシンのｃａｌＨ遺伝子の非相同発現後に製造された新しいメチマイシン／ピクロマイシン誘導体（１１および１２）へのハイブリッド経路を示す。
【図８】
図８は、しっかりしたＤＮＡ結合に重要な、カリケマイシン（６）の４つの特有の糖を示す。糖（９）は、４−アミノ−４，６−ジデオキシグルコース（８）から誘導され、糖ＡおよびＢの間の制限されたＮ−Ｏ結合の一部である。化合物８は、アミノ基転移反応によって対応する４−ケト糖（７）から誘導される。遺伝子ｃａｌＨは、化合物（７）の化合物（８）への転化を可能にする所望のＣ−４アミノトランスフェラーゼをエンコードする。
【図９】
図９は、約６５ＫＢの連続する配列にわたる４８個の同定された遺伝子の相対的な座を示す地図である。同定された遺伝子のうちの８個は、公的データベースにおいて相同性を示さない。
【図１０】
図１０は、必要とされるヌクレオチド糖の生合成のためのさらなる仮定の経路を示す。酵素は以下のように示される：Ｅ_ｄｅｏｘ＝デオキシゲナーゼ；Ｅ_ａｍ＝アミノトランスフェラーゼ；Ｅ_ｅｐ＝エピメラーゼ；Ｅ_ｍｅｔ＝メチルトランスフェラーゼ；Ｅ_ｏｄ＝４，６−デヒドラターゼ；Ｅ_ｏｘ＝オキシダーゼ；Ｅ_ｐ＝ヌクレオチジルトランスフェラーゼ；Ｅ_ｒｅｄ＝レダクターゼ；Ｅ_ｓｈ＝スルフヒドリトランスフェラーゼ。
【図１１】
図１１は、ＣａｌＶおよびＣａｌＴによって仲介されるオルセリン酸のヨウ素化ならびに、次のＣａｌＳおよびＣａｌＷによって仲介される酸化、およびＣａｌＤおよびＣａｌＪによって仲介されるメチル化の段階を概略的に示す。さらに、この図は、反応のための推定の基質の合成を示す。
【図１２】
図１２は、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）におけるカリケマイシン耐性のメカニズムを記載する。ｃａｌＣは、細菌にカリケマイシン耐性を付与する。
【図１３】
図１３、エネジン−誘導のＤＮＡ開裂のための第１の連続アッセイの概略的ダイヤグラム、分子破壊光（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅａｋ Ｌｉｇｈｔｓ）。実線は共有結合を示し、破線は水素結合を示し、文字は任意の塩基であり、灰色の影の入った丸は蛍光運搬体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）（ＦＡＭ：フルオレセイン）を示し、黒丸は対応する消光剤（ＤＡＢＣＹＬ：４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）を示し、破線の矢は蛍光を示す。一般に、分子標識は、対応する蛍光信号を生じる蛍光運搬体−消光剤の対の分離によって作動する。分子破壊光は、図に示されたように、蛍光運搬体−消光剤の対の分離および対応する蛍光信号を生じる、酵素的もしくは非酵素的なヌクレアーゼ活性による幹の開裂によって作動する。この研究では、分子破壊光は、好ましいカリケマイシン認識部位（太字、ＴＣＣＴ）またはＢａｍＨＩ認識部位（太字、ＧＧＡＴＣＣ）を含む。予測される開裂部位は、矢印によって示される。
【図１４】
図１４は、分子破壊光の特異性の証明および原則の一般的証明を示す。３７℃にて３．２ｎＭの破壊光を含むアッセイの時間にわたって観察された蛍光強度の変化。（ａ） １００ＵのＢａｍＨＩ（□）での破壊光カリケマイシンＭＬＢ（破壊光Ａ）、１００ＵのＢａｍＨＩ（ｏ）でのＢａｍＨＩ ＭＬＢ（破壊光Ｂ）および、酵素なし（・）でのＢａｍＨＩ ＭＬＢ（１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）。（ｂ） １０ＵのＤＮａｓｅＩ（□）での カリケマイシンＭＬＢ（破壊光Ａ）、１０ＵのＤＮａｓｅＩ（ｏ）でのＢａｍＨＩ ＭＬＢ（破壊光Ｂ）および、酵素なし（・）でのカリケマイシン ＭＬＢ（破壊光Ａ）（４０ ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、１ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ８．０；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）。これは、ＢａｍＨＩおよびＤＮａｓｅＩ のＤＮＡ開裂活性のための現在最も高感度のアッセイである。
【図１５】
図１５は、カリケマイシンおよびエスペラマイシンによるカリケマイシンＭＬＢ（破壊光Ａ）の開裂を示す。３７℃にて３．２カリケマイシンＭＬＢを含むアッセイの時間にわたって観察されたＤＮＡ開裂（４０ ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）、ＤＴＴ（５０μＭ）および種々のエネジン。（ａ） カリケマイシン濃度：３１．７ｎＭ（ｏ）、１５．９ｎＭ（□）、３．２ ｎＭ（◇）、１．６ ｎＭ（Δ）、０．７８ ｎＭ（・）および０．３１ ｎＭ（黒四角）。（ｂ） エスペラマイシン濃度：３１．７ｎＭ（ｏ）、１５．９ｎＭ（□）、３．２ ｎＭ（◇）、１．６ ｎＭ（Δ）、０．７８ ｎＭ（・）、０．３１ ｎＭ（黒四角）および０．１５。ｎＭ（◆）。これらの結果は、エネジン誘発ＤＮＡ開裂のための最初の連続した最も高感度のアッセイを示す。
【図１６】
図１６（ａ） ３７℃にて一定の３．２ｎＭの破壊光Ａを含むアッセイの時間にわたって観察されたＤＮＡ開裂（５０ ｍＭのリン酸ナトリウム、２．５ｍＭのアスコルビン酸塩、ｐＨ７．５；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）および種々のブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）。ブレオマイシン濃度：２００ ｎＭ（ｏ）、１００ ｎＭ（ ）、５０ ｎＭ（◇）、２５ ｎＭ（Δ）、１２．５ ｎＭ（・）、５ ｎＭ（黒四角）および２．５ ｎＭ（黒三角）。（ｃ） ３７℃にて一定の３２ｎＭの破壊光Ａを含むアッセイの時間にわたって観察されたＤＮＡ開裂（４０ ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、２．５ｍＭのアスコルビン酸塩、ｐＨ７．５；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）および種々のＭＰＥ。Ｆｅ（ＩＩ）濃度：５０ ｎＭ（ｏ）、１２５ ｎＭ（□）、２５０ ｎＭ（◇）、５００ ｎＭ（Δ）、１μＭ（・）および２μＭ（黒四角）。（ｄ） ３７℃にて一定の３２ｎＭの破壊光Ａを含むアッセイの時間にわたって観察されたＤＮＡ開裂（４０ ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、２．５ｍＭのアスコルビン酸塩、ｐＨ７．５；λ_Ｅｘ＝４８５ｎｍ、λ_Ｅｍ＝５１７ｎＭ）および種々のＦｅ^２＋−ＥＤＴＡ。Ｆｅ（ＩＩ）濃度：１２．５μＭ（ｏ）、６．３Ｍ（□）、３．１μＭ（◇）および１．３μＭ（Δ）。
【図１７】
図１７は、破壊光アッセイを用いた、カリケマイシンが仲介するＤＮＡ開裂の直接イン ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）抑制を示す。３．６ｐＭの破壊光Ａを、増加する量のＣａｌＣと共に、３．５ｎＭのカリケマイシンと同時インキュベートする。カリケマイシンの完全な抑制は、ほぼ２倍過剰のＣａｌＣで達成される。ＣａｌＣは、エスペラマイシン誘導のＤＮＡ開裂に効果を有さない。
【図１８】
図１８は、ＣａｌＣ のトリプトファン蛍光の増加によって測定された、ＣａｌＣと「活性化された」カリケマイシンとの間の相互作用を示す。ＣａｌＣは５個のトリプトファンを有し、システイン残基を有しておらず、還元的活性化剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）により影響されない。カリケマイシン（３）の濃度がＤＴＴの不在下で増加するにつれて、ＣａｌＣのＴｒｐ蛍光強度にわずかな変化がある。カリケマイシン（４）を「活性化する」ためにＤＴＴを添加すると、ＣａｌＣのＴｒｐ蛍光強度の増加により示されるように、ＣａｌＣへの結合の増加を生じる。[0001]
This application is a continuation-in-part of US patent application 09 / 457,045 filed December 7, 1999, which is hereby incorporated by reference in its entirety, and claims its benefits. U.S. Patent Application U.S. Pat. S. This is a 09 / 724,797 PCT application. This application also claims benefits from provisional patent application 60 / 111,325 filed on Dec. 7, 1998, which is incorporated herein in its entirety.
[0002]
Field of Invention
The present invention relates to Micromonospora etinospora spp. The present invention relates to a biosynthetic gene cluster of calicensis. In particular, the calicheamicin biosynthetic gene cluster includes genes encoding proteins and enzymes used in the biosynthetic pathway and construction of the calicheamicin aryl tetrasaccharide and aglycone, as well as genes conferring calichemycin resistance. The invention also relates to an isolated gene of the biosynthetic cluster and its corresponding protein. Further, the present invention relates to a calicheamicin gene cluster and DNA hybridization using a gene from which the cluster is separated. The present invention also relates to expression vectors comprising biosynthetic gene clusters, individual genes or functional variants thereof.
[0003]
Background of the Invention
Enedyne antibiotics discovered in the 1980s have long been appreciated for their novel molecular structure, their remarkable biological activity, and their attractive mode of action. Enedin antibiotics were originally derived from the fermentation of microorganisms, including Micromonospora, Actinomadura and Streptomyces. Rothstein, D.C. M.M. Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, p. 2 (1995). As a grade, enidine antibiotics have been referred to as the highest potency and highly active anti-tumor reagents discovered so far. Rothstein, D.C. M.M. Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, Preface (1995).
[0004]
To date, at least 12 antibiotics of this family have been discovered, all of which are roughly divided into two categories. Members of the first category of enidines are classified as chromoprotein enines because they have a novel 9-membered ring chromophore core structure, which also requires specific associated proteins for chromophore stability. And Members of the second category of enidines are classified as non-chromoprotein enines. These enines contain a 10-membered ring, which does not require additional stabilizing factors. This energy ring structure is often referred to as the “warhead”. This warhead induces DNA damage, which is often a double-strand break and cannot be recovered. This type of DNA damage is usually irreparable to cells and in most cases fatal. Because of these remarkable chemical and biological properties, it is remarkable to study these substances with the goal of developing new, clinically useful therapeutic antitumor agents by both the pharmaceutical industry and the academic world. There was effort.
[0005]
The enine subfamily of 9-membered chromoproteins consists of: neocarzinostatin (Myers, A. G. et al. From Streptomyces carzinostaticus). , J. Am. Chem. Soc., 110, 7212-7214 (1988)); Kedarcidin from Actinomycete L585-6 (Leet J. E. et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 7946-7948 (1992)); N1999A2 (Yoshida (Y) from Streptomyces globisporus) shida) K. et al., Tetrahedron Lett., 34, 2637-2640 (1993)); majuropeptin (Schroeder et al., D. from Actinomadura madurea). Am. Chem. Soc., 116, 9351-9352 (1994)), Streptomyces sp. N1999A2 from AJ9493 (Schroeder, DR et al., J. Am. Chem. Soc., 116, 9351-9352 (1994)); actinoxanthin from Actinomyces globisporus (Khoklov, A. S. et al., J. Antibiot., XXII, 541-544 (1969)); Et al., J. Antibiot., XXIII, 369-372 (1970)); Auromycin from Yamamoto, T. et al., J. Antibiot., XXXII, 330-339 (1979); Streptomyces macromonomyceticus (1979); Sporamycin from Streptosporangium pseudovulgare (Komiyama, K. et al., J. Antibiot., XXX, 202-208 (1977)). All of which are novel bicyclo [7.3.0. ] It is thought to have a dodecadiene chromophore core structure. Furthermore, with the exception of N1999A2, the required apoprotein serves as a stabilizer and specific carrier for unstable chromophores and for transporting and interacting with target DNA.
[0006]
The non-chromophore energin subfamily is Micromonospora echinospora spp. Calichemycin from calicensis; polysyncraton lithostrotum, nameenamycin from polysynkraton lithostrotum; actinomadra cerosporum (actinomadura esporum); Of dynemicin.
[0007]
Enedin antibiotics have efficacy as anticancer agents because of their ability to cleave DNA. However, many of these compounds are too toxic for current use in clinical research. Today, only calichemycin is known to be currently used in clinical trials and provides promised results as an anticancer agent. For example, the calichemycin-antibody conjugate, MyloTarg ™, also known as CMA-676, was approved by the FDA in January 2000 to treat acute myeloid leukemia. Enedin also has potential utility as an anti-infective if it can somehow be toxic.
