JP2005500803A - 破骨細胞関連レセプター - Google Patents

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Abstract

本発明は、骨組織の成長、発達、修復、分解、および恒常性に関与する細胞（例えば、破骨細胞）の活性を調節する、方法および組成物に関する。従って、この組成物は、このようなプロセスを調節するため、および骨成長関連障害（例えば、骨粗鬆症および大理石骨病）を処置するために、使用され得る。特に、本発明は、破骨細胞関連レセプター（すなわち、ＯＳＣＡＲ）と呼ばれる新規なポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、破骨細胞により特異的に発現され、かつ破骨細胞活性を調節する。ＯＳＣＡＲ核酸（ベクターを含む）、融合ポリペプチド、およびＯＳＣＡＲ特異的抗体もまた提供され、同様に、このような核酸、ポリペプチド、および抗体を使用する、診断アッセイおよびスクリーニングアッセイもまた提供される。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、「破骨細胞関連レセプター」遺伝子または「ＯＳＣＡＲ」として本明細書中で称される新規遺伝子、およびその遺伝子産物に関する。ＯＳＣＡＲ遺伝子は、破骨細胞によって特異的に発現される。従って、本発明はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物を特異的に発現する細胞を同定することによって破骨細胞を同定および単離する方法に関する。
【０００２】
ＯＳＣＡＲ遺伝子およびＯＳＣＡＲ遺伝子産物はまた、破骨細胞の成熟の制御または調節に関与する。従って、本発明はさらに、破骨細胞の成熟および／もしくは活性を調節または抑制するための、方法および組成物に関する。このような方法は、例えば、骨粗鬆症および大理石骨病のような破骨細胞関連疾患を処置するのに有用である。従って、本発明はまた、このような疾患を処置するための方法および組成物に関する。
【０００３】
本発明はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合し、そして／もしくはそれらの活性を調節し、ゆえに破骨細胞の成熟および／もしくは活性を調節するために使用され得る化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。このようなスクリーニング方法によって同定され得、ゆえに本発明の分野内でもある化合物としては、ＯＳＣＡＲリガンドおよび膜貫通シグナルアダプターが挙げられる。
【０００４】
（発明の背景）
骨の発達およびホメオスタシスは、主として２つの異なる細胞型（骨芽細胞および破骨細胞）によって制御される。骨のマトリックスは、骨芽細胞によって分泌され、この細胞は、既存する骨のマトリックスの表面に存在し、そして新しい骨の層をその上に沈着させる。成熟破骨細胞は、石灰化した骨のマトリックスを再吸収する、単球／マクロファージ起源の多核細胞である。通常、これら２つの細胞型の活性は、しっかりと調整され、生物の骨の構造および完全度を維持している。しかし、これら２つの細胞型の活性を調節する機構は、ほとんど理解されていないままであり、そして広範囲にわたって未知である。
【０００５】
多数の疾患および障害が、異常な骨の成長または骨の質量における異常な増大もしくは減少と関連する。例えば、大理石骨病は、骨のマトリックスの肥厚化であり、破骨細胞が骨を吸収できなくさせる破骨細胞成熟における欠損と関連する（例えば、Ｋｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９、３９７：３１５−３２３；Ｓｏｒｉａｎｏら、Ｃｅｌｌ １９９１、６４：６９３−７０２；Ｉｏｔｓｏｖａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３：１２８５−１２８９を参照のこと）。対照的に、骨粗鬆症は、破骨細胞活性の増大によって特徴付けられる疾患であり、非常に多孔性の容易に破砕し、そして治癒が遅い骨を生じる。異常な骨の成長および再吸収を含むかまたはこれらに関連する多くの他の疾患および障害もまた公知であり、いくつか名前を挙げると、パジェット病、骨形成不全症、線維性形成異常症、低ホスファターゼ血症、原発性上皮小体機能亢進症、関節炎および歯周病が挙げられる。さらに、骨溶解が、骨に内在する多くの悪性腫瘍または骨から離れた悪性腫瘍（例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、および腎臓癌における骨格転移、悪性腫瘍の間の体液性カルシウム過剰血症、ならびに多発性骨髄腫）によって誘導され得る。
【０００６】
このような疾患および障害は、米国および他の国々で主要な公衆衛生上の関心事を表す。例えば、１０００万人のアメリカ人（このうち、８０％が女性である）が既に骨粗鬆症に罹患し、一方、別の１０００万人の個人が、低い骨質量を有し、従って疾患に対して増大した危険性にあると概算されている。
【０００７】
従って、骨芽細胞および／または破骨細胞のような細胞を（例えば、細胞サンプルまたは組織サンプル中で）同定するために使用され得、そしてこのような細胞の活性を制御または調節する方法および組成物に対する必要性が存在する。異常な骨の成長および再吸収に関連する疾患および障害（上記の疾患を含む）を、例えば、骨芽細胞および破骨細胞の活性を調節することによって処置するための、方法ならびに組成物に対する必要性もまた存在する。当該分野におけるこれらの要求および他の要求が、本発明によって取り組まれる。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、骨組織の成長、発達、修復、再吸収、分解またはホメオスタシスに関連するプロセスに関与し、ゆえにこのようなプロセスの調節に有用である、組成物および方法を提供することによって、当該分野における上記の問題および他の問題を克服する。例えば、本発明の方法は、骨組織の異常な成長、発達、修復、再吸収、分解、再吸収またはホメオスタシスを含む障害（すなわち、「骨の成長に関連する障害」）の処置に有用であり得る。このような障害の例としては、骨粗鬆症および大理石骨病が挙げられるが、これらに限定されない。このような障害の非限定的な例としては、パジェット病、骨形成不全症、線維性形成異常症、低ホスファターゼ血症、原発性上皮小体機能亢進症、関節炎、歯周病および骨溶解（例えば、悪性腫瘍に由来する）が挙げられる。
【０００９】
詳細には、本発明は、破骨細胞によって発現される、本明細書中ではＯＳＣＡＲポリペプチドと称される新規ポリペプチドを提供する。本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、破骨細胞の成長および成熟、ならびに破骨細胞と関連する活性（例えば、骨組織の再吸収）を調節する。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（すなわち、マウス（ｍｏｕｓｅ））ポリペプチドであり、マウスの破骨細胞によって発現される、ＯＳＣＡＲポリペプチドを提供する。例えば、１つの実施形態において、本発明は、図２Ｂ（配列番号３）に記載のアミノ酸配列を含むＯＳＣＡＲポリペプチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、図１Ｃ（配列番号３）に記載アミノ酸配列を含むＯＳＣＡＲポリペプチドを提供する。なお別の好ましい実施形態において、本発明は、図２６Ｂおよび図２７Ｂ（それぞれ、配列番号２９および配列番号３１）に記載のアミノ酸配列を含むＯＳＣＡＲポリペプチドを提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ヒトポリペプチドであるＯＳＣＡＲポリペプチドを提供する。例えば、好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）に記載のゲノム配列によってコードされるポリペプチドである。特定の特に好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図３Ｂ（配列番号７）、図４Ｂ（配列番号９）、図５Ｂ（配列番号１１）、図２４Ｂ（配列番号２５）、図２５Ｂ（配列番号２７）に記載のアミノ酸配列を含み得る。なお他の実施形態において、本発明は、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの１つ以上のドメインに対応するアミノ酸配列（例えば、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの、シグナルペプチド配列、Ｉｇ様ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、細胞質テイルドメイン配列またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、図１Ｃ、図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂ，図２４Ｂ、図２５Ｂ、図２６Ｂ、および図２７Ｂ（それぞれ配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１）に記載のポリペプチドのうちのいずれか由来のもの））を含むポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を提供する。なお他の実施形態において、本発明は、ＯＳＣＡＲポリペプチドの改変体を提供する。特に、本発明は、規定されたハイブリダイゼーション条件下で、図１Ｃ、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂ，図２４Ｂ、図２５Ｂ、図２６Ｂ、および図２７Ｂ（それぞれ配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１）に提供されるようなＯＳＣＡＲポリペプチドの相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされる、ポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、例えば、図１Ａ〜Ｂ、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図２４Ａ、図２５Ａ、図２６Ａおよび図２７Ａ（それぞれ、配列番号１〜２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０および配列番号３２）に提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）に記載のゲノムＯＳＣＡＲ核酸配列を含む、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はさらに、これらの核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらのＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ核酸に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、このようなＯＳＣＡＲポリペプチド、ＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲ抗体のフラグメントに関する。
【００１２】
さらに、本発明はまた、細胞中、細胞の表面上（例えば、細胞表面上に発現されるＯＳＣＡＲ）、細胞培養物中（例えば、細胞培養培地中）、細胞培養抽出物または細胞溶解物中の、ＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲポリペプチドの存在または発現を検出するためのスクリーニング方法を含む、本発明のＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲポリペプチドを検出および同定するためのスクリーニングアッセイに関し、そしてこのスクリーニングアッセイを提供する。これらの方法は、改変体ＯＳＣＡＲポリペプチドおよび改変体ＯＳＣＡＲ核酸（例えば、１つ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を含むＯＳＣＡＲポリペプチド；または１つ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有するＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸）を検出および同定するための方法を含む。これらの方法によって同定され得る他の改変体ＯＳＣＡＲポリペプチドおよび改変体ＯＳＣＡＲ核酸は、相同性ＯＳＣＡＲポリペプチドおよび相同性ＯＳＣＡＲ核酸（例えば、他の生物種由来であり、そして好ましくは他の哺乳動物生物（例えば、ヒト）由来）を含む。従って、このような改変体ＯＳＣＡＲポリペプチドおよび改変体ＯＳＣＡＲ核酸、ならびにこれらに特異的に結合する抗体ならびにそのフラグメントは、本発明によって提供され、そして本発明の一部とみなされる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のＯＳＣＡＲ核酸または本発明ＯＳＣＡＲポリペプチドに特異的に結合する化合物を同定するための方法（例えば、スクリーニングアッセイ）を提供する。このようなスクリーニングアッセイによって同定され得る化合物としては、低分子（例えば、分子量が約２ｋＤ未満の分子、より好ましくは分子量が約１ｋＤ未満の分子）および高分子（タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを含む）が挙げられる。このようなスクリーニング方法によって同定され得る化合物としてはさらに、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物（例えば、ＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲポリペプチド）に特異的に結合する細胞内化合物（例えば、天然のリガンド）が挙げられる。さらに、ＯＳＣＡＲポリペプチドと特定の結合パートナー（例えば、ＯＳＣＡＲ特異的リガンド）との間、またはＯＳＣＡＲ核酸および特定の結合パートナーとの間の結合相互作用を妨害する化合物（例えば、低分子、高分子、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを含む）を同定するための、他のスクリーニングアッセイが提供される。従って、このようなスクリーニング方法は、本発明の一部とみなされる。さらに、このようなアッセイによって同定された化合物（結合化合物（例えば、ＯＳＣＡＲ特異的リガンド）およびＯＳＣＡＲ特異的結合相互作用を妨害する化合物を含む）もまた、本発明の一部である。
【００１４】
別の局面において、本発明は、破骨細胞の活性を調節するための方法を提供する。このような方法は、一般的に、破骨細胞を、ＯＳＣＡＲ遺伝子の活性（例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現）を調節するかまたはＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節する化合物と接触させる工程を包含する。これらの方法に使用される化合物としては、ＯＳＣＡＲシグナル伝達を阻害し、ゆえに破骨細胞活性化（例えば、成熟）を阻害するＯＳＣＡＲアンタゴニスト、ならびに、ＯＳＣＡＲシグナル伝達および／または破骨細胞の成熟ならびに破骨細胞活性を促進するＯＳＣＡＲアゴニスト（ＯＳＣＡＲ特異的リガンドを含む）が挙げられる。これらの方法は、破骨細胞を、この細胞によるＯＳＣＡＲ遺伝子またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物の発現が増強または阻害されるような化合物（例えば、アンチセンス、リボザイム、三重らせん形成核酸、または他の低分子化合物）と接触させる工程を包含し得る。このような方法は、例えば、破骨細胞を、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合し、そして／またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を増大させる化合物と接触させることによって、破骨細胞活性を増大させるための方法を含み得る。この方法の１つの好ましい実施形態において、破骨細胞を、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドと接触させる。
【００１５】
本発明の方法はさらに、破骨細胞の活性を減少させることを含む。これらの方法は、破骨細胞を、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を阻害または減少させる化合物と接触させる工程を包含し得る。特定の好ましい実施形態において、この化合物は、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドのＯＳＣＡＲ遺伝子産物への結合を阻害または妨害する化合物であり得る。例えば、１つの好ましい実施形態において、この化合物は、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはＯＳＣＡＲ特異的リガンドのいずれかに特異的に結合する抗体を含み、その結果、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドとＯＳＣＡＲ遺伝子産物との間の結合が、阻害される。別の好ましい実施形態において、この化合物は、１つ以上の可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドアミノ酸配列（最も好ましくは、ＯＳＣＡＲポリペプチドのリガンド結合ドメイン（例えば、細胞外配列ドメインおよび／またはシグナル配列ドメイン）を含むアミノ酸配列を含む）を含む。特に好ましい実施形態において、投与される化合物は、免疫グロブリンＦｃ領域または他の低分子と結合体化した、これらのアミノ酸配列を有する可溶性融合ポリペプチドを含む。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規な遺伝子（本明細書中で「破骨細胞関連レセプター」またはＯＳＣＡＲ遺伝子と称される）およびその遺伝子産物に関する。ＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物（これらは、初めて本明細書中に記載される）は、破骨細胞中で特異的に発現される。さらに、出願人らはまた、骨芽細胞によって生成されるＯＳＣＡＲ特異的リガンド（本明細書中で「ＯＳＣＡＲリガンド」または「ＯＳＣＡＲ−Ｌ」と称される）の存在を発見した。本発明のＯＳＣＡＲ特異的リガンドはまた、例えば、マウス胚性線維芽細胞、マウスＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、マウスＳＴ２骨芽細胞様細胞、ミンク肺上皮細胞、ラットＵＭＲ１０６骨芽細胞様細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ｈＦＯＢ１．１９、ならびにサルＣＯＳ−１細胞を含む、他の細胞によって発現され得る。ＯＳＣＡＲリガンドは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合する。以下に示される実施例において記載される実験において、ＯＳＣＡＲリガンドを発現する骨芽細胞と、未成熟な破骨細胞を接触させることは、破骨細胞の成熟を効果的に刺激し、成熟した多核性破骨細胞の数を増加させる。しかし、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の可溶性融合タンパク質の投与は、これらの破骨細胞によって発現されるＯＳＣＡＲペプチドに対するＯＳＣＡＲリガンドの結合を阻害し、それによって破骨細胞の成熟を阻害する。従って、ＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物は、破骨細胞活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）ために使用され得、従って、例えば、異常な骨成長に関連する疾患および障害（骨粗鬆症および大理石骨病を含む）を処置する方法に有用である。
【００１７】
ＯＳＣＡＲポリペプチドは、一般的に、以下に記載されるようなＯＳＣＡＲ核酸配列の相補体にハイブリダイズする遺伝子によってコードされるポリペプチドである。代表的に、本発明の全長ＯＳＣＡＲポリペプチドは、約３５ｋＤａ、あるいは約４０ｋＤａの見かけの分子量を有する。本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、以下の実施例において記載されるような破骨細胞の成熟を調節し得る。
【００１８】
ＯＳＣＡＲポリペプチドはさらに、以下に詳細に記載されるように、２つの免疫グロブリンドメインおよび膜貫通ドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして特徴付けられる。従って、好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、他の免疫グロブリンタンパク質およびポリペプチド（例えば、マウスＰｉｒＡおよびウシＦｃαＲ）とアミノ酸配列相同性および／またはアミノ酸配列同一性を共有する。例えば、限定するためでないが、図１Ｃに示される特定のＯＳＣＡＲポリペプチドに類似するポリペプチドを同定するために、ＢＬＡＳＰアルゴリズム（標準的なパラメーター）を使用するＮＣＢＩタンパク質データベースの検索により、このポリペプチドは、マウスＰｉｒＡ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５３２１７．１）と２６．４％の配列同一性およびウシＦｃαＲのポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ２４０７１）と２４．２％の配列同一性を共有することが明らかとなる。
【００１９】
ＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、細胞におけるその発現パターンによって特徴付けられ得る。詳細には、ＯＳＣＡＲポリペプチドは、ＯＳＣＡＲポリペプチドを発現するように形質転換されている宿主細胞以外は、好ましくは、破骨細胞によって特異的に発現され、そして好ましくは、任意の他の細胞型によって発現されない。詳細には、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、好ましくは、マクロファージおよび樹状細胞を含む他の骨髄由来の細胞によって発現されない。
【００２０】
１つの特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）（すなわち、マウス（ｍｏｕｓｅ））細胞から誘導されるか、またはマウス細胞から誘導されたペプチドのアミノ酸配列を有する。例えば、本発明のマウスＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ（配列番号３）に示されるアミノ酸配列を含み得る。この配列は、以下の少なくとも５つの異なるドメインに対応する配列を含む：シグナルペプチド配列（配列番号３のアミノ酸残基１〜１６を含む）、２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ、配列番号３のアミノ酸残基１７〜１２２および１２３〜２２８を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号３のアミノ酸残基２２９〜２４７を含む）および細胞質テールドメイン配列（配列番号３のアミノ酸残基２４８〜２６４を含む）。
【００２１】
特定の実施形態の種々の局面において、成熟ＯＳＣＡＲポリペプチドは、シグナルペプチド配列を欠く。従って、別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ（配列番号３）に示される配列のアミノ酸残基１７〜２６４に対応するアミノ酸配列を含む。なお他の実施形態において、本発明の可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドは、膜貫通ドメインおよび（ほとんどの実施形態において）細胞質テールドメインを欠く。従って、なお他の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ（配列番号３）に示される配列のアミノ酸残基１７〜２２８、および必要に応じて、アミノ酸残基２４８〜２６４に対応するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
他の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、ヒト細胞から誘導されるか、またはヒト細胞から誘導されたポリペプチドに実質的に対応する。例えば、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、本明細書中で「Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム」と称され、かつ図３Ｂ（配列番号７）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアミノ酸配列のアミノ酸残基９７は、図３Ｂ（配列番号７）において示されるように、セリン（ＳｅｒまたはＳ）である。しかし、別の例示的な実施形態において、その配列のアミノ酸残基９７は、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）であり得る。Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアミノ酸配列はまた、少なくとも４つのドメインに対応するアミノ酸配列を含み、これは、図１Ｃ（配列番号３）に示されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチドについて上記の４つのドメインに対応する。詳細には、Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームは、シグナルペプチド配列（配列番号７のアミノ酸残基１〜１８を含む）、２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２３および１２４〜２２９を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号７のアミノ酸残基２３０〜２４８を含む）および細胞質テールドメイン配列（配列番号７のアミノ酸残基２４９〜２６３を含む）を含む。
【００２３】
あるいは、本発明のヒトＯＳＣＡＲポリペプチドは、本明細書中で「Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム」と称され、かつ図４Ｂ（配列番号９）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。なお別の特定の実施形態において、本発明のヒトＯＳＣＡＲポリペプチドは、本明細書中で「Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム」と称され、かつ図５Ｂ（配列番号１１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアミノ酸配列のアミノ酸残基８６は、図５Ｂ（配列番号１１）において示されるように、セリン（ＳｅｒまたはＳ）である。しかし、別の例示的な実施形態において、その配列のアミノ酸残基８６は、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）であり得る。これらのヒトＯＳＣＡＲポリペプチドの各々は、少なくとも４つのドメインに対応するアミノ酸配列を含み、これらは、図１Ｃ（配列番号３）に示されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチドについて、および図３Ｂ（配列番号７）に示されるＣ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについての上記のドメインに対応する。
【００２４】
詳細には、Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームは、シグナルペプチド配列（配列番号９のアミノ酸残基１〜１８を含む）、２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ、配列番号９のアミノ酸残基１９〜１２７および１２８〜２３３を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号９のアミノ酸残基２３４〜２５２を含む）および細胞質テールドメイン配列（配列番号９のアミノ酸残基２５３〜２６７を含む）を含む。
【００２５】
Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームもまた、シグナルペプチド配列（配列番号１１のアミノ酸残基１〜１３を含む）、２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ、配列番号１１のアミノ酸残基１４〜１１２および１１３〜２１８を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号１１のアミノ酸残基２１９〜２３７を含む）および細胞質テールドメイン配列（配列番号１１のアミノ酸残基２３８〜２５２を含む）を含む。
【００２６】
本発明のマウスＯＳＣＡＲポリペプチドについて上記のように、成熟ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドは、これらの実施形態の種々の局面において、シグナルペプチドを欠き得る。従って、他の特定の実施形態において、本発明のヒトＯＳＣＡＲポリペプチドは、図３Ｂ（配列番号７）に示される配列のアミノ酸残基１９〜２４８、図４Ｂ（配列番号９）に示される配列のアミノ酸残基１９〜２５２、または図５Ｂ（配列番号１１）に示される配列のアミノ酸残基１４〜２５２に対応するアミノ酸配列を含み得る。なお他の特定の実施形態において、本発明の可溶性ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドは、膜貫通ドメインおよび（ほとんどの実施形態において）細胞質テールドメインを欠く。従って、なお他の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、以下に対応するアミノ酸配列を含み得る：（１）図３Ｂ（配列番号７）に示される配列のアミノ酸残基１９〜２２９および必要に応じて、アミノ酸残基２４９〜２６３；（２）図４Ｂ（配列番号９）に示される配列のアミノ酸残基１９〜２３３および必要に応じて、アミノ酸残基２３４〜２５２；または（３）図５Ｂ（配列番号１１）に示される配列のアミノ酸残基１４〜２１８および必要に応じて、アミノ酸残基２１９〜２３７。
【００２７】
他の代替的な実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ（配列番号３）、図３Ｂ（配列番号７）、図４Ｂ（配列番号９）、図５Ｂ（配列番号１１）、図２４Ｂ（配列番号２５）、図２５Ｂ（配列番号２７）、図２６Ｂ（配列番号２９）および図２７Ｂ（配列番号３１）に示されるＯＳＣＡＲポリペプチドに対して、少なくとも２５％、または少なくとも３０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも７５％、そしてなおより好ましくは少なくとも９０％同一であるポリペプチドである。
【００２８】
なお他の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、本明細書中に記載の全長ＯＳＣＡＲポリペプチドのフラグメント（例えば、配列番号３、７、９または１１のフラグメント）を含む。例えば、以下の実施例は、図２Ｂ（配列番号５）に示されるアミノ酸配列を含む全長ＯＳＣＡＲ遺伝子産物のフラグメントをコードするＯＳＣＡＲ遺伝子フラグメント（ＯＣＬ１７８と称される）を記載する。全長ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の他の例示的なフラグメントは、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドについて上記のドメインの１つを含むポリペプチド（例えば、シグナル配列ドメイン、Ｉｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞質テールドメインのアミノ酸配列を含むフラグメント）またはこれらのドメインの１つの一部分を含むフラグメントである。全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの他のフラグメントは、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドについて上記の２つ以上のドメインの任意の組み合わせを含むポリペプチドを含む；例えば、シグナル配列ドメイン、Ｉｇ様ドメイン（例えば、配列番号３、７、９もしくは１１の第１または第２のＩｇ様ドメイン）、膜貫通ドメイン、または細胞質テールドメインからなる群より選択される２つ以上のドメインに対応するアミノ酸配列を含むフラグメント。
【００２９】
ＯＳＣＡＲポリペプチドのこのようなフラグメントは、例えば、以下に定義されるような種々の融合ポリペプチドを構築するために有用である。例えば、シグナル配列ドメインを含む融合ポリペプチドは、抽出および精製のために、宿主細胞による培養培地への分泌について融合ポリペプチドを標的化するために使用され得る。膜貫通ドメインを含む融合ポリペプチドは、細胞表面上での発現のための融合ポリペプチドを標的化するために使用され得る。好ましい実施形態において、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの１つ以上のＩｇ様ドメインを含む融合ポリペプチドは、Ｉｇ様ドメインに特異的に結合する抗体を合成するために使用され得、そして破骨細胞の表面上でのＯＳＣＡＲ発現を検出するために使用され得る。あるいは、ＯＳＣＡＲリガンドに結合するＯＳＣＡＲ Ｉｇ様ドメインを含む可溶性融合ポリペプチドが、合成され得る。このような融合ポリペプチドは、例えば、以下の実施例において記載され、例えば、ＯＳＣＡＲリガンドの競合物として有用であり、そして破骨細胞の数および活性を減少させる。従って、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはそのフラグメントの配列を含む融合ポリペプチドを含む。
【００３０】
ＯＳＣＡＲ核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子ならびに以下の記載の改変（例えば、改変された塩基および／または骨格）のいずれかを含む核酸分子であり得る。１つの好ましい実施形態において、核酸は、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドをコードするコード配列に対して、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、およびなおより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する；例えば、図１Ａ〜Ｂ（配列番号１〜２）、または図３Ａ、４Ａ、５Ａ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａもしくは２７Ａ（それぞれ、配列番号６、８、１０、２６、２８、３０および３２）のいずれか１つに示されるコード配列。あるいは、本発明のＯＳＣＡＲ核酸は、例えば、図１Ｃ（配列番号３）、または図３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂもしくは２７Ｂ（それぞれ、配列番号７、９、１１、２５、２７、２９および３１）のいずれか１つに示されるＯＳＣＡＲポリペプチドに対して、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは少なくとも７５％そしてなおより好ましくは少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
【００３１】
あるいは、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸は、このようなコード配列の相補体、またはこのようなコード配列のフラグメントに、以下に詳細に示される条件下でハイブリダイズし得る。例えば、以下の実施例は、クローンＯＣＬ１７８に含まれそして図２（配列番号４）に示されるＯＳＣＡＲフラグメントとハイブリダイズする、アガロースゲル中の電気泳動によって決定されるような、それぞれ４．０ｋｂ、１．８ｋｂおよび１．０ｋｂの見かけの長さのＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の同定を記載する。
【００３２】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸は、ＯＳＣＡＲゲノム配列からイントロン配列を取り除くためにプロセシングされたかまたは「スプライシングされた」核酸（例えば、これらから誘導されるｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ）を含む。あるいは、本発明のＯＳＣＡＲ核酸は、エキソン配列およびイントロン配列の両方を含むプロセシングされていない核酸（例えば、ゲノムＯＳＣＡＲ配列、スプライシングされていないＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ配列およびこれらから誘導されるｃＤＮＡ配列）であり得る。
【００３３】
例えば、図７Ａ〜Ｄは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子の配列を含む、ヒト１９番染色体クローンＣＴＤ−３０９３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０１２３１４．５；ＧＩ：７７１５４７）由来の領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。ヒト染色体配列のこの領域を有するこのようなＯＳＣＡＲゲノム配列の存在は、以前には知られておらず、そして初めて本明細書中で記載される。従って、このようなＯＳＣＡＲゲノム配列は、本発明のＯＳＣＡＲ核酸の中の１つである。詳細には、図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）に示されるゲノム配列は、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物をコードするＲＮＡに転写されるかまたは転写され得るエキソン配列を含む。これらのエキソン配列は、大文字によって図７Ａ〜Ｄに示される。図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）に示されるゲノム配列はまた、イントロン配列ならびに５’および３’のプロセシングされていない領域（ＵＰＲ）の配列を含み、これらの全ては、小文字によって図７Ａ〜Ｄで示される。具体的には、図７Ａ〜Ｄおよび配列番号１２に示されるＯＳＣＡＲゲノム配列は、特に、表１に示されるイントロンドメインおよびエキソンドメインを含む。
【００３４】
【表１】
Figure 2005500803
従って、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、ゲノムＯＳＣＡＲ核酸分子を含む。このようなゲノムＯＳＣＡＲ核酸分子は、図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）に示されるＯＳＣＡＲゲノム配列を有する核酸を含む。本発明のゲノムＯＳＣＡＲ核酸はまた、全長ＯＳＣＡＲゲノム配列の１つ以上のエキソンまたはイントロンに対応する配列を有する核酸分子（例えば、図７Ａ〜Ｄに示されそして上の表１に特定される１つ以上のエキソン配列およびイントロン配列に対応する核酸配列を含む）を含む。
【００３５】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸はまた、全長ＯＳＣＡＲ配列のフラグメントを含み得る。例えば、好ましい実施形態において、このようなＯＳＣＡＲ核酸フラグメントは、全長コードＯＳＣＡＲ核酸配列の少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの配列に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、フラグメントは、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａ、および２７Ａ（それぞれ、配列番号１〜２、４、６、８、１０、２６、２８、３０および３２）のいずれかに示されるＯＳＣＡＲコード配列の一部分（例えば、少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチド）に対応する。他の好ましい実施形態において、ＯＳＣＡＲ核酸フラグメントは、全長ＯＳＣＡＲ核酸配列に対して、例えば、図１Ａ〜Ｂ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａ、および２７Ａ（それぞれ、配列番号１〜２、４、６、８、１０、２６、２８、３０および３２）に示されるＯＳＣＡＲ核酸配列のいずれかに対して、またはこのような全長ＯＳＣＡＲ配列の相補体に対して、以下に詳細に記載される条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの配列を含む。本発明のＯＳＣＡＲ核酸フラグメントはまた、ＯＳＣＡＲゲノム配列（例えば、図７Ａ〜Ｄに示されそして配列番号１２に示される配列）の少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチドの配列に対応するヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ＯＳＣＡＲ核酸フラグメントは、ＯＳＣＡＲゲノム配列（例えば、図７Ａ〜Ｄに示されそして配列番号１２に示されるゲノム配列）に対して、またはＯＳＣＡＲゲノム配列の１つ以上のエキソンもしくはイントロン（例えば、図７Ａ〜Ｄに示されそして上の表１に記載されるエキソンおよびイントロン）に対して、またはこのようなＯＳＣＡＲゲノム配列の相補体に対して、以下に詳細に記載される条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチドの配列を含み得る。
【００３６】
このようなフラグメントを含む核酸分子は、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子を検出または増幅するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーとして有用である。しかし、オリゴヌクレオチドフラグメントはまた、アンチセンス核酸として、３重らせん形成オリゴヌクレオチドとして、またはリボザイムとして、使用され得る。しかし、ＯＳＣＡＲ配列の１つ以上のフラグメントを含む本発明の核酸分子はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物についての全長コード配列であり得る。
