JP2005504289A - プリオンアッセイ用に調製された筋肉試料 - Google Patents
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Abstract
筋肉組織試料を調製する方法、および試料中のプリオンの存在を決定するために調製した試料をアッセイする方法が開示される。筋肉組織は、ホモジナイズされ、PrPSc、複合体形成剤、またはホモジネートの他の成分よりもより高い比重を有する複合体を形成する複合体形成剤と混合される。その後重力(例えば超遠心)を用いて複合体を濃縮し、この濃縮物をアッセイしてプリオンを検出する。筋肉組織は、好ましくは哺乳類の他の筋肉と比較してより高い、またはより好ましくは最高濃度のプリオンを有する後肢筋のような筋肉または筋肉群から摘出される。
Description
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利
米国政府は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成金番号第AG 10770号に準拠し、本出願に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般に筋肉組織試料の調製およびそれのプリオンの存在に関するアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
プリオンは、哺乳類において、CJD、BSE、およびスクレイピーを含む、神経変性疾患を引き起こす(Prusiner、「Novel Proteinaceous infectious particles cause scrapie」、Science、216:136-144(1982))。スクレイピーの臨床徴候を有する動物において、最高レベルのプリオンが、脳および脊髄において認められるが、他の組織、特に細網内皮系の組織は、実質的プリオン力価を示している(Eklundら、「Pathogenesis of scrapie virus infection in the mouse」、J.Infect.Dis.、117:15-22(1967)；Hadlowら、「Virologic and neurohistologic finding in diary goats affected with natural scrapie」、Vet.Pathol.、17:187-199(1980))。感染した組織の経口摂取によるプリオンの伝達は、齧歯類において説明されており、最近になっては畜牛およびヒツジにおいてよく説明されている(Prusinerら、「Immunological and molecular biological studies of prion proteins in bovine spongiform encephalopathy」、J.Infect.Dis.、167:602-613(1993)；Carp、「Transmission of scrapie by oral route: effect of gingival scarification」、Lancet、1:170-171(1982)；Phillipsら、The BSE Inquiry (Stationery Office、ロンドン)(2000))。BSEプリオンは、畜牛から十代および若年成人に明らかに伝達されたが(Willら、「Deaths from variant Creutzfeldt-Jakob Disease」、Lancet、353:979 (1999)；Scottら、「Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to humans」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999))、北米においてシカ科のプリオンがヒトへ伝達されたかどうかは、依然不明である(Sprakerら、「Spongiform encephalopathy in free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus), white-tailed deer (Odocoileus virginianus), and Rocky Mountainer elk (Cervus elaphus nelsoni) in northcentral Colorado」、J.Wildl.Dis.、33:1-6(1997))。
【０００４】
唯一分かっているプリオン構成成分は、正常な細胞表面糖タンパク質(PrPC)に由来した異常なPrPアイソフォーム(PrPSc)であり、その発現がプリオン生成には必要である((Buelerら、「Mice devoid of PrP are resistant to scrapie」、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusinerら、「Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-PrP antibodies」、Proc.Natl.Acad.Sci USA、90:10608-10612(1993))。ウェスタンブロット分析は、マウスおよび畜牛(ボス・タウラス(Bos taurus))の両方において、PrPCが、骨格筋において、脳内レベルの約5〜10％のレベルで発現されたことを明らかにし(図1)、このことは既報に一致していた(Horiuchiら、「A cellular form of prion protein (PrPC) exists in many non-neuronal tissues of sheep」、J.Gen.Virol.、76:2583-2587(1995)；Bendheimら、「Nearly ubiquitous tissue distribution of the scrapie agent precursor protein」、Neurology、42:149-156(1992))。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ひとつには、プリオンは、現在利用可能なアッセイ法により検出されるのに十分な高い濃度で、筋肉組織において認められるという予想外の知見を基にしている。筋肉におけるプリオン検出能は、本明細書において説明および開示された試料調製法を使用することにより増強される。筋肉組織は、ウシなどの哺乳類から摘出され、ホモジナイズされる。ホモジネート中のプリオンは、遠心分離、および／またはプリオンに結合し、プリオンもしくは複合体形成剤のいずれか単独よりもより高い比重の複合体を形成するリンタングステン酸ナトリウムのような複合体形成剤を用いて濃縮される。本明細書に示した試料調製およびプリオン濃縮法を使用し、プリオンは、筋肉組織中に、血中において認められるプリオン濃度の約100〜約1,000倍高いレベルで認められた。筋肉中のプリオンは、例えこれらが筋肉組織中に、プリオンが脳組織において認められるレベルの約1/100〜約1/1,000のレベルで存在したとしても検出される。
【０００６】
プリオンは筋肉において認められるという予想外の知見に加え、プリオンは、一部の筋肉または筋肉群において、他の筋肉または筋肉群と比較してより高い濃度で存在することも、予想はしていなかったが見出された。異なる筋肉群におけるプリオン濃度をマッピングし、いずれか所定の哺乳類種において最高濃度のプリオンである可能性のある筋肉を見つけることができる。後肢筋は、本明細書に提供されたデータを基に、最高濃度のプリオンを含むと考えられる。
【０００７】
本発明のある局面には、筋肉組織試料に、その中のプリオンおよび／またはPrPScの存在を検出するために、任意の型のアッセイ法が適用される。
【０００８】
本発明の特徴は、筋肉組織が、筋肉組織中のPrPScをアッセイ用に調製するために濃縮されるような方法で調製されることである。
【０００９】
本発明の利点は、筋肉が採取される動物を殺傷することなく筋肉組織が摘出され、アッセイされ得ることである。
【００１０】
別の利点は、本明細書に示されたアッセイ法は、プロテアーゼ抵抗性PrPSc(例えば、PrP27-30)および感染性の両方を検出することができることである。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により完全に説明された本発明の詳細を読むことにより、当業者には明らかになると考えられる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本アッセイ法、方法、および組成物を説明する前に、本発明は、説明された特定の態様に限定されず、従って当然変動することができることは理解されるべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用された用語は、単に特定の態様を説明する目的のためであり、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１３】
値の範囲が提供された場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各値は、文脈が別に明確に示さない限りはその下限単位の1/10まで、および他の記載された値またはその記載された範囲内に介在する値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれても良く、記載された範囲内の特に除外された限界を条件として、これも本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらに含まれた両限界のいずれかを除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００１４】
別に定義しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものに類似したまたは同等の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料はこれから説明するものである。本明細書において言及された全ての刊行物は、その刊行物に引用された状況で方法および／または材料を開示しかつ説明するために、本明細書に参照として組入れられている。
【００１５】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ひとつ(a、an、およびthe)」は、その文脈が明確に別に指示しない限りは、複数の意味を含むことには注意しなければならない。従って、例えば、「あるひとつの(a)プリオン」の言及は、複数のこのようなプリオンを含み、および「そのひとつの(the)抗体」の言及は、1種または複数の抗体および当業者に公知のそれらの同等物などの言及を含む。
【００１６】
本出願に引用された全ての参考文献および特許出願は、それらの全体が参照として組込まれている。
【００１７】
本明細書において考察した刊行物は、本出願の出願日以前に明らかにされたもののみが提供されている。本明細書は、先行する発明に基づいて本発明にこのような刊行物に先行して権利を与えられるものではないことを承認する意味で構成されたものではない。更に提供された刊行物の日付は、実際の刊行の日付と異なることがあり、これは個別に確認する必要がある。
【００１８】
全般的発明
牛海綿状脳症(BSE)プリオンに感染した畜牛からの牛製品の消費が新変異型クロイツフェルトヤコブ病(nvCJD)を引き起こすことの相当な証拠が議論されている。nvCJDを予防する試みにおいて、高力価の感染性プリオンを含むと考えられている神経組織およびリンパ組織を含むある種の「特定廃棄部位(offal)」は、ヒトが消費する予定の食品から除外されている(Phillipsら、The BSE Inquiry (Stationery Office、ロンドン)(2000))。
【００１９】
本発明は、マウス骨格筋はプリオンを伝播しこれらの病原体の測定可能な力価を蓄積することを示す。本明細書に示されたデータは、実験的スクレイピーの神経学的徴候のある野生型(wt)マウスの骨格筋において、測定可能なプリオン力価およびプリオンタンパク質の疾患を引き起こすアイソフォーム(PrPSc)の両方を示している。プリオンが筋肉内で産生されるのか、もしくは単に蓄積するだけなのかを決定するために実験を行い、筋肉において専らマウスまたはシリアンハムスター(SHa)のいずれかのPrPを発現しているトランスジェニックマウスを確立した。これらのマウスへのプリオンの筋肉内(i.m.)接種は、筋肉内に新生プリオンの形成を生じた。対照的に、PrP発現が肝細胞に標的化されたマウスの接種は、非常に低い肝臓プリオン力価を生じた。従って、特定の組織に関するプリオンの指向性は、発現されたPrP量以外の要因により左右され、かつそのような要因は、骨格筋中のプリオンの伝播および蓄積を可能にしている。本明細書に提供された結果は、著しい食餌によるプリオンへの曝露が、例え神経およびリンパ組織を含まないとしても、精肉の消費によりもたらされることを示している。
【００２０】
本発明以前は、プリオンに感染した動物はその動物の筋肉組織内には、プリオンを有さない、もしくは検出可能なレベルのプリオンを有さないと広く考えられていた。しかし、本発明の試料調製法を用い、筋肉組織に存在するプリオンを濃縮するような方法で筋肉試料を調製し、および濃縮試料内に検出可能なレベルのプリオンを認めることが可能になった。
【００２１】
本発明の重要な局面は、ヒト、マウス、およびハムスターを含むいずれかの哺乳類であって良いが、より一般的にはウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、七面鳥、ロバなどの家畜であるような哺乳類から筋肉組織を得ることを含む、試料を調製する方法である。摘出された筋肉組織試料は、流動性のあるホモジネートを作製するために、ブレンダーのようないずれか適当な手段によりホモジナイズされる。次にこのホモジネートが、高速で超遠心に供される。この遠心分離は、遠心分離が実行される容器の底に、強制的に試料中のプリオンが生じるのに十分な期間継続される。これらのプリオンは、他のタンパク質と比較してそれらが若干小型の立体配置であるために、他のタンパク質と比較して、より高い比重を有する。次に強制的に遠心容器の底に濃縮試料には、プリオンを検出するための望ましいアッセイ法が供される。このアッセイ法は、ウェスタンブロット、ELISAアッセイ法、または1999年4月6日に公開された米国特許第5,891,641号に開示されたような高次構造依存型イムノアッセイ法(CDIアッセイ法)または2001年4月10日に公開された米国特許第6,214,565号に開示されたようなアッセイ法、または米国特許第5,846,533号に開示されたような直接抗体アッセイ法であって良く、これらの特許は全て、高次構造が変更されたタンパク質を検出、特に試料内のプリオンを検出するためのアッセイ法を開示しおよび説明するために、本明細書に参照として組入れられている。
【００２２】
好ましい本発明の局面は、試料が最初に、試料内のPrPScまたはプリオンと結合する複合体形成剤と接触させられ、プリオン単独と比較してより高い比重を有する成分を作製するような試料調製をもたらす。複合体形成剤の例は、リンタングステン酸(PTA)およびその塩を含む、ヘテロポリ酸およびそれらの塩、特にリンタングステン酸ナトリウムを含む(全般的に複合体形成剤および試料調製法が開示され、本明細書に組入れられている、米国特許第5,977,324号を参照のこと。)。
【００２３】
本発明の様々な他の局面および態様に加え、本発明の利点は、この開示内容を読むことにより当業者には明らかになると考えられる。具体的試料調製法およびアッセイ法は、本開示の一部を形成する特許請求の範囲により包含されたものである。
【００２４】
発明の局面
本発明は、以下の工程を含む、試料を調製する方法を含む：哺乳類からの筋肉組織試料を得る工程；試料をホモジナイズし、これによりホモジネートを作製する工程；ホモジネートを、ホモジネート中のPrPScに結合する複合体形成剤と接触させ、PrPScまたは複合体形成剤のいずれか単独の比重と比較してより高い比重を持つ複合体を形成させる工程；ならびに、重力の適用により複合体を濃縮する工程。
【００２５】
この筋肉組織は、試料が得られる哺乳類種の他の筋肉よりも、より高い濃度のプリオンを有する筋肉に由来する。試料は、筋肉が得られた哺乳類の他の筋肉と比較して、より高い濃度のプリオンを有する筋肉から得られる。筋肉組織試料は、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得られ、この際重力による濃縮が遠心分離により増強される。複合体形成剤は、ヘテロポリ酸およびそれらの塩から選択され、ならびにリンタングステン酸ナトリウムであって良く、この方法は、ホモジネート中のPrPcを変性するためおよびホモジネート中のPrPScの高次構造を変更するための条件および期間でホモジネートを処理する工程を含むことができる。
【００２６】
本発明は更に、下記の工程を含む、筋肉中のPrPScの存在を決定する方法も含む：筋肉組織が摘出された哺乳類種の他の筋肉組織よりもより高濃度のプリオンを含む筋肉組織から摘出されたホモジナイズした筋肉組織を、PrPScと結合する複合体形成剤と接触させ、PrPScの比重と比較してより高い比重を有する複合体を形成させる工程であって、この筋肉組織は、ヒト、ウシ、シカ、およびヒツジから選択された哺乳類から摘出される工程；濃縮試料中の複合体を濃縮するために、遠心分離に由来する力を使用する工程；濃縮試料を分析し、PrPScの存在を決定する工程。
【００２７】
更に本発明は、下記の工程を含むアッセイ法を含む：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；この試料を、試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；濃縮試料を、第一の部分および第二の部分に分ける工程；第一の部分と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質への結合よりもより高度の親和性で第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する、標識抗体とを接触させる工程；第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対してより高度の親和性を有する異なる高次構造を呈するようになる方法で第二の部分を処理する工程；第二の部分と標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；標識抗体の第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；ならびに、第一の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の結合レベルと第二の部分のレベルとを比較し、これにより筋肉試料が、疾患に関連した第二の高次構造をとるPrPタンパク質を含んだかどうかを決定する工程。
【００２８】
このアッセイ法において、筋肉組織試料は、ヒト、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得ることができ；この際濃縮は試料と複合体形成剤とを接触させる工程、および試料を遠心分離に供する工程を含む。
【００２９】
この処理は、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質の少なくとも2％を異なる高次構造へ転換するために、熱、圧力、および化学的曝露からなる群より選択される処理に第二の部分を供することにより行っても良く；ここで標識抗体は、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質対するよりも少なくとも4倍高い親和性を有するか；または、標識抗体は、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質に対するよりも少なくとも30倍高い親和性を有するか；または、標識抗体は、ユウロピウム標識された3F4 IgGであるか；または、標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルは、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定される。
【００３０】
本発明の別の局面は、下記の工程を含むアッセイ法を含む：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；この試料を、試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に、その高次構造の、標識抗体の第二の疾患関連高次構造への結合レベルよりも、標識抗体へのより高い結合親和性を有する異なる高次構造への変更を引き起こすような方法で、濃縮試料を処理する工程；濃縮され処理試料と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する結合よりもより高度の親和性で第一の高次構造および異なる高次構造をとるPrPタンパク質に結合する標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の試料中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；試料中の標識された結合レベルと標準物質への先に確立された処理された結合標準レベルとを比較し、この処理前に処理された標準物質は、(i)第一の高次構造および(ii)第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を既知量含んでいる工程；ならびに、前述の比較を基に、筋肉試料の第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を含有する可能性を決定する工程。
【００３１】
このアッセイ法において、筋肉組織試料は、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得ることができ、標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルは、フローサイトメトリーを用いて決定される。
【００３２】
このアッセイ法において、標準は、正常な罹患していない個体に由来する同等の筋肉試料中の、PrPタンパク質レベルの先の測定から得られる。
【００３３】
このアッセイ法において、標準は、第二の疾患関連高次構造に随伴した疾患と診断された個体由来の筋肉の同等の試料中の、PrPタンパク質レベルの先の測定から得られる。
【００３４】
更に別の本発明の局面は、下記の工程を含むアッセイ法である：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で試料を濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；濃縮試料を第一の部分および第二の部分に分ける工程；第一の部分と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に結合するよりもより高度の親和性で第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する、標識抗体とを接触させる工程；第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対してより高度の親和性を有する異なる高次構造を呈するようになる方法で第二の部分を処理する工程；第二の部分と標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；標識抗体の第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；この処理により生じるこの抗体に対する第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加を補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定されたレベルを調節する工程；差異を得るために、第一の部分における標識抗体タンパク質の結合レベルを、第二の部分における標識抗体の調節した結合レベルから減算する工程；ならびに、下記式にこの差異を当てはめる工程であって、差異はΔで表わされる工程：
[PrP]〜ΔFn->d＝Fd-(Fn ＊fn->d)
(式中、前記変数は各々下記のように提供される：
F - 任意の検出可能なシグナル；
Fn - 未変性高次構造をとるタンパク質のシグナル；
Fn αおよびFn β - それぞれ、未変性の非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
Fd - 処理したタンパク質のシグナル；
Fd αおよびFd β - 処理した非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
ΔFn->d - 未変性状態から処理状態への移行時のシグナルの増加；
ΔFα n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の非疾患高次構造のシグナルの増加；
ΔFβ n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の疾患高次構造のシグナルの増加；
fα n->d - 非疾患高次構造の未変性状態から処理状態への移行に関する相関係数；
[PrPβ] - 疾患高次構造をとるタンパク質の濃度；
〜 - 比例を示す；および
＊ - 乗法を示す)
【００３５】
本発明の任意の方法は、処理により得られる抗体に対する第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加について補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定された結合レベルを調節する工程を含むことができる。
【００３６】
別の本発明の局面は、下記の工程を含む方法である：筋肉組織試料と、PrPタンパク質に結合する複合体形成剤とを接触させる工程；複合体形成剤と筋肉試料とを、試料中のPrPタンパク質が複合体形成剤に結合し、PrPタンパク質単独または複合体形成剤単独のいずれかの密度よりもより高い密度を有する複合体を生成するような期間および条件下で接触させ続ける工程；この試料を、複合体形成剤に結合したPrPタンパク質の複合体を分離するのに十分な速度および期間で遠心分離し、試料濃縮物を提供する工程。
【００３７】
この方法は更に、複合体のPrPタンパク質を分析して特徴を決定する工程を含むことができ、この特徴は、溶解度、三次元構造、および感染性からなる群より選択される。
【００３８】
この方法は更に、PrPタンパク質の特徴と、筋肉が摘出された動物と同じ動物の脳組織から摘出されたPrPタンパク質の疾患高次構造の同じ特徴とを比較する工程を含むことができる。
【００３９】
加えて、本発明の方法は更に下記を含む：濃縮試料の第一の部分と、第一の高次構造に、第二の病原性高次構造に対するよりもより高い親和性を有する結合パートナーとを接触させ、第一の部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第一の濃度を決定する工程；試料濃縮物の第二の部分を処理し、このタンパク質の第二の高次構造の結合パートナーに対する結合親和性を増大させる工程；処理試料の第二の部分と結合パートナーとを接触させ、第二の処理した部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第二の濃度を決定する工程；第二の濃度を調節し、この調節が、処理から得られる結合パートナーに対する、第一の高次構造をとるタンパク質の増大した親和性を補正する調節された濃度を提供する工程；ならびに、第一の濃度と調節された濃度とを比較し、第二の病原性高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程。
【００４０】
この方法は、第一の濃度および第二の濃度が、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定され；タンパク質の第二の病原性高次構造は、試料中に、1×103粒子/mlまたはそれ未満の濃度で存在し；ならびに、試料の第二の部分が、第二の病原性高次構造をとるタンパク質の少なくとも2％を結合パートナーに対する増大した結合親和性を有する高次構造へ転換するのに十分な熱、圧力、および化学変性からなる群より選択される処理を用いて処理されることにより実行されうる。
【００４１】
この方法はさらに下記を含むものであることができる：試料濃縮物を、タンパク質の第二の高次構造が第二の高次構造よりも高い結合パートナーに対する親和性を有する結合高次構造へ転換するように処理する工程；処理試料を、結合パートナーと接触させ、試料中の結合パートナー／タンパク質複合体の濃度を決定する工程；濃度を調節し、タンパク質の第一の高次構造の、処理から生じる結合パートナーに対する増大した親和性を補正する調節された濃度を提供する工程；ならびに、調節された濃度と、対照濃度および予め決定された標準濃度からなる群より選択される既知の濃度とを比較し、試料中の第二の高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程。
【００４２】
更にこの方法は、結合パートナーが標識抗体を含み、複合体形成剤がリンタングステン酸の金属塩を含む方法であって、濃度はフローサイトメトリーを用いて決定され；ならびに、調節された濃度は処理された非感染対照試料から決定された既知の濃度と比較され；ならびに、調節された濃度はヒト、ウシ、およびヒツジからなる群より選択される哺乳類の非感染集団由来の処理試料に由来する予め決定された既知の濃度と比較され；ならびに、この抗体が3F4であり、かつ複合体形成剤がリンタングステン酸ナトリウムであり；ならびに、第二の高次構造をとるタンパク質が、試料中に1ml当り1×103個のタンパク質分子またはそれ未満の濃度で存在する方法であって、第一の高次構造をとるタンパク質は、試料中に1ml当り1×106個のタンパク質分子またはそれよりも多い濃度で存在する。