[0008]
Calichemycin has two distinct structural regions: aryl tetrasaccharides and aglycones (also known as warheads). Aryl tetrasaccharides exhibit a very unusual series of glycoside, thioether, and hydroxylamine linkages that make the drug predominantly a specific region within the minor groove of DNA (5′-TCCT-3 ′ and 5′-TTTT-3 ′). In addition, it is useful to send when those sequences are available. However, specificity is also situation dependent. The aglycones of calichemycin are highly functionalized bicyclos [7.3.1. With allylic trisulfides that serve as triggering mechanisms. ] It consists of a tridecazidinene core structure. McGahren, W.M. J. et al. Et al., Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, p. 75-86 (1995). When the aryl tetrasaccharide is tightly coupled, bicyclo [7.3.1.1] by 1,4-dehydrobenzene-diradical. Aromatization of the tridecadienene core structure results in site-specific oxidative double-strand breaks in the targeted DNA. Zein, N .; Science, 240, 1198-1201 (1988). Aglycones produce a reaction that produces a carbon-centered diradical, which is responsible for DNA cleavage.
[0009]
This activity of calichemycin has generated significant interest in the pharmaceutical industry, which is flourishing in the recent FDA approval of the calichemycin-antibody conjugate, MyloTag ™ (CMA-676), for the treatment of acute myeloid leukemia (AML). I let you. Moreover, a similar strategy was used in phase I trials for treating breast cancer. Considerable programs have also recently been attempted to test calichemycin conjugated to alternative delivery systems. Hamann, P.M. R. Et al., 87th Annual Meeting of the American Cancer Research Association, Washington, D., et al. C. Pp. 471 (1996); Hinman, L .; M.M. Et al., Cancer Res. 53, 3336 (1993); Hinman, L .; M.M. Et al., Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, p. 87-105 (1995); Sievers, E .; L. Blood, 93, 3678-3684 (1999); Siegel, M. et al. M.M. Et al., Anal. Chem. 69, 2716-2726 (1997); Elestad, G .; Personal document.
[0010]
The biological activity and molecular structure of calichemycin also prompted the search for potentially useful analogs. Of the many laboratories producing synthetic analogues, one group has been shown to effectively inhibit the growth and spread of liver metastases in a congenital model of murine neuroblastoma Calicheamicin gamma^IManufactured. Road, H.C. N. Et al., Cancer Res. 58, 2925-2928 (1998); Wrasidlo, W .; Acta Oncologica, 34, 157-164 (1995). In addition to the synthesis of calichemycin analogs, Random mutagenesis of echinospora and screening of mutant strains with improved biosynthesis potential was also performed. Rothstein, D.M. Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, pp. 107-126 (1995).
[0011]
The first total synthesis of calichemycin was reported in 1992 by Nicolau and collaborators. The synthesis of this complex antibiotic has shown many inconveniences. For example, the Nacelle procedure gives only approximately 0.007% yield and requires 47 steps. Halcomb, R.A. L. Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, pp. 383-439 (1995). Thus, the total synthesis of calichemycin is described in M.M. It remains secondary to the separation of calichemycin from large-scale fermentation of echinospora. Accordingly, there remains a need for methods for producing large amounts of calichemycin and potentially useful variants. Fantini, A.M. Et al., Enedyne Antibiotics as Antigen Agents, 29-48 (1995). Transforming calicheamicin DNA into bacteria, such as, but not limited to, Streptomyces, Micromonospora, other actinomyces species, or E. coli production strains, Address this need. However, prior to our discovery, the cloned M. cerevisiae. The echinospora gene is not available and the putative M. pneumoniae. Only a limited set of studies on the echinospora promoter was available. Lin, L.L. S. Et al. Gen. Microbiol. , 138, 1881-1885 (1992); Lin, L .; S. Et al. Bacteriol. , 174, 3111-3117 (1992); Baum, E .; Z. Et al. Bacteriol. , 171, 6503-6510 (1989); Baum, E .; Z. Et al. Bacteriol. 170, 71-77 (1988).
[0012]
The molecular structure of calichemycin associated with its useful biological activity and potential therapeutic value impresses calichemycin as a target for study of natural product biosynthesis. Radical-based mechanism of oxidative DNA cleavage by calichemycin (ie, bicyclo [7.3.1.] Tridecadienene core structure by 1,4-dehydrobenzene-diradical that results in site-specific oxidative double-stranded DNA cleavage Aromatization) is well understood, but prior to the present invention it was not known how Micromonospora constructs calichemycin. As a result, prior to the present invention, it was necessary to find and understand calichemycin biosynthesis. Prior to this discovery by the inventors, there was a complete lack of knowledge of the genes encoding the non-chromoprotein enine biosynthesis.
[0013]
The toxicity of enidine compounds including calichemycin concentrates on the problem of aiming at compounds that cleave only the DNA of interest, eg, tumor cell DNA, and not the host DNA. Because of its potent ability to cleave the DNA of calichemycin, scientists have studied the mechanism by which the organism producing calichemycin protects itself against the DNA-cleavage activity of this molecule. Rothstein, D.C. M.M. Enedine Antibiotics as Antitumor Agents, p. 77 (1995). Prior to the present invention, there was a complete lack of knowledge of the gene encoding the self-resistance of non-chromoprotein enidine.
[0014]
Summary of the Invention
The present invention relates to the initial identification, isolation and cloning of non-chromoprotein enidine biosynthetic gene clusters, as well as the mapping and nucleotide sequence analysis of genes in the clusters. The present invention provides biochemical studies of total calichemycin biosynthesis clusters and aryl tetrasaccharide biosynthesis. In addition, the calicheamicin self-resistance gene and protein were isolated to have genes for the steps in the calichemycin cascade and the resulting enzyme. The present invention also provides enine overproduction strain constructs for the rational biosynthetic modification of bioactive secondary metabolites, for clues to new drugs, and for the combined biosynthesis program of enine To do.
[0015]
The present invention relates to a nucleic acid molecule, a portion of the nucleic acid molecule that encodes a protein, a portion of the nucleic acid molecule that encodes a biologically active fragment of a protein, and a micromonospora ethinospora (Micromonospora). Nucleic acid molecules isolated from the non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Echinospora) are provided. Isolated nucleic acid molecules can be single-stranded or double-stranded. As used herein, a nucleic acid molecule, polypeptide or protein described, for example, as from an organism or gene cluster can be isolated from such organism or gene cluster, or Can be a molecule produced using synthetic, chemical, recombinant or other such methods, and can contain amino acid or nucleotide sequences that can be separated from such organisms or gene clusters .
[0016]
The present invention provides 48 genes, 27 of which encode structural genes and the rest encode various functions. The present invention is interested in the following genes or nucleic acids:
[Chemical Formula 3]

[0017]
The present invention is also interested in the following proteins or putative proteins:
[Formula 4]

[0018]
In one embodiment, the present invention provides that the nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33. , 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 , 85, 87, 89, 91, 93 or 94, or isolated nucleotide molecules that hybridize with at least one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 , 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 7, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94 It relates to a functional derivative of an isolated nucleotide molecule that hybridizes with at least one of them. In one embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, It has at least one nucleotide sequence of 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94. That is, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 100% complementarity (sequence identity) with at least one of 94. In another embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, It has at least 90% complementarity (sequence identity) with at least one of 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94. In yet another embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27. , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94, have at least 80% complementarity (sequence identity).
[0019]
In yet another embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27. , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94, at least 70% complementary (sequence identity). In yet another embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27. , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94, have at least 60% complementarity (sequence identity). In yet another embodiment of the invention, the isolated nucleotide molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27. , 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77 , 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, or 94.
[0020]
In another embodiment of the invention, an isolated protein or functional derivative thereof is provided that is encoded by a DNA molecule as previously described herein. Preferred proteins are SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 12, 16, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 Or having at least one amino acid sequence of 95 or one or more functional variants or derivatives of those polypeptides.
[0021]
In another embodiment, the invention provides a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster, a portion of the gene cluster encoding a protein, a portion of the gene cluster encoding a biologically active fragment of a protein, the gene cluster A nucleic acid molecule isolated from Micromonospora echinospora comprising a single-stranded nucleic acid molecule derived from or a single-stranded nucleic acid molecule derived from a portion of the gene cluster.
[0022]
In particular, the present invention relates to Micromonospora etinospora spp., Which relates to the biosynthesis of calichemycin. Nucleic acid molecules isolated from calicensis are provided. In another embodiment, the present invention also provides a micromonospora etinospora spp. It relates to a nucleic acid that can be hybridized with one or more nucleic acids isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Calichensis. In a further embodiment, the invention provides an expression vector comprising a nucleic acid molecule isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Micromonospora echinospora. In a still further embodiment, the present invention provides a cosmid comprising a nucleic acid molecule isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Micromonospora echinospora.
[0023]
In a preferred embodiment, the present invention provides SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 and 94 isolated nucleic acid molecules are provided.
[0024]
In a further embodiment, the present invention provides a host cell transformed with a nucleic acid molecule isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Micromonospora etinospora. The host cell can optionally be derived from bacteria, yeast, fungi, insects, plants or mammals and can be transformed according to standard methods. In a preferred embodiment, the host cell is a bacterial E. coli, Streptomyces spp. Or, Micromonospora spp. Can be. In a more preferred embodiment, the host cell is a bacterium from the genus Streptomyces or the genus Micromonospora.
[0025]
In a further embodiment, the present invention provides SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, The invention relates to a host cell transformed with an expression vector comprising at least one of the nucleotide sequences 87, 89, 91, 93 or 94, or a part thereof or an allele thereof. In a preferred embodiment, the host cell produces a biologically functional protein or protein portion that is encoded by an expression vector.
[0026]
In a particular embodiment, the invention relates to a host cell transformed with an expression vector comprising calC or a part thereof or an allele thereof operably linked to a regulatory sequence that allows expression of CalC. In another specific embodiment, the present invention provides a host cell transformed with an expression vector comprising calH or a portion thereof or an allele thereof operably linked to a regulatory sequence that allows expression of CalH. I will provide a. In yet a further specific embodiment, the present invention relates to a host cell transformed with an expression vector comprising calQ or a part or allele thereof operably linked to a regulatory sequence that allows expression of CalQ. I will provide a. Similarly, the present invention provides a host cell transformed with an expression vector comprising calG or a portion thereof or allele thereof operably linked to a regulatory sequence that allows expression of CalG.
[0027]
In a still further embodiment, the present invention provides SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36. , 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, It relates to a host cell transformed with an expression vector encoding at least one polypeptide comprising the amino acid sequence of 86, 88, 90, 92 or 95 or one or more functional variants of those polypeptides. In a preferred embodiment, the host cell produces a biologically functional protein or protein portion that is encoded by an expression vector.
[0028]
In a particular embodiment, the present invention provides a host cell transformed with an expression vector encoding CalC or a functional derivative thereof operably linked to regulatory sequences that allow expression of the encoded polypeptide. About. In another specific embodiment, the present invention has been transformed with an expression vector encoding CalH or a functional derivative thereof operably linked to a regulatory sequence that allows expression of the encoded polypeptide. A host cell is provided. In yet another specific embodiment, the present invention is transformed with an expression vector encoding CalQ or a functional derivative thereof operably linked to regulatory sequences that allow expression of the encoded polypeptide. Host cells are provided. Similarly, the present invention provides host cells transformed with an expression vector encoding CalG, or a functional derivative thereof, operably linked to regulatory sequences that allow expression of the encoded polypeptide.
[0029]
The present invention further provides a method for expressing a protein by culturing a host cell transformed with the expression vector of the present invention and incubating the host cell for a time and under conditions that allow for expression of the protein.
[0030]
In yet another embodiment, the present invention provides a method of purifying calichemycin using affinity chromatography. A sample containing calichemycin is contacted with an affinity matrix having the protein CalC bound to it for a time and under conditions that allow calichemycin to bind to the matrix, eluting calichemycin from the matrix and recovering calichemycin.
[0031]
In a further embodiment, the present invention provides SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 , 88, 90, 92 or 95 amino acid sequences are provided.
[0032]
In a still further embodiment, the present invention provides the production of the following two new macrolides:
[0033]
[Chemical formula 5]

The present invention further provides a method of conferring calichemycin resistance to a subject comprising obtaining a cell from the subject, transforming the cell with a calichemycin self-resistance gene, and returning the cell to the subject. Alternatively, the calichemycin self-resistance gene can be targeted to and delivered to the desired host cell by known gene therapy delivery systems.