【００３７】
（定義）
一般的な定義。本明細書中で使用される用語は、一般的に、本発明の文脈中および各用語が使用される特定の文脈中で、当該分野で通常の意味を有する。特定の用語は、本発明のデバイスおよび方法ならびにこれらを作製および使用する方法を記載する際に、当業者にさらなる手引きを提供するために、以下または明細書中の他のいずれかで述べられる。
【００３８】
用語「骨成長関連障害（ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「骨成長関連障害（ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」、「骨成長障害」、「骨成長疾患」およびその他のこのようなバリエーションは、本明細書中で一般に使用される場合、骨組織の異常な成長、修復の発達、再吸収、分解またはホメオスタシスに関連する任意の疾患または障害を意味する。従って、骨成長関連障害は、個体における骨質量の異常な増加ならびに異常な減少に関連する疾患および障害を含み得る。また、本発明の対象である骨成長関連障害としては、破骨細胞の異常な（例えば、増加または減少した）活性に関連する障害が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明の対象である骨成長関連障害はさらに、破骨細胞の異常な（例えば、増加または減少した）活性に関連する障害を含む。本発明の方法および組成物に従って診断または処置され得る例示的な骨成長関連障害としては、いくつか例を挙げると、大理石骨病、骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全、線維性形成異常、低ホスファターゼ血、原発性上皮小体亢進関節炎、歯周病および骨髄腫血液疾患が挙げられる。さらに、骨溶解は、骨に存在するかまたは骨から離れて存在する多数の悪性腫瘍（例えば、***、肺、前立腺、甲状腺および腎臓の癌における骨格転移、悪性腫瘍の間の体液の高カルシウム血症、ならびに多発性骨髄腫）によって誘導され得る。
【００３９】
骨成長関連障害は、ＯＳＣＡＲの核酸、遺伝子産物またはポリペプチドと直接的または間接的のいずれかで関連し得る。このような障害としては、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはその遺伝子産物の異常な合成または発現に関連する障害、そしてまたＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物の異常な（例えば、増加または減少した）活性によって引き起こされる疾患および障害（例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはその遺伝子産物の異常な生理活性に関連する障害）を含む。本発明の他のＯＳＣＡＲ関連障害は、ＯＳＣＡＲ遺伝子、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはＯＳＣＡＲポリペプチドと相互作用する別の化合物（例えば、天然リガンドまたは他の細胞性化合物）の異常な合成、発現または活性に関連する障害を含む。さらに、本発明のＯＳＣＡＲ関連障害は、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはその遺伝子産物の異常な合成、発現または活性によってそれ自体引き起こされないかまたは関連していないが、ＯＳＣＡＲ遺伝子、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはＯＳＣＡＲポリペプチドの合成、発現または活性を調節する（例えば、増加または減少させる）方法によって、あるいはＯＳＣＡＲ遺伝子、遺伝子産物またはポリペプチドと相互作用する化合物（例えば、天然リガンドまたは他の細胞性化合物）の合成、発現または活性を調節する方法によって処置され得る障害を含む。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、参照された物質が、それが天然に見出される環境から取り出されていることを意味する。従って、単離された生物学的物質は、細胞性成分（すなわち、その物質が見出されるかまたは生成される細胞の成分）を含み得ない。核酸分子の場合において、単離された核酸は、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限フラグメントを含む。別の実施形態において、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り取られ、そしてより好ましくは、染色体中に見出される場合、単離された核酸分子によって含まれる遺伝子の上流または下流に位置する、非調節領域、非コード領域、または他の遺伝子にもはや結合していない。なお別の実施形態において、単離された核酸は、１つ以上のイントロンを欠く。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列を含む。従って、特定の実施形態において、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質は、他のタンパク質もしくは核酸、または両方と会合し得、単離されたタンパク質は、細胞中で他のタンパク質または核酸と会合し、またはこれが膜結合タンパク質である場合、細胞膜と会合する。単離された細胞小器官、細胞、または組織は、これが生物体において見出される解剖学的部位から取り出されている。単離された物質は、精製され得るが、必ずしも精製される必要はない。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」は、無関係の物質（すなわち、混入物）（物質が獲得されるネイティブな物質を含む）の存在を減少または除去する条件下で単離された物質をいう。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、それが細胞中で会合する他のタンパク質または核酸を実質的に含まない；精製された核酸分子は、好ましくは、それが細胞中で見出され得るタンパク質または他の無関係の核酸分子を実質的に含まない。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に含まない」は、物質の分析試験の文脈において、操作的に使用される。好ましくは、混入物を実質的に含まない精製された物質は、少なくとも５０％純粋；より好ましくは少なくとも９０％純粋；そしてより好ましくはなお少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成物分析、生物学的アッセイ、および当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。
【００４２】
精製の方法は当該分野で周知である。例えば、核酸は、沈殿、クロマトグラフィー（分取固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重らせんクロマトグラフィーを含む）、超遠心分離、および他の手段によって精製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質は、種々の方法によって精製され得る。この方法としては、限定はしないが、以下が挙げられる：分取ディスクゲル電気泳動、等電集束、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出、および向流分配。いくつかの目的について、組み換えシステムにおいてポリペプチドを生成することが好ましい。ここでは、このタンパク質は、精製を容易にするさらなる配列（例えば、限定しないが、ポリヒスチジン配列、または抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧおよびＧＳＴ））を含む。次いで、このポリペプチドを、適切な固相マトリックス上のクロマトグラフィーによって宿主細胞の粗溶解物から精製し得る。あるいは、タンパク質に対して、またはそれから誘導されたペプチドに対して生成された抗体は、精製試薬として用いられ得る。細胞は、種々の技術によって精製され得る。この技術としては、遠心分離、マトリックス分離（例えば、ナイロンウール分離）、パニングおよび他の免疫選択技術、枯渇（例えば、混入している細胞の補体枯渇）、およびセルソーティング（例えば、蛍光標示式細胞分取器（蛍光発色セルソーティング）［ＦＡＣＳ］）が挙げられる。他の精製方法が可能である。精製された物質は、約５０％未満、好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満の細胞成分（もともとその物質が結合していた）を含み得る。「実質的に純粋」とは、当該分野で公知の従来の精製技術を用いて達成され得る最高程度の純度を示す。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「サンプル」とは、例えば、トランスジェニック動物中の遺伝子治療または遺伝子発現を評価するため、またはＯＳＣＡＲ遺伝子またはその遺伝子産物を特異的に発現する細胞（例えば、破骨細胞）を同定するために、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはＯＳＣＡＲ核酸の存在について試験され得る生物学的物質をいう。このようなサンプルは、組織、血液、および血球（循環する造血幹細胞を含む（タンパク質または核酸の可能性のある検出のため））、胸水、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腹水、および細胞培養物を含む、任意の供給源から入手され得る。好ましい実施形態において、サンプルは骨髄から入手される。
【００４４】
非ヒト動物としては、限定はしないが、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなど）；ペット（例えば、イヌおよびネコ）；および家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、およびウシ）、そして特にヒトまたはマウスのＯＳＣＡＲでトランスジェニックにされたこのような動物が挙げられる。
【００４５】
好ましい実施形態において、用語「約」および「ほぼ（およそ）」は、一般に、自然なまたは正確な測定値を与える測定された量について受容可能な程度の誤差を意味する。代表的に、例示的な程度の誤差は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）内、好ましくは１０％内であり、そしてより好ましくは５％内である。あるいは、そして特に生物学的システムにおいては、用語「約」および「およそ」は、所定の値のある程度の大きさ内である値、好ましくは５倍以内、そしてより好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書において与えられる数値は、他に言及しない限り、この用語「約」または「ほぼ（およそ）」が、表示して言及されない場合、推測され得ることを意味する。
【００４６】
用語「分子」は、１つ以上の原子を含む、任意の異なるかまたは識別可能な構造単位の物質、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４７】
（分子生物学の定義）本発明に従って、当該分野内の従来の分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は文献中で詳細に説明される。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」として本明細書においては言及している）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｎｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｅ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００４８】
用語「ポリマー」とは、繰り返し一緒に連結されている２つ以上の構築ブロック（「マー」）からなる任意の物質または化合物を意味する。例えば、「ダイマー（二量体）」は、２つの構築ブロックが一緒に連結された化合物であり；「トリマー（三量体）」は、３つの構築ブロックが一緒に連結された化合物である；等々。
【００４９】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、本明細書において用いる場合、代表的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子をいう。ここでこのポリマー骨格は、ポリマー分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ）との間の特定の様式においてこのような水素結合を可能にする様式でこの塩基を示す。このような塩基は代表的にイノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジンである。ポリマー分子は「二本鎖」および「一本鎖」のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにその骨格改変（例えば、メチルホスフェート連結）を含む。
【００５０】
従って、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、概してＤＮＡおよびＲＮＡ中の、一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、そして２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は頻繁に遺伝子情報を保有しており、この情報は、タンパク質および酵素を作製するために細胞機構によって用いられる情報を含む。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成ポリヌクレオチドおよび遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これは、一本鎖分子および二本鎖分子；すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリッド、ならびにアミノ酸骨格に対して塩基を結合することによって形成された「タンパク質核酸（ＰＮＡ）」を含む。これはまた、改変塩基（例えば、チオ−ウラシル、チオ−グアニン、およびウルオロ−ウラシル）を含む核酸を含む。
【００５１】
本明細書におけるポリヌクレオチドは、天然調節配列に隣接していてもよいし、または異種配列（プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域および３’非コード領域などを含む）に結合していてもよい。この核酸はまた、当該分野で公知の多くの手段によって改変され得る。このような改変の非限定的な例としては、メチル化、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびヌクレオチド間改変（例えば、無電荷連結を有する改変（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、および荷電連結を有する改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）など）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、いくつかの例を挙げると、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキレーターのような、１つ以上のさらなる共有結合した部分を含み得る。このポリヌクレオチドは、メチルホスホトリエステルもしくはエチルホスホトリエステル、またはアルキルホスホラミダイト結合の形成によって誘導され得る。さらに、本明細書におけるポリヌクレオチドはまた、直接または間接的のいずれかで、検出可能シグナルを提供し得る標識で改変され得る。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。作製され得る改変の非限定的な例は、発明の詳細な説明において以下に提供される。
【００５２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合と呼ばれる化学的な結合によって一緒に連結されるアミノ酸と呼ばれる化学的な構築ブロックの鎖である。用語「タンパク質」とは、遺伝子または核酸分子（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）によってコードされ、直接または間接的にその遺伝子から転写されたアミノ酸残基を含むポリペプチドをいう。必要に応じて、タンパク質は、遺伝子によってまたはｍＲＮＡによってコードされる特定のアミノ酸残基を欠失し得る。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終タンパク質から切断されており、従って最終タンパク質の一部ではないかもしれない、タンパク質のＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードし得る。タンパク質またはポリペプチド（酵素を含む）は、「ネイティブ」もしくは「野生型」であり得、このことは、これが天然に存在することを意味する；あるいはタンパク質またはポリペプチド（酵素を含む）は、「変異体」、「改変体」であり得るか、もしくは「改変され」得、このことは、これが作製、変更、誘導されているか、またはこれがネイティブなタンパク質から、もしくは別の変異体から何らかの方法で異なっているかまたは変化していることを意味する。
【００５３】
「リガンド」は、広義では、別の分子に結合する任意の分子である。好ましい実施形態において、リガンドは、可溶性分子もしくは２つの分子の小さい方のいずれか、またはその両方である。他の分子は、「レセプター」と呼ばれる。好ましい実施形態において、リガンドおよびそのレセプターの両方は、細胞によって生成される分子（好ましくはタンパク質またはポリペプチド）である。特に好ましい実施形態において、リガンドは、可溶性分子であり、そしてレセプターは内在性膜タンパク質（すなわち、細胞の表面上で発現されるタンパク質）である。しかし、どの分子がリガンドであるかと、どれがレセプターであるかの間の区別は、例えば、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ特異的リガンドの両方が内在性膜タンパク質であるかまたはそうであるらしい実施形態において、不定であり得る。
【００５４】
リガンドのそのレセプターに対する結合は、頻繁に、細胞内のシグナル伝達における工程である。例示的なリガンド−レセプター相互作用としては、ホルモンレセプターに対するホルモンの結合（例えば、エストロゲンレセプターに対するエストロゲンの結合）、およびニューロンの表面上のレセプターに対する神経伝達物質の結合が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドの「増幅」とは、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度を増大するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を意味する。ＰＣＲの詳細については、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８、２３９：４８７を参照のこと。
【００５６】
ＤＮＡの「化学的配列決定」とは、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定；Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７７，７４：５６０）の配列決定のような方法を意味する。ここでＤＮＡは、個々の塩基特異的反応を用いて切断される。
【００５７】
ＤＮＡの「酵素的配列決定」とは、当該分野で周知のＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７７，７４：５４６３）の配列決定およびそのバリエーションのような方法を意味する。ここでは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖ＤＮＡがコピーされ、そしてランダムに終止される。
【００５８】
「遺伝子」は、ヌクレオチドの配列であり、機能的な「遺伝子産物」をコードする。一般に、遺伝子産物は機能的タンパク質である。しかし、遺伝子産物はまた、細胞中の別のタイプの分子（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ））であり得る。本発明の目的のために、遺伝子産物とは、細胞中で見出され得るｍＲＮＡ配列のこともいう。例えば、本発明に従う遺伝子発現レベルの測定は、ｍＲＮＡレベルの測定に相当し得る。遺伝子は、調節配列（すなわち、非コード配列）、およびコード配列を含み得る。例示的な調節配列としては、プロモーター配列（例えば、遺伝子が発現される条件を決定する）が挙げられる。この遺伝子の転写領域はまた、イントロン、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、および３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含む非翻訳領域を含み得る。
【００５９】
「コード配列」または「コードする」配列、および発現産物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素）とは、発現された場合、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列である；すなわち、このヌクレオチド配列は、そのＲＮＡを「コードする」か、またはこのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、または酵素のアミノ酸配列をコードする。
【００６０】
「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得るＤＮＡ調節領域であり、そして下流（３’方向）のコード配列の転写を開始する。本発明を規定する目的で、このプロモーター配列は、その転写開始部位によってその３’末端に結合され、そして上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンド以上の検出可能レベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内で、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって、簡便に見出された）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００６１】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡに転写するとき、細胞中の転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」であるか、またはそれらの配列と「作動可能に連結され」ている。次いでこのＲＮＡは、トランスＲＮＡスプライスされ（これがイントロンを含む場合）、そしてこの配列がタンパク質をコードする場合、そのタンパク質に翻訳される。
【００６２】
用語「発現する」および「発現」とは、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報が明らかになることを可能にするか、または明らかにさせること（例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）、またはタンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞によって発現されて、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、またはｒＲＮＡ）、またはタンパク質のような「発現産物」を形成する。発現産物自体（例えば、得られたＲＮＡまたはタンパク質）はまた、細胞によって「発現された」ともいわれる。
【００６３】
用語「トランスフェクション」とは、外来核酸の細胞への導入を意味する。用語「形質転換」とは、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質を生成するように、「外来」（すなわち、外因性のまたは細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡの配列をこの宿主細胞へ導入することを意味する。本発明においては、代表的にＲＮＡが導入された遺伝子または配列によってコードされるが、タンパク質または酵素も導入された遺伝子または配列によってコードされる。この導入された遺伝子または配列はまた、「クローニングされた（ｃｌｏｎｅｄ）」、または「外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）」遺伝子または配列と呼ばれ得、調節配列または制御配列（例えば、細胞の遺伝子機構によって用いられる開始配列、終止配列、プロモーター配列、シグナル配列、分泌配列、または他の配列）を含み得る。この遺伝子または配列は、非機能的配列または既知の機能のない配列を含み得る。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取りそして発現する宿主細胞は、「形質転換され」ており、そして「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源（異なる属または種の宿主細胞として、同じ属または種の細胞を含む）由来であり得る。
【００６４】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」とは、宿主を形質転換し、そして導入された配列の発現（転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）をその宿主細胞に導入し得る媒体（ビークル）を意味する。ベクターとは、プラスミド、ファージ、ウイルスなどを含み得、そしてこれらは以下に詳細に考察されている。
【００６５】
「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」とは、所定の制限部位でベクターに挿入され得る発現産物をコードする、配列をコードするＤＮＡ、またはＤＮＡのセグメントをいう。このカセット制限部位は、適切なリーディングフレームでカセットの挿入を確実にするように設計される。概して、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ以上の制限部位に挿入され、次いで、ベクターによって伝播性のベクターＤＮＡとともに宿主細胞に搬入される。挿入されたＤＮＡまたは付加されたＤＮＡ（例えば、発現ベクター）を有するＤＮＡのセグメントまたは配列はまた、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれ得る。共通のタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは一般に二本鎖ＤＮＡ（通常、細菌起源）の自己含有分子であり、プラスミドは、さらなる（外来の）ＤＮＡを容易に受容し得、そして適切な宿主細胞に容易に導入し得る。多数のベクター（プラスミドおよび真菌のベクターを含む）が、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における複製、および／または発現について記載されている。用語「宿主細胞」とは、細胞による物質の産生のために任意の方法において、選択、改変、形質転換、増殖もしくは使用、または操作される、任意の生物体の任意の細胞を意味する。例えば、宿主細胞は、特定の遺伝子（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）、タンパク質、または酵素を発現するために操作されるものであり得る。宿主細胞はさらに、以下に記載するスクリーニングまたは他のアッセイのために用いられ得る。宿主細胞は、インビトロで、または非ヒト動物（例えば、トランスジェニック動物、または一過性にトランスフェクトされた動物）における１つ以上の細胞において培養され得る。
【００６６】
用語「発現系」とは、例えば、ベクターに担持され、そして宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現に適切な条件下の宿主細胞および適合性ベクターを意味する。通常の発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｈｉ５、またはＳ２細胞）とＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓベクター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞）と発現系、および哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。例えば、ＯＳＣＡＲは、ＰＣ１２、ＣＯＳ−１、またはＣ２Ｃ１２細胞で発現され得る。他の適切な細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３Ｔ（ヒト腎臓細胞）、マウス初代筋芽細胞、およびＮＩＨ ３Ｔ３細胞が挙げられる。
【００６７】
用語「異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、天然には存在しないエレメントの組み合わせをいう。例えば、本発明は、ｒＲＮＡ配列、およびｒＲＮＡ配列の一部ではない異種ＲＮＡ配列を含むキメラＲＮＡ分子を含む。この文脈においては、異種ＲＮＡ配列とは、リボソームＲＮＡ配列内に天然には位置していないＲＮＡ配列をいう。あるいは、異種ＲＮＡ配列は、リボソームＲＮＡ配列内に天然に位置していてもよいが、天然に存在しないｒＲＮＡ配列中の位置に見出される。別の例として、異種ＤＮＡとは、細胞または細胞の染色体部位に天然には位置していないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、それが天然に作動可能に連結されている遺伝子とは異なる遺伝子と作動可能に連結されている調節エレメントである。
【００６８】
用語「変異体」および「変異」とは、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）における任意の検出可能な変化、またはこのような変化の任意のプロセス、機構もしくは結果を意味する。これは、遺伝子変異を含み、ここで遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）は変更され、任意の遺伝子またはＤＮＡが任意の変異プロセスから生じ、そして任意の発現産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質、または酵素）が、改変された遺伝子またはＤＮＡの配列によって発現される。用語「改変体」とは、改変した、または変更した遺伝子、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ、酵素、細胞など（すなわち、任意の変異体の種類）を示すために用いられ得る。例えば、本発明は、ｒＲＮＡ配列を含む、変更した、または「キメラ」のＲＮＡ分子に関する。この分子は、天然にはその配列の一部でないか、または天然にはそのｒＲＮＡ配列の位置に配置されていない異種ＲＮＡ配列を挿入することによって変更されている。このようなキメラＲＮＡの配列、ならびにそれをコードするＤＮＡおよび遺伝子はまた、本明細書において「変異体」配列とも呼ばれる。
【００６９】
本明細書において用いる場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一般には少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド以上の核酸であって、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし得る核酸をいう。オリゴヌクレオチドは、例えば、３２Ｐヌクレオチド、または標識（例えば、ビオチンまたは蛍光色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５））が共有結合したヌクレオチドで標識され得る。１実施形態において、標識されたオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いられ得る。別の実施形態において、オリゴヌクレオチド（その１つまたは両方が標識され得る）は、ＯＳＣＡＲの全長またはフラグメントをクローニングするためか、またはＯＳＣＡＲをコードする核酸の存在を検出するためのいずれかのために、ＰＣＲプライマーとして用いられ得る。さらなる実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＯＳＣＡＲ ＤＮＡ分子と三重螺旋を形成し得る。概して、オリゴヌクレオチドは合成的に、好ましくは核酸シンセサイザー（合成器）で調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、天然には存在しないリン酸エステルアナログ結合（例えば、チオエステル結合など）を用いて調製され得る。
【００７０】
本発明は、ＯＳＣＡＲ遺伝子またはその遺伝子産物の発現を阻害するために用いられ得る、アンチセンス核酸（リボザイムを含む）を提供する。「アンチセンス核酸」は、一本鎖核酸分子であり、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子における相補的な塩基と細胞質条件下でのハイブリダイゼーションの際に、後の役割を阻害する。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写物である場合、アンチセンス核酸分子は、逆転写物（ｃｏｕｎｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）、またはｍＲＮＡを妨害する相補的核酸である。現在用いられているとおり、「アンチセンス」は、広義には、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、三重螺旋相互作用、リボザイムおよびＲＮａｓｅ−Ｈ媒介停止を含む。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現のために組み換え遺伝子によってコードされ得る（例えば、米国特許第５，８１４，５００号；米国特許第５，８１１，２３４号）か、あるいは合成的に調製され得る（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号）。本発明のアンチセンス核酸分子の他の特異的な例は、以下に提供される。
【００７１】
本発明のために想定される合成オリゴヌクレオチドの特定の非限定的な例としては、上記の核酸部分に加えて、ホスホロチオエート、ホスホロトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子または複素環式糖間連結を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。最も好ましいのは、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２の骨格（ここでホスホジエステルは、ＯＰＯ２−Ｏ−ＣＨ２である）を有するものである。米国特許第５，６７７，４３７号は、芳香族複素環オリゴヌクレオチド連結を記載している。窒素リンカーまたは窒素を含む基がまた、オリゴヌクレオチド模倣物を調製するために用いられ得る（米国特許第５，７９２，８４４号、および同第５，７８３，６８２号）。米国特許第５，６３７，６８４号は、ホスホラミダイトおよびホスホロチオアミダイトのオリゴマー化合物を記載している。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、想定される（米国特許第５，０３４，５０６号）。他の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格が、ポリアミド骨格と置換され得、この塩基は、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に対して直接または間接的に結合される（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７，１９９１）。他の合成オリゴヌクレオチドは、２’位置で以下のうちの１つを含む置換糖部分を含み得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここで、ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−；Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；フルオレセイン部分；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基に代わってシクロブチルまたは他の炭素環のような糖模倣物を有し得る。アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、およびウリジン以外のヌクレオチド（例えば、イノシン）を有するヌクレオチド単位が、オリゴヌクレオチド分子において用いられ得る。
【００７２】
核酸分子は、この核酸分子の一本鎖形態が、適切な条件の温度および溶液イオン強度の下で他の核酸分子にアニーリングし得る場合、別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸についての予備的なスクリーニングについて、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（５５℃のＴｍ（融点）に相当する）を用い得る（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアルデヒドなし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。中度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、さらに高いＴｍに相当する（例えば、４０％ホルムアミドとともに５×ＳＣＣまたは６×ＳＣＣ）。高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、最高のＴｍに相当する（例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣまたは６×ＳＣＣ）。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が、相補的な配列を含むことが必要であるが、これは、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存し、塩基間のミスマッチは可能である。核酸をハイブリダイズするために適切なストリンジェンシーは、当該分野で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きくなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリダイズのためのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順番で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長より大きいハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための式が導びかれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０−９．５１を参照のこと）。さらに短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）でのハイブリダイゼーションのためには、ミスマッチの位置がさらに重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７−１１．８を参照のこと）。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり；そしてより好ましくは、この長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００７３】
特定の実施形態において、用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」とは、５５℃のＴｍをいい、そして上記のような条件を利用する。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃である；さらに好ましい実施形態において、Ｔｍは６５℃である。特定の実施形態において、「高ストリンジェンシー」とは、０．２×ＳＳＣ中の６８℃で、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃での、またはこれらの２つのいずれかの条件下で観察されるハイブリダイゼーションに等価なハイブリダイゼーションのレベルを提供する条件下のハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件をいう。
【００７４】
オリゴヌクレオチドに適切なハイブリダイゼーション条件（例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー）は、オリゴヌクレオチドのより低い融点によって、代表的に全長核酸（例えば、全長ｃＤＮＡ）とはいくぶん異なる。オリゴヌクレオチドの融点は、含まれたオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するので、適切なハイブリダイゼーション温度は、用いられるオリゴヌクレオチド分子に依存して変化する。例示的な温度は３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドについて）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドについて）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドについて）であり得る。オリゴヌクレオチドの例示的な適切なハイブリダイゼーション条件としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄、または等価なレベルのハイブリダイゼーションを提供する他の条件が挙げられる。
【００７５】
（ＯＳＣＡＲポリペプチド）
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、上記で規定されている。１つの好ましいＯＳＣＡＲポリペプチドは、約２６４アミノ酸残基長の配列を含み、そして好ましくは約１６アミノ酸残基長のシグナルペプチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、約２４８アミノ酸残基長の配列を含み得、そしてシグナルペプチド配列は含まない。２つの実施形態のポリペプチドは、それぞれ、約２８．７ｋＤａおよび約２７．０ｋＤＡの推定分子量（アミノ酸配列から算出した）を有し得る。なお他の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、例えば、グリコシル化によって改変され得る。このような実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのみかけの分子量は、そのアミノ酸配列のみによって算出した分子量とは異なり得る。例えば、好ましい実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドは、３５ｋＤａまたは４０ｋＤａのみかけの分子量（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された）を有し得る。
