JP2005504282A - 分子分解のラマン監視による核酸シークエンシング - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
より詳細には、本方法および装置は、分子をエキソヌクレアーゼ活性に晒し、核酸の一端から一つずつ遊離したヌクレオチドを除去し、ラマン分光法またはFRETによってリリースされたヌクレオチドを識別することによって、一本鎖DNAまたはRNAの単一分子をシークエンシングする事に関する。
【選択図】図1
Description
【0001】
本方法、構成要素および装置は、分子生物学およびゲノム解析の分野に関する。より詳細には、開示された方法、構成要素および装置は、核酸シークエンシングに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトゲノム解析計画の出現によって、核酸(例えばデオキシリボ核酸(DNA)およびリボゾームリボ核酸(RNA))をシークエンシングするための改良された方法が開発される事が必要とされてきた。遺伝情報は、染色体に形成されるDNAの非常に長い分子の形で格納される。ヒトゲノムの23組の染色体は、約30億の塩基対を含むDNAの塩基配列である。このDNAの塩基配列情報は、各々の個体の特性(例えば、身長、目の色、および民族性)を決定する。多くの普通の疾患、例えばガン、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血および筋ジストロフィーは、少なくともその一部がDNAの塩基配列の相違に基づく。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
ヒトゲノムの全ての配列の決定によって、この種の疾患の遺伝子的な根拠を識別するための基盤が提供される。しかし、各々の疾患に伴う遺伝子の変異を識別するための多くの研究が未だ為されていない。従って、疾患を促進するDNAの塩基配列の特定の変異を識別するために、この種の疾患を示す個人およびその家族の染色体の部分的なDNA塩基配列決定を必要とする。若干のケースにおいて、RNA(遺伝情報を処理する為に必要な仲介用の分子)もまた、様々な疾患の遺伝子的な根拠を識別するためにシークエンスされ得る。
【0004】
大きさに応じて切断され、蛍光性の標識を付された核酸の検出に基づく従来の核酸シークエンシングの方法は、シークエンシングされ得る核酸の長さによって制限される。一般的に、1回で決定され得る核酸配列は500〜1000の塩基のみである。これは、遺伝子と称されるDNAの機能単位の長さ(通常はその数万〜数十万倍の塩基長)より非常に短い。従来の方法を用いる際、完全な遺伝子配列を決定する為に、多くの遺伝子を複製し、オーバーラップする断片へと切断し、そしてその後、オーバーラップしたDNA配列が完全な遺伝子へと構築される。このプロセスは、面倒で、高価で、非効率的で時間がかかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0005】
添付の図面は、本願明細書の一部を形成し、開示された実施形態の特定の様態をより詳しく示すために備えられている。本願明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と共に図面の一つ以上を参照することによって、これらの実施形態がより良く理解され得る。
【0006】
開示された方法、構成要素および装置は、核酸の高速かつ自動化されたシークエンシングにとって有用である。特定の実施形態において、本方法、構成要素および装置は、1000を超える、2000を超える、5000を超える、10000を超える、20000を超える、50000を超える、100000を超える、またそれ以上の非常に長い核酸の分子の配列を得るのに適している。様々な実施形態において、この種の配列情報は、核酸13、102の1つの分子を用いて、単一のシークエンシングの実行の間に得られ得る。他の実施形態において、核酸の配列を確認する為に、または、完全な配列データを得るために、核酸分子13、102の複数の複製が並列または直列にシークエンスされる。他の実施形態において、核酸分子13、102およびその相補鎖は、配列情報の精度を確認するためにシークエンスされても良い。従来の方法と比較した場合の上記の方法による核酸のシークエンシングの効果として、1回のシークエンシング実行に際して長い核酸の配列を読む能力、配列データを得る際の速度の速さ、シークエンシング時のコストの減少、および1単位の配列データにつき必要なオペレータ時間量の効率の高さ、と言った事が挙げられる。
【0007】
特定の実施形態において、シークエンシングされる核酸13、102はDNAである。但し、RNAまたは合成ヌクレオチド類似体を含む他の核酸13、102が同様に配列され得ることが予期される。以下の詳細な説明は、開示された実施形態のより完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細を含む。しかし、これらの具体的な詳細なしでこれらの実施形態が実施され得るという事は、当業者にとって明らかである。他の例において、本技術分野において公知である装置、方法、手順、および個々の構成要素は、本願明細書において詳述しなかった。
【0008】
図1および図2において開示される幾つかの実施形態において、本発明の方法は、反応室11、101内の固定化表面14、103に付着され、分解反応によって分解される個々の一本鎖の核酸分子13、102のシークエンシングを含む。このような実施形態において、反応室11、101は、核酸分子13、102の遊離末端17、105から1度につき1個のヌクレオチド16、104を順番に取り除くような1つ以上の分解試薬15、106を備える。例えば、この種の分解試薬15、106は、公知の任意のエキソヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。幾つかの実施形態において、ヌクレオチド16、104が溶液にリリースされるにつれて、これらがラマン分光法によって識別される。
【0009】
特定の実施形態が、図1において例示される。図1は、流路12に接続される反応室11を備える、核酸シークエンシングのための装置10を示す。反応室11は、例えばエキソヌクレアーゼのような分解試薬15中に、固定化表面14に付着した核酸分子13を備える。エキソヌクレアーゼ15は、核酸分子13の遊離末端17から、個々のヌクレオチド16を順次放出するような触媒作用を及ぼす。個体ヌクレオチド16が分解反応および入力される溶液によってリリースされるにつれて、これらは検出ユニット18を通過して流路12の下流側に移動する。検出ユニット18は、励起光線20を発する励起源19(例えばレーザ)を備える。電子がより高いエネルギー状態に励起させるために、励起光線20はリリースされたヌクレオチド16と相互に作用する。電子が下位のエネルギー状態まで戻る際に生じるラマン発光スペクトルが、ラマン分光検出器21(例えば分光計またはモノクロメータ)によって検出される。
【0010】
図1に示される実施形態において、リリースされたヌクレオチド16は、検出ユニット18による検出に先立って、核酸分子13から空間的に切り離される。空間的切断によって、個体ヌクレオチド16が単離し、ラマン検出器21のSN比が増加する方向に作用する。
【0011】
図1は、単一の核酸分子13が単一の反応室11に含まれる実施形態を示す。他の実施形態において、複数の核酸分子13が別々の反応室11のそれぞれにおいて同時にシークエンシングされても良い。このような場合、各々の反応室11の核酸分子13は、同一であってもよいし、異なっていても良い。更に他の実施形態において、2つ以上の核酸分子13が単一の反応室11に存在しても良い。このような実施形態において、核酸分子13の配列は同一である。複数の核酸分子13が反応室11に存在する際、ラマン発光信号は、反応室11中の全ての核酸分子13から同時にリリースされるヌクレオチド16の平均を表す。当業者は、公知のデータ分析技術を用いて、反応室11で発生している大多数の反応に先行するかまたは遅延している分解反応によって任意の時間において取得される信号を修正する事が出来る。特定の実施形態において、当業者は、分解試薬15の塊を急速混合で加える事によって、単一の反応室11に存在する複数の核酸分子13の分解を同期する手順を用いることが出来る。
【0012】
他の特定の実施形態において、標識分子が、反応室11または流路12の検出ユニット18の上流側に添加され得る。標識分子が核酸分子13からリリースされるにつれて、標識分子は、遊離したヌクレオチド16とバインディングされ、標識を付す。このリリース後の標識付けによって、核酸分子13のヌクレオチド16が溶液に放出される前に標識付けられてしまう際に発生する問題が回避される。例えば、核酸分子13に組み込まれる各々のヌクレオチド16が分解前に標識を付される場合、大きな蛍光プローブ分子によって相当な立体障害が発生し得る。そして、効率が低下し、シークエンシング反応のために必要な時間が増加する。
