JP2005504282A - 分子分解のラマン監視による核酸シークエンシング - Google Patents

Abstract

【課題】本願明細書において開示される方法、組成および装置は、核酸シークエンシングのために有用である。
【解決手段】
より詳細には、本方法および装置は、分子をエキソヌクレアーゼ活性に晒し、核酸の一端から一つずつ遊離したヌクレオチドを除去し、ラマン分光法またはＦＲＥＴによってリリースされたヌクレオチドを識別することによって、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの単一分子をシークエンシングする事に関する。
【選択図】図１

Description

【技術分野】
【０００１】
本方法、構成要素および装置は、分子生物学およびゲノム解析の分野に関する。より詳細には、開示された方法、構成要素および装置は、核酸シークエンシングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム解析計画の出現によって、核酸（例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボゾームリボ核酸（ＲＮＡ））をシークエンシングするための改良された方法が開発される事が必要とされてきた。遺伝情報は、染色体に形成されるＤＮＡの非常に長い分子の形で格納される。ヒトゲノムの２３組の染色体は、約３０億の塩基対を含むＤＮＡの塩基配列である。このＤＮＡの塩基配列情報は、各々の個体の特性（例えば、身長、目の色、および民族性）を決定する。多くの普通の疾患、例えばガン、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血および筋ジストロフィーは、少なくともその一部がＤＮＡの塩基配列の相違に基づく。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトゲノムの全ての配列の決定によって、この種の疾患の遺伝子的な根拠を識別するための基盤が提供される。しかし、各々の疾患に伴う遺伝子の変異を識別するための多くの研究が未だ為されていない。従って、疾患を促進するＤＮＡの塩基配列の特定の変異を識別するために、この種の疾患を示す個人およびその家族の染色体の部分的なＤＮＡ塩基配列決定を必要とする。若干のケースにおいて、ＲＮＡ（遺伝情報を処理する為に必要な仲介用の分子）もまた、様々な疾患の遺伝子的な根拠を識別するためにシークエンスされ得る。
【０００４】
大きさに応じて切断され、蛍光性の標識を付された核酸の検出に基づく従来の核酸シークエンシングの方法は、シークエンシングされ得る核酸の長さによって制限される。一般的に、１回で決定され得る核酸配列は５００〜１０００の塩基のみである。これは、遺伝子と称されるＤＮＡの機能単位の長さ（通常はその数万〜数十万倍の塩基長）より非常に短い。従来の方法を用いる際、完全な遺伝子配列を決定する為に、多くの遺伝子を複製し、オーバーラップする断片へと切断し、そしてその後、オーバーラップしたＤＮＡ配列が完全な遺伝子へと構築される。このプロセスは、面倒で、高価で、非効率的で時間がかかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
添付の図面は、本願明細書の一部を形成し、開示された実施形態の特定の様態をより詳しく示すために備えられている。本願明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と共に図面の一つ以上を参照することによって、これらの実施形態がより良く理解され得る。
【０００６】
開示された方法、構成要素および装置は、核酸の高速かつ自動化されたシークエンシングにとって有用である。特定の実施形態において、本方法、構成要素および装置は、１０００を超える、２０００を超える、５０００を超える、１００００を超える、２００００を超える、５００００を超える、１０００００を超える、またそれ以上の非常に長い核酸の分子の配列を得るのに適している。様々な実施形態において、この種の配列情報は、核酸１３、１０２の１つの分子を用いて、単一のシークエンシングの実行の間に得られ得る。他の実施形態において、核酸の配列を確認する為に、または、完全な配列データを得るために、核酸分子１３、１０２の複数の複製が並列または直列にシークエンスされる。他の実施形態において、核酸分子１３、１０２およびその相補鎖は、配列情報の精度を確認するためにシークエンスされても良い。従来の方法と比較した場合の上記の方法による核酸のシークエンシングの効果として、１回のシークエンシング実行に際して長い核酸の配列を読む能力、配列データを得る際の速度の速さ、シークエンシング時のコストの減少、および１単位の配列データにつき必要なオペレータ時間量の効率の高さ、と言った事が挙げられる。
【０００７】
特定の実施形態において、シークエンシングされる核酸１３、１０２はＤＮＡである。但し、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチド類似体を含む他の核酸１３、１０２が同様に配列され得ることが予期される。以下の詳細な説明は、開示された実施形態のより完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細を含む。しかし、これらの具体的な詳細なしでこれらの実施形態が実施され得るという事は、当業者にとって明らかである。他の例において、本技術分野において公知である装置、方法、手順、および個々の構成要素は、本願明細書において詳述しなかった。
【０００８】
図１および図２において開示される幾つかの実施形態において、本発明の方法は、反応室１１、１０１内の固定化表面１４、１０３に付着され、分解反応によって分解される個々の一本鎖の核酸分子１３、１０２のシークエンシングを含む。このような実施形態において、反応室１１、１０１は、核酸分子１３、１０２の遊離末端１７、１０５から１度につき１個のヌクレオチド１６、１０４を順番に取り除くような１つ以上の分解試薬１５、１０６を備える。例えば、この種の分解試薬１５、１０６は、公知の任意のエキソヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、ヌクレオチド１６、１０４が溶液にリリースされるにつれて、これらがラマン分光法によって識別される。
【０００９】
特定の実施形態が、図１において例示される。図１は、流路１２に接続される反応室１１を備える、核酸シークエンシングのための装置１０を示す。反応室１１は、例えばエキソヌクレアーゼのような分解試薬１５中に、固定化表面１４に付着した核酸分子１３を備える。エキソヌクレアーゼ１５は、核酸分子１３の遊離末端１７から、個々のヌクレオチド１６を順次放出するような触媒作用を及ぼす。個体ヌクレオチド１６が分解反応および入力される溶液によってリリースされるにつれて、これらは検出ユニット１８を通過して流路１２の下流側に移動する。検出ユニット１８は、励起光線２０を発する励起源１９（例えばレーザ）を備える。電子がより高いエネルギー状態に励起させるために、励起光線２０はリリースされたヌクレオチド１６と相互に作用する。電子が下位のエネルギー状態まで戻る際に生じるラマン発光スペクトルが、ラマン分光検出器２１（例えば分光計またはモノクロメータ）によって検出される。
【００１０】
図１に示される実施形態において、リリースされたヌクレオチド１６は、検出ユニット１８による検出に先立って、核酸分子１３から空間的に切り離される。空間的切断によって、個体ヌクレオチド１６が単離し、ラマン検出器２１のＳＮ比が増加する方向に作用する。
【００１１】
図１は、単一の核酸分子１３が単一の反応室１１に含まれる実施形態を示す。他の実施形態において、複数の核酸分子１３が別々の反応室１１のそれぞれにおいて同時にシークエンシングされても良い。このような場合、各々の反応室１１の核酸分子１３は、同一であってもよいし、異なっていても良い。更に他の実施形態において、２つ以上の核酸分子１３が単一の反応室１１に存在しても良い。このような実施形態において、核酸分子１３の配列は同一である。複数の核酸分子１３が反応室１１に存在する際、ラマン発光信号は、反応室１１中の全ての核酸分子１３から同時にリリースされるヌクレオチド１６の平均を表す。当業者は、公知のデータ分析技術を用いて、反応室１１で発生している大多数の反応に先行するかまたは遅延している分解反応によって任意の時間において取得される信号を修正する事が出来る。特定の実施形態において、当業者は、分解試薬１５の塊を急速混合で加える事によって、単一の反応室１１に存在する複数の核酸分子１３の分解を同期する手順を用いることが出来る。
【００１２】
他の特定の実施形態において、標識分子が、反応室１１または流路１２の検出ユニット１８の上流側に添加され得る。標識分子が核酸分子１３からリリースされるにつれて、標識分子は、遊離したヌクレオチド１６とバインディングされ、標識を付す。このリリース後の標識付けによって、核酸分子１３のヌクレオチド１６が溶液に放出される前に標識付けられてしまう際に発生する問題が回避される。例えば、核酸分子１３に組み込まれる各々のヌクレオチド１６が分解前に標識を付される場合、大きな蛍光プローブ分子によって相当な立体障害が発生し得る。そして、効率が低下し、シークエンシング反応のために必要な時間が増加する。
【００１３】
ヌクレオチド１６の放出後の標識付けを含む実施形態において、他の検出方式（例えば蛍光分光学法またはルミネセンス分光法）が使用され得る事が予想される。溶液中に遊離したヌクレオチド１６を検出するための多くの他の方式が公知であり、使用可能である。この種の方法に際し、ラマン分光検出ユニット１８は、蛍光、発光または他の種類の信号を検出するように設計されている検出ユニット１８と置換されて良い。