【００７６】
上記のように、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、破骨細胞におけるその発現パターンによって特徴付けられ得る。詳細には、ＯＳＣＡＲ遺伝子および本発明の遺伝子産物は好ましくは、破骨細胞においてのみ発現される（ＯＳＣＡＲポリペプチドを発現するように（例えば、下記の方法に従って）操作された宿主細胞を除いて）。詳細には、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは好ましくは、マクロファージおよび樹状細胞を含む、他の骨髄由来細胞においては発現されない。さらに、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは好ましくは、器官（筋、腎臓、脳、心臓、肝臓、小腸、胸腺、脾臓、およびリンパ球を含むがこれに限定されない）の他の細胞または組織においては発現されない。しかし、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドがこれらの細胞型および他の細胞型（このような細胞は、例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いて形質転換されている）によって発現され得ることが理解される。
【００７７】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、それらの特異的な生体活性によって特徴付けられ得る。詳細には、これらのポリペプチドは、以下の実施例において実証されるように、破骨細胞の成熟および活性を調節し得る。例えば、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドの投与により、骨芽細胞の存在下での、破骨細胞の成熟および活性を減少し得る（例えば、多核性の破骨細胞の減少した数によって決定される）。任意の特定の理論または活性の機構に束縛されることを望まないが、このようなポリペプチドは骨芽細胞によって産生されたＯＳＣＡＲリガンドに競合的に結合すると考えられる。このようなＯＳＣＡＲリガンドは、通常、破骨細胞によって発現されたＯＳＣＡＲポリペプチドに結合し、その結果、これらの破骨細胞の成熟が誘導される。従って、ＯＳＣＡＲリガンドに競合的に結合することによって、さらなるＯＳＣＡＲポリペプチドの投与が、破骨細胞のリガンド刺激を実際に防止する。
【００７８】
あるいは、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、破骨細胞によって発現される場合、ＯＳＣＡＲリガンドとの結合により、破骨細胞の成熟および／または破骨細胞の活性を増加する能力によって特徴付けされ得る。
【００７９】
一つの特異的な実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃに記載されるアミノ酸配列（配列番号３）を含む。このマウスのＯＳＣＡＲポリペプチドは、少なくとも５つの異なるドメインに対応する配列を含む：シグナルペプチド配列（配列番号３のアミン酸残基１〜１６を含む）；２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ配列番号３のアミノ酸残基１７〜１２２および１２３〜２２８を含む）；膜貫通ドメイン配列（配列番号３のアミノ酸残基２２９〜２４７を含む）；および細胞質テールドメイン（ｓｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ ｄｏｍａｉｎ）配列（配列番号３のアミノ酸残基２４８から２６４を含む）。これらのドメインのうちのいずれかを明確にするために特定されたアミノ酸残基の数は、おおよその数であることが理解される。
【００８０】
別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列を含む。詳細には、本発明は、ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドの少なくとも５つのアイソフォーム（すなわち、改変体）を提供する。本明細書において、これらの改変体は、それぞれ、Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム（図３Ｂおよび配列番号７に記載される）、Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム（図４Ｂおよび配列番号９に記載される）；Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム（図５Ｂおよび配列番号１１に記載される）、ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームＳ１（図２４Ｂおよび配列番号２５に記載される）ならびにヒトＯＳＣＡＲアイソフォームＳ２（図２５Ｂおよび配列番号２７に記載される）をいう。
【００８１】
従って、一つの特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図３Ｂ（配列番号７）に記載されるアミノ酸配列を含む。このＣ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームは、少なくとも５つの異なるドメインに対応する配列を含む：シグナルペプチド配列（配列番号７のアミノ酸残基１〜１８を含む）、２つのＩｇ−様ドメイン配列（それぞれ配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２３および１２４〜２２９を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号７のアミノ酸残基２３０〜２４８を含む）；および細胞質テールドメイン配列（配列番号７のアミノ酸残基２４９〜２６３を含む）。
【００８２】
別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図４Ｂ（配列番号９）に記載されるアミノ酸配列を含む。このＣ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームはまた、少なくとも５つの異なるドメインに対応する配列を含む：シグナルペプチド配列（配列番号９のアミノ酸残基１〜１８を含む）、２つのＩｇ−様ドメイン配列（配列番号９のアミノ酸残基１９〜１２７および１２８〜２３３を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号９のアミノ酸残基２３４〜２５２を含む）；および細胞質テールドメイン配列（配列番号９のアミノ酸残基２５３〜２６７を含む）。
【００８３】
なお別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図５Ｂ（配列番号１１）に記載されるアミノ酸配列を含む。このＣ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームはまた、少なくとも５つの異なるドメインに対応する配列を含む：シグナルペプチド配列（配列番号１１のアミノ酸残基１〜１３を含む）、２つのＩｇ−様ドメイン配列（それぞれ配列番号１１のアミノ酸残基１４〜１１２および１１３〜２１８を含む）、膜貫通ドメイン配列（配列番号１１のアミノ酸残基２１９〜２３７を含む）；および細胞質テールドメイン配列（配列番号１１のアミノ酸残基２３８〜２５２を含む）。
【００８４】
なお別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図２４Ｂ（配列番号２５）に記載されるアミノ酸配列を含む。この実施形態は、上記の実施形態において見出される膜貫通ドメインを欠失する。
【００８５】
なお別の特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図２５Ｂ（配列番号２７）に記載されるアミノ酸配列を含む。この実施形態はまた、上記の実施形態において見出される膜貫通ドメインを欠失する。
【００８６】
別の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂ（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）に記載される全長ＯＳＣＡＲポリペプチドのような、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの１以上の個々のドメインのアミノ酸配列を含む。従って、例えば、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、配列番号３、７、９および１１に記載されるＯＳＣＡＲポリペプチドのいずれかについて上に記載される、シグナル配列ドメイン、いずれかのＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、これらの個々のドメインの任意の組み合わせに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む。これらのドメインのうちのいずれかを明確にするために特定されたアミノ酸残基の数は、おおよその数であることが理解される。
【００８７】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂ（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）に記載される全長ＯＳＣＡＲポリペプチドのいずれかのエピトープのような、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドのエピトープのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。ＯＳＣＡＲポリペプチドのエピトープは、ポリペプチド上の部位を表し、このポリペプチドに対して抗体が産生され得、そしてこのポリペプチドに抗体が結合する。従って、ＯＳＣＡＲエピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ＯＳＣＡＲタンパク質に対する抗体を作製するために有用である。好ましくは、エピトープは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、または５０個のアミノ酸残基長の配列を含む。従って、ＯＳＣＡＲタンパク質のエピトープを含む、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドは、好ましくは、ＯＳＣＡＲタンパク質配列の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または少なくとも５０個のアミノ酸残基の配列に対応するアミノ酸配列を含む。例えば、特定の好ましい実施形態において、このエピトープが、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂ（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）に記載されるＯＳＣＡＲポリペプチドのうちの一つのエピトープである場合、ＯＳＣＡＲポリペプチドは、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂ（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）に記載される配列の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または少なくとも５０個のアミノ酸残基の配列に対応するアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチド中のさらに他のフラグメントが、本明細書中で提供される。例えば、実施例（後述）は、図２Ｂに記載されるポリペプチド配列（配列番号５）をコードする、ＯＣＬ１７８と呼ばれるクローンを提供する。このポリペプチドは、図１Ｃに記載される全長ポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸残基１６１〜２６５の配列に対応する。このようなフラグメントはまた、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチド中にある。
【００８９】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、全長ＯＳＣＡＲポリペプチド（例えば、配列番号３、７、９、１１、２５および２７）のアナログおよび誘導体を含む。本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログおよび誘導体は、上記のＯＳＣＡＲポリペプチドと同一の特徴または相同的な特徴を有する。
【００９０】
例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドの短縮型が提供され得る。このような短縮型は、特定の欠失を有するＯＳＣＡＲポリペプチドを含み得る。例えば、特定の実施形態において、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの１個以上のドメイン（例えば、シグナル配列ドメイン、１個以上のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質テールドメイン）に対応するアミノ酸残基は、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列から欠失され得る。好ましい実施形態において、本発明の短縮ＯＳＣＡＲポリペプチドは、シグナル配列ドメインが欠失されたか、そうでなければ除去されたポリペプチドであり、すなわち、シグナル配列ドメインを含まないポリペプチドである。
【００９１】
特定の実施形態において、誘導体は、機能的に活性であり、すなわち、この誘導体は、本発明の全長の野生型ＯＳＣＡＲポリペプチドに関連する、１個以上の機能的活性を示し得る。
【００９２】
ＯＳＣＡＲキメラ融合ポリペプチドが調製され得、ここで、この融合タンパク質のＯＳＣＡＲ部分は、ＯＳＣＡＲポリペプチドの１つ以上の特徴を有する。従って、このような融合ポリペプチドは、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドの実施形態を示す。例示的なＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドは、全長ＯＳＣＡＲアミノ酸配列、誘導体ＯＳＣＡＲアミノ酸配列または短縮ＯＳＣＡＲアミノ酸配列、およびＯＳＣＡＲポリペプチド配列のフラグメント（例えば、エピトープまたは１つ以上のドメインに対応するフラグメント）を含む融合物を含有する、ポリペプチドを含む。このような融合ポリペプチドはまた、マーカーポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＦＬＡＧ、ヒスチジンタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、赤血球凝集素、またはヒトＩｇＧのＦｃ部分）を含み得る。他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドは、βガラクトシダーゼのような細菌性タンパク質で発現され得る。さらに、ＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドは、このポリペプチドの安定性を増加させるアミノ酸配列を含み得る（例えば、チオレダクターゼアミノ酸配列または１つ以上の免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２）の配列）。
【００９３】
ＯＳＣＡＲアナログまたは改変体はまた、例えば、置換、添加または欠失によりコードする核酸分子を改変することによって作製され得る。好ましくは、このような改変された核酸分子は、機能的に類似の分子（すなわち、１つ以上のＯＳＣＡＲ機能を実施するか、または１つ以上のＯＳＣＡＲ生体適合性を有する分子）をコードする。従って、特定の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログは、機能保存的な改変体である。
【００９４】
ポリペプチドの「機能保存的な改変体」は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体のコンホメーションおよび／または機能（例えば、生体適合性）を改変することなく変えられた、ポリペプチドの改変体である。このような変化としては、同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性度、アルカリ度、疎水性、芳香族性などの類似の特性）を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換が上げられるが、これらに限定されない。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジン（これに限定されない）は、親水性塩基性アミノ酸であり、そして交換可能であり得る。同様に、イソロイシン（疎水性アミノ酸）は、ロイシン、メチオニンまたはバリンで置換され得る。このような変化は、タンパク質またはポリペプチドのみかけの分子量または等電点にほとんど影響を有さないか、または全く影響を有さない。
【００９５】
本明細書中において、保存されているとして特異的に同定されるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、タンパク質またはポリペプチドの改変体とは異なり得る。従って、類似機能の任意の２種のＯＳＣＡＲポリペプチド間で、タンパク質またはアミノ酸配列の類似性の割合は変化し得る。代表的に、異なるＯＳＣＡＲポリペプチド改変体間での、タンパク質またはアミノ酸配列の類似性の割合は、アライメントスキーム（例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄおよび／またはＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズム）に従って決定される場合、７０％から９９％であり得る。「機能保存的な改変体」はまた、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される場合、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、このような機能保存的な改変体はまた、これらが比較されるネイティブなポリペプチドと、同一または類似の特性、機能または生体活性を有する。さらに、本発明の機能保存的な改変体は、本発明の全長ＯＳＣＡＲタンパク質の改変体（例えば、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂに記載の配列を含むＯＳＣＡＲポリペプチドの改変体（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）を含むだけでなく、改変された（例えば、短縮および欠失）ＯＳＣＡＲポリペプチドの機能保存的な改変体、および全長ＯＳＣＡＲタンパク質のフラグメント（例えば、ドメインまたはエピトープに対応する）を含む。
【００９６】
なお他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログは、ＯＳＣＡＲポリペプチドの対立遺伝子改変体または対立遺伝子変異体である。対立遺伝子改変体および対立遺伝子変異体という用語は、ポリペプチドを記載するために使用される場合、対立遺伝子改変体または対立遺伝子変異体の遺伝子によってコードされたポリペプチドをいう。従って、本発明の対立遺伝子改変体および対立遺伝子変異体のＯＳＣＡＲポリペプチドは、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子の、対立遺伝子改変体または対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００９７】
なお他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログは、同一の種（例えば、対立遺伝子改変体）または別の種（例えば、オルソログポリペプチド）；好ましくは、別の哺乳動物の種（例えば、マウス、ヒト、ラット、ウサギ、ハムスターまたはモルモット）由来の、実質的に相同性のポリペプチドである。しかし、本発明のＯＳＣＡＲホモログは、いくつかを挙げると、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、トリおよびゼノプスを含む任意の種由来であり得る。例えば、図３Ｂ（配列番号７）に記載されるＯＳＣＡＲポリペプチド配列は、ヒトＯＳＣＡＲオルソログであり、そして図１Ｃ（配列番号３）に記載されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチドに対して相同性である。図６に示される、これらの２つのアミノ酸配列のアライメントは、この２つの配列がかなりの配列同一性を共有することを実証する。詳細には、Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム（図６のｈＯＳＣＡＲ（配列番号７））のポリペプチド配列は、マウスＯＳＣＡＲポリペプチド配列（図６のｍＯＳＣＡＲ（配列番号３））に対して７４．６％（すなわち、約７５％）の同一性である。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、その全ての文法的な形態およびスペル変化において、用語「相同性」は、「共通の進化的起源」を有すると理解されるタンパク質間の関係をいい、これには、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質および異なる種由来の相同性タンパク質が挙げられる。例えば、Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ １９８７，５０：６６７を参照のこと。異なる種由来の対応するタンパク質は、「オルソログ」といわれる。相同性タンパク質およびオルソログタンパク質、ならびにそれらのコード遺伝子は、配列類似性によって示されるような、配列相同性を有する。このような配列類似性は、例えば、配列類似性の割合（例えば、アミノ酸配列の同一性または相同性の割合）、または保存された部分における、特異的アミン酸残基もしくはモチーフの割合によって示され得る。
【００９９】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的な形態において、核酸配列間またはアミノ酸配列間の、同一性または対応の程度をいう。本明細書中で他の述べられる場合を除いて、用語「相同性」は、単に、配列の類似性をいい、必ずしも共通の進化の起源に関するわけではない。
【０１００】
特定の実施形態において、このポリペプチドが本明細書中に開示されるアルゴリズムの一つによって決定される際に、少なくとも３５〜４０％、１以上の高度に保存されたドメインにおいてまたは対立遺伝子に対して、全アミノ酸配列にわたって、好ましくは少なくとも６０％、そして最も好ましくは少なくとも９０または９５％類似である場合、２つのポリペプチド配列は、「実質的に相同性」であるか、または「実質的に類似性」である。アミノ酸配列または核酸配列を比較するために使用され得る配列比較アルゴリズムは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＢＬＡＳＴ Ｘ）、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｎｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ＧＣＧ ＰａｋｃａｇｅのためのＰｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラムなどを含む。他に記載されなければ、本明細書中で言及される全ての配列の比較は、これらのアルゴリズムを用いて提供されるデフォルトパラメーターを使用してなされる。これらの配列の例は、本発明の特定のＯＳＣＡＲ遺伝子および遺伝子産物の、対立遺伝子改変体または種改変体であり、これは、例えば、図１Ｃ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂに示されるＯＳＣＡＲポリペプチド配列（それぞれ、配列番号３、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）の、対立遺伝子改変体または種改変体を含む。実質的に相同性である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して、配列を比較することによって同定され得る。
【０１０１】
他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドの改変体（アナログまたはホモログを含む）は、例えば、規定条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドである。例えば、特定の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログおよび／またはホモログは、５０％のホルムアミドおよび５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣを含む高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＯＳＣＡＲ核酸配列（例えば、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２６Ａおよび２７Ａ（それぞれ、配列番号１、２、４、３０、および３１）、ならびに３Ａ、４Ａ、５Ａ、２４Ａ、および２５Ａ（それぞれ、配列番号６、８、１０、２６および２８））に記載されるコード配列のいずれか）の相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログおよび／またはホモログは、中程度にストリンジェントな条件下（すなわち、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣを含む４０％ホルムアミド）、または低ストリンジェンシー条件下（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％の乳剤、ホルムアミドなし、３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、または０．５％のＳＤＳ）で、ＯＳＣＡＲ核酸配列（例えば、それぞれ、図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａ、ならびに、配列番号１、２、４、６、８、１０、２６、２８、３０、および３１に記載のコード配列）の相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含み得る。
【０１０２】
さらに他の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアナログ、ホモログおよびオルソログを含む改変体は、改変体ＯＳＣＡＲ遺伝子を単離することによって（例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列を基礎に設計された短縮オリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって、そして、以下に記載されるようにして）同定され得る。
【０１０３】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドの誘導体としては、さらに、化学的に改変される、リン酸化ＯＳＣＡＲ、ミリスチル化ＯＳＣＡＲ、メチル化ＯＳＣＡＲ、および他のＯＳＣＡＲポリペプチドが挙げられるが、これらに限定する意味ではない。本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドはまた、例えば、ヨウ素もしくはリン（例えば、ＥＰ３７２７０７Ｂを参照のこと）または他の検出可能な分子（例えば、ビオチン、蛍光色素（例えば、Ｃｙ５またはＣｙ３）、金属イオンと複合体化するキレート剤、クロモホア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）またはフルオロホア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、金コロイド、ラテックスビーズのような粒子）で放射標識されるか、あるいは水性ポリマーに結合された、標識化した改変体を含む。
【０１０４】
ＯＳＣＡＲ核酸またはポリペプチドの、生物学的に活性な成分の化学的な改変体は、特定の状況下で、さらなる利点を提供し得る。例えば、Ｄａｖｉｓらに１９７０年１２月１８日に交付された米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。また総説に関して、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、１９８１）３６７〜３８３頁を参照こと。タンパク質の改変および融合タンパク質を記載する総説論文は、Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １９９２，３：４〜１０，Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ：Ｍｏｕｎｔｖｉｅｗ Ｃｏｕｒｔ，Ｆｒｉｅｒｎ Ｂａｒｎｅｔ Ｌａｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ Ｎ２０，ＯＬＤ，ＵＫに見出される。
【０１０５】
（ＯＳＣＡＲ核酸）
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子はまた、上に規定される通りであり、そしてＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびに上記の改変体（例えば、改変された塩基および／または骨格）のうちのいずれかを含有する核酸分子を含む。一般に、ＯＳＣＡＲ核酸分子は、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸配列の相補体、およびそれらのフラグメントを含む。従って、一つの好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、図１Ｃ（配列番号３）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、図１Ａおよび１Ｂ（それぞれ、配列番号１および２）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列）を含む。別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、図２６Ｂ（配列番号２９）に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列（例えば、図２６Ａ（配列番号３０）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列）を含む。なお別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、図２７Ｂ（配列番号３１）に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸配列（例えば、図２７Ａ（配列番号３２）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列）を含む。
【０１０６】
別の好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、上記のＣ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて、図３Ｂ（配列番号７）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、図３Ａ（配列番号６）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列を含む。好ましくは、この例示的なＯＳＣＡＲ配列（すなわち、図３Ａおよび配列番号６に示される例示的な配列）の核酸３２８は、グアニンである。しかし、例示的な代替実施形態において、核酸３２８は、チミンであり得る。
【０１０７】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、上記のＣ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて、図４Ｂ（配列番号９）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、図４Ａ（配列番号８）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列を含む。なお別の好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、上記のＣ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて、図５Ｂ（配列番号１１）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、図５Ａ（配列番号１０）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列を含む。
【０１０８】
別の好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、Ｓ１ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて、図２４Ｂ（配列番号２５）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、図２４Ａに記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列を含む。なお別の好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、Ｓ２ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて、図２５Ｂ（配列番号２７）に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、この配列は、図２５Ａ（配列番号２８）に記載される特定のＯＳＣＡＲ核酸配列を含む。
【０１０９】
なお他の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、ＯＳＣＡＲポリペプチドの１つ以上のドメイン（例えば、シグナル配列ドメイン、１つ以上のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質テールドメイン）をコードする核酸配列、またはＯＳＣＡＲポリペプチドのドメインの任意の組み合わせをコードする核酸配列を含む。
【０１１０】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子に対するゲノムＯＳＣＡＲヌクレオチド配列を含む。例えば、図７Ａ〜Ｄ（配列番号１２）は、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子のヌクレオチド配列を含むヒト第１９染色体の領域由来の配列を記載する。従って、これらのヌクレオチド配列を含む核酸分子は、本発明のＯＳＣＡＲ核酸中にある。例えば、一つの実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、表１（上述）に記載され、そして図７Ａ〜Ｄに例示される、１つ以上のイントロン配列またはエキソン配列由来のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、ＯＳＣＡＲ遺伝子のエキソンおよび／またはイントロンの組み合わせについてのヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子はまた、ＯＳＣＡＲポリペプチドのフラグメント（例えば、エピトープ）をコードする核酸配列も含み得る。このようなフラグメントは、例えば、図２Ａ（配列番号４）に記載される核酸配列をコードするポリヌクレオチド、および図２Ｂ（配列番号５）に記載されるポリペプチド配列をコードする他の核酸配列を含む。
【０１１２】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子はまた、改変されたＯＳＣＡＲポリペプチド（例えば、アミノ酸の置換、欠失または短縮を有するポリペプチド）のため、およびＯＳＣＡＲポリペプチドの改変体（同一の種および異なる種由来のアナログおよびホモログを含む改変体）のためのコード配列を含有する核酸分子を含む。好ましい実施形態において、このような核酸分子は、ＯＳＣＡＲコードヌクレオチド配列（例えば、図１Ａ−Ｂ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ−Ｄ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａに記載されるコード配列）（それぞれ、配列番号１−２、６、８、１０、１２、２６、２８、３０および３２）に対して、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７５％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。あるいは、本発明の核酸分子はまた、例えば、規定条件下でサザンブロットアッセイにおいて、ＯＳＣＡＲ核酸分子にハイブリダイズする核酸分子であり得る。例えば、特定の実施形態において、標識化したＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡは、１．６５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントおよび５．５ｋｂのＢｇｌ ＩＩフラグメントを含む、１つ以上のヒトゲノムフラグメントにハイブリダイズする。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、５０％のホルムアミドおよび５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣを含む高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図１Ａ−Ｂ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ−Ｄ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａに記載されるコード配列（それぞれ、配列番号１−２、６、８、１０、１２、２６、２８、３０および３２）のうちのいずれかのような、ＯＳＣＡＲ核酸配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、核酸分子は、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（すなわち、５×ＳＳＣまたは６×ＳＳＣを含む４０％ホルムアミド）、または低いストリンジェンシー条件下（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％の乳剤、ホルムアミドなし、３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、または０．５％のＳＤＳ）で、ＯＳＣＡＲ核酸配列（例えば、図１Ａ−Ｂ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ−Ｄ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａに記載されるコード配列）の相補体にハイブリダイズする。特定の好ましいハイブリダイゼーション条件は、低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、３０％ホルムアミド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，６、２．５×Ｄｅｎｈａｒｄ溶液、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳおよび１．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ***ＤＮＡ）中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続く低いストリンジェンシー洗浄緩衝液（例えば、０．５×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳ）を使用する、５０℃での洗浄（好ましくは、２回）を含む。例えば、下記の実施例は、マウスのフラグメントおよびヒトゲノムＤＮＡをＯＳＣＡＲクローンＯＳＬ１７８（配列番号４）由来のＯＳＣＡＲ核酸配列にハイブリダイズさせる実験を記載する。従って、このようなゲノム配列は、本発明のＯＳＣＡＲ核酸配列の一部である。
【０１１４】
あるいは、本発明の核酸分子は、同じように規定されたハイブリダイゼーション条件下で、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメント（例えば、図２Ａにおいて示されるフラグメント（配列番号４））の相補体に対してか、または図２Ｂに示されるＯＳＣＡＲポリペプチドフラグメント（配列番号５）をコードする別の核酸分子に対してハイブリダイズし得る。例えば、下記の実施例は、クローンＯＣＬ１７８中に含まれ、そして図２Ａ（配列番号４）に示されるＯＳＣＡＲ核酸フラグメントにハイブリダイズする、見かけ上４．０ｋｂ、１．８ｋｂおよび１．１ｋｂの長さのＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の同定を記載する。実施例はまた、ＯＣＬ１７８核酸にハイブリダイズするマウスゲノムＤＮＡフラグメントおよびヒトゲノムＤＮＡフラグメントの両方の同定を記載する。従って、このような核酸は、本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子の例示的な実施形態である。
【０１１５】