[0034]
The present invention further provides calichemycin or a biologically active metabolite thereof for calD, E, F, G, H, J, K, N, O, P, Q, S, T, U, V, W, X, 6MSAS. , ActI-III, orfI, orfIII, orfV, and orfVII, by altering the expression thereof, is provided. Such denaturation can be achieved by selective “knock out” and heterologous expression of these genes and their products. Various combinations of these mutated or wild type gene products can be used for the production of calicheamicin analogs in vitro or in vivo.
[0035]
The present invention further provides for the production of calicheamicin by introducing multiple copies of positive regulators and transporters, or by eliminating or reducing expression of negative regulators (eg, CalA, B, I, L, Orf8). Provide a way to increase. Furthermore, upregulation of the calicheamicin resistance genes calC, calN and orfXI can be used to reduce the toxicity of calichemycin to healthy tissues and cells during treatment.
In yet a further embodiment, the present invention provides a method for transposon-mediated mutagenesis or a method for transferring chromosomal DNA fragments in vivo by expression of orf3 integrase and IS insertion elements.
[0036]
The advantages of the present invention are numerous. The ability to isolate and clone calicheamicin DNA opens the door for genetic analysis of calichemycin biosynthesis. This is because such analysis requires the ability to obtain large quantities of DNA encoding calichemycin biosynthesis. Using the teachings of the present invention, M.I. Calikemycin biosynthesis by mutagenesis of echinospora can be studied. For example, after isolating and characterizing mutants that are blocked in calichemycin biosynthesis, the defective or partial calichemycin product can be analyzed. Moreover, a particular enzyme can be overexpressed or underexpressed after the gene is subcloned into a host, eg, E. coli, and the result of such overexpression or underexpression is expressed as an enzyme. Can be studied to clarify the function of Furthermore, cloning of biosynthetic genes can ultimately result in increased yields of gene products by cloning and expressing biosynthetic genes encoding rate limiting enzymes back into the production organism.
[0037]
Furthermore, it may also be possible to produce new products by cloning biosynthetic genes into strains that make the relevant compounds. Such genes can confer on the host organism the ability to perform new reactions in the enine nucleus and thus produce new drugs. Thus, the present invention also provides a means for biosynthetic modification of biologically active secondary metabolites by enidine combinatorial biosynthesis. Since the precedents of most pharmaceutical products are brought about by naturally occurring compounds and challenges have been made to synthesize these metabolites, genetic manipulation of sugar adducts with metabolites is a possible new The means to achieve the right drug. Thus, the emerging field of combinatorial biosynthesis has become an abundant new source for modified non-natural sugar skeletons. Marsden, A.M. Science 1998, 279, 199-201. A problem inherent in genetic manipulation of sugar adducts relates to the fact that naturally occurring biologically active secondary metabolites have unusual carbohydrate ligands, which serve as essential molecular recognition elements for biological activity. Macrolide Antibiotics, Chemistry, Biology and Practice (Macrolide Antibiotics, Chemistry, Biology and Practice), 1984. Without these essential sugar adducts, the biological activity of most clinically important secondary metabolites is either completely destroyed or dramatically reduced. Currently, the technology for genetic manipulation of sugar adducts for a given metabolite is mainly a modification of the small subset of genes required to constitute and add each desired sugar moiety and / or Rely on deletions. Thus, there is a need to develop alternative strategies for constructing and adding non-naturally occurring sugars. The present invention is directed to this need. The present invention uses the fact that the glycosyltransferase responsible for the ultimate glycosylation of certain secondary metabolites exhibits a high degree of promiscuousness for nucleotide sugar donors. Zhao, L. Et al. Am. Chem. Soc. 1988, 120, 12159-12160. This non-selectivity of glycosyltransferases has the potential to allow a definitive glycosylation type change of the natural or non-natural secondary metabolite backbone in a combinatorial format. The present invention discloses a method of using glycogene recruitment and coordinated action from various biosynthetic pathways that make up complex gene clusters that create and add unnatural sugars.
[0038]
Insight into how micromonospora self-resistance genes and gene products work to control the toxic effects of calichemycin provides a new way to achieve clinical research. For example, as provided by the disclosure of the present invention, knowledge of the mechanisms underlying calichemycin resistance has given the means to use higher doses of calichemycin to the non-cancerous cells of this drug at the same time. It can be provided while suppressing toxic effects. In addition, understanding the negative mechanism of calichemycin self-resistance helps to understand self-resistance with other enidine antibiotics, so that it is too toxic for possible use as a therapeutic agent Once envisioned, those enines can be made useful. The calicheamicin self-resistance mechanism elucidated using the present invention provides a gene therapy approach, for example, an approach that introduces an enidine resistance gene into bone marrow cells, thereby improving resistance and making it resistant to chemotherapy doses of calichemycin To do. Banerjee, D.C. Et al., Stem Cells, 12, 378-385 (1994). Thus, understanding calichemycin self-resistance will significantly help continuation of clinical studies involving calichemycin and enidine. The present invention addresses this need because it provides for the isolation and characterization of resistance genes and their associated proteins for any non-chromoprotein enidine.
Detailed Description of the Invention
The present invention relates to the separation and characterization of calichemycin biosynthetic clusters. This cluster encodes proteins and enzymes related to calicheamicin deoxy sugar synthesis (aryl tetrasaccharide), polyketide biosynthesis (aromatic residues of aglycone and aryl tetrasaccharide), regulation, transport, cluster migration and calichemycin resistance Encode the gene. Forty-eight putative genes have been identified, 27 of which encode putative structural proteins and the rest encode various functions. Specifically, 15 genes encoding aryl tetrasaccharide moieties (20,928 bp; D, E, F, G, H, J, K, N, O, Q, S, T, U, X, W, 6MSAS), 12 putative genes encoding aglycone (13,284 bp; P, S, V, W, ActI, ActII, ActIII, OrfI, OrfIII, OrfV, OrfVI, OrfVII), membrane transport, regulation, DNA movement and 13 putative genes related to resistance (19,704 bp; A, B, C, I, L, M, R, orf4, orf8, OrfVIII, OrfIX, OrfX, OrfXI, IS-element) and unknown The remaining 8 genes of function (7383 bp; orf1, orf2, orf3, orf5, orf6, orf7, OrfII, OrfIV) A.
[0039]
The calichemycin biosynthesis gene cluster includes the following genes: calA, calB, calC, calD, calE, calF, calG, calH, calI, calJ, calK, calL, calM, calN, calO, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP, calP , CalT, calU, calV, calW, calX, 6MSAS, ActI, ActII, ActIII, orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orfI, orfII, orfI, orfII, , OrfIX, orfX, orfXI and IS-element genes. It should be noted that orf8 may contain DNA derived in whole or in part from recombinant vectors LP46 and / or LP54. The genes listed above encode the following polypeptides: CalA (328 amino acids), CalB (561 amino acids), CalC (181 amino acids), CalD (263 amino acids), CalE (420 amino acids), CalF (245 amino acids), CalG (990 amino acids), CalH (338 amino acids), CalI (568 amino acids), CalJ (332 amino acids), CalK (440 amino acids), CalL (562 amino acids), CalM (416 amino acids), CalN (398 amino acids), CalO ( 331 amino acids), CalP (about 179 amino acids), CalQ (453 amino acids), CalR (265 amino acids), CalS (1113 amino acids), CalT (280 amino acids), CalU (377 amino acids), CalV (125 amino acids) ), CalW (449 amino acids), CalX (197 amino acids), 6MSAS (198 amino acids), ActI (207 amino acids), ActII (136 amino acids), ActIII (308 amino acids), Orf1 (322 amino acids), Orf2 (654 amino acids), Orf3 (209 amino acids), Orf4 (521 amino acids), Orf5 (175 amino acids), Orf6 (139 amino acids), Orf7 (187 amino acids), Orf8 (266 amino acids), OrfI (127 amino acids), OrfII (248 amino acids), OrfIII ( 298 amino acids), OrfIV (363 amino acids), OrfV (288 amino acids), OrfVI (1012 amino acids), OrfVII (236 amino acids), OrfVIII (441 amino acids), OrfIX (5 4 amino acids), OrfX (504 amino acids), OrfXI (251 amino acids) and IS- elements (402 amino acids).
[0040]
In elucidating the calicheamicin biosynthetic gene cluster, the present inventors have developed a micromonospora etinospora spp. We started with a genomic library containing the genome of calicensis. Micromonospora ethinospora (Micromonospora echinospora) spp. The cosmid library is isolated by isolating calicensis chromosomal DNA, fragmenting the chromosomal DNA, inserting the DNA into a cosmid vector, and generating a cosmid library according to methods well known in the art. Generated. This procedure can be performed using any species of Micromonospora, Streptomyces or other suitable bacteria.
[0041]
Based on previous studies of enine metabolic labeling, it was hypothesized that the aglycone of calichemycin was derived from polyketide. Polyketide metabolites include vast structural miscellaneous that still share the normal mechanism of biosynthesis. Hutchinson, C.I. R. Et al., Chem. Rev. , 97, 2525-2535 (1997); R. Et al., Biotechnology of Antibiotics pp. 577-657; Fujii, I .; Et al., Chem. Rev. 97, 2511-2523 (1997); Hopwood, D .; A. Et al., Chem. Rev. 97, 2465-2497 (1997); Hopwood, D .; A. Et al., Ann. Rev. Genet. , 24, 37-66 (1990); Staunton, J .; Et al., Chemical Reviews, 97, 2611-2629 (1997). The most important polyketide synthase (“PKS”) genes exhibit a high degree of sequence homology (path-to-path, organism-to-organism) and often cluster with genes encoding self-resistance and deoxysugar ligand biosynthesis. Hopwood, D.H. A. Et al., Chem. Rev. 97, 2465-2497 (1997); Hopwood, D .; A. Et al., Ann. Rev. Genet. , 24, 37-66 (1990); Staunton, J .; Et al., Chem. Rev. , 97, 2611-2629 (1997).
[0042]
A degenerate primer based on a conserved region in PKS is used for Southern hybridization to allow M. cerevisiae with a putative PKS gene. Clones were identified from an ethinospora genomic library. Southern hybridization was performed by a method known in the art. Type I PKS gene (KS^I) Using a DNA probe designed to target Southern hybridization of the echinospora cosmid library (Kakavas, SJ et al., J. Bacteriol., 179, 7515-7522 (1997)) was performed with clones 4b, 10a, 13a, 56 and 60. Revealed 5 positive clones called. See FIG. When the genomic library was rescreened with a type II DNA probe (actI), the same five clones were also identified. This preliminary analysis clearly demonstrated the presence of homologues of the Micromonospora PKS gene, but a secondary screen was performed. This is because PKS hybridization analysis is often embarrassed by incorrect hybridization to gene clusters encoding spore pigment biosynthesis.
[0043]
The second screen was based on the assumption that the calicheamicin biosynthetic cluster also contains a gene encoding deoxysugar ligand synthesis. Furthermore, since macromolecule-sugar synthesis in many organisms begins with a similar common intermediate, all hexopyranosyl ligands of calichemycin are common intermediate 4-keto-6-deoxy TDP-D-glucose (30). (Figure 5). Thus, in addition to having a PKS-encoding region, the cluster encoding calichemycin biosynthesis has a common glucose-1-phosphate nucleotidyl transferase and NDP-α-D-glucose 4,6-dehydratase gene (each putative). Enzyme E_plAnd E_odSeem to have both). See FIG. These enzymes are required to convert sugar (12) (FIG. 5) to the hypothesized common intermediate 4-keto-6-deoxy TDP-D-glucose (30). Analogs of 4,6-dehydratase have been previously characterized from E. coli, Salmonella and Streptomyces. Moreover, the nucleotide transferase from Salmonella was characterized as alpha-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase. Secondary screening is performed by M.M. The echinospora calichemycin synthesis begins with similar precursors found in E. coli, Streptomyces and Salmonella, which is a common intermediate 4-keto- This was done with a probe based on the premise that dehydratase is required to convert to 6-deoxy TDP-D-glucose (30). In particular, DNA probes (E_od ^IIs a conserved NAD of bacterial NDP-α-D-glucose 4,6-dehydratase⁺-Designed from the binding site. He, X. Et al., Biochem. , 35, 4721-4731 (1996). E_od ^IGenome M. using a probe. Southern hybridization of the ethinospora cosmid library showed cross hybridization with clones 4b, 10a, 13a, 56 and 60. Two additional clones (referred to as 58 and 66) were also identified in this screening. See FIG. This secondary hybridization showed a clustering of genes encoding both polyketide and deoxysugar biosynthesis.