【００４３】
実施例
下記実施例は、いかにして本発明を製造および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが自らの本発明と見なす範囲を限定することは意図しておらず、下記の実験が、実施された全てまたは唯一の実験であることを表わすことは意図されていない。使用された数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実にするよう試みたが、若干の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。特に記さない限りは、部分は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏であり、ならびに圧力は大気でまたはその近傍で行われる。
【００４４】
骨格筋および肝臓のホモジネートを、Rocky Mountain Laboratory(RML)マウスプリオン株を脳内(i.c.)接種したスクレイピーの徴候を示すFVBマウスから、128日目に調製した。これらのマウスの筋肉内プリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定したところ、105〜106 ID50単位/gであった(下記表1参照)。
【００４５】
これらの実質的筋肉内プリオン力価は、脳由来のプリオンによるマウス臓器の全般的汚染を示しておらず、その理由は、野生型マウスではほとんどPrPcを発現しない臓器である肝臓(Raeberら、「Ectopic expression of prion protein (PrP) in T lymphocytes or hepatocytes of PrP knockout mice is insufficient to sustain prion replication」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))の同じマウスに由来したホモジネートは、スクレイピーの伝達に失敗しているか、またはごくわずかなマウスにのみ伝達されるからであり、このことは力価が103 ID50単位/gまたはそれ未満であることが示している。先行する研究は、プリオン感染の徴候を示しているマウスにおける脳プリオン力価は、Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした場合に、典型的には109〜1010 ID50単位/gであることを明らかにした(Supattaponeら、「Branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma cells」、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。
【００４６】
（表1） 野生型(FVB)マウス組織におけるプリオン力価*
*マウスは、RMLプリオンの脳内接種後128日目、神経疾患の徴候を示した時点で屠殺した。
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおけるインキュベーション時間アッセイ法により決定した。
【００４７】
感染性プリオンに加え、プロテアーゼ抵抗性PrPScは、接種した野生型マウスの筋肉において検出されたが、未接種対照においては検出されず、これは図2に示した。ウェスタンブロットにおいて、接種したマウスのプロテイナーゼK(PK)で消化した筋肉ホモジネートは、脳において認められるPrPScのものと同じ、見かけの分子量およびグライコフォーム率を示した。筋肉および脳ホモジネートの比較は、筋肉におけるプロテアーゼ抵抗性PrPScは、脳内よりも〜500倍低かったことを示した。この脳／筋肉PrPSc比102.7は、脳／筋肉ID50単位比である約103に類似している。
【００４８】
図2は、RML感染したCD1マウスの筋肉組織内のプロテアーゼ抵抗性PrP(プリオン)を示している、ウェスタンブロット像である。詳細に述べると、レーン1は、未接種のCD1マウス由来の未処理の脳ホモジネートを含む。他のレーンは全て、CD1マウス筋肉のプロテイナーゼK消化したホモジネート由来の不溶性のペレット化された物質を含む。プロテアーゼ抵抗性PrPは、未接種のマウスの筋肉においては認められなかった(レーン2)のに対し、RMLプリオンの脳内接種後132日目の神経疾患徴候を示しているマウスの筋肉において、PrPScは容易に検出された(レーン4および5)。比較のために、スクレイピーの徴候を示しているマウス由来の脳ホモジネートを、未接種のマウス由来の筋肉ホモジネートに1:1000希釈した(レーン3)。負荷量は、プロテイナーゼ消化および沈殿前の、出発材料の総タンパク質(mg)と等量として表わした。レーン4および5は、レーン2および3の当初の材料の2倍の生成物を負荷したことに注意。このブロットは、Hum-D13抗体でプロービングした。
【００４９】
筋肉組織は、様々な細胞型により構成され(Engelら、Myology: basic and clinical、McGraw-Hill社、ニューヨーク)(1986))、神経組織と密に会合している。プリオンが、筋原線維においてそれ自身複製するかどうかを決定するために、筋細胞特異的プロモーターの制御下でのみPrPを発現するトランスジェニック(Tg)マウスのふたつの系統を構築した。各系統について、導入遺伝子を、染色体PrP遺伝子が破壊されているFVBマウス(Prnp0/0)に導入した(Buelerら、「Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein」、Nature、356:577-582(1992)；Tellingら、「Interactions between wild-type and mutant prion proteins modulate neurodegeneration in transgenic mice」、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。
【００５０】
図3A、3B、および3Cは全て、トランスジェニックマウスにおけるPrPC発現の分布を示しているウェスタンブロット像である。詳細に述べると、図3Aは、ポリクローナル抗体R073でプロービングした、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウス由来のウェスタンブロット像を示している。筋肉内のPrPC発現は、野生型マウス脳(示さず)よりも約8倍高かった。図3Bは、ハムスターPrPCを認識するモノクローナル抗体である3F4でプロービングした、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスからのウェスタンブロット像を示している。PrPC発現は、骨格筋(Sk.Muscle)においてのみ検出された。このブロットのより長期の曝露(示さず)は、心筋における微量の発現を明らかにしたが、他の臓器においては、PrPCは検出されなかった。レーン5(肺)において最も顕著に認められる低分子量のバンドは、抗マウスIg二次抗体が3F4で予めインキュベーションされずに使用された場合にも認められた。図3Cにおいて、2匹のTg(TTR-MoPrP)FVB/Prnp0/0マウスの臓器のホモジネートをFVB脳と比較した。ブロットは、R073でプロービングした。肝臓におけるPrPC発現は、FVB脳におけるものよりも低かったが、このトランスジェニック系統のマウスの脳におけるものよりも高かった。非常に少量のPrPが腎臓において発現された。肝臓由来のPrPのグリコシル化された形は、同じマウスまたはFVBマウスの脳からの、対応するグライコフォーム類よりもわずかに迅速に移動した。
【００５１】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0と称される第一の系統において、ニワトリα-アクチンプロモーターは、マウスPrnpa対立遺伝子の発現を指示する。これらのトランスジェニックマウス由来の骨格筋(図3a)は、PrPを、野生型マウスの脳において認められるレベルよりも約8倍より高いレベルで発現した。図3に示されたように、低レベルのPrPが、心筋において生成され、およびPrPは脳においてわずかに検出された。
【００５２】
Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0と称される第二の系統において、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーターは、SHaPrPの発現を駆動する。この系統において、筋肉内のPrP発現のレベルは、ハムスター脳において発現されたPrPレベルよりも4倍より高い。Tg(MCK-ShaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、図3Bに示したように、心筋において低レベルのPrPCを発現し、脳においてPrPは検出されなかった。
【００５３】
これらのTgマウスおよび非Tg同腹仔に、プリオンを、左後肢に筋肉内接種した。その後これらのマウスを、接種後様々な時点で屠殺した。Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスは、マウスRMLプリオンを接種したのに対し、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、ハムスターSc237プリオンを接種した。未接種の対側後肢の筋肉、脳、および脾臓のホモジネート中のプリオン力価を、バイオアッセイ法により測定した。結果は、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0筋肉において、力価＞107 ID50単位/gを示し、これは接種後350日目に得られた。力価は一般に、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの筋肉よりも低く、これらの測定値は、接種後の413日目に屠殺した3匹全て中の2匹のマウスで〜104 ID50単位/gおよび別のマウスにおいて〜108 ID50単位/gであった(表2)。接種後76日目に屠殺した第四のマウスの筋肉プリオン力価は、〜104 ID50単位/gであった。これらのアッセイ法の結果は、未接種のTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスおよびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の筋肉ホモジネートにおいてはプリオンを検出しなかった。
【００５４】
いくつかの実験を行い、筋肉に認められたプリオンはそこで形成されたことを確認した。ふたつの実験結果は、本発明者らが測定したプリオンの給源としての接種物が残留したことを排除した。第一に、プリオン伝播が不可能であるFVB/Prnp0/0マウス(Buelerら、「Mice devoid of PrP are resistant to scrapie」、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusinerら、「Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-PrP antibodies」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))に、先に説明したTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスを使用する実験に平行してRMLプリオンを筋肉内接種した。FVB/Prnp0/0マウスの筋肉において、接種後350日目にプリオンは検出されず、これはこれらのプリオンが一掃されたことを示している。
【００５５】
第二に、FVB/Prnp0/0マウスは、PrPCを発現しているマウスよりもより効率的にプリオンを一掃する(Raceら、「Scrapie infectivity found in resistant species」、Nature、392:770(1998))と考えられるので、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0およびFVB/Prnp0/0マウスの両方に、Sc237プリオンを接種した。その後、下記表3に示したような様々な間隔で、接種した筋肉におけるプリオン力価を決定した。プリオンは、両系統において同等に迅速に消失した。更にTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスへ接種後28日目に、注射部位に対し同側に認められるプリオンのレベルは、より遅く屠殺したマウスにおいて認められるレベルよりも少なくとも10倍低く、このことは新たな(de novo)プリオン合成を示している(表2および3の比較)。
【００５６】
（表2） トランスジェニックマウス組織におけるプリオン力価
*動物の接種から屠殺までの日数
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡シリアンハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0組織プリオン力価。他は全てTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした。
【００５７】
（表3）シリアンハムスターSc237プリオン接種後のマウス筋肉におけるプリオン力価の漸減
†n、スクレイピー疾患と診断された動物数；n0、接種した動物数
*脳内接種したハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。場合によっては、非常に長いインキュベーション時間が、低い力価計算値を生じさせ、これは過小評価された可能性が高い(「方法」参照)。これらの値は、比較を目的として報告した。
【００５８】
筋肉において認められたプリオンが本発明者らのマウスの他所において生成された汚染物である可能性を排除するために、筋肉内接種したTgマウスの脳および脾臓におけるプリオン力価を決定した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの脳においてプリオンは検出されなかったが、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0脳において低い力価が認められ、この知見は、そこで生成された低レベルのPrPCと一致している。低いプリオン力価は、両系統の接種したマウスの脾臓においても認められ、このことは、ウェスタンブロット分析ではこれらの系統において脾臓のPrPが検出されなかったので、これは他所で生成されたプリオンの蓄積を表わしている可能性がある。脾臓および脳における力価は、全ての場合において筋肉よりも低く、従って、筋肉における力価は、他の組織からの汚染によるものではないと思われる。
【００５９】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、筋疾患を自然発症し、これはSHaPrPプロモーターの制御下でPrPCが過剰発現されているマウスにおける知見と一致している(Westawayら、「Degeneration of skeletal muscle, peripheral nerves, and the central nervous system in transgenic mice overexpressing wild-type prion proteins」、Cell、76:117-129(1994))。同様の組織学的異常が、プリオン接種したマウスおよび未接種、Tg対照の筋肉において検出された。
【００６０】
骨格筋はプリオンを伝播および蓄積することが本質的に可能であることが明らかになったので、これは全てのPrP発現している組織の特徴であるかどうか、または一部の細胞型においてのみ認められる他の要因が必要であるかどうかについて実験を行った。最近の研究(Raeberら、「Ectopic expression of prion protein (PrP) in T lymphocytes or hepatocytes of PrP knockout mice is insufficient to sustain prion replication」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))は、肝細胞またはT細胞の細胞型においてPrPを発現しているTgマウスの肝細胞またはT細胞においてプリオンは伝播しなかったことを結論付けている。しかしRaeberらは、これらのマウスの肝臓において達成されたPrP発現レベルは極めて低く、および循環血中T細胞中の検出可能なプリオンの非存在は、自然の代謝回転の間のプリオン感染細胞の喪失に起因するか、またはプリオンが関連した毒性によるものであるかもしれないことを述べている。
【００６１】
プリオンが肝細胞において伝播することができるかどうかを決定するために、Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスを、TTRプロモーター断片が、肝臓および脳神経細胞サブセットに同時にマウスPrnpa発現を指示するようなプロセスにおいて用いたところ(図3C参照)、脳よりも肝臓においてより高いPrPレベルであった。マウスは、RMLプリオンを脳内接種し、および296日目に疾患徴候を発症した場合に屠殺した。脳プリオン力価は、108〜109 ID50単位/gであったのに対し、肝臓プリオン力価は、わずかに103〜104 ID50単位/gであった。同じ系統のマウスに、RMLプリオンを腹腔内(i.p.)接種し、接種部位の影響を試験した。これらのマウスは、疾患が出現することはなく、接種後523日目に屠殺した。この腹腔内接種したマウスの肝臓プリオン力価は、脳内接種したマウスのものに似ていた。肝臓プリオン力価は低いにもかかわらず、RMLプリオンを接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の肝臓ホモジネートは、RML接種したFVBマウス由来の肝臓ホモジネートの場合よりも有意に多いマウスにスクレイピーを伝達したので、肝臓における高レベルのPrPC発現は、プリオン形成を増強することは明らかである(表1および2、P＜0.001、フィッシャーの直接法)。
【００６２】
これらのデータから、異なる細胞型は、例えPrPC発現レベルが同様である場合であっても、著しく異なる効率でプリオンを蓄積すると結論付けた。マウスPrPCを発現しているTgマウスの3種の組織を比較し、RMLプリオン力価は、脳において〜109 ID50単位/g、肝臓において〜103 ID50単位/g(Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスについて)、および骨格筋において107 ID50単位/g(Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスについて)であった。異なるレベルのプリオンが蓄積する理由は明らかではない。肝臓PrPの明らかに異なるグリコシル化は、そこで認められる不充分なプリオン蓄積に寄与し得るが、脳および筋肉PrPは、識別不可能なグライコフォームであるにも関わらず、異なる蓄積のレベルを示した。
【００６３】
ここで提供された結果は、筋肉は、プリオンを伝播することが本質的に可能であることを明らかにしている。従って、CNSおよびリンパ組織が慎重に精肉から除去されたとしても、実質的に測定可能なプリオン力価が、骨格筋において認められ得る。このスクレイピーに感染した野生型マウスの筋肉におけるプリオン力価は106 ID50単位/gと高いということは、プリオンに感染した動物由来の精肉を消費するヒトは、感染獲得のリスクがあるという懸念を生じる。しかしプリオン汚染した精肉から疾患を発症するヒトのリスクを評価する場合には、いくつかの注意点が考慮されるべきである。第一に、筋肉内のプリオン蓄積の効率は、関連した宿主種またはプリオン株のいずれかにより変動し得る。実際本明細書に示された結果において、マウスRMLプリオンは、ハムスターSc237プリオンが蓄積したよりもより効率的に筋肉に蓄積したように見える。第二に、経口伝達は、本明細書の結果を提供するために使用されたバイオアッセイ法で使用された脳内接種と比較して、非効率である。ハムスターにおいて、経口曝露は、脳内経路の場合よりも105〜109倍低い(Prusinerら、「Transmission of scrapie in hamsters」、J.Infect.Dis.、152:971-978(1985)；Diringerら、「Effect of repeated oral infection of hamsters with scrapie」、J.Gen.Virol.、79:609-612(1998))。最後に、種の壁が考慮されるべきである。一般に、プリオンのひとつの種から別の種へ効率的に伝達されるには、これらのふたつの種の間でPrPアミノ酸配列の高度の相同性が必要である。しかし、アミノ酸配列が伝達効率に影響する程度は、関連したプリオン株により左右される。nvCJDプリオンである場合、ウシPrPを発現しているTgマウスは、ヒトまたはキメラヒト-マウスPrPのいずれかを発現しているTgマウスよりもはるかに、nvCJDプリオンに易罹患性である(Hillら、「The same prion strain causes vCJD and BSE」、Nature、389:448-450(1997)；Scottら、「Identification of a prion protein epitope modulating transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to transgenic mice」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:14279-14284(1999))。
【００６４】
本明細書に提供された結果は、BSE畜牛に加え、慢性消耗性疾患のシカおよびヘラジカの骨格筋内のプリオン蓄積を示唆している。詳細に述べると、本発明者らは、BSEで死亡した畜牛の筋肉組織は試験しなかったが、これらの結果は、ウシの筋肉内のPrPCの存在を示している(図1)。
【００６５】
図1に示された異なるウェスタンブロットは、哺乳類の筋肉組織におけるPrPC発現を示している。詳細に述べると、図1Aは、FVBマウスの様々な組織におけるPrPC発現レベルを示している、ウェスタンブロット像である。最高レベルのPrPCは、脳(Br)であるが、完全にグリコシル化されたPrPCに対応する個別のバンドが、骨格筋(Sk Mu)および心臓(He)ホモジネートのレーンにおいても認められる。部分的にグリコシル化されたPrPCを明らかに示している非常にかすかなバンドが、肝臓(Li)および腎臓(Ki)ホモジネートを生じるレーンにおいて認められる。バンドは、FVB/Prnp0/0マウスからの組織においては認められない。このブロットは、R073血清でプロービングした。(b)は、ボス・タウラスの脳および筋肉におけるPrPC発現レベルを比較するウェスタンブロットである。1匹の動物の脳ホモジネートの連続希釈物を、異なる供給業者から得た2匹の動物からの筋肉ホモジネートの希釈物と比較した。筋肉ホモジネート25μg中に認められたPrPCの量は、脳ホモジネート1.3μgにおいて認められる量よりもわずかに大きく、従って筋肉中のPrPC発現は、脳における発現の〜5〜10％である。このブロットの筋肉由来のPrPCは、脳由来のものよりもより迅速に移動し、その理由は、この筋肉は5-オクタリピートPRNP対立遺伝子を生じる動物に由来するのに対し、脳は6-オクタリピート対立遺伝子を伴う動物に由来するからである(Goldmannら、「Different forms of the bovine PrP gene have five or six copies of a short, G-C-rich element within the protein-coding exon」、J.Gen.Virol.、72:201-204(1991))。
【００６６】
示された結果は、PrPCはヒト筋肉において発現されること、およびPrPScはCJD患者の筋肉に蓄積したことを決定している(図4参照)。大腿四頭筋50mgを、本明細書に開示されおよび説明された「方法」に説明されたように調製した場合、抗PrP Fab'を用いるウェスタンブロットにより、〜27kDバンドが認められた。
【００６７】
図4は、PrPScはCJD患者の筋肉に蓄積することを示している。大腿四頭筋の筋肉および脾臓を、病理学的に確定されたCJDで死亡した患者から得た。ホモジネートを、「方法」に説明したようにプロテイナーゼKで消化し、同等な50mg組織を各レーンに負荷した。このブロットは、ヒトPrPを認識する組換えFab'であるHum-Pでプロービングした。筋肉および脾臓に認められた約25kDのバンドは、PrPScのプロテアーゼ抵抗性コア(core)を示した。
【００６８】
これらの結果は全て、PrPScはBSE畜牛由来のウシ筋肉において認められることを示している。本明細書に提供された結果は、RIIIマウスのバイオアッセイ法で、BSE畜牛の骨格筋においてプリオンを検出することができなかったこと(Wellsら、「Preliminary observations on the pathogenesis of experimental bovine spongiform encephalopathy (BSE): an update」、Vet.Rec.、142:103-106(1998))は、Tg(BoPrP)Prnp0/0において高感度バイオアッセイ法を用いて再試験すべきであることを示している(Scottら、「Identification of a prion protein epitope modulating transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to transgenic mice」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:14279-14284(1999)；Scottら、「Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to humans」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999))。感度の良いイムノアッセイ法も、プリオン疾患の畜牛またはシカ由来の筋肉中のPrPScレベルを決定する際に有用であることができる(Safarら、「Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations」、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。マウスの筋肉はプリオンを伝播および蓄積するという本明細書に提供された結果は、これまで推定されたものよりもより緊急に、ウシ筋肉においてプリオン力価の正確な決定をすることができる。
【００６９】
方法
導入遺伝子構築体
MCK-SHaPrP
マウス筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域の3.3kbp断片は、骨格筋および心筋にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現を指示する(Johnsonら、「Muscle creatine kinase sequence elements regulating skeletal and cardiac muscle expression in transgenic mice」、Mol.Cell.Biol.、9:3393-3399(1989))。pNASS-β(Clonetech社)中のβガラクトシダーゼコード配列を完全長SHaPrPのコード配列で置換え、MCKプロモーター／エンハンサーをこのベクターのXho1部位へ連結した。この完全な構築体において、SV40スプライシングドナーおよびアクセプター部位は、MCKプロモーターおよびシリアンハムスターオープンリーディングフレーム(ORF)の間に位置している。この「人工的イントロン」は、この導入遺伝子の発現を増大することができる(Choiら、「A generic intron increases gene expression in transgenic mice」、Mol.Cell Biol.、11:3070-3074(1991))。
【００７０】
α-アクチン-MoPrP
ニワトリα-アクチン遺伝子断片は、191位から転写開始部位に対し+27の位置まで広がっているが、これは骨格筋にCAT遺伝子の発現を指示する(Petropoulosら、「The chicken skeletal muscle alpha-actin promoter is tissue specific in transgenic mice」、Mol.Cell Biol.、9:3785-3792(1989))。この218bp断片は、プロモーター／エンハンサー要素および12kbpの第二のイントロンが欠失されているマウスPrP遺伝子の誘導体へ連結した(Fischerら、「Prion protein (PrP) with amino-proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie」、EMBO J.、15:1255-1264(1996))。
【００７１】
TTR-MoPrP
マウスのトランスサイレチン(TTR)遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー配列を含むおよそ300bpの配列を、先に説明したα-アクチン-MoPrP構築体において使用したマウスPrP遺伝子の同じ修飾した断片へ連結した。使用したトランスサイレチンプロモーター／エンハンサー配列は、肝臓および脳に直接発現し、場合によっては腎臓に発現することが、これまでに明らかにされている(Costaら、「The cell-specific enhancer of the mice transthyretin (prealbumin) gene binds a common factor at one site and a liver-specific factor(s) at two other sites」、Mol.Cell Biol.、8:81-90(1988))。