他の実施形態では、本発明の核酸分子は、全長ＯＳＣＡＲ配列のフラグメントを含む。例えば、好ましい実施形態において、このようなＯＳＣＡＲ核酸フラグメントは、全長をコードするＯＳＣＡＲヌクレオチド配列のなかの少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、およびより好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドの配列に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、このフラグメントは、図１Ａ〜Ｂ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ〜Ｄ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａ（それぞれ、配列番号１〜２、６、８、１０、１２、２６、２８、３０および３２）に示されるＯＳＣＡＲコード配列、または図１Ｃ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、２４Ｂ、２５Ｂ、２６Ｂおよび２７Ｂ（それぞれ、配列番号３、５、７、９、１１、２５、２７、２９および３１）に示されるポリペプチド配列をコードする他のヌクレオチド配列の部分（例えば、少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチドの部分）に対応する。
【０１１６】
他の好ましい実施形態では、ＯＳＣＡＲ核酸フラグメントは、全長をコードするＯＳＣＡＲ核酸配列（例えば、図１Ａ〜Ｂ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、７Ａ〜Ｄ、２４Ａ、２５Ａ、２６Ａおよび２７Ａに示される配列（それぞれ、配列番号１〜２、６、８、１０、１２、２６、２８、３０および３２））、またはそのフラグメント（例えば、図２Ａおよび配列番号４に示される配列）に対して相補的であり、および／またはハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、そしてより好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドの配列を含む。このようなオリゴヌクレオチドについて適切なハイブリダイゼーション条件は上記の通りであり、そして６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を含む。オリゴヌクレオチドの融解温度は、そのオリゴヌクレオチド配列の長さに依存するので、適切なハイブリダイゼーション温度は、使用されるオリゴヌクレオチド分子に応じて変動する。例示的な温度は、３７℃（１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、および６０℃（２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）である。
【０１１７】
本発明の核酸分子はまた、「キメラ」ＯＳＣＡＲ核酸分子を含む。このようなキメラ核酸分子は、少なくとも１つのＯＳＣＡＲ核酸配列（これは、上記の任意の全長ＯＳＣＡＲ核酸配列または部分的ＯＳＣＡＲ核酸配列であり得る）と、少なくとも１つの非ＯＳＣＡＲ核酸配列とを含むポリヌクレオチドである。例えば、非ＯＳＣＡＲ核酸配列は、別の非ＯＳＣＡＲ遺伝子に由来し、かつ天然に存在するＯＳＣＡＲ遺伝子と通常関連していない調節配列（例えば、プロモーター配列）であり得る。非ＯＳＣＡＲ核酸配列はまた、別の非ＯＳＣＡＲポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧ、ヒスチジンタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン、β−ガラクトシダーゼ、チオレダクターゼ、または免疫グロブリンのドメイン（１つまたは複数）（例えば、Ｆｃ領域））についてのコード配列であり得る。好ましい実施形態では、本発明のキメラ核酸分子は、本発明のＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドをコードする。
【０１１８】
このようなフラグメントを含む核酸分子は、例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする他の核酸分子（ＯＳＣＡＲアナログおよびＯＳＣＡＲホモログのような改変体ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする遺伝子を含む）を検出および増幅するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）として有用である。本発明のオリゴヌクレオチドフラグメントはまた、例えば、細胞におけるＯＳＣＡＲ遺伝子の発現または転写のレベルを調節するために、例えば、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチドとして、またはリボザイムとして、使用され得る。
【０１１９】
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子は、ゲノムＤＮＡであろうと、ｃＤＮＡであろうと、または他のものであろうと、任意の供給源（例えば、マウスおよびヒトのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーを含む）から単離され得る。ＯＳＣＡＲ遺伝子を得るための方法は、上記のように、当該分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９、前出、を参照のこと）。
【０１２０】
ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡから（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」から）、当該分野において公知の標準的な手順により獲得され得、そして好ましくは、そのタンパク質の高レベル発現を有する組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから（例えば、破骨細胞ライブラリー（なぜなら、これらの細胞は、最高レベルのＯＳＣＡＲ発現を示すため））から得られる。１つの好ましい実施形態では、下記の実施例において記載されるように、ＤＮＡを「サブトラクション」ライブラリーから得て、特定の細胞型により特異的に発現される遺伝子のｃＤＮＡについてライブラリーを富化する。例えば、下記の実施例において記載されるように、破骨細胞−マクロファージサブトラクションライブラリーが構築され得、ここでは、マクロファージによっても発現される、破骨細胞由来のｃＤＮＡのかなりの画分が取り除かれる。このようなサブトラクションライブラリーを使用することによって、破骨細胞により特異的に発現されかつマクロファージによっては発現されない遺伝子（例えば、ＯＳＣＡＲ）についてのｃＤＮＡを単離する可能性が高まり得る。他の実施形態では、ライブラリーを、化学合成によってか、ｃＤＮＡクローニングによってか、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローニングによって、調製し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．編，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．第Ｉ巻および第ＩＩ巻を参照のこと）。
【０１２１】
ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コード領域に加えて、調節ＤＮＡ領域およびイントロンＤＮＡ領域を含み得る。ｃＤＮＡ由来のクローンは、一般的に、イントロン配列を含まない。どのような供給源であろうと、遺伝子は、その遺伝子の増幅のために適切なベクターに分子クローニングされるべきである。所望のＯＳＣＡＲ遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグメントの同定は、多数の方法で達成され得る。例えば、下記に例示されるＯＳＣＡＲ遺伝子の部分が精製され得、そして標識化プローブを調製するために標識され得る（Ｂｅｎｔｏｎ＆Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７７，１９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ＆Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７５，７２：３９６１）。このプローブに対して実質的な相同性を有するＤＮＡフラグメント（例えば、別の個体由来の対立遺伝子改変体）が、ハイブリダイズする。特定の実施形態では、最も高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用して、相同性ＯＳＣＡＲ遺伝子を同定する。
【０１２２】
さらなる選択を、その遺伝子の特性に基づいて実施し得る（例えば、その遺伝子が、本明細書に開示されるＯＳＣＡＲタンパク質の等電点、電気泳動性、アミノ酸組成、部分的もしくは完全アミノ酸配列、抗体結合活性、またはリガンド結合プロフィールを有するタンパク質産物をコードするか否か）。このように、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的特性、化学的特性、免疫学的特性、または機能的特性に基づくアッセイにより検出され得る。
【０１２３】
ＯＳＣＡＲ遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が、本発明の実施において使用され得る。これらには、対立遺伝子改変体、種改変体、配列保存的改変体、および機能的改変体が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明の核酸配列は、「機能保存的改変体」および「配列保存的改変体」の両方を含む。核酸の機能保存的改変体とは、上記で規定されたような、ポリペプチドの機能保存的改変体をコードする核酸である。核酸の「配列保存的改変体」とは、異なるポリヌクレオチド配列を有するが同じアミノ酸配列をコードする核酸である。
【０１２４】
アミノ酸置換もまた導入されて、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換し得る。例えば、Ｃｙｓが、別のＣｙｓとジスルフィド架橋の可能性のある部位に導入され得る。
【０１２５】
本発明のＯＳＣＡＲの誘導体およびアナログをコードする遺伝子は、当該分野で公知の種々の方法によって生成され得る。その産生を生じさせる操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローン化されたＯＳＣＡＲ遺伝子配列は、当該分野で公知の任意の多数のストラテジーによって改変され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，前出）。配列は、制限エンドヌクレアーゼで適切な部位で切断され得、次いで、所望される場合にはさらに酵素的に改変され、単離され得、そしてインビトロで連結され得る。ＯＳＣＡＲの誘導体またはアナログをコードする遺伝子の生成においては、ＯＳＣＡＲ遺伝子と同じ翻訳読み取り枠内に改変された遺伝子が残り、所望される活性がコードされる遺伝子領域内において翻訳停止シグナルにより割り込まれないことを確実にするように注意がなされるべきである。
【０１２６】
さらに、ＯＳＣＡＲコード核酸配列は、インビトロまたはインビボで変異されて、翻訳開始配列および／または翻訳終結配列を作製および／または破壊するか、あるいはコード領域において改変を作製するか、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、あるいは既存の配列を破壊して、インビトロでのさらなる改変を容易にし得る。改変はまた、制限部位を導入するため、および発現ベクターへのＯＳＣＡＲ遺伝子のクローニングを容易にするためになされ得る。当該分野において公知の任意の変異誘発技術が使用され得、これらには、インビトロ部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１，１９７８；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＤＮＡ ３：４７９−４８８，１９８４；Ｏｌｉｐｈａｎｔら，Ｇｅｎｅ ４４：１７７，１９８６；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７１０，１９８６）ＴＡＢリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲ技術は、部位特異的変異誘発のために好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ」，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，第６章，６１〜７０頁を参照のこと）。
【０１２７】
次いで、同定されおよび単離された遺伝子は、適切なクローニングベクター中に挿入され得る。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用され得る。可能なベクターとしては、プラスミドまたは改変されたウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。しかしこのベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。ベクターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ、バクテリオファージ、例えば、λ誘導体、またはプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２誘導体またはｐＵＣプラスミド誘導体、例えば、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＲＳＥＴまたはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）あるいはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）など。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡフラグメントを連結することによって達成され得る。しかし、ＤＮＡを断片化するために使用される相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合には、このＤＮＡの末端が酵素的に改変され得る。あるいは、所望される任意の部位を、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって生成し得；連結されたこれらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドを含み得る。
【０１２８】
組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどを通して宿主細胞中に導入され得、その結果、この遺伝子配列の多数のコピーが生成される。好ましくは、クローン化された遺伝子は、シャトルベクタープラスミドに含まれる。シャトルベクタープラスミドは、クローニング細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における増幅、および適切な発現細胞株への引き続く挿入のための容易な精製（そのようなことが所望される場合）を提供する。例えば、１つより多くの型の生物において複製し得るベクターであるシャトルベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド由来の配列と、酵母２ｍプラスミド由来の配列とを連結することによって、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの両方における複製のために調製され得る。
【０１２９】
（ＯＳＣＡＲポリペプチドの発現）
ＯＳＣＡＲ、あるいはその抗原性フラグメント、誘導体もしくはアナログ、または機能的に活性な誘導体（そのキメラタンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。従って、本発明のＯＳＣＡＲをコードする核酸は、本発明の発現ベクター中においてプロモーターに作動可能に連結され得る。ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の両方が、このような調節配列の制御下でクローン化され得、そして発現され得る。このようなベクターを使用して、機能的または機能上、不活性にされたＯＳＣＡＲポリペプチドを発現し得る。
【０１３０】
必須の転写シグナルおよび翻訳シグナルが、組換え発現ベクターに提供され得る。
【０１３１】
あり得る宿主−ベクター系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：発現プラスミドでトランスフェクトされるか、またはウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなど）に感染される、哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染される、昆虫細胞系；酵母のような微生物（酵母ベクターを含む）；または、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換される、細菌。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性において変動する。利用される宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのうちのいずれか１つが使用され得る。
【０１３２】
ＯＳＣＡＲタンパク質の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得る。しかし、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能的でなければならない。ＯＳＣＡＲ遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２，１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような、原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１，１９７８）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５，１９８３）；また、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０を参照のこと；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えば、Ｇａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および、造血組織特異性を示す転写制御領域、特に：骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４，１９８６）、造血幹細胞分化因子プロモーター、エリスロポエチンレセプタープロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅら，Ｂｌｏｏｄ，１５：２５５７，１９９１）など。
【０１３３】
実際、任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、またはウイルスベクターを使用して、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の発現が所望される細胞または組織に導入され得る組換え核酸構築物を調製し得る。あるいは、特定の型の細胞または組織における組換えＯＳＣＡＲ遺伝子産物の発現が所望される場合、その所望される細胞型または組織型に選択的に感染するウイルスベクターが使用され得る。
【０１３４】
別の実施形態において、本発明は、細胞中における内因性ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために非内因性プロモーターを使用することによって、ＯＳＣＡＲポリペプチドを発現させる方法を提供する。細胞中における内因性ＯＳＣＡＲ遺伝子は、細胞のゲノム中に通常（すなわち、天然に）見出される、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子である。しかし、非内因性プロモーターは、遺伝子の発現を制御するために使用され得るが内因性ＯＳＣＡＲ遺伝子とは通常にも天然にも関連付けられない、プロモーターまたは他のヌクレオチド配列である。例示として、相同組換え方法が使用されて（好ましくは、タンパク質をコードしない本発明のＯＳＣＡＲ核酸配列を使用する）、内因性ＯＳＣＡＲ遺伝子の近位に増幅可能な遺伝子または他の調節配列を挿入し得る。次いで、挿入された配列は、例えば、その細胞において通常生じるレベルよりも高いレベルのＯＳＣＡＲ遺伝子発現を提供するためか、または（例えば、破骨細胞において）ＯＳＣＡＲ遺伝子発現の正常レベルを妨げる内因性ＯＳＣＡＲ調節配列における１以上の変異を克服するために使用され得る。このような相同組換え方法は、当該分野で周知である。例えば、国際特許公開ＷＯ ９１／０６６６６（Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉによる；１９９１年５月１６日公開）；国際特許公開ＷＯ ９１／０９９５５５（Ｃｈａｐｐｅｌによる；１９９１年７月１１日公開）；および国際特許公開ＷＯ ９０／１４０９２（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＣａｍｐｂｅｌｌによる；１９９０年１１月２９日公開）を参照のこと。
【０１３５】
タンパク質の可溶性形態は、培養液を収集することか、または界面活性剤での処理（および所望される場合には、上記のような超音波処理または他の機械的プロセス）によって封入体を可溶化することによって獲得され得る。可溶化または可溶性のタンパク質は、種々の技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、等電点電気泳動、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的可溶性、免疫沈降、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術による）を使用して、単離され得る。
【０１３６】
（発現ベクター）
広範な種々の宿主／発現ベクターの組合わせが、本発明のＤＮＡ配列を発現させるにおいて使用され得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、以下が挙げられる：ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌性プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１（例えば、ＮＭ９８９）および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ）の多数の誘導体；酵母プラスミド（例えば、２ｍプラスミド）またはその誘導体；真核生物細胞において有用なベクター（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクター）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するために改変されたプラスミド）；など。
【０１３７】
好ましいベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および所望される細胞親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有する他の組換えウイルス）である。従って、機能的または変異体ＯＳＣＡＲタンパク質またはそのポリペプチドドメインフラグメントをコードする遺伝子は、ウイルスベクターを使用してかＤＮＡの直接的な導入を通して、インビボ、エキソビボ、またはインビトロで導入され得る。標的化された組織における発現は、特定の細胞にトランスジェニックベクターを標的化することによって（例えば、ウイルスベクターまたはレセプターリガンドを用いて）か、もしくは組織特異的プロモーターを使用することによってか、または両方によって、もたらされ得る。標的化遺伝子送達は、国際特許公開ＷＯ９５／２８４９４（１９９５年１０月公開）に記載されている。
【０１３８】
本発明に従って、ベクターは、例えば、ＯＳＣＡＲ特異的抗体（すなわち、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に特異的に結合する抗体）を使用してか、またはＯＳＣＡＲ結合パートナー（例えば、ＯＳＣＡＲ特異的リガンド）を使用して、破骨細胞に特異的に標的化され得る。ベクターはまた、ＯＳＣＡＲ結合パートナーのフラグメント（例えば、ペプチドまたはポリペプチドのフラグメント）、特に、ＯＳＣＡＲ結合配列を含むフラグメントを使用して、破骨細胞に特異的に標的化され得る。このような方法を使用して、破骨細胞に、任意の遺伝子を発現するベクター（ＯＳＣＡＲ特異的アンチセンス核酸またはＯＳＣＡＲ特異的リボザイムを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない）を標的化し得る。
【０１３９】
同様に、本発明はまた、標的化実体（ｅｎｔｉｔｙ）としてＯＳＣＡＲポリペプチドを使用することによる、破骨細胞および胚性線維芽細胞ならびに細胞表面上にＯＳＣＡＲ特異的リガンドまたはＯＳＣＡＲ結合パートナーを発現する他の細胞（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＳＴ２、Ｍｌｇ、ＵＭＲ１０６、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ｈＦＯＢｌ．１９、およびＣＯＳ−１細胞）の特異的標的化を可能にする。
【０１４０】
インビボまたはエキソビボでの標的化および治療手順のために通常使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築する方法および使用する方法は、当該分野で公知である（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０，１９９２を参照のこと）。好ましくは、ウイルスベクターは、複製欠損性（すなわち、それらは、標的細胞において自律的に複製し得ない）である。一般的に、本発明の範囲内において使用される複製欠損性ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞におけるウイルスの複製に必須である少なくとも１つの領域を欠く。これらの領域は、当業者に公知の任意の手順によって、排除（完全または部分的に）されるか、非機能的にされるかのいずれかであり得る。これらの技術としては、完全な除去、置換（他の配列による（特に、挿入された核酸による））、（複製のために）必須の領域に対する１以上の塩基の部分的な欠失または付加が挙げられる。このような技術は、遺伝子操作の技術を使用してか、または変異原性薬剤での処理によって、インビトロ（単離されたＤＮＡにおいて）かインサイチュで実施され得る。好ましくは、複製欠損性ウイルスは、ウイルス粒子のキャプシド形成に必須であるそのゲノムの配列を保持する。
【０１４１】
ＤＮＡウイルスベクターとしては、弱毒化ＤＮＡウイルスまたは欠損性ＤＮＡウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など（しかしこれらに限定されない））が挙げられる。完全またはほぼ完全にウイルス遺伝子を欠く欠損性ウイルスが好ましい。欠損性ウイルスは、細胞への導入後に感染性ではない。欠損性ウイルスベクターの使用は、そのベクターが他の細胞に感染し得るという懸念を伴わずに、特定の局在化された領域における細胞への投与を可能にする。従って、特定の組織が特異的に標的化され得る。特定のベクターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：欠損性ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０，１９９１）、グリコタンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠損性ヘルペスウイルスベクター（特許公開ＲＤ ３７１００５ Ａ）、または他の欠損性ヘルペスウイルスベクター（国際特許公開ＷＯ ９４／２１８０７（１９９４年９月２９日公開）；国際特許公開ＷＯ ９２／０５２６３（１９９４年４月２日公開））；弱毒化アデノウイルスベクター、例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔらにより記載されたベクター（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２；Ｌａ Ｓａｌｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０，１９９３もまた参照のこと）；およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１，１９８７；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８，１９８９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６，１９８８）。
【０１４２】
種々の企業が、市販でウイルスベクターを製造する。この企業には、以下が挙げられるが、決してこれらに限定されないＡｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，ＰＡ；アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクターおよびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター），およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルスベクター、ワクシニアベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクター）。
【０１４３】
別の実施形態では、ベクターは、リポフェクションによってか、裸のＤＮＡとしてか、または他のトランスフェクション促進因子（ペプチド、ポリマーなど）を用いて、インビボで導入され得る。合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７，１９８７；ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８，１９８９；Ｍａｃｋｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１，１９８８；Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８，１９９３を参照のこと）。核酸の移入のために有用な脂質化合物および組成物は、ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。脂質は、標的化の目的のために、他の分子に化学的に結合され得る（Ｍａｃｋｅｙら，前出を参照のこと）。標的化されたペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）およびタンパク質（例えば、抗体）または非ペプチド分子が、化学的にリポソームに結合され得る。他の分子もまた、インビボでの核酸のトランスフェクションを容易にするために有用である（例えば、カチオン性オリゴヌクレオチド（例えば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）を参照のこと）。
【０１４４】
裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでベクターを導入することもまた可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当該分野で公知の方法（例えば、エレクトロポレーション、微量注入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用（例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７，１９９２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４，１９８８；Ｈａｒｔｍｕｔら，カナダ国特許出願番号２，０１２，３１１（１９９０年３月１５日出願）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０，１９９１を参照のこと））によって、所望される宿主細胞に導入され得る。レセプター媒介性のＤＮＡ送達アプローチもまた使用され得る（Ｃｕｒｉｅｌら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７）。米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号は、哺乳動物における、トランスフェクション促進因子を使用しない外因性ＤＮＡ配列の送達を開示する。近年、電気的転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）と称される、比較的低電圧で高効率のインビボＤＮＡ転写技術が記載された（Ｍｉｒら，Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３２１：８９３，１９９８；ＷＯ ９９／０１１５７；ＷＯ ９９／０１１５８；ＷＯ ９９／０１１７５）。
【０１４５】
好ましくは、インビボ投与について、ウイルスベクターおよびトランスフェクト細胞の免疫学的不活性化を回避するために、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）と組合わせて、適切な免疫抑制処置を使用する。例えば、免疫抑制性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−γ）、または抗ＣＤ４抗体）を投与して、ウイルスベクターに対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答をブロックし得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９５を参照のこと）。これに関して、最少数の抗原を発現するように操作されたウイルスベクターを使用することが有利である。
【０１４６】
（ＯＳＣＡＲに対する抗体）
ＯＳＣＡＲに対する抗体は、特に、以下に示されるようなＯＳＣＡＲ活性の診断および細胞内調節のために有用である。本発明に従って、組換え的または化学合成によって生成されたＯＳＣＡＲポリペプチド、およびそのフラグメントまたは他の誘導体もしくはアナログ（融合タンパク質を含む）が、ＯＳＣＡＲポリペプチドを認識する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、好ましくは、ヒトＯＳＣＡＲまたはマウスＯＳＣＡＲに特異的である（すなわち、これらに特異的に結合する）。しかし、あるいは、抗体は、いくつかの他の生物種（好ましくは、哺乳動物種）由来のＯＳＣＡＲオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）に特異的であり得る。抗体は、ＯＳＣＡＲの変異体形態もしくは野生型ＯＳＣＡＲ、または両方を認識し得る。
【０１４７】
当該分野で公知の種々の手順が、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはその誘導体もしくはアナログに対するポリクローナル抗体を生成するために使用され得る。抗体の生成のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない）に、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはその誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）での注射により免疫し得る。１つの実施形態では、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはそのフラグメントを、免疫原性キャリア（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合体化し得る。種々のアジュバントを使用して、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させ得、これらには、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
ＯＳＣＡＲポリペプチド、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製について、培養物中で無限継代培養細胞株による抗体分子の調製を提供する任意の技術が、使用され得る。これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって元々開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ １９７５，２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９８３，４：７２；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８３，８０：２０２６−２０３０）およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５，ｐｐ７７−９６）。本発明のさらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、無菌動物において生成され得る（国際特許公開番号ＷＯ８９／１２６９０）。実際、本発明に従って、ＯＳＣＡＲポリペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる、「キメラ抗体」を生成するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４，１５９：８７０；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １９８４，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１４：４５２−４５４）が、使用され得る；このような抗体は、本発明の範囲内である。このようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体は、ヒト疾患または障害（下記）の治療における使用のために好ましい。なぜなら、ヒト抗体またはヒト化抗体は、それら自体で免疫応答、特にアレルギー応答を異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）抗体よりも誘導する可能性がはるかに低いからである。
【０１４９】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得るＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって生成され得るＦａｂフラグメント。
【０１５０】
本発明に従って、単鎖抗体の生成について記載される技術（米国特許第５，４７６，７８６号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号）は、ＯＳＣＡＲポリペプチド特異的単鎖抗体を生成するために適応され得る。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載される技術（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９，２４６：１２７５−１２８１）を利用して、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはその誘導体もしくはアナログに対する所望の特異性を有するモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定し得る。
【０１５１】
抗体の生成および使用において、所望の抗体についてスクリーニングするかまたは所望の抗体を用いて試験することは、当該分野において公知の技術によって達成され得る（例えば、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射性アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド標識、酵素標識または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど）。１つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体は、二次抗体、または一次抗体に対する試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は標識される。免疫アッセイにおける結合を検出するための多くの手段が、当該分野において公知であり、これらは、本発明の範囲内である。例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含むＯＳＣＡＲポリペプチドフラグメントに結合する産物について、生成されたハイブリドーマをアッセイし得る。特定種の動物由来のＯＳＣＡＲポリペプチドに対して特異的な抗体の選択について、その種の動物の細胞によって発現されたかまたはその種の動物から単離されたＯＳＣＡＲポリペプチドとの陽性結合に基づいて、選択され得る。
【０１５２】
前述の抗体は、ＯＳＣＡＲポリペプチドの局在および活性に関する分野において公知の方法（例えば、上記または当該分野において公知の検出技術のいずれかを使用するウエスタンブロッティング、インサイチュでのＯＳＣＡＲポリペプチドの画像化、適切な生理学的サンプルにおけるそのレベルの測定など）において使用され得る。このような抗体はまた、（例えば、米国特許第５，６７９，５８２号に記載されるような）リガンド結合についてのアッセイにおいて使用され得る。抗体結合は、一般に、生理学的条件下（例えば、約７と８との間のｐＨ、および生理学的イオン強度）で最も容易に生じる。緩衝化溶液中にキャリアタンパク質が存在すると、アッセイが安定化する。最適な条件の乱れ（例えば、イオン強度、温度もしくはｐＨの増加もしくは減少、または界面活性剤もしくはカオトロピック塩の添加）をいくらか寛容するとはいえ、このような乱れは、結合安定性を減少する。
【０１５３】
さらに他の実施形態において、抗ＯＳＣＡＲ抗体をまた使用して、パニングまたは関連した免疫吸着技術によってＯＳＣＡＲポリペプチドを発現する細胞（例えば、破骨細胞）を単離し得る。
【０１５４】