【0013】
ヌクレオチド16の放出後の標識付けを含む実施形態において、他の検出方式(例えば蛍光分光学法またはルミネセンス分光法)が使用され得る事が予想される。溶液中に遊離したヌクレオチド16を検出するための多くの他の方式が公知であり、使用可能である。この種の方法に際し、ラマン分光検出ユニット18は、蛍光、発光または他の種類の信号を検出するように設計されている検出ユニット18と置換されて良い。
【0014】
標識分子は、一般のヌクレオチド16の各種類を区別する事が可能であるユニークかつ高い可視光性を持つシグニチャを有する。特定の実施形態において、標識はラマン発光信号を増強するのに、またヌクレオチド16に対するラマン検出器21の感度または選択性を増強させるのに寄与する。ラマン分光を含む実施形態において使用され得る標識分子の例は、TRIT(イソチオシアン酸テトラメチルローダミン)、NBD(7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾール)、テキサスレッド染料、フタール酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット染料、クレシルブルーバイオレット染料、ブリリアントクレシルブルー染料、パラアミノ安息香酸、エリトロシンおよびアミノアクリジンを含むが、標識分子の実施形態は上記のものに限定されない。特定の実施形態における使用に供し得る他の標識部分は、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リンおよび硫黄を含む。特定の実施例において、カーボンナノチューブが、ラマン標識として使用されて良い。ラマン分光における標識の使用は、公知である(例えば米国特許第5306403号および第6174677号)。当業者は、異なるヌクレオチド16にバインドされた場合に、または一種類のヌクレオチド16のみをバインドするために異なる標識が設計されているべき場合に、ラマン標識が識別可能なラマン・スペクトルを生成するべきである事を理解するであろう。
【0015】
特定の実施形態において、核酸分子13は、固定化表面14に対して付着する事によって適所に固定され、流路12を流下する微量流体の流れ中に浸漬される。微量流体は、リリースされたヌクレオチド16を核酸分子13から離間させ、かつ検出ユニット18を通過させるように運搬する。微量流体の流れは、核酸分子13を通過してケイ素、ガラスまたは他のチップ内のマイクロキャピラリ・チューブまたはエッチチャンネルのような流路12を流下する溶剤のバルク流に起因し得るが、上記の例に限定されない。他の実施形態において、バルク媒体は非常にゆっくりとしか移動しないか、あるいは全く移動せず、外部から印加された電界に応答して、溶液中の荷電種(例えば、負に帯電したヌクレオチド16)が、チャネルまたはチューブを備える流路12中を流下する。
【0016】
他の実施形態において、核酸分子13が接続される固定化表面14を、リリースされたヌクレオチド16から遠ざけることによって移動することによって、核酸分子13を移動させる事が出来る。リリースされたヌクレオチド16は、核酸分子13を追跡する検出ユニット18を移動させる事によってスキャン・識別され得る。
【0017】
上述された実施形態において、検出ユニット18は、核酸分子13からリリースされる複数の一般のヌクレオチド16を区別することが出来る必要がある。少なくとも、DNA分子13をシークエンシングするために、検出ユニット18は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、シトシン(C)、チミジン(T)を含むヌクレオチド16を識別可能でなければならない。RNA13がシークエンシングされる際は、検出ユニット18は、A、G、Cおよびウリジン(U)を含むヌクレオチド16を識別可能でなければならない。1つの反応室11に1個の核酸分子13を有する際、ヌクレオチド16は一つずつ検出ユニット18を通過して移動するので、検出ユニット18が溶液のヌクレオチド16のそれぞれの量を計量し得る事は必ずしも必要では無い。
【0018】
図2に示される他の実施形態において、検出ユニット107は、溶液に遊離して存在するヌクレオチド104の数を計量するために十分である程度に感度が高い。従って、核酸分子102からリリースされたヌクレオチド104を離間させる必要はない。図2にて示されるように、装置100は、固定化表面103に一端が付着する核酸分子102を含む反応室101を備える。遊離したヌクレオチド104は、分解試薬106(例えばエキソヌクレアーゼ)の作用によって、核酸分子102の遊離末端105から、順番に取り除かれる。
【0019】
図2に示すように、これらの実施形態において、遊離したヌクレオチド104は、核酸分子102から空間的に分離されない。励起光線110を発する励起源108と検出器109とを有する検出ユニット107は、核酸分子102および遊離したヌクレオチド104を含んでいる反応室101を分析する。検出器109が溶液中の各々のヌクレオチド104の量を計量することが出来るので、核酸102の配列は、溶液中のヌクレオチド104の放出の時間的配列によって測定される事が出来る。より大きな容積がスキャンされているので、より広い領域をカバーするためのより強い励起光線110を使用する必要があり得る。
【0020】
これらの実施形態において、各々の連続したヌクレオチド104が核酸分子102の遊離末端105からリリースされるにつれて溶液中の該種のヌクレオチド104の信号が増加する事によって、該ヌクレオチド104が識別される。ラマン検出器109は、溶液中の各々のヌクレオチド104(アデノシン一リン酸(AMP)、グアノシン一リン酸(GMP)、シトシン一リン酸(CMP)、そして、ウリジン一リン酸(UMP)またはチミジン一リン酸(TMP))の分子数を別々に計量する事が出来、そして、核酸分子102によって生じるベースライン・ラマン信号から、これらの信号を分離する事が出来る。
【0021】
当業者は、DNA13、102の解析が、デオキシリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオチド16、104(チミジンを含む)の放出に帰着し、その一方で、RNA13、102の解析が、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド16、104(ウリジンを含む)の放出に帰着する事を理解するであろう。通常、ヌクレオシド一リン酸16、104は、エキソヌクレアーゼ15、106活性によってリリースされる形式を採るが、本実施形態は、遊離したヌクレオチドまたはヌクレオシド16、104の如何なる特定の形式の検出にも限定されず、分解試薬15、106の活性によって核酸13、102からリリースされ得る任意のモノマー16、104を含んで良い。
【0022】
更なる実施形態において、図1および図2に示される方法と装置10、100の若干の組み合わせが使用され得る。図1の方法は、低感度の検出器21を使用することができるが、より複雑な分子移送の手順を必要とする。図2の方法は、分子移送は単純化されているが、より高感度の検出器109を必要とする。様々な折衷的なアプローチが使用されて良い。例えば、流路12を流下する微量流体の流れを、既に検出されたヌクレオチド16を励起光線20、110によって照射される領域から取り除く為に用いることができる一方、ラマン検出器21の計量の能力によって、リリースされた複数のヌクレオチド16間が時間的または空間的に所定の時間(距離)だけ離間していない場合においても検出を行う事が出来る。
【0023】
特定の実施形態において、検出器21、109(例えば分光計またはモノクロメータアレイ)からのデータは、所定のラマン・シグニチャを所定のヌクレオチド16、104と関連付けるデータベースを維持する情報処理システムへと送られて良い。情報処理システムは、検出器21、109によって検出されたシグニチャを記録し、これらのシグニチャをデータベース内の既知のヌクレオチド16、104のシグニチャに関連付けさせ、そして、核酸分子13、102の配列を示すヌクレオチド16、104の出現の記録を維持する。オーバーラップする時間的または空間的信号が複数のヌクレオチド16、104から検出される場合、情報処理システムはまた、バックグラウンド信号の減算、および「ベースコーリング」の決定のような標準的な手順を実行することができる。
【0024】
特定の実施形態において、核酸分子13、102は、界面14、103に付着され得る。界面14、103は、例えば機能性ガラス、シリコン、PDMS(ポリジメチル・シロキサン)、銀または他の金属で被覆された界面、石英、プラスチック、PTFE(ポリ四フッ化エチレン)、PVP(ポリビニルピロリドン)、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ゴム乳液粒子、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスビーズ、磁性ビーズ、または、例えばアミン、カルボキシル、チオール、ヒドロキシルまたはディールス‐アルダー反応物のようなの官能基を界面14、103に取り込む事が可能な当技術において公知の他の任意の材料である。