【００７２】
微量注入およびスクリーニング
前述の導入遺伝子構築体は、FVB/Prnp0/0マウスに導入した。α-アクチン-MoPrPおよびTTR-MoPrP導入遺伝子の組込みは、テールDNAのマウスPrP特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより検出したが、MCK-SHaPrP導入遺伝子の存在はMCK-SHaPrP接合部を超えて増幅するプライマーを用いるテールDNAのポリメラーゼ連鎖反応により決定した。
【００７３】
PrP 発現の分析
臓器ホモジネートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に調製した。骨格筋について、近位後肢筋をホモジナイズした。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法(Pierce社)によりタンパク質濃度を決定した後、指定量の総タンパク質を、常法に従うウェスタンブロットにより、化学発光検出システム(ECL, Amersham社)を用い分析した(Sambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1989))。ブロットは、マウスおよびハムスターPrPを認識するポリクローナルウサギ抗血清である、R073(Serbanら、「Rapid detection of Creutzfeldt-Jakob Disease and scrapie prion proteins」、Neurology、40:110-117(1990))；マウスPrPを認識する組換え抗体である、Hum-D13(Peretzら、「Strain-specified relative conformational stability of the scrapie prion protein」Protein Sci.、10:854-863(2001))；ハムスターPrPは認識するがマウスのそれは認識しないモノクローナル抗体である、3F4(Kascsakら、「Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins」、J. Virol.、61:3688-3693(1987))；または、ウシPrPを認識する組換え抗体である、HumP(J.Safar、個人的情報)でプロービングした。PrP発現レベルは、ウェスタンブロットにおける適当なホモジネートの連続希釈物の視覚検査により決定した。
【００７４】
骨格筋 PrP Sc の検出
マウス筋肉のホモジネートを液体窒素下で微粉化し、PBS中に10％に懸濁し、その後Potter-Elvehjemホモジナイザーの10ストロークに供した。プロテイナーゼ消化のために、PBS中の4％サルコシル等量をホモジネート1〜4mlに添加し、PKを、PKのホモジネート総タンパク質に対する比1:50で添加した。この試料を、37℃で1時間振盪しながらインキュベーションし、その後プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete、Boehringer-Mannheim社)を添加した。リンタングステン酸(PTA)沈殿を、試料に固定角ローターにおいて4℃、20,000×gで遠心分離に供した以外は、既報のように行った(Safarら、「Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations」、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。ウェスタンブロットおよび検出を先に説明されたように行った。脳および筋肉PrPScの相対量を、ウェスタンブロット上において脳ホモジネートの連続希釈物から得たバンドの筋肉由来のPrPScを表わすバンドに対するバンド密度の比較により決定した。写真フィルムをフラットベッド型スキャナーでデジタル化した画像のNIH Imageソフトウェア解析を用いてバンド密度を定量し、脳の中のPrPSc量に対して筋肉中の量を内挿した。いくつかの異なる期間の曝露の解析から得た平均値を報告した。ヒト筋肉は、ホモジネーションを使い捨てプラスチック製組織グラインダーを用いて行いPTA沈殿を省略した以外は、マウス筋肉のように調製した。
【００７５】
マウスのプリオン接種
筋肉内接種または腹腔内接種したマウスは、スクレイピーの徴候を示すSc237プリオンを接種したシリアンハムスターからまたはRMLプリオンを接種したCD-1マウスのいずれかからの、10％のプールした脳ホモジネート50μl(プリオンおよそ107 ID50単位)を受け取った。脳内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスは、RML感染したマウス脳の最終1％ホモジネート30μlを受け取った(およそ105 ID50単位)。
【００７６】
インキュベーション時間アッセイ法
臓器ホモジネートのプリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定した。ハムスターPrPを発現するTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の組織は、シリアンハムスターにおいてアッセイした(Prusinerら、「Measurement of the scrapie agent using an incubation time interval assay」、Ann.Neurol、11:353-358(1982)；Prusinerら、「Prion Biology and Diseases」(Prusiner, S.B.編集)653-715、(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1999))。マウスPrPを発現するTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の組織を、マウスPrnpaを過剰発現しているトランスジェニック系統であるTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした(Tellingら、「Interactions between wild-type and mutant prion proteins modulate neurodegeneration in transgenic mice」、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。RMLプリオン株を使用するTg(MoPrP)4053/FVBについてのインキュベーション時間-プリオン力価の相関は、以下である：
対数力価(ID50単位/g)＝1+32.189*e(-O.0278*( 平均インキュベーション時間 ( 日数 ))
(Supattaponeら、「Branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma cells」、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。インキュベーション時間アッセイ法は、高い力価よりも低いプリオン力価を推定する際に正確さが低くなる。ここで適用される慣例は、一部、しかし全てではない接種された動物が罹病する場合力価は103 ID50単位/g未満であり、動物が罹病しない場合力価は102 ID50単位/g未満であるという推定であった。低い力価の別の推定は、(0.5t)Nは接種しない動物がスクレイピーを発症する見込みであるので(ここで、Nは接種した動物数であり、tは1回接種当りのID50単位力価である)、伝達ゼロの少なくとも5％見込みを有する最大力価は、0.43単位/接種であるか、または約103.2 ID50単位/g組織であると推定することにより得られ、従ってこれはこのアッセイ感度の下限である。
【００７７】
Sc237プリオンのバイオアッセイ法の一部において全ての脳内接種したハムスターは疾患発症したが、力価に対する平均インキュベーション時間の標準曲線を描く式から計算したプリオン力価は、1 ID50単位/接種よりも有意に低い推定値を生じた。これらの場合において、プリオン力価は、他の実験と比較することができるように計算して報告した。全ての動物が疾患を発症した場合には、力価は全ての接種された動物が罹病する少なくとも5％の見込みを生じるために必要な最小値よりも大きいので、実際の力価は有意に高い可能性がある。8匹の動物が1％ホモジネート50μlを接種された場合、全ての動物がスクレイピーを発症する尤度は(1-0.5t)Nであるので、この値は1.7 ID50単位/接種または約103.5 ID50単位/g組織である。
【００７８】
実施例
特定の筋肉において認められた PrP Sc の個別のレベル
材料および方法
骨格筋内の PrP Sc 検出
筋肉組織を液体窒素下で微粉化し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に10％に懸濁し、その後Potter-Elvehjemホモジナイザーの10ストロークに供した。プロテイナーゼ消化のために、PBS中の4％サルコシルを等量をホモジネート1〜4mlに添加し、プロテイナーゼK(PK)を、PKのホモジネートのタンパク質に対する比1:50で添加した。この試料を、37℃で1時間振盪しながらインキュベーションし、その後プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete、Boehringer-Mannheim社)を添加した。リンタングステン酸沈殿を、試料に固定角ローターにおいて4℃、20,000×gで遠心分離に供した以外は、既報のように行った(Safar, J.、Wille, H.、Itri, V.、Groth, D.、Serban, H.、Torchia, M.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。
【００７９】
ウェスタンブロットおよびPrP検出を、先に説明されたように行った(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。脳および筋肉PrPScの相対量を、ウェスタンブロット上において脳ホモジネートの連続希釈物から得たバンドの筋肉由来のPrPScを表わすバンドに対する密度の比較により決定した。写真フィルムのデジタル化した画像のNIH Imageソフトウェア解析を用いてバンド密度を定量し、脳の中のPrPSc量に対して筋肉中の量を内挿した。いくつかの異なる期間の曝露の解析から得た平均値を報告した。
【００８０】
ELISAを用いるPrPSc検出のために、PK消化した筋肉ホモジネートを先に説明したように遠心分離した後、6Mグアニジンチオシアネートで変性した。引き続き変性したホモジネートを、96ウェルImmulon II ELISAプレート(Dynex社)の表面上に固定し、表面の残余を3％ウシ血清アルブミンでブロックした。PrPScの検出は、1×Tris緩衝生理食塩水中のHuM-D18抗体の2時間のインキュベーション(Peretz, D.、Scott, M.、Groth, D.、Williamson, A.、Burton, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Protein Sci.、10:854-863(2001))、それに続くアルカリホスファターゼに複合したヤギ抗ヒトFab抗体(Pierce社)との1時間のインキュベーションにより行った。追加の1時間のインキュベーションは、405nmで測定することができる呈色生成物の発色のためにアルカリホスファターゼ基質である1-工程pNPP(Pierce社)を利用した。
【００８１】
マウスのプリオン接種
マウスに、スクレイピーの徴候を示すSc237プリオンを接種したシリアンハムスター由来またはRocky Mountain Laboratory(RML)プリオンを接種したCD-1マウスのいずれかに由来した、10％プールした脳ホモジネート50μlを筋肉内または腹腔内に接種した。この接種物は、〜107 ID50単位のプリオンを含んだ。脳内接種したマウスは、RML感染またはMe7感染したマウス脳の最終1％のホモジネート30μlを受け取った(〜106 ID50単位)。
【００８２】
プリオン力価の決定
臓器ホモジネート中のプリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定した。シリアンハムスター(SHa)PrPを発現しているTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の組織を、シリアンハムスターにおいてアッセイした(Prusiner, S.B.、Cochran, S.P.、Groth, D.F.、Downey, D.B.、Bowman, K.A.およびMartinez, H.M.、Ann.Neurol.、11:353-358(1982)；Prusiner, S.B.、Kaneko, K.、Cohen, F.E.、Safar, J.およびRiesner, D.、「Prion Biology and Diseases」、Prusiner, S.B.編集(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー)、653-715、(1999))。マウス(Mo)PrPを発現しているTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の組織を、マウスPrnpaを過剰発現しているトランスジェニック系統であるTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした(Telling, G.C.、Haga, T.、Torchia, M.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。RMLプリオン株を使用するTg(MoPrP)4053/FVBに関するインキュベーション時間とプリオン力価の間の関係は、以下である：
対数力価(ID50単位/g)＝1+32.189*e(-O.0278*( 平均インキュベーション時間 ( 日数 ))
(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。インキュベーション時間アッセイ法は、高い力価よりも低いプリオン力価を推定する際に正確さが低くなる。この論文で適用される慣例は、一部、しかし全てではない接種された動物が罹病する場合力価は103 ID50単位/g未満であり、動物が罹病しない場合力価は102 ID50単位/g未満であるという推定であった。低い力価の別の推定は、(0.5t)Nは接種しない動物がスクレイピーを発症する見込みであるので(ここで、Nは接種した動物数であり、tは1回接種当りのID50単位力価である)、伝達ゼロの少なくとも5％見込みを有する最大力価は、0.43単位/接種であるか、または約103.2 ID50単位/g組織であると推定することにより得られ、従ってこれはこのアッセイ感度の下限である。Sc237プリオンのバイオアッセイ法の一部において、全ての脳内接種したハムスターは疾患を発症したが、力価に対する平均インキュベーション時間の標準曲線を描く式から計算したプリオン力価は、1 ID50単位/接種よりも有意に低い推定値を生じた。これらの場合において、プリオン力価は、他の実験と比較することができるように計算して報告した。全ての動物が疾患を発症した場合には、力価は全ての接種された動物が罹病する少なくとも5％の見込みを生じるために必要な最小値よりも大きいので、実際の力価は有意に高い可能性がある。8匹の動物が1％ホモジネート50μlを接種された場合、全ての動物が疾患発症する尤度は(1-0.5t)Nであるので、この値は1.7 ID50単位/接種または約103.5 ID50単位/g組織である。
【００８３】
導入遺伝子構築体
MCK-SHaPrP
マウス筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域の3.3kbp断片は、骨格筋および心筋にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現を指示する(Johnson, J.B.、Wold, B.J.およびHauschka, S.D.、Mol.Cell.Biol.、9:3393-3399(1989))。本発明者らは、pNASS-β(Clonetech社)中のβガラクトシダーゼコード配列を完全長SHaPrPのコード配列で置換え、MCKプロモーター／エンハンサーをこのベクターのXho1部位へ連結した。この完全な構築体において、SV40スプライシングドナーおよびアクセプター部位は、MCKプロモーターおよびシリアンハムスターオープンリーディングフレーム(ORF)の間に位置している。この「人工的イントロン」は、この導入遺伝子の発現を増大することができる(Choi, T.、Huang, M.、Gorman, C.およびJaenisch, R.、Mol.Cell Biol.、11:3070-3074(1991))。
【００８４】
α-アクチン-MoPrP
ニワトリα-アクチン遺伝子断片は、191位から転写開始部位に対し+27の位置まで広がっているが、これは骨格筋にCAT遺伝子の発現を指示する(Petropoulos, C.J.、Rosenberg, M.P.、Jenkins, N.A.、Copeland, N.G.およびHughes, S.H.、Mol.Cell Biol.、9:3785-3792(1989))。本発明者らは、この218bp断片を、プロモーター／エンハンサー要素および12kbpの第二のイントロンが欠失されているマウスPrP遺伝子の誘導体へ連結した(Fischer, M.、Rulicke, T.、Raeber, A.、Sailer, A.、Moser, M.、Oesch, B.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、EMBO J.、15:1255-1264(1996))。
【００８５】
TTR-MoPrP
マウスのトランスサイレチン(TTR)遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー配列を含むおよそ300bpの配列を、先に説明したα-アクチン-MoPrP構築体において使用したマウスPrP遺伝子の同じ修飾した断片へ連結した。使用したTTRプロモーター／エンハンサー配列は、肝臓および脳に直接発現し、場合によっては腎臓に発現することがこれまでに明らかにされている(Costa, R.H.、Lai, E.、Grayson, D.R.およびDarnell, J.E.Jr.、Mol.Cell Biol.、8:81-90(1988))。
【００８６】
微量注入およびスクリーニング
前述の導入遺伝子構築体をFVB/Prnp0/0マウスに導入した。α-アクチン-MoPrPおよびTTR-MoPrP導入遺伝子の組込みは、テールDNAのマウスPrP特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより検出したが、MCK-SHaPrP導入遺伝子の存在はMCK-SHaPrP接合部を超えて増幅するプライマーを用いるテールDNAのポリメラーゼ連鎖反応により決定した。
【００８７】
PrP 発現の分析
臓器ホモジネートをPBS中に調製した。骨格筋について、本発明者らは近位後肢筋をホモジナイズした。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法(Pierce社)によりタンパク質濃度を決定した後、指定量の総タンパク質を、常法に従うウェスタンブロットにより化学発光検出システム(ECL, Amersham社)を用いて分析した(Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1989))。ブロットは、マウスおよびハムスターPrPを認識するポリクローナルウサギ抗血清である、R073(Serban, D.、Taraboulos, A.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Neurology、40:110-117(1990))；マウスPrPを認識する組換え抗体である、Hum-D13(Peretz, D.、Scott, M.、Groth, D.、Williamson, A.、Burton, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Protein Sci.、10:854-863(2001))；ハムスターPrPは認識するがマウスのPrPは認識しないモノクローナル抗体である、3F4(Kascsak, R.J.、Rubenstein, R.、Merz, P.A.、Tonna-DeMasi, M.、Fersko, R.、Carp, R.I.、Wisniewski, H.M.およびDiringer, H.、J. Virol.、61:3688-3693(1987))；または、ウシPrPを認識する組換え抗体である、Hum-P(J.Safar、個人的情報)でプロービングした。本発明者らは、PrP発現レベルをウェスタンブロットにおける適当なホモジネートの連続希釈物の視覚検査により決定した。
【００８８】
結果
筋肉内の実質的プリオン力価
PrPC発現はプリオン伝播に必須であるので、本発明者らは最初にウェスタンブロット分析を使用し、マウスおよび畜牛(ボス・タウラス)の両方において、PrPCが骨格筋中に脳内レベルの約5〜10％のレベルで発現されることを確認した(図5；Horiuchi, M.、Yamazaki, N.、Ikeda, T.、Ishiguro, N.およびShinagawa, M.、J.Gen.Virol.、76:2583-2587(1995)；Bendheim, P.E.、Brown, H.R.、Rudelli, R.D.、Scala, L.J.、Goller, N.L.、Wen, G.Y.、Kascsak, R.J.、Cashman, N.R.およびBolton, D.C.、Neurology、42:149-156(1992))。本発明者らは次に、インキュベーション時間アッセイ法を用い、疾患徴候を示しているFVBマウスの後肢筋のプリオン力価を決定した。RMLプリオンを脳内接種した後128日目に屠殺したマウスから採集した筋肉は、力価105〜106 ID50単位/gを持っていた(表4)。
【００８９】
（表4） 野生型 FVBマウス組織のおけるプリオン力価*
*マウスは、神経疾患の徴候を示した時点で屠殺し、これはRMLプリオンの脳内接種後128日目であった。
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡Tg(MoPrP)4O53/FVBマウスにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。
【００９０】
これらの同じマウス由来の、野生型マウスにおいてはほとんどPrPCを発現しない臓器である肝臓(Raeber, A.J.、Sailer, A.、Hegyi, I.、Klein, M.A.、Rulike, T.、Fischer, M.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))のホモジネートは、スクレイピーを伝達しないか、またはわずかなマウスのみに伝達し、これは力価103 ID50単位/gまたはそれ未満を示しているので、これらの筋肉中のプリオンの驚くべき高力価は、脳由来のプリオンによるマウス臓器の全般的汚染を表わしてはいない。先行する研究では、プリオン感染症の徴候を示しているマウスにおける脳プリオン力価は、Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイされた場合、典型的には、109〜1010 ID50単位/gである(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。
【００９１】
図5(a)は、FVBマウスの様々な組織におけるPrPC発現のレベルを示しているウェスタンブロットである。最高レベルのPrPCは脳(Br)であるが、完全にグリコシル化されたPrPCに相当する個別のバンドが骨格筋(Sk Mu)および心臓(He)ホモジネートのレーンにも認められる。部分的にグリコシル化されたPrPCを明らかに表わしているかすかなバンドは、肝臓(Li)および腎臓(Ki)ホモジネートを生じるレーンに認められる。FVB/Prnp0/0マウス由来の組織にバンドは認められない。このブロットは、R073ポリクローナル抗血清でプロービングされる。図5(b)は、ボス・タウラスの脳および筋肉中のPrPC発現レベルを比較するウェスタンブロットを示している。1匹の動物由来の脳ホモジネートの連続希釈物は、異なる供給業者から得た2匹の動物由来の筋肉ホモジネート希釈物と比較した。筋肉ホモジネート25μlにおいて認められるPrPCの量は、脳ホモジネート1.3μgにおいて認められるものよりもわずかに大きい。これらの結果は、筋肉におけるPrPC発現は、脳のそれの〜5から10％である。このブロットの筋肉由来のPrPCは、脳に由来したものよりもより迅速に移動し、その理由は、筋肉が5-オクタリピートPRNP対立遺伝子を生じる畜牛に由来するのに対し、脳は6-オクタリピート対立遺伝子を持つ動物に由来するからである(Goldmann, W.、Hunter, N.、Martin, T.、Dawson, M.およびHope, J.、J.Gen.Virol.、72:201-204(1991))。
【００９２】
PrP Sc の特定の筋肉群における示差的な蓄積
本発明者らが骨格筋において発見した感染性プリオンの高力価を確認するために、本発明者らはプロテアーゼ抵抗性PrPScの存在を検出するためにウェスタンイムノブロットを使用した。本発明者らは最初に、RMLプリオンの脳内接種の128日後に神経疾患の徴候を示している野生型 CD-1マウスの後肢筋を試験した(図6a)。これらのマウス由来であるが未接種の対照由来ではない筋肉ホモジネートは、脳において認められるPrPScのものと同じ見かけの分子量およびグライコフォーム比のPK抵抗性PrPScを示した。ウェスタンブロットにおける筋肉および脳ホモジネートの連続希釈物の比較は、筋肉のプロテアーゼ抵抗性PrPScは、脳におけるプロテアーゼ抵抗性PrPScよりも〜500倍低いことを明らかにした(データは示さず)。この脳／筋肉PrPSc比102.7は、脳／筋肉プリオン力価の比である約103に類似している。
【００９３】
本発明者らは次に、様々な筋肉群内のPrPScの分布を試験した。これらの研究のために、本発明者らは、マウスプリオンのMe7株を脳内接種した138または146日目に疾患の徴候を示しているマウスを使用した。再度本発明者らは、後肢筋内の実質的PK抵抗性PrPSc蓄積を観察した(図6b)。対照的に、本発明者らは、1匹のマウスの前肢筋肉の例外を除いて、頭部および頸部、背部または前肢を含む他の領域からの骨格筋におけるPrPSc蓄積は検出しなかった(図6c)。ウェスタンブロット分析において示される領域特異的PrPSc蓄積を確認するために、本発明者らは、ELISAを用いPrPScのレベルを測定し、これはウェスタンブロットよりもより定量的な結果をもたらした(表5)。感染したマウスの後肢の筋肉、および先に説明したような1匹のマウスの前肢筋肉のみが、有意にバックグラウンドを上回る値を有した。
【００９４】
図6(a)は5個のレーンを示し、レーン1は、未接種のCD-1マウス由来の未処理の脳ホモジネートを含む。他のレーンは全て、CD-1マウス筋肉のPK消化したホモジネートの不溶性の画分を含む。プロテアーゼ抵抗性PrPScは、未接種のマウスの筋肉においては認められなかったのに対し(レーン2)、PrPScは、RMLプリオンの脳内接種後132日目に、神経疾患の徴候を示しているマウスの筋肉において容易に検出可能であった(レーン4および5)。比較のために、疾患徴候を示しているマウス由来の脳ホモジネートを、未接種のマウスの筋肉ホモジネートへ1:1000希釈した(レーン3)。負荷した量は、プロテイナーゼ消化および沈殿前の、ホモジネートの総タンパク質(mg)の等量として表した。レーン4および5は、レーン2および3の当初のホモジネートの2倍の生成物が負荷されたことに注意。
【００９５】
図6(b)において、Me7プリオンを接種した3匹の罹病したFVBマウスの後肢骨格筋をホモジネートし、分析を行った。これらのマウスは、Me7プリオンの脳内接種後138日目(MK70665)および146日目(MK70658、MK70659)に、スクレイピーの典型的臨床徴候を示した。試料は、PKで消化するか(レーン2、4、6)、または消化しなかった(レーン1、3、5)。PK消化した筋肉ホモジネート2mgおよび未消化の筋肉ホモジネート約60μgを分析に使用した。
【００９６】
図6(c)において、パネルbにおいて分析したマウスの頭部-頸部(HN)、背部(B)、および前肢(FL)の筋肉組織を、後肢筋を採集した時点で採集した。レーンには、PK消化した(偶数レーン)および未消化の筋肉ホモジネート(奇数レーン)を負荷した。分析方法はパネルbにおいて説明したものと同じであった。全てのブロットは、HuM-D13抗体でプロービングした。
【００９７】
（表5） Me7プリオンを脳内接種したマウス由来の筋肉組織の様々な領域における示差的プロテアーゼ抵抗性PrPSc蓄積
*平均および標準偏差(S.D.)は、ELISAの2つ組または3つ組から得た。S.D.を伴わない数値は、単独のELISA測定から得た。
†P値は、複数の比較を補正するために、α＝0.0125のt検定を用い、全て接種したマウス由来の所定の領域の筋肉に対して未接種のマウスの全ての筋肉を比較して計算した。
【００９８】
筋肉における固有のプリオン複製