特定の実施形態において、ＯＳＣＡＲポリペプチドの活性に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体が生成され得る。特に、細胞内単鎖Ｆｖ抗体を使用して、ＯＳＣＡＲ活性を調節（阻害）し得る（Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９３，９０：７８８９−７８９３；Ｃｈｅｎ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ １９９７，３：１６０−１６７；Ｓｐｉｔｚら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９６，１６：３４１５−２２；Ｉｎｄｏｌｆｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：６３４−６３５；Ｋｉｊｍａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９５，６８：２４７−２６７）。このような抗体は、リガンドを同定するために下記のアッセイを使用して試験され得る。
【０１５５】
抗体をまた使用して、下記のスクリーニングアッセイの項に考慮されるような免疫毒素を作製し得る。
【０１５６】
（トランスジェニック動物を使用するインビボ試験）
トランスジェニック哺乳動物は、ＯＳＣＡＲの分子機構、特に、ＯＳＣＡＲ誘導性シグナル伝達を評価するために調製され得る。このような哺乳動物は、薬物候補をスクリーニングまたは試験するための優れたモデルを提供する。従って、ヒトＯＳＣＡＲ「ノックイン」哺乳動物は、ヒト被験体で起こり得るこの系の分子生物学をより詳細に評価するために調製され得る。また、「ノックアウト」動物において化合物または疾患を、例えば、ＯＳＣＡＲ活性における欠損を補填しえる化合物を同定するために評価し得る。両方の技術は、細胞ゲノム中の天然の位置における一単位の遺伝情報の操作を可能にし、そして終末分化した生物のバックグラウンドにおける操作の結果を試験することを可能にする。トランスジェニック哺乳動物は、以下が挙げられるがこれらに限定されない任意の方法によって調製され得る：胚性幹（ＥＳ）細胞の改変および芽細胞へのヘテロ核の注入。
【０１５７】
「ノックイン」哺乳動物は、内因性遺伝子が異種遺伝子と置換されている哺乳動物である（Ｒｏａｍｅｒら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．１９９１，３：３３１）。好ましくは、異種遺伝子は、同種遺伝子の発現または機能のいずれかの評価の目的で、目的の遺伝子座に「ノックイン」される（この場合、この遺伝子はレポーター遺伝子であり得る；Ｅｌｅｇａｎｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８，９５：１１８９７を参照のこと）。これにより、異種遺伝子発現を、適切なプロモーターからの転写に関連付ける。これは、変異組換え部位（Ａｒａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９７，２５：８６８）またはＰＣＲ（ＺｈａｎｇおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９８，２５：７８４）を使用する、相同組換え、トランスポゾン（ＷｅｓｔｐｈａｌおよびＬｅｄｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９７，７：５３０）により達成され得る。
【０１５８】
「ノックアウト哺乳動物」は、遺伝子ターゲティングの方法（例えば、米国特許第５，７７７，１９５号および同第５，６１６，４９１号を参照のこと）によって不活化された特定の遺伝子をそのゲノム内に含む哺乳動物（例えば、マウス）である。ノックアウト哺乳動物は、ヘテロ接合性ノックアウト（すなわち、一方が不完全な対立遺伝子であり、一方が野生型対立遺伝子である）およびホモ接合性変異体の両方を含む。ノックアウト哺乳動物の調製は、まず、特定の遺伝子の発現を抑制するために使用される核酸構築物を、胚性幹細胞と称される未分化細胞型に導入することを必要とする。次いで、この細胞は、哺乳動物胚内に注入される。次いで、組み込まれた細胞を有する哺乳動物胚は、妊娠の持続期間にわたって乳母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）内に移植される。Ｚｈｏｕら（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５，９：２６２３−３４）は、ＰＰＣＡノックアウトマウスを記載する。
【０１５９】
用語「ノックアウト」は、細胞内の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現を部分的にかまたは完全に抑制することをいう。用語「ノックアウト構築物」は、細胞内の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の発現を減少または抑制するように設計されている核酸配列をいう。ノックアウト構築物として使用される核酸配列は、代表的には、以下からなる：（１）抑制されるべき遺伝子のいくつかの部分由来のＤＮＡ（エキソン配列、イントロン配列および／またはプロモーター配列）、ならびに（２）細胞におけるノックアウト構築物の存在を検出するために使用されるマーカー配列。ノックアウト構築物は、細胞内に挿入され、そしてネイティブなＤＮＡ配列の転写を阻止または妨害するような位置において、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。このような挿入は、通常相同組み換えによって生じる（すなわち、ノックアウト構築物が細胞内に挿入される場合、内因性ＤＮＡ配列に相同なノックアウト構築物の領域が互いにハイブリダイズして、このノックアウト構築物がこの内因性ＤＮＡの対応する位置に組み込まれるように組み換える）。ノックアウト構築物核酸配列は、以下を含み得る：１）抑制されるべき遺伝子の１以上のエキソンおよび／またはイントロンの全長配列または部分配列、２）抑制されるべき遺伝子の全長プロモーター配列または部分プロモーター配列、あるいは３）これらの組合わせ。代表的には、ノックアウト構築物は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入され、そして、通常相同組換えのプロセスによってＥＳ細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれる。次いで、このＥＳ細胞は、発達中の胚に注入され、そして発達中の胚に組み込まれる。
【０１６０】
句「遺伝子の破壊」および「遺伝子破壊」は、その遺伝子の野生型または天然に存在する配列と比較して、細胞中のその遺伝子の発現を減少または阻止するように、ネイティブＤＮＡ配列の１つの領域（通常、１以上のエキソン）および／または遺伝子のプロモーター領域に核酸配列を挿入することをいう。例示の目的で、核酸構築物は、破壊されるべきＤＮＡ配列（プロモーター領域および／またはコード領域）に相補的なＤＮＡ配列に挿入される抗生物質耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含んで調製され得る。次いで、この核酸構築物が細胞内にトランスフェクトされる場合、この構築物は、ゲノムＤＮＡ内に組み込まれる。従って、この細胞の多くの子孫は、そのＤＮＡが今や抗生物質耐性遺伝子によって破壊されているので、少なくともいくつかの細胞においてその遺伝子をもはや発現しないか、または減少したレベルでその遺伝子を発現する。
【０１６１】
一般に、相同組み換えについて、ＤＮＡは、少なくとも約１キロベース（ｋｂ）長であり、好ましくは３〜４ｋｂ長であり、これによりノックアウト構築物がＥＳ細胞のゲノムＤＮＡ内に導入される場合、組み換えのための相補的な配列が十分提供される（下記に考慮される）。
【０１６２】
２以上の遺伝子がノックアウトまたはノックインされているか、あるいはその両方である哺乳動物は、本発明の範囲内である。このような哺乳動物は、各ノックアウト構築物を生成するために本明細書中で記載される手順を反復することによってか、または単一遺伝子ノックアウトを有する各哺乳動物を互いに交配しそして二重ノックアウト遺伝子型を有する哺乳動物をスクリーニングすることによって生成され得る。
【０１６３】
調節されたノックアウト動物は、種々の系を使用して調製され得る。例えば、ｔｅｔ−リプレッサー系（米国特許第５，６５４，１６８号を参照のこと）またはＣｒｅ−Ｌｏｘ系（米国特許第４，９５９，３１７号および同第５，８０１，０３０号を参照のこと）。
【０１６４】
別の系列の実施形態において、トランスジェニック動物が作製される。ここでは、（ｉ）ヒトＯＳＣＡＲがトランスジェニック動物のゲノム内に安定に挿入されており；および／または（ｉｉ）内因性ＯＳＣＡＲ遺伝子が不活化され、そしてこれらのヒト対応物と置換されている（例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９７，１７：４０４；Ｅｓｔｈｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６，７４：９５３；Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ．Ｓｕｐｐｌ．１９９６，２：３６を参照のこと）。このような動物は、候補化合物を用いて処理され得、そして神経発生、神経変性、または候補治療化合物の効果についてモニターされ得る。
【０１６５】
（適用および使用）
ＯＳＣＡＲ遺伝子配列（ＯＳＣＡＲ遺伝子配列全長フラグメントを含む）、ＯＳＣＡＲポリペプチド（ＯＳＣＡＲタンパク質全長フラグメントおよびＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドを含む）についての種々の適用および使用、ならびにＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲポリペプレオチド（ＯＳＣＡＲ遺伝子およびタンパク質の全長フラグメントを含む）に対する抗体の種々の適用および使用が、本明細書中に記載される。このような適用は、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子、およびＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはＯＳＣＡＲポリペプチドに関連する骨増殖関連障害を評価するための予後的適用および診断的適用の両方を含み得、このような障害を有するかまたはこのような障害に対する素因を有する被験体の同定を含む。さらに、このような適用は、ＯＳＣＡＲ遺伝子、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物またはＯＳＣＡＲポリペプチドに関連する障害を処置するための方法、ならびにＯＳＣＡＲ遺伝子、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたはこれらの組み合わせのいずれかの合成、発現または活性を調節する化合物（天然のリガンドおよび他の細胞性化合物を含む）を同定するスクリーニング方法を含み得る。
【０１６６】
下記の実施例に実証されるように、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子、遺伝子産物およびポリペプチドは、破骨細胞の成熟を調節するその能力、および結果として、骨組織の増殖、修復、発達、吸収、分解およびホメオスタシスを調節する能力によって特徴付けられ得る。従って、好ましい実施形態において、本発明のＯＳＣＡＲ核酸およびポリペプチド、ならびにこのようなＯＳＣＡＲ核酸およびポリペプチドに対する抗体は、以下で使用され得る：骨増殖障害または骨増殖障害に対する素因を有する個体を同定するための予後的適用および診断的適用において；骨増殖関連障害を処置するための方法において；そして、破骨細胞の成熟および／または活性を調節する化合物（天然のリガンドおよび他の細胞性化合物および合成化合物を含む）を同定するためのスクリーニング方法、ならびに骨の増殖、修復、発達、吸収、分解またはホメオスタシスを調節する化合物（天然のリガンドおよび他の細胞性化合物および合成化合物を含む）を同定するためのスクリーニング方法において。
【０１６７】
（診断的適用）
種々の方法が、骨増殖関連障害（例えば、大理石骨病および骨粗鬆症）の診断的評価および予後的評価のために、ならびにこのような障害に対する素因を有する被験体の同定のために使用され得る。これらの方法は、上記のＯＳＣＡＲ核酸およびポリペプチド（これらのフラグメント、キメラおよび融合物を含む）のような試薬、ならびにこれらのポリペプチドに対する抗体を利用する。例えば、このような試薬は、特に以下に対して使用され得る：（１）細胞内のＯＳＣＡＲ遺伝子の重複または欠失の検出、ＯＳＣＡＲ遺伝子変異の存在、または影響されていない状態（すなわち、骨増殖関連障害を有していないか、または骨増殖関連障害を有する訴因がない被験体）における発現と比較して、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物（例えば、ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ）の過剰発現または過少発現のいずれかの検出；（２）罹患していない状態における量に対してＯＳＣＡＲ遺伝子産物の過剰量または過少量のいずれかの検出；そして（３）罹患していない状態に対して異常なＯＳＣＡＲ遺伝子産物活性の検出。
【０１６８】
好ましい実施形態において、このような試薬を使用して、骨増殖関連障害（例えば、大理石骨病または骨粗鬆症）を診断し得るか、または骨増殖関連障害を発症する被験体の素因を評価し得る。
【０１６９】
好ましい実施形態において、本明細書中に記載される方法は、予めパックされた診断キットを使用して実施される。このようなキットは、少なくとも１つの本発明の特定のＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲ特異的抗体試薬を備え得る。キットおよびそこに含まれる任意の試薬を、例えば、臨床設定に使用して、異常（例えば、骨増殖関連障害（例えば、大理石骨病または骨粗鬆症））を示す患者を診断し得る。
【０１７０】
個体由来の（任意の細胞型の）有核細胞を含むサンプルは、ゲノム核酸についての開始供給源として、そしてＯＳＣＡＲ遺伝子の変異を検出するために、このような診断方法に使用され得る。ＯＳＣＡＲ遺伝子が発現される任意の細胞型の細胞または任意の組織型の組織を含むサンプルはまた、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現もしくはＯＳＣＡＲ遺伝子産物（例えば、ＯＳＣＡＲタンパク質）の検出のため、ならびにＯＳＣＡＲ遺伝子もしくはＯＳＣＡＲ遺伝子産物を発現する細胞（特に、破骨細胞）を同定するためのこのような診断的方法において使用され得る。例えば、好ましい実施形態において、細胞によるＯＳＣＡＲ遺伝子またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物の発現は、その細胞が破骨細胞であることを示す。
【０１７１】
（ＯＳＣＡＲ核酸の検出）
サンプル中のＯＳＣＡＲ変異を検出するため、またはＯＳＣＡＲ核酸配列のレベルをアッセイするために、種々の方法が使用され得る。例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子内の変異は、当該分野において公知の多くの技術を利用することによって、および任意の有核細胞由来の核酸を用いて検出され得る。この核酸は、当業者にすでに周知の標準的核酸調製手順に従って単離され得る。
【０１７２】
ＯＳＣＡＲ核酸配列は、ＯＳＣＡＲ遺伝子構造を含む異常を検出するために、このような生物学的サンプルのハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。このような方法において検出され得る例示的な異常としては、点変異、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、逆位、転座および染色体再構築が挙げられる。これらの異常を検出するために使用され得る例示的アッセイとしては、サザン分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、一本鎖構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）多型分析（ＳＳＣＰ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析が挙げられる。
【０１７３】
例として、そして、限定の目的ではなく、ＯＳＣＡＲ遺伝子特異的変異の検出のための診断方法は、１以上の標識された核酸試薬（例えば、組換えＯＳＣＡＲ ＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはその縮重改変体）と、これらの試薬がサンプル核酸中のその相補配列に特異的にアニーリングまたはハイブリダイゼーションするために好ましい条件下で、サンプルより得られた核酸（組換えＤＮＡ分子、クローン遺伝子またはこの縮重改変体を含む）とを接触させる工程およびインキュベートする工程を包含し得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、アニーリングしていないかまたはハイブリダイズしていない全ての核酸を除く。次いで、ハイブリダイズした核酸の存在（このような分子が存在する場合）は検出され、そしてこの核酸試薬がアニーリングしたＯＳＣＡＲ遺伝子配列は、ＯＳＣＡＲ遺伝子変異が存在するか否かを決定するために、正常（すなわち、野生型）ＯＳＣＡＲ遺伝子配列から予想されるアニーリングパターンと比較され得る。
【０１７４】
このような検出スキームの好ましい実施形態において、目的の細胞型または組織由来の核酸は、例えば、膜またはプラスチック表面（例えば、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズ）のような固体支持体に固定化され得る。インキュベーション後、アニーリングしていない標識化ＯＳＣＡＲ核酸試薬の検出は、容易に除去され得、そして残った、アニーリングした標識化ＯＳＣＡＲ核酸試薬は、当該分野において周知の標準的技術を使用して達成され得る。
【０１７５】
患者サンプル中または他の細胞供給源中のＯＳＣＡＲ遺伝子特異的核酸を検出するための代替的診断方法は、これらの増幅（例えば、ＰＣＲ（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に教示される実験的実施例を参照のこと）、次いで、当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出による）を含み得る。生じた増幅配列は、ＯＳＣＡＲ変異がそのサンプル中に存在するか否かを決定するために、その核酸が正常コピーのＯＳＣＡＲ遺伝子のみを含んで増幅された場合に予想されるものと比較され得る。
【０１７６】
他の周知の遺伝子型決定技術をまた使用して、ＯＳＣＡＲ変異を保有する個体を同定し得る。このような技術としては、例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）の使用が挙げられる。ＤＮＡ多型を分析するための他の方法を使用して、制限酵素部位の間に直列状に反復する、可変数の短いＤＮＡ配列の存在を利用し、ＯＳＣＡＲ変異を同定し得る。例えば、米国特許第５，０７５，２１７号は、短い直列状反復のブロックにおける長多型に基づくＤＮＡマーカーを記載する。このようなブロックの平均間隔は、３０〜７０ｋｂであると見積もられる。非常に近接して配置されるマーカーは、高頻度の同時遺伝形質を示し、そして遺伝的変異（例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子内の変異を含む）の同定において非常に有用であり、そして、遺伝的変異（例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子内）に関連する疾患および障害の診断のために非常に有用である。
【０１７７】
本発明の診断的方法および予後的方法はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現のレベルをアッセイするための方法を含む。例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子を発現することが既知であるかまたは予想される細胞型または組織（例えば、破骨細胞）由来のＲＮＡは、上記のようなハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術を利用して単離および試験され得る。単離された細胞は、例えば、細胞培養物由来または患者由来の細胞であり得る。細胞培養物から得られた細胞の分析は、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するためにか、あるいは、その細胞がＯＳＣＡＲ遺伝子を発現する特定の細胞型のものであることを確認するために有用であり得る。例えば、下記の実施例は、ＯＳＣＡＲ遺伝子が葉骨細胞中に特異的に発現されることを実証する。よって、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現のレベルをアッセイするための方法は、細胞（細胞培養物由来であるか患者のような個体由来）が破骨細胞であるか否かを決定するために特に有用である。
【０１７８】
このような検出スキームの１つの好ましい実施形態において、ｃＤＮＡ分子は、目的のＲＮＡ分子から合成される（例えば、逆転写によって）。次いで、ｃＤＮＡ内の配列は、ＰＣＲのような核酸増幅反応についてのテンプレートとして使用され得る。このようなアッセイの逆転写工程および増幅工程において合成開始試薬として使用される核酸試薬（例えば、プライマー）は、好ましくは、本明細書中に記載されるＯＳＣＡＲ核酸配列から選択されるか、またはそのフラグメントである。好ましくは、この核酸試薬は、少なくとも９〜３０ヌクレオチド長である。増幅は、検出のために、例えば、放射活性標識されたかまたは蛍光標識されたヌクレオチドを使用して実施され得る。あるいは、十分増幅した産物は、標準的エチジウムブロマイドまたは他の染色方法によってその産物が可視化され得るようになされ得る。
【０１７９】
本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子発現アッセイはまた、インサイチュで（すなわち、固定および／または凍結され得る、患者組織の組織切片上に直接的に）実施され得、これにより核酸精製の必要性を排除する。ＯＳＣＡＲ核酸試薬は、このようなインサイチュ手順のためのプローブまたはプライマーとして使用され得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ，ＰＣＲ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，１９９２，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。あるいは、十分量の適切な細胞が得られ得る場合、標準的ノーザン分析を実施して、ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルを検出することによってＯＳＣＡＲ遺伝子発現のレベルを決定し得る。
【０１８０】
（ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の検出）
本発明の診断的方法および予後的方法はまた、ＯＳＣＡＲタンパク質または他のＯＳＣＡＲポリペプチド（機能的に保存された改変体およびそのフラグメントを含む）のレベルを検出する工程を包含する方法を含む。例えば、損なわれていない、野生型ＯＳＣＡＲ遺伝子産物もしくは変異体ＯＳＣＡＲ遺伝子産物、または、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の機能的に保存された改変体もしくはペプチドフラグメントに対する抗体は、骨増殖関連障害（例えば、大理石骨病および骨粗鬆症）のための診断的試薬および予後的試薬として使用され得る。このような試薬を使用して、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物合成または発現のレベルにおける異常を検出し得るか、あるいは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の構造、時期的発現または物理的位置における異常を検出し得る。本明細書中以下に記載されるような抗体および免疫アッセイ法はまた、大理石骨病および骨粗鬆症のような骨増殖関連障害についての処置の効率を評価するための重要なインビトロ適用を有する。例えば、抗体、または抗体のフラグメントを、インビトロで潜在的治療化合物をスクリーニングする際に使用して、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現およびＯＳＣＡＲポリペプチド産生に対する化合物の効果を確認し得る。ＯＳＣＡＲ関連障害に対して有利な効果を有し得る化合物は、同定され得、そしてこのような化合物についての治療的有効用量が、このようなアッセイを使用して決定され得る。
【０１８１】
インビトロイムノアッセイはまた、ＯＳＣＡＲ関連障害のための細胞ベースの遺伝子治療の効力を評価するために用いられ得る。例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドに対する抗体は、ＯＳＣＡＲポリペプチドを生成するために遺伝子操作された細胞において達成されたＯＳＣＡＲ遺伝子発現またはＯＡＣＡＲポリペプチド発現のレベルを決定するためにインビトロで用いられ得る。このような方法は、細胞内ＯＳＣＡＲ遺伝子産物を検出するために（好ましくは、細胞溶解物または細胞抽出物を用いて）、細胞表面のＯＳＣＡＲ遺伝子産物の発現を検出するために、または細胞培養培地に分泌されたＯＳＣＡＲ遺伝子産物を検出するために用いられ得る。このような評価方法は、インビボで治療効力を達成するために必要な形質転換細胞の数、および遺伝子置換プロトコルの最適化を決定するために用いられ得る。
【０１８２】
一般に、このような方法を用いて分析される組織型または細胞型としては、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物を発現することが公知の破骨細胞のような細胞型が挙げられる。Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されるようなタンパク質単離方法が用いられ得る。単離された細胞は、細胞培養物に由来するか、または個体（例えば、ＯＳＣＡＲ関連障害を有すると疑われる患者またはＯＳＣＡＲ関連障害の傾向を有すると疑われる患者）に由来する細胞であり得る。
【０１８３】
１つの例として、抗体または抗体のフラグメントが、例えば、光学顕微鏡と合わせて、蛍光標識した抗体を用いた免疫蛍光技術、フローサイトメトリー法または蛍光検出法により、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の改変体またはそれらのフラグメントの存在を検出するために用いられ得る。このような技術は、細胞表面上のＯＳＣＡＲ遺伝子産物を検出するために特に好ましい。
【０１８４】
抗体またはそのフラグメントはまた、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物のインサイチュ検出のための免疫蛍光技術または免疫電子顕微鏡技術において組織学的に用いられ得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本（例えば、組織サンプル）を取り出すこと、および本発明の標識抗体またはこのような抗体のフラグメントをこの標本に適用することにより達成され得る。この抗体または抗体フラグメントは、好ましくは、標識抗体または標識抗体フラグメントを生物学的サンプルに重層することにより適用される。このような手順の使用により、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の存在のみならず、試験組織における遺伝子産物の分布もまた検出することが可能である。当該分野で周知の広範に種々の組織学的方法（例えば、染色手順）が、このようなインサイチュ検出を達成するために過度な実験なくして当業者により容易に改変され得る。
【０１８５】
ＯＳＣＡＲ遺伝子産物のイムノアッセイは、代表的には、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物（例えば、機能的に保存された改変体またはそのペプチドフラグメントを含む）を特異的に結合し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、生物学的サンプル（例えば、生物学的流体、組織抽出物、新鮮に採取された細胞または細胞溶解物）をインキュベートすることを含む。次いで、結合した抗体は、当該分野で周知の任意の多くの技術により検出され得る。
【０１８６】
（スクリーニングアッセイ）
本明細書中以下に記載のスクリーニングアッセイを用いて、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合するか、さもなければ相互作用する化合物（ＯＳＣＡＲ遺伝子産物、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の天然のリガンドおよび合成のリガンドと相互作用する細胞内化合物（例えば、タンパク質またはタンパク質の一部）、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と他の化合物との（例えば、天然のリガンドまたは細胞内化合物との）相互作用を妨害する化合物、ならびにＯＳＣＡＲ遺伝子の活性を（例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現のレベルを調節することにより）調節する化合物、またはＯＳＣＡＲポリペプチドもしくは他のＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性（例えば、生体活性）を調節する化合物を含む）を同定することもまた可能である。例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイは、ＯＳＣＡＲ遺伝子のプロモーターまたは他の調節配列に結合する化合物を同定するために用いられ得、それゆえ、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現のレベルを調節し得る（例えば、Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：２８５５８−２８５６２を参照のこと）。
【０１８７】
このようなスクリーニングアッセイにより同定され得る化合物のクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：低分子（例えば、分子量が約２ｋｄ未満、より好ましくは、分子量が約１ｋｄ未満であるか、そして／または血液脳関門を通過し得るかもしくは適切な細胞に進入し得、かつＯＳＣＡＲ遺伝子の発現、ＯＳＣＡＲ調節経路に関与するある遺伝子の発現に影響を及ぼし得る有機分子または無機分子）、ならびに巨大分子（例えば、分子量が約２ｋｄを超える分子）。これらのスクリーニングアッセイにより同定される化合物としては、ペプチドおよびポリペプチドが挙げられ得る。例えば、コンビナトリアルライブラリー（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４：８２−８４により記載されるコンビナトリアルライブラリー；およびＨｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９１，３５４：８４−８６により記載されるコンビナトリアルライブラリー）の可溶性ペプチド、融合ペプチドのメンバー；コンビナトリアルケミストリー（例えば、Ｄ配置アミノ酸および／またはＬ配置アミノ酸の分子ライブラリー）により得られるライブラリーのメンバー；ランダムなまたは部分的に縮重した方向付けられたホスホペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）ライブラリーのメンバーのようなホスホペプチド（例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９３，７２：７６７−７７８を参照のこと）；抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、または単鎖が挙げられるが、これらに限定されない）；抗体フラグメント（ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＡｂ発現ライブラリーフラグメントおよびそのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）。
【０１８８】
以下に示す実施例中で実証されるように、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物は、破骨細胞の成熟および活性を調節し、さらにＯＳＣＡＲ遺伝子産物に対するリガンドのような化合物は、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節し、それにより、破骨細胞の成熟および／または活性を調節する能力を有する。従って、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物は、破骨細胞の活性を調節するため、特に、骨組織の成長、修復、発生、分解、再吸収、修復またはホメオスタシスを調節するために有用であり得る。従って、本明細書中に記載のスクリーニング方法により同定される化合物はまた、例えば、破骨細胞の活性を調節することによって、および／または骨組織の増殖、修復、発生、再吸収、分解、修復もしくはホメオスタシスを調節することによって、骨増殖関連障害（例えば、骨大理石病、骨粗鬆症を含む）を処置するために有用であり得る。
【０１８９】
結合化合物のアッセイ。インビトロ系は、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物を結合し得る化合物を同定するために容易に設計され得る。このような化合物は、例えば、野生型ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節するか、あるいは変異体または他の改変体ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節するために有用であり得る。
【０１９０】
一般に、このようなスクリーニングアッセイは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物および試験化合物を相互作用（例えば、結合する）させ、それにより、検出され得る複合体を形成するに十分な条件下および時間にわたり、この２つの化合物を含む反応混合物の調節を含む。このアッセイは、任意の種々の異なる方法で行われ得る。例えば、１つの実施形態は、ＯＳＣＡＲポリペプチドまたは試験化合物を固相にアンカーし、反応の最後に、結合していない化合物を（例えば、洗浄することにより）除去した後に固相上に存在するＯＳＣＡＲポリペプチドと試験化合物との複合体を検出することを含む。例えば、このような方法の１つの好ましい実施形態において、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物は、固相にアンカーされ得、標識化合物（例えば、上記の任意の方法に従って標識された）は、固相の表面に接触される。試験化合物を十分な時間にわたり、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と試験化合物との間で複合体形成され得る条件下でインキュベートした後、試験化合物の結合していない分子は、この表面から（例えば、洗浄により）除去され、残っている標識分子が検出される。
【０１９１】
別の代替的な実施形態において、１以上の異なる試験化合物の分子は、固相に結合され、標識されたＯＳＣＡＲポリペプチドの分子が固相に接触される。このような実施形態において、異なる試験化合物の分子は、好ましくは、固相上の特定の位置で固相に結合され、その結果、ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合する試験化合物は、固相または表面上に結合したＯＳＣＡＲポリペプチドの位置を決定することにより同定され得る。
【０１９２】
ＯＳＣＡＲと相互作用する化合物についてのアッセイ。タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の種々の公知の方法はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と相互作用するタンパク質を検出および／または同定するために用いられ得る。例えば、同時免疫沈降、架橋および勾配またはクロマトグラフィーカラムによる同時精製、ならびに当該分野で公知の他の技術が用いられ得る。このようなアッセイを用いて同定され得るタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞外タンパク質（例えば、ＯＳＣＡＲ特異的リガンド）および細胞内タンパク質（例えば、シグナル伝達タンパク質）。
【０１９３】
限定ではなく、例として、発現クローニングアッセイは、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドおよびＯＳＣＡＲ遺伝子産物と特異的に相互作用する他のタンパク質を同定するために用いられ得る。このようなアッセイにおいて、ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドを発現する任意の細胞株（例えば、破骨細胞、胚性繊維芽細胞、ＮＩＨ細胞、３Ｔ３細胞、ＳＴ２細胞、Ｍｌｇ細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ｈＦＯＢ１．１９細胞およびサルＣＯＳ−１細胞）から生成され得る。次いで、このような発現ライブラリーに由来するクローンは、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドを正常には発現しないＢ細胞リンパ腫株（例えば、ＣＨ１２細胞、Ａ２０．２５細胞またはＬＢＢ１細胞）のような細胞にトランスフェクトされ得るか、または感染され得る。次いで、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドをコードするクローンでトランスフェクトされた細胞は、この遺伝子産物を発現し得、標準的な技術（例えば、ＦＡＣＳ）を用いて、またはＯＳＣＡＲポリペプチド（例えば、ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ融合ポリペプチド）が結合した磁性ビーズを用いて同定および単離され得る。
【０１９４】
あるいは、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドが、当該分野で周知の免疫沈降技術を用いて、細胞株（上記の任意のＯＳＣＡＲ−Ｌ発現細胞株を含む）から単離され得る。
【０１９５】
ＯＳＣＡＲ特異的リガンドはまた、ＯＳＣＡＲ結合化合物を同定するために、上記で議論されたスクリーニングアッセイのいずれかを用いて単離され得る。例えば、ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、固相に結合され得るか、さもなければ付着され得、標識化合物（例えば、候補ＯＳＣＡＲリガンド）は、ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ融合ポリペプチドと試験化合物との間で複合体を形成させるに十分な時間および条件下で表面に接触され得る。次いで、試験化合物の結合していない分子は、表面から（例えば、洗浄により）除去され得、結合し続けている標識化合物が検出され得る。
【０１９６】
一旦このように単離されると、標準的な技術を用いて、このようなアッセイにおいて検出される任意のタンパク質が同定され得る。例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部は、当該分野で周知の技術（例えば、Ｅｄｍａｎ分解技術（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ ３４−４９）を参照のこと）を用いて確認され得る。
【０１９７】
一旦このようなタンパク質が同定されると、それらのアミノ酸配列は、このようなタンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために、例えば、上記の標準的なハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術を用いて、オリゴヌクレオチド混合物を生成するためのガイドとして用いられ得る。例えば、このようなオリゴヌクレオチド混合物を生成するための技術およびスクリーニングアッセイにおけるこれらの使用の説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）を参照のこと。
【０１９８】
ＯＳＣＡＲポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定を生じる他の方法は、当該分野で公知である。例えば、発現ライブラリーが、標識ＯＳＣＡＲポリペプチドを用いてプローブされ得る。
【０１９９】
限定ではない別の例として、ツーハイブリッド系を用いて、インビボでＯＳＣＡＲ遺伝子産物とのタンパク質相互作用が検出され得る。簡潔には、このような系を利用して、ツーハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築され得る。このツーハイブリッドタンパク質のうちの一方は、好ましくは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に融合した転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインを構成する。他方のハイブリッドタンパク質は、好ましくは、第１のハイブリッドにおいて用いられた転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインを含み、このドメインは、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラスミドライブラリーに組み換えられたｃＤＮＡによりコードされる未知のタンパク質に融合されている。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーの両方は、レポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳ、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３またはＧＦＰ）を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは他の適切な生物の系統に同時形質転換され得る。好ましくは、このレポーター遺伝子の調節領域は、このツーハイブリッドタンパク質の転写アクチベーター部分の結合部位を含む。このようなツーハイブリッド系において、２つのハイブリッドタンパク質のいずれか単独の存在のみでは、レポーター遺伝子の転写を活性化することはできない。具体的には、このＤＮＡ結合ドメインハイブリッドタンパク質は、必要な活性化機能に集中することができないので転写を活性化できない。同様に、活性化ドメインハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子のＤＮＡ結合部位に集中することができないので、転写を活性化できない。しかし、２つのハイブリッドタンパク質間の相互作用は、その機能的転写アクチベータータンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現を生じる。従って、本明細書中に詳細に記載されるもののようなツーハイブリッド系において、ＯＳＣＡＲポリペプチド（すなわち、転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインに融合されたＯＳＣＡＲポリペプチド）と試験ポリペプチド（すなわち、転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインに融合されたタンパク質）との間の相互作用は、単にレポーター遺伝子の遺伝子産物の発現を検出することにより検出され得る。