【0025】
幾つかの実施例において、核酸分子13、102および分解試薬15、106間のバインディングの相互作用が立体障害無しで発生するように、官能基が共有結合で架橋剤に付着しても良い。代表的な架橋基は、エチレングリコール・オリゴマおよびジアミンを含む。付着は共有結合であっても良いし、非共有結合であっても良い。核酸分子13、102を界面14、103に付着させる様々な方法が公知であり、本発明に使用され得る。
【0026】
(単語の定義)
本願明細書において用いられる「1」、「1つの」と言う単語は、「1つ以上」という事を意味する。
【0027】
「核酸」13、102は、任意の化学修飾が施された一本鎖、二本鎖、三本鎖のDNAまたはRNAのいずれかを包含するが、一本鎖の核酸13、102である事が好ましい。実質的に、核酸13、102の任意の修飾が予期される。本願明細書において使用されるように、一本鎖の核酸13、102は、接頭辞「ss」によって表され得、二本鎖の核酸は接頭辞「ds」によって表され得、三本鎖の核酸は「ts」によって表され得る。
【0028】
「核酸」13、102の長さは、10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000、それ以上、または、ノーカットの染色体DNA分子13、102までの、ほとんど任意の長さを取り得る。
【0029】
「ヌクレオシド」16、104は、デオキシリボース、ペントース糖のリボースまたは類似体または誘導体のようなペントース糖に共有結合される塩基(A、C、G、TまたはU)を有する分子である。
【0030】
「ヌクレオチド」16、104は、ペントース糖に共有結合で付着する少なくとも1つのリン酸基を更に備えるヌクレオシドを表す。幾つかの実施形態においては、ヌクレオチド16、104はリボヌクレオシド一リン酸16、104またはデオキシリボヌクレオシド一リン酸16、104であるが、他の実施形態においては、ヌクレオシド二リン酸または三リン酸16、104が生じ得る事が予期される。他の実施形態において、ヌクレオシド16、104は核酸分子13、102からリリースされ、後述のように検出される。分解試薬15、106によって核酸13、102からリリースされ得る限りにおいて、様々な代替または変更がヌクレオチド16、104の構成において為され得る事が予想される。例えば、特定の実施例において、リボースまたはデオキシリボース成分が、他のペントース糖またはペントース糖類似体で置換されても良い。他の実施形態において、リン酸基は様々な類似体によって置換されて良い。
【0031】
(核酸)
シークエンシングされる核酸分子13、102は、当業者にとって公知の任意の技法によって調整される。特定の実施形態において、核酸分子13、102は、自然に発生するDNAまたはRNA分子である。実質的に、染色体、ミトコンドリアおよびクロロプラストDNAおよびリボソーム、トランスファー、異種核およびメッセンジャーRNAを含む任意の自然に発生する核酸13、102が調製され、開示される方法によってシークエンスされるが、シークエンスの方法は上記に限定されない。
【0032】
様々な形状の細胞核酸13、102を調製・分離するための方法は公知である(例えば、ベルガーおよびキンメル(Berger and Kimmel)編、「分子クローニング技術のガイド(Guide to Molecular Cloning Techniques)」、(ニューヨーク、ニューヨーク州)、(Academic Press)、1987年、サムブルック、フリッチェおよびマニアティス(Sambrook, Fritsch and Maniatis)編、「分子クローニング:実験室マニュアル、第2版、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.)」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年等を参照)。通常、細胞、組織またはシークエンシングされる核酸13、102を含む他の原料物質は、例えば最初に液体窒素によって凍結され、続いて乳鉢と乳棒によって粉砕されることによって均質化される。特定の組織は、ワーリングブレンダ、Virtis社のホモジェナイザ、Dounce社のホモジェナイザまたは他のホモジェナイザを使用して均質化され得る。原料ホモジェネートは、デタージェント(例えばナトリウム・ドデシル硫酸塩(SDS)、トリトンX−100、CHAPS(3−[(3?コラミドプロピル)?ジメチルアミノ]?1?プロパン−スルホン酸塩)、オクチルグルコシド、または公知技術による他のデタージェントによって抽出されて良い。また(あるいは加えて)、例えば、グアニジニウムイソチオシアン酸塩、またはフェノールのような有機溶媒のようなカオトロピック剤によって抽出を行っても良い。幾つかの実施形態において、例えばプロテイナーゼKを用いたプロテアーゼ処理が、細胞のタンパク質を分解するのに用いることが出来る。粒子状の不純物が、遠心または超遠心分離(例えば約5000〜10000g・10〜30分、または約50000〜100000g・30〜60分)によって取り除かれる。低イオン強度の緩衝液に対する透析が、塩または他の可溶な不純物を取り除く為に用いられて良い。核酸13、102は、−20℃の環境下でエチルアルコールを添加する事によって、また、0.3Mナトリウム酢酸塩(pH6.5)および0.8倍量の2−プロパノールを添加する事によって沈殿し得る。沈殿した核酸13、102は、遠心分離によって、また、染色体DNA13、102に対しては、沈殿したDNA13、102をガラスピペットまたは他のプローブ上にスプーリングする事によって収集され得る。
【0033】
当業者は、上述した手順は単なる典型例であり、シークエンシングされる核酸13、102の特定の種類に従い、様々な他の手順が用いられ得る事を理解するであろう。例えば、ミトコンドリアDNA13、102は、ステップグラジエントを用いる塩化セシウム密度勾配遠心分離によって通常は調製されるが、その一方で、mRNAは、例えばプロメガ社(マディソン、ウィスコンシン州)またはクローンテック社(パロアルト、カリフォルニア州)のような商用供給元による分取カラムを使用して通常は調製される。この種の例は、本技術において公知である。
【0034】
調製される核酸13、102の型に従って、様々なヌクレアーゼ阻害剤が使用され得る、と言う事を当業者は理解するであろう。例えば、バルク溶液へのRNアーゼの混入は、ピロ炭酸ジエチル(DEPC)による処理によって除去し得る。市販のヌクレアーゼ阻害剤は、プロメガ社(マディソン、ウィスコンシン州)や、BRL社(ゲイサーズバーグ、メリーランド州)のような標準的な供給元から取得する事が出来る。精製された核酸13、102が、例えばTE(Tris−EDTA)(エチレンジアミン四酢酸)のような緩衝液に溶解され、使用に先立って−20℃または液体窒素中に格納される。
【0035】
一本鎖DNA(ssDNA)13、102がシークエンシングされる場合、ssDNA13、102は標準的な手法によって二本鎖DNA(dsDNA)より調製され得る。最も単純な場合、dsDNAは、アニーリング温度よりも高い温度に加熱され得、この温度において自然にssDNA13、102に分割される。代表的な条件としては、少なくとも5分間、92〜95℃での加温が挙げられ得る。dsDNAを切り離すための条件を決定するための式は、例えば分子のGC含量および長さに応じて、公知である。あるいは、公知技術である標準の増幅手法により、二本鎖DNAの1つの鎖のみに結合するプライマを使用することによって二本鎖DNAから一本鎖DNA13、102が調製されても良い。一本鎖DNA13、102を調製する他の方法は公知である。例えば、シークエンシングされる二本鎖DNAをM13のようなファージの複製型に挿入して、ファージが核酸13、102の一本鎖の複製を生産することが出来る。
【0036】
特定の実施形態は自然に発生する核酸13、102の調整に関する一方、エキソヌクレアーゼまたは他の分解試薬15のための基質として供され得る実質的に任意の型の核酸13、102のシークエンシングを行う事が可能である。例えば、様々な増幅手法(例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR(登録商標))増幅)によって調製される核酸13、102のシークエンシングを行う事が出来る(米国特許第4683195号、第4683202号および第4800159号を参照)。シークエンシングされる核酸13、102は、標準的なベクター(例えばプラスミド、コスミド、BAC(バクテリア人工染色体)またはYACs(酵母人工染色体))でクローニングされても良い(例えば、ベルガーおよびキンメル(Berger and Kimmel)、1987年;サムブルック(Sambrook)等、1989年、を参照)。例えば、挿入された核酸13、102は、適当な制限エンドヌクレアーゼによる切出しによってベクターDNAから単離し得、続いてアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色が行われる。サイズによって分別されて選択された核酸13、102は、ゲルから、例えば低融点アガロースの使用によって、またはゲル切片からの電気泳動溶出によって採集され得る。挿入された核酸13、102の単離の方法は公知である。