【００１４】
標識分子は、一般のヌクレオチド１６の各種類を区別する事が可能であるユニークかつ高い可視光性を持つシグニチャを有する。特定の実施形態において、標識はラマン発光信号を増強するのに、またヌクレオチド１６に対するラマン検出器２１の感度または選択性を増強させるのに寄与する。ラマン分光を含む実施形態において使用され得る標識分子の例は、ＴＲＩＴ（イソチオシアン酸テトラメチルローダミン）、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタール酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット染料、クレシルブルーバイオレット染料、ブリリアントクレシルブルー染料、パラアミノ安息香酸、エリトロシンおよびアミノアクリジンを含むが、標識分子の実施形態は上記のものに限定されない。特定の実施形態における使用に供し得る他の標識部分は、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リンおよび硫黄を含む。特定の実施例において、カーボンナノチューブが、ラマン標識として使用されて良い。ラマン分光における標識の使用は、公知である（例えば米国特許第５３０６４０３号および第６１７４６７７号）。当業者は、異なるヌクレオチド１６にバインドされた場合に、または一種類のヌクレオチド１６のみをバインドするために異なる標識が設計されているべき場合に、ラマン標識が識別可能なラマン・スペクトルを生成するべきである事を理解するであろう。
【００１５】
特定の実施形態において、核酸分子１３は、固定化表面１４に対して付着する事によって適所に固定され、流路１２を流下する微量流体の流れ中に浸漬される。微量流体は、リリースされたヌクレオチド１６を核酸分子１３から離間させ、かつ検出ユニット１８を通過させるように運搬する。微量流体の流れは、核酸分子１３を通過してケイ素、ガラスまたは他のチップ内のマイクロキャピラリ・チューブまたはエッチチャンネルのような流路１２を流下する溶剤のバルク流に起因し得るが、上記の例に限定されない。他の実施形態において、バルク媒体は非常にゆっくりとしか移動しないか、あるいは全く移動せず、外部から印加された電界に応答して、溶液中の荷電種（例えば、負に帯電したヌクレオチド１６）が、チャネルまたはチューブを備える流路１２中を流下する。
【００１６】
他の実施形態において、核酸分子１３が接続される固定化表面１４を、リリースされたヌクレオチド１６から遠ざけることによって移動することによって、核酸分子１３を移動させる事が出来る。リリースされたヌクレオチド１６は、核酸分子１３を追跡する検出ユニット１８を移動させる事によってスキャン・識別され得る。
【００１７】
上述された実施形態において、検出ユニット１８は、核酸分子１３からリリースされる複数の一般のヌクレオチド１６を区別することが出来る必要がある。少なくとも、ＤＮＡ分子１３をシークエンシングするために、検出ユニット１８は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）を含むヌクレオチド１６を識別可能でなければならない。ＲＮＡ１３がシークエンシングされる際は、検出ユニット１８は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウリジン（Ｕ）を含むヌクレオチド１６を識別可能でなければならない。１つの反応室１１に１個の核酸分子１３を有する際、ヌクレオチド１６は一つずつ検出ユニット１８を通過して移動するので、検出ユニット１８が溶液のヌクレオチド１６のそれぞれの量を計量し得る事は必ずしも必要では無い。
【００１８】
図２に示される他の実施形態において、検出ユニット１０７は、溶液に遊離して存在するヌクレオチド１０４の数を計量するために十分である程度に感度が高い。従って、核酸分子１０２からリリースされたヌクレオチド１０４を離間させる必要はない。図２にて示されるように、装置１００は、固定化表面１０３に一端が付着する核酸分子１０２を含む反応室１０１を備える。遊離したヌクレオチド１０４は、分解試薬１０６（例えばエキソヌクレアーゼ）の作用によって、核酸分子１０２の遊離末端１０５から、順番に取り除かれる。
【００１９】
図２に示すように、これらの実施形態において、遊離したヌクレオチド１０４は、核酸分子１０２から空間的に分離されない。励起光線１１０を発する励起源１０８と検出器１０９とを有する検出ユニット１０７は、核酸分子１０２および遊離したヌクレオチド１０４を含んでいる反応室１０１を分析する。検出器１０９が溶液中の各々のヌクレオチド１０４の量を計量することが出来るので、核酸１０２の配列は、溶液中のヌクレオチド１０４の放出の時間的配列によって測定される事が出来る。より大きな容積がスキャンされているので、より広い領域をカバーするためのより強い励起光線１１０を使用する必要があり得る。
【００２０】
これらの実施形態において、各々の連続したヌクレオチド１０４が核酸分子１０２の遊離末端１０５からリリースされるにつれて溶液中の該種のヌクレオチド１０４の信号が増加する事によって、該ヌクレオチド１０４が識別される。ラマン検出器１０９は、溶液中の各々のヌクレオチド１０４（アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、シトシン一リン酸（ＣＭＰ）、そして、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）またはチミジン一リン酸（ＴＭＰ））の分子数を別々に計量する事が出来、そして、核酸分子１０２によって生じるベースライン・ラマン信号から、これらの信号を分離する事が出来る。
【００２１】
当業者は、ＤＮＡ１３、１０２の解析が、デオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド１６、１０４（チミジンを含む）の放出に帰着し、その一方で、ＲＮＡ１３、１０２の解析が、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド１６、１０４（ウリジンを含む）の放出に帰着する事を理解するであろう。通常、ヌクレオシド一リン酸１６、１０４は、エキソヌクレアーゼ１５、１０６活性によってリリースされる形式を採るが、本実施形態は、遊離したヌクレオチドまたはヌクレオシド１６、１０４の如何なる特定の形式の検出にも限定されず、分解試薬１５、１０６の活性によって核酸１３、１０２からリリースされ得る任意のモノマー１６、１０４を含んで良い。
【００２２】
更なる実施形態において、図１および図２に示される方法と装置１０、１００の若干の組み合わせが使用され得る。図１の方法は、低感度の検出器２１を使用することができるが、より複雑な分子移送の手順を必要とする。図２の方法は、分子移送は単純化されているが、より高感度の検出器１０９を必要とする。様々な折衷的なアプローチが使用されて良い。例えば、流路１２を流下する微量流体の流れを、既に検出されたヌクレオチド１６を励起光線２０、１１０によって照射される領域から取り除く為に用いることができる一方、ラマン検出器２１の計量の能力によって、リリースされた複数のヌクレオチド１６間が時間的または空間的に所定の時間（距離）だけ離間していない場合においても検出を行う事が出来る。
【００２３】
特定の実施形態において、検出器２１、１０９（例えば分光計またはモノクロメータアレイ）からのデータは、所定のラマン・シグニチャを所定のヌクレオチド１６、１０４と関連付けるデータベースを維持する情報処理システムへと送られて良い。情報処理システムは、検出器２１、１０９によって検出されたシグニチャを記録し、これらのシグニチャをデータベース内の既知のヌクレオチド１６、１０４のシグニチャに関連付けさせ、そして、核酸分子１３、１０２の配列を示すヌクレオチド１６、１０４の出現の記録を維持する。オーバーラップする時間的または空間的信号が複数のヌクレオチド１６、１０４から検出される場合、情報処理システムはまた、バックグラウンド信号の減算、および「ベースコーリング」の決定のような標準的な手順を実行することができる。
【００２４】
特定の実施形態において、核酸分子１３、１０２は、界面１４、１０３に付着され得る。界面１４、１０３は、例えば機能性ガラス、シリコン、ＰＤＭＳ（ポリジメチル・シロキサン）、銀または他の金属で被覆された界面、石英、プラスチック、ＰＴＦＥ（ポリ四フッ化エチレン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ゴム乳液粒子、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスビーズ、磁性ビーズ、または、例えばアミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシルまたはディールス‐アルダー反応物のようなの官能基を界面１４、１０３に取り込む事が可能な当技術において公知の他の任意の材料である。
【００２５】
幾つかの実施例において、核酸分子１３、１０２および分解試薬１５、１０６間のバインディングの相互作用が立体障害無しで発生するように、官能基が共有結合で架橋剤に付着しても良い。代表的な架橋基は、エチレングリコール・オリゴマおよびジアミンを含む。付着は共有結合であっても良いし、非共有結合であっても良い。核酸分子１３、１０２を界面１４、１０３に付着させる様々な方法が公知であり、本発明に使用され得る。
【００２６】
（単語の定義）
本願明細書において用いられる「１」、「１つの」と言う単語は、「１つ以上」という事を意味する。