【０２００】
このようなツーハイブリッドアッセイおよび他のアッセイにおいてスクリーニングするためのｃＤＮＡライブラリーは、当該分野で公知の任意の適切な技術に従って作製され得る。特定ではあるが限定ではない例として、ｃＤＮＡフラグメントがベクターに挿入され得、その結果、これらのフラグメントは、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合されて（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｆｕｓｅｄ）、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動されるＨＩＳ３遺伝子を含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは他の適切な生物の系統に、「ベイト」ＯＳＣＡＲ−ＧＡＬ４融合プラスミドとともに同時形質転換される。ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合された、このｃＤＮＡライブラリー由来のタンパク質（このタンパク質は、ＯＳＣＡＲ−ＧＡＬ４融合物のＯＳＣＡＲポリペプチド部分と相互作用する）は、ＧＡＬ４タンパク質を再構成および活性化し、それにより、ＨＩＳ３遺伝子の発現を駆動し得る。ＨＩＳ３遺伝子を発現するコロニーは、ヒスチジンを欠いた半固体の寒天ベースの培地を含むペトリ皿上でのそれらの増殖により検出され得る。次いで、ｃＤＮＡは、これらの系統から精製され得、配列決定され得、ＯＳＣＡＲポリペプチドと相互作用するコードされたタンパク質を同定するために用いられ得る。
【０２０１】
一旦、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合する化合物を同定すると、これらの方法において記載されるスクリーニング方法はまた、これらの結合化合物に結合する他の化合物（例えば、低分子、ペプチドおよびタンパク質）を同定するために用いられ得る。このような化合物はまた、ＯＳＣＡＲ関連生物活性を、例えば、天然のＯＳＣＡＲリガンドまたは結合パートナーに結合し、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物とのその相互作用を妨害することにより調節するために有用であり得る。例えば、これらの化合物は、ＯＳＣＡＲ−Ｌを発現する細胞株（前述を参照のこと）へのＯＳＣＡＲ−Ｆｃの結合を阻害するそれらの能力について試験され得る。
【０２０２】
ＯＳＣＡＲ−リガンド相互作用を妨害する化合物についてのアッセイ。下記に示す実施例は、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物がインビボで１以上の分子（すなわち、リガンド）と相互作用し得ることを実証する。結合相互作用を撹乱するか、さもなければ妨害する化合物は、下記の実施例で実証されているように、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節することにおいて有用である。特に、このような化合物は、破骨細胞の成熟または活性を調節し、続いて、これは、骨組織の成長、修復、発生、再吸収、分解もしくはホメオスタシスの調節または骨増殖関連障害の処置に影響を及ぼす。
【０２０３】
このような化合物としては、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合する化合物を同定するために、前出で記載のスクリーニングアッセイに従って同定された化合物（そこで記載された化合物の任意の多くの例示的クラスを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
一般に、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナー（例えば、リガンド）との間の相互作用を妨害する化合物を同定するためにアッセイは、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物およびその結合パートナーを含む試験反応混合物を、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物およびその結合パートナーが結合して、複合体を形成するに十分な条件下および時間にわたり調製することを含む。阻害活性について（すなわち、結合複合体の形成を阻害するか、または一旦結合した結合複合体を破壊する能力について）化合物を試験するために、この試験化合物はまた、好ましくは、試験反応混合物中に存在する。１つの例示的実施形態において、この試験化合物は、最初に、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物とその結合パートナーを有する試験反応混合物中に含まれ得る。しかし、あるいは、この試験化合物は、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物およびその結合パートナーの添加に続いて、後に試験反応混合物に添加され得る。好ましい実施形態において、１以上のコントロール反応混合物（これは、試験化合物を含まない）がまた調製され得る。代表的には、コントロール反応混合物は、試験反応混合物中に同じＯＳＣＡＲ遺伝子産物および結合パートナーを含むが、試験化合物は含まない。コントロール反応混合物はまた、試験化合物の代わりに、試験反応混合物中には存在しないプラシーボを含み得る。次いで、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの間での複合体の形成は、反応混合物中で検出され得る。試験化合物の存在下ではなく、試験化合物の非存在下での（例えば、コントロール反応混合物中での）このような複合体の形成は、試験化合物が、ＯＳＣＡＲポリペプチドと結合パートナーとの相互作用を妨害するか、またはこの相互作用を調節する化合物であることを示す。
【０２０５】
ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を調節する化合物についてのこのようなアッセイは、不均質な形式で行われてもよいし、あるいは均質な形式で行われてもよい。不均質なアッセイは、代表的には、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを固相にアンカーし、反応の最後に固相にアンカーした化合物を検出することを含む。従って、このようなアッセイは、ＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲ遺伝子産物を検出および／または同定するために、ならびにＯＳＣＡＲ結合パートナーを検出または同定するために前出で記載した固相アッセイに類似している。実際、当業者は、それらのアッセイについての上記の原理および技術の多くが、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの間の相互作用を調節する化合物を同定するための本明細書中に記載の固相アッセイにおいて過度の実験なくして改変および適用され得ることを認識する。
【０２０６】
使用される特定のアッセイに拘わらず、反応物が反応混合物に添加される順序は、例えば、競合によって、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物を同定するために、または行われた結合複合体を破壊する化合物を同定するために変化され得る。競合によってＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物は、試験化合物の存在下で反応を行うことにより同定され得る。具体的には、このようなアッセイにおいて、試験化合物は、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物および結合パートナーの前に、またはこれらと同時に反応混合物に添加され得る。ＯＳＣＡＲ遺伝子産物と結合パートナーとの行われた複合体を破壊する試験化合物は、複合体が形成された後に、試験化合物を反応混合物に添加することにより試験され得る。
【０２０７】
本明細書中に記載のスクリーニングアッセイはまた、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドもしくはタンパク質の一部に対応するペプチドまたはポリペプチド、あるいはこのようなペプチドまたはポリペプチドの配列を含む融合タンパク質を用いて実施され得る。例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドと結合パートナーとの相互作用を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイは、結合パートナー（例えば、リガンド「結合部位」）に結合する全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの特定の領域またはドメインに対応するペプチドまたはポリペプチドを用いて実施され得る。例えば、１つの実施形態において、スクリーニングアッセイは、全長ＯＳＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、配列番号３に示されるＯＳＣＡＲポリペプチドのアミノ酸残基１〜２２８の配列を含む）に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチド（またはそれらの融合物）を用いて行われ得る。
【０２０８】
ＯＳＣＡＲポリペプチドの特異的結合部位を同定するために用いられ得る種々の方法が、当該分野で公知である。例えば、結合部位は、ＯＳＣＡＲ遺伝子を変異させ、上記のような結合の破壊をスクリーニングすることにより同定され得る。結合パートナーをコードする遺伝子はまた、このようなアッセイにおいて変異され、ＯＳＣＡＲ遺伝子に対する変異から破壊を保障する変異が同定され得る。次いで、これらの変異の配列分析により、２つのタンパク質の結合領域に対応する変異が明らかになり得る。
【０２０９】
代替的な実施形態において、タンパク質（例えば、ＯＳＣＡＲタンパク質またはＯＳＣＡＲタンパク質に対するタンパク質結合パートナー）は、本明細書中上記に記載の方法を用いて固相または支持体にアンカーされ得る。固相表面にアンカーされたタンパク質に結合する別の標識タンパク質は、タンパク質分解酵素で処理され得、そのフラグメントは、上記の結合アッセイの方法に従って、固相表面に結合されたタンパク質との相互作用が可能にされ得る。短時間洗浄した後、処理されたタンパク質の標識ペプチドフラグメントは、アンカーしたタンパク質と会合したままであり得る。これらのペプチドは単離され得、これらのペプチドが由来した全長タンパク質の領域は、アミノ酸配列によって同定され得る。
【０２１０】
さらなる他の実施形態において、ＯＳＣＡＲリガンド相互作用を妨害する化合物はまた、ＯＳＣＡＲポリペプチド（例えば、ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ融合ポリペプチド）の、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドを発現する細胞（例えば、破骨細胞、胚性繊維芽細胞、ＮＩＨ細胞、３Ｔ３細胞、ＳＴ２細胞、Ｍｌｇ細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ｈＦＯＢｌ．１９細胞、およびＣＯＳ−１細胞）への結合を調節する化合物をスクリーニングすることにより同定され得る。
【０２１１】
（治療方法および薬学的調製物）
本発明のＯＳＣＡＲ核酸分子、ポリペプチドおよび抗体は、例えば、破骨細胞の成熟および活性を調節するために用いられ得る。さらに、本発明のＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲポリペプチドに結合する化合物は、ＯＳＣＡＲ遺伝子発現を調節する化合物、および結合化合物で（例えば、天然のリガンドで）ＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲポリペプチドの結合を妨害するか、あるいはこの結合を調節する化合物は、例えば、破骨細胞の成熟または活性を調節するための方法において有用であり得る。従って、このような化合物はまた、破骨細胞活性（例えば、骨組織の成長、修復、発生、再吸収、分解およびホメオスタシス）と関連するプロセスを調節するために用いられ得る。このような方法は、骨増殖関連障害（例えば、骨粗鬆症、大理石骨病など）を処置するために特に有用であり得る。例えば、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物（例えば、ＯＳＣＡＲリガンド）に結合する化合物は、ＯＳＣＡＲ活性を増大させ得、破骨細胞の成熟を刺激し得、それにより破骨細胞関連活性を増大させ得る。従って、このような化合物は、破骨活性の活性化が所望され得る条件で処理するために用いられ得る。例えば、破骨細胞は、石灰化された骨マトリクスを再吸収する細胞であるので、ＯＳＣＡＲ活性を増大させ、破骨細胞の成熟を誘導する化合物は、骨増殖関連障害（例えば、異常に高いかまたは上昇した骨質量と関連する大理石骨病）を処置するために有用であり得る。あるいは、例えば、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物とリガンドとの間での結合相互作用を妨害することによりＯＳＣＡＲ活性を減少させる化合物は、破骨細胞成熟および破骨細胞関連活性を減少させ得る。従って、これらの化合物は、減少した破骨細胞活性が所望され得る条件で処置するために使用され得る。例えば、ＯＳＣＡＲ活性を減少させる化合物は、異常に低いかまたは減少した骨質量と関連する骨増殖関連障害（例えば、骨粗鬆症）を処置するために使用され得る。
【０２１２】
このような方法は、化合物が実際に、例えば、組織サンプルにおいて破骨細胞の数を増大または減少させるか否かを決定するために用いられ得る。従って、これらの方法は、特定の処置が破骨細胞活性に所望の影響を生じるか否かをモニターするために用いられ得る。
【０２１３】
あるいは、処置の有効性は、（例えば、動物モデルまたは患者において）個体の骨質量をモニターし、治療の結果として骨質量が増大したか、または減少したか否かを決定することにより確認され得る。
【０２１４】
阻害アプローチ。破骨細胞成熟または活性を調節するための方法は、ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の合成またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物活性を調節する１以上の化合物を投与することを含むだけであり得る。その結果、破骨細胞成熟または活性が、調節される（例えば、増大または減少される）。同様に、骨の増殖、修復、発生、再吸収、分解またはホメオスタシスを調節する（例えば、増大または減少させる）ための方法は、ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の合成またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物活性を調節する１以上の化合物を投与することを含むだけであり得る。好ましくは、これらの１以上の化合物は、骨の増殖、修復、発生、再吸収、分解またはホメオスタシスが所望されるように調節されるまで投与される。
【０２１５】
ＯＳＣＡＲ核酸の活性、発現または合成を調節する能力を示し得る化合物の中には、アンチセンス分子、リボザイム分子および三重らせん分子がある。このような分子は、野生型ＯＳＣＡＲ核酸および野生型ＯＳＣＡＲポリペプチドを減少または阻害するように設計され得るか、あるいは変異ＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲポリペプチドを標的化し得る。
【０２１６】
アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子を標的化するためにハイブリダイズし、タンパク質翻訳を阻止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするために作用する。アンチセンスアプローチは、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を阻止する。絶対的な相補性は、好ましくはあるが、必須ではない。
【０２１７】
核酸の一部に「相補的な」配列とは、核酸とハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を有する配列をいう。核酸がハイブリダイズする能力は、配列相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。しかし、一般に、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、塩基ミスマッチが多くなり、これは、安定な二重鎖（または三重らせんにおいては三重鎖）を含み得、なおこれを形成し得る。ミスマッチの許容され得る程度は、例えば、ハイブリダイズした複合体の融解温度を決定するための標準的な手順を用いることにより、容易に確認され得る。
【０２１８】
１つの好ましい実施形態において、ＯＳＣＡＲ遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因的なＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用され得る。アンチセンス核酸は、好ましくは、長さが少なくとも６ヌクレオチド、より好ましくは、長さ約６〜約５０ヌクレオチドの範囲である。特定の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドであり得る。
【０２１９】
インビトロでの研究は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する能力を定量するために最初に用いられることが一般に好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果との間を区別するコントロールを利用することが好ましい。これらの研究は、標的ＲＮＡまたは標的タンパク質のレベルと、内部コントロールＲＮＡまたはコントロールタンパク質のレベルとを比較することもまた好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られる結果は、コントロールオリゴヌクレオチドを用いて得られるものであることが想定される。コントロールオリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、このオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、標的配列に対する特異的ハイブリダイゼーションを阻止することが必要であるにすぎないアンチセンス配列とは異なることが好ましい。
【０２２０】
標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写され、翻訳されない領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０２２１】
アンチセンス分子は、好ましくは、インビボで標的遺伝子を発現する破骨細胞のような細胞に送達される。多くの方法は、細胞にアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを送達されるために開発されている。例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接注射され得るか、あるいは所望の細胞を標的にするように設計した改変されたアンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現するレセプターまたは抗原に特異的に結合する、ペプチドまたは抗体に連結するアンチセンスである）が全身投与され得る。
【０２２２】
好ましい実施形態は、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンス核酸分子の細胞内濃度を達成する。例えば、一つの好ましいアプローチは、組換えＤＮＡ構築物を使用する。ここで、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、強力なｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に位置される。患者の標的細胞にトランスフェクトするための、このような構築物の使用は、一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写をもたらす。この一本鎖ＲＮＡは、内因性の標的遺伝子転写物と相補的な塩基対を形成し、それゆえ、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防ぐ。例えば、上に記載のベクターは、細胞によって取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写に向わせるように導入される。所望のアンチセンスＲＮＡを産生するために転写され得る限り、このようなベクターはエピソームに保持され得るか、または染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術的方法により構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または当該分野で公知の他のものであり得、これらは哺乳動物において複製および発現のために使用され得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、特定の細胞型（例えば、哺乳動物の破骨細胞（例えば、ヒトは破骨細胞）において）において作用することが当該分野で公知である任意のプロモーターによりなされ得る。例えば、組換えＯＳＣＡＲ核酸の発現に関連して議論された任意のプロモーター（前出）はまた、ＯＳＣＡＲアンチセンス核酸を発現させるために使用され得る。
【０２２３】
標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために設計されたリボザイム分子または、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、それゆえ、標的遺伝子産物の発現を防ぐために使用され得る（例えば、国際公開番号第ＷＯ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０，２４７：１２２２−１２２５を参照のこと）。
【０２２４】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する能力のある酵素的ＲＮＡ分子である（総論について、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９４，４：４６９−４７１を参照のこと）。リボザイムの作用のメカニズムは、相補的な標的ＲＮＡにリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、引き続くにエンドヌクレオチド鎖分解性の切断事象に関連する。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な１つ以上の配列を含み、そしてｍＲＮＡ切断に応答可能な周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと。
【０２２５】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを、標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊するために使用し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により規定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。唯一必要なことは、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基対の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は、当該分野で周知であり、そしてＭｙｅｒｓ，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（特に図４，８３３ページを参照のこと）およびＨａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ １９８８，３３４：５８５−５９１により詳細に記載されている。
【０２２６】
好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端近くの位置するように（すなわち、効率を上げ、そして機能的でないｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように）操作されている。
【０２２７】
本発明のリボザイムはまた、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに天然に存在する（ＩＶＳ ＲＮＡ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして公知）のようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（これ以降、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）を含む。これは、Ｔｈｏｍａｓ Ｃｅｃｈおよび共同研究者（Ｚａｕｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４，２２４：５７４−５７８； ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６，２３１：４７０−４７５；Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８６，３２４：４２９−４３３；国際出願番号ＷＯ ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，Ｃｅｌｌ １９８６，４７：２０７−２１６）によって広く記載されている。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡの切断が生じた後に標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対の活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子内に存在する８塩基対活性部位配列を標的にするこれらのＣｅｃｈ型リボザイムを含む。
【０２２８】
アンチセンスアプローチの場合のように、このリボザイムは改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的化を改善するために）を含み得、そしてインビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるはずである。送達の一つの好ましい方法は、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することに関連する。その結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性の標的遺伝子のメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するために十分な量のリボザイムを産生する。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒性なので、より低い細胞内濃度が効力のために必要とされる。このような構築物は、任意の上記のベクターを用いて細胞に導入され得る。
【０２２９】
内因性標的遺伝子発現はまた、標的遺伝子またはそのプロモーターを、標的化相同組換えを用いて不活性化または「ノックアウト」することにより減少させ得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１７：２３０−２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ １９８７，５１：５０３−５１２；ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８９，５：３１３−３２１を参照のこと）。例えば、内因性標的遺伝子に相同なＤＮＡ（標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に隣接した変異体、機能的でない標的遺伝子（または完全に関連のないＤＮＡ配列）が、インビボで標的遺伝子を発現する細胞にトランスフェクトするために（選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを伴うかまたは伴わずに）使用され得る。標的化相同組換えによるこのＤＮＡ構築物の挿入は、標的遺伝子の不活性化をもたらす。このようなアプローチは、農学分野で得に適合されており、ＥＳ（胚性幹）細胞への改変が、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を生み出すために使用され得る（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７ならびにＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９８９，前出を参照のこと）。しかしながら、このアプローチは、ヒトにおける使用に適合され得る。但し、組換えＤＮＡ構築物は、適切なウイルスベクターを用いてインビボで必要とされる部位に直接的に投与されるか、または標的化される。
【０２３０】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、体内の標的細胞において標的遺伝子の転写を防ぐ三重らせん構造を形成するために、標的遺伝子の調節領域（すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することにより減少され得る（一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１９９１，６：５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２，６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １９９２，１４：８０７−８１５を参照のこと）。
【０２３１】
転写の阻害を阻害するための三重らせん形成において用いられる核酸分子は、一本鎖であり、そしてデオキシヌクレオチドを含むべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対規則を介して三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、これは、一般に二本鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンいずれかのかなりの大きいストレッチを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンベースであり得、これは生じる三重らせんの三つの結合した鎖にわたるＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットをもたらす。ピリミジンの豊富な分子は、その鎖に平行方向の２本の鎖のうちの一本鎖のプリンの豊富な領域に塩基相補性を提供する。さらに、核酸分子は、プリンの豊富な（例えば、Ｇ残基の伸長を含む）分子が選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二重鎖と三重らせんを形成する。ここで、プリン残基の大部分は、標的化された二重鎖のうちの一本の鎖に位置し、三重鎖の３つの鎖にわたってＣＧＣトリプレットを生じる。
【０２３２】
あるいは、三重らせん形成に標的化され得る潜在的な配列は、「スイッチバック」と呼ばれる核酸分子を創造することにより増加され得る。スイッチバック分子は、５’−３’、３’−５’様式を交互にすることにおいて合成され、この結果，これらは二重鎖の第一の一方の鎖と塩基対形成し、次いで、他方の鎖と塩基対形成し、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きいストレッチの必要性を除去する。
【０２３３】
本明細書中に記載されるアンチセンス、リボザイム、および／または三重らせん分子が、変異体遺伝子発現を阻害するために使用される場合、この技術は、転写（三重らせん）および／または正常な標的遺伝子の対立遺伝子により産生されるｍＲＮＡの翻訳（アンチセンス、リボザイム）を、そのように効率的に減少させるかまたは効率的に阻害することが可能であり、存在する正常遺伝子産物の濃度が正常な表現型のとって必要とされる濃度未満であり得る可能性を上昇する。このような場合に、標的遺伝子活性の実質的に正常なレベルが維持され、それゆえ、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードしそしてこれらを発現する核酸分子が、遺伝子治療法（例えば、以下で記載されるような遺伝子治療法）を介して細胞に導入され得る。この遺伝子治療法は、どのアンチセンス、リボザイム、または三重らせんでも利用される処置に感受性の配列を含まない。あるいは、それらによってこの標的遺伝子が外因性タンパク質をコードする場合、標的遺伝子活性の不可欠なレベルを維持するために正常標的遺伝子タンパク質を同時投与することが望ましくあり得る。
【０２３４】
（遺伝子治療）
障害がＯＳＣＡＲ遺伝子変異に由来する場合、処置方法は、この障害の症状が改善するように、野生型ＯＳＣＡＲ核酸分子または正常な生物学的活性を有するＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を個体に供与することを包含し得る。
【０２３５】
あるいは、障害がＯＳＣＡＲ遺伝子変異に由来する場合、処置は、障害の症状が改善するように、野生型のＯＳＣＡＲ遺伝子産物または正常な生物学的活性を有するＯＳＣＡＲ遺伝子産物を発現するように改変された細胞（例えば、破骨細胞または線維芽細胞）を個体に移植または供与することを包含する。
【０２３６】
当該分野で利用可能である遺伝子治療のための方法の任意のものが、本発明に従って使用され得る。遺伝子治療法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９３，１２： ４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９３，３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３，２６０：２９６−９３２；ＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３，６２：１９１−２１７；ならびにＭａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １９９３，１１：１５５−２１５）を参照のこと。特に、細胞中の発現ＯＳＣＡＲ核酸について前出したものに記載される任意のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターは、こらの遺伝子治療法において使用され得る。
【０２３７】
組換えＤＮＡ技術の分野において通常知られる方法はまた、このような遺伝子治療においても使用され得る。例えば、以下に記載される方法を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＤｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
【０２３８】
本発明の遺伝子治療法の一つの局面において、本明細書中に記載の発現ベクターのいずれかを含む治療ベクターが使用され、これは、適切な宿主細胞内で機能的なＯＳＣＡＲ遺伝子産物を発現する核酸配列を含む。特に、このベクターは、好ましくは、機能的な本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドに対するコード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む核酸配列を含有する。このプロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーターであり得、そして必要に応じて組織特異的であり得る。別の実施形態において、このベクターは核酸分子を含み、ここでＯＳＣＡＲ核酸配列は、ゲノムの所望の部位で相同組換えを促進する領域により隣接される。従って、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の染色体内発現を提供する（例えば、ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９，８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４２：４３５−４３８を参照のこと）。
【０２３９】
例えば、骨の成長、修復、発生、再吸収、分解または恒常性のような、破骨細胞の活性を調節するための方法において、ベクターが個体に投与される実施形態では、個体へのベクターの送達は、直接的か、または間接的のいずれかであり得る。ベクター送達の直接的方法は、個体をベクターまたは送達複合体に直接曝露する工程を包含する。送達の間接的な方法において、細胞はまず、インビトロ（例えば、細胞培養物において）でベクターで形質転換し、次いで患者に移植する。このような送達の直接的方法および間接的方法はまた、インビボおよびエキソビボでの遺伝子治療法にそれぞれ関連する。
【０２４０】
このような遺伝子治療法において使用される核酸の正確な形態および量は、特別な用途（例えば、疾患の特定の型および所望される効果の重大性、患者の状態など）に依存する。特別な用途または治療のための適切な形態および核酸の量は、当業者によって決定され得る。
【０２４１】
（抗ＯＳＣＡＲ抗体治療）
以下の特定の実施例において実証されるように、本発明のＯＳＣＡＲ遺伝子産物は、破骨細胞において優先的にまたは排他的に発現される。従って、本発明の治療方法はまた、標的に対するＯＳＣＡＲ遺伝子産物に特異的に結合し、そして破骨細胞を一過性に除去する抗体の使用を含む。このような治療法は、破骨細胞媒介性骨吸収の抑制が所望される場合、大理石骨病のような疾患および障害を処置するために特に所望される。
【０２４２】
本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドに特異的に結合する、上記の任意の抗体はまた、このような治療において使用され得る。例えば、このような方法において使用される治療的抗体は、全長の抗体またはそれらのフラグメントであり得、これらは、細胞毒性分子（例えば、ラジオアイソトープまたはリシンのような毒素）に連結される。ついで、これらの抗体は標的細胞に対して（すなわち、破骨細胞に対して）特異的な標的細胞毒性のために使用され得る。
【０２４３】
これらの方法の他の実施形態において、抗体の内因性機能（すなわち、この機能は抗体のＦｃ部分により媒介される）は、例えば、抗体媒介性細胞毒性などによって破骨細胞を明らかに標的にする。このような抗体ベースの治療はすでに当該分野で周知である。
【０２４４】
なお別の実施形態において、細胞内抗体（「細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」とも呼ばれる）はまた、ＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を調節するために使用され得る。細胞内タンパク質の活性を調節するための細胞内発現抗体の用途は、当該分野に周知であり、そして多くの種々の系について記載されている（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ．１９９７，４：１１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９４，５：５９５を参照のこと）。これらとしては、（これらに限定されないが）以下が挙げられる：ウイルス感染（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８，９：１６２７を参照のこと）および他の感染疾患（例えば、Ｒｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７，５１：２５７），ならびにｐ２１のような癌遺伝子（例えば、Ｃａｒｄｉｎａｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８，４３９：１９７−２０２；およびＣｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９８，５８：１１７０−６を参照のこと），ｍｙｂ（Ｋａｓｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２５１：１２４−３０），ｅｒｂＢ−２（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９５，１５：１１８２−９１）など。
【０２４５】
（薬学的調製物）
ＯＳＣＡＲ遺伝子発現またはＯＳＣＡＲ遺伝子産物活性に影響を与えることが決定される化合物は、破骨細胞の成熟または破骨細胞に関連する活性を調節するための治療有効用量で（例えば、個体に）投与され得；あるいは、このような化合物は、個体の骨組織の成長、修復、発生、吸収、分解または恒常性を調節するための治療有効用量で投与され得る。それゆえ、用語治療有効用量は、このように調節された活性ならびに／または大理石骨病および骨粗鬆症のような障害に関連する骨成長の症状における改善を生じるのに十分な化合物の量をいう。
【０２４６】
化合物の毒性および治療効果は、標準的薬学的手順（例えば、細胞培養物アッセイ、またはＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために実験動物を使用する）によって決定され得る。パラメーターＬＤ５０およびＥＤ５０は当該分野で周知であり、それぞれ、集団の５０％に致死的および集団の５０％に治療有効な化合物の用量をいう。毒性と治療有効性との間の用量比率は、治療的インデックスと呼ばれ、比率：ＬＤ５０／ＥＤ５０として示され得る。大きな治療インデックスを示す化合物が好ましい。一方、毒性の副作用を示す化合物が使用され得る。しかし、このような場合において、他の細胞、組織または器官への損傷の可能性を最小にし、そして副作用を減少させる限り、このような化合物が、影響を受ける部位を特異的に標的にする送達経路のために使用されることが特に好ましい。