【0037】
(一つの核酸分子の単離)
特定の実施形態において、シークエンシングされる核酸分子13、102は、単一のssDNAまたはssRNAの分子である。単一のssDNAまたはssRNA分子13、102を選択・操作するための様々な方法(例えば流体力学に基づく絞り込み(hydrodynamic focusing)、マイクロマニピュレータ・カップリング(micro−manipulator coupling)、光学トラッピング、または、これらおよび同様の方法の組み合わせ)が使用されて良い(グッドウィン(Goodwin)等、Acc.Chem.Res.29:607−619、1996年;米国特許第4962037号、第5405747号、第5776674号、第6136543号、第6225068号を参照)。
【0038】
特定の実施形態において、マイクロ流体システム(microfluidics)またはナノ流体システム(nanofluidics)が、核酸13、102を分類・単離するために用いることが出来る。ミクロチャネル、ミクロキャピラリまたはミクロ孔へと核酸13、102の運動を操作するために、流体動力学が用いられて良い。一実施形態において、流体力学的な力は、単一の核酸分子を切り離すべく、核酸分子13、102を櫛状の構造を横切って移動させるために用いることが出来る。一旦核酸分子13、102が切り離されると、流体力学に基づく絞り込みが、分子13、102を反応室11、101の内部に配置するために用いることが出来る。熱または電位、圧力または真空が、核酸13、102の操作のための動力を提供するべく用られ得る。典型的な実施形態において、米国特許第5867266号および第6214246号において開示されているように、シークエンシングのための核酸13、102の操作は、マイクロ加工されたチャネルおよび統合したゲル材料を含むチャネル・ブロック・デザインの使用を含んで良い。
【0039】
他の実施形態において、核酸13、102を含むサンプルは、固定化表面14、103への付着の前に希釈され得る。典型的な実施形態において、固定化表面14、103は、磁性または非磁性ビーズまたは他の離散的な構造のユニットの形状をしていても良い。適切な希釈濃度において、各々のビーズ14、103は、0個または1個の核酸分子13、102をバインディングする統計確率を有する。1個の接続された核酸分子13、102を有するビーズ14、103は、例えば、蛍光染料およびフローサイトメーターによる分類、磁気による分類を使用して識別され得る。ビーズ14、103および核酸13、102の相対的な大きさおよび均一度に応じて、磁気フィルタおよび質量による選別が、単一の結合した核酸分子13、102を含むビーズ14、103を切り離すために用いることが可能であってもよい。他の実施形態において、単一のビーズまたは他の固定化表面14、103に付着する複数の核酸13、102がシークエンシングされて良い。
【0040】
他の実施形態において、シークエンシング用に被覆されたファイバの先端14、103(例えば米国特許第6225068号)が、単一の分子核酸13、102を生成するために用いることが出来る。他の実施形態において、固定化表面14、103は、単一分子のアビジンまたは他の架橋剤を含むように調整されても良い。この種の界面14、103は単一のビオチニル化されたプライマ16を付着させる事が出来、そして、これはシークエンシングされる単一の核酸13、102によってハイブリダイズされ得る。この実施形態は、アビジン−ビオチン・バインディング・システムに限定されず、公知の任意のバインディング・システムに適用され得る。
【0041】
他の実施形態において、シークエンシングにおける単分子核酸分子13、102の操作の為に、光学トラップが使用されて良い(例えば米国特許第5776674号)。典型的な光学トラッピング・システムは、Cell Robotics社(アルバカーキ、ニューメキシコ州)、S+L社(ハイデルベルク、ドイツ連邦共和国)およびP.A.L.M.Gmbh(ヴォルフラーツハウゼン、ドイツ連邦共和国)より市販されている。
【0042】
(固定化の方法)
様々な実施形態において、シークエンシングされる核酸分子13、102は、固体の表面14、103に付着され得る(つまり、固定化される)。核酸分子13、102の固定化は、核酸分子13、102と表面14、103との間の非共有結合的または共有結合的な付着を含む様々な方法によって達成され得る。ある具体例において、固定化は、表面14、103をストレプトアビジンまたはアビジンで被覆し、更にビオチニル化された核酸13、102を付着する事によって達成され得る(ホルムストロム(Holmstrom)等、Anal.Biochem、209:278−283,1993年)。固定化は、ケイ素、ガラスまたは他の表面14、103を、ポリLリシンまたはポリLリシン−フェニルアラニンで被覆し、更に、二機能性の架橋試薬を用いて、アミノまたはスルフヒドリルで修飾された核酸13、102を共有結合によって付着させることによって行われて良い(ランニング(Running)等、BioTechniques、8:276−277、1990年;ニュートン(Newton)等、Nucleic Acids Res.21:1155−62,1993年)。架橋用のアミノシランの使用によって表面14、103上にアミン残基が導入され得る。
【0043】
固定化は、化学的に修飾された表面14、103に5’リン酸化された核酸13、102を直接共有結合によって付着させる事によって起こり得る(ラスマッセン(Rasmussen)等、Ana.Biochem,198:138−142,1991年)。核酸13、102と表面14、103との間の共有結合は、水溶性シアナミドによる縮合反応によって形成される。この方法によって、核酸13、102の5’リン酸塩による優先的な5’付着が容易になる。
【0044】
通常、DNA13、102は、まずガラス表面14、103をシラン処理し、続いてカルボジイミドまたはグルタールアルデヒドによって活性化する事によってガラスに付着される。他の方法として、分子の3’末端または5’末端のいずれかに組み込まれるアミノリンカーによってリンクされるDNA13、102に、3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GOP)またはアミノプロピルトリメトキシシラン(APTS)のような試薬を使用することが出来る。DNA13、102は、紫外線を使用して、表層膜14、103に直接バインドされ得る。核酸13、102の固定化の技法の他の例が、米国特許第5610287号、第5776674号および第6225068号に開示されているが、固定化の技法の例はこれらに限定されない。
【0045】
核酸13、102の固定化のために使用される表面14、103の種類は限定されるものではない。様々な実施形態において、固定化表面14、103は、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、平坦面、尖った表面、または、核酸13、102のシークエンシング反応が行われ得るような十分な耐性が有って不活性である実質的に任意の材料を有する任意の構造の固体の表面14、103であって良い。使用され得る表面14、103として、ガラス、シリカ、ケイ酸エステル、PDMS、銀または他の金属で被覆された表面、ニトロセルロース、ナイロン、活性石英、活性ガラス、重合ビニリデン二フッ化物(PVDF)、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレートまたはポリジメチル・シロキサンのような他のポリマー、および、共有結合によるリンクを核酸分子13、102と形成する事が可能なナイトレン、カルベン、ケチルラジカルのような感光性の種を含む感光性樹脂等であって良いが、表面14、103はこれらのものに限定されない(例えば米国特許第5405766号および第5986076号を参照)。
【0046】
様々な実施形態において、二機能性の架橋試薬が、例えば核酸分子13、102を表面14、103に付着させる為に有用であって良い。二機能性の架橋試薬は、それらの官能基(例えばアミノ、グアニジノ、インドールまたはカルボキシル基)の選択性によって分類されて良い。これらのうちで、アミノ基を遊離させる試薬が、市場での入手容易性、合成の平易さおよびこれらが適用され得る反応条件の緩やかさといった理由によって普及している。分子架橋の典型的な方法が、米国特許第5603872号および第5401511号において開示されている。架橋試薬は、グルタールアルデヒド(GAD)、二機能性のオキシラン(OXR)、エチレングリコール・ジグリシジルエーテル(EGDE)およびカルボジイミド(例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロポキシル)カルボジイミド(EDC))を含む。