【００２７】
「核酸」１３、１０２は、任意の化学修飾が施された一本鎖、二本鎖、三本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを包含するが、一本鎖の核酸１３、１０２である事が好ましい。実質的に、核酸１３、１０２の任意の修飾が予期される。本願明細書において使用されるように、一本鎖の核酸１３、１０２は、接頭辞「ｓｓ」によって表され得、二本鎖の核酸は接頭辞「ｄｓ」によって表され得、三本鎖の核酸は「ｔｓ」によって表され得る。
【００２８】
「核酸」１３、１０２の長さは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、７５０００、１０００００、１５００００、２０００００、５０００００、１００００００、１５０００００、２００００００、５００００００、それ以上、または、ノーカットの染色体ＤＮＡ分子１３、１０２までの、ほとんど任意の長さを取り得る。
【００２９】
「ヌクレオシド」１６、１０４は、デオキシリボース、ペントース糖のリボースまたは類似体または誘導体のようなペントース糖に共有結合される塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を有する分子である。
【００３０】
「ヌクレオチド」１６、１０４は、ペントース糖に共有結合で付着する少なくとも１つのリン酸基を更に備えるヌクレオシドを表す。幾つかの実施形態においては、ヌクレオチド１６、１０４はリボヌクレオシド一リン酸１６、１０４またはデオキシリボヌクレオシド一リン酸１６、１０４であるが、他の実施形態においては、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸１６、１０４が生じ得る事が予期される。他の実施形態において、ヌクレオシド１６、１０４は核酸分子１３、１０２からリリースされ、後述のように検出される。分解試薬１５、１０６によって核酸１３、１０２からリリースされ得る限りにおいて、様々な代替または変更がヌクレオチド１６、１０４の構成において為され得る事が予想される。例えば、特定の実施例において、リボースまたはデオキシリボース成分が、他のペントース糖またはペントース糖類似体で置換されても良い。他の実施形態において、リン酸基は様々な類似体によって置換されて良い。
【００３１】
（核酸）
シークエンシングされる核酸分子１３、１０２は、当業者にとって公知の任意の技法によって調整される。特定の実施形態において、核酸分子１３、１０２は、自然に発生するＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。実質的に、染色体、ミトコンドリアおよびクロロプラストＤＮＡおよびリボソーム、トランスファー、異種核およびメッセンジャーＲＮＡを含む任意の自然に発生する核酸１３、１０２が調製され、開示される方法によってシークエンスされるが、シークエンスの方法は上記に限定されない。
【００３２】
様々な形状の細胞核酸１３、１０２を調製・分離するための方法は公知である（例えば、ベルガーおよびキンメル（Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ）編、「分子クローニング技術のガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、（ニューヨーク、ニューヨーク州）、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年、サムブルック、フリッチェおよびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、１９８９年等を参照）。通常、細胞、組織またはシークエンシングされる核酸１３、１０２を含む他の原料物質は、例えば最初に液体窒素によって凍結され、続いて乳鉢と乳棒によって粉砕されることによって均質化される。特定の組織は、ワーリングブレンダ、Ｖｉｒｔｉｓ社のホモジェナイザ、Ｄｏｕｎｃｅ社のホモジェナイザまたは他のホモジェナイザを使用して均質化され得る。原料ホモジェネートは、デタージェント（例えばナトリウム・ドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００、ＣＨＡＰＳ（３−［（３?コラミドプロピル）?ジメチルアミノ］?１?プロパン−スルホン酸塩）、オクチルグルコシド、または公知技術による他のデタージェントによって抽出されて良い。また（あるいは加えて）、例えば、グアニジニウムイソチオシアン酸塩、またはフェノールのような有機溶媒のようなカオトロピック剤によって抽出を行っても良い。幾つかの実施形態において、例えばプロテイナーゼＫを用いたプロテアーゼ処理が、細胞のタンパク質を分解するのに用いることが出来る。粒子状の不純物が、遠心または超遠心分離（例えば約５０００〜１００００ｇ・１０〜３０分、または約５００００〜１０００００ｇ・３０〜６０分）によって取り除かれる。低イオン強度の緩衝液に対する透析が、塩または他の可溶な不純物を取り除く為に用いられて良い。核酸１３、１０２は、−２０℃の環境下でエチルアルコールを添加する事によって、また、０．３Ｍナトリウム酢酸塩（ｐＨ６．５）および０．８倍量の２−プロパノールを添加する事によって沈殿し得る。沈殿した核酸１３、１０２は、遠心分離によって、また、染色体ＤＮＡ１３、１０２に対しては、沈殿したＤＮＡ１３、１０２をガラスピペットまたは他のプローブ上にスプーリングする事によって収集され得る。
【００３３】
当業者は、上述した手順は単なる典型例であり、シークエンシングされる核酸１３、１０２の特定の種類に従い、様々な他の手順が用いられ得る事を理解するであろう。例えば、ミトコンドリアＤＮＡ１３、１０２は、ステップグラジエントを用いる塩化セシウム密度勾配遠心分離によって通常は調製されるが、その一方で、ｍＲＮＡは、例えばプロメガ社（マディソン、ウィスコンシン州）またはクローンテック社（パロアルト、カリフォルニア州）のような商用供給元による分取カラムを使用して通常は調製される。この種の例は、本技術において公知である。
【００３４】
調製される核酸１３、１０２の型に従って、様々なヌクレアーゼ阻害剤が使用され得る、と言う事を当業者は理解するであろう。例えば、バルク溶液へのＲＮアーゼの混入は、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）による処理によって除去し得る。市販のヌクレアーゼ阻害剤は、プロメガ社（マディソン、ウィスコンシン州）や、ＢＲＬ社（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）のような標準的な供給元から取得する事が出来る。精製された核酸１３、１０２が、例えばＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）（エチレンジアミン四酢酸）のような緩衝液に溶解され、使用に先立って−２０℃または液体窒素中に格納される。
【００３５】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１３、１０２がシークエンシングされる場合、ｓｓＤＮＡ１３、１０２は標準的な手法によって二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）より調製され得る。最も単純な場合、ｄｓＤＮＡは、アニーリング温度よりも高い温度に加熱され得、この温度において自然にｓｓＤＮＡ１３、１０２に分割される。代表的な条件としては、少なくとも５分間、９２〜９５℃での加温が挙げられ得る。ｄｓＤＮＡを切り離すための条件を決定するための式は、例えば分子のＧＣ含量および長さに応じて、公知である。あるいは、公知技術である標準の増幅手法により、二本鎖ＤＮＡの１つの鎖のみに結合するプライマを使用することによって二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ１３、１０２が調製されても良い。一本鎖ＤＮＡ１３、１０２を調製する他の方法は公知である。例えば、シークエンシングされる二本鎖ＤＮＡをＭ１３のようなファージの複製型に挿入して、ファージが核酸１３、１０２の一本鎖の複製を生産することが出来る。
【００３６】
特定の実施形態は自然に発生する核酸１３、１０２の調整に関する一方、エキソヌクレアーゼまたは他の分解試薬１５のための基質として供され得る実質的に任意の型の核酸１３、１０２のシークエンシングを行う事が可能である。例えば、様々な増幅手法（例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ（登録商標））増幅）によって調製される核酸１３、１０２のシークエンシングを行う事が出来る（米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号および第４８００１５９号を参照）。シークエンシングされる核酸１３、１０２は、標準的なベクター（例えばプラスミド、コスミド、ＢＡＣ（バクテリア人工染色体）またはＹＡＣｓ（酵母人工染色体））でクローニングされても良い（例えば、ベルガーおよびキンメル（Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ）、１９８７年；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、１９８９年、を参照）。例えば、挿入された核酸１３、１０２は、適当な制限エンドヌクレアーゼによる切出しによってベクターＤＮＡから単離し得、続いてアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色が行われる。サイズによって分別されて選択された核酸１３、１０２は、ゲルから、例えば低融点アガロースの使用によって、またはゲル切片からの電気泳動溶出によって採集され得る。挿入された核酸１３、１０２の単離の方法は公知である。