【０２４７】
細胞培養物アッセイまたは動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を処方するのに使用し得る。本発明の治療方法において使用される化合物の投薬用は、好ましくは、ＥＤ５０の濃度を含むが、毒性がほとんどないか、全くない（例えば、ＬＤ５０の濃度未満である）循環濃度の範囲内である。任意の用途で使用される特定の投薬量は、使用される特定の投薬形態、利用される投薬経路、個体（例えば、患者）の状態などの因子に依存して、この範囲内で変化し得る。
【０２４８】
治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に見積もられ得、そしてＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて処方される。化合物のＩＣ５０濃度は、症状の最大阻害の半分を達成する濃度である（例えば、細胞培養アッセイから決定されるように）。次いで、特定の個体（例えば、ヒト患者）における使用のための適切な投薬量は、このような情報を用いてさらに正確に決定され得る。
【０２４９】
血漿中の化合物の測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィーのような技術により、患者のような個体において慣用的に測定され得る。
【０２５０】
本発明に従う使用のための薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を用いる従来の様式において処方され得る。
【０２５１】
従って、化合物およびそれらの生理学的に受容可能な塩および溶媒は、吸入または吹送（口または鼻を通すことのいずれか）、あるいは経口的、経頬的、非経口的または直腸投与のために処方され得る。
【０２５２】
経口的投与のために、この薬学的組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの形態で使用されうる。これらは、以下のような薬学的に受容可能な賦形剤を用いる慣用的な手段により調製される：結合薬剤（例えば、予めゲル化されたトウモロコシの澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、イモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム澱粉）；あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は、当該分野で周知の方法によりコートされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁の形態で使用され得るか、または使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥産物として示され得る。このような液体調製物は、以下のような薬学的に受容可能な添加物を用いて従来の手段により調製され得る：懸濁剤（例えば、ソルビトルシロップ、セルロース誘導体または水素化された食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）。この保存剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、矯味・矯臭剤、着色料および甘味剤を含み得る。
【０２５３】
経口的投与のための調製は、活性化合物の制御された放出を得るように適切に処方され得る。経頬投与についての処方物は、従来の様式において処方される錠剤またはトローチ剤の形態で使用され得る。吸入による投与のために、本発明に従って使用される化合物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、炭酸ガスまたは他の適切なガス）の使用を伴う、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアゾールスプレー調製物の形態で従来の通りに送達される。加圧されたエアゾールの場合、投薬量単位は、定量される量を送達するためのバルブを提供することにより決定され得る。吸入器または噴霧器における使用のための例えば、ゼラチンのためのカプセルおよびカートリッジは、化合物および適切な粉末基材（例えば、ラクトースまたは澱粉）の粉末混合物を含んで処方され得る。
【０２５４】
化合物は、注射（例えば、ボーラス注射または持続的な注入）による非経口的投与のために処方され得る。注射のための処方物は、単位投薬形態（例えば、保存剤を添加されたアンプルまたは複数用量の容器）で存在し得る。この化合物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとり得、そして懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような処方的薬剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌の発熱源を含まない水）で構成される粉末形態であり得る。
【０２５５】
この化合物はまた、坐剤または持続性浣腸のような直腸用の組成物（例えば、ココアバターもしくは他のグリセリドのような従来の坐剤基材を含む）において処方され得る。
【０２５６】
先に記載された処方物に加えて、この化合物はまた、デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。このような長い間作用する処方物は、移植（例えば、皮下または筋内）によってか、または筋内注射によって投与され得る。従って、例えば、この化合物は、適切なポリマー物質または疎水性物質（例えば、受容可能な油における乳濁液）またはイオン交換樹脂、あるいは溶解性の低い誘導体（例えば、溶解性の低い塩）を伴って投与され得る。
【０２５７】
所望される場合、この組成物は、パックまたはディスペンサーデバイス内に存在し得、これらは、活性成分を含む１回以上の単位投薬形態を含み得る。このパックは、ブリスターパックのような金属またはプラスチックの箔を含み得る。このパックまたはディスペンサーデバイスはまた、投与についての指示が付随し得る。
【０２５８】
（実施例）
本発明はまた、特定の実施例を用いることによって記載される。しかし、本明細書中のいかなる実施例の使用も、実例となるのみであり、本発明の範囲および意味または例示されたいかなる用語も制限しない。同様に、本発明はまた、本明細書中に記載される、いかなる特に好ましい実施形態に制限されない。実際に、本発明の多くの改変およびバリエーションは、本明細書を読んだ当業者に明らかであり、そしてこの精神および範囲から逸脱することなしになされ得る。それゆえ、本発明は、添付の特許請求に記載されるの等価物の全ての範囲を伴って、特許請求の範囲の用語によってのみ制限される。
【０２５９】
（実施例１：マウスＯＳＣＡＲ遺伝子の単離および特徴付け）
この実施例は、破骨細胞において特異的に発現する免疫グロブリン（Ｉｇ）様レセプターをコードする新規のｃＤＮＡの単離を記載する。この実施例は、本明細書中でＯＳＣＡＲと呼ばれる新規の遺伝子および遺伝子産物を提供する。
【０２６０】
（材料および方法）
（破骨細胞およびマクロファージの調整）
骨髄細胞を、（Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９９，１４０：１９２７−１９３５）に記載されるように４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６の雄性マウスから単離した。大腿骨および脛骨を、無菌的に取り出す。この骨端を切断し、そして骨髄細胞を滅菌した３１ゲージの針を用いてＢＳＳ溶液を注射することによって洗浄した。単一の細胞懸濁液を得るために、骨髄細胞をプラスチックのパスツールピペットを用いて懸濁した。メッシュを用いて濾過した後、骨髄細胞をＧｅｙ’ｓ溶液で処理した。この骨髄細胞を２回洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭ中に懸濁し、７５０ｍｌフラスコに１×１０６細胞／ｍｌの密度でＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）中で２４時間インキュベートする。２４時間後、この非接着細胞を収集し、そして同じ培地に再懸濁した。破骨細胞およびマクロファージ細胞の調整のために、１０ｍｌの懸濁液（３×１０７細胞）を１０ｍｍペトリ皿に添加した。ヒトＭ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）をマクロファージ細胞に添加し、一方、ｈＭ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ｍＴＲＡＮＣＥ（ｌμｇ／ｍｌ）およびＰＧＥ２（１μＭ）を破骨細胞のために使用した。培養物に３日目で養分を与え、そして４日目でＰＢＳで２回洗浄した後、接触細胞を収集した。成熟樹状細胞を（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７６：１６９３−１７０２）に記載されるように骨髄前駆細胞から得た。
【０２６１】
（骨髄細胞からのＲＮＡの単離）
破骨細胞およびマクロファージ細胞からの全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯ）を用いて培養皿から直接単離した。ポリＡ ｍＲＮＡをオリゴテックスｍＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡから単離した。ポリＡ ｍＲＮＡの溶出物を、エタノールで沈殿させ、ＤＥＰＣで処理した蒸留水中に再懸濁した。ポリＡ ｍＲＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計により決定した。
【０２６２】
（頭蓋骨および長骨からのＲＮＡの単離）
３日齢マウスから頭蓋骨を収集し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＴＲＩＺＯＬで処理した。４週齢雌性マウスから長骨を収集し、凍結し、Ｂｅｓｓｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて破砕し、そしてＴＲＩＺＯＬで処理した。組織由来の全ＲＮＡを製造業者のプロトコル（ＧＩＢＣＯ）に従ってＴＲＩＺＯＬを用いて収集した。
【０２６３】
（差し引きのｃＤＮＡライブラリーの作製）
骨髄由来の破骨細胞およびマクロファージ細胞からのポリＡ ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に従ってＰＣＲ選択差し引きキットを使用して、差し引きのｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用した。差し引きからのｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ ＴＡクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に直接挿入した。１４℃で一晩結合させた後、この結合混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩＩＢのコンピテント細胞に形質転換させた。これらの細胞を、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有するアンピシリンを含むＬＢ皿上にプレートした。２５０の白色コロニーをミニプレップ培養のために無作為に選別した。
【０２６４】
（破骨細胞特異的遺伝子の同定） その差引き済みフラグメントを含むプラスミドＤＮＡサンプルを、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを使用して単離した（ＱＩＡＧＥＮ）。ＥｃｏＲＩで消化した後、このＤＮＡをアガロースゲル上で分離し、Ｎｙｌｏｎ膜（ＮＥＮ）に移し、そして破骨細胞およびマクロファージ由来の３２Ｐ標識ｃＤＮＡでプロービングした。全３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブは、以前に記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）ようにランダムヘキサマーをプライマーとして使用して、各全ＲＮＡを用いて合成した。
【０２６５】
このナイロン膜を、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハート溶液、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０％ ＰＥＧ ８，０００）中で４時間プレハイブリダイズした。変性ＤＮＡプローブを添加し、そして１６時間ハイブリダイズした。フィルターを洗浄し、そして以前に記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）ように、オートラジオグラフした。破骨細胞プローブに選択的にハイブリダイズしたサンプルを、さらなる分析のために選択した。
【０２６６】
（ノーザン分析） ノーザンブロット分析を、記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）ように、ノーザンハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、５×デンハート溶液、５×ＳＳＣ、および３ｍｇ／ｍｌの超音波処理済みサケ***（ＤＮＡ））を使用して実施した。異なる細胞型および組織サンプルから、製造業者のプロトコル（ＧＩＢＣＯ）に従ってＴＲＩＺＯＬを使用して、全ＲＮＡを収集した。ＯＣＬ１７８、および全長ＴＲＡＰおよびカテプシンＫ ｃＤＮＡを標識し、そしてプローブとして使用した。
【０２６７】
（結果および考察）
（ＯＳＣＡＲのためのｃＤＮＡフラグメントの単離） 破骨細胞（ＯＣ）およびマクロファージ（ＭΦ）は、骨髄前駆細胞に由来する。ＯＣおよびＭΦが潜在的に共通の前駆細胞に由来するので、本発明者らは、製造業者のプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に従ってＰＣＲ選択差引きキットを使用して、差引きｃＤＮＡ（マウスＯＣ−ＭΦ）ライブラリーを構築した。ＯＣ特異的遺伝子を同定するために、この差引き済みフラグメントを含むプラスミドＤＮＡを２５０クローンから精製し、消化し、アガロースゲル上で分離し、Ｎｙｌｏｎ膜（ＮＥＮ）に移し、そしてＯＣまたはＭΦ由来の３２Ｐ標識ｃＤＮＡでプロービングした（図８）。１つのクローン（ＯＣＬ１７８と呼ぶ）を同定した。このクローンは、マクロファージ中よりも破骨細胞中の方が高発現される。このクローンを、さらなる分析のために選択した。このクローンが、新規な遺伝子（本明細書中でＯＳＣＡＲと呼ぶ）のフラグメントであることを決定した。
【０２６８】
（ＯＳＣＡＲは、ＯＣにおいて特異的に発現されるが、ＭΦまたは樹状細胞（ＤＣ）において特異的には発現されない） ＯＣＬ１７８が破骨細胞中で特異的に発現される遺伝子に由来するか否かを決定するために、ＯＣおよびＭΦ由来のｍＲＮＡを、３２Ｐ標識ＯＣＬ１７８でハイブリダイズした。図９に示されるように、このＯＣＬ１７８フラグメントは、見かけのサイズが４．０ｋｂ、１．８ｋｂ、および１．０ｋｂである３つの異なるｍＲＮＡ種を検出した。ＯＳＣＡＲの発現が、骨髄由来ＯＣ（ＢＭＯＣ）において特異的に検出されたが、骨髄由来ＭΦ（ＢＭＭ）において特異的には検出されなかった。さらに、ＯＳＣＡＲ発現は、骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）において検出されなかった。この骨髄由来ＤＣは、ＯＣおよびＭΦと同じ前駆体に由来する。ＴＲＡＰおよびカテプシンＫは、破骨細胞特異的マーカーであると当該分野において考えられている遺伝子である。なぜなら、これらの発現が、ＯＣにおいて検出されたがＭΦにおいては検出されなかったからである（例えば、Ｍｉｎｋｉｎ，Ｃ．、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．、１９８２、３４：２８５；Ｅｋ−Ｒｙｌａｎｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１９９７、３２１：３０５〜１１；Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．、１９８５、２４１：６７１〜６７５；Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ，１９９８、９３：１６５〜１７６を参照のこと）。しかし、ＯＳＣＡＲと異なり、ＴＲＡＰおよび／またはカテプシンＫの発現はまた、ＢＭＤＣにおいても検出され得る（図９を参照のこと）。従って、破骨細胞におけるＯＳＣＡＲの発現は、ＴＲＡＰまたはカプテシンＫのいずれかよりもかなり特異的であり、このことは、このＯＳＣＡＲの遺伝子およびその遺伝子産物が、当該分野で公知の他のマーカー（例えば、ＴＲＡＰおよびカプテシンＫ）よりも改善された、破骨細胞特異的マーカーであることを示す。
【０２６９】
（ＯＳＣＡＲは、ＯＣにおいて特異的に発現されるが、他の細胞において特異的には発現されない） ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ発現の特異性を決定するために、種々の組織由来のｍＲＮＡを、ノーザン分析によって分析した（図１０）。図１０に示されるように、ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡ発現が、ＯＣ（ＯＣＬ）において特異的に検出されるが、試験した他の組織（筋肉、腎臓、脳、心臓、肝臓、肺、腸、胸腺、脾臓およびリンパ節を含む）において特異的には検出されない。比較において、ＴＲＡＰ ｍＲＮＡまたはカテプシンＫ ｍＲＮＡ（これらは、ＯＣについての特異的マーカーであると当該分野で考えられている）は、他の細胞型（すなわち、破骨細胞以外の組織由来の細胞）由来のｍＲＮＡにおいて検出され得る。従って、この結果は、ＯＳＣＡＲ発現が破骨細胞に特異的であること、ならびにＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物が改善された破骨細胞特異的マーカーであることを、確認する。
【０２７０】
（ＯＳＣＡＲは、インビトロおよびインビボにおいて分化した細胞において発現される） ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＴＲＡＮＣＥにより処理した場合、インビボで破骨細胞様細胞へと分化することが示されている（Ｈｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９９、９６：３５４０〜３５４５）。本明細書の図１１Ａ〜Ｃにおいて示されるノーザンブロット分析は、これらの細胞がまた、４８時間の処理の間もＯＳＣＡＲを発現することを示す。ＯＳＣＡＲ発現は、４日後が最も高い。この４日後は、これらの細胞が完全に分化している。
【０２７１】
さらに、ＯＳＣＡＲ発現は、上記の種々の組織（例えば、筋肉、腎臓、脳、心臓、肝臓、肺、腸、胸腺、脾臓およびリンパ節）において検出されないが、ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡは、破骨細胞が豊富な組織（例えば、頭蓋および長骨）のノーザンブロット分析において検出される（図１１Ｃ）。
【０２７２】
従って、ＯＳＣＡＲは、分化した破骨細胞において発現され、そしてさらに、分化がインビボで生じるかまたはインビトロで生じるかに関わらず、そのような発現が生じる。
【０２７３】
（実施例２：ＯＳＣＡＲは、新規な免疫グロブリン（Ｉｇ）様レセプターをコードする）
本実施例は、全長マウスＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする配列を含むｃＤＮＡ分子の、単離および特徴付けを記載する。
【０２７４】
（材料および方法）
（マウスｃＤＮＡライブラリーの作製） マウスｃＤＮＡライブラリーを、製造業者のプロトコル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に従って、骨髄由来成熟破骨細胞由来のポリＡ ｍＲＮＡを使用して、作製した。全長ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡを、記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）ように、ＯＣＬ１７８インサートを使用してスクリーニングすることによって、このライブラリーから単離した。
【０２７５】
（アミノ酸配列分析） 全長マウスＯＳＣＡＲアミノ酸配列を、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて相同タンパク質配列について検索するために使用した。検索は、ＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７、２５：３３８９〜３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０、２１５：４０３〜４１０）をデフォルトパラメータ値とともに使用して、実行した。
【０２７６】
（結果および考察）
ＯＣＬ１７８を、マウス骨髄破骨細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。実施例１（上記）に記載される１．８ｋｂ ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡに対応するクローンおよび１．０ｋｂ ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡに対応するクローンを、標準的配列決定技術に従って配列決定した。これらのクローンの各々からのｃＤＮＡ配列が、図１Ａ（１．８ｋｂ ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ）および図１Ｂ（１．０ｋｂ ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ）、ならびに配列番号１および配列番号２に、それぞれ示される。これらの２つの核酸配列の比較により、この２つのクローンは３’非翻訳領域でのみ異なることが示される。各クローンは、同じ推定アミノ酸配列をコードし、この推定アミノ酸配列は、図１Ｃ（配列番号３）に示される。上記４．０ｋｂ ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡを含むクローンの配列分析によって、このクローンが同じポリペプチドをコードするが、ＯＳＣＡＲゲノム配列由来のイントロン配列を含むプロセシングされていない（すなわち、スプライシングされていない）ＯＳＣＡＲ ｍＲＮＡに由来することが、明らかになった。
【０２７７】
クローンＯＣＬ１７８の配列分析により、このクローン中に含まれるｃＤＮＡが、全長ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ配列のフラグメントに対応することが確認された。詳細には、ＯＣＬ１７８中に含まれるＯＳＣＡＲ核酸配列（図２Ａ；配列番号４）は、図１Ｃ（配列番号３）に示されるＯＳＣＡＲポリペプチド配列のアミノ酸残基１６１〜１６５をコードする、全長マウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ配列のフラグメントに対応する。この特定のフラグメントのアミノ酸配列は、図２Ｂおよび配列番号５にもまた、別に示される。
【０２７８】
推定マウスＯＳＣＡＲポリペプチドのアミノ酸配列分析は、ＯＳＣＡＲが２６４アミノ酸残基の新規なＩｇ様レセプターであることを示す。この全長マウスＯＳＣＡＲポリペプチドは、シグナルペプチド配列（アミノ酸残基１〜１６に対応する）、２つのＩｇ様ドメイン配列（それぞれ、アミノ酸残基１７〜１２２および１２３〜２２８に対応する）、単一の膜貫通ドメイン配列（アミノ酸残基２２９〜２４７に対応する）、および短い細胞質テール配列（アミノ酸残基２４８〜２６４に対応する）を含む。これらの個々のドメインを描写するために使用されたアミノ酸残基数は概数であることが、理解される。
【０２７９】
ＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムを使用してＮＣＢＩ核酸およびタンパク質データベースにおいて相同配列について検索することにより、図１Ａ〜Ｃ（配列番号１〜３）に示されるＯＳＣＡＲ核酸配列およびＯＳＣＡＲポリペプチド配列が新規であることが、確認された。本明細書に記載されるマウスＯＳＣＡＲ配列に対応する核酸配列もタンパク質配列も、これらのデータベースにおいて同定されなかった。しかし、このＯＳＣＡＲポリペプチド配列は、他の２つのＩｇ様レセプターに対して有意な配列相同性を示した。詳細には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用するＮＣＢＩタンパク質データベースの検索により、このマウスＯＳＣＡＲポリペプチド（図１Ｃ；配列番号３）が、マウスＰｉｒＡ（登録番号ＡＡＣ５３２１７．１）に対して２６．４％同一性を有し、そしてタンパク質ウシＦｃαＲ（登録番号Ｐ２４０７１）に対して２４．２％同一性を有することが、明らかになった。
【０２８０】
このＯＳＣＡＲポリペプチド配列の膜貫通ドメインは、他のＩｇ様レセプター（前記のようなマウスＰｉｒＡおよびウシＦｃαＲを含む）に対するアミノ酸配列類似性を示す。さらに、このＯＳＣＡＲポリペプチドの膜貫通配列中に保存されたアルギニン（図１Ｃおよび配列番号３におけるアミノ酸残基２３１）が存在することは、膜貫通シグナル伝達アダプターモチーフとの会合活性を示す。このようなシグナル伝達アダプターは、例えば、ＯＳＣＡＲポリペプチドと免疫共沈するタンパク質を同定することによってか、またはこの膜貫通配列のすべてもしくは一部を好ましくは含むＯＳＣＡＲポリペプチドのフラグメントと免疫共沈するタンパク質を同定することによって、容易に同定し得る（上記、スクリーニングアッセイを参照のこと）。
【０２８１】
Ｉｇ様レセプターは、これらのレセプターを発現する細胞の発生および／または機能の調節に関与することが公知である。さらに、Ｉｇ様レセプターの活性は、通常はＩｇ様ドメインにて、特定のリガンドとの結合を介して媒介される。従って、図１Ｃおよび配列番号３に示されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチドの配列分析は、ＯＳＣＡＲがＯＳＣＡＲ特異的リガンド（本明細書中でＯＳＣＡＲ−Ｌと呼ばれる）と相互作用し、そしてこのような相互作用は破骨細胞の発生および機能を調節するという、知見を支持する。
【０２８２】
（実施例３：マウスおよびヒトのゲノムＤＮＡは、マウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡにハイブリダイズする）
本実施例は、マウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡにハイブリダイズするヒトゲノムＤＮＡの同定を開示する。このヒトＯＳＣＡＲゲノムＤＮＡを、ＢＬＡＳＴ検索（これもまた本明細書中に記載される）を介してさらに特徴付けた。
【０２８３】
（材料および方法）
（サザンブロット分析） サザンブロット分析を、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液（３０％ホルムアミド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２．５×デンハート溶液、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．５ｍｇ／ｍｌ超音波処理済サケ***ＤＮＡ）を使用して、４２℃にて１６時間実施した。その膜を、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ）を使用して、５０℃にて２回洗浄した（洗浄１回につき２０分間）。
【０２８４】
（結果および考察）
（マウスＯＳＣＡＲは、単一遺伝子に由来する） マウスゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素およびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、そして、図１Ｃ（配列番号３）に示される全長マウスＯＳＣＡＲポリペプチド配列をコードする３２Ｐ標識ｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析によって、分析した。７．０ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントおよび５．０ｋｂ ＢｇｌＩＩフラグメントが、ＯＳＣＡＲプローブにハイブリダイズした（図１２Ａ）。これらの結果は、上記の選択的スプライシングされた４．０ｋｂ ｃＤＮＡ、１．８ｋｂ ｃＤＮＡ、および１．０ｋｂ ｃＤＮＡにおいて同定されたマウスＯＳＣＡＲ配列が、単一マウス遺伝子の選択的スプライシングされた転写物であることを、示す。
【０２８５】
（ヒトゲノムＤＮＡは、マウスＯＳＣＡＲ核酸にハイブリダイズする） ヒトゲノムＤＮＡもまたＥｃｏＲＩ制限酵素およびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、そして、マウスゲノムＤＮＡを分析するために使用した（上記）のと同じ全長ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプローブおよびハイブリダイゼーション条件を使用するサザンブロット分析によって、分析した。マウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプローブは、ヒトゲノムＤＮＡの約１．６５ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイズし、かつヒトゲノムＤＮＡの約５．５ｋｂ ＢｇｌＩＩフラグメントとハイブリダイズする（図１２Ｂ）。従って、本発明のマウスＯＳＣＡＲ核酸分子に対するハイブリダイゼーションにより検出および同定され得る、ヒトＯＳＣＡＲホモログもまた存在する。
【０２８６】
（ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子の同定および特徴付け） このＢＬＡＳＴＮアルゴリズムは、ＮＣＢＩ核酸データベースを検索して図１Ａ〜Ｂ（配列番号１〜２）に示されるマウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ配列に相同な配列を同定するために、そのアルゴリズムのデフォルトパラメータを用いて使用した。これらのデータベースは、公知の多数の遺伝子の核酸配列を含むだけではなく、部分的なヒトゲノム配列も含む。
【０２８７】
このＢＬＡＳＴ検索により、ヒト第１９染色体のクローンＣＴＤ−３０９３中に含まれるヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０１２３１４．５；ＧＩ：７７１５４７）の一部は、マウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ配列に対して相同性を共有することが、明らかになった。従って、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子は、この染色体上に位置する。このヒト第１９染色体配列をマウスＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡ配列と比較することによって、このゲノムヒトＯＳＣＡＲ核酸配列のエキソンを同定した。
【０２８８】
図７Ａ〜Ｄおよび配列番号１２は、ヒト第１９染色体上のこの新規なヒトＯＳＣＡＲ遺伝子を含む領域のヌクレオチド配列を示す。特に、配列番号１２および図７Ａ〜Ｄに示されるヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに供託されたヒト第１９染色体クローンＣＴＤ−３０９３の配列（登録番号ＡＣ０１２３１４．５；ＧＩ：７７１１５４７）からのヌクレオチド１１７００１〜１２４９２０の配列に対応する。この染色体領域内に含まれる新規なＯＳＣＡＲゲノム配列のエキソンは、図７Ａ〜Ｄにおいて大文字により示され、一方、このＯＳＣＡＲ遺伝子内のイントロン配列は、小文字で示される。この新規なＯＳＣＡＲゲノム配列のイントロン／エキソン境界のヌクレオチド残基数はまた、上記表１に示され、これは、配列番号１２におけるヌクレオチド残基数に対する。
【０２８９】
このヒトＯＳＣＡＲ遺伝子をさらに特徴付けるために、ヒト破骨細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーを、マウスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための上記の技術と同様の技術を使用して、スクリーニングした。ヒトＯＳＣＡＲの３つのスプライス改変体またはアイソフォームを、同定した。これらの３つのアイソフォームは、本明細書中でそれぞれ、Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム、Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォーム、およびＣ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームと呼ばれる。これらの３つのアイソフォームの各々についてのｃＤＮＡ配列は、図３Ａおよび配列番号６（Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）、図４Ａおよび配列番号８（Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）、ならびに図５Ａおよび配列番号８（Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）に示される。これら３つのアイソフォームの各々によりコードされるＯＳＣＡＲポリペプチドについての推定アミノ酸配列もまた、本明細書において、図３Ｂおよび配列番号７（Ｃ１８ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）、図４Ｂおよび配列番号９（Ｃ１６ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）、ならびに図５Ｂおよび配列番号１１（Ｃ１０ヒトＯＳＣＡＲアイソフォームについて）に提供される。これらの配列を、後に再配列決定し、そして些細な配列決定訂正して確認した。特に、ヒトＯＳＣＡＲ Ｃ１８アイソフォームのｃＤＮＡの核酸残基３２８（図３Ａおよび配列番号６に示される）が、もともと配列決定したときのチミジンでなくグアニン（Ｇ）であることを決定した。この訂正は、Ｃ１８スプライス改変体についての推定アミノ酸配列（図３Ｂおよび配列番号７に示される）における些細な変化をもたらし、そのアミノ酸残基９７は、もともと推定したときのイソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）でなく、セリン（ＳまたはＳｅｒ）である。Ｃ１８アイソフォームについて訂正した核酸配列およびアミノ酸配列は、本明細書中で図３Ａおよび３Ｂ、ならびに配列番号６および７に、それぞれ提示される。
【０２９０】
同様に、ヒトＯＳＣＡＲ Ｃ１０アイソフォームｃＤＮＡの核酸残基２９５（図５Ａおよび配列番号１０に示される）が、もともと配列決定したときのチミジンでなくグアニン（Ｇ）であることを決定した。この訂正は、Ｃ１０スプライス改変体についての推定アミノ酸配列（図５Ｂおよび配列番号１１に示される）における些細な変化をもたらし、そのアミノ酸残基８６は、もともと推定したときのイソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）でなく、セリン（ＳまたはＳｅｒ）である。Ｃ１０アイソフォームについて訂正した核酸配列およびアミノ酸配列は、本明細書中で図５Ａおよび５Ｂ、ならびに配列番号１０および１１に、それぞれ提示される。
【０２９１】
ヒトＯＳＣＡＲポリペプチド配列とマウスＯＳＣＡＲポリペプチド配列との整列（図６）により、これらの配列が、非常に高いレベルの相同性を共有することが確認される。特に、この２つの配列は、７４．６％（すなわち、約７５％）同一であることが見出された。
【０２９２】
（実施例４：ＯＳＣＡＲの細胞外ドメインを含む融合タンパク質は、破骨細胞の変異および活性を調節する）
本実施例は、本発明のＯＳＣＡＲアミノ酸配列を含む、特定の融合ポリペプチドを記載する。本実施例はまた、予備実験を記載し、この予備実験は、このような融合ポリペプチドが、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドに結合可能であること、そして破骨細胞活性を調節するために使用され得ることを、示す。
【０２９３】
（材料および方法）
（ＦＡＣＳ分析） ＦＡＣＳ分析を、例えば、Ｓｈａｒｒｏｗ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ（Ｃｏｌｉｇａｎら編）第５．１〜５．２章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃにより記載される慣用的方法；およびＫｅｖｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ（Ｃｏｌｉｇａｎら編）第５．３章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載される慣用的方法に従って、実施した。
【０２９４】
（融合タンパク質の生成） ＯＳＣＡＲの細胞外ドメインを含む融合タンパク質を、下記のように生成した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を使用するＰＣＲを使用して、関連するＯＳＣＡＲドメインおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分を増幅した。
【０２９５】
（ｐｃＤＮＡにおけるＯＳＣＡＲ−Ｆｃの生成） 図１Ｃに示されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメイン（配列番号３；アミノ酸残基１〜２２８）をコードする核酸を、５’ＯＳＣＡＲ−Ｍｅｔ−ＲＩおよび３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−Ｂｇｌ ｉｉ（それぞれ、配列番号１３〜１４）と呼ばれるプライマーを使用して、ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。
【０２９６】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を、５’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（配列番号１５）および３’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（配列番号１６）と呼ばれるプライマーを使用して、ヒトｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。この第２のＰＣＲ反応からの生成物を、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化した。その後、両方のＰＣＲ反応からの消化産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを使用してｐｃＤＮＡ１発現ベクター中に連結した。
【０２９７】
使用したプライマーの核酸配列は、以下の通りである：
５’−ＯＳＣＡＲ−Ｍｅｔ−ＲＩ： ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＡＴＡＣＴＣ−３’（配列番号１３）
３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−Ｂｇｌ ｉｉ： ５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣＴＧＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１４）
５’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１： ５’−ＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号１５）
３’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１： ５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＴ−３’（配列番号１６）。
【０２９８】
（ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓにおけるＯＳＣＡＲ−Ｆｃの作製） ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを使用して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクターｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。
【０２９９】
（ｐＧＥＸ６ｐ−１におけるＧＳＴ−ＯＳＣＡＲの作製） 図１Ｃに示されるＯＳＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメイン（配列番号３；アミノ酸残基１〜２２８）をコードする核酸配列を、５’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨＲ（配列番号１７）および３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＳＴＯＰ−ＸｈｏＩ（配列番号１８）と呼ばれるプライマーを使用して、ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを使用して、ｐＧＥＸ６ｐ−１ベクター中に連結した。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中にトランスフェクトし、そしてＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌ誘導法を使用してそのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中で発現させた（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照のこと）。
【０３００】
使用したプライマーの核酸配列は、以下の通りである：
５’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨＲ： ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）
３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＳＴＯＰ−ＸｈｏＩ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１８）。
【０３０１】