[0044]
For final confirmation, secondary metabolite biosynthesis typically clusters with resistance genes in actinomicetes so that all hybridization-positive clones grow in the presence of various concentrations of calichemycin Tested for ability to In this final screen, 6 out of 7 hybridizing clones showed different levels of calichemycin resistance (4b = 10a = 13a ≧ 56 ≧ 66> 60) (see FIG. 1), while clone 58 Lacked the ability to grow in the presence of calichemycin. Furthermore, these resistance screens showed that clones 4b, 10a, 13a confer much higher levels of calichemycin resistance than other clones. Upon rescreening the genomic library for calichemycin resistant clones, three additional clones (3a, 4a and 16a) were found to confer similar levels of resistance. Increasingly, the results demonstrate that clones 4b, 10a, 13a, 56 and 60 have PKSI and II homologues and deoxysugar biosynthesis genes, and encode genes responsible for conferring calichemycin self-resistance. did.
[0045]
Positive clones for PKSI and II and deoxysugar biosynthesis homologies and calicheamicin resistance were used to locate the biosynthetic cluster. Southern hybridization established similarity between clones 3a, 4a, 4b, 10a, 13a, 16a and 56. In addition, nucleotide sequence duplications were found between clones 4b, 13a and 56. See FIG. Restriction mapping and Southern hybridization of these clones showed that positive cosmid clones have a M.D. range of> 100 kb. It was shown to correspond to a continuous region of the echinospora chromosome. Thus, the present invention provides cosmids having nucleic acid molecules from Micromonospora etinospora encoding non-chromoprotein enidine biosynthetic clusters.
[0046]
After isolating the biosynthetic gene cluster and elucidating the sequence, an open reading frame (“orf”) was assigned. Temporary gene assignments were derived from amino acid sequence similarity of translated orf to gene products of known function by direct BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) database search at the amino acid level . Karlin et al., Proceed Natl. Acad. Sci. , U. S. A. , 87, 2264-2268 (1990); Karlin et al., Proceed Natl. Acad. Sci. , U. S. A. , 90, 5873-5877 (1993); Altchul, Nature Genet. 6, 119-129 (1994). The organization of the gene cluster is provided in FIG.
Temporary gene assignments were made based on BLAST analysis. In particular, 15 genes encoding aryl tetrasaccharide moieties (20,928 bp; D, E, F, G, H, J, K, N, O, Q, S, T, U, X, W, 6MSAS) , 12 putative genes encoding aglycone (13,284 bp; P, S, V, W, ActI, ActII, ActIII, OrfI, OrfIII, OrfV, OrfVI, OrfVII), membrane transport, regulation, DNA movement and / or Or 13 putative genes related to resistance (19,704 bp; A, B, C, I, L, M, R, orf4, orf8, OrfVIII, OrfIX, OrfX, OrfXI, IS-element) and unknown The remaining 8 genes of function (7383 bp; orf1, orf2, orf3, orf5, orf6, orf7, OefII, OrfIV) A.
[0047]
One aspect of the present invention is an M.I. The present invention relates to the transformation of host cells using echinospora DNA. This method uses a vector based on pKC1139 to³Renewable transformation efficiency of kanamycin resistant transformants / gDNA is provided. The present invention further provides that the host cell can be, but is not limited to, a bacterium, yeast, fungus, insect, plant or mammal. Transformation of bacterial, yeast, fungal, insect, plant or mammalian cells is performed by methods known in the art.
[0048]
The invention also provides for the isolation and characterization of genes encoding polypeptides associated with calichemycin resistance, such as orfXI and calC. One embodiment of the invention comprises the gene calC and the DNA sequence SEQ. It relates to a separated DNA strand having ID No: 1. The present invention also provides the amino acid sequence SEQ. ID No. Relates to the isolated protein CalC having 2. The present invention further provides a calC gene fragment encoding a biologically active CalC polypeptide. The polypeptide CalC confers calichemycin resistance and has 181 amino acids. The present invention also provides a CalC fragment that confers calichemycin resistance.
[0049]
The calC locus was isolated by identifying calichemycin genomic cosmid clones that were able to grow on luria bertani ("LB") agar plates containing ampicillin and calichemycin. The DNA of positive clones (clone grown on plates containing calichemycin) was isolated and subsequent restriction mapping localized the desired phenotype (calichemycin resistance). The DNA was then sequenced and the open reading frame was analyzed to confirm the orf encoding the desired phenotype. In vitro studies were also performed to confirm the ability of CalC to inhibit DNA cleavage.
[0050]
Using known methods, the DNA containing calC was cloned into an inducible vector, resulting in overexpression of calC. The polypeptide product (CalC) was then separated, purified and homogenized. Analysis of the purified CalC indicated that it is a non-heme iron metalloprotein that functions by suppressing calichemycin-induced in vitro DNA cleavage. Another aspect of the invention is an expression vector comprising a fragment of calC encoding calC or a biologically active molecule. Also provided is a transformed host cell, preferably a bacterium, more preferably E. coli, comprising calC or a fragment of calC encoding a biologically active molecule. Such a transgenic expression of calC is 10 in E. coli.⁵Double calicheamicin resistance, S. cerevisiae It results in a 100-fold increase in resistance in lividans and a 50-fold increase in resistance in yeast.
[0051]
The present invention provides for the transformation of human cells using the calC gene. Transgenic expression of calC in the HT1080 (human) cell line increased its resistance to calichemycin 10-fold. This technique allows, for example, removing bone marrow cells from patients being treated with calichemycin, transforming these cells with calC, and returning transformed cells to the patient. As the returned human-calC-transformed cells are resistant to calichemycin, this makes the patient resistant to treatment with calichemycin and allows the patient to receive higher doses of calichemycin. Transformation is performed by methods known in the art. Embodiments of the invention may be applicable to many diseases that are treated with calichemycin.
[0052]
The present invention further provides methods for assaying calichemycin-induced DNA cleavage and methods for its CalC-mediated inhibition using molecular disruption photoassays. Two molecular breaking lights (MLB) are described in Example 7 for the experiment. Breaking light A consists of a 10-base pair stem containing the known calichemycin recognition sequence 5'-TCCT-3 ', while breaking light B has a BamHI endonuclease recognition sequence 5'-GGATCC-3'. The 5'-fluorescent carrier of both probes is fluorescein (FAM, absorption_maximum= 485 nm, radiation_maximum= 517 nm) and the corresponding 3'-quencher was 4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL). In general, MLBs operate by separation of a fluorescent carrier-quencher pair and produce a corresponding fluorescent signal. Molecular disruption light, as shown in FIG. 13, operates by stem cleavage by specific enzymatic or non-enzymatic nuclease activity, resulting in the separation of the fluorescent carrier-quencher pair and the corresponding fluorescent signal (FIG. 14). A 2-fold molar excess of Calikemycin CalC completely disrupts calichemycin-mediated DNA cleavage as monitored by the disruption light assay (see FIG. 15).
[0053]
CalC acts as a “cleavage sink”. In essence, the protein is cleaved as an alternative to the desired DNA target. Thus, the present invention provides the first such proven mechanism for resistance to cleaving agents and why CalC has been tested to some extent for all organisms tested (ie, E. coli, S. lividans). (Lividans, yeast and human).
The present invention further provides the use of a disruptive light assay to determine the potency of calichemycin during its manufacture. Moreover, molecular disruption photoassays can be used to determine the DNA cleavage activity of calichemycin analogs produced using the techniques of the present invention.
[0054]
Another aspect of the invention is the DNA sequence SEQ. It relates to a separated DNA strand comprising the calH gene with ID No: 3. The present invention also provides the amino acid sequence SEQ. ID No. Relates to the polypeptide CalH having 4. The present invention further provides a calH gene fragment encoding biologically active CalH. CalH is associated with the formation of the aryl tetrasaccharide 4,6-dideoxy-4-hydroxylamino-D-glucose moiety. CalH catalyzes the conversion of intermediate (30) to intermediate (39) (Figure 5). CalH is TDP-6-deoxy-D-glycerol-L-threo-4-hexulose 4-transaminase, which catalyzes pyridoxal phosphate ("PLP")-dependent transamination from glutamate, 4-amino-6-deoxy TDP-D glucose (intermediate 39) (FIG. 5) is provided. The present invention also provides CalH fragments that retain biological activity. Also provided is an expression vector comprising a calH gene or a fragment of the calH gene encoding a biologically active polypeptide. CalH is (histidine)₁₀-Overexpressed as a fusion protein and then purified by nickel affinity chromatography.
[0055]
According to BLAST analysis, CalH was converted from compound 30 to compound 39 during the biosynthesis of TDP-perosamine (TDP-4,6-dideoxy-4-amino-D-mannose) in E. coli. It is very similar to the enzyme perosamine synthase that converts (FIG. 5). Wang, L.M. Et al., Infect. Immunol. 66, 3545-3551 (1998). Thus, CalH is considered to be a 4-ketohexose aminotransferase. In order to confirm the function assigned to the provisional BLAST, combinatorial biosynthesis was performed. In particular, the calH gene from calichemycin was incorporated into a mutant strain of Streptomyces venezuela. The 4-dehydrase gene (des1) in the methymycin / picromycin pathway was deleted in this mutant strain. S. The promoter sequence methymycin / picromycin cluster from Venezuela was incorporated into an expression vector and An exogenous gene (calichemycin calH) was expressed in Venezuela. Wild type S. In Venezuela, the methymycin / picromycin pathway is known to yield methymycin, neomethymycin, picromycin and narbomycin. See FIG. Deletion of the des1 gene in the mutant strain resulted in the accumulation of the CalH substrate, TDP-4-keto-6-deoxyglucose (compound 30, FIG. 6). S. An expression vector constructed using the Venezuela promoter expressed the calH gene to make a CalH protein. CalH acted on substrate 30 to produce compound 39 (FIG. 6). Compound 39 is now S.P. The action of Venezuela's DesVII (glycosyltransferase) produced two methymycin / picromycin-calichemycin hybrid compounds. See FIG. 6, compounds 40 and 41. These hybrid compounds have the 4-aminohexose ligand of calichemycin. This study provides unequivocal support for the assignment of the calH gene to encode the TDP-6-deoxy-D-glycero-L-threo-4-hexulose 4-aminotransferase of the calichemycin pathway. CalH acted on the TDP-4-keto-deoxyglucose substrate (compound 30) to give compound 39 (FIG. 5).
[0056]
Furthermore, CalH can directly mediate the synthesis of the product TDP-4,6-dideoxy-alpha-D-glucose, as evidenced by HPLC separation of the product and confirmation by high resolution mass spectrometry. Moreover, this compound was found to co-elute with chemically synthesized TDP-4-amino-4,6-dideoxy-alpha-D-glucose.
[0057]
In addition, these results are Since the Venezuela pathway glycosyltransferase (DesVII) has shown that its structure can recognize an alternative sugar substrate significantly different from the original amino sugar substrate TDP-D-desosamine, the corresponding glycosyltransferase ( Reinforce the miscellaneous nature of DesVII). The results also clearly demonstrate the ability to manipulate the glycosylation of secondary metabolites by rational selection of gene combinations. S. by a newly constructed expression vector. The successful expression of the CalH protein in Venezuela highlights the possibility of using this system to express other foreign genes in this strain.
[0058]
Thus, one aspect of the present invention further relates to the construction of complex gene clusters that have the ability to make and add unnatural sugars. The present invention further provides an expression vector having a calichemycin gene operably linked to a regulatory sequence to control calichemycin protein expression, preferably the regulatory sequence is a Streptomyces promoter . The present invention also relates to two newly synthesized sugars, compound (11) and compound (12) (FIG. 7). Compound (11) has the formula:
[Chemical 6]

Have
[0059]
The spectral data of compound (11) was as follows:
¹H-NMR (500 MHz CDCl₃, J expressed in hertz) δ 6.75 (III, dd, J = 16.0, 5.5, 9-H), 6.44 (1H, dd, J = 16.0, 1.2, 8- H), 5.34 (1H, d, J = 8.0, NH), 4.96 (1H, m, 11-H), 4.27 (1H, d, J = 7.5, 1 -H), 3.66 (1H, dd, J = 9.5, 8.0, 4′-H), 3.60 (1H, d, J = 10.5, 3-H), 3.50. (1H, 1, J = 9.5, 3′H), 2.^d(1H, m, 5′-H), 3.4 (1H, m, 2′-H), 2.84 (1H, dq, J = 10.5, 7.5, 2-H), 64 (1H, m, 10-H), 2.53 (1H, m, 6-H), 2.06 (3H, s, Me-C = O), 1.7 (1H, m, 12-H) ), 1.66 (1H, m, 5-H), 1.56 (1H, m, 12-H), 1.4 (1H, M, 5-H), 1.36 (3H, d, J = 7.5, 2-Me), 1.25 (311, d, J = 6.5, 5'-Me), 1.24 (1H, m, 4-H), 1.21 (3H, d , J = 7.5, 6Me), 1.10 (3H, d, J = 6.5, 10-Me), 0.99 (3H, d, J = 6.0, 4-Me), 0. 91 (3 , T, J = 7.2, 12-Me);¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) 205.3 (C-7), 175.1 (C-1), 171.9 (Me-CO), 147.1 (C-9), 126.1 (C-8), 103. 0 (C-1 ′), 85.8 (C-3), 75.8 (C-5 ′), 75.8 (C-3 ′), 74.1 (C-11), 70.8 ( C-2 ′), 57.6 (C-4 ′), 45.3 (C-6), 44.0 (C-2), 38.1 (C-10), 34.2 (C-5) ), 33.6 (C-4), 25.4 (C-12), 23.7 (Me-CO), 18.1 (C-6 '), 17.9 (6Me), 17. 6 (4-Me), 16.4 (2-Me), 10.5 (12-Me), 9.8 (10-Me).