筋肉組織は、様々な細胞型で構成され(Engel, A.およびBanker, B.Q.、「Myology: basic and clinical」(McGraw-Hill社、ニューヨーク)(1986))、かつ神経組織に密に会合している。プリオンが筋原線維において複製するかどうかを決定するために、本発明者らは、筋細胞特異的プロモーターの制御下でのみPrPを発現するふたつの系統のトランスジェニック(Tg)マウスを構築した。各系統について、本発明者らは導入遺伝子を染色体PrP遺伝子が破壊されているFVBマウス(Prnp0/0)へ導入した(Telling, G.C.、Haga, T.、Torchia, M.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996)；Bueler, H.、Fisher, M.、Lang, Y.、Bluethmann, H.、Lipp, H.-P.、DeArmond, S.J.、Prusiner, S.B.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、Nature、356:577-582(1992))。第一の系統において、Tg(α-アクチンMoPrP)6906/Prnp0/0と称されるニワトリα-アクチンプロモーターはマウスPrnpa対立遺伝子の発現を指示する。第二の系統において、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0と称されるMCKプロモーターはSHaPrPの発現を起動する。
【００９９】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウス由来の骨格筋(図7a)は、PrPCを、野生型マウス脳において認められるレベルよりも約8倍より高いレベルで発現している。低レベルのPrPCは心筋において生成され、およびPrPCは脳においてかろうじて検出可能である。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0系統において、筋肉におけるPrPC発現のレベルは、ハムスター脳において発現されるPrPCレベルよりも4倍高い。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、心筋において低レベルのPrPCを発現し、および脳においてPrPCは検出されなかった(図7b)。
【０１００】
本発明者らは、Tgマウスおよび非Tg同腹仔の左後肢にプリオンを筋肉内接種し、その後接種後様々な時点でマウスを屠殺した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスに、ハムスターSc237プリオンを接種した。本発明者らは、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスにRMLプリオンを接種し、平行してプリオン伝播が不可能であるFVB/Prnp0/0マウス(Bueler, H.、Aguzzi, A.、Sailer, A.、Greiner, R.-A.、Autenried, P.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusiner, S.B.、Groth, D.、Serban, A.、Koehler, R.、Foster, D.、Torchia, M.、Burton, D.、Yang, S.-L.およびDeArmond, S.J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))に同じプリオン株を接種した。本発明者らはインキュベーション時間アッセイ法を使用し、接種した側と対側の後肢の筋肉、脳、および脾臓のホモジネート中のプリオン力価を決定した。
【０１０１】
図7は、トランスジェニックマウスにおけるPrPCの分布を示しているウェスタンブロットを示す。詳細に述べると、図7(a)において、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスは、ポリクローナル抗体R073でプロービングした。筋肉におけるPrPC発現は、野生型マウス脳における(示さず)よりも約8倍高い。(b)Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、ハムスターPrPCを認識するモノクローナル抗体である3F4でプロービングした。PrPC発現は、骨格筋(Sk.Muscle)においてのみ検出可能である。このブロットのより長い曝露(示さず)は、心筋における微量の発現を明らかにしたが、他の臓器のいずれにおいてもPrPCは検出されなかった。レーン5(肺)において最も顕著に認められた低分子量バンドは、抗マウスIg二次抗体が、予め3F4と共にインキュベーションせずに使用される場合にも認められた。(c)ふたつのTg(TTR-MoPrP)FVB/Prnp0/0マウス由来の臓器のホモジネートを、FVB脳と比較した。ブロットは、R073でプロービングした。肝臓におけるPrPC発現はFVB脳よりも低いが、このトランスジェニック系統のマウス脳内よりも高かった。非常に少量のPrPCが腎臓において発現される。肝臓からのPrPCのグリコシル化された形は、これらの同じマウスまたはFVBマウスの脳由来の対応するグライコフォームよりもより迅速に移動する。
【０１０２】
本発明者らは、RMLプリオンを接種したTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスから接種後350日目に得た筋肉において、＞107 ID50単位/gの力価を認めた。力価は一般に、Sc237プリオンを接種したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの筋肉において低く、2匹のマウスにおいて〜104 ID50単位/gであり、かつ別のマウスにおいて〜108 ID50単位/gであり、これら3匹は全て接種後413日目に屠殺した(表6)。接種後76日目に屠殺した第四のマウスの筋肉プリオン力価は、〜104 ID50単位/gであった。本発明者らは、未接種のTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスからの筋肉ホモジネートにおいてはプリオンを検出しなかった。
【０１０３】
いくつかの実験を行い、筋肉において認められたプリオンはそこで形成されたことを確認した。ふたつの実験の結果は、測定したプリオンの給源としての接種物が残留したことを排除した。第一に、プリオンは、FVB/Prnp0/0マウスの筋肉において検出されず、これはプリオンを伝播することが不可能であり(Bueler, H.、Aguzzi, A.、Sailer, A.、Greiner, R.-A.、Autenried, P.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、 Cell、73:1339-1347(1993)；Prusiner, S.B.、Groth, D.、Serban, A.、Koehler, R.、Foster, D.、Torchia, M.、Burton, D.、Yang, S.-L.およびDeArmond, S.J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))、RMLプリオンの筋肉内接種後350日目に、このプリオンは一掃されたことを示した。第二に、FVB/Prnp0/0マウスは、PrPCを発現しているマウスよりもプリオンをより効率的に一掃すると考えられるので(Race, R.およびChesebro, B.、Nature、392:770(1998))、本発明者らは、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0およびFVB/Prnp0/0マウスの両方に、Sc237プリオンを接種し、その後異なる間隔で接種した筋肉中のプリオン力価を決定した(表7)。プリオンは、両系統から同等に迅速に消失した。更にTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスへ接種後28日目に、同側部位に認められたプリオンのレベルは、より遅く屠殺したマウスの注射部位の対側に認められたレベルよりも少なくとも10倍低く、このことは新たな(de novo)プリオン合成を示している(表6および7の比較)。
【０１０４】
（表6）トランスジェニックマウス組織におけるプリオン力価
*動物の接種から屠殺までの日数
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡シリアンハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0組織のプリオン力価
他は全てTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした。
** 筋肉組織は、プリオン接種により感染した後肢の対側後肢に由来した。
【０１０５】
（表7） Sc237プリオン接種した後の筋肉におけるプリオン力価の漸減
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
*脳内接種されたハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。場合によっては、非常に長いインキュベーション時間が、低い力価計算値を生じ、これは過小評価された可能性が高い(方法参照)。これらの値は比較を目的として報告している。
【０１０６】
筋肉において認められたプリオンが、本発明者らのマウスの他所において生成された汚染物である可能性を排除するために、本発明者らは筋肉内接種したTgマウスの脳および脾臓におけるプリオン力価を決定した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス脳においてプリオンは検出されなかったが、Tg(α-アクチンMoPrP)6906/Prnp0/0脳において低力価が検出され、この知見は、そこで生成された低レベルのPrPCと一致している。本発明者らは、両系統の接種したマウスの脾臓においても、低いプリオン力価を認め、ウェスタンブロット分析はこれらの系統において脾臓PrPCを検出しなかったので、これは他所で形成されたプリオンの蓄積を表わしている可能性がある。脾臓および脳における力価は、全ての場合において、筋肉よりも低く；従って、筋肉における力価は、他の組織からの汚染によるものではないと思われる。
【０１０７】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、筋疾患を自然発生的に発症し、これはSHaPrPプロモーターの制御下で、PrPCが過剰発現されているマウスにおける知見に一致した(Westaway, D.、DeArmond, S.J.、Cayetano-Canlas, J.、Groth, D.、Foster, D.、Yang, S.-L.、Torchia, M.、Carlson, G.A.およびPrusiner, S.B.、Cell、76:117-129(1994))。本発明者らは、プリオン接種したマウスおよび未接種のTg対照の筋肉において同様の組織学的異常を検出した。
【０１０８】
肝細胞の非効率的なプリオン蓄積
プリオンが肝細胞において伝播するかどうかを決定するために、本発明者らは、TTRプロモーター断片が肝臓および脳神経細胞サブセットに同時のマウスPanpa発現を指示し、肝臓におけるPrPレベルが脳よりもより高いTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスを使用した(図7c)。本発明者らは、このマウスにRMLプリオンを脳内接種し、これらが疾患徴候を発症した296日目に屠殺した。接種部位の影響を試験するために、本発明者らは、Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスに、RMLプリオンを腹腔内でも接種した。
【０１０９】
RMLプリオンを脳内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスの脳におけるプリオン力価は、108〜109 ID50単位/gであったのに対し、肝臓プリオン力価はわずかに〜103 ID50単位/gであった。RMLプリオンを腹腔内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスは疾患を決して示さず、接種後523日目に屠殺した。腹腔内接種したマウスの肝臓プリオン力価は脳内接種したマウスの力価に類似していた。肝臓プリオン力価は低いが、RMLプリオンを接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の肝臓ホモジネートはRML接種したFVBマウス由来の肝臓ホモジネートよりも有意に多いのマウスに疾患を伝達したので、肝臓における高レベルのPrPCはプリオン形成を増強することは明らかである(表4および6、P＜0.001、フィッシャー直説法)。
【０１１０】
これらのデータは、異なる細胞型はPrPC発現レベルが同様である場合であっても著しく異なる効率でプリオンを蓄積することを示している。マウスPrPCを発現しているTgマウスにおける3種の組織を比較することにより、RMLプリオン力価は、脳において〜109 ID50単位/g、肝臓において〜103 ID50単位/g(Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスについて)、および後肢骨格筋において107 ID50単位/gであった(Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスについて)。プリオン蓄積の異なるレベルは、プリオン複製に関与するとみなされた補助的タンパク質の制限された発現の一部によるものである可能性がある(Kaneko, K.、Zulianello, L.、Scott, M.、Cooper, C.M.、Wallace, A.C.、James, T.L.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:10069-10074(1997)；Zulianello, L.、Kaneko, K.、Scott, M.、Erpel, S.、Han, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、J. Virol.、74:4351-4360(2000))。肝臓PrPCの明らかに異なるグリコシル化はそこで認められる非効率的なプリオン蓄積に寄与し得るが、脳および筋肉PrPScは、識別不能のグライコフォームにもかかわらず異なるレベルの蓄積を示した。肝細胞またはT細胞の細胞型においてPrPを発現するTgマウスのこれらの細胞種においてプリオンは伝播できなかったと結論付けた他の研究者らの研究(Raeber, A.J.、Sailer, A.、Hegyi, I.、Klein, M.A.、Rulike, T.、Fischer, M.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))によっても注目されている。しかしこれらの執筆者らは、それらのマウスの肝臓において達成されたPrP発現レベルは極めて低く、循環血中T細胞に検出可能なプリオンが存在しないことは、自然な代謝回転の間のプリオン感染細胞の喪失に起因するかまたはプリオンに関連した毒性によるものである可能性があることことを述べている。
【０１１１】
考察
前述の実験は、マウス骨格筋は、プリオン伝播が本来可能であること、少なくとも107 ID50単位/gと高い力価で筋肉に蓄積することができること、および最も驚くべきことに、この蓄積の効率は体の異なる領域から採取した筋肉群間で著しく変動することを明らかにしている。本発明者らが、野生型マウスにおいておよび骨格筋においてほぼ独占的にPrPCを発現しているトランスジェニックマウスにおいて、ふたつの異なるプリオン株で同様の結果を得た点で、本発明者らの骨格筋におけるプリオン蓄積の知見は明白であるように見える。プリオンがある種の筋肉において他よりより効率的に蓄積する理由は明らかではない。しかし、異なる骨格筋群は、多くの疾患過程の易罹患性が異なることを示しており、その特徴はおそらく異なる体領域の骨格筋における生化学的差異を反映していると思われる。
【０１１２】
トランスジェニックマウスにおける研究(Telling, G.C.、Scott, M.、Mastrianni, J.、Gabizon, R.、Torchia, M.、Cohen, F.E.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Cell、83:79-90(1995))および培養した細胞における研究(Kaneko, K.、Zulianello, L.、Scott, M.、Cooper, C.M.、Wallace, A.C.、James, T.L.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:10069-10074(1997)；Zulianello, L.、Kaneko, K.、Scott, M.、Erpel, S.、Han, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、J. Virol.、74:4351-4360(2000))は、プリオンの効率的伝播に必要であるこれまでプリオンタンパク質変調因子「PPMF」と称された、PrP以外の細胞因子に関係している。おそらく一部の骨格筋のみが、高力価のプリオンを蓄積することができる十分量のPPMFを有する。同様に、本発明者らの研究により明らかになった肝組織におけるプリオンの非効率的な蓄積は、プリオン伝播におけるPPMFのような補助因子の役割の更なる証拠である。
【０１１３】
この高いプリオン力価は、CNSおよびリンパ組織が筋肉から慎重に除去される場合であっても骨格筋において認められることがあり、プリオン感染した動物由来の精肉を消費するヒトが感染を獲得するリスクがあるという懸念を生じている。しかしプリオン汚染された精肉から疾患を発症するヒトのリスクを評価する場合には、いくつかの注意点が考慮されるべきである。第一に、筋肉におけるプリオン蓄積の効率は、関連した宿主種またはプリオン株のいずれかにより変動し得る。実際、マウスRMLプリオンは、ハムスターSc237プリオンよりもより効率的に筋肉に蓄積するように見える。第二に経口伝達は、本試験において報告されたバイオアッセイ法に使用した脳内接種と比較して非効率である。ハムスターにおいて、経口曝露は、脳内経路の場合よりも105〜109倍低い効率である(Prusiner, S.B.、Cochran, S.P.およびAlpers, M.P.、J.Infect.Dis.、152:971-978(1985)；Diringer, H.、Roehmel, J.およびBeekes, M.、J.Gen.Virol.、79:609-612(1998))。最後に、種の壁が考慮されるべきである。多くの場合において、ひとつの種から別の種へプリオンが効率的に伝達されるには、これらふたつの種の間でPrPのアミノ酸配列の高度の相同性が必要である。しかし、アミノ酸配列が伝播効率に影響を及ぼす程度は、プリオン株に左右される。nvCJDプリオンである場合、ウシPrPCを発現しているTgマウスは、ヒトまたはキメラヒト-マウスPrPCのいずれかを発現しているTgマウスよりもはるかにヒト脳由来のnvCJDプリオンに罹患し易い(Scott, M.R.、Will, R.、Ironside, J.、Nguyen, H.-O.B.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999)；Hill, A.F.、Desbruslais, M.、Joiner, S.、Sidle, K.C.L.、Gowland, I.、Collinge, J.、Doey, L.J.およびLantos, P.、Nature、389:448-450(1997))。
【０１１４】
先行する研究は一般に、筋肉組織における低いプリオン力価を報告している。これらの研究の一部は、非効率的な種を超えた(cross-specie)伝達を用いており、これは筋肉におけるプリオン検出の失敗に寄与している(Wells, G.A.H.、Hawkins, S.A.C.、Green, R.B.、Austin, A.R.、Dexter, I.、Spencer, Y.I.、Chaplin, M.J.、Stack, M.J.およびDawson, M.、Vet. Rec.、142:103-106(1998))。本発明者らの調査は、この失敗に関するもう一つの可能性のある説明を明らかにしている。筋肉プリオン蓄積は筋肉群間で、またはおそらく特異的筋肉間で変動するので、先行する研究は、最高のプリオン力価を生じる筋肉の試料採取に失敗している可能性がある。プリオンが、プリオン疾患を有するヒトのある筋肉において、プリオン疾患を有するマウスにおいて本発明者らが認めたレベル近傍にまで蓄積する場合、全ての型のCJDおよび関連した障害を、生検のための筋肉組織を使用して確定診断することが可能であるはずである。この方法は、現在ヒトにおいてプリオン疾患を確定診断する唯一の方法である、比較的困難かつ病的な(morbid)脳生検法に勝る有意な利点を提供するであろう。
【０１１５】
前記結果は、BSEの畜牛、スクレイピーのヒツジ、またはCWDのシカおよびヘラジカの骨格筋におけるプリオン蓄積が未だ確立されていないことを示している。しかし本発明者らの知見は、動物の骨格筋におけるプリオン分布を決定する包括的および体系的試みが緊急に必要とされていることを示している。この筋肉におけるプリオン分布は、動物種、おそらくは種の交雑、変種、および系統に加えプリオン株によってさえも変動しうる。このようなアッセイ法は、トランスジェニックマウスにおけるバイオアッセイ法および筋肉組織におけるPrPSc検出に適合された定量的イムノアッセイ法のような、感度の良い定量的技術を用いて実行されることが必要である。
【０１１６】
本発明はそれらの具体的態様を参照し説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、かつ同等物と交換することができることは当業者により理解されるべきである。加えて、多くの修飾を行い、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスのひとつまたは複数の工程を、本発明の目的、精神、および範囲に適合することができる。このような修飾は全て、本明細書に添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】脳および筋肉におけるPrPC発現のレベル検出するウェスタンブロット画像を示している。
【図１Ｂ】連続希釈による筋肉と比較した脳におけるPrPC発現のウェスタンブロット比較の画像を示している。
【図２】Ham-D13抗体でプロービングした5本のレーンの画像を示している。
【図３】図3A、3B、および3Cは、異なるトランスジェニックマウスから摘出したいくつかの異なる組織型について行ったウェスタンブロットの画像を示している。
【図４】病理学的にCJDによる死亡が確認されたヒトから摘出した筋肉および脾臓組織の画像を示している。
【図５】哺乳類筋肉におけるPrPC発現のレベルを示しているウェスタンブロットを含み、5aは脳において最高の発現を示し、5bは0/0 PrPノックアウトマウスにおいて発現を示していない。
【図６】各々筋肉におけるPrPScの消化を示すレーンを示している、図6(a)、6(b)、および6(c)を含む。
【図７】異なる組織型のウェスタンブロットを含む図であって、7(a)は、筋肉における比較的高い発現を示し；7(b)は、筋肉のみにおける発現を示し；7(c)は、筋肉におけるほぼ例外のない発現を示している。
【０００１】
米国政府の権利
米国政府は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成金番号第AG 10770号に準拠し、本出願に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、一般に筋肉組織試料の調製およびそれのプリオンの存在に関するアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
プリオンは、哺乳類において、CJD、BSE、およびスクレイピーを含む、神経変性疾患を引き起こす(Prusiner、「Novel Proteinaceous infectious particles cause scrapie」、Science、216:136-144(1982))。スクレイピーの臨床徴候を有する動物において、最高レベルのプリオンが、脳および脊髄において認められるが、他の組織、特に細網内皮系の組織は、実質的プリオン力価を示している(Eklundら、「Pathogenesis of scrapie virus infection in the mouse」、J.Infect.Dis.、117:15-22(1967)；Hadlowら、「Virologic and neurohistologic finding in diary goats affected with natural scrapie」、Vet.Pathol.、17:187-199(1980))。感染した組織の経口摂取によるプリオンの伝達は、齧歯類において説明されており、最近になっては畜牛およびヒツジにおいてよく説明されている(Prusinerら、「Immunological and molecular biological studies of prion proteins in bovine spongiform encephalopathy」、J.Infect.Dis.、167:602-613(1993)；Carp、「Transmission of scrapie by oral route: effect of gingival scarification」、Lancet、1:170-171(1982)；Phillipsら、The BSE Inquiry (Stationery Office、ロンドン)(2000))。BSEプリオンは、畜牛から十代および若年成人に明らかに伝達されたが(Willら、「Deaths from variant Creutzfeldt-Jakob Disease」、Lancet、353:979 (1999)；Scottら、「Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to humans」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999))、北米においてシカ科のプリオンがヒトへ伝達されたかどうかは、依然不明である(Sprakerら、「Spongiform encephalopathy in free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus), white-tailed deer (Odocoileus virginianus), and Rocky Mountainer elk (Cervus elaphus nelsoni) in northcentral Colorado」、J.Wildl.Dis.、33:1-6(1997))。
【０００４】
唯一分かっているプリオン構成成分は、正常な細胞表面糖タンパク質(PrPC)に由来した異常なPrPアイソフォーム(PrPSc)であり、その発現がプリオン生成には必要である((Buelerら、「Mice devoid of PrP are resistant to scrapie」、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusinerら、「Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-PrP antibodies」、Proc.Natl.Acad.Sci USA、90:10608-10612(1993))。ウェスタンブロット分析は、マウスおよび畜牛(ボス・タウラス(Bos taurus))の両方において、PrPCが、骨格筋において、脳内レベルの約5〜10％のレベルで発現されたことを明らかにし(図1)、このことは既報に一致していた(Horiuchiら、「A cellular form of prion protein (PrPC) exists in many non-neuronal tissues of sheep」、J.Gen.Virol.、76:2583-2587(1995)；Bendheimら、「Nearly ubiquitous tissue distribution of the scrapie agent precursor protein」、Neurology、42:149-156(1992))。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ひとつには、プリオンは、現在利用可能なアッセイ法により検出されるのに十分な高い濃度で、筋肉組織において認められるという予想外の知見を基にしている。筋肉におけるプリオン検出能は、本明細書において説明および開示された試料調製法を使用することにより増強される。筋肉組織は、ウシなどの哺乳類から摘出され、ホモジナイズされる。ホモジネート中のプリオンは、遠心分離、および／またはプリオンに結合し、プリオンもしくは複合体形成剤のいずれか単独よりもより高い比重の複合体を形成するリンタングステン酸ナトリウムのような複合体形成剤を用いて濃縮される。本明細書に示した試料調製およびプリオン濃縮法を使用し、プリオンは、筋肉組織中に、血中において認められるプリオン濃度の約100〜約1,000倍高いレベルで認められた。筋肉中のプリオンは、例えこれらが筋肉組織中に、プリオンが脳組織において認められるレベルの約1/100〜約1/1,000のレベルで存在したとしても検出される。
【０００６】
プリオンは筋肉において認められるという予想外の知見に加え、プリオンは、一部の筋肉または筋肉群において、他の筋肉または筋肉群と比較してより高い濃度で存在することも、予想はしていなかったが見出された。異なる筋肉群におけるプリオン濃度をマッピングし、いずれか所定の哺乳類種において最高濃度のプリオンである可能性のある筋肉を見つけることができる。後肢筋は、本明細書に提供されたデータを基に、最高濃度のプリオンを含むと考えられる。
【０００７】
本発明のある局面には、筋肉組織試料に、その中のプリオンおよび／またはPrPScの存在を検出するために、任意の型のアッセイ法が適用される。
【０００８】
本発明の特徴は、筋肉組織が、筋肉組織中のPrPScをアッセイ用に調製するために濃縮されるような方法で調製されることである。