【００３７】
（一つの核酸分子の単離）
特定の実施形態において、シークエンシングされる核酸分子１３、１０２は、単一のｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡの分子である。単一のｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子１３、１０２を選択・操作するための様々な方法（例えば流体力学に基づく絞り込み（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）、マイクロマニピュレータ・カップリング（ｍｉｃｒｏ−ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、光学トラッピング、または、これらおよび同様の方法の組み合わせ）が使用されて良い（グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）等、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：６０７−６１９、１９９６年；米国特許第４９６２０３７号、第５４０５７４７号、第５７７６６７４号、第６１３６５４３号、第６２２５０６８号を参照）。
【００３８】
特定の実施形態において、マイクロ流体システム（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）またはナノ流体システム（ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）が、核酸１３、１０２を分類・単離するために用いることが出来る。ミクロチャネル、ミクロキャピラリまたはミクロ孔へと核酸１３、１０２の運動を操作するために、流体動力学が用いられて良い。一実施形態において、流体力学的な力は、単一の核酸分子を切り離すべく、核酸分子１３、１０２を櫛状の構造を横切って移動させるために用いることが出来る。一旦核酸分子１３、１０２が切り離されると、流体力学に基づく絞り込みが、分子１３、１０２を反応室１１、１０１の内部に配置するために用いることが出来る。熱または電位、圧力または真空が、核酸１３、１０２の操作のための動力を提供するべく用られ得る。典型的な実施形態において、米国特許第５８６７２６６号および第６２１４２４６号において開示されているように、シークエンシングのための核酸１３、１０２の操作は、マイクロ加工されたチャネルおよび統合したゲル材料を含むチャネル・ブロック・デザインの使用を含んで良い。
【００３９】
他の実施形態において、核酸１３、１０２を含むサンプルは、固定化表面１４、１０３への付着の前に希釈され得る。典型的な実施形態において、固定化表面１４、１０３は、磁性または非磁性ビーズまたは他の離散的な構造のユニットの形状をしていても良い。適切な希釈濃度において、各々のビーズ１４、１０３は、０個または１個の核酸分子１３、１０２をバインディングする統計確率を有する。１個の接続された核酸分子１３、１０２を有するビーズ１４、１０３は、例えば、蛍光染料およびフローサイトメーターによる分類、磁気による分類を使用して識別され得る。ビーズ１４、１０３および核酸１３、１０２の相対的な大きさおよび均一度に応じて、磁気フィルタおよび質量による選別が、単一の結合した核酸分子１３、１０２を含むビーズ１４、１０３を切り離すために用いることが可能であってもよい。他の実施形態において、単一のビーズまたは他の固定化表面１４、１０３に付着する複数の核酸１３、１０２がシークエンシングされて良い。
【００４０】
他の実施形態において、シークエンシング用に被覆されたファイバの先端１４、１０３（例えば米国特許第６２２５０６８号）が、単一の分子核酸１３、１０２を生成するために用いることが出来る。他の実施形態において、固定化表面１４、１０３は、単一分子のアビジンまたは他の架橋剤を含むように調整されても良い。この種の界面１４、１０３は単一のビオチニル化されたプライマ１６を付着させる事が出来、そして、これはシークエンシングされる単一の核酸１３、１０２によってハイブリダイズされ得る。この実施形態は、アビジン−ビオチン・バインディング・システムに限定されず、公知の任意のバインディング・システムに適用され得る。
【００４１】
他の実施形態において、シークエンシングにおける単分子核酸分子１３、１０２の操作の為に、光学トラップが使用されて良い（例えば米国特許第５７７６６７４号）。典型的な光学トラッピング・システムは、Ｃｅｌｌ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ社（アルバカーキ、ニューメキシコ州）、Ｓ＋Ｌ社（ハイデルベルク、ドイツ連邦共和国）およびＰ．Ａ．Ｌ．Ｍ．Ｇｍｂｈ（ヴォルフラーツハウゼン、ドイツ連邦共和国）より市販されている。
【００４２】
（固定化の方法）
様々な実施形態において、シークエンシングされる核酸分子１３、１０２は、固体の表面１４、１０３に付着され得る（つまり、固定化される）。核酸分子１３、１０２の固定化は、核酸分子１３、１０２と表面１４、１０３との間の非共有結合的または共有結合的な付着を含む様々な方法によって達成され得る。ある具体例において、固定化は、表面１４、１０３をストレプトアビジンまたはアビジンで被覆し、更にビオチニル化された核酸１３、１０２を付着する事によって達成され得る（ホルムストロム（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０９：２７８−２８３，１９９３年）。固定化は、ケイ素、ガラスまたは他の表面１４、１０３を、ポリＬリシンまたはポリＬリシン−フェニルアラニンで被覆し、更に、二機能性の架橋試薬を用いて、アミノまたはスルフヒドリルで修飾された核酸１３、１０２を共有結合によって付着させることによって行われて良い（ランニング（Ｒｕｎｎｉｎｇ）等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８：２７６−２７７、１９９０年；ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１１５５−６２，１９９３年）。架橋用のアミノシランの使用によって表面１４、１０３上にアミン残基が導入され得る。
【００４３】
固定化は、化学的に修飾された表面１４、１０３に５’リン酸化された核酸１３、１０２を直接共有結合によって付着させる事によって起こり得る（ラスマッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）等、Ａｎａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８：１３８−１４２，１９９１年）。核酸１３、１０２と表面１４、１０３との間の共有結合は、水溶性シアナミドによる縮合反応によって形成される。この方法によって、核酸１３、１０２の５’リン酸塩による優先的な５’付着が容易になる。
【００４４】
通常、ＤＮＡ１３、１０２は、まずガラス表面１４、１０３をシラン処理し、続いてカルボジイミドまたはグルタールアルデヒドによって活性化する事によってガラスに付着される。他の方法として、分子の３’末端または５’末端のいずれかに組み込まれるアミノリンカーによってリンクされるＤＮＡ１３、１０２に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）またはアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）のような試薬を使用することが出来る。ＤＮＡ１３、１０２は、紫外線を使用して、表層膜１４、１０３に直接バインドされ得る。核酸１３、１０２の固定化の技法の他の例が、米国特許第５６１０２８７号、第５７７６６７４号および第６２２５０６８号に開示されているが、固定化の技法の例はこれらに限定されない。
【００４５】
核酸１３、１０２の固定化のために使用される表面１４、１０３の種類は限定されるものではない。様々な実施形態において、固定化表面１４、１０３は、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、平坦面、尖った表面、または、核酸１３、１０２のシークエンシング反応が行われ得るような十分な耐性が有って不活性である実質的に任意の材料を有する任意の構造の固体の表面１４、１０３であって良い。使用され得る表面１４、１０３として、ガラス、シリカ、ケイ酸エステル、ＰＤＭＳ、銀または他の金属で被覆された表面、ニトロセルロース、ナイロン、活性石英、活性ガラス、重合ビニリデン二フッ化物（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレートまたはポリジメチル・シロキサンのような他のポリマー、および、共有結合によるリンクを核酸分子１３、１０２と形成する事が可能なナイトレン、カルベン、ケチルラジカルのような感光性の種を含む感光性樹脂等であって良いが、表面１４、１０３はこれらのものに限定されない（例えば米国特許第５４０５７６６号および第５９８６０７６号を参照）。
【００４６】