High resolution FAB-MS; C₂₅H₄₂-NO₈(M + H⁺) Calculated value 484.2910, measured value 484.2303.
[0060]
Compound 12 has the formula:
[Chemical 7]

Have
[0061]
The spectral data of compound (12) was as follows:
¹H-NMR (500 MHz CDCl₃, J expressed in hertz) δ 6.69 (1H, dd, J = 16.0, 6.0, 11-H), 6.09 (1H, dd, J = 16.0, 1.5, 10- H), 5.35 (1H, d, J = 8.5, NH), 4.96 (1H, m, 13-H), 4.36 (1H, d, J = 7.5, 1 'H), 4.19 (1H, m, 5-H), 3.83 (1H-q, J = 6.5, 2-H), 3.68 (1H, dt, J = 10.0, 8.5, 4′H), 3.52 (1H, t, J = 8.5, 3-′H), 3.50 (1H, m, 5-H), 3.42 (1H, t, J = 7.5, 2′-H), 2.92 (1H, dq, J = 7.0, 5.0, 4-H), 2.81 (1H, m, 8-H), 73 (1H, t, = 7.5, 2'-H), 2.06 (3H, a, Me-C-O), 1.8 (1H, m, 6-H), 1.6 (1H, m, 14-H) ), 1.55 (1H, m, 7-H), 1.37 (3H, d, J = 6.5, 2-Me), 1.32 (3H, d, J = 7.0, 4- Me), 1.3 (1H, m, H-14), 1.27 (3H, d, J = 6.5, 5′-Me), 1.25 (1H, m, 7-H), 1 .12 (3H, d, J = 6.0, 8-Me), 1.11 (3H, d, J = 6.5, 12-Me), 1.07 (3H, d, J = 6.0) , 6-Me), 0.91 (3H, 1, J = 7.2, 1 + Me); high resolution FAB-MS; C₂₈H₄₆-NO₂(M + H⁺) Calculated value 540.3172, measured value 540.3203.
[0062]
One embodiment of the present invention comprises the calG gene and has the DNA sequence SEQ. Relates to the separated DNA strand having ID No: 5. Another aspect of the present invention is the amino acid sequence SEQ. ID No. The protein CalG having 6. According to BLAST analysis, calG encodes 4,6-dehydratase. Dehydratase has been characterized from E. coli, Salmonella, and Streptomyces (Thompson, M. et al., J. Gen. Microbiol., 138, 779-786 (1992); Vara, JA, et al., J. Biol. Chem., 263, 1492-114995 (1988)), a similar NDP-D-glucose 4,6-dehydratase has been characterized from various organisms. Liu, H .; -W. , Et al., Ann. Rev. Microbiol. 48, 223-256 (1994); Harris, T .; M.M. Et al., Acc. Chem. Res. , Printing (1999). Based on these previous studies, the general transformation catalyzed by 4,6-dehydratase is an intramolecular oxidation-reduction reaction, where enzyme-bound NAD⁺Was known to accept 4-H as a hydride in the oxidative half-reaction and to give a reducing equivalent to the dehydrated product C-6 in the reductive half-reaction. Thus, it is clear that CalG is required for formation of the aryl tetrasaccharide 4,6-dideoxy-4-hydroxylamino-D-glucose moiety. CalG appears to be TDP-D-glucose 4,6-dehydratase that catalyzes the conversion of intermediate 13 to intermediate 30 (see FIG. 5). Another aspect of the invention is an expression vector comprising a fragment of calG encoding calG or a biologically active molecule. Also provided is a transformed host cell, preferably a bacterium, more preferably E. coli, comprising calG or a fragment of calG encoding a biologically active molecule.
[0063]
Furthermore, CalG is the product TDP-4-keto-6-deoxy-alpha-D-, as evidenced by assays where the product is known to absorb at 320 nm under basic conditions. Glucose synthesis can be directly mediated. Moreover, this compound was found to co-elute with chemically synthesized TDP-4-keto-6-dideoxy-alpha-D-glucose. CalG has been demonstrated to use UDP-glucose as a substrate.
[0064]
An isolated DNA strand containing the calS gene is also disclosed. Based on sequence homology with other P450-oxidases, CalS appears to be a P450-oxidase homologue that oxidizes intermediate 39 to intermediate 42 (FIG. 5). Oxidation can occur at the nucleotide sugar level or at hydroxylamine formation after the sugar is converted to an aglycon. Also provided are expression vectors comprising a calS gene encoding a calS gene or a biologically active molecule. Also provided is a transformed host cell, preferably a bacterium, more preferably E. coli, comprising calG or a fragment of calG encoding a biologically active molecule.
[0065]
An isolated DNA strand containing the calQ gene is also disclosed. Based on sequence homology, CalQ appears to be a UDP-D-glucose-6 dehydrogenase homolog. The CalQ assay is based on the fact that this enzyme requires 2 equivalents of NAD + for activity. Thus, the assay was based on increased absorption (as a result of the conversion of NAD + to NADH when UDP-alpha-D-glucose is converted to UDP-alpha-D-glucuronic acid). The product was also shown to be co-eluted with commercially available UDP-glucuronic acid and confirmed separately by high resolution mass spectrometry. This enzyme has also been shown to use TDP-glucose.
[0066]
Also provided is an expression vector comprising a calQ gene or a fragment of calQ encoding a biologically active molecule. Also provided is a transformed host cell, preferably a bacterium, more preferably E. coli, comprising calQ or a fragment of calQ encoding a biologically active molecule.
[0067]
The present invention allows the genetic manipulation of biosynthetic gene clusters to produce calicheamicin analogs. The present invention provides for the production of calicheamicin analogs by constructing deletions or substitutions of genes associated with aryl tetrasaccharide biosynthesis. The present invention further provides in vitro glycosylation (by glycosyltransferase) by altering the type of glycosylation of calichemycin to produce additional analogs. The present invention also provides for the alteration of the aglycon of calichemycin by genetic manipulation of the gene encoding warhead biosynthesis. Genetic manipulation, eg, generation of deletions or substitutions, is performed using methods known in the art.
[0068]
The present invention provides a method for purifying calichemycin by affinity chromatography. Due to the homology with calichemycin, CalC functions as a calichemycin-blocking / binding protein. Affinity chromatography is performed using methods known in the art.
[0069]
The present invention relates to the art of controlling the expression of a gene by inserting the gene into a suitable expression vector and operably linking the gene to a regulatory sequence to produce a protein encoded by the inserted gene. To the expression of genes located in the biosynthetic gene cluster by using known methods. The present invention also uses a method known in the art to insert a fragment of a gene selected from a biosynthetic gene cluster that encodes a biologically active protein into an appropriate expression vector. Provide expression of a biologically active protein. A gene is operably linked to regulatory sequences to control its expression.
[0070]
As used herein, the term “hybridization” generally refers to hybridization of nucleic acids under appropriate conditions of stringency, which will be readily apparent to those skilled in the art, depending on the nature of the probe and target sequences. Used to mean Hybridization and wash conditions are well known in the art, and adjustment of the conditions is easily accomplished by varying the incubation time, temperature and / or ionic strength of the solution, depending on the desired stringency. The For example, Sambrook, J. et al. Et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. See, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York The choice of conditions depends on the length of the sequence to be hybridised, in particular the length of the probe sequence, the relative GC content of the nucleic acid and the amount of mismatch to be tolerated. Low stringency conditions are desirable when partial hybridization between strands with a small degree of complementarity is desired. High stringency conditions are desirable when perfect or near perfect complementarity is desired. For typical high stringency conditions, the hybridization solution is 6 × S. S. C. , 0.01M EDTA, 1 × Denhardt's solution and 0.5% SDS. Hybridization is carried out at about 68 ° C. for about 3-4 hours for cloned DNA fragments and about 12-16 hours for total eukaryotic DNA. For low stringency, the temperature of hybridization is lowered about 12 ° C. below the melting temperature (TM) of the duplex. TM is known to be a function of GC content and duplex length and solution ionic strength.
[0071]
As used herein, the terms “substantial sequence identity” or “substantial homology” refer to nucleotide or amino acid sequences that are substantially equivalent in structure or function to other nucleotide or amino acid sequences. Used to indicate gender. Any structural or functional differences between sequences having substantial sequence identity or substantial homology are minor, ie, do not substantially affect the ability of the sequence to function as shown in the desired application. Differences may be due to, for example, inherent changes in codon usage between different species. If there is a significant amount of sequence overlap or similarity between two or more different sequences, or if the different sequences exhibit similar physical characteristics, structural differences are minor even if the length or structure of the sequences are different. It is thought that. Such features include, for example, the ability to hybridize under defined conditions, or in the case of proteins, immunological cross-reactivity, similar enzymatic activity, and the like.
[0072]
Furthermore, two nucleotide sequences are “substantially complementary” if the sequences have at least about 40%, more preferably at least about 60%, and most preferably about 90% sequence similarity between them. is there. Two amino acid sequences are “substantially homologous” if they have at least about 40% similarity, more preferably at least about 70% similarity between the active portions of the polypeptide.
[0073]
As used herein, the expression “hybridizes to a corresponding portion” of a DNA or RNA molecule refers to a molecule that hybridizes, such as an oligonucleotide, polynucleotide or any nucleotide sequence (sense or antisense orientation). ) Means to recognize and hybridize to the sequence of another nucleic acid molecule which is approximately the same size and has sufficient sequence similarity to perform hybridization under appropriate conditions. The size of the “corresponding part” is such that the “corresponding part” can be smaller or larger than the molecule hybridizing to it, for example 20-30% larger or smaller, preferably only about 12-15% larger or smaller. It should be understood to allow for some mismatches in hybridization.
[0074]
The term “functional derivative” of a nucleotide sequence (or poly- or oligonucleotide) means a fragment, variant, homologue or analogue of a nucleotide sequence of interest or of a nucleotide sequence encoding a peptide of interest Used here to do. Functional derivatives can include alternative codons for amino acids, or can encode different amino acids that do not substantially alter the function of interest of the peptide encoded by the nucleotide. A functional derivative can retain at least part of the function of the nucleotide sequence of interest or of the nucleotide sequence encoding the peptide of interest, this function allowing its usefulness in accordance with the present invention. Such functions include SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, The ability to hybridize with at least one of 91, 93 or 94; the DNA is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 18, 20, 22, 24, 26, 28 , 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or another encoding another functional derivative thereof The ability to hybridize with substantially homologous DNA from an organism or with its mRNA transcript; or SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 16, 18, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 , 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95, etc. It may include the ability to encode a click quality.
[0075]
A “fragment” of a gene or nucleotide sequence refers to any subset of a molecule, such as a shorter polynucleotide or oligonucleotide. A “variant” is a molecule that is substantially similar to the entire gene or a fragment thereof, eg, a nucleotide substitution variant having one or more substituted nucleotides, but is capable of hybridizing to a particular gene or native DNA. Molecules that maintain the ability to encode mRNA transcripts that hybridize with. “Homolog” refers to a fragment or variant sequence from a different genus or species. “Analog” refers to a non-natural molecule that is substantially similar to, or functions in association with, the entire molecule, variant or fragment thereof.
[0076]
The “functional derivatives” of the proteins described herein are SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 , 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95, a fragment, variant, analog or chemical derivative, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95 It retains at least a part of one activity, or SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, Immunologically cross-reactive with antibodies specific for at least one of 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95. It is intended to. As used herein, a fragment of a protein refers to any subset of the molecule. Variant peptides can be made by direct chemical synthesis, for example using methods well known in the art. An analog of a protein refers to a non-natural protein that is substantially similar to the whole protein or fragment thereof. As used herein, a chemical derivative of a protein can include additional chemical moieties that are not normally part of a peptide or peptide fragment. Denaturation can be introduced into the peptide or fragment thereof by reacting the targeted amino acid residue of the peptide with an organic derivatizing agent capable of reacting with a selected side chain or terminal residue.
[0077]
A protein or peptide according to the present invention can be cultured as a free protein, depending on the cloning protocol used, by culturing cells transformed with the nucleotide sequence of the present invention (in sense orientation) and allowing the cells to synthesize the protein. Alternatively, it can be produced by separating the protein from the culture medium or cell extract as a fusion protein. Alternatively, the protein can be produced in a cell free system. Ranu et al., Meth. Enzymol. 60: 459-484, (1979).