【0047】
(分解試薬)
シークエンシング反応は、分解試薬15、106を、核酸分子13、102の遊離末端17、105にバインディングし、1度に1個のヌクレオチド16、104を取り除く事を含む。特定の実施形態において、この反応は酵素(例えばエキソヌクレアーゼ15、106)によって触媒作用を及ぼされ得る。本実施形態は、使用され得るエキソヌクレアーゼ15、106の型によって制限されない。使用され得るエキソヌクレアーゼ15、106として、大腸菌エキソヌクレアーゼI、III、VまたはVII、Bal31エキソヌクレアーゼ、mung beanエキソヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIホロエンザイムまたはクレノー断片、RecJ、エキソヌクレアーゼT、T4またはT7DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼT7Gene6、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、Thermococcus litoralisDNAポリメラーゼ、Pyrococcus sp.GB−D DNAポリメラーゼ、lambdaエキソヌクレアーゼ、S.アウレウス球菌ヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼI、リボヌクレアーゼA、T1球菌ヌクレアーゼ、または公知の他のエキソヌクレアーゼが含まれる。エキソヌクレアーゼ15、106は、例えばニューイングランドバイオラボ社(ベヴァリー、マサチューセッツ州)、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社(ピスカッタウェイ、ニュージャージー州)、プロメガ社(マディソン、ウィスコンシン州)、シグマ・ケミカルズ社(セントルイス、ミズーリ州)またはベーリンガー・マンハイム社(インディアナポリス、インディアナ州)のような供給源から市販されている。
【0048】
当業者は、例えば、エキソヌクレアーゼ15、106活性を有する酵素が様々な性状を有すると理解する。例えば、これらはヌクレオチド16、14を5’末端、3’末端から、または、核酸分子13、102のいずれかの末端から取り除く事が出来る。これらは、RNA、DNA、またはRNAおよびDNA13、102の双方に対して特異性を示す。これらの活性は、一本鎖または二本鎖の核酸13、102のいずれを使用するかに依存し得る。これらは、反応培地の様々な特性(例えば塩、温度、pHまたは二価カチオン)に応じて異なった影響を受け得る。様々なエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ15、106のこれらの、そしてまた他の特性は公知である。
【0049】
当業者は、エキソヌクレアーゼ15、106活性の速度がヌクレオチド16、104の解析の最適速度と一致するように、検出ユニット18、107によって操作され得る事を理解するであろう。反応室11、101の温度、圧力、pH、塩濃度または二価陽イオン濃度を調整する事を含む、エキソヌクレアーゼ15、106活性速度を調整する様々な方法が公知である。エキソヌクレアーゼ15、106活性の最適化の方法は公知である。
【0050】
(標識)
検出ユニット18、107によるヌクレオチド16、104の計測を容易にするために、特定の実施形態が、標識をヌクレオチド16、104に組み込むことを含んで良い。ラマン標識、フルオロホア、クロモホア、ラジオアイソトープ、酵素による標識、抗体、化学発光、電子発光、親和標識のような、多くの異なる標識が使用され得る。当業者は、これらの標識、本願明細書において言及されない他の標識成分が、様々な実施形態において使用され得る事を認識するであろう。
【0051】
ラマン分光法を含んでいる実施形態に用いられる標識は上述された。他の実施形態において、使用される標識成分は、例えば、Alexa350、Alexa430、AMCA(7−アミノ−4−メチルクマリン−3−酢酸)、BODIPY(5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸)630/650、BODIPY650/665、BODIPY−FL(フルオレセイン)、BODIPY−R6G(6−カルボキシローダミン)、BODIPY−TMR(テトラメチルローダミン)、BODIPY−TRX(Texas Red−X)、Cascade Blue、Cy2(シアニン)、Cy3、Cy5,6−FAM(5−カルボキシフルオレセイン)、フルオレセイン、6−JOE(2’7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレイセン)、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、Rhodamine Green、Rhodamine Red、ROX(6−カルボキシ−X−ローダミン)、TAMRA(N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン)、TetramethylrhodamineおよびTexas Redのようなフルオロホアであって良い。蛍光性または発光性の標識は、通常の民間の供給源(例えばモレキュラープローブス社(ユージン、オレゴン州)より取得可能である。
【0052】
(反応室)
反応室11、101は、水環境において、固定化表面14、103、核酸分子13、102、分解試薬15、106、およびヌクレオチド16、104を保持するように設計されている。幾つかの実施形態において、反応室11、101は、例えばペルチェ素子の組み込み、または公知技術の他の方法によって温度が制御されるように設計される。小容量液体の温度制御の方法は公知である(米国特許第5038853号、第5919622号、第6054263号および第6180372号参照)。
【0053】
特定の実施形態において、コンピュータチップの製造またはミクロキャピラリチップの製造の分野において公知であるように、反応室11、101および、流路12、または廃棄ポートに対する、核酸13、102の供給ポートに対する、または分解試薬15、106の供給ポートに対する接続を提供する為の任意の反応室11、101に関する流体チャネルが、バッチ製作プロセスによって製造される。幾つかの実施形態において、装置10の反応室11、101および他の構成要素(例えば流路12)は、単一の統合したチップとして製造されて良い。この種のチップは、従来技術によって、例えばフォトリソグラフィーおよびエッチングによって製造され得る。しかし、製造方法はこれに限定されず、公知技術の他の方法(例えばレーザアブレーション、射出成形、鋳造またはインプリンティングの技法)が使用されても良い。ナノ電気機械システムの製造方法が、特定の実施形態に対して使用されて良い(例えば、クレーグヘッド(Craighead)、Science、290:1532−36、2000年を参照)。マイクロ加工されたチップは、例えば、カリパー・テクノロジーズ社(マウンテンビュー、カリフォルニア州)およびアクララ・バイオサイエンシーズ社(マウンテンビュー、カリフォルニア州)のような供給元から市販されている。
【0054】
プラズマ増速化学蒸着(PECVD)システム(PEII−A、テクニクス・ウエスト社、サンノゼ、カリフォルニア州)によるアモルファスシリコン犠牲層の堆積に先立って、Borofloatガラスウェーハー(プレシジョングラス&オプティクス(サンタアナ、カリフォルニア州))が、高濃度HF(フッ化水素酸)中で短期間プレエッチングされ、洗浄されても良いが、上記の方法に限定されない。ウェーハは、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)を注入されて良く、フォトレジストによってスピンコートされ(シプリー1818、マールボロ、マサチューセッツ州)て、ソフトベークされて良い。コンタクトマスク・アライナ(Quintel社、サンノゼ、カリフォルニア州)が、一つ以上のマスクデザインによってフォトレジスト層を露光するために用いられ得、そして、露光したフォトレジストはMicropositの現像液濃縮剤(シプリー)および水の混合液を使用して除去される。現像されたウェーハはハードベークされて良く、そして、露光したアモルファスシリコンが、PECVD炉中でCF4(四フッ化炭素)プラズマを使用して除去されて良い。ウェーハは、反応室11、101、流路12、および任意のチャネルを生成する為に、高濃度HFによって化学的にエッチングされて良い。残留したフォトレジストがストリッピングされ、アモルファスシリコンが除去される。