様々な実施形態において、二機能性の架橋試薬が、例えば核酸分子１３、１０２を表面１４、１０３に付着させる為に有用であって良い。二機能性の架橋試薬は、それらの官能基（例えばアミノ、グアニジノ、インドールまたはカルボキシル基）の選択性によって分類されて良い。これらのうちで、アミノ基を遊離させる試薬が、市場での入手容易性、合成の平易さおよびこれらが適用され得る反応条件の緩やかさといった理由によって普及している。分子架橋の典型的な方法が、米国特許第５６０３８７２号および第５４０１５１１号において開示されている。架橋試薬は、グルタールアルデヒド（ＧＡＤ）、二機能性のオキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコール・ジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）およびカルボジイミド（例えば１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロポキシル）カルボジイミド（ＥＤＣ））を含む。
【００４７】
（分解試薬）
シークエンシング反応は、分解試薬１５、１０６を、核酸分子１３、１０２の遊離末端１７、１０５にバインディングし、１度に１個のヌクレオチド１６、１０４を取り除く事を含む。特定の実施形態において、この反応は酵素（例えばエキソヌクレアーゼ１５、１０６）によって触媒作用を及ぼされ得る。本実施形態は、使用され得るエキソヌクレアーゼ１５、１０６の型によって制限されない。使用され得るエキソヌクレアーゼ１５、１０６として、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩ、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼ、ｍｕｎｇ ｂｅａｎエキソヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩホロエンザイムまたはクレノー断片、ＲｅｃＪ、エキソヌクレアーゼＴ、Ｔ４またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＴ７Ｇｅｎｅ６、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ｌａｍｂｄａエキソヌクレアーゼ、Ｓ．アウレウス球菌ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、Ｔ１球菌ヌクレアーゼ、または公知の他のエキソヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼ１５、１０６は、例えばニューイングランドバイオラボ社（ベヴァリー、マサチューセッツ州）、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社（ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）、プロメガ社（マディソン、ウィスコンシン州）、シグマ・ケミカルズ社（セントルイス、ミズーリ州）またはベーリンガー・マンハイム社（インディアナポリス、インディアナ州）のような供給源から市販されている。
【００４８】
当業者は、例えば、エキソヌクレアーゼ１５、１０６活性を有する酵素が様々な性状を有すると理解する。例えば、これらはヌクレオチド１６、１４を５’末端、３’末端から、または、核酸分子１３、１０２のいずれかの末端から取り除く事が出来る。これらは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡ１３、１０２の双方に対して特異性を示す。これらの活性は、一本鎖または二本鎖の核酸１３、１０２のいずれを使用するかに依存し得る。これらは、反応培地の様々な特性（例えば塩、温度、ｐＨまたは二価カチオン）に応じて異なった影響を受け得る。様々なエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ１５、１０６のこれらの、そしてまた他の特性は公知である。
【００４９】
当業者は、エキソヌクレアーゼ１５、１０６活性の速度がヌクレオチド１６、１０４の解析の最適速度と一致するように、検出ユニット１８、１０７によって操作され得る事を理解するであろう。反応室１１、１０１の温度、圧力、ｐＨ、塩濃度または二価陽イオン濃度を調整する事を含む、エキソヌクレアーゼ１５、１０６活性速度を調整する様々な方法が公知である。エキソヌクレアーゼ１５、１０６活性の最適化の方法は公知である。
【００５０】
（標識）
検出ユニット１８、１０７によるヌクレオチド１６、１０４の計測を容易にするために、特定の実施形態が、標識をヌクレオチド１６、１０４に組み込むことを含んで良い。ラマン標識、フルオロホア、クロモホア、ラジオアイソトープ、酵素による標識、抗体、化学発光、電子発光、親和標識のような、多くの異なる標識が使用され得る。当業者は、これらの標識、本願明細書において言及されない他の標識成分が、様々な実施形態において使用され得る事を認識するであろう。
【００５１】
ラマン分光法を含んでいる実施形態に用いられる標識は上述された。他の実施形態において、使用される標識成分は、例えば、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、ＢＯＤＩＰＹ（５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（フルオレセイン）、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ（６−カルボキシローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２（シアニン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、フルオレセイン、６−ＪＯＥ（２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレイセン）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）、ＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄのようなフルオロホアであって良い。蛍光性または発光性の標識は、通常の民間の供給源（例えばモレキュラープローブス社（ユージン、オレゴン州）より取得可能である。
【００５２】
（反応室）
反応室１１、１０１は、水環境において、固定化表面１４、１０３、核酸分子１３、１０２、分解試薬１５、１０６、およびヌクレオチド１６、１０４を保持するように設計されている。幾つかの実施形態において、反応室１１、１０１は、例えばペルチェ素子の組み込み、または公知技術の他の方法によって温度が制御されるように設計される。小容量液体の温度制御の方法は公知である（米国特許第５０３８８５３号、第５９１９６２２号、第６０５４２６３号および第６１８０３７２号参照）。
【００５３】
特定の実施形態において、コンピュータチップの製造またはミクロキャピラリチップの製造の分野において公知であるように、反応室１１、１０１および、流路１２、または廃棄ポートに対する、核酸１３、１０２の供給ポートに対する、または分解試薬１５、１０６の供給ポートに対する接続を提供する為の任意の反応室１１、１０１に関する流体チャネルが、バッチ製作プロセスによって製造される。幾つかの実施形態において、装置１０の反応室１１、１０１および他の構成要素（例えば流路１２）は、単一の統合したチップとして製造されて良い。この種のチップは、従来技術によって、例えばフォトリソグラフィーおよびエッチングによって製造され得る。しかし、製造方法はこれに限定されず、公知技術の他の方法（例えばレーザアブレーション、射出成形、鋳造またはインプリンティングの技法）が使用されても良い。ナノ電気機械システムの製造方法が、特定の実施形態に対して使用されて良い（例えば、クレーグヘッド（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：１５３２−３６、２０００年を参照）。マイクロ加工されたチップは、例えば、カリパー・テクノロジーズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）およびアクララ・バイオサイエンシーズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）のような供給元から市販されている。
【００５４】
プラズマ増速化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）システム（ＰＥＩＩ−Ａ、テクニクス・ウエスト社、サンノゼ、カリフォルニア州）によるアモルファスシリコン犠牲層の堆積に先立って、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔガラスウェーハー（プレシジョングラス＆オプティクス（サンタアナ、カリフォルニア州））が、高濃度ＨＦ（フッ化水素酸）中で短期間プレエッチングされ、洗浄されても良いが、上記の方法に限定されない。ウェーハは、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を注入されて良く、フォトレジストによってスピンコートされ（シプリー１８１８、マールボロ、マサチューセッツ州）て、ソフトベークされて良い。コンタクトマスク・アライナ（Ｑｕｉｎｔｅｌ社、サンノゼ、カリフォルニア州）が、一つ以上のマスクデザインによってフォトレジスト層を露光するために用いられ得、そして、露光したフォトレジストはＭｉｃｒｏｐｏｓｉｔの現像液濃縮剤（シプリー）および水の混合液を使用して除去される。現像されたウェーハはハードベークされて良く、そして、露光したアモルファスシリコンが、ＰＥＣＶＤ炉中でＣＦ_４（四フッ化炭素）プラズマを使用して除去されて良い。ウェーハは、反応室１１、１０１、流路１２、および任意のチャネルを生成する為に、高濃度ＨＦによって化学的にエッチングされて良い。残留したフォトレジストがストリッピングされ、アモルファスシリコンが除去される。