[0078]
As can be appreciated from the above disclosure, the present invention has a wide range of applications. Accordingly, the following examples are given for purposes of illustration and not limitation.
[0079]
Example
Example 1
For rapid elucidation of nucleotide sequences, thermocycles (thermocycle) directly from pUC- or pBluescript based subclones (using M13 primers and primer walking) and from isolated cosmids (by primer walking). ) Sequencing was achieved. Nucleotide sequence data was obtained using two Applied Biosystems automated 310 gene analyzers and then the sequence was applied using Applied Biosystems AutoAssembler ™ DNA sequence construction software. And built. Dear, S.M. Et al., Nucl. Acids Res. , 14, 3907-3911 (1991); Huang, X .; Et al., Genomics, 14, 18-25 (1992). Orf assignment was achieved using a combination of the computer usage program MacVector ™ 6.0 and Brugene. MacVector is a commercially available product that provides the ability to construct a Micromonospora codon bias table (from a known Micromonospora sequence) and then use this codon bias table to search for the optimal orf. Software package available. Fickett, J.A. W. , Nucleic Acids Research, 10, 5303-5318 (1982). Alternatively, the shareware program Brugene is specially designed for streptomycetes and gives priority to orf showing high consistency G / C% in the fluctuating position.
[0080]
Example 2: calC Separation and characterization
To isolate the gene responsible for calichemycin resistance in Micromonospora, clones conferring calichemycin resistance were identified as ampicillin (50 μg ml).^-1) And calichemycin (0.25 μg ml)^-1) Plates were selected by growth of a Micromonospora genomic bivalent cosmid library. In this selection, 6 clones (3a, 4a, 4b, 10a, 13a and 16a) showed calichemycin resistance. Restriction mapping of these clones localized the desired phenotype to the −2 kb PstI-SacI fragment of DNA (FIG. 2). The maximum allowable concentration of calichemycin on the LB plate was verified. The result is as follows:
[0081]
[Table 1]

[0082]
Nucleotide sequence analysis of the PstI-SacI fragment suggested that it contains two possible orfs. The proximal 1 kb of this fragment had a single orf calD, while the distal 1 kb showed orf calC. Computer translation of calC and subsequent BLAST analysis does not show homology with known proteins, whereas translation of calD to the respective protein CalD is typically S-adenosylmethionine-used The presence of three amino acid motifs conserved in O-methyltransferase was shown. Therefore, it was hypothesized that calD was not responsible for calichemycin resistance. To exclude the possibility of calD being responsible for calichemycin resistance, a subclone was created (pJT1224) to include intact calD but not the truncated calC gene. This subclone did not confer calikemycin resistance. Next, a subclone containing the calC region was constructed (pJT1232). This clone conferred calichemycin resistance as shown in the previous chart.
[0083]
In order to confirm the amino acid sequence of CalC and to know its characteristics, calC was cloned into the pMAL-C2 vector (pMAL-C2 itself was not able to confer calichemycin resistance, see the chart above). The resulting plasmid pRE7 containing calC conferred calichemycin resistance. See chart above. Plasmid pRE7 was then induced with isopropyl beta-D-thiogalactoside (“IPTG”) to overexpress CalC. Induced pRE7 confers calichemycin resistance and produced a maltose-binding protein CalC fusion protein (mbp-CalC). The resulting overexpression of CalC is responsible for the calikemycin resistance 10 in vivo.²Doubled. See chart above.
[0084]
Example 3: Protein CalC Expression
The protein mbp-CalC was overexpressed and purified for further analysis. mbp-CalC was purified from pRE7 / E. coli to homogeneity as determined by SDS-PAGE. Overnight LB culture (50 mg ml from fresh pRE7 / E. Coli colonies^-1Ampicillin and 50 ng ml^-1At 37 ° C. and 250 rpm.₆₀₀= 0.5, induced with 0.5 mM IPTG, and growth continued overnight. Cells were collected (4,000 × g, 4 ° C., 20 minutes), resuspended in buffer A (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA) and disrupted by sonication. . Cell debris was removed by centrifugation (5,000 × g, 4 ° C., 20 minutes). The supernatant was amylose affinity column (1.5 x 7.0 cm, 1 mL)^-1). The desired mbp-CalC protein was eluted with buffer A containing 10 mM maltose. The eluate was concentrated and chromatographed on an S-300 column (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 200 mM NaCl). The active fraction was used immediately or frozen at −80 ° C. for storage.
[0085]
Example 4: CalC Of calicheamicin resistance in rats
Since calichemycin provided double-stranded DNA cleavage and CalC was provided to provide calikemycin resistance in vivo, adding CalC to an in vitro calichemycin-induced DNA cleavage assay resulted in DNA It was expected to suppress cleavage. To test this theory, a preliminary assay was performed using supercoiled pBluescript plasmid DNA (“pBS”) as the template and dithiothreitol (“DTT”) as the reductive initiator. In a typical assay, purified mbp-CalC (15.0 nM) and 30.0 nM calichemycin were preincubated for 15 minutes at 37 ° C. in a total volume of 25 μL of 40 mM Tris-Cl, pH 7.5. Next, 2.5 μL of 10 mM DTT stock solution was added to the assay solution and the assay was incubated for an additional hour at 37 ° C. DNA fragmentation was assessed by electrophoresis on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide. Using this assay, mbp-CalC was converted to calichemycin 10³It was found that calichemycin-induced DNA cleavage can be completely suppressed at a concentration in the vicinity of a double excess. Preincubation of mbp-CalC and DTT, protein removal by forced dialysis and the use of DTT solution as the next reducing agent did not significantly affect the amount of DNA cleavage.
[0086]
As shown in FIG. 4 (b), no DNA cleavage was observed in the absence of DTT or calichemachine (lanes a and b), whereas effective cleavage was demonstrated in the presence of DTT and calichemachine (lane). c). As expected, the addition of mbp-CalC completely inhibited calichemycin-induced DNA cleavage (lane f), and the addition of mbp alone as a control (lane d) failed to inhibit calichemycin-induced DNA cleavage. Furthermore, preincubation of mbp-CalC and DTT (not shown), or apo-mbp-CalC (lack of Fe cofactor) (lane e) also failed to suppress calichemycin-induced DNA cleavage. However, Fe⁺²Or Fe⁺³To the apo-mbp-CalC assay was able to reconstitute CalC activity (lane g). Reconstitution of apo-mbp-CalC was performed as described above with 1 mM FeSO prior to the activity assay.₄(Fe⁺²) Or FeCl₃(Fe⁺³) And preincubation.
[0087]
Example 5: Methymycin / Piclomycin − Production of calichemycin hybrid compounds
PJST1192, a subclone containing the 7.0 kb KpnI fragment of cosmid 13a_kpn7The 1.2 kb calH gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The amplified gene was cloned into the EcoRI / XbaI site of the expression vector pDHS617. This expression vector contains an apramycin resistance marker. Plasmid pDHS617 was derived from pOJ1446 (Bierman, M. et al., Gene 1992, 116, 43-49). S. Promoter sequences from the Venezuela methymycin / picromycin cluster were incorporated into the plasmid, and Foreign genes were expressed in Venezuela. The resulting plasmid pLZ-C242 (including the calH gene insert and promoter sequence) was previously constructed by conjugation transfer using E. coli S17-1. It was introduced into a mutant desI of Venezuela (Borisova, S. et al., Org. Lett. 1999.1.133-136). In the DesI mutant, desI is replaced with a neomycin resistance gene, which confers kanamycin resistance. PLS-C242 containing S.P. Venezuela DesI colonies were identified based on resistance to apramycin antibiotics. One of these positive colonies, DesI / calH-1, was grown for 48 hours at 29 ° C. in 100 ml of seeding medium, then inoculated into 5 liters of nutrient medium and allowed to grow. Cane, D.C. E. Et al. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 522-526. The culture was centrifuged to remove cell debris and mycella. The supernatant was adjusted to pH 9.5 with concentrated KOH and then extracted with chloroform. The crude product (700 mg) was subjected to flash chromatography on silica gel using a gradient of 1-20% methanol in chloroform. The main product 10-deoxymethinolide (about 400 mg) and a mixture of two minor macrolide compounds were obtained. Two types of macrolides, acetonitrile / H₂C using an isocratic mobile phase of O (1: 1)₁₈Further purification by HPLC on the column. They were later identified as Compound (11) and Compound (12) (FIG. 7) by spectral analysis.
[0088]
Example 6: Molecular disruption light assay
The present invention further provides a method of assaying calichemycin-induced DNA cleavage and its CalC-mediated suppression using a molecular disruption light assay. For the experiment, two molecular breaking lights are shown in FIG. Breaking light A consists of a 10-base pair stem containing a known calichemycin recognition sequence 5′-TCCT-3 ′, and breaking light B has a BamHI endonuclease recognition sequence 5′-GGATCC-3 ′. It was. The length of the breakdown light B was also adjusted to a comparable length and melting temperature, taking into account the 3 base pair overhang requirement required for BamHI recognition. The rings of both probes have T-rings to ensure non-hybridization interactions.₄It consisted of a ring. The 5'-fluorescent carrier of both probes is fluorescein (FAM, absorbance_maximum= 485 nm, radiation_maximum= 517 nm), the corresponding 3'-quencher was 4- (4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL). Previous studies have shown that DABCYL serves as a universal quencher for molecular labeling, with a significant spectral overlap between the emission spectrum of FAM and the absorption spectrum of DABCYL (1.02 x 10^-15  M^-1  cm³). With typical molecular labels, the quenching efficiency of this pair by FRET has been shown to be essentially complete (99.9%), compared to the FRET-based assay of a typical complementary oligonucleotide pair. Give a significant improvement in signal to noise ratio.
[0089]
Enzymatic cleavage as a proof of principle. The first test proved the specificity of the designed molecular disruption light by enzymatic cleavage. In particular, only the disrupting light B should be cleaved in the presence of the restriction endonuclease BamHI, and both A and B should be digested by the non-specific nuclease DNaseI. As expected, FIG. 14a shows a time-dependent and [BamHI] -dependent increase in fluorescence only at B, while A shows no change at 37 ° C. FIG. 14b shows the increase in fluorescence over time with disrupted light A or B when digested with DNase I, which is also [DNase I] dependent. By comparison, control samples containing disruptive light alone or in the presence of BSA did not change fluorescence over 37 hours at 37 ° C. In the absence of fluorescence in the absence of enzyme, the designed destruction light does not show appreciable melting at the indicated assay temperature. In addition, these experiments clearly demonstrate the specificity of BamHI cleavage for B and show for the first time the principle application of molecular disruption light to assess DNA cleavage.
[0090]
Interestingly, the intensity of the fluorescence maximum obtained with complete BamHI cleavage was only 75%, which was observed in the presence of DNase I with the same concentration of molecular breaking light. Furthermore, after completion of the BamHI reaction, addition of BamHI showed no change, but addition of DNaseI resulted in further cleavage, giving the expected 100% fluorescence maximum. This observation suggests that the poly-guanidine tail remains attached to the FAM when BamHI digestion quenches the fluorescence signal by ˜25%. Consistent with this finding, PAGE analysis of the reaction product confirmed the presence of a 3-base overhang after overtreatment with BamHI which decomposes completely upon DNase I digestion. As a result, the fluorescence maximum observed with excess BamHI showed 100% cleavage for the BamHI dynamic studies described below.
[0091]
Enidine-catalyzed cleavage. Previous assays for the enine cleavage of DNA were by discontinuous assays using radioactive DNA probes, electrophoresis and subsequent phosphoimager analysis. In contrast, the use of destructive light can directly track the extent of DNA cleavage by specific enidines with high selectivity in real time. To demonstrate, FIGS. 15a, b and 16a, c, d show that naturally occurring enidines containing various concentrations of (1) esperamicin in the presence of excess reductive activator DTT, (2 Non-enedin small molecule agents (eg bleomycin), (3) methidium propyl-Fe-EDTA, (4) Fe-EDTA, (5) and the restriction endonuclease BamHI to explain the cleavage of disruptive light A . Under the conditions described, this assay allows detection of 1 in the pM range. This sensitivity is comparable to the selection method in the detection of DNA-damaging agents, a biochemical induction assay (BIA). Furthermore, the sensitivity can be significantly increased by simply increasing the concentration of molecular disruption light in the assay, as demonstrated with iron-dependent agents. The observed maximum fluorescence obtained with cleavage of 3.2 nM disruption light A using 1 or 2 is identical to that observed with DNase I, consistent with complete degradation of the oligonucleotide. As a control, incubation of molecular disruption light A with DTT or enidine alone showed no change in fluorescence. Furthermore, although there is some controversy regarding the “specificity” of 1, the molecular breaking light B was cleaved by 1 at the same rate. This supports the view that the specificity of one is more context dependent and probably less dependent on the DNA sequence. It should also be noted that 1 primarily leads to double-strand cleavage, 2 provides a single-chain nick, and current molecular disruption photoassays cannot distinguish between these two phenomena.