【0055】
ダイヤモンドドリル・ビット(クリスタライト社、ウェスタービル、オハイオ州)によって、エッチングされたウェーハにアクセスホールが穿設される。完成したチップは、プログラム可能な真空炉(CenturionVPM,J.M.Ney、ユカイパ、カリフォルニア州)中において、エッチング・穿設されたプレートと、同サイズの平坦なウェーハとを熱的にボンディングすることによって製作されて良い。特定の実施形態において、チップは2つのエッチングされたプレートを相互にボンディングすることによって製作されても良い。反応室11、101および流路12を組み込むのチップの製作のための他の典型的な方法が、米国特許第5867266および第6214246号において開示されている。
【0056】
検出ユニット18、107によってヌクレオチド16、104の検出を容易にするために、反応室11、101および(または)流路12を構成する材料は、検出ユニット18、107において使用される励起および発光振動数の電磁波の放射に対して透過性を有する材料が選定され得る。ガラス、ケイ素および一般にラマン分光法、蛍光分光学法、ルミネセンス分光法または他の形式の分光法に使用される周波数範囲においてほぼ透過性を有するその他の材料が使用されて良い。幾つかの実施形態において、検出ユニット18、107と相対する反応室11、101および(または)流路12の表面は、銀、金、白金、銅、アルミニウム、または検出ユニット18、107に対して比較的不透明である他の材料によって被覆されていても良い。この場合、不透明体材料は、例えば表面強化ラマン分光法のような、ラマン信号またはその他の信号を増強するために利用可能であり、その一方で、検出ユニット18、107の機能は妨げられない。また、反応室11、101および(または)流路12は、銀、金、白金、銅またはアルミニウムを含むメッシュを含んで良い。流路12を備える実施形態において、通常、ヌクレオチド16は、流路12に配置されている最中に検出される事を、当業者は理解するであろう。流路12の存在しない実施形態において、ヌクレオチド104は反応室101において検出される。
【0057】
様々な実施形態において、反応室11、101内部の容積は、約1ピコリットル、約2ピコリットル、約5ピコリットル、約10ピコリットル、約20ピコリットル、約50ピコリットル、約100ピコリットル、約250ピコリットル、約500ピコリットル、約1ナノリットル、約2ナノリットル、5ナノリットル、約10ナノリットル、約20ナノリットル、約50ナノリットル、約100ナノリットル、約250ナノリットル、約500ナノリットル、約1マイクロリットル、約2マイクロリットル、約5マイクロリットル、約10マイクロリットル、約20マイクロリットル、約50マイクロリットル、約100マイクロリットル、約250マイクロリットル、約500マイクロリットルまたは約1ミリリットルであって良い。
【0058】
(流路)
特定の実施形態において、遊離したヌクレオチド16は、検出ユニット18を通り越して流路12を流下する。遊離したヌクレオチド16の移送の手法として、微量流体移送が挙げられるが、これに限定されない。流路12は、ミクロキャピラリ(例えば、アクレラ・バイオサイアンシズ社(マウンテンビュー、カリフォルニア州)から入手可能)または液体用の集積回路(例えば、Caliper Technologies社(マウンテンビュー、カリフォルニア州))を含んで良い。この種の微量流体移送のプラットフォームは、ナノリットルのオーダーの容積のサンプルしか必要としない。
【0059】
特定の実施形態において、検出される遊離したヌクレオチド16は、溶剤のバルク流れによって流路12の下流に移動する。他の実施形態において、流路12の下流に遊離したヌクレオチド16を輸送し、検出ユニット18を通過させるために、ミクロキャピラリ電気泳動を用いても良い。ミクロキャピラリ電気泳動は、細いキャピラリまたはチャネルを使用する事を一般に含む。キャピラリまたはチャネルは、特定の分別培地で充填されていてもよいし、充填されていなくても良い。装置の反応室11側が負に、検出ユニット18側が正となるような電界の印加に応答して、適切に帯電した分子種(例えば負に帯電したヌクレオチド16)の電気泳動が発生する。電気泳動は通常、ミクロキャピラリに同時に加えられる要素の混合物の大きさの分別のために使用されるが、それはまた、流路12に順番に添加される同じ位のサイズのヌクレオチド16を輸送するために用いる事も可能である。プリンヌクレオチド(A、G)16は、ピリミジンヌクレオチド(C、T、U)16よりも大きく、移送される速度がより遅いので、流路12およびそれに対応する検知器ユニット18を通過する時間長によって、核酸13からリリースされるヌクレオチド16の順序が狂ってしまう事を防止しなければならない。あるいは、流路12を流下するプリンおよびピリミジンヌクレオチド16の移動速度がほぼ同じとなるか、または一致するように、ミクロキャピラリを満たす分別培地が選定されて良い。例えば、ミクロキャピラリ電気泳動の方法は、ウーリーおよびマチエス(Woolley and Mathies)、会報、全米科学アカデミー(Natl.Acad.Sci.USA)91:11348−352、1994年)によって開示されている。
【0060】
ミクロキャピラリ電気泳動的装置を含む微量流体移送装置用のマイクロ素子の製造が、例えば、ヤコブセン(Jacobsen)等(Anal.Biochem、209:278−283、1994年)、エッフェンハウザー(Effenhauser)等(Anal.Chem.66:2949−2953、1994年)、ハリソン(Harrison)等(Science、261:895−897、1993年)、および米国特許第5904824号において議論された。一般的に、これらの方法は、シリカ、ケイ素、またはその他結晶基板またはチップ上のミクロン・スケールのチャネルのフォトリソグラフィー・エッチングを含み、実用に供され得る。幾つかの実施形態において、ミクロキャピラリは、射出成形または他の公知技術を用いて、反応室11、101の製作に際して記載された同様の重合物質より製造されて良い。
【0061】
(検出ユニット)
ラマン分光法を含む実施形態
【0062】
幾つかの実施形態において、検出ユニット18、107は、ラマン分光法によってヌクレオチド16、104を検出・計量するように設計されている。ラマン分光法によるヌクレオチド16、104の検出のための様々な方法が、公知である(米国特許第5306403号、第6002471号、第6174677号を参照)。表面増強ラマン分光法(SERS)または表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)の様々な例が開示されている。SERSおよびSERRSにおいて、ラマン検出の感度は、きめの粗い金属表面(例えば銀、金、白金、銅またはアルミニウム表面)に吸収される分子に比べて、106倍以上に増強される。
【0063】
ラマン検出ユニット18、107の例が、米国特許第6002471号において開示されるが、これに限定されない。本実施形態において、励起光線20、110は、532ナノメートルの波長のNd:YAGレーザ19、108か、365ナノメートルの波長のTi:サファイア・19、108によって生成される。レーザ光線20、110は、パルス光であっても良いし、連続光であっても良い。励起光線20、110は、共焦点光学系および顕微鏡の対物レンズを通過して、流路12または反応室101に焦点が合わせられる。ヌクレオチド16、104からのラマン発光は、顕微鏡の対物レンズおよび共焦点光学系によって集められ、スペクトル解離のためにモノクロメータに接続される。共焦点光学系は、ダイクロイックフィルタ、バリアーフイルタ、共焦点ピンホール、レンズおよびバックグラウンド信号を低減させるためのミラーの組み合わせを備える。標準的なフルフィールドの光学系が、共焦点光学系と同様に使用され得る。ラマン発光信号は、ラマン検出器21、109によって検出される。検出器21、109は、信号の計数およびデジタル化のために、コンピュータに接続されたアバランシェフォトダイオードを備える。表面増強ラマンおよび表面増強ラマン共鳴によって増強された信号を供給する為に、特定の実施形態において、銀、金、白金、銅またはアルミニウムを備えるメッシュが、流路12または反応室101に含まれていて良い。
【0064】
検出ユニット18、107の他の実施形態が、例えば米国特許第5306403号において開示され、この実施形態は、シングルフォトン・カウンティングモードで作動するガリウム砒素光電子増倍管(RCA社C31034またはBurle Industry社C3103402)を有する二重格子分光光度計21、109を備えるSpex1403を含む。励起源19、108は、SpectraPhysics社の166アルゴン−イオンレーザ19、108の514.5ナノメートルの光線、および、コヒーレント社のInnova70クリプトン−イオンレーザ19、108の647.1ナノメートルの光線である。