【００５５】
ダイヤモンドドリル・ビット（クリスタライト社、ウェスタービル、オハイオ州）によって、エッチングされたウェーハにアクセスホールが穿設される。完成したチップは、プログラム可能な真空炉（ＣｅｎｔｕｒｉｏｎＶＰＭ，Ｊ．Ｍ．Ｎｅｙ、ユカイパ、カリフォルニア州）中において、エッチング・穿設されたプレートと、同サイズの平坦なウェーハとを熱的にボンディングすることによって製作されて良い。特定の実施形態において、チップは２つのエッチングされたプレートを相互にボンディングすることによって製作されても良い。反応室１１、１０１および流路１２を組み込むのチップの製作のための他の典型的な方法が、米国特許第５８６７２６６および第６２１４２４６号において開示されている。
【００５６】
検出ユニット１８、１０７によってヌクレオチド１６、１０４の検出を容易にするために、反応室１１、１０１および（または）流路１２を構成する材料は、検出ユニット１８、１０７において使用される励起および発光振動数の電磁波の放射に対して透過性を有する材料が選定され得る。ガラス、ケイ素および一般にラマン分光法、蛍光分光学法、ルミネセンス分光法または他の形式の分光法に使用される周波数範囲においてほぼ透過性を有するその他の材料が使用されて良い。幾つかの実施形態において、検出ユニット１８、１０７と相対する反応室１１、１０１および（または）流路１２の表面は、銀、金、白金、銅、アルミニウム、または検出ユニット１８、１０７に対して比較的不透明である他の材料によって被覆されていても良い。この場合、不透明体材料は、例えば表面強化ラマン分光法のような、ラマン信号またはその他の信号を増強するために利用可能であり、その一方で、検出ユニット１８、１０７の機能は妨げられない。また、反応室１１、１０１および（または）流路１２は、銀、金、白金、銅またはアルミニウムを含むメッシュを含んで良い。流路１２を備える実施形態において、通常、ヌクレオチド１６は、流路１２に配置されている最中に検出される事を、当業者は理解するであろう。流路１２の存在しない実施形態において、ヌクレオチド１０４は反応室１０１において検出される。
【００５７】
様々な実施形態において、反応室１１、１０１内部の容積は、約１ピコリットル、約２ピコリットル、約５ピコリットル、約１０ピコリットル、約２０ピコリットル、約５０ピコリットル、約１００ピコリットル、約２５０ピコリットル、約５００ピコリットル、約１ナノリットル、約２ナノリットル、５ナノリットル、約１０ナノリットル、約２０ナノリットル、約５０ナノリットル、約１００ナノリットル、約２５０ナノリットル、約５００ナノリットル、約１マイクロリットル、約２マイクロリットル、約５マイクロリットル、約１０マイクロリットル、約２０マイクロリットル、約５０マイクロリットル、約１００マイクロリットル、約２５０マイクロリットル、約５００マイクロリットルまたは約１ミリリットルであって良い。
【００５８】
（流路）
特定の実施形態において、遊離したヌクレオチド１６は、検出ユニット１８を通り越して流路１２を流下する。遊離したヌクレオチド１６の移送の手法として、微量流体移送が挙げられるが、これに限定されない。流路１２は、ミクロキャピラリ（例えば、アクレラ・バイオサイアンシズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手可能）または液体用の集積回路（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州））を含んで良い。この種の微量流体移送のプラットフォームは、ナノリットルのオーダーの容積のサンプルしか必要としない。
【００５９】
特定の実施形態において、検出される遊離したヌクレオチド１６は、溶剤のバルク流れによって流路１２の下流に移動する。他の実施形態において、流路１２の下流に遊離したヌクレオチド１６を輸送し、検出ユニット１８を通過させるために、ミクロキャピラリ電気泳動を用いても良い。ミクロキャピラリ電気泳動は、細いキャピラリまたはチャネルを使用する事を一般に含む。キャピラリまたはチャネルは、特定の分別培地で充填されていてもよいし、充填されていなくても良い。装置の反応室１１側が負に、検出ユニット１８側が正となるような電界の印加に応答して、適切に帯電した分子種（例えば負に帯電したヌクレオチド１６）の電気泳動が発生する。電気泳動は通常、ミクロキャピラリに同時に加えられる要素の混合物の大きさの分別のために使用されるが、それはまた、流路１２に順番に添加される同じ位のサイズのヌクレオチド１６を輸送するために用いる事も可能である。プリンヌクレオチド（Ａ、Ｇ）１６は、ピリミジンヌクレオチド（Ｃ、Ｔ、Ｕ）１６よりも大きく、移送される速度がより遅いので、流路１２およびそれに対応する検知器ユニット１８を通過する時間長によって、核酸１３からリリースされるヌクレオチド１６の順序が狂ってしまう事を防止しなければならない。あるいは、流路１２を流下するプリンおよびピリミジンヌクレオチド１６の移動速度がほぼ同じとなるか、または一致するように、ミクロキャピラリを満たす分別培地が選定されて良い。例えば、ミクロキャピラリ電気泳動の方法は、ウーリーおよびマチエス（Ｗｏｏｌｌｅｙ ａｎｄ Ｍａｔｈｉｅｓ）、会報、全米科学アカデミー（Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９１：１１３４８−３５２、１９９４年）によって開示されている。
【００６０】
ミクロキャピラリ電気泳動的装置を含む微量流体移送装置用のマイクロ素子の製造が、例えば、ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）等（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０９：２７８−２８３、１９９４年）、エッフェンハウザー（Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒ）等（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：２９４９−２９５３、１９９４年）、ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：８９５−８９７、１９９３年）、および米国特許第５９０４８２４号において議論された。一般的に、これらの方法は、シリカ、ケイ素、またはその他結晶基板またはチップ上のミクロン・スケールのチャネルのフォトリソグラフィー・エッチングを含み、実用に供され得る。幾つかの実施形態において、ミクロキャピラリは、射出成形または他の公知技術を用いて、反応室１１、１０１の製作に際して記載された同様の重合物質より製造されて良い。
【００６１】
（検出ユニット）
ラマン分光法を含む実施形態
【００６２】
幾つかの実施形態において、検出ユニット１８、１０７は、ラマン分光法によってヌクレオチド１６、１０４を検出・計量するように設計されている。ラマン分光法によるヌクレオチド１６、１０４の検出のための様々な方法が、公知である（米国特許第５３０６４０３号、第６００２４７１号、第６１７４６７７号を参照）。表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）または表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）の様々な例が開示されている。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳにおいて、ラマン検出の感度は、きめの粗い金属表面（例えば銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面）に吸収される分子に比べて、１０^６倍以上に増強される。
【００６３】
ラマン検出ユニット１８、１０７の例が、米国特許第６００２４７１号において開示されるが、これに限定されない。本実施形態において、励起光線２０、１１０は、５３２ナノメートルの波長のＮｄ：ＹＡＧレーザ１９、１０８か、３６５ナノメートルの波長のＴｉ：サファイア・１９、１０８によって生成される。レーザ光線２０、１１０は、パルス光であっても良いし、連続光であっても良い。励起光線２０、１１０は、共焦点光学系および顕微鏡の対物レンズを通過して、流路１２または反応室１０１に焦点が合わせられる。ヌクレオチド１６、１０４からのラマン発光は、顕微鏡の対物レンズおよび共焦点光学系によって集められ、スペクトル解離のためにモノクロメータに接続される。共焦点光学系は、ダイクロイックフィルタ、バリアーフイルタ、共焦点ピンホール、レンズおよびバックグラウンド信号を低減させるためのミラーの組み合わせを備える。標準的なフルフィールドの光学系が、共焦点光学系と同様に使用され得る。ラマン発光信号は、ラマン検出器２１、１０９によって検出される。検出器２１、１０９は、信号の計数およびデジタル化のために、コンピュータに接続されたアバランシェフォトダイオードを備える。表面増強ラマンおよび表面増強ラマン共鳴によって増強された信号を供給する為に、特定の実施形態において、銀、金、白金、銅またはアルミニウムを備えるメッシュが、流路１２または反応室１０１に含まれていて良い。
【００６４】