[0092]
Interestingly, two distinct rates were observed in the enidine molecular disruption light assay. The first rate (0-50 seconds) is the lag time most likely to be due to the activation of enidine, and the second rate (50-200 seconds) indicates the initial rate of DNA cleavage. To confirm this, an assay was also established, which was first preincubated with DTT and enidine for 1-5 minutes before starting with the addition of substrate oligonucleotides. In these pre-incubation experiments, the “lag time” observed prior to activation was no longer apparent, and the initial rate of DNA cleavage was the same as determined in the standard assay. Long-term (> 30 minutes) pre-incubation shows the same phenomenon, suggesting that the “activated” enidine is probably more stable in the aqueous aerobic environment than previously estimated.
[0093]
CalC inhibits calichemycin-mediated DNA cleavage. As shown in FIG. 17, CalC directly inhibits calichemycin-mediated DNA cleavage in a disruptive light assay. 3.6 pM of disrupted light A is co-incubated with 3.5 nM calichemycin with increasing amounts of CalC (0.0 nm, 1.3 nm, 2.6 nm, 3.9 nm, 5.2 nm). With approximately a 2-fold excess of CalC, complete inhibition of calichemycin is achieved. CalC does not affect esperamycin-induced DNA cleavage (data not shown).
[0094]
All publications, patents, and patent applications referred to herein are in the same scope, as if each individual publication, patent or patent application was specifically incorporated by reference in its entirety. All of which are incorporated herein by reference.
[Brief description of the drawings]
[Figure 1]
FIG. An overview of cosmid clones isolated from an ethinospora genomic library is shown. This figure shows the results of screening a genomic library for clones with calichemycin biosynthetic clusters.
[Figure 2]
FIG. 2 shows part of cosmid clones 4b, 13a and 56 and A restriction map of the corresponding location of the cal gene from echinospora is shown.
[Fig. 3]
FIG. 3 is a table of open reading frames (“orf”) in the calichemycin biosynthesis cluster. This table lists the polypeptide encoded by the gene as well as its function in the proposed or actually determined biosynthetic pathway.^aUnless otherwise stated, attribution based on BLAST searches at the amino acid level.^bThe highest probability score obtained.^cAssignment based on biochemical studies.^dOnly part of the orf was elucidated.
[Fig. 4]
FIG. 4 is a graph of the UV-visible absorption spectrum of purified mbp-CalC. Purified mpb-CalC was analyzed in the following solution: 52 μM mpb-CalC; 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. The inset shows the results of low temperature (4.3K) X-band EPR analysis of CalC. 250 μM mpb-CalC containing 0.5 mole Fe per mole CalC was analyzed in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. The spectrometer settings were as follows: Area setting = 2050G; Scanning range = 4,000 G; Constant time = 82 seconds; Modulation width = 16 G; Microwave power = 31 μW; Frequency = 9.71 Ghz; Gain = 1000 Measured spin metric = 90 ± 10 μM Fe.
FIG. 4 (b) provides the result of mbp-CalC in an in vitro assay.
[Figure 5]
FIG. 5 shows a hypothetical pathway for the biosynthesis of the required nucleotide sugars. The enzyme is shown as follows: E_deox= Deoxygenase; E_am= Aminotransferase; E_ep= Epimerase; E_met= Methyltransferase; E_od= 4,6-dehydratase; E_ox= Oxidase; E_p= Nucleotidyl transferase; E_red= Reductase; E_sh= Sulfhydryltransferase.
[Fig. 6]
FIG. 6 shows a schematic representation of the in vivo production of picromycin / methymycin-calichemycin hybrid metabolites.
[Fig. 7]
FIG. 7 shows the Streptomyces venezuela methymycin / picromycin gene cluster. Eight open reading frames (desI-desVIII) in this cluster were assigned as genes related to desosamine biosynthesis. This figure also shows S. FIG. 5 shows a hybrid pathway to new methymycin / picromycin derivatives (11 and 12) produced after heterologous expression of calichemycin calH gene in a Venezuela mutant.
[Fig. 8]
FIG. 8 shows the four unique sugars of calichemycin (6) that are important for tight DNA binding. Sugar (9) is derived from 4-amino-4,6-dideoxyglucose (8) and is part of the restricted N—O bond between sugars A and B. Compound 8 is derived from the corresponding 4-keto sugar (7) by a transamination reaction. The gene calH encodes the desired C-4 aminotransferase that allows the conversion of compound (7) to compound (8).
FIG. 9
FIG. 9 is a map showing the relative loci of 48 identified genes across approximately 65 KB of contiguous sequence. Eight of the identified genes do not show homology in public databases.
FIG. 10
FIG. 10 shows additional hypothetical pathways for the required nucleotide sugar biosynthesis. The enzyme is shown as follows: E_deox= Deoxygenase; E_am= Aminotransferase; E_ep= Epimerase; E_met= Methyltransferase; E_od= 4,6-dehydratase; E_ox= Oxidase; E_p= Nucleotidyl transferase; E_red= Reductase; E_sh= Sulfhydryltransferase.
FIG. 11
FIG. 11 schematically illustrates the steps of Caliodine and CalT mediated iodination of orthoseric acid and subsequent CalS and CalW mediated oxidation and CalD and CalJ mediated methylation. In addition, this figure shows the synthesis of a putative substrate for the reaction.
FIG.
FIG. 12 describes the mechanism of calicheamicin resistance in Micromonospora. calC confers calichemycin resistance to bacteria.
FIG. 13
FIG. 13, Schematic diagram of a first serial assay for enidine-induced DNA cleavage, Molecular Break Lights (Molecular Break Lights). Solid lines indicate covalent bonds, dashed lines indicate hydrogen bonds, letters are arbitrary bases, gray shaded circles indicate fluorphore (FAM: fluorescein), and black circles indicate corresponding quenchers (DABCYL: 4- (4-dimethylaminophenylazo) benzoic acid), and the dashed arrow indicates fluorescence. In general, molecular labels operate by separation of a fluorescent carrier-quencher pair that produces a corresponding fluorescent signal. Molecular disruption light operates by cleavage of the stem by enzymatic or non-enzymatic nuclease activity, resulting in the separation of a fluorescent carrier-quencher pair and the corresponding fluorescent signal, as shown in the figure. In this study, the molecular disruption light contains a preferred calichemycin recognition site (bold, TCCT) or BamHI recognition site (bold, GGATCC). The predicted cleavage site is indicated by an arrow.
FIG. 14
FIG. 14 shows a proof of specificity of molecular breaking light and a general proof of principle. Change in fluorescence intensity observed over the time of the assay with 3.2 nM disruptive light at 37 ° C. (A) Breaking light calichemycin MLB with 100 U BamHI (□) (breaking light A), BamHI MLB with 100 U BamHI (o) and BamHI MLB without enzyme (•) (10 mM) TrisHCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂1 mM DTT, pH 7.9; λ_Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM). (B) Caliquemycin MLB (disruption light A) with 10 U DNase I (□) BamHI MLB (disruption light B) with 10 U DNase I (o) and calichemycin MLB (disruption light A) without enzyme (·) (40 mM TrisHCl, 10 mM MgSO₄1 mM CaCl₂, PH 8.0; λ_Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM). This is currently the most sensitive assay for DNA cleavage activity of BamHI and DNaseI.
FIG. 15
FIG. 15 shows cleavage of calichemycin MLB (disruption light A) by calichemycin and esperamycin. DNA cleavage observed over the time of the assay with 3.2 calichemycin MLB at 37 ° C. (40 mM TrisHCl, pH 7.5; λ_Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM), DTT (50 μM) and various enidines. (A) Calichemycin concentration: 31.7 nM (o), 15.9 nM (□), 3.2 nM (◇), 1.6 nM (Δ), 0.78 nM (•) and 0.31 nM (black) square). (B) Esperamycin concentration: 31.7 nM (o), 15.9 nM (□), 3.2 nM (◇), 1.6 nM (Δ), 0.78 nM (•), 0.31 nM (Black squares) and 0.15. nM (◆). These results represent the first sequential and most sensitive assay for enidine-induced DNA cleavage.
FIG. 16
FIG. 16 (a) DNA cleavage (50 mM sodium phosphate, 2.5 mM ascorbate, pH 7.5; λ; observed over the time of the assay with constant 3.2 nM disruptive light A at 37 ° C._Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM) and various bleomycins. Bleomycin concentration: 200 nM (o), 100 nM (), 50 nM (◇), 25 nM (Δ), 12.5 nM (•), 5 nM (black square) and 2.5 nM (black triangle). (C) DNA cleavage (40 mM TrisHCl, 2.5 mM ascorbate, pH 7.5; λ; observed over the time of the assay with constant 32 nM disruption light A at 37 ° C._Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM) and various MPEs. Fe (II) concentration: 50 nM (o), 125 nM (□), 250 nM (◇), 500 nM (Δ), 1 μM (•) and 2 μM (black squares). (D) DNA cleavage observed over the time of the assay with constant 32 nM disruption light A at 37 ° C. (40 mM TrisHCl, 2.5 mM ascorbate, pH 7.5; λ_Ex= 485 nm, λ_Em= 517 nM) and various Fe²⁺-EDTA. Fe (II) concentration: 12.5 μM (o), 6.3 M (□), 3.1 μM (◇) and 1.3 μM (Δ).
FIG. 17
FIG. 17 shows direct in vitro suppression of calicheamicin-mediated DNA cleavage using a disruptive light assay. 3.6 pM of disrupting light A is co-incubated with 3.5 nM calichemycin with increasing amounts of CalC. Complete suppression of calichemycin is achieved with an almost 2-fold excess of CalC. CalC has no effect on esperamycin-induced DNA cleavage.
FIG. 18
FIG. 18 shows the interaction between CalC and “activated” calichemycin as measured by the increase in tryptophan fluorescence of CalC. CalC has 5 tryptophans, no cysteine residues, and is not affected by the reductive activator dithiothreitol (DTT). There is a slight change in the CalC Trp fluorescence intensity as the concentration of calichemycin (3) increases in the absence of DTT. Addition of DTT to “activate” calichemycin (4) results in increased binding to CalC, as shown by an increase in the CalC Trp fluorescence intensity.