【０００９】
本発明の利点は、筋肉が採取される動物を殺傷することなく筋肉組織が摘出され、アッセイされ得ることである。
【００１０】
別の利点は、本明細書に示されたアッセイ法は、プロテアーゼ抵抗性PrPSc(例えば、PrP27-30)および感染性の両方を検出することができることである。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により完全に説明された本発明の詳細を読むことにより、当業者には明らかになると考えられる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本アッセイ法、方法、および組成物を説明する前に、本発明は、説明された特定の態様に限定されず、従って当然変動することができることは理解されるべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用された用語は、単に特定の態様を説明する目的のためであり、限定を意図するものではないことも理解されるべきである。
【００１３】
値の範囲が提供された場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各値は、文脈が別に明確に示さない限りはその下限単位の1/10まで、および他の記載された値またはその記載された範囲内に介在する値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれても良く、記載された範囲内の特に除外された限界を条件として、これも本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらに含まれた両限界のいずれかを除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００１４】
別に定義しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものに類似したまたは同等の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料はこれから説明するものである。本明細書において言及された全ての刊行物は、その刊行物に引用された状況で方法および／または材料を開示しかつ説明するために、本明細書に参照として組入れられている。
【００１５】
本明細書および添付された特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ひとつ(a、an、およびthe)」は、その文脈が明確に別に指示しない限りは、複数の意味を含むことには注意しなければならない。従って、例えば、「あるひとつの(a)プリオン」の言及は、複数のこのようなプリオンを含み、および「そのひとつの(the)抗体」の言及は、1種または複数の抗体および当業者に公知のそれらの同等物などの言及を含む。
【００１６】
本出願に引用された全ての参考文献および特許出願は、それらの全体が参照として組込まれている。
【００１７】
本明細書において考察した刊行物は、本出願の出願日以前に明らかにされたもののみが提供されている。本明細書は、先行する発明に基づいて本発明にこのような刊行物に先行して権利を与えられるものではないことを承認する意味で構成されたものではない。更に提供された刊行物の日付は、実際の刊行の日付と異なることがあり、これは個別に確認する必要がある。
【００１８】
全般的発明
牛海綿状脳症(BSE)プリオンに感染した畜牛からの牛製品の消費が新変異型クロイツフェルトヤコブ病(nvCJD)を引き起こすことの相当な証拠が議論されている。nvCJDを予防する試みにおいて、高力価の感染性プリオンを含むと考えられている神経組織およびリンパ組織を含むある種の「特定廃棄部位(offal)」は、ヒトが消費する予定の食品から除外されている(Phillipsら、The BSE Inquiry (Stationery Office、ロンドン)(2000))。
【００１９】
本発明は、マウス骨格筋はプリオンを伝播しこれらの病原体の測定可能な力価を蓄積することを示す。本明細書に示されたデータは、実験的スクレイピーの神経学的徴候のある野生型(wt)マウスの骨格筋において、測定可能なプリオン力価およびプリオンタンパク質の疾患を引き起こすアイソフォーム(PrPSc)の両方を示している。プリオンが筋肉内で産生されるのか、もしくは単に蓄積するだけなのかを決定するために実験を行い、筋肉において専らマウスまたはシリアンハムスター(SHa)のいずれかのPrPを発現しているトランスジェニックマウスを確立した。これらのマウスへのプリオンの筋肉内(i.m.)接種は、筋肉内に新生プリオンの形成を生じた。対照的に、PrP発現が肝細胞に標的化されたマウスの接種は、非常に低い肝臓プリオン力価を生じた。従って、特定の組織に関するプリオンの指向性は、発現されたPrP量以外の要因により左右され、かつそのような要因は、骨格筋中のプリオンの伝播および蓄積を可能にしている。本明細書に提供された結果は、著しい食餌によるプリオンへの曝露が、例え神経およびリンパ組織を含まないとしても、精肉の消費によりもたらされることを示している。
【００２０】
本発明以前は、プリオンに感染した動物はその動物の筋肉組織内には、プリオンを有さない、もしくは検出可能なレベルのプリオンを有さないと広く考えられていた。しかし、本発明の試料調製法を用い、筋肉組織に存在するプリオンを濃縮するような方法で筋肉試料を調製し、および濃縮試料内に検出可能なレベルのプリオンを認めることが可能になった。
【００２１】
本発明の重要な局面は、ヒト、マウス、およびハムスターを含むいずれかの哺乳類であって良いが、より一般的にはウシ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、七面鳥、ロバなどの家畜であるような哺乳類から筋肉組織を得ることを含む、試料を調製する方法である。摘出された筋肉組織試料は、流動性のあるホモジネートを作製するために、ブレンダーのようないずれか適当な手段によりホモジナイズされる。次にこのホモジネートが、高速で超遠心に供される。この遠心分離は、遠心分離が実行される容器の底に、強制的に試料中のプリオンが生じるのに十分な期間継続される。これらのプリオンは、他のタンパク質と比較してそれらが若干小型の立体配置であるために、他のタンパク質と比較して、より高い比重を有する。次に強制的に遠心容器の底に濃縮試料には、プリオンを検出するための望ましいアッセイ法が供される。このアッセイ法は、ウェスタンブロット、ELISAアッセイ法、または1999年4月6日に公開された米国特許第5,891,641号に開示されたような高次構造依存型イムノアッセイ法(CDIアッセイ法)または2001年4月10日に公開された米国特許第6,214,565号に開示されたようなアッセイ法、または米国特許第5,846,533号に開示されたような直接抗体アッセイ法であって良く、これらの特許は全て、高次構造が変更されたタンパク質を検出、特に試料内のプリオンを検出するためのアッセイ法を開示しおよび説明するために、本明細書に参照として組入れられている。
【００２２】
好ましい本発明の局面は、試料が最初に、試料内のPrPScまたはプリオンと結合する複合体形成剤と接触させられ、プリオン単独と比較してより高い比重を有する成分を作製するような試料調製をもたらす。複合体形成剤の例は、リンタングステン酸(PTA)およびその塩を含む、ヘテロポリ酸およびそれらの塩、特にリンタングステン酸ナトリウムを含む(全般的に複合体形成剤および試料調製法が開示され、本明細書に組入れられている、米国特許第5,977,324号を参照のこと。)。
【００２３】
本発明の様々な他の局面および態様に加え、本発明の利点は、この開示内容を読むことにより当業者には明らかになると考えられる。具体的試料調製法およびアッセイ法は、本開示の一部を形成する特許請求の範囲により包含されたものである。
【００２４】
発明の局面
本発明は、以下の工程を含む、試料を調製する方法を含む：哺乳類からの筋肉組織試料を得る工程；試料をホモジナイズし、これによりホモジネートを作製する工程；ホモジネートを、ホモジネート中のPrPScに結合する複合体形成剤と接触させ、PrPScまたは複合体形成剤のいずれか単独の比重と比較してより高い比重を持つ複合体を形成させる工程；ならびに、重力の適用により複合体を濃縮する工程。
【００２５】
この筋肉組織は、試料が得られる哺乳類種の他の筋肉よりも、より高い濃度のプリオンを有する筋肉に由来する。試料は、筋肉が得られた哺乳類の他の筋肉と比較して、より高い濃度のプリオンを有する筋肉から得られる。筋肉組織試料は、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得られ、この際重力による濃縮が遠心分離により増強される。複合体形成剤は、ヘテロポリ酸およびそれらの塩から選択され、ならびにリンタングステン酸ナトリウムであって良く、この方法は、ホモジネート中のPrPcを変性するためおよびホモジネート中のPrPScの高次構造を変更するための条件および期間でホモジネートを処理する工程を含むことができる。
【００２６】
本発明は更に、下記の工程を含む、筋肉中のPrPScの存在を決定する方法も含む：筋肉組織が摘出された哺乳類種の他の筋肉組織よりもより高濃度のプリオンを含む筋肉組織から摘出されたホモジナイズした筋肉組織を、PrPScと結合する複合体形成剤と接触させ、PrPScの比重と比較してより高い比重を有する複合体を形成させる工程であって、この筋肉組織は、ヒト、ウシ、シカ、およびヒツジから選択された哺乳類から摘出される工程；濃縮試料中の複合体を濃縮するために、遠心分離に由来する力を使用する工程；濃縮試料を分析し、PrPScの存在を決定する工程。
【００２７】
更に本発明は、下記の工程を含むアッセイ法を含む：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；この試料を、試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；濃縮試料を、第一の部分および第二の部分に分ける工程；第一の部分と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質への結合よりもより高度の親和性で第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する、標識抗体とを接触させる工程；第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対してより高度の親和性を有する異なる高次構造を呈するようになる方法で第二の部分を処理する工程；第二の部分と標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；標識抗体の第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；ならびに、第一の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の結合レベルと第二の部分のレベルとを比較し、これにより筋肉試料が、疾患に関連した第二の高次構造をとるPrPタンパク質を含んだかどうかを決定する工程。
【００２８】
このアッセイ法において、筋肉組織試料は、ヒト、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得ることができ；この際濃縮は試料と複合体形成剤とを接触させる工程、および試料を遠心分離に供する工程を含む。
【００２９】
この処理は、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質の少なくとも2％を異なる高次構造へ転換するために、熱、圧力、および化学的曝露からなる群より選択される処理に第二の部分を供することにより行っても良く；ここで標識抗体は、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質対するよりも少なくとも4倍高い親和性を有するか；または、標識抗体は、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質に対するよりも少なくとも30倍高い親和性を有するか；または、標識抗体は、ユウロピウム標識された3F4 IgGであるか；または、標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルは、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定される。
【００３０】
本発明の別の局面は、下記の工程を含むアッセイ法を含む：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；この試料を、試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に、その高次構造の、標識抗体の第二の疾患関連高次構造への結合レベルよりも、標識抗体へのより高い結合親和性を有する異なる高次構造への変更を引き起こすような方法で、濃縮試料を処理する工程；濃縮され処理試料と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する結合よりもより高度の親和性で第一の高次構造および異なる高次構造をとるPrPタンパク質に結合する標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の試料中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；試料中の標識された結合レベルと標準物質への先に確立された処理された結合標準レベルとを比較し、この処理前に処理された標準物質は、(i)第一の高次構造および(ii)第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を既知量含んでいる工程；ならびに、前述の比較を基に、筋肉試料の第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を含有する可能性を決定する工程。
【００３１】
このアッセイ法において、筋肉組織試料は、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得ることができ、標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルは、フローサイトメトリーを用いて決定される。
【００３２】
このアッセイ法において、標準は、正常な罹患していない個体に由来する同等の筋肉試料中の、PrPタンパク質レベルの先の測定から得られる。
【００３３】
このアッセイ法において、標準は、第二の疾患関連高次構造に随伴した疾患と診断された個体由来の筋肉の同等の試料中の、PrPタンパク質レベルの先の測定から得られる。
【００３４】
更に別の本発明の局面は、下記の工程を含むアッセイ法である：第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；試料中に存在するプリオンを濃縮する方法で試料を濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；濃縮試料を第一の部分および第二の部分に分ける工程；第一の部分と、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に結合するよりもより高度の親和性で第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する、標識抗体とを接触させる工程；第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対してより高度の親和性を有する異なる高次構造を呈するようになる方法で第二の部分を処理する工程；第二の部分と標識抗体とを接触させる工程；標識抗体の第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；標識抗体の第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；この処理により生じるこの抗体に対する第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加を補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定されたレベルを調節する工程；差異を得るために、第一の部分における標識抗体タンパク質の結合レベルを、第二の部分における標識抗体の調節した結合レベルから減算する工程；ならびに、下記式にこの差異を当てはめる工程であって、差異はΔで表わされる工程：
[PrP]〜ΔFn->d＝Fd-(Fn ＊fn->d)
(式中、前記変数は各々下記のように提供される：
F - 任意の検出可能なシグナル；
Fn - 未変性高次構造をとるタンパク質のシグナル；
Fn αおよびFn β - それぞれ、未変性の非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
Fd - 処理したタンパク質のシグナル；
Fd αおよびFd β - 処理した非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
ΔFn->d - 未変性状態から処理状態への移行時のシグナルの増加；
ΔFα n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の非疾患高次構造のシグナルの増加；
ΔFβ n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の疾患高次構造のシグナルの増加；
fα n->d - 非疾患高次構造の未変性状態から処理状態への移行に関する相関係数；
[PrPβ] - 疾患高次構造をとるタンパク質の濃度；
〜 - 比例を示す；および
＊ - 乗法を示す)
【００３５】
本発明の任意の方法は、処理により得られる抗体に対する第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加について補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定された結合レベルを調節する工程を含むことができる。
【００３６】
別の本発明の局面は、下記の工程を含む方法である：筋肉組織試料と、PrPタンパク質に結合する複合体形成剤とを接触させる工程；複合体形成剤と筋肉試料とを、試料中のPrPタンパク質が複合体形成剤に結合し、PrPタンパク質単独または複合体形成剤単独のいずれかの密度よりもより高い密度を有する複合体を生成するような期間および条件下で接触させ続ける工程；この試料を、複合体形成剤に結合したPrPタンパク質の複合体を分離するのに十分な速度および期間で遠心分離し、試料濃縮物を提供する工程。
【００３７】
この方法は更に、複合体のPrPタンパク質を分析して特徴を決定する工程を含むことができ、この特徴は、溶解度、三次元構造、および感染性からなる群より選択される。
【００３８】
この方法は更に、PrPタンパク質の特徴と、筋肉が摘出された動物と同じ動物の脳組織から摘出されたPrPタンパク質の疾患高次構造の同じ特徴とを比較する工程を含むことができる。
【００３９】
加えて、本発明の方法は更に下記を含む：濃縮試料の第一の部分と、第一の高次構造に、第二の病原性高次構造に対するよりもより高い親和性を有する結合パートナーとを接触させ、第一の部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第一の濃度を決定する工程；試料濃縮物の第二の部分を処理し、このタンパク質の第二の高次構造の結合パートナーに対する結合親和性を増大させる工程；処理試料の第二の部分と結合パートナーとを接触させ、第二の処理した部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第二の濃度を決定する工程；第二の濃度を調節し、この調節が、処理から得られる結合パートナーに対する、第一の高次構造をとるタンパク質の増大した親和性を補正する調節された濃度を提供する工程；ならびに、第一の濃度と調節された濃度とを比較し、第二の病原性高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程。
【００４０】
この方法は、第一の濃度および第二の濃度が、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定され；タンパク質の第二の病原性高次構造は、試料中に、1×103粒子/mlまたはそれ未満の濃度で存在し；ならびに、試料の第二の部分が、第二の病原性高次構造をとるタンパク質の少なくとも2％を結合パートナーに対する増大した結合親和性を有する高次構造へ転換するのに十分な熱、圧力、および化学変性からなる群より選択される処理を用いて処理されることにより実行されうる。
【００４１】
この方法はさらに下記を含むものであることができる：試料濃縮物を、タンパク質の第二の高次構造が第二の高次構造よりも高い結合パートナーに対する親和性を有する結合高次構造へ転換するように処理する工程；処理試料を、結合パートナーと接触させ、試料中の結合パートナー／タンパク質複合体の濃度を決定する工程；濃度を調節し、タンパク質の第一の高次構造の、処理から生じる結合パートナーに対する増大した親和性を補正する調節された濃度を提供する工程；ならびに、調節された濃度と、対照濃度および予め決定された標準濃度からなる群より選択される既知の濃度とを比較し、試料中の第二の高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程。
【００４２】
更にこの方法は、結合パートナーが標識抗体を含み、複合体形成剤がリンタングステン酸の金属塩を含む方法であって、濃度はフローサイトメトリーを用いて決定され；ならびに、調節された濃度は処理された非感染対照試料から決定された既知の濃度と比較され；ならびに、調節された濃度はヒト、ウシ、およびヒツジからなる群より選択される哺乳類の非感染集団由来の処理試料に由来する予め決定された既知の濃度と比較され；ならびに、この抗体が3F4であり、かつ複合体形成剤がリンタングステン酸ナトリウムであり；ならびに、第二の高次構造をとるタンパク質が、試料中に1ml当り1×103個のタンパク質分子またはそれ未満の濃度で存在する方法であって、第一の高次構造をとるタンパク質は、試料中に1ml当り1×106個のタンパク質分子またはそれよりも多い濃度で存在する。
【００４３】
実施例
下記実施例は、いかにして本発明を製造および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが自らの本発明と見なす範囲を限定することは意図しておらず、下記の実験が、実施された全てまたは唯一の実験であることを表わすことは意図されていない。使用された数値(例えば、量、温度など)に関して精度を確実にするよう試みたが、若干の実験誤差および偏差は考慮されるべきである。特に記さない限りは、部分は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏であり、ならびに圧力は大気でまたはその近傍で行われる。
【００４４】
骨格筋および肝臓のホモジネートを、Rocky Mountain Laboratory(RML)マウスプリオン株を脳内(i.c.)接種したスクレイピーの徴候を示すFVBマウスから、128日目に調製した。これらのマウスの筋肉内プリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定したところ、105〜106 ID50単位/gであった(下記表1参照)。
【００４５】
これらの実質的筋肉内プリオン力価は、脳由来のプリオンによるマウス臓器の全般的汚染を示しておらず、その理由は、野生型マウスではほとんどPrPcを発現しない臓器である肝臓(Raeberら、「Ectopic expression of prion protein (PrP) in T lymphocytes or hepatocytes of PrP knockout mice is insufficient to sustain prion replication」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))の同じマウスに由来したホモジネートは、スクレイピーの伝達に失敗しているか、またはごくわずかなマウスにのみ伝達されるからであり、このことは力価が103 ID50単位/gまたはそれ未満であることが示している。先行する研究は、プリオン感染の徴候を示しているマウスにおける脳プリオン力価は、Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした場合に、典型的には109〜1010 ID50単位/gであることを明らかにした(Supattaponeら、「Branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma cells」、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。
【００４６】
（表1） 野生型(FVB)マウス組織におけるプリオン力価*
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおけるインキュベーション時間アッセイ法により決定した。
【００４７】
感染性プリオンに加え、プロテアーゼ抵抗性PrPScは、接種した野生型マウスの筋肉において検出されたが、未接種対照においては検出されず、これは図2に示した。ウェスタンブロットにおいて、接種したマウスのプロテイナーゼK(PK)で消化した筋肉ホモジネートは、脳において認められるPrPScのものと同じ、見かけの分子量およびグライコフォーム率を示した。筋肉および脳ホモジネートの比較は、筋肉におけるプロテアーゼ抵抗性PrPScは、脳内よりも〜500倍低かったことを示した。この脳／筋肉PrPSc比102.7は、脳／筋肉ID50単位比である約103に類似している。
【００４８】
図2は、RML感染したCD1マウスの筋肉組織内のプロテアーゼ抵抗性PrP(プリオン)を示している、ウェスタンブロット像である。詳細に述べると、レーン1は、未接種のCD1マウス由来の未処理の脳ホモジネートを含む。他のレーンは全て、CD1マウス筋肉のプロテイナーゼK消化したホモジネート由来の不溶性のペレット化された物質を含む。プロテアーゼ抵抗性PrPは、未接種のマウスの筋肉においては認められなかった(レーン2)のに対し、RMLプリオンの脳内接種後132日目の神経疾患徴候を示しているマウスの筋肉において、PrPScは容易に検出された(レーン4および5)。比較のために、スクレイピーの徴候を示しているマウス由来の脳ホモジネートを、未接種のマウス由来の筋肉ホモジネートに1:1000希釈した(レーン3)。負荷量は、プロテイナーゼ消化および沈殿前の、出発材料の総タンパク質(mg)と等量として表わした。レーン4および5は、レーン2および3の当初の材料の2倍の生成物を負荷したことに注意。このブロットは、Hum-D13抗体でプロービングした。
【００４９】
筋肉組織は、様々な細胞型により構成され(Engelら、Myology: basic and clinical、McGraw-Hill社、ニューヨーク)(1986))、神経組織と密に会合している。プリオンが、筋原線維においてそれ自身複製するかどうかを決定するために、筋細胞特異的プロモーターの制御下でのみPrPを発現するトランスジェニック(Tg)マウスのふたつの系統を構築した。各系統について、導入遺伝子を、染色体PrP遺伝子が破壊されているFVBマウス(Prnp0/0)に導入した(Buelerら、「Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein」、Nature、356:577-582(1992)；Tellingら、「Interactions between wild-type and mutant prion proteins modulate neurodegeneration in transgenic mice」、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。
【００５０】
図3A、3B、および3Cは全て、トランスジェニックマウスにおけるPrPC発現の分布を示しているウェスタンブロット像である。詳細に述べると、図3Aは、ポリクローナル抗体R073でプロービングした、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウス由来のウェスタンブロット像を示している。筋肉内のPrPC発現は、野生型マウス脳(示さず)よりも約8倍高かった。図3Bは、ハムスターPrPCを認識するモノクローナル抗体である3F4でプロービングした、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスからのウェスタンブロット像を示している。PrPC発現は、骨格筋(Sk.Muscle)においてのみ検出された。このブロットのより長期の曝露(示さず)は、心筋における微量の発現を明らかにしたが、他の臓器においては、PrPCは検出されなかった。レーン5(肺)において最も顕著に認められる低分子量のバンドは、抗マウスIg二次抗体が3F4で予めインキュベーションされずに使用された場合にも認められた。図3Cにおいて、2匹のTg(TTR-MoPrP)FVB/Prnp0/0マウスの臓器のホモジネートをFVB脳と比較した。ブロットは、R073でプロービングした。肝臓におけるPrPC発現は、FVB脳におけるものよりも低かったが、このトランスジェニック系統のマウスの脳におけるものよりも高かった。非常に少量のPrPが腎臓において発現された。肝臓由来のPrPのグリコシル化された形は、同じマウスまたはFVBマウスの脳からの、対応するグライコフォーム類よりもわずかに迅速に移動した。
【００５１】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0と称される第一の系統において、ニワトリα-アクチンプロモーターは、マウスPrnpa対立遺伝子の発現を指示する。これらのトランスジェニックマウス由来の骨格筋(図3a)は、PrPを、野生型マウスの脳において認められるレベルよりも約8倍より高いレベルで発現した。図3に示されたように、低レベルのPrPが、心筋において生成され、およびPrPは脳においてわずかに検出された。