検出ユニット１８、１０７の他の実施形態が、例えば米国特許第５３０６４０３号において開示され、この実施形態は、シングルフォトン・カウンティングモードで作動するガリウム砒素光電子増倍管（ＲＣＡ社Ｃ３１０３４またはＢｕｒｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ社Ｃ３１０３４０２）を有する二重格子分光光度計２１、１０９を備えるＳｐｅｘ１４０３を含む。励起源１９、１０８は、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ社の１６６アルゴン−イオンレーザ１９、１０８の５１４．５ナノメートルの光線、および、コヒーレント社のＩｎｎｏｖａ７０クリプトン−イオンレーザ１９、１０８の６４７．１ナノメートルの光線である。
【００６５】
励起源１９、１０８のその他の例として、Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社の窒素レーザ１９、１０８の３３７ナノメートルの光線、およびＬｉｃｏｎｏｘ社製のヘリウム−カドミウム・レーザ１９、１０８の３２５ナノメートルの光線が挙げられる（米国特許第６１７４６７７号）。励起光線２０、１１０は、バンドパスフィルタ（Ｃｏｒｉｏｎ社）によって、スペクトル的に不要な成分を取り除かれ、６倍の対物レンズ（ニューポート社Ｌ６Ｘ）によって、流路１２または反応室１０１に焦点が合わせられる。対物レンズは、励起光線２０、１１０と放出されたラマン信号が直角になるようにホログラフィック・ビームスプリッタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社ＨＢ６４７−２６Ｎ１８）を使用する事によって、ヌクレオチド１６、１０４を励起する為およびラマン信号を集める為の双方に用いられ得る。ホログラフィック・ノッチフィルタ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が、レイリー散乱輻射線を低減させる為に用いられて良い。ラマン検出器２１、１０９の他の例として、赤色が強められたインテンシファイアー付き電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を備えるＩＳＡ社のＨＲ−３２０スペクトルグラフが挙げられる。例えば、電荷注入素子、フォトダイオードアレイまたはフォトトランジスタアレイのような、他の型の検出器２１、１０９が使用されて良い。
【００６６】
ヌクレオチド１６、１０４を検出する為に、通常のラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、レーザーラマンマイクロプローブ分光法（ＭＯＬＥ）またはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡または共焦点ラマン顕微鏡、３次元または走査ラマン、ラマン・サチュレーション分光法、時間分解された共鳴ラマン、ラマン・デカップリング分光法（Ｒａｍａｎ ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）または紫外ラマン顕微鏡のような、任意の好適な形態または構成の公知のラマン分光法または関連する技術が用いられて良いが、上記の当該技術に限定される物ではない。
【００６７】
ＦＲＥＴを含む実施形態
他の実施形態において、ヌクレオチド１６、１０４は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いる事によって識別・計量されても良い。ＦＲＥＴは、ドナー分子とアクセプタ分子との間の接近を検出するために用いる分光学的現象である。ドナーからの蛍光性発光がアクセプタの励起スペクトルと重なるように、ドナーおよびアクセプタのペアが選択される。２つの分子間の距離が１００オングストローム未満となった際、ドナーの励起状態エネルギーが無放射でアクセプタに転送され、ドナーの蛍光が停止する。アクセプタ分子がフルオロホアである場合、その蛍光が増強される。オリゴヌクレオチドに対するＦＲＥＴの使用のための構成要素および方法は公知である（例えば米国特許第５８６６３６６号）。
【００６８】
ＦＲＥＴのための標識として多用される分子は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）および５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含む。使用可能な他のＦＲＥＴドナーまたはアクセプタ分子が、公知である（米国特許第５８６６３３６号の表１を参照）。当業者は、ＦＲＥＴのための標識分子のペアの選定に精通しているであろう（米国特許第５８６６３３６号）。
【００６９】
ＦＲＥＴを含む実施形態において、ドナーおよびアクセプタ分子は、共有結合または非共有結合でシークエンシング装置１０、１００の様々な成分に付着してよい。特定の実施形態において、ドナーまたはアクセプタ分子は、ヌクレオチド１６、１０４に、エキソヌクレアーゼ１５、１０６に、または流路１２に付着されて良い。
【００７０】
特定の実施形態において、ドナー分子はエキソヌクレアーゼ１５、１０６または流路１２の表面に付着し、アクセプタ分子がヌクレオチド１６、１０４に付着して良い。この場合、ヌクレオチド１６、１０４の各々の型は、識別可能な発光スペクトルを有するアクセプタ分子に接続されなければならない。その一方で、ドナー分子は、４種類のアクセプタ分子の全ての励起スペクトルと重なる広い発光スペクトルを有する様に選定されなければならない。複数のドナー分子が、エキソヌクレアーゼ１５、１０６または流路１２に存在しても良い。但し、他の実施形態においては、単一のドナー分子のみが存在しても良い。
【００７１】
励起によって、複数のドナー分子は自身のエネルギーをヌクレオチド１６、１０４に付着しているアクセプタ標識分子へ転送する。そして、アクセプタ分子から増強された蛍光信号が蛍光される。信号の増強の強度は距離が離れるにつれて急速に減少するので、ドナー分子に非常に近接したヌクレオチド１６、１０４に最も大きな信号増強が発生する。触媒部位上にまたはその近傍においてエキソヌクレアーゼ１５、１０６に付着するドナー分子の場合、最も強い発光信号を有するヌクレオチド１６、１０４は、エキソヌクレアーゼ１５、１０６の触媒部位に位置する。ドナー分子は、触媒部位の近傍で、かつ分解試薬１５、１０６のエキソヌクレアーゼ活性を妨げない位置に接続されなければならない。ドナー分子が励起光線２０の焦点が合わせられる位置である流路１２の表面に接続される実施形態において、励起光線２０の焦点中のヌクレオチド１６のみが、検出可能な蛍光性信号を与えなければならない。励起光線２０、１１０の波長は、ドナー分子を最大限に励起する一方で、アクセプタ分子は僅かにしか励起されないように選定され得る。各々のヌクレオチド１６、１０４が核酸分子１３、１０２から取り除かれるにつれて、対応するドナー標識からの信号が検出される。
【００７２】
特定の実施形態において、シークエンシングされる鋳型核酸１３、１０２は、例えば光学トラップを用いて、公知の方法によって蛍光顕微鏡の視界の範囲内に保持する事が出来る（例えば米国特許第６１３６５４３号）。使用され得る蛍光顕微鏡の例として、１００倍の倍率を有する油浸レンズ（Ｐｌａｎ．ｍｕｌｔｉｄｏｔ．Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ．ｔｉｍｅｓ．１００、１．４０ＮＡ（オリンパス社））を用いる逆位相差・落射式蛍光顕微鏡（ＩＭＴ２−ＲＦＣ、オリンパス社）が挙げられるが、これに限定される物ではない。そして、前述されたように、励起光線２０、１１０がレーザ１９、１０８によって発されることができる。蛍光発光は、適当なフィルタを用いて対物レンズで集められ得、任意の高感度蛍光検出器２１、１０９（例えばＣＣＤ装置、フォトダイオード、光電子増倍管またはその均等物）を使用して検出する事が出来る。
【００７３】
情報処理システムおよびデータ分析
【００７４】
特定の実施形態において、核酸シークエンシング装置１０、１００は、情報処理システムを備えていて良い。本実施形態に用いられる情報処理システムの形式は特に限定される物ではない。典型的な情報処理システムは、情報を伝達するためのバスおよび情報を処理するためのプロセッサを備えるコンピュータを組み込むことが出来る。一実施形態において、プロセッサは、インテル社（サンタクララ、カリフォルニア州）から入手可能なプロセッサであるペンティアム（登録商標）ＩＩシリーズ、ペンティアム（登録商標）ＩＩＩシリーズおよびペンティアム（登録商標）４シリーズから選択されるが、これらに限定される物ではない。他の実施例では、プロセッサは、インテル社（サンタクララ、カリフォルニア州）のセレロン（登録商標）、イタニウム（登録商標）またはペンティアム・ジオン（登録商標）プロセッサであってもよい。様々な他の実施例において、プロセッサは、インテル（登録商標）アーキテクチャ（例えばインテル（登録商標）ＩＡ−３２またはインテル（登録商標）ＩＡ−６４アーキテクチャ）に基づいてもよい。あるいは、他のプロセッサが使われても良い。
【００７５】
コンピュータは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他の動的記憶装置、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）または他の静的記憶装置、および磁気ディスクまたは光ディスクまたはそれに対応するようなデータ記憶装置を更に備えて良い。情報処理システムは、表示装置（例えばＣＲＴまたは液晶ディスプレイ）、文字入力装置（例えばキーボード）、カーソル制御装置（例えばマウス、トラックボールまたはカーソル方向キー）および通信装置（例えば、モデム、ネットワークインターフェイスカードまたはイーサネット、トークンリングまたは他の形式のネットワーク接続インタフェース機器）の様な、公知技術による他の周辺機器を更に備えて良い。