Claims (32)

ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから単離された核酸分子であって、核酸分子、タンパク質をコードする該核酸分子の一部、タンパク質の生物学的に活性な断片をエンコードする該核酸分子の一部、該核酸分子から誘導される単鎖の核酸分子、または該核酸分子の一部から誘導される単鎖の核酸分子を含む、前記核酸分子。A nucleic acid molecule isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Micromonospora etinospora, wherein the nucleic acid molecule, a portion of the nucleic acid molecule encoding the protein, the biological of the protein Said nucleic acid molecule comprising a part of the nucleic acid molecule encoding an active fragment, a single-stranded nucleic acid molecule derived from the nucleic acid molecule, or a single-stranded nucleic acid molecule derived from a part of the nucleic acid molecule. 該単離された核酸分子が、ｃａｌＡ， ｃａｌＢ， ｃａｌＣ， ｃａｌＤ， ｃａｌＥ， ｃａｌＦ， ｃａｌＧ， ｃａｌＨ， ｃａｌＩ， ｃａｌＪ， ｃａｌＫ， ｃａｌＬ， ｃａｌＭ， ｃａｌＮ， ｃａｌＯ， ｃａｌＰ， ｃａｌＱ， ｃａｌＲ， ｃａｌＳ， ｃａｌＴ， ｃａｌＵ， ｃａｌＶ， ｃａｌＷ， ｃａｌＸ， ６ＭＳＡＳ， ＡｃｔＩ， ＡｃｔＩＩ， ＡｃｔＩＩＩ， ｏｒｆ１， ｏｒｆ２， ｏｒｆ３， ｏｒｆ４， ｏｒｆ５， ｏｒｆ６， ｏｒｆ７， ｏｒｆ８， ｏｒｆＩ， ｏｒｆＩＩ， ｏｒｆＩＩＩ， ｏｒｆＩＶ， ｏｒｆＶ， ｏｒｆＶＩ， ｏｒｆＶＩＩ， ｏｒｆＶＩＩＩ， ｏｒｆＩＸ， ｏｒｆＸ， ｏｒｆＸＩまたはＩＳ−要素遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。The isolated nucleic acid molecule is calA, calB, calC, calD, calE, calF, calG, calH, calI, calJ, calK, calL, calM, calN, calO, calP, calQ, calR, calR, calQ, calR, , CalV, calW, calX, 6MSAS, ActI, ActII, ActIII, orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orfI, orfII, orfIII, orfIV, orfIV, orfIV, orfIV, orfIV The isolated nucleic acid of claim 1, comprising at least one of, orfXI or an IS-element gene. Child. 該単離された核酸分子が、２つ以上のタンパク質をコードしている、請求項１記載の単離された核酸分子。2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the isolated nucleic acid molecule encodes two or more proteins. 該分子が、完全な非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the molecule comprises a complete non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster. 該非色素タンパク質エネジンがカリケマイシンである、請求項１記載の単離された核酸分子。2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein the non-chromoprotein enidine is calichemycin. ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からの核酸分子とハイブリダイズすることができる、単離された核酸分子であって、該ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からの核酸分子が、非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから１つ以上のタンパク質をコードする、単離された核酸分子。Micromonospora etinospora spp. An isolated nucleic acid molecule capable of hybridizing with a nucleic acid molecule from Calichensis, said Micromonospora etinospora spp. An isolated nucleic acid molecule, wherein the nucleic acid molecule from Calichensis encodes one or more proteins from the non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster. 該分子が、該非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから少なくとも１つのタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする、請求項６記載の単離された核酸分子。7. The isolated nucleic acid molecule of claim 6, wherein the molecule encodes a protein having at least one protein activity from the non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster. 該核酸分子が、ｃａｌＡ， ｃａｌＢ， ｃａｌＣ， ｃａｌＤ， ｃａｌＥ， ｃａｌＦ， ｃａｌＧ， ｃａｌＨ， ｃａｌＩ， ｃａｌＪ， ｃａｌＫ， ｃａｌＬ， ｃａｌＭ， ｃａｌＮ， ｃａｌＯ， ｃａｌＰ， ｃａｌＱ， ｃａｌＲ， ｃａｌＳ， ｃａｌＴ， ｃａｌＵ， ｃａｌＶ， ｃａｌＷ， ｃａｌＸ， ６ＭＳＡＳ， ＡｃｔＩ， ＡｃｔＩＩ， ＡｃｔＩＩＩ， ｏｒｆ１， ｏｒｆ２， ｏｒｆ３， ｏｒｆ４， ｏｒｆ５， ｏｒｆ６， ｏｒｆ７， ｏｒｆ８， ｏｒｆＩ， ｏｒｆＩＩ， ｏｒｆＩＩＩ， ｏｒｆＩＶ， ｏｒｆＶ， ｏｒｆＶＩ， ｏｒｆＶＩＩ， ｏｒｆＶＩＩＩ， ｏｒｆＩＸ， ｏｒｆＸ， ｏｒｆＸＩまたはＩＳ−要素遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項６記載の単離された核酸分子。The nucleic acid molecule is calA, calB, calC, calD, calE, calF, calG, calH, calI, calJ, calK, calL, calM, calN, calO, calP, calQ, calR, calR, calR, calR, calR, calS, , CalX, 6MSAS, ActI, ActII, ActIII, orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orfI, orfII, orfIII, orfIV, orfV, orfV, orfVI, or V The isolated nucleic acid molecule according to claim 6, comprising at least one of the element genes. 該核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のうちの少なくとも１つを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。The nucleic acid molecule is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 15, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41. , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 93. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising at least one of. 該単離された核酸分子が、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）からのＰ_４５０オキシダーゼ、ヘキソピラノシル−２−３−レダクターゼまたはＵＤＰ−Ｄ−グルコース６−デヒドロゲナーゼをコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。The isolated nucleic acid molecule is a micromonospora etinospora spp. _{P 450} oxidase from Karikenshisu (calichensis), encoding hexopyranosyl -2-3- reductase or UDP-D-glucose 6-dehydrogenase, isolated nucleic acid molecule of claim 1, wherein. 該単離された核酸分子が、膜輸送体、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、Ｎ，Ｎ−ジメチルトランスフェラーゼ、ジペプチド輸送体、Ｌ−システイン／シスチンＣ−Ｓ−ラーゼ、オリゴペプチド輸送タンパク質、調節タンパク質、デサチュラーゼ、転写調節体、オキシゲナーゼ、ハロゲナーゼ、β−ケト−アシルシンターゼＩＩＩ、チトクロームＰ４５０、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｌ−ヘキソース２，３−デヒドロゲナーゼ、オルセリン酸シンターゼ、ポリケタイドサイクラーゼ、ポリケタイドシンターゼ、インテグラーゼ、染色体分配タンパク質、ヒドロキシラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、ｇｌｕ−アンモニア−リガーゼアデニリルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、内在性膜タンパク質、膜タンパク質、免疫耐性タンパク質または、カリケマイシン生合成をコードするミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．カリケンシス（ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）の遺伝子クラスターからの挿入要素をコードする、請求項１記載の単離された核酸分子。The isolated nucleic acid molecule is a membrane transporter, O-methyltransferase, glycosyltransferase, N, N-dimethyltransferase, dipeptide transporter, L-cysteine / cystine C-S-lase, oligopeptide transport protein, regulatory protein , Desaturase, transcriptional regulator, oxygenase, halogenase, β-keto-acyl synthase III, cytochrome P450, TDP-4-keto-6-deoxy-L-hexose 2,3-dehydrogenase, orthophosphate synthase, polyketide cyclase, polyketide Synthase, integrase, chromosome partitioning protein, hydroxylase, aminotransferase, glu-ammonia-ligase adenylyltransferase, methyltransferase, endogenous Proteins, membrane proteins, immune tolerance protein, or, Micromonospora & Echinosupora encoding Karikemaishin biosynthesis (Micromonospora echinospora) spp. 2. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, which encodes an insertion element from a calicensis gene cluster. タンパク質またはタンパク質の生物学的に活性な断片をコードする核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が請求項１記載の核酸分子である発現ベクター。An expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding a protein or biologically active fragment of a protein, wherein the nucleic acid molecule is the nucleic acid molecule of claim 1. 該核酸分子が調節配列に動作可能に結合されて、該タンパク質またはポリペプチドの発現を制御する、請求項１２記載の発現ベクター。13. The expression vector of claim 12, wherein the nucleic acid molecule is operably linked to a regulatory sequence to control expression of the protein or polypeptide. 調節配列が、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプロモーターである、請求項１３記載の発現ベクター。14. The expression vector according to claim 13, wherein the regulatory sequence is a Streptomyces promoter. 請求項１記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。A host cell transformed with the nucleic acid molecule of claim 1. 請求項１２記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。A host cell transformed with the expression vector according to claim 12. 請求項１３記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。A host cell transformed with the expression vector according to claim 13. 該宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物、菌類または哺乳動物の細胞である、請求項１５記載の宿主細胞。16. A host cell according to claim 15, wherein the host cell is a bacterial, yeast, insect, plant, fungal or mammalian cell. 宿主細菌が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）である、請求項１５記載の宿主細胞。16. The host cell according to claim 15, wherein the host bacterium is E. coli or Streptomyces. ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）からの非色素タンパク質エネジン生合成遺伝子クラスターから単離された核酸分子を含むコスミドであって、該単離された核酸分子が、該核酸分子、タンパク質をコードする該核酸分子の一部、タンパク質の生物学的に活性な断片をコードする該核酸分子の一部、該核酸分子から誘導される単鎖の核酸分子または、該核酸分子の一部から誘導される単鎖の核酸分子を含む、前記コスミド。A cosmid comprising a nucleic acid molecule isolated from a non-chromoprotein enidine biosynthetic gene cluster from Micromonospora etinospora, wherein the isolated nucleic acid molecule encodes the nucleic acid molecule, protein A portion of the nucleic acid molecule, a portion of the nucleic acid molecule encoding a biologically active fragment of a protein, a single-stranded nucleic acid molecule derived from the nucleic acid molecule, or a portion of the nucleic acid molecule The cosmid comprising a single-stranded nucleic acid molecule. 該核酸分子が、ｃａｌＡ， ｃａｌＢ， ｃａｌＣ， ｃａｌＤ， ｃａｌＥ， ｃａｌＦ， ｃａｌＧ， ｃａｌＨ， ｃａｌＩ， ｃａｌＪ， ｃａｌＫ， ｃａｌＬ， ｃａｌＭ， ｃａｌＮ， ｃａｌＯ， ｃａｌＰ， ｃａｌＱ， ｃａｌＲ， ｃａｌＳ， ｃａｌＴ， ｃａｌＵ， ｃａｌＶ， ｃａｌＷ， ｃａｌＸ， ６ＭＳＡＳ， ＡｃｔＩ， ＡｃｔＩＩ， ＡｃｔＩＩＩ， ｏｒｆ１， ｏｒｆ２， ｏｒｆ３， ｏｒｆ４， ｏｒｆ５， ｏｒｆ６， ｏｒｆ７， ｏｒｆ８， ｏｒｆＩ， ｏｒｆＩＩ， ｏｒｆＩＩＩ， ｏｒｆＩＶ， ｏｒｆＶ， ｏｒｆＶＩ， ｏｒｆＶＩＩ， ｏｒｆＶＩＩＩ， ｏｒｆＩＸ， ｏｒｆＸ， ｏｒｆＸＩまたはＩＳ−要素遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項２０記載のコスミド。The nucleic acid molecule is calA, calB, calC, calD, calE, calF, calG, calH, calI, calJ, calK, calL, calM, calN, calO, calP, calQ, calR, calR, calR, calR, calR, calS, , CalX, 6MSAS, ActI, ActII, ActIII, orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orfI, orfII, orfIII, orfIV, orfV, orfV, orfVI, or V The cosmid according to claim 20, comprising at least one of the element genes. タンパク質を発現する方法であって、宿主細胞を請求項１２記載の発現ベクターでトランスフェクションする工程および、該細胞を、所望の量の該タンパク質またはタンパク質の該生物学的に活性な断片の発現に十分な長さの時間、十分な条件下でインキュベーションする工程を含む方法。A method for expressing a protein, the method comprising transfecting a host cell with an expression vector according to claim 12, and expressing the cell in a desired amount of the protein or the biologically active fragment of the protein. Incubating under sufficient conditions for a sufficient length of time. 該宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、植物、菌類または哺乳動物の細胞である、請求項２１記載の方法。24. The method of claim 21, wherein the host cell is a bacterial, yeast, insect, plant, fungal or mammalian cell. アフィニティクロマトグラフィーを用いてカリケマイシンを精製する方法であって、カリケマイシンを含む溶液を、ＣａｌＣが結合しているアフィニティカラムに暴露する工程および、カリケマイシンを回収する工程を含む方法。A method of purifying calichemycin using affinity chromatography, comprising the steps of exposing a solution containing calichemycin to an affinity column to which CalC is bound and recovering calichemycin. アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５を含むポリペプチド。Amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95 A polypeptide comprising: 対象にカリケマイシン耐性を付与する方法であって、対象から細胞を得る工程、細胞をカリケマイシン自己耐性遺伝子で形質転換する工程および、細胞を対象に戻す工程を含む方法。A method of imparting calichemycin resistance to a subject, comprising the steps of obtaining cells from the subject, transforming the cells with a calichemycin self-resistance gene, and returning the cells to the subject. 構造：

を有する化合物。Construction:

A compound having 構造：

を有する化合物。Construction:

A compound having 該タンパク質が、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つを含む、請求項１記載の単離された核酸分子。The protein has the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90 92. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising at least one of. タンパク質の該生物学的に活性な断片が、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む、請求項１記載の単離された核酸分子。The biologically active fragment of a protein has the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82 84. The isolated nucleic acid molecule of claim 1, comprising at least one biologically active portion of, 84, 86, 88, 90, 92 or 95. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ３， ５， ７， ９， １１， １３， １５， １７， １９， ２１， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３３， ３５， ３７， ３９， ４１， ４３， ４５， ４７， ４９， ５１， ５３， ５５， ５７， ５９， ６１， ６３， ６５， ６７， ６９， ７１， ７３， ７５， ７７， ７９， ８１， ８３， ８５， ８７， ８９， ９１， ９３または９４のヌクレオチド配列、またはその一部もしくはその対立遺伝子うちの少なくとも１つを含む単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、生物学的に機能性のタンパク質またはタンパク質の一部をコードする、単離された核酸分子。SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93 or 94 An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence, or a portion thereof or at least one of its alleles, wherein the isolated nucleic acid molecule is a biologically functional protein or part of a protein An isolated nucleic acid molecule encoding. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ４， ６， ８， １０， １２， １４， １６， １８， ２０， ２２，２４， ２６， ２８， ３０， ３２， ３４， ３６， ３８， ４０， ４２， ４４， ４６， ４８， ５０， ５２， ５４， ５６， ５８， ６０， ６２， ６４， ６６，， ６８， ７０， ７２， ７４， ７６， ７８， ８０， ８２， ８４， ８６， ８８， ９０， ９２または９５のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは、それらのポリペプチドの１つ以上の機能的変異体。SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 or 95 Or a functional variant of one or more of these polypeptides.

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