【0065】
励起源19、108のその他の例として、Laser Science社の窒素レーザ19、108の337ナノメートルの光線、およびLiconox社製のヘリウム−カドミウム・レーザ19、108の325ナノメートルの光線が挙げられる(米国特許第6174677号)。励起光線20、110は、バンドパスフィルタ(Corion社)によって、スペクトル的に不要な成分を取り除かれ、6倍の対物レンズ(ニューポート社L6X)によって、流路12または反応室101に焦点が合わせられる。対物レンズは、励起光線20、110と放出されたラマン信号が直角になるようにホログラフィック・ビームスプリッタ(Kaiser Optical Systems社HB647−26N18)を使用する事によって、ヌクレオチド16、104を励起する為およびラマン信号を集める為の双方に用いられ得る。ホログラフィック・ノッチフィルタ(Kaiser Optical Systems社)が、レイリー散乱輻射線を低減させる為に用いられて良い。ラマン検出器21、109の他の例として、赤色が強められたインテンシファイアー付き電荷結合素子(RE−ICCD)検出システム(Princeton Instruments社)を備えるISA社のHR−320スペクトルグラフが挙げられる。例えば、電荷注入素子、フォトダイオードアレイまたはフォトトランジスタアレイのような、他の型の検出器21、109が使用されて良い。
【0066】
ヌクレオチド16、104を検出する為に、通常のラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、コヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、レーザーラマンマイクロプローブ分光法(MOLE)またはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡または共焦点ラマン顕微鏡、3次元または走査ラマン、ラマン・サチュレーション分光法、時間分解された共鳴ラマン、ラマン・デカップリング分光法(Raman decoupling spectroscopy)または紫外ラマン顕微鏡のような、任意の好適な形態または構成の公知のラマン分光法または関連する技術が用いられて良いが、上記の当該技術に限定される物ではない。
【0067】
FRETを含む実施形態
他の実施形態において、ヌクレオチド16、104は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用いる事によって識別・計量されても良い。FRETは、ドナー分子とアクセプタ分子との間の接近を検出するために用いる分光学的現象である。ドナーからの蛍光性発光がアクセプタの励起スペクトルと重なるように、ドナーおよびアクセプタのペアが選択される。2つの分子間の距離が100オングストローム未満となった際、ドナーの励起状態エネルギーが無放射でアクセプタに転送され、ドナーの蛍光が停止する。アクセプタ分子がフルオロホアである場合、その蛍光が増強される。オリゴヌクレオチドに対するFRETの使用のための構成要素および方法は公知である(例えば米国特許第5866366号)。
【0068】
FRETのための標識として多用される分子は、フルオレセイン、5−カルボキシフルオレセイン(FAM)、2’7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオレセイン(JOE)、ローダミン、6−カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、4−(4’−ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)および5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS)を含む。使用可能な他のFRETドナーまたはアクセプタ分子が、公知である(米国特許第5866336号の表1を参照)。当業者は、FRETのための標識分子のペアの選定に精通しているであろう(米国特許第5866336号)。
【0069】
FRETを含む実施形態において、ドナーおよびアクセプタ分子は、共有結合または非共有結合でシークエンシング装置10、100の様々な成分に付着してよい。特定の実施形態において、ドナーまたはアクセプタ分子は、ヌクレオチド16、104に、エキソヌクレアーゼ15、106に、または流路12に付着されて良い。
【0070】
特定の実施形態において、ドナー分子はエキソヌクレアーゼ15、106または流路12の表面に付着し、アクセプタ分子がヌクレオチド16、104に付着して良い。この場合、ヌクレオチド16、104の各々の型は、識別可能な発光スペクトルを有するアクセプタ分子に接続されなければならない。その一方で、ドナー分子は、4種類のアクセプタ分子の全ての励起スペクトルと重なる広い発光スペクトルを有する様に選定されなければならない。複数のドナー分子が、エキソヌクレアーゼ15、106または流路12に存在しても良い。但し、他の実施形態においては、単一のドナー分子のみが存在しても良い。
【0071】
励起によって、複数のドナー分子は自身のエネルギーをヌクレオチド16、104に付着しているアクセプタ標識分子へ転送する。そして、アクセプタ分子から増強された蛍光信号が蛍光される。信号の増強の強度は距離が離れるにつれて急速に減少するので、ドナー分子に非常に近接したヌクレオチド16、104に最も大きな信号増強が発生する。触媒部位上にまたはその近傍においてエキソヌクレアーゼ15、106に付着するドナー分子の場合、最も強い発光信号を有するヌクレオチド16、104は、エキソヌクレアーゼ15、106の触媒部位に位置する。ドナー分子は、触媒部位の近傍で、かつ分解試薬15、106のエキソヌクレアーゼ活性を妨げない位置に接続されなければならない。ドナー分子が励起光線20の焦点が合わせられる位置である流路12の表面に接続される実施形態において、励起光線20の焦点中のヌクレオチド16のみが、検出可能な蛍光性信号を与えなければならない。励起光線20、110の波長は、ドナー分子を最大限に励起する一方で、アクセプタ分子は僅かにしか励起されないように選定され得る。各々のヌクレオチド16、104が核酸分子13、102から取り除かれるにつれて、対応するドナー標識からの信号が検出される。
【0072】
特定の実施形態において、シークエンシングされる鋳型核酸13、102は、例えば光学トラップを用いて、公知の方法によって蛍光顕微鏡の視界の範囲内に保持する事が出来る(例えば米国特許第6136543号)。使用され得る蛍光顕微鏡の例として、100倍の倍率を有する油浸レンズ(Plan.multidot.Apochromat.times.100、1.40NA(オリンパス社))を用いる逆位相差・落射式蛍光顕微鏡(IMT2−RFC、オリンパス社)が挙げられるが、これに限定される物ではない。そして、前述されたように、励起光線20、110がレーザ19、108によって発されることができる。蛍光発光は、適当なフィルタを用いて対物レンズで集められ得、任意の高感度蛍光検出器21、109(例えばCCD装置、フォトダイオード、光電子増倍管またはその均等物)を使用して検出する事が出来る。
【0073】
情報処理システムおよびデータ分析
【0074】
特定の実施形態において、核酸シークエンシング装置10、100は、情報処理システムを備えていて良い。本実施形態に用いられる情報処理システムの形式は特に限定される物ではない。典型的な情報処理システムは、情報を伝達するためのバスおよび情報を処理するためのプロセッサを備えるコンピュータを組み込むことが出来る。一実施形態において、プロセッサは、インテル社(サンタクララ、カリフォルニア州)から入手可能なプロセッサであるペンティアム(登録商標)IIシリーズ、ペンティアム(登録商標)IIIシリーズおよびペンティアム(登録商標)4シリーズから選択されるが、これらに限定される物ではない。他の実施例では、プロセッサは、インテル社(サンタクララ、カリフォルニア州)のセレロン(登録商標)、イタニウム(登録商標)またはペンティアム・ジオン(登録商標)プロセッサであってもよい。様々な他の実施例において、プロセッサは、インテル(登録商標)アーキテクチャ(例えばインテル(登録商標)IA−32またはインテル(登録商標)IA−64アーキテクチャ)に基づいてもよい。あるいは、他のプロセッサが使われても良い。
【0075】
コンピュータは、ランダムアクセスメモリ(RAM)または他の動的記憶装置、リードオンリーメモリ(ROM)または他の静的記憶装置、および磁気ディスクまたは光ディスクまたはそれに対応するようなデータ記憶装置を更に備えて良い。情報処理システムは、表示装置(例えばCRTまたは液晶ディスプレイ)、文字入力装置(例えばキーボード)、カーソル制御装置(例えばマウス、トラックボールまたはカーソル方向キー)および通信装置(例えば、モデム、ネットワークインターフェイスカードまたはイーサネット、トークンリングまたは他の形式のネットワーク接続インタフェース機器)の様な、公知技術による他の周辺機器を更に備えて良い。