【００５２】
Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0と称される第二の系統において、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーターは、SHaPrPの発現を駆動する。この系統において、筋肉内のPrP発現のレベルは、ハムスター脳において発現されたPrPレベルよりも4倍より高い。Tg(MCK-ShaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、図3Bに示したように、心筋において低レベルのPrPCを発現し、脳においてPrPは検出されなかった。
【００５３】
これらのTgマウスおよび非Tg同腹仔に、プリオンを、左後肢に筋肉内接種した。その後これらのマウスを、接種後様々な時点で屠殺した。Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスは、マウスRMLプリオンを接種したのに対し、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、ハムスターSc237プリオンを接種した。未接種の対側後肢の筋肉、脳、および脾臓のホモジネート中のプリオン力価を、バイオアッセイ法により測定した。結果は、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0筋肉において、力価＞107 ID50単位/gを示し、これは接種後350日目に得られた。力価は一般に、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの筋肉よりも低く、これらの測定値は、接種後の413日目に屠殺した3匹全て中の2匹のマウスで〜104 ID50単位/gおよび別のマウスにおいて〜108 ID50単位/gであった(表2)。接種後76日目に屠殺した第四のマウスの筋肉プリオン力価は、〜104 ID50単位/gであった。これらのアッセイ法の結果は、未接種のTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスおよびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の筋肉ホモジネートにおいてはプリオンを検出しなかった。
【００５４】
いくつかの実験を行い、筋肉に認められたプリオンはそこで形成されたことを確認した。ふたつの実験結果は、本発明者らが測定したプリオンの給源としての接種物が残留したことを排除した。第一に、プリオン伝播が不可能であるFVB/Prnp0/0マウス(Buelerら、「Mice devoid of PrP are resistant to scrapie」、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusinerら、「Ablation of the prion protein (PrP) gene in mice prevents scrapie and facilitates production of anti-PrP antibodies」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))に、先に説明したTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスを使用する実験に平行してRMLプリオンを筋肉内接種した。FVB/Prnp0/0マウスの筋肉において、接種後350日目にプリオンは検出されず、これはこれらのプリオンが一掃されたことを示している。
【００５５】
第二に、FVB/Prnp0/0マウスは、PrPCを発現しているマウスよりもより効率的にプリオンを一掃する(Raceら、「Scrapie infectivity found in resistant species」、Nature、392:770(1998))と考えられるので、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0およびFVB/Prnp0/0マウスの両方に、Sc237プリオンを接種した。その後、下記表3に示したような様々な間隔で、接種した筋肉におけるプリオン力価を決定した。プリオンは、両系統において同等に迅速に消失した。更にTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスへ接種後28日目に、注射部位に対し同側に認められるプリオンのレベルは、より遅く屠殺したマウスにおいて認められるレベルよりも少なくとも10倍低く、このことは新たな(de novo)プリオン合成を示している(表2および3の比較)。
【００５６】
（表2） トランスジェニックマウス組織におけるプリオン力価
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡シリアンハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0組織プリオン力価。他は全てTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした。
【００５７】
（表3）シリアンハムスターSc237プリオン接種後のマウス筋肉におけるプリオン力価の漸減
*脳内接種したハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。場合によっては、非常に長いインキュベーション時間が、低い力価計算値を生じさせ、これは過小評価された可能性が高い(「方法」参照)。これらの値は、比較を目的として報告した。
【００５８】
筋肉において認められたプリオンが本発明者らのマウスの他所において生成された汚染物である可能性を排除するために、筋肉内接種したTgマウスの脳および脾臓におけるプリオン力価を決定した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの脳においてプリオンは検出されなかったが、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0脳において低い力価が認められ、この知見は、そこで生成された低レベルのPrPCと一致している。低いプリオン力価は、両系統の接種したマウスの脾臓においても認められ、このことは、ウェスタンブロット分析ではこれらの系統において脾臓のPrPが検出されなかったので、これは他所で生成されたプリオンの蓄積を表わしている可能性がある。脾臓および脳における力価は、全ての場合において筋肉よりも低く、従って、筋肉における力価は、他の組織からの汚染によるものではないと思われる。
【００５９】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、筋疾患を自然発症し、これはSHaPrPプロモーターの制御下でPrPCが過剰発現されているマウスにおける知見と一致している(Westawayら、「Degeneration of skeletal muscle, peripheral nerves, and the central nervous system in transgenic mice overexpressing wild-type prion proteins」、Cell、76:117-129(1994))。同様の組織学的異常が、プリオン接種したマウスおよび未接種、Tg対照の筋肉において検出された。
【００６０】
骨格筋はプリオンを伝播および蓄積することが本質的に可能であることが明らかになったので、これは全てのPrP発現している組織の特徴であるかどうか、または一部の細胞型においてのみ認められる他の要因が必要であるかどうかについて実験を行った。最近の研究(Raeberら、「Ectopic expression of prion protein (PrP) in T lymphocytes or hepatocytes of PrP knockout mice is insufficient to sustain prion replication」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))は、肝細胞またはT細胞の細胞型においてPrPを発現しているTgマウスの肝細胞またはT細胞においてプリオンは伝播しなかったことを結論付けている。しかしRaeberらは、これらのマウスの肝臓において達成されたPrP発現レベルは極めて低く、および循環血中T細胞中の検出可能なプリオンの非存在は、自然の代謝回転の間のプリオン感染細胞の喪失に起因するか、またはプリオンが関連した毒性によるものであるかもしれないことを述べている。
【００６１】
プリオンが肝細胞において伝播することができるかどうかを決定するために、Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスを、TTRプロモーター断片が、肝臓および脳神経細胞サブセットに同時にマウスPrnpa発現を指示するようなプロセスにおいて用いたところ(図3C参照)、脳よりも肝臓においてより高いPrPレベルであった。マウスは、RMLプリオンを脳内接種し、および296日目に疾患徴候を発症した場合に屠殺した。脳プリオン力価は、108〜109 ID50単位/gであったのに対し、肝臓プリオン力価は、わずかに103〜104 ID50単位/gであった。同じ系統のマウスに、RMLプリオンを腹腔内(i.p.)接種し、接種部位の影響を試験した。これらのマウスは、疾患が出現することはなく、接種後523日目に屠殺した。この腹腔内接種したマウスの肝臓プリオン力価は、脳内接種したマウスのものに似ていた。肝臓プリオン力価は低いにもかかわらず、RMLプリオンを接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の肝臓ホモジネートは、RML接種したFVBマウス由来の肝臓ホモジネートの場合よりも有意に多いマウスにスクレイピーを伝達したので、肝臓における高レベルのPrPC発現は、プリオン形成を増強することは明らかである(表1および2、P＜0.001、フィッシャーの直接法)。
【００６２】
これらのデータから、異なる細胞型は、例えPrPC発現レベルが同様である場合であっても、著しく異なる効率でプリオンを蓄積すると結論付けた。マウスPrPCを発現しているTgマウスの3種の組織を比較し、RMLプリオン力価は、脳において〜109 ID50単位/g、肝臓において〜103 ID50単位/g(Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスについて)、および骨格筋において107 ID50単位/g(Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスについて)であった。異なるレベルのプリオンが蓄積する理由は明らかではない。肝臓PrPの明らかに異なるグリコシル化は、そこで認められる不充分なプリオン蓄積に寄与し得るが、脳および筋肉PrPは、識別不可能なグライコフォームであるにも関わらず、異なる蓄積のレベルを示した。
【００６３】
ここで提供された結果は、筋肉は、プリオンを伝播することが本質的に可能であることを明らかにしている。従って、CNSおよびリンパ組織が慎重に精肉から除去されたとしても、実質的に測定可能なプリオン力価が、骨格筋において認められ得る。このスクレイピーに感染した野生型マウスの筋肉におけるプリオン力価は106 ID50単位/gと高いということは、プリオンに感染した動物由来の精肉を消費するヒトは、感染獲得のリスクがあるという懸念を生じる。しかしプリオン汚染した精肉から疾患を発症するヒトのリスクを評価する場合には、いくつかの注意点が考慮されるべきである。第一に、筋肉内のプリオン蓄積の効率は、関連した宿主種またはプリオン株のいずれかにより変動し得る。実際本明細書に示された結果において、マウスRMLプリオンは、ハムスターSc237プリオンが蓄積したよりもより効率的に筋肉に蓄積したように見える。第二に、経口伝達は、本明細書の結果を提供するために使用されたバイオアッセイ法で使用された脳内接種と比較して、非効率である。ハムスターにおいて、経口曝露は、脳内経路の場合よりも105〜109倍低い(Prusinerら、「Transmission of scrapie in hamsters」、J.Infect.Dis.、152:971-978(1985)；Diringerら、「Effect of repeated oral infection of hamsters with scrapie」、J.Gen.Virol.、79:609-612(1998))。最後に、種の壁が考慮されるべきである。一般に、プリオンのひとつの種から別の種へ効率的に伝達されるには、これらのふたつの種の間でPrPアミノ酸配列の高度の相同性が必要である。しかし、アミノ酸配列が伝達効率に影響する程度は、関連したプリオン株により左右される。nvCJDプリオンである場合、ウシPrPを発現しているTgマウスは、ヒトまたはキメラヒト-マウスPrPのいずれかを発現しているTgマウスよりもはるかに、nvCJDプリオンに易罹患性である(Hillら、「The same prion strain causes vCJD and BSE」、Nature、389:448-450(1997)；Scottら、「Identification of a prion protein epitope modulating transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to transgenic mice」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:14279-14284(1999))。
【００６４】
本明細書に提供された結果は、BSE畜牛に加え、慢性消耗性疾患のシカおよびヘラジカの骨格筋内のプリオン蓄積を示唆している。詳細に述べると、本発明者らは、BSEで死亡した畜牛の筋肉組織は試験しなかったが、これらの結果は、ウシの筋肉内のPrPCの存在を示している(図1)。
【００６５】
図1に示された異なるウェスタンブロットは、哺乳類の筋肉組織におけるPrPC発現を示している。詳細に述べると、図1Aは、FVBマウスの様々な組織におけるPrPC発現レベルを示している、ウェスタンブロット像である。最高レベルのPrPCは、脳(Br)であるが、完全にグリコシル化されたPrPCに対応する個別のバンドが、骨格筋(Sk Mu)および心臓(He)ホモジネートのレーンにおいても認められる。部分的にグリコシル化されたPrPCを明らかに示している非常にかすかなバンドが、肝臓(Li)および腎臓(Ki)ホモジネートを生じるレーンにおいて認められる。バンドは、FVB/Prnp0/0マウスからの組織においては認められない。このブロットは、R073血清でプロービングした。(b)は、ボス・タウラスの脳および筋肉におけるPrPC発現レベルを比較するウェスタンブロットである。1匹の動物の脳ホモジネートの連続希釈物を、異なる供給業者から得た2匹の動物からの筋肉ホモジネートの希釈物と比較した。筋肉ホモジネート25μg中に認められたPrPCの量は、脳ホモジネート1.3μgにおいて認められる量よりもわずかに大きく、従って筋肉中のPrPC発現は、脳における発現の〜5〜10％である。このブロットの筋肉由来のPrPCは、脳由来のものよりもより迅速に移動し、その理由は、この筋肉は5-オクタリピートPRNP対立遺伝子を生じる動物に由来するのに対し、脳は6-オクタリピート対立遺伝子を伴う動物に由来するからである(Goldmannら、「Different forms of the bovine PrP gene have five or six copies of a short, G-C-rich element within the protein-coding exon」、J.Gen.Virol.、72:201-204(1991))。
【００６６】
示された結果は、PrPCはヒト筋肉において発現されること、およびPrPScはCJD患者の筋肉に蓄積したことを決定している(図4参照)。大腿四頭筋50mgを、本明細書に開示されおよび説明された「方法」に説明されたように調製した場合、抗PrP Fab'を用いるウェスタンブロットにより、〜27kDバンドが認められた。
【００６７】
図4は、PrPScはCJD患者の筋肉に蓄積することを示している。大腿四頭筋の筋肉および脾臓を、病理学的に確定されたCJDで死亡した患者から得た。ホモジネートを、「方法」に説明したようにプロテイナーゼKで消化し、同等な50mg組織を各レーンに負荷した。このブロットは、ヒトPrPを認識する組換えFab'であるHum-Pでプロービングした。筋肉および脾臓に認められた約25kDのバンドは、PrPScのプロテアーゼ抵抗性コア(core)を示した。
【００６８】
これらの結果は全て、PrPScはBSE畜牛由来のウシ筋肉において認められることを示している。本明細書に提供された結果は、RIIIマウスのバイオアッセイ法で、BSE畜牛の骨格筋においてプリオンを検出することができなかったこと(Wellsら、「Preliminary observations on the pathogenesis of experimental bovine spongiform encephalopathy (BSE): an update」、Vet.Rec.、142:103-106(1998))は、Tg(BoPrP)Prnp0/0において高感度バイオアッセイ法を用いて再試験すべきであることを示している(Scottら、「Identification of a prion protein epitope modulating transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to transgenic mice」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:14279-14284(1999)；Scottら、「Compelling transgenetic evidence for transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to humans」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999))。感度の良いイムノアッセイ法も、プリオン疾患の畜牛またはシカ由来の筋肉中のPrPScレベルを決定する際に有用であることができる(Safarら、「Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations」、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。マウスの筋肉はプリオンを伝播および蓄積するという本明細書に提供された結果は、これまで推定されたものよりもより緊急に、ウシ筋肉においてプリオン力価の正確な決定をすることができる。
【００６９】
方法
導入遺伝子構築体
MCK-SHaPrP
マウス筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域の3.3kbp断片は、骨格筋および心筋にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現を指示する(Johnsonら、「Muscle creatine kinase sequence elements regulating skeletal and cardiac muscle expression in transgenic mice」、Mol.Cell.Biol.、9:3393-3399(1989))。pNASS-β(Clonetech社)中のβガラクトシダーゼコード配列を完全長SHaPrPのコード配列で置換え、MCKプロモーター／エンハンサーをこのベクターのXho1部位へ連結した。この完全な構築体において、SV40スプライシングドナーおよびアクセプター部位は、MCKプロモーターおよびシリアンハムスターオープンリーディングフレーム(ORF)の間に位置している。この「人工的イントロン」は、この導入遺伝子の発現を増大することができる(Choiら、「A generic intron increases gene expression in transgenic mice」、Mol.Cell Biol.、11:3070-3074(1991))。
【００７０】
α-アクチン-MoPrP
ニワトリα-アクチン遺伝子断片は、191位から転写開始部位に対し+27の位置まで広がっているが、これは骨格筋にCAT遺伝子の発現を指示する(Petropoulosら、「The chicken skeletal muscle alpha-actin promoter is tissue specific in transgenic mice」、Mol.Cell Biol.、9:3785-3792(1989))。この218bp断片は、プロモーター／エンハンサー要素および12kbpの第二のイントロンが欠失されているマウスPrP遺伝子の誘導体へ連結した(Fischerら、「Prion protein (PrP) with amino-proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie」、EMBO J.、15:1255-1264(1996))。
【００７１】
TTR-MoPrP
マウスのトランスサイレチン(TTR)遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー配列を含むおよそ300bpの配列を、先に説明したα-アクチン-MoPrP構築体において使用したマウスPrP遺伝子の同じ修飾した断片へ連結した。使用したトランスサイレチンプロモーター／エンハンサー配列は、肝臓および脳に直接発現し、場合によっては腎臓に発現することが、これまでに明らかにされている(Costaら、「The cell-specific enhancer of the mice transthyretin (prealbumin) gene binds a common factor at one site and a liver-specific factor(s) at two other sites」、Mol.Cell Biol.、8:81-90(1988))。
【００７２】
微量注入およびスクリーニング
前述の導入遺伝子構築体は、FVB/Prnp0/0マウスに導入した。α-アクチン-MoPrPおよびTTR-MoPrP導入遺伝子の組込みは、テールDNAのマウスPrP特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより検出したが、MCK-SHaPrP導入遺伝子の存在はMCK-SHaPrP接合部を超えて増幅するプライマーを用いるテールDNAのポリメラーゼ連鎖反応により決定した。
【００７３】
PrP 発現の分析
臓器ホモジネートを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に調製した。骨格筋について、近位後肢筋をホモジナイズした。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法(Pierce社)によりタンパク質濃度を決定した後、指定量の総タンパク質を、常法に従うウェスタンブロットにより、化学発光検出システム(ECL, Amersham社)を用い分析した(Sambrookら、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1989))。ブロットは、マウスおよびハムスターPrPを認識するポリクローナルウサギ抗血清である、R073(Serbanら、「Rapid detection of Creutzfeldt-Jakob Disease and scrapie prion proteins」、Neurology、40:110-117(1990))；マウスPrPを認識する組換え抗体である、Hum-D13(Peretzら、「Strain-specified relative conformational stability of the scrapie prion protein」Protein Sci.、10:854-863(2001))；ハムスターPrPは認識するがマウスのそれは認識しないモノクローナル抗体である、3F4(Kascsakら、「Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins」、J. Virol.、61:3688-3693(1987))；または、ウシPrPを認識する組換え抗体である、HumP(J.Safar、個人的情報)でプロービングした。PrP発現レベルは、ウェスタンブロットにおける適当なホモジネートの連続希釈物の視覚検査により決定した。
【００７４】
骨格筋 PrP Sc の検出
マウス筋肉のホモジネートを液体窒素下で微粉化し、PBS中に10％に懸濁し、その後Potter-Elvehjemホモジナイザーの10ストロークに供した。プロテイナーゼ消化のために、PBS中の4％サルコシル等量をホモジネート1〜4mlに添加し、PKを、PKのホモジネート総タンパク質に対する比1:50で添加した。この試料を、37℃で1時間振盪しながらインキュベーションし、その後プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete、Boehringer-Mannheim社)を添加した。リンタングステン酸(PTA)沈殿を、試料に固定角ローターにおいて4℃、20,000×gで遠心分離に供した以外は、既報のように行った(Safarら、「Eight prion strains have PrPSc molecules with different conformations」、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。ウェスタンブロットおよび検出を先に説明されたように行った。脳および筋肉PrPScの相対量を、ウェスタンブロット上において脳ホモジネートの連続希釈物から得たバンドの筋肉由来のPrPScを表わすバンドに対するバンド密度の比較により決定した。写真フィルムをフラットベッド型スキャナーでデジタル化した画像のNIH Imageソフトウェア解析を用いてバンド密度を定量し、脳の中のPrPSc量に対して筋肉中の量を内挿した。いくつかの異なる期間の曝露の解析から得た平均値を報告した。ヒト筋肉は、ホモジネーションを使い捨てプラスチック製組織グラインダーを用いて行いPTA沈殿を省略した以外は、マウス筋肉のように調製した。
【００７５】
マウスのプリオン接種
筋肉内接種または腹腔内接種したマウスは、スクレイピーの徴候を示すSc237プリオンを接種したシリアンハムスターからまたはRMLプリオンを接種したCD-1マウスのいずれかからの、10％のプールした脳ホモジネート50μl(プリオンおよそ107 ID50単位)を受け取った。脳内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスは、RML感染したマウス脳の最終1％ホモジネート30μlを受け取った(およそ105 ID50単位)。
【００７６】
インキュベーション時間アッセイ法
臓器ホモジネートのプリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定した。ハムスターPrPを発現するTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の組織は、シリアンハムスターにおいてアッセイした(Prusinerら、「Measurement of the scrapie agent using an incubation time interval assay」、Ann.Neurol、11:353-358(1982)；Prusinerら、「Prion Biology and Diseases」(Prusiner, S.B.編集)653-715、(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1999))。マウスPrPを発現するTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の組織を、マウスPrnpaを過剰発現しているトランスジェニック系統であるTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした(Tellingら、「Interactions between wild-type and mutant prion proteins modulate neurodegeneration in transgenic mice」、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。RMLプリオン株を使用するTg(MoPrP)4053/FVBについてのインキュベーション時間-プリオン力価の相関は、以下である：
対数力価(ID50単位/g)＝1+32.189*e(-O.0278*( 平均インキュベーション時間 ( 日数 ))
(Supattaponeら、「Branched polyamines cure prion-infected neuroblastoma cells」、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。インキュベーション時間アッセイ法は、高い力価よりも低いプリオン力価を推定する際に正確さが低くなる。ここで適用される慣例は、一部、しかし全てではない接種された動物が罹病する場合力価は103 ID50単位/g未満であり、動物が罹病しない場合力価は102 ID50単位/g未満であるという推定であった。低い力価の別の推定は、(0.5t)Nは接種しない動物がスクレイピーを発症する見込みであるので(ここで、Nは接種した動物数であり、tは1回接種当りのID50単位力価である)、伝達ゼロの少なくとも5％見込みを有する最大力価は、0.43単位/接種であるか、または約103.2 ID50単位/g組織であると推定することにより得られ、従ってこれはこのアッセイ感度の下限である。