【００７６】
特定の実施形態において、検出ユニット１８、１０７は情報処理システムに操作可能なように接続されていても良い。検出ユニット１８、１０７からのデータは、プロセッサおよびメインメモリに格納されるデータによって処理されて良い。標準のヌクレオチド１６、１０４の発光プロファイルについてのデータが、メインメモリまたはＲＯＭに格納されて良い。プロセッサは、核酸分子１３、１０２からリリースされるヌクレオチド１６、１０４の型を識別するために、反応室１０１または流路１２のヌクレオチド１６、１０４からの複数の発光スペクトルを比較することが出来る。また、メインメモリは、核酸分子１３、１０２からリリースされたヌクレオチド１６、１０４の配列を格納する事が出来る。プロセッサは、核酸１３、１０２の配列を決定するために、検出ユニット１８、１０７からのデータを分析することが出来る。別の構成を有する情報処理システムが、特定の実施において使用され得る事が認識されるであろう。従って、システムの構成は、異なる実施形態においては変化していても良い。
【００７７】
本願明細書において記載されているプロセスは、プログラムされたプロセッサの制御下で実行され得る一方で、別の実施形態においては、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡｓ）、ＴＴＬロジック、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）等の任意のプログラマブルまたはハードコーデッド・ロジックによって、その全部または一部が実行されて良い事に注目されたい。加えて、開示された方法は、プログラムされた汎用コンピュータコンポーネントおよび／またはカスタム・ハードウェアコンポーネントの任意の組み合わせによって実行されて良い。
【００７８】
データ収集操作の後、データは通常データ分析操作へと送られる。分析操作を容易にするために、検出ユニット１８、１０９によって得られるデータは、通常は上述されたようにデジタルコンピュータを使用して分析される。一般的にコンピュータは、検出ユニット１８、１０９からデータの受取りおよび格納のため、そして同様に、データの解析および報告のために、適切にプログラムされる。
【００７９】
特定の実施形態において、専用設計されたソフトウェアパッケージが、検出ユニット１８、１０９から得られるデータを分析するために用いることが出来る。他の実施形態において、情報処理システムおよび市販されているソフトウェアパッケージを使用する事によってデータ分析が実行されても良い。ＤＮＡの塩基配列解析のための利用可能なソフトウェアとして、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡシークエンシング分析ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）パッケージ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社、アナーバー、ミシガン州）、および、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙのウェブサイトｗｗｗ．ｎｂｉｆ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／１．４．１．ｐｈｐを通して入手可能な様々なソフトウェアパッケージが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】シークエンシングされる核酸分子からリリースされたヌクレオチドが空間的に切り離されるような、ＤＮＡ塩基配列決定のための装置および方法の例を示す（縮尺は均等では無い）。
【図２】リリースされたヌクレオチドが核酸分子から空間的に切り離されず、検出器が溶液に存在するヌクレオチドを計量するような、ＤＮＡ塩基配列決定のための装置および方法の例を示す（縮尺は均等では無い）。

Claims (28)

1. ａ）単一の核酸分子を接続する固定化表面を含む反応室と
   ｂ）前記反応室に接続される流路と、
   ｃ）励起源およびラマン分光検出器を備える検出ユニットと
   を備える、装置。
2. 前記励起源が、レーザである、請求項１に記載の装置。
3. 前記ラマン検出器が、分光計またはモノクロメータである、請求項１に記載の装置。
4. （ｉ）情報処理システムと
   （ｉｉ）データベースと
   を更に備える、請求項１に記載の装置。
5. 前記固定化表面が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、円すい面、平坦面または曲面である、請求項１に記載の装置。
6. 前記流路が、チップ内のミクロキャピラリまたは１つ以上のミクロチャネルを備える、請求項１に記載の装置。
7. 前記流路の一部が、銀、金、白金、銅またはアルミニウムで覆われている、請求項１に記載の装置。
8. 前記流路が、銀、金、白金、銅またはアルミニウムのメッシュを備える、請求項１に記載の装置。
9. 分解試薬を更に備える、請求項１に記載の装置。
10. ａ）単一の核酸分子を接続する固定化表面を含む反応室と、
    ｂ）励起源およびラマン分光検出器を備える検出ユニットと
    を備える、装置。
11. （ｉ）情報処理システムと、
    （ｉｉ）データベースと
    を更に備える、請求項１０に記載の装置。
12. 前記励起源が、レーザである、請求項１０に記載の装置。
13. 前記ラマン検出器が、分光計またはモノクロメータである、請求項１０に記載の装置。
14. 前記固定化表面が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、円すい面、平坦面または曲面である、請求項１０に記載の装置。
15. 前記反応室中に、銀、金、白金、銅またはアルミニウムのメッシュを更に備える、請求項１０に記載の装置。
16. 分解試薬を更に備える、請求項１０に記載の装置。
17. 核酸をシークエンシングする方法であって、
    ａ）反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
    ｂ）前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
    ｃ）前記ヌクレオチドを前記核酸分子から切り離すステップと、
    ｄ）ラマン分光法によって前記ヌクレオチドを検出するステップと
    を備える、方法。
18. 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ活性によって前記核酸分子の前記遊離末端から取り除かれる、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、標識分子がヌクレオチドのそれぞれに接続される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記ヌクレオチドが、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、誘導ラマン散乱、逆ラマン、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、またはコヒーレント反ストークスラマン散乱によって検出される、請求項１７に記載の方法。
21. 核酸をシークエンシングする方法であって、
    ａ）反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
    ｂ）前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
    ｃ）ラマン分光法によって前記反応室の前記ヌクレオチドを計量するステップと
    を備える、方法。
22. 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ活性によって前記核酸分子の前記遊離末端から取り除かれる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、標識分子がヌクレオチドのそれぞれに接続される、請求項２１に記載の方法。
24. 前記ヌクレオチドが、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、誘導ラマン散乱、逆ラマン、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、またはコヒーレント反ストークスラマン散乱によって検出される、請求項２１に記載の方法。
25. 核酸をシークエンシングする方法であって、
    ａ）反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
    ｂ）前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
    ｃ）蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分光法によって前記ヌクレオチドを検出するステップと
    を備える、方法。
26. 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、前記ヌクレオチドがアクセプタ分子に接続される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼによって取り除かれる、請求項２６に記載の方法。
28. １つ以上のドナー分子が前記エキソヌクレアーゼに接続される、請求項２７に記載の方法。