【0076】
特定の実施形態において、検出ユニット18、107は情報処理システムに操作可能なように接続されていても良い。検出ユニット18、107からのデータは、プロセッサおよびメインメモリに格納されるデータによって処理されて良い。標準のヌクレオチド16、104の発光プロファイルについてのデータが、メインメモリまたはROMに格納されて良い。プロセッサは、核酸分子13、102からリリースされるヌクレオチド16、104の型を識別するために、反応室101または流路12のヌクレオチド16、104からの複数の発光スペクトルを比較することが出来る。また、メインメモリは、核酸分子13、102からリリースされたヌクレオチド16、104の配列を格納する事が出来る。プロセッサは、核酸13、102の配列を決定するために、検出ユニット18、107からのデータを分析することが出来る。別の構成を有する情報処理システムが、特定の実施において使用され得る事が認識されるであろう。従って、システムの構成は、異なる実施形態においては変化していても良い。
【0077】
本願明細書において記載されているプロセスは、プログラムされたプロセッサの制御下で実行され得る一方で、別の実施形態においては、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ(FPGAs)、TTLロジック、または特定用途向け集積回路(ASIC)等の任意のプログラマブルまたはハードコーデッド・ロジックによって、その全部または一部が実行されて良い事に注目されたい。加えて、開示された方法は、プログラムされた汎用コンピュータコンポーネントおよび/またはカスタム・ハードウェアコンポーネントの任意の組み合わせによって実行されて良い。
【0078】
データ収集操作の後、データは通常データ分析操作へと送られる。分析操作を容易にするために、検出ユニット18、109によって得られるデータは、通常は上述されたようにデジタルコンピュータを使用して分析される。一般的にコンピュータは、検出ユニット18、109からデータの受取りおよび格納のため、そして同様に、データの解析および報告のために、適切にプログラムされる。
【0079】
特定の実施形態において、専用設計されたソフトウェアパッケージが、検出ユニット18、109から得られるデータを分析するために用いることが出来る。他の実施形態において、情報処理システムおよび市販されているソフトウェアパッケージを使用する事によってデータ分析が実行されても良い。DNAの塩基配列解析のための利用可能なソフトウェアとして、PRISM(登録商標)DNAシークエンシング分析ソフトウェア(アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州)、Sequencher(登録商標)パッケージ(Gene Codes社、アナーバー、ミシガン州)、および、National Biotechnology Information Facilityのウェブサイトwww.nbif.org/links/1.4.1.phpを通して入手可能な様々なソフトウェアパッケージが含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1】シークエンシングされる核酸分子からリリースされたヌクレオチドが空間的に切り離されるような、DNA塩基配列決定のための装置および方法の例を示す(縮尺は均等では無い)。
【図2】リリースされたヌクレオチドが核酸分子から空間的に切り離されず、検出器が溶液に存在するヌクレオチドを計量するような、DNA塩基配列決定のための装置および方法の例を示す(縮尺は均等では無い)。
Claims (28)
- a)単一の核酸分子を接続する固定化表面を含む反応室と
b)前記反応室に接続される流路と、
c)励起源およびラマン分光検出器を備える検出ユニットと
を備える、装置。 - 前記励起源が、レーザである、請求項1に記載の装置。
- 前記ラマン検出器が、分光計またはモノクロメータである、請求項1に記載の装置。
- (i)情報処理システムと
(ii)データベースと
を更に備える、請求項1に記載の装置。 - 前記固定化表面が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、円すい面、平坦面または曲面である、請求項1に記載の装置。
- 前記流路が、チップ内のミクロキャピラリまたは1つ以上のミクロチャネルを備える、請求項1に記載の装置。
- 前記流路の一部が、銀、金、白金、銅またはアルミニウムで覆われている、請求項1に記載の装置。
- 前記流路が、銀、金、白金、銅またはアルミニウムのメッシュを備える、請求項1に記載の装置。
- 分解試薬を更に備える、請求項1に記載の装置。
- a)単一の核酸分子を接続する固定化表面を含む反応室と、
b)励起源およびラマン分光検出器を備える検出ユニットと
を備える、装置。 - (i)情報処理システムと、
(ii)データベースと
を更に備える、請求項10に記載の装置。 - 前記励起源が、レーザである、請求項10に記載の装置。
- 前記ラマン検出器が、分光計またはモノクロメータである、請求項10に記載の装置。
- 前記固定化表面が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、円すい面、平坦面または曲面である、請求項10に記載の装置。
- 前記反応室中に、銀、金、白金、銅またはアルミニウムのメッシュを更に備える、請求項10に記載の装置。
- 分解試薬を更に備える、請求項10に記載の装置。
- 核酸をシークエンシングする方法であって、
a)反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
b)前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
c)前記ヌクレオチドを前記核酸分子から切り離すステップと、
d)ラマン分光法によって前記ヌクレオチドを検出するステップと
を備える、方法。 - 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ活性によって前記核酸分子の前記遊離末端から取り除かれる、請求項17に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、標識分子がヌクレオチドのそれぞれに接続される、請求項17に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、誘導ラマン散乱、逆ラマン、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、またはコヒーレント反ストークスラマン散乱によって検出される、請求項17に記載の方法。
- 核酸をシークエンシングする方法であって、
a)反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
b)前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
c)ラマン分光法によって前記反応室の前記ヌクレオチドを計量するステップと
を備える、方法。 - 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼ活性によって前記核酸分子の前記遊離末端から取り除かれる、請求項21に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、標識分子がヌクレオチドのそれぞれに接続される、請求項21に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、誘導ラマン散乱、逆ラマン、誘導ゲイン・ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、またはコヒーレント反ストークスラマン散乱によって検出される、請求項21に記載の方法。
- 核酸をシークエンシングする方法であって、
a)反応室内の固定化表面にその一端が付着する単一の核酸分子を調製するステップと、
b)前記核酸分子の遊離末端から順番にヌクレオチドを取り除くステップと、
c)蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)分光法によって前記ヌクレオチドを検出するステップと
を備える、方法。 - 前記ヌクレオチドが前記核酸分子から取り除かれた後、前記ヌクレオチドがアクセプタ分子に接続される、請求項25に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、エキソヌクレアーゼによって取り除かれる、請求項26に記載の方法。
- 1つ以上のドナー分子が前記エキソヌクレアーゼに接続される、請求項27に記載の方法。
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