【００７７】
Sc237プリオンのバイオアッセイ法の一部において全ての脳内接種したハムスターは疾患発症したが、力価に対する平均インキュベーション時間の標準曲線を描く式から計算したプリオン力価は、1 ID50単位/接種よりも有意に低い推定値を生じた。これらの場合において、プリオン力価は、他の実験と比較することができるように計算して報告した。全ての動物が疾患を発症した場合には、力価は全ての接種された動物が罹病する少なくとも5％の見込みを生じるために必要な最小値よりも大きいので、実際の力価は有意に高い可能性がある。8匹の動物が1％ホモジネート50μlを接種された場合、全ての動物がスクレイピーを発症する尤度は(1-0.5t)Nであるので、この値は1.7 ID50単位/接種または約103.5 ID50単位/g組織である。
【００７８】
実施例
特定の筋肉において認められた PrP Sc の個別のレベル
材料および方法
骨格筋内の PrP Sc 検出
筋肉組織を液体窒素下で微粉化し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に10％に懸濁し、その後Potter-Elvehjemホモジナイザーの10ストロークに供した。プロテイナーゼ消化のために、PBS中の4％サルコシルを等量をホモジネート1〜4mlに添加し、プロテイナーゼK(PK)を、PKのホモジネートのタンパク質に対する比1:50で添加した。この試料を、37℃で1時間振盪しながらインキュベーションし、その後プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete、Boehringer-Mannheim社)を添加した。リンタングステン酸沈殿を、試料に固定角ローターにおいて4℃、20,000×gで遠心分離に供した以外は、既報のように行った(Safar, J.、Wille, H.、Itri, V.、Groth, D.、Serban, H.、Torchia, M.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Nat.Med.、4:1157-1165(1998))。
【００７９】
ウェスタンブロットおよびPrP検出を、先に説明されたように行った(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。脳および筋肉PrPScの相対量を、ウェスタンブロット上において脳ホモジネートの連続希釈物から得たバンドの筋肉由来のPrPScを表わすバンドに対する密度の比較により決定した。写真フィルムのデジタル化した画像のNIH Imageソフトウェア解析を用いてバンド密度を定量し、脳の中のPrPSc量に対して筋肉中の量を内挿した。いくつかの異なる期間の曝露の解析から得た平均値を報告した。
【００８０】
ELISAを用いるPrPSc検出のために、PK消化した筋肉ホモジネートを先に説明したように遠心分離した後、6Mグアニジンチオシアネートで変性した。引き続き変性したホモジネートを、96ウェルImmulon II ELISAプレート(Dynex社)の表面上に固定し、表面の残余を3％ウシ血清アルブミンでブロックした。PrPScの検出は、1×Tris緩衝生理食塩水中のHuM-D18抗体の2時間のインキュベーション(Peretz, D.、Scott, M.、Groth, D.、Williamson, A.、Burton, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Protein Sci.、10:854-863(2001))、それに続くアルカリホスファターゼに複合したヤギ抗ヒトFab抗体(Pierce社)との1時間のインキュベーションにより行った。追加の1時間のインキュベーションは、405nmで測定することができる呈色生成物の発色のためにアルカリホスファターゼ基質である1-工程pNPP(Pierce社)を利用した。
【００８１】
マウスのプリオン接種
マウスに、スクレイピーの徴候を示すSc237プリオンを接種したシリアンハムスター由来またはRocky Mountain Laboratory(RML)プリオンを接種したCD-1マウスのいずれかに由来した、10％プールした脳ホモジネート50μlを筋肉内または腹腔内に接種した。この接種物は、〜107 ID50単位のプリオンを含んだ。脳内接種したマウスは、RML感染またはMe7感染したマウス脳の最終1％のホモジネート30μlを受け取った(〜106 ID50単位)。
【００８２】
プリオン力価の決定
臓器ホモジネート中のプリオン力価を、インキュベーション時間アッセイ法により決定した。シリアンハムスター(SHa)PrPを発現しているTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス由来の組織を、シリアンハムスターにおいてアッセイした(Prusiner, S.B.、Cochran, S.P.、Groth, D.F.、Downey, D.B.、Bowman, K.A.およびMartinez, H.M.、Ann.Neurol.、11:353-358(1982)；Prusiner, S.B.、Kaneko, K.、Cohen, F.E.、Safar, J.およびRiesner, D.、「Prion Biology and Diseases」、Prusiner, S.B.編集(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー)、653-715、(1999))。マウス(Mo)PrPを発現しているTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の組織を、マウスPrnpaを過剰発現しているトランスジェニック系統であるTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした(Telling, G.C.、Haga, T.、Torchia, M.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996))。RMLプリオン株を使用するTg(MoPrP)4053/FVBに関するインキュベーション時間とプリオン力価の間の関係は、以下である：
対数力価(ID50単位/g)＝1+32.189*e(-O.0278*( 平均インキュベーション時間 ( 日数 ))
(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。インキュベーション時間アッセイ法は、高い力価よりも低いプリオン力価を推定する際に正確さが低くなる。この論文で適用される慣例は、一部、しかし全てではない接種された動物が罹病する場合力価は103 ID50単位/g未満であり、動物が罹病しない場合力価は102 ID50単位/g未満であるという推定であった。低い力価の別の推定は、(0.5t)Nは接種しない動物がスクレイピーを発症する見込みであるので(ここで、Nは接種した動物数であり、tは1回接種当りのID50単位力価である)、伝達ゼロの少なくとも5％見込みを有する最大力価は、0.43単位/接種であるか、または約103.2 ID50単位/g組織であると推定することにより得られ、従ってこれはこのアッセイ感度の下限である。Sc237プリオンのバイオアッセイ法の一部において、全ての脳内接種したハムスターは疾患を発症したが、力価に対する平均インキュベーション時間の標準曲線を描く式から計算したプリオン力価は、1 ID50単位/接種よりも有意に低い推定値を生じた。これらの場合において、プリオン力価は、他の実験と比較することができるように計算して報告した。全ての動物が疾患を発症した場合には、力価は全ての接種された動物が罹病する少なくとも5％の見込みを生じるために必要な最小値よりも大きいので、実際の力価は有意に高い可能性がある。8匹の動物が1％ホモジネート50μlを接種された場合、全ての動物が疾患発症する尤度は(1-0.5t)Nであるので、この値は1.7 ID50単位/接種または約103.5 ID50単位/g組織である。
【００８３】
導入遺伝子構築体
MCK-SHaPrP
マウス筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域の3.3kbp断片は、骨格筋および心筋にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現を指示する(Johnson, J.B.、Wold, B.J.およびHauschka, S.D.、Mol.Cell.Biol.、9:3393-3399(1989))。本発明者らは、pNASS-β(Clonetech社)中のβガラクトシダーゼコード配列を完全長SHaPrPのコード配列で置換え、MCKプロモーター／エンハンサーをこのベクターのXho1部位へ連結した。この完全な構築体において、SV40スプライシングドナーおよびアクセプター部位は、MCKプロモーターおよびシリアンハムスターオープンリーディングフレーム(ORF)の間に位置している。この「人工的イントロン」は、この導入遺伝子の発現を増大することができる(Choi, T.、Huang, M.、Gorman, C.およびJaenisch, R.、Mol.Cell Biol.、11:3070-3074(1991))。
【００８４】
α-アクチン-MoPrP
ニワトリα-アクチン遺伝子断片は、191位から転写開始部位に対し+27の位置まで広がっているが、これは骨格筋にCAT遺伝子の発現を指示する(Petropoulos, C.J.、Rosenberg, M.P.、Jenkins, N.A.、Copeland, N.G.およびHughes, S.H.、Mol.Cell Biol.、9:3785-3792(1989))。本発明者らは、この218bp断片を、プロモーター／エンハンサー要素および12kbpの第二のイントロンが欠失されているマウスPrP遺伝子の誘導体へ連結した(Fischer, M.、Rulicke, T.、Raeber, A.、Sailer, A.、Moser, M.、Oesch, B.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、EMBO J.、15:1255-1264(1996))。
【００８５】
TTR-MoPrP
マウスのトランスサイレチン(TTR)遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサー配列を含むおよそ300bpの配列を、先に説明したα-アクチン-MoPrP構築体において使用したマウスPrP遺伝子の同じ修飾した断片へ連結した。使用したTTRプロモーター／エンハンサー配列は、肝臓および脳に直接発現し、場合によっては腎臓に発現することがこれまでに明らかにされている(Costa, R.H.、Lai, E.、Grayson, D.R.およびDarnell, J.E.Jr.、Mol.Cell Biol.、8:81-90(1988))。
【００８６】
微量注入およびスクリーニング
前述の導入遺伝子構築体をFVB/Prnp0/0マウスに導入した。α-アクチン-MoPrPおよびTTR-MoPrP導入遺伝子の組込みは、テールDNAのマウスPrP特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより検出したが、MCK-SHaPrP導入遺伝子の存在はMCK-SHaPrP接合部を超えて増幅するプライマーを用いるテールDNAのポリメラーゼ連鎖反応により決定した。
【００８７】
PrP 発現の分析
臓器ホモジネートをPBS中に調製した。骨格筋について、本発明者らは近位後肢筋をホモジナイズした。ビシンコニン酸(BCA)アッセイ法(Pierce社)によりタンパク質濃度を決定した後、指定量の総タンパク質を、常法に従うウェスタンブロットにより化学発光検出システム(ECL, Amersham社)を用いて分析した(Sambrook, J.、Fritsch, E.F.およびManiatis, T.、「Molecular Cloning - A Laboratory Manual」、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY)(1989))。ブロットは、マウスおよびハムスターPrPを認識するポリクローナルウサギ抗血清である、R073(Serban, D.、Taraboulos, A.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Neurology、40:110-117(1990))；マウスPrPを認識する組換え抗体である、Hum-D13(Peretz, D.、Scott, M.、Groth, D.、Williamson, A.、Burton, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Protein Sci.、10:854-863(2001))；ハムスターPrPは認識するがマウスのPrPは認識しないモノクローナル抗体である、3F4(Kascsak, R.J.、Rubenstein, R.、Merz, P.A.、Tonna-DeMasi, M.、Fersko, R.、Carp, R.I.、Wisniewski, H.M.およびDiringer, H.、J. Virol.、61:3688-3693(1987))；または、ウシPrPを認識する組換え抗体である、Hum-P(J.Safar、個人的情報)でプロービングした。本発明者らは、PrP発現レベルをウェスタンブロットにおける適当なホモジネートの連続希釈物の視覚検査により決定した。
【００８８】
結果
筋肉内の実質的プリオン力価
PrPC発現はプリオン伝播に必須であるので、本発明者らは最初にウェスタンブロット分析を使用し、マウスおよび畜牛(ボス・タウラス)の両方において、PrPCが骨格筋中に脳内レベルの約5〜10％のレベルで発現されることを確認した(図5；Horiuchi, M.、Yamazaki, N.、Ikeda, T.、Ishiguro, N.およびShinagawa, M.、J.Gen.Virol.、76:2583-2587(1995)；Bendheim, P.E.、Brown, H.R.、Rudelli, R.D.、Scala, L.J.、Goller, N.L.、Wen, G.Y.、Kascsak, R.J.、Cashman, N.R.およびBolton, D.C.、Neurology、42:149-156(1992))。本発明者らは次に、インキュベーション時間アッセイ法を用い、疾患徴候を示しているFVBマウスの後肢筋のプリオン力価を決定した。RMLプリオンを脳内接種した後128日目に屠殺したマウスから採集した筋肉は、力価105〜106 ID50単位/gを持っていた(表4)。
【００８９】
（表4） 野生型 FVBマウス組織のおけるプリオン力価*
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡Tg(MoPrP)4O53/FVBマウスにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。
【００９０】
これらの同じマウス由来の、野生型マウスにおいてはほとんどPrPCを発現しない臓器である肝臓(Raeber, A.J.、Sailer, A.、Hegyi, I.、Klein, M.A.、Rulike, T.、Fischer, M.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))のホモジネートは、スクレイピーを伝達しないか、またはわずかなマウスのみに伝達し、これは力価103 ID50単位/gまたはそれ未満を示しているので、これらの筋肉中のプリオンの驚くべき高力価は、脳由来のプリオンによるマウス臓器の全般的汚染を表わしてはいない。先行する研究では、プリオン感染症の徴候を示しているマウスにおける脳プリオン力価は、Tg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイされた場合、典型的には、109〜1010 ID50単位/gである(Supattapone, S.、Wille, H.、Uyechi, L.、Safar, J.、Tremblay, P.、Szoka, F.C.、Cohen, F.E.、Prusiner, S.B.およびScott, M.R.、J. Virol.、75:3453-3461(2001))。
【００９１】
図5(a)は、FVBマウスの様々な組織におけるPrPC発現のレベルを示しているウェスタンブロットである。最高レベルのPrPCは脳(Br)であるが、完全にグリコシル化されたPrPCに相当する個別のバンドが骨格筋(Sk Mu)および心臓(He)ホモジネートのレーンにも認められる。部分的にグリコシル化されたPrPCを明らかに表わしているかすかなバンドは、肝臓(Li)および腎臓(Ki)ホモジネートを生じるレーンに認められる。FVB/Prnp0/0マウス由来の組織にバンドは認められない。このブロットは、R073ポリクローナル抗血清でプロービングされる。図5(b)は、ボス・タウラスの脳および筋肉中のPrPC発現レベルを比較するウェスタンブロットを示している。1匹の動物由来の脳ホモジネートの連続希釈物は、異なる供給業者から得た2匹の動物由来の筋肉ホモジネート希釈物と比較した。筋肉ホモジネート25μlにおいて認められるPrPCの量は、脳ホモジネート1.3μgにおいて認められるものよりもわずかに大きい。これらの結果は、筋肉におけるPrPC発現は、脳のそれの〜5から10％である。このブロットの筋肉由来のPrPCは、脳に由来したものよりもより迅速に移動し、その理由は、筋肉が5-オクタリピートPRNP対立遺伝子を生じる畜牛に由来するのに対し、脳は6-オクタリピート対立遺伝子を持つ動物に由来するからである(Goldmann, W.、Hunter, N.、Martin, T.、Dawson, M.およびHope, J.、J.Gen.Virol.、72:201-204(1991))。
【００９２】
PrP Sc の特定の筋肉群における示差的な蓄積
本発明者らが骨格筋において発見した感染性プリオンの高力価を確認するために、本発明者らはプロテアーゼ抵抗性PrPScの存在を検出するためにウェスタンイムノブロットを使用した。本発明者らは最初に、RMLプリオンの脳内接種の128日後に神経疾患の徴候を示している野生型 CD-1マウスの後肢筋を試験した(図6a)。これらのマウス由来であるが未接種の対照由来ではない筋肉ホモジネートは、脳において認められるPrPScのものと同じ見かけの分子量およびグライコフォーム比のPK抵抗性PrPScを示した。ウェスタンブロットにおける筋肉および脳ホモジネートの連続希釈物の比較は、筋肉のプロテアーゼ抵抗性PrPScは、脳におけるプロテアーゼ抵抗性PrPScよりも〜500倍低いことを明らかにした(データは示さず)。この脳／筋肉PrPSc比102.7は、脳／筋肉プリオン力価の比である約103に類似している。
【００９３】
本発明者らは次に、様々な筋肉群内のPrPScの分布を試験した。これらの研究のために、本発明者らは、マウスプリオンのMe7株を脳内接種した138または146日目に疾患の徴候を示しているマウスを使用した。再度本発明者らは、後肢筋内の実質的PK抵抗性PrPSc蓄積を観察した(図6b)。対照的に、本発明者らは、1匹のマウスの前肢筋肉の例外を除いて、頭部および頸部、背部または前肢を含む他の領域からの骨格筋におけるPrPSc蓄積は検出しなかった(図6c)。ウェスタンブロット分析において示される領域特異的PrPSc蓄積を確認するために、本発明者らは、ELISAを用いPrPScのレベルを測定し、これはウェスタンブロットよりもより定量的な結果をもたらした(表5)。感染したマウスの後肢の筋肉、および先に説明したような1匹のマウスの前肢筋肉のみが、有意にバックグラウンドを上回る値を有した。
【００９４】
図6(a)は5個のレーンを示し、レーン1は、未接種のCD-1マウス由来の未処理の脳ホモジネートを含む。他のレーンは全て、CD-1マウス筋肉のPK消化したホモジネートの不溶性の画分を含む。プロテアーゼ抵抗性PrPScは、未接種のマウスの筋肉においては認められなかったのに対し(レーン2)、PrPScは、RMLプリオンの脳内接種後132日目に、神経疾患の徴候を示しているマウスの筋肉において容易に検出可能であった(レーン4および5)。比較のために、疾患徴候を示しているマウス由来の脳ホモジネートを、未接種のマウスの筋肉ホモジネートへ1:1000希釈した(レーン3)。負荷した量は、プロテイナーゼ消化および沈殿前の、ホモジネートの総タンパク質(mg)の等量として表した。レーン4および5は、レーン2および3の当初のホモジネートの2倍の生成物が負荷されたことに注意。
【００９５】
図6(b)において、Me7プリオンを接種した3匹の罹病したFVBマウスの後肢骨格筋をホモジネートし、分析を行った。これらのマウスは、Me7プリオンの脳内接種後138日目(MK70665)および146日目(MK70658、MK70659)に、スクレイピーの典型的臨床徴候を示した。試料は、PKで消化するか(レーン2、4、6)、または消化しなかった(レーン1、3、5)。PK消化した筋肉ホモジネート2mgおよび未消化の筋肉ホモジネート約60μgを分析に使用した。
【００９６】
図6(c)において、パネルbにおいて分析したマウスの頭部-頸部(HN)、背部(B)、および前肢(FL)の筋肉組織を、後肢筋を採集した時点で採集した。レーンには、PK消化した(偶数レーン)および未消化の筋肉ホモジネート(奇数レーン)を負荷した。分析方法はパネルbにおいて説明したものと同じであった。全てのブロットは、HuM-D13抗体でプロービングした。
【００９７】
（表5） Me7プリオンを脳内接種したマウス由来の筋肉組織の様々な領域における示差的プロテアーゼ抵抗性PrPSc蓄積
†P値は、複数の比較を補正するために、α＝0.0125のt検定を用い、全て接種したマウス由来の所定の領域の筋肉に対して未接種のマウスの全ての筋肉を比較して計算した。
【００９８】
筋肉における固有のプリオン複製
筋肉組織は、様々な細胞型で構成され(Engel, A.およびBanker, B.Q.、「Myology: basic and clinical」(McGraw-Hill社、ニューヨーク)(1986))、かつ神経組織に密に会合している。プリオンが筋原線維において複製するかどうかを決定するために、本発明者らは、筋細胞特異的プロモーターの制御下でのみPrPを発現するふたつの系統のトランスジェニック(Tg)マウスを構築した。各系統について、本発明者らは導入遺伝子を染色体PrP遺伝子が破壊されているFVBマウス(Prnp0/0)へ導入した(Telling, G.C.、Haga, T.、Torchia, M.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Genes & Dev.、10:1736-1750(1996)；Bueler, H.、Fisher, M.、Lang, Y.、Bluethmann, H.、Lipp, H.-P.、DeArmond, S.J.、Prusiner, S.B.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、Nature、356:577-582(1992))。第一の系統において、Tg(α-アクチンMoPrP)6906/Prnp0/0と称されるニワトリα-アクチンプロモーターはマウスPrnpa対立遺伝子の発現を指示する。第二の系統において、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0と称されるMCKプロモーターはSHaPrPの発現を起動する。
【００９９】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウス由来の骨格筋(図7a)は、PrPCを、野生型マウス脳において認められるレベルよりも約8倍より高いレベルで発現している。低レベルのPrPCは心筋において生成され、およびPrPCは脳においてかろうじて検出可能である。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0系統において、筋肉におけるPrPC発現のレベルは、ハムスター脳において発現されるPrPCレベルよりも4倍高い。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、心筋において低レベルのPrPCを発現し、および脳においてPrPCは検出されなかった(図7b)。
【０１００】
本発明者らは、Tgマウスおよび非Tg同腹仔の左後肢にプリオンを筋肉内接種し、その後接種後様々な時点でマウスを屠殺した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスに、ハムスターSc237プリオンを接種した。本発明者らは、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスにRMLプリオンを接種し、平行してプリオン伝播が不可能であるFVB/Prnp0/0マウス(Bueler, H.、Aguzzi, A.、Sailer, A.、Greiner, R.-A.、Autenried, P.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、Cell、73:1339-1347(1993)；Prusiner, S.B.、Groth, D.、Serban, A.、Koehler, R.、Foster, D.、Torchia, M.、Burton, D.、Yang, S.-L.およびDeArmond, S.J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))に同じプリオン株を接種した。本発明者らはインキュベーション時間アッセイ法を使用し、接種した側と対側の後肢の筋肉、脳、および脾臓のホモジネート中のプリオン力価を決定した。
【０１０１】
図7は、トランスジェニックマウスにおけるPrPCの分布を示しているウェスタンブロットを示す。詳細に述べると、図7(a)において、Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスは、ポリクローナル抗体R073でプロービングした。筋肉におけるPrPC発現は、野生型マウス脳における(示さず)よりも約8倍高い。(b)Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、ハムスターPrPCを認識するモノクローナル抗体である3F4でプロービングした。PrPC発現は、骨格筋(Sk.Muscle)においてのみ検出可能である。このブロットのより長い曝露(示さず)は、心筋における微量の発現を明らかにしたが、他の臓器のいずれにおいてもPrPCは検出されなかった。レーン5(肺)において最も顕著に認められた低分子量バンドは、抗マウスIg二次抗体が、予め3F4と共にインキュベーションせずに使用される場合にも認められた。(c)ふたつのTg(TTR-MoPrP)FVB/Prnp0/0マウス由来の臓器のホモジネートを、FVB脳と比較した。ブロットは、R073でプロービングした。肝臓におけるPrPC発現はFVB脳よりも低いが、このトランスジェニック系統のマウス脳内よりも高かった。非常に少量のPrPCが腎臓において発現される。肝臓からのPrPCのグリコシル化された形は、これらの同じマウスまたはFVBマウスの脳由来の対応するグライコフォームよりもより迅速に移動する。
【０１０２】
本発明者らは、RMLプリオンを接種したTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスから接種後350日目に得た筋肉において、＞107 ID50単位/gの力価を認めた。力価は一般に、Sc237プリオンを接種したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスの筋肉において低く、2匹のマウスにおいて〜104 ID50単位/gであり、かつ別のマウスにおいて〜108 ID50単位/gであり、これら3匹は全て接種後413日目に屠殺した(表6)。接種後76日目に屠殺した第四のマウスの筋肉プリオン力価は、〜104 ID50単位/gであった。本発明者らは、未接種のTg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスからの筋肉ホモジネートにおいてはプリオンを検出しなかった。
【０１０３】
いくつかの実験を行い、筋肉において認められたプリオンはそこで形成されたことを確認した。ふたつの実験の結果は、測定したプリオンの給源としての接種物が残留したことを排除した。第一に、プリオンは、FVB/Prnp0/0マウスの筋肉において検出されず、これはプリオンを伝播することが不可能であり(Bueler, H.、Aguzzi, A.、Sailer, A.、Greiner, R.-A.、Autenried, P.、Aguet, M.およびWeissmann, C.、 Cell、73:1339-1347(1993)；Prusiner, S.B.、Groth, D.、Serban, A.、Koehler, R.、Foster, D.、Torchia, M.、Burton, D.、Yang, S.-L.およびDeArmond, S.J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:10608-10612(1993))、RMLプリオンの筋肉内接種後350日目に、このプリオンは一掃されたことを示した。第二に、FVB/Prnp0/0マウスは、PrPCを発現しているマウスよりもプリオンをより効率的に一掃すると考えられるので(Race, R.およびChesebro, B.、Nature、392:770(1998))、本発明者らは、Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0およびFVB/Prnp0/0マウスの両方に、Sc237プリオンを接種し、その後異なる間隔で接種した筋肉中のプリオン力価を決定した(表7)。プリオンは、両系統から同等に迅速に消失した。更にTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスへ接種後28日目に、同側部位に認められたプリオンのレベルは、より遅く屠殺したマウスの注射部位の対側に認められたレベルよりも少なくとも10倍低く、このことは新たな(de novo)プリオン合成を示している(表6および7の比較)。
【０１０４】
（表6）トランスジェニックマウス組織におけるプリオン力価
†n、スクレイピー疾患を診断した動物数；n0、接種した動物数
‡シリアンハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定したTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0組織のプリオン力価
他は全てTg(MoPrP)4053/FVBマウスにおいてアッセイした。
** 筋肉組織は、プリオン接種により感染した後肢の対側後肢に由来した。
【０１０５】
（表7） Sc237プリオン接種した後の筋肉におけるプリオン力価の漸減
*脳内接種されたハムスターにおいてインキュベーション時間アッセイ法により決定した。場合によっては、非常に長いインキュベーション時間が、低い力価計算値を生じ、これは過小評価された可能性が高い(方法参照)。これらの値は比較を目的として報告している。
【０１０６】
筋肉において認められたプリオンが、本発明者らのマウスの他所において生成された汚染物である可能性を排除するために、本発明者らは筋肉内接種したTgマウスの脳および脾臓におけるプリオン力価を決定した。Tg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウス脳においてプリオンは検出されなかったが、Tg(α-アクチンMoPrP)6906/Prnp0/0脳において低力価が検出され、この知見は、そこで生成された低レベルのPrPCと一致している。本発明者らは、両系統の接種したマウスの脾臓においても、低いプリオン力価を認め、ウェスタンブロット分析はこれらの系統において脾臓PrPCを検出しなかったので、これは他所で形成されたプリオンの蓄積を表わしている可能性がある。脾臓および脳における力価は、全ての場合において、筋肉よりも低く；従って、筋肉における力価は、他の組織からの汚染によるものではないと思われる。
【０１０７】
Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0およびTg(MCK-SHaPrP)8775/Prnp0/0マウスは、筋疾患を自然発生的に発症し、これはSHaPrPプロモーターの制御下で、PrPCが過剰発現されているマウスにおける知見に一致した(Westaway, D.、DeArmond, S.J.、Cayetano-Canlas, J.、Groth, D.、Foster, D.、Yang, S.-L.、Torchia, M.、Carlson, G.A.およびPrusiner, S.B.、Cell、76:117-129(1994))。本発明者らは、プリオン接種したマウスおよび未接種のTg対照の筋肉において同様の組織学的異常を検出した。
【０１０８】
肝細胞の非効率的なプリオン蓄積
プリオンが肝細胞において伝播するかどうかを決定するために、本発明者らは、TTRプロモーター断片が肝臓および脳神経細胞サブセットに同時のマウスPanpa発現を指示し、肝臓におけるPrPレベルが脳よりもより高いTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスを使用した(図7c)。本発明者らは、このマウスにRMLプリオンを脳内接種し、これらが疾患徴候を発症した296日目に屠殺した。接種部位の影響を試験するために、本発明者らは、Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスに、RMLプリオンを腹腔内でも接種した。
【０１０９】
RMLプリオンを脳内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスの脳におけるプリオン力価は、108〜109 ID50単位/gであったのに対し、肝臓プリオン力価はわずかに〜103 ID50単位/gであった。RMLプリオンを腹腔内接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスは疾患を決して示さず、接種後523日目に屠殺した。腹腔内接種したマウスの肝臓プリオン力価は脳内接種したマウスの力価に類似していた。肝臓プリオン力価は低いが、RMLプリオンを接種したTg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウス由来の肝臓ホモジネートはRML接種したFVBマウス由来の肝臓ホモジネートよりも有意に多いのマウスに疾患を伝達したので、肝臓における高レベルのPrPCはプリオン形成を増強することは明らかである(表4および6、P＜0.001、フィッシャー直説法)。
【０１１０】
これらのデータは、異なる細胞型はPrPC発現レベルが同様である場合であっても著しく異なる効率でプリオンを蓄積することを示している。マウスPrPCを発現しているTgマウスにおける3種の組織を比較することにより、RMLプリオン力価は、脳において〜109 ID50単位/g、肝臓において〜103 ID50単位/g(Tg(TTR-MoPrP)8332/Prnp0/0マウスについて)、および後肢骨格筋において107 ID50単位/gであった(Tg(α-アクチン-MoPrP)6906/Prnp0/0マウスについて)。プリオン蓄積の異なるレベルは、プリオン複製に関与するとみなされた補助的タンパク質の制限された発現の一部によるものである可能性がある(Kaneko, K.、Zulianello, L.、Scott, M.、Cooper, C.M.、Wallace, A.C.、James, T.L.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:10069-10074(1997)；Zulianello, L.、Kaneko, K.、Scott, M.、Erpel, S.、Han, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、J. Virol.、74:4351-4360(2000))。肝臓PrPCの明らかに異なるグリコシル化はそこで認められる非効率的なプリオン蓄積に寄与し得るが、脳および筋肉PrPScは、識別不能のグライコフォームにもかかわらず異なるレベルの蓄積を示した。肝細胞またはT細胞の細胞型においてPrPを発現するTgマウスのこれらの細胞種においてプリオンは伝播できなかったと結論付けた他の研究者らの研究(Raeber, A.J.、Sailer, A.、Hegyi, I.、Klein, M.A.、Rulike, T.、Fischer, M.、Brandner, S.、Aguzzi, A.およびWeissmann, C.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:3987-3992(1999))によっても注目されている。しかしこれらの執筆者らは、それらのマウスの肝臓において達成されたPrP発現レベルは極めて低く、循環血中T細胞に検出可能なプリオンが存在しないことは、自然な代謝回転の間のプリオン感染細胞の喪失に起因するかまたはプリオンに関連した毒性によるものである可能性があることことを述べている。
【０１１１】
考察
前述の実験は、マウス骨格筋は、プリオン伝播が本来可能であること、少なくとも107 ID50単位/gと高い力価で筋肉に蓄積することができること、および最も驚くべきことに、この蓄積の効率は体の異なる領域から採取した筋肉群間で著しく変動することを明らかにしている。本発明者らが、野生型マウスにおいておよび骨格筋においてほぼ独占的にPrPCを発現しているトランスジェニックマウスにおいて、ふたつの異なるプリオン株で同様の結果を得た点で、本発明者らの骨格筋におけるプリオン蓄積の知見は明白であるように見える。プリオンがある種の筋肉において他よりより効率的に蓄積する理由は明らかではない。しかし、異なる骨格筋群は、多くの疾患過程の易罹患性が異なることを示しており、その特徴はおそらく異なる体領域の骨格筋における生化学的差異を反映していると思われる。
【０１１２】
トランスジェニックマウスにおける研究(Telling, G.C.、Scott, M.、Mastrianni, J.、Gabizon, R.、Torchia, M.、Cohen, F.E.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、Cell、83:79-90(1995))および培養した細胞における研究(Kaneko, K.、Zulianello, L.、Scott, M.、Cooper, C.M.、Wallace, A.C.、James, T.L.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94:10069-10074(1997)；Zulianello, L.、Kaneko, K.、Scott, M.、Erpel, S.、Han, D.、Cohen, F.E.およびPrusiner, S.B.、J. Virol.、74:4351-4360(2000))は、プリオンの効率的伝播に必要であるこれまでプリオンタンパク質変調因子「PPMF」と称された、PrP以外の細胞因子に関係している。おそらく一部の骨格筋のみが、高力価のプリオンを蓄積することができる十分量のPPMFを有する。同様に、本発明者らの研究により明らかになった肝組織におけるプリオンの非効率的な蓄積は、プリオン伝播におけるPPMFのような補助因子の役割の更なる証拠である。
【０１１３】
この高いプリオン力価は、CNSおよびリンパ組織が筋肉から慎重に除去される場合であっても骨格筋において認められることがあり、プリオン感染した動物由来の精肉を消費するヒトが感染を獲得するリスクがあるという懸念を生じている。しかしプリオン汚染された精肉から疾患を発症するヒトのリスクを評価する場合には、いくつかの注意点が考慮されるべきである。第一に、筋肉におけるプリオン蓄積の効率は、関連した宿主種またはプリオン株のいずれかにより変動し得る。実際、マウスRMLプリオンは、ハムスターSc237プリオンよりもより効率的に筋肉に蓄積するように見える。第二に経口伝達は、本試験において報告されたバイオアッセイ法に使用した脳内接種と比較して非効率である。ハムスターにおいて、経口曝露は、脳内経路の場合よりも105〜109倍低い効率である(Prusiner, S.B.、Cochran, S.P.およびAlpers, M.P.、J.Infect.Dis.、152:971-978(1985)；Diringer, H.、Roehmel, J.およびBeekes, M.、J.Gen.Virol.、79:609-612(1998))。最後に、種の壁が考慮されるべきである。多くの場合において、ひとつの種から別の種へプリオンが効率的に伝達されるには、これらふたつの種の間でPrPのアミノ酸配列の高度の相同性が必要である。しかし、アミノ酸配列が伝播効率に影響を及ぼす程度は、プリオン株に左右される。nvCJDプリオンである場合、ウシPrPCを発現しているTgマウスは、ヒトまたはキメラヒト-マウスPrPCのいずれかを発現しているTgマウスよりもはるかにヒト脳由来のnvCJDプリオンに罹患し易い(Scott, M.R.、Will, R.、Ironside, J.、Nguyen, H.-O.B.、Tremblay, P.、DeArmond, S.J.およびPrusiner, S.B.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96:15137-15142(1999)；Hill, A.F.、Desbruslais, M.、Joiner, S.、Sidle, K.C.L.、Gowland, I.、Collinge, J.、Doey, L.J.およびLantos, P.、Nature、389:448-450(1997))。
【０１１４】
先行する研究は一般に、筋肉組織における低いプリオン力価を報告している。これらの研究の一部は、非効率的な種を超えた(cross-specie)伝達を用いており、これは筋肉におけるプリオン検出の失敗に寄与している(Wells, G.A.H.、Hawkins, S.A.C.、Green, R.B.、Austin, A.R.、Dexter, I.、Spencer, Y.I.、Chaplin, M.J.、Stack, M.J.およびDawson, M.、Vet. Rec.、142:103-106(1998))。本発明者らの調査は、この失敗に関するもう一つの可能性のある説明を明らかにしている。筋肉プリオン蓄積は筋肉群間で、またはおそらく特異的筋肉間で変動するので、先行する研究は、最高のプリオン力価を生じる筋肉の試料採取に失敗している可能性がある。プリオンが、プリオン疾患を有するヒトのある筋肉において、プリオン疾患を有するマウスにおいて本発明者らが認めたレベル近傍にまで蓄積する場合、全ての型のCJDおよび関連した障害を、生検のための筋肉組織を使用して確定診断することが可能であるはずである。この方法は、現在ヒトにおいてプリオン疾患を確定診断する唯一の方法である、比較的困難かつ病的な(morbid)脳生検法に勝る有意な利点を提供するであろう。
【０１１５】
前記結果は、BSEの畜牛、スクレイピーのヒツジ、またはCWDのシカおよびヘラジカの骨格筋におけるプリオン蓄積が未だ確立されていないことを示している。しかし本発明者らの知見は、動物の骨格筋におけるプリオン分布を決定する包括的および体系的試みが緊急に必要とされていることを示している。この筋肉におけるプリオン分布は、動物種、おそらくは種の交雑、変種、および系統に加えプリオン株によってさえも変動しうる。このようなアッセイ法は、トランスジェニックマウスにおけるバイオアッセイ法および筋肉組織におけるPrPSc検出に適合された定量的イムノアッセイ法のような、感度の良い定量的技術を用いて実行されることが必要である。
【０１１６】
本発明はそれらの具体的態様を参照し説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができ、かつ同等物と交換することができることは当業者により理解されるべきである。加えて、多くの修飾を行い、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスのひとつまたは複数の工程を、本発明の目的、精神、および範囲に適合することができる。このような修飾は全て、本明細書に添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】脳および筋肉におけるPrPC発現のレベル検出するウェスタンブロット画像を示している。
【図１Ｂ】連続希釈による筋肉と比較した脳におけるPrPC発現のウェスタンブロット比較の画像を示している。
【図２】Ham-D13抗体でプロービングした5本のレーンの画像を示している。
【図３】図3A、3B、および3Cは、異なるトランスジェニックマウスから摘出したいくつかの異なる組織型について行ったウェスタンブロットの画像を示している。
【図４】病理学的にCJDによる死亡が確認されたヒトから摘出した筋肉および脾臓組織の画像を示している。
【図５】哺乳類筋肉におけるPrPC発現のレベルを示しているウェスタンブロットを含み、5aは脳において最高の発現を示し、5bは0/0 PrPノックアウトマウスにおいて発現を示していない。
【図６】各々筋肉におけるPrPScの消化を示すレーンを示している、図6(a)、6(b)、および6(c)を含む。
【図７】異なる組織型のウェスタンブロットを含む図であって、7(a)は、筋肉における比較的高い発現を示し；7(b)は、筋肉のみにおける発現を示し；7(c)は、筋肉におけるほぼ例外のない発現を示している。
Claims (33)
- 試料を調製する方法であって、以下の工程を含む方法：
哺乳類から筋肉組織試料を得る工程；
試料をホモジナイズし、これによりホモジネートを作製する工程；
ホモジネートと、ホモジネート中のPrPScと結合する複合体形成剤とを接触させ、PrPScまたは複合体形成剤のいずれか単独の比重と比較してより高い比重を有する複合体を形成させる工程；および
重力の適用により複合体を濃縮する工程。 - 筋肉組織が、試料が得られた哺乳類種における他の筋肉よりも高い濃度のプリオンを有する筋肉に由来する、請求項1記載の方法。
- 試料が、筋肉が得られた哺乳類における任意の他の筋肉と比較してより高濃度のプリオンを有する筋肉から得られる、請求項2記載の方法。
- 筋肉組織試料が、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択される哺乳類の後肢筋から得られ、重力による濃縮が遠心分離により増強される、請求項1記載の方法。
- 複合体形成剤が、ヘテロポリ酸およびその塩から選択される、請求項1記載の方法。
- 複合体形成剤が、リンタングステン酸ナトリウムである、請求項5記載の方法。
- ホモジネート中のPrPcを変性させるためおよびホモジネート中のPrPScの高次構造を変更するための条件下および期間で、ホモジネートを処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 筋肉内のPrPScの存在を決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
筋肉組織が摘出された哺乳類種における他の筋肉組織よりも高い濃度のプリオンを含む筋肉組織から摘出された、ホモジナイズされた（ヒト、ウシ、シカ、およびヒツジから選択される哺乳類から摘出された）筋肉組織と、PrPScと結合する複合体形成剤とを接触させ、PrPScの比重と比較してより高い比重を有する複合体を形成させる工程；
遠心分離に由来する力を使用して、濃縮試料中の複合体を濃縮する工程；ならびに
濃縮試料を分析してPrPScの存在を決定する工程。 - 以下の工程を含む、アッセイ法：
第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；
試料中に存在するプリオンを濃縮する様式で試料を濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；
濃縮試料を、第一の部分および第二の部分に分ける工程；
第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に結合するよりも高い親和性で第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する標識抗体と、第一の部分を接触させる工程；
第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、（第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対してより高度の親和性を有する）異なる高次構造を呈することを引き起こす様式で、第二の部分を処理する工程；
第二の部分と、標識抗体とを接触させる工程；
標識抗体の、第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；
標識抗体の、第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；ならびに
第一の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の結合レベルと第二の部分中のレベルとを比較し、これにより筋肉試料が疾患に関連した第二の高次構造をとるPrPタンパク質を含むかどうかを判定する工程
を含むアッセイ法。 - 筋肉組織試料がヒト、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択される哺乳類の後肢筋から得られ、かつ濃縮工程が試料と複合体形成剤とを接触させる工程および試料を遠心分離に供する工程を含む、請求項9記載の方法。
- 第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質の少なくとも2％を異なる高次構造へ転換するために熱、圧力、および化学的曝露からなる群より選択される処理に第二の部分を供することにより処理工程を行う、請求項9記載の方法。
- 標識抗体が、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質に対するよりも少なくとも4倍高い親和性を有する、請求項9記載の方法。
- 標識抗体が、第一の高次構造をとるPrPタンパク質に対して、第二の高次構造をとるPrPタンパク質に対するよりも少なくとも30倍高い親和性を有する、請求項9記載の方法。
- 標識抗体が、ユウロピウム標識された3F4 IgGである、請求項9記載の方法。
- 標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルが、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定される、請求項7記載の方法。
- 以下の工程を含むアッセイ法：
第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；
試料を、試料中に存在するプリオンを濃縮する様式で濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；
第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質が、その高次構造を、標識抗体の第二の疾患関連高次構造への結合レベルよりも、標識抗体への結合親和性がより高い異なる高次構造へ変更させるのを引き起こすような様式で、濃縮試料を処理する工程；
第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質への結合よりも高い親和性で第一の高次構造および異なる高次構造をとるPrPタンパク質に結合する標識抗体と、濃縮され処理試料とを接触させる工程；
標識抗体の試料中の、PrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；
試料中の標識された結合レベルと、以前に確立された、処理された標準物質への結合標準レベルとを比較する工程であって、処理前に処理された標準物質が、(i)第一の高次構造および(ii)第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を既知量含んでいる工程；ならびに
上記比較を基に、筋肉試料が第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質を含有する可能性を決定する工程。 - 筋肉組織試料が、ウシ、ヒツジ、およびシカから選択された哺乳類の後肢筋から得られ、かつ標識抗体のPrPタンパク質への結合レベルが、フローサイトメトリーを用いて決定される、請求項16記載の方法。
- 標準が、正常な罹患していない個体に由来する同等の筋肉試料中のPrPタンパク質レベルの先の測定から得られる、請求項17記載の方法。
- 標準が、第二の疾患関連高次構造関連疾患を有すると診断された個体に由来する、同等の筋肉試料中のPrPタンパク質レベルの以前の測定値から得られる、請求項17記載の方法。
- 以下の工程を含む、アッセイ法：
第一の高次構造および第二の疾患関連高次構造を呈するPrPタンパク質を含むことが疑われる筋肉組織試料を提供する工程；
試料中に存在するプリオンを濃縮する様式で試料を濃縮し、これにより濃縮試料を提供する工程；
濃縮試料を第一の部分および第二の部分に分ける工程；
第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に結合するよりも高い親和性でその第一の高次構造をとるPrPタンパク質に結合する標識抗体と、第一の部分とを接触させる工程；
第二の疾患関連高次構造をとる任意のPrPタンパク質が、第二の疾患関連高次構造をとるPrPタンパク質に対する親和性と比較して、標識抗体に対する親和性がより高い異なる高次構造を呈するのを引き起こす様式で第二の部分を処理する工程；
第二の部分と標識抗体とを接触させる工程；
標識抗体の、第一の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；
標識抗体の、第二の部分中のPrPタンパク質への結合レベルを決定する工程；
処理により生じる抗体に対する、第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加を補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定されたレベルを調節する工程；
差異を得るために、第一の部分における標識抗体タンパク質の結合レベルを、調節された、第二の部分における標識抗体の結合レベルから減算する工程；ならびに
差異がΔで表わされる、下記式
[PrPβ]〜ΔFβ n->d＝Fd-(Fn ＊fα n->d)
(式中、前記変数は各々下記のように提供される：
F - 任意の検出可能なシグナル；
Fn - 未変性高次構造をとるタンパク質のシグナル；
Fn αおよびFn β - それぞれ、未変性の非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
Fd - 処理したタンパク質のシグナル；
Fd αおよびFd β - 処理した非疾患および疾患の高次構造のシグナル；
ΔFn->d - 未変性状態から処理状態への移行時のシグナルの増加；
ΔFα n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の非疾患高次構造のシグナルの増加；
ΔFβ n->d - 未変性状態から処理状態への移行時の疾患高次構造のシグナルの増加；
fα n->d - 非疾患高次構造の未変性状態から処理状態への移行に関する相関係数；
[PrPβ] - 疾患高次構造をとるタンパク質の濃度；
〜 - 比例を示す；および
＊ - 乗法を示す)
にこの差異を当てはめる工程。 - 処理により得られる抗体に対する第一の高次構造をとるPrPタンパク質の親和性の増加について補正するために、第二の部分中のPrPタンパク質への標識抗体の決定された結合レベルを調節する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
- 筋肉組織試料と、PrPタンパク質に結合する複合体形成剤とを接触させる工程；
試料中のPrPタンパク質が複合体形成剤に結合して、PrPタンパク質単独または複合体形成剤単独のいずれかの密度を上回る密度を有する複合体を生成するような期間および条件下で、複合体形成剤と筋肉試料とを接触させ続ける工程；
試料を、複合体形成剤に結合したPrPタンパク質の複合体を分離するのに十分な速度および期間で遠心分離し、試料濃縮物を提供する工程
を含む方法。 - 複合体のPrPタンパク質を分析して特徴を決定する工程
をさらに含む、請求項22記載の方法。 - 特徴が、溶解度、三次元構造、および感染性からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
- PrPタンパク質の特徴と、筋肉が摘出された動物と同じ動物の脳組織から摘出されたPrPタンパク質の疾患高次構造の同じ特徴とを比較する工程
をさらに含む、請求項24記載の方法。 - 濃縮試料の第一の部分と、第一の高次構造に対して第二の病原性高次構造に対するよりも高い親和性を有する結合パートナーとを接触させ、第一の部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第一の濃度を決定する工程；
試料濃縮物の第二の部分を処理し、結合パートナーに対する第二の高次構造のタンパク質の結合親和性を増大させる工程；
処理試料の第二の部分と結合パートナーとを接触させ、第二の処理した部分における結合パートナー／タンパク質複合体の第二の濃度を決定する工程；
第二の濃度を調節し、処理から得られる結合パートナーに対する、第一の高次構造をとるタンパク質の増大した親和性を調整補正する、調節された濃度を提供する工程；ならびに
第一の濃度と調節された濃度とを比較し、第二の病原性高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程
をさらに含む、請求項22記載の方法。 - 第一の濃度および第二の濃度が、時間分解型かつ解離増強型の蛍光を用いて決定され、
タンパク質の第二の病原性高次構造が、1×103粒子/mlまたはそれ未満の濃度で試料中に存在し、かつ
第二の病原性高次構造をとる任意のタンパク質の少なくとも2％を、結合パートナーに対する結合親和性が増大した高次構造へ転換するのに十分な、熱、圧力、および化学変性からなる群より選択される処理を用いて、試料の第二の部分が処理される、
請求項26記載の方法。 - 試料濃縮物を処理して、タンパク質の第二の高次構造を、第二の高次構造よりも結合パートナーに対する親和性が高い結合高次構造へと転換する工程；
処理試料と結合パートナーとを接触させ、試料中の結合パートナー／タンパク質複合体の濃度を決定する工程；
濃度を調節し、タンパク質の第一の高次構造の、処理に起因する結合パートナーに対する増大した親和性を補正する調節された濃度を提供する工程；ならびに
調節された濃度と、対照濃度および予め決定された標準濃度からなる群より選択される既知の濃度とを比較し、試料中の第二の高次構造をとるタンパク質の存在を決定する工程
をさらに含む、請求項22記載の方法。 - 結合パートナーが標識抗体を含み、複合体形成剤がリンタングステン酸の金属塩を含み、かつ濃度がフローサイトメトリーを用いて決定される、請求項28記載の方法。
- 調節された濃度が、処理された非感染対照試料から決定された既知の濃度と比較される、請求項28記載の方法。
- 調節された濃度が、ヒト、ウシ、およびヒツジからなる群より選択される哺乳類の非感染集団由来の処理試料に由来から決定された既知の濃度と比較される、請求項28記載の方法。
- 抗体が3F4であり、かつ複合体形成剤がリンタングステン酸ナトリウムである、請求項28記載の方法。
- 第二の高次構造をとるタンパク質が、1ml当り1×103個のタンパク質分子またはそれ未満の濃度で試料中に存在し、かつ第一の高次構造をとるタンパク質が、1ml当り1×106個のタンパク質分子またはそれよりを上回る濃度で試料中に存在する、請求項28記載の方法。
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