（ｐＧＥＸ６ｐ−１におけるＧＳＴ−Ｆ−ＯＳＣＡＲの作製） 図１Ｃ（配列番号３）に示されるＯＳＣＡＲポリペプチドの第１のＩｇ様ドメイン（すなわち、アミノ酸残基１７〜１２２）をコードする核酸配列を、５’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨＲ（配列番号１７、上記）および３’−ＯＳＣＡＲ−ＥｃＩ−ＳＴＯＰ−ＸｈｏＩ（配列番号１９）と呼ばれるプライマーを使用して、ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてｐＧＥＸ６ｐ−１ベクター中に連結した。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中にトランスフェクトし、そしてＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌ誘導法を使用してそのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中で発現させた（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照のこと）。
【０３０２】
使用したプライマーの核酸配列は、以下の通りである：
５’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨＲ： ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）
３’−ＯＳＣＡＲ−ＥｃＩ−ＳＴＯＰ−ＸｈｏＩ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＣＣＧＴＴＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号１９）。
【０３０３】
（ｐＧＥＸ６ｐ−１におけるＧＳＴ−Ｓ−ＯＳＣＡＲの作製） 図１Ｃ（配列番号３）に示されるＯＳＣＡＲポリペプチドの第２のＩｇ様ドメイン（すなわち、アミノ酸残基１２３〜２２８）をコードする核酸配列を、５’−ＯＳＣＡＲ−ＥｃＩＩ−ＨＲ（配列番号２０）および３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＳＴＯＰ−ＸｈｏＩ（配列番号１８、上記）と呼ばれるプライマーを使用して、ＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてｐＧＥＸ６ｐ−１ベクター中に連結した。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中にトランスフェクトし、そしてＩＰＴＧおよびＸｇａｌ誘導法を使用してそのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株細胞中で発現させた（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記を参照のこと）。
【０３０４】
使用したプライマーの核酸配列は、以下の通りである：
５’−ＯＳＣＡＲ−ＥｃＩＩＩ−ＲＩ： ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴ−３’（配列番号２０）
３’−ＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＳＴＯＰ−Ｘｈｏ Ｉ： ５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＴＧＧＧＴＡＴＡＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１８）。
【０３０５】
（ＯＳＣＡＲ−Ｆｃの精製） ＯＳＣＡＲ−ＩｇＧを、記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）ようにプロテインＡクロマトグラフィーを使用して、培養上清から精製した。
【０３０６】
（破骨細胞成熟アッセイ） 破骨細胞を、Ｓｕｄａら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ １９７７、２８２、２２３〜３５）により記載されるように、野生型マウスおよびＴＲＡＮＣＥノックアウトマウスの頭蓋冠から単離した。破骨細胞と造血前駆体との同時培養実験において、骨髄細胞（１×１０５細胞）および破骨細胞（１×１０４細胞）を、１×１０−７Ｍまたは１×１０−８Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の存在下で、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で、９６ウェルプレート（０．２ｍｌ／ウェル）にて同時培養した。２０μｇ／ｍｌのＯＳＣＡＲ−ＩｇＧまたはヒトＩｇＧ１を培養物に添加して、破骨細胞の分化の間のＯＳＣＡＲの役割を観察した。１６０μｌの古い培地を新鮮な培地で置換することによって、３日ごとに培養液を供給した。６日または７日の間培養した後、細胞を固定し、記載された（Ｗａｎｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９９、１４０：１９２７〜１９３５）ように、ＴＲＡＰ（ＳＩＧＭＡ）について染色した。３つを超える核を有するＴＲＡＰ（＋）多核性破骨細胞の数を、ウェル各々から計数した。
【０３０７】
（結果および考察）
（ＯＳＣＡＲ−Ｌは、破骨細胞の表面上に発現される） マウス頭蓋冠由来の初代破骨細胞を、アイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１タンパク質（図１３Ａ）、または上記の材料および方法の節に記載されるＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドのいずれかで染色（すなわち、インキュベート）し（図１３Ｂ）、その後、ＰＥ結合体化抗ヒトＩｇＧ１抗体とともにインキュベートした。その後、その細胞をＦＡＣＳによって分析し、これらの細胞に関連するＰＥ蛍光のレベルを検出した。その結果を、図１３Ａ〜Ｂに示すヒストグラムにおいて示す。詳細には、これらのヒストグラムは、各実験について、特定レベルのＰＥ蛍光（水平軸）を有する、観察された細胞の数（垂直軸）を示す。より高い観察された蛍光レベルを有する細胞は、より多量のＰＥ結合体化抗体がそれらの細胞に結合していることを示す。次いで、このＰＥ結合体化抗ヒトＩｇＧ抗体は、細胞表面に結合したｈＩｇＧ（図１３Ａ）またはＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図１３Ｂ）のいずれかに、例えば、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドへの結合によって結合することによって、その細胞に間接的に結合する。
【０３０８】
ＰＥ蛍光レベルは、その細胞をＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドとともにインキュベートした場合に、ＩｇＧ１コントロールとともにインキュベートした細胞におけるＰＥ蛍光と比較して、有意に増加した。従って、このデータは、破骨細胞が、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドに特異的に結合する化合物（すなわち、ＯＳＣＡＲリガンド）を発現することを示す。特に、ＩｇＧ１ポリペプチドが破骨細胞に結合しなかったので、それらの細胞により発現されたＯＳＣＡＲリガンドは、これらの実験において使用したＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドのＯＳＣＡＲポリペプチド配列に特異的に結合し、かつその融合ポリペプチドのＩｇＧ１配列には結合しない。
【０３０９】
ＰＥ蛍光レベルは、破骨細胞をビタミンＤ３または副甲状腺ホルモンのいずれかで処理した同じ実験においても、有意には変化しなかった。ビタミンＤ３または副甲状腺ホルモンは、それぞれ、破骨細胞および破骨細胞活性を増加させることが公知である。従って、そのＯＳＣＡＲリガンドの発現は、このような化合物により影響されない。
【０３１０】
（ＯＳＣＡＲ−Ｉｇの添加は、破骨細胞活性を調節する） ＯＳＣＡＲポリペプチドが破骨細胞および／または骨芽細胞の活性を調節する能力を試験するために、パイロット実験を行った。マウスの骨髄細胞および骨芽細胞を、破骨細胞成熟アッセイにおいて、上記のように共培養した。指定された単一の時点での共培養物の観察は、アイソタイプ−コントロールヒトＩｇＧ１タンパク質で処理したＴＲＡＰ染色共培養物において、成熟（すなわち、多核性）破骨細胞の存在を明らかにしなかった。ビタミンＤ３（１００ｎＭ）およびコントロールＩｇＧ１タンパク質での共培養した骨髄細胞および骨芽細胞のさらなる処理は、ＴＲＡＰ染色によって検出されたように、多核性の破骨細胞の形成を誘導した。より低いレベルのビタミンＤ３（１０ｎＭ）での共培養した骨髄細胞および骨芽細胞の処理は、いくらかの破骨細胞前駆細胞の形成を生じたが、成熟した多核性の破骨細胞は、ＴＲＡＰ染色によって検出されなかった。これらの結果は、骨芽細胞中のＴＲＡＮＣＥを活性化し、それによって破骨細胞成熟を誘導する、ビタミンＤ３の既知の能力に起因して、予測どおりである。実際、ＴＲＡＮＣＥノックアウト破骨細胞を骨髄細胞とこの共培養したコントロール実験において、同様のレベルのビタミンＤ３での処理は、破骨細胞の成熟に対して効果を有さなかった。
【０３１１】
対照的に、ビタミンＤ３（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）および上記のＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドでの共培養細胞の処理は、上記のコントロール実験と比較して、形成された成熟多核性破骨細胞の数の明らかな増加を生じた。これらの結果を、図１４に定量的に示す。
【０３１２】
ＴＲＡＰ（＋）多核性細胞の観察は、破骨細胞成熟を示す。従って、ＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドの存在下でのこれらの細胞数の増加は、破骨細胞活性が、この特定のパイロット実験の特定の条件下で、いくつかの様式で調節されたことを示唆する。いかなる特定の理論にも作用機構にも限定されないが、これらの実験において使用された可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドは、骨芽細胞によって発現されるＯＳＣＡＲ特異的リガンドに競合的に結合し、それによって、そのＯＳＣＡＲ特異的リガンドと、骨髄細胞によって（例えば、骨髄細胞中の破骨細胞前駆細胞および未成熟破骨細胞によって）発現されるＯＳＣＡＲポリペプチドとの間の相互作用を妨げると考えられる。
【０３１３】
従って、これらの実験において示されたデータは、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ特異的リガンドを使用して、破骨細胞の成熟および／または活性を調節し、それによって、骨組織の成長、発達、修復、分解、吸収または恒常性に関連するプロセスの調節を可能にし得ることを示す。
【０３１４】
（実施例５：ＯＳＣＡＲの細胞外ドメインを含む融合タンパク質は、破骨細胞の成熟および活性を阻害する）
この実験は、予備データ（上記実施例４に示される）によってＯＳＣＡＲが破骨細胞活性を調節し得ることを示された後に行った、さらなるより確定的な実験を記載する。詳細には、破骨細胞成熟の速度論的測定からのデータを提示する。これらのデータは、破骨細胞の活性を調節するＯＳＣＡＲ融合ポリペプチドの能力をさらに特徴付ける。
【０３１５】
（材料および方法）
（ＯＳＣＡＲ−Ｆｃ融合タンパク質の生成および精製） ＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合タンパク質の調製を、実施例４に先に記載のように行った。
【０３１６】
（破骨細胞成熟の速度論的測定） 骨髄細胞および破骨細胞を、先の実施例４に記載のように、野生型マウスおよびＴＲＡＮＣＥノックアウトマウスから単離し、そして９６ウェルプレート中で共培養した。元の共培養物よりも高い破骨細胞特異的前駆細胞の集団を含む、浮遊細胞培養物もまた調製した。手短に言うと、全骨髄培養物（３×１０５細胞）を５ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）で処理し、その後、得られたマクロファージ細胞を除去することよって、この浮遊培養物を調製した。
【０３１７】
１０ｎＭのビタミンＤ３をこれらの培養物に添加し、破骨細胞成熟を刺激した。２０μｇ／ｍｌのＯＳＣＡＲ−ＩｇまたはヒトＩｇＧ１のいずれかもまた、培養物に添加して、破骨細胞分化中のＯＳＣＡＲの役割を観察した。コントロール培養物もまた、１０ｎＭのビタミンＤ３のみ（すなわち、ＯＳＣＡＲもＩｇＧ１もなし）を添加して調製したか、またはビタミンＤ３もタンパク質も添加しない培地中で培養したかのいずれかであった。少なくとも６日間培養した後、ウェル中のＴＲＡＰ（＋）多核性細胞の数を、先に実施例４に記載したように、毎日カウントした。
【０３１８】
（象牙質吸収アッセイ） 骨吸収活性を示す、象牙質吸収アッセイを、以前に記載されたように行った。例えば、Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９３，８（８）：９５３−６０；およびＳｕｄａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９７、２８２：２２３−２５を参照のこと。
【０３１９】
手短に言うと、マウスの骨芽細胞および骨髄細胞の共培養物を、象牙質スライス上で、かつ１０ｎＭのビタミンＤ３の存在下で、上記のように調製した。２０μｇ／ｍｌのＯＳＣＡＲ−ＩｇＧまたはヒトＩｇＧ１をこの培養物に添加し、破骨細胞活性（すなわち、骨吸収または象牙質吸収）に対するＯＳＣＡＲの役割を観察した。コントロール培養物もまた、１０ｎＭのビタミンＤ３のみ（すなわち、ＯＳＣＡＲ−ＩｇもＩｇＧ１もなし）の存在下でか、あるいはビタミンＤ３または融合タンパク質のいずれにも曝露しないでのいずれかで、象牙質スライス上で増殖させた。
【０３２０】
６日間の象牙質スライス上での培養後、細胞をＴＲＡＰで染色し、多核性の破骨細胞を検出した。象牙質スライス中の吸収窩を、光学顕微鏡で可視化した。
【０３２１】
（結果および考察）
（ＯＳＣＡＲ−Ｉｇの添加は、ＴＲＡＰ（＋）の数を減少させる）
（多核性細胞） ＯＳＣＡＲが破骨細胞の成熟および／または活性をどのように調節し得るかをより良好に特徴付けるために、ＯＳＣＡＲポリペプチドの存在下および非存在下の両方で数日間の期間にわたって破骨細胞成熟をモニターする、速度論的実験を行った。この速度論的実験は、ＯＳＣＡＲが有し得る破骨細胞に対する効果を完全に特徴付けるために必要である。なぜなら、成熟破骨細胞は、通常は、培養物中で生存可能に存続しないからである。従って、破骨細胞を刺激する因子は、培養物中で観察される成熟（すなわち、多核性）破骨細胞の数の最初の増加、およびその後の成熟後細胞死に起因する数の減少によって、特徴付けられ得る。図１５Ａ〜１５Ｃは、共培養マウス骨髄細胞および骨芽細胞（図１５Ａ〜１５Ｂ）、および破骨細胞特異的前駆細胞のより高い集団を含む浮遊細胞培養物（図１５Ｃ）を使用した、速度論的実験について得られたデータを示す。
【０３２２】
図１５Ａにおいて定量的に示されるように、多核性ＴＲＡＰ（＋）細胞の数によって示される、全骨髄培養物中のビタミンＤ３刺激骨芽細胞成熟は、処理後約７日で劇的にピークに達する。しかし、この最初の増加の後、それぞれ８日目および９日目までに、活性は、迅速に進行的に減少する。対照的に、ビタミンＤ３およびＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドでの共培養物の処理は、コントロール実験と比較して、６日目〜９日目に形成されるＴＲＡＰ（＋）細胞数において有意な減少を生じた。
【０３２３】
処理７日後（この時点で、刺激された破骨細胞成熟がピークに達した）で共培養物中に存在する成熟（すなわち、ＴＲＡＰ（＋）、多核性）細胞の数を示す棒グラフを、図１５Ｂに示す。ビタミンＤ３のみの存在下またはコントロールＩｇＧと共にビタミンＤ３の存在下のいずれかで培養した細胞は、成熟破骨細胞の数の顕著な増加（１ウェル当たり約１５０〜２００個の細胞）を示す。成熟破骨細胞の数は、ビタミンＤ３およびＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合タンパク質を含む共培養物においては大いに減少される（すなわち、１ウェル当たり５０個未満の細胞）。
【０３２４】
浮遊細胞培養物についての速度曲線（図１５Ｃ）は、ＴＲＡＰ（＋）細胞の数において類似するが、より段階的な増加が、ビタミンＤ３によって処理の約７日後で誘導され、少なくとも９日目まで継続する。ビタミンＤ３およびコントロールヒトＩｇＧ１タンパク質での浮遊細胞培養物の処理は、予測されたように、類似の増殖曲線を生じる。しかし、ビタミンＤ３およびＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合タンパク質での浮遊細胞培養物の処理は、図１５Ａに示される共培養された骨髄細胞および骨芽細胞培養物について観察された阻害と類似の様式で、破骨細胞の成熟を有意に阻害する。
【０３２５】
（ＯＳＣＡＲ−Ｉｇは、破骨細胞による象牙質吸収を阻害する） 象牙質吸収アッセイ実験もまた、以前に記載されたように行い（例えば、Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８、９５：３５９７−３６０２；およびＴａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９３、８：９５３−９６０）、破骨細胞および／または骨芽細胞の活性に対するＯＳＣＡＲの効果をより徹底的に特徴付けた。より詳細には、このアッセイは、骨または象牙質の吸収に対するＯＳＣＡＲの効果を検出する。図１６のパネルＡ〜Ｅは、象牙質スライド上で共培養した、ＴＲＡＰ（＋）染色マウス骨芽細胞および骨髄細胞の顕微鏡写真を示す。図１６のパネルＦ〜Ｊは、対応する象牙質スライドの顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真の暗い染色は、象牙質が吸収された、スライド中の窩を示す。
【０３２６】
予測されるように、ビタミンＤ３を含まない象牙質スライド上で共培養した細胞（パネル１６Ａ）は、ＴＲＡＰ（＋）細胞の欠失によって示されるように、ほとんどまたは全く破骨細胞成熟を示さない。同様に、その対応する象牙質スライド上には、吸収が示されない（図１６Ｆ）。対照的に、１０−８ＭのビタミンＤ３のみ（図１６Ｂ）またはコントロールＩｇＧタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）と共に１０−８ＭのビタミンＤ３（図１６Ｅ）のいずれかに曝露した場合、象牙質スライド上の共培養物は、顕著に増加したＴＲＡＰ（＋）染色を示す。象牙質吸収を示す暗い染色もまた、それらの対応する象牙質スライド（それぞれ、図１６Ｇおよび１６Ｊ）上に観察される。これらの吸収窩は、対応する細胞培養物中のＴＲＡＰ（＋）染色領域と相関し、これは、予測されたように、破骨細胞成熟の増加が吸収の増加と相関することを確証する。
【０３２７】
これらの陽性コントロールで観察されたものとは対照的に、１０−８ＭのビタミンＤ３と一緒にＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（２０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした象牙質上の共培養物は、ごくわずかにしかＴＲＡＰ（＋）染色を示さないかまたは全くＴＲＡＰ（＋）染色を示さず（図１６Ｃ）、そして象牙質吸収は、ほとんどまたは全く存在しない（図１６Ｈ）。従って、ＯＳＣＡＲ−Ｉｇでの処理は、実際には、破骨細胞の活性を阻害し、そしてより詳細には、骨または象牙質の吸収を阻害する。
【０３２８】
ＯＳＣＡＲ−Ｉｇで観察されたこれらの結果を確認するために、陰性コントロール実験もまた実施した。詳細には、骨芽細胞および骨髄細胞の共培養物を、１０−８ＭのビタミンＤ３およびマウスＴＲＡＮＣＥインヒビター（ｍＴＲ−Ｆｃ）（破骨細胞活性の公知のインヒビター（Ｆｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８、１８８：９９７−１０００））と共にインキュベートした。予測されたように、これらの共培養物において、ＴＲＡＰ（＋）染色は、ほとんどまたは全く観察されず（図１６Ｄ）、存在した場合でも、ごくわずかな象牙質吸収しか生じなかった（図１６Ｉ）。
【０３２９】
これらの象牙質吸収実験からの結果を、図１７に定量的に示す。詳細には、これらの図の棒グラフは、共培養した破骨細胞および骨髄細胞の各スライス上でカウントされた、象牙質吸収窩の平均の数を示す。平均して１００個を超える窩が、ビタミンＤ３のみ（１０２．７±１６．８個）またはコントロールＩｇＧ１タンパク質（１１４．７±２２．２個）と共にインキュベートしたスライス上で観察された。対照的に、ＯＳＣＡＲ−Ｉｇと共にインキュベートすると、１０分の１未満に吸収が阻害され、各スライス上には１０個未満（７±２）の窩が観察される。
【０３３０】
従って、これらの実験からのデータは、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ特異的リガンドが、破骨細胞の成熟および／または活性（例えば、本明細書中に記載される象牙質吸収アッセイによって測定または推測され得る、骨または象牙質の吸収のような活性を含む）を調節するために使用され得ることを確証する。詳細には、いかなる特定の理論にも作用機構にも限定されないが、これらの実験において使用された可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドは、骨芽細胞によって発現されるＯＳＣＡＲ特異的リガンドに競合的に結合し、それによって、骨髄細胞によって（例えば、破骨細胞前駆細胞によって、および骨髄細胞中の未成熟破骨細胞によって）発現されるＯＳＣＡＲポリペプチドが活性化されるのを妨げると考えられる。結果として、ＯＳＣＡＲがその特定のリガンドに結合することによって通常活性化または刺激される、破骨細胞の成熟および活性は、阻害される。従って、本発明の方法および組成物を使用して、破骨細胞活性に関連するプロセス（骨組織の成長、発達、修復、分解、吸収または恒常性に関連するプロセスが挙げられるが、これらに限定されない）が容易に調節され得る。
【０３３１】
（実施例６：ＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合タンパク質が破骨細胞成熟を阻害する能力は、種間で交差反応性である）
上記の実施例４および５は、マウス由来のＯＳＣＡＲ核酸配列およびＯＳＣＡＲアミノ酸配列を使用する、可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチド（ＯＳＣＡＲ−ＩｇまたはｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇと称する）の調製および単離を記載する。これらの実施例はまた、マウス細胞の成熟および活性を調節するための可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドの使用を実証する。
【０３３２】
本実施例は、ヒト由来のＯＳＣＡＲ核酸配列およびＯＳＣＡＲアミノ酸配列を使用する可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチド（ｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇと称する）の調製および単離を記載し、ヒト細胞の成熟および活性を調節するためのこの可溶性ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドの使用をさらに実証する。ＯＳＣＡＲが異なる種間で交差反応性であることを示すデータもまた示される。詳細には、本実施例は、ヒト細胞の成熟および活性を調節するための可溶性マウスＯＳＣＡＲポリペプチドの使用を実証する。同様に、マウス細胞の成熟および活性を調節するためのヒトＯＳＣＡＲポリペプチドの使用もまた記載する。
【０３３３】
（材料および方法）
（ｐｃＤＮＡにおけるｈＯＳＣＡＲ−Ｆｃの生成） 図３Ａに示されるヒトＯＳＣＡＲポリペプチドの細胞外ドメイン（配列番号６：アミノ酸残基１〜２１９）をコードする核酸配列を、５’ｈＯＳＣＡＲ−Ｍｅｔ−ＸｈｏＩおよび３’−ｈＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨｉｎｄＩＩＩと称するプライマー（それぞれ、配列番号２１および配列番号２２）を使用して、ｈＯＳＣＡＲ ｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【０３３４】
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＳおよびＴｈｒｏｍｂｉｎ−ＡＳと称するプライマー（それぞれ、配列番号２３および配列番号２４）を使用して、上記の生成された産物をさらに増幅することによって、トロンビン部位を、ヒトＯＳＣＡＲの末端に挿入した。
【０３３５】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を、５’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（配列番号１５）および３’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１（配列番号１６）と称するプライマーを使用して、ヒトｃＤＮＡプラスミドからＰＣＲ増幅した。この第３のＰＣＲ反応由来の産物を、Ｂｇｌ ＩＩおよびＸｂａＩで消化した。次いで、両方のＰＣＲ反応由来の消化産物を、Ｅｘ６およびＸｂａＩを使用して、ｐｃＤＮＡ１発現ベクターに連結した。
【０３３６】
使用したプライマーの核酸配列は、以下のとおりである：
５’ｈＯＳＣＡＲ−Ｍｅｔ−ＸｈｏＩ：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号２１）
３’−ｈＯＳＣＡＲ−Ｅｃ−ＨｉｎｄＩＩＩ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡ−３’（配列番号２２）
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ｓ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧ−３’（配列番号２３）
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ＡＳ：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧ−３’（配列番号２４）
５’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１：５’−ＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号１５）
３’−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１：５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＴ−３’（配列番号１６）。
【０３３７】
（ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓにおけるｈＯＳＣＡＲ−Ｆｃの生成） ｈＯＳＣＡＲ−Ｆｃ ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩを使用して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクターｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。
【０３３８】
（ｈＯＳＣＡＲ−Ｆｃの精製） ｈＯＳＣＡＲ−ＩｇＧを、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出）プロテインＡクロマトグラフィーを使用して培養上清から精製した。
【０３３９】
（ヒト単球培養物の生成） 血液白血球を、Ｌｅｕｋｏｐａｋフィルターを使用する連続濾過白血球搬出法（ＣＦＬ）によって収集し、次いで、向流遠心溶離に供して、質量によって分けられた別々の画分を得た。ＣＤ１４＋細胞について約９０％の純度を含む画分は、単球である。Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９８、２４６（１）：１９９−２０４に記載されるように、この単球を維持し、そしてヒト破骨細胞へ分化するように誘導した。
【０３４０】
（マウス骨髄細胞培養物） マウス骨芽細胞および骨髄細胞の共培養物を、実施例４に記載されるように調製した。
【０３４１】
（象牙質吸収アッセイ） 象牙質吸収アッセイを、上記のように調製したヒト単球細胞培養物を使用して、慣用的なプロトコル（実施例５（前出）およびＴａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９３、８（８）：９５３−９６０）に従って行った。
【０３４２】
（結果および考察）
（ＯＳＣＡＲ−Ｉｇは、ヒト破骨細胞の成熟および活性を阻害する） 実施例４および５（前出）に記載の実験と同様の実験を、可溶性マウスＯＳＣＡＲポリペプチドおよびヒトＯＳＣＡＲポリペプチド（それぞれ、ｍＯＳＣＡＲ−ＩｇおよびｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇ）を使用して行い、ＯＳＣＡＲポリペプチドがヒト細胞の成熟および／または活性を調節する能力を特徴付けた。詳細には、ヒト単球細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＮＣＥ（２００ｎｇ／ｍｌ）、および２０ｎｇ／ｍｌの可溶性ｈＯＳＣＡＲ−ＩｇまたはｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇのいずれかの存在下で培養し、そしてＴＲＡＰ（＋）多核性細胞を、曝露後５日および１０日にのいずれかでカウントした。これらのデータを、それぞれ、図１８Ａ（曝露後５日）および図１８Ｂ（曝露後１０日）にグラフで示す。コントロール実験もまた行い、ここでは、ヒト単球を、Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥのみ（すなわち、ＯＳＣＡＲ−Ｉｇなし）と共にか、またはＭ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびヒトＩｇＧ１ポリペプチドと共にのいずれかで培養した。ネガティブコントロールのために、ヒト単球細胞を、Ｍ−ＣＳＦのみ（すなわち、ＴＲＡＮＣＥもＯＳＣＡＲ−Ｉｇもなし）と共に、およびＭ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび公知の破骨細胞インヒビターＴＲ−Ｆｃ（実施例５（前出）を参照のこと）と共に、培養した。
【０３４３】
予測されたように、Ｍ−ＣＳＦのみ（Ｍ）またはＭ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＲ−Ｆｃ（ＭＴ＋ＴＲ−Ｆｃ）と共にインキュベートした細胞培養物には、ＴＲＡＰ（＋）多核性細胞が、ごくわずかにしか観察されなかったかまたは全く観察されなかった。図１８Ａおよび図１８Ｂの、それぞれ、レーン１、５および６を参照のこと。しかし、対照的に、Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥのみ（ＭＴ；図１８Ａおよび１８Ｂのレーン２）またはＭ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＩｇＧ（ＭＴ＋ＩｇＧ；図１８Ａおよび１８Ｂのレーン５）のいずれかとのヒト単球細胞のインキュベーション、ｈＯＳＣＡＲ−ＩｇＧ（図１８Ａおよび１８Ｂのレーン３）との単球のインキュベーションは、それらが破骨細胞の成熟レベルの上昇を阻害したことを示した。ｍＯＳＣＡＲ−ＩｇＧ（図１８Ａおよび１８Ｂのレーン４）とのインキュベーションは、同様の効果を有した。ｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇと比較して、ｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇとの１０日間のインキュベーションの後に、いくらか多くのＴＲＡＰ（＋）多核性細胞が観察された（図１８Ｂ、それぞれ、レーン４および３）。にもかかわらず、ｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇとの１０日間のインキュベーションの後に観察されたＴＲＡＰ（＋）多核性細胞の数は、ヒト細胞をＭ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥのみとインキュベートした場合またはＩｇＧ１とインキュベートした場合に観察された数よりも、１桁を超えて低い。従って、ヒトおよびマウスの両方のＯＳＣＡＲポリペプチドは、ヒト破骨細胞の成熟および活性を効果的に調節し得る。
【０３４４】
これらの細胞の培養物由来の顕微鏡写真を、図１９（曝露後５日）および図２０（曝露後１０日）に示す。Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥ（図１９Ｂおよび２０Ｂ）またはＭ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＩｇＧ１（図１９Ｆおよび２０Ｆ）と共にインキュベートした培養物は、より多くの多核性細胞（矢印によって示される）を有するが、ｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図１９Ｃおよび２０Ｃ）またはｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図１９Ｄおよび２０Ｄ）のいずれかと共に培養した培養物由来の顕微鏡写真には、多核性細胞は、ごくわずかにしか観察され得ないかまたは全く観察され得ない。
【０３４５】
象牙質吸収アッセイ（実施例５（前出）に記載されるような）もまた、ヒト単球細胞培養物を使用して行い、ヒト破骨細胞活性を調節するマウスＯＳＣＡＲポリペプチドの能力を確認した。これらの実験の結果を、図２１Ａ〜Ｊに示す。詳細には、図２１のパネルＡ〜Ｅは、３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（図２１Ａ）、３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび２００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＮＣＥ（図２１Ｂ）、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＮＣＥ（２００ｎｇ／ｍｌ）および２０μｇ／ｍｌのｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図２１Ｃ）、Ｍ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＮＣＥ（２００ｎｇ／ｍｌ）および５μｇのＴＲ−Ｆｃ（図２１Ｄ）、ならびにＭ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＲＡＮＣＥ（２００ｎｇ／ｍｌ）および２０μｇ／ｍｌのｈＩｇＧ１（図２１Ｅ）の存在下で象牙質スライド上で培養した、ヒト単球細胞の顕微鏡写真を示す。図２１Ｆ〜Ｊは、それぞれ、図２１Ａ〜Ｅの細胞培養物を洗い流した後の象牙質スライドの顕微鏡写真を示す。これらの顕微鏡写真の暗い染色は、象牙質が吸収された窩を示す。
【０３４６】
マウス細胞を使用した象牙質吸収実験で観察されたもの（実施例５（前出）および図１７Ａ〜１７Ｃを参照のこと）と類似して、ヒト単球をＭ−ＣＳＦのみ（図２１Ｆ）またはＴＲ−Ｆｃ（図２１Ｉ）のいずれかと共に培養した場合、象牙質吸収は、ほとんど観察されなかったかまたは全く観察されなかった。しかし、ヒト単球細胞をＴＲＡＮＣＥのみ（図２１Ｇ）またはＴＲＡＮＣＥおよびコントロールＩｇＧ１ポリペプチド（図２１Ｊ）のいずれかと培養した場合、有意な吸収が観察された。しかし、ＴＲＡＮＣＥの存在下で観察された増加した吸収レベルは、ヒト単球細胞をｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇとインキュベートした場合、阻害された（図２１Ｈ）。
【０３４７】
従って、これらの実験からの結果は、ヒト細胞（すなわち、ヒト破骨細胞）の成熟および活性の両方が、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチド（ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドのみならず、マウスのような他の生物種由来のＯＳＣＡＲポリペプチドも含む）によって調節され得ることを示す。
【０３４８】
（ヒトＯＳＣＡＲは、マウス細胞と交差反応性である） ヒト単球細胞を使用する上記の実験と同様の逆の実験もまた行い、ヒトＯＳＣＡＲポリペプチドが他の生物種由来の細胞の成熟および活性を調節する能力を調査した。詳細には、これらの実験は、ｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇポリペプチドがマウス骨芽細胞の成熟および活性を調節する能力を調査した。これらの実験は、マウス破骨細胞および骨髄細胞の共培養物を使用する、第４節および５節に記載の実験（前出）と本質的に同じであった。しかし、これらの実験において、細胞培養物を、先の実施例で使用した可溶性マウスＯＳＣＡＲポリペプチドに代えて、可溶性ヒトＯＳＣＡＲポリペプチド（ｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇ）と共にインキュベートした。これらの特定の実験からの結果を、図２２および２３に示す。詳細には、図２２Ａ〜２２Ｆは、増殖培地のみ（図２２Ａ）、ビタミンＤ３（図２２Ｂ）、ビタミンＤ３およびｈＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図２２Ｃ）、またはビタミンＤ３およびｍＯＳＣＡＲ−Ｉｇ（図２２Ｄ）のいずれかと共に６日間インキュベートした後の、ＴＲＡＰ染色マウス細胞培養物の顕微鏡写真を示す。陽性コントロール実験および陰性コントロール実験もまた行い、ここでは、マウス細胞の共培養物を、ビタミンＤ３およびＩｇＧ１ポリペプチド（図２２Ｆ）またはビタミンＤ３およびＴＲ−Ｆｃ（図２２Ｅ）のいずれかと共にインキュベートした。各培養物中でカウントされたＴＲＡＰ（＋）多核性細胞の数を、図２３にグラフで示す。マウス細胞を使用する他の実験で観察されたものと一致して、ビタミンＤ３およびマウスＯＳＣＡＲポリペプチドと共にインキュベートした共培養物は、ビタミンＤ３のみまたはビタミンＤ３およびコントロールＩｇＧ１ポリペプチドとインキュベートした共培養物で観察された数と比較して、有意に少ない成熟破骨細胞を有した。しかし、興味深いことに、ビタミンＤ３およびヒトＯＳＣＡＲポリペプチドと共にインキュベートした共培養物は、同様のレベルの破骨細胞阻害を有した。
【０３４９】
従って、本実施例で記載される実験は、本発明のＯＳＣＡＲ核酸およびＯＳＣＡＲポリペプチドが交差反応性であり、そしてそのＯＳＣＡＲ核酸またはＯＳＣＡＲポリペプチドが由来する生物種と同じかまたは異なるかのいずれかであり得る生物種において、破骨細胞の成熟および／または活性を調節するために使用され得ることを実証する。従って、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ核酸は、本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ核酸が由来する種と同じ生物種または本発明のＯＳＣＡＲポリペプチドおよびＯＳＣＡＲ核酸が由来する種とは異なる生物種のいずれかにおいて、骨組織の成長、発達、修復、分解、吸収または恒常性に関連するプロセスを調節するために使用され得る。
【０３５０】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲が制限されるべきでない。実際、本明細書中に記載される改変に加え本発明の種々の改変が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０３５１】
多くの参考文献（特許、特許出願および他の刊行物を含む）が、本発明の説明において引用および考察されている。このような参考文献の引用および／または考察は、単に、本発明の説明を明確にするために提供され、いかなるこのような参考文献も本明細書中に記載の本発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書中に引用および考察された全ての参考文献は、その全体が参考として、各参考文献が参考として個々に援用されるのと同程度で、本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｃは、マウスＯＳＣＡＲ遺伝子の１．８ｋｂ（図１Ａ；配列番号１）および１．１ｋｂ（図１Ｂ；配列番号２）のスプライス改変体のｃＤＮＡ配列を示す。各配列の開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を、太字で示す。両方のｃＤＮＡ転写物によってコードされるＯＳＣＡＲポリペプチド配列を、図１Ｃ（配列番号３）に示す。
【図２】
図２Ａ〜２Ｂは、クローンＯＣＬ１７８中に含まれるマウスＯＳＣＡＲフラグメントのｃＤＮＡ配列（図２Ａ；配列番号４）を示す。このクローンによってコードされるＯＳＣＡＲポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列（これは、配列番号３のアミノ酸残基１６１〜２６５の配列に対応する）を、図２Ｂ（配列番号５）で示す。
【図３】
図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物のＣ１８アイソフォームの、ｃＤＮＡ配列（図３Ａ；配列番号６）および推定アミノ酸配列（図３Ｂ；配列番号７）を示す。
【図４】
図４Ａ〜４Ｂは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物のＣ１６アイソフォームの、ｃＤＮＡ配列（図４Ａ；配列番号８）および推定アミノ酸配列（図４Ｂ；配列番号９）を示す。
【図５】
図５Ａ〜５Ｂは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物のＣ１０アイソフォームの、ｃＤＮＡ配列（図５Ａ；配列番号１０）および推定アミノ酸配列（図５Ｂ；配列番号１１）を示す。
【図６】
図６は、図１Ｃ（配列番号３）に示されるマウスＯＳＣＡＲポリペプチド配列と図３Ｂ（配列番号７）に示されるヒトＯＳＣＡＲポリペプチドのＣ１８アイソフォームのアミノ酸配列の整列を示す。マウスＯＳＣＡＲポリペプチド配列およびヒトＯＳＣＡＲポリペプチド配列を、それぞれ、ｍＯＳＣＡＲ（上の列）およびｈＯＳＣＡＲ（下の列）で示す。
【図７】
図７Ａ〜７Ｄは、ヒト第１９染色体クローンＣＴＤ−３０９３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０１２３１４．５；ＧＩ：７７１１５４７）からのヌクレオチド残基１１７００１−１２４９２０（配列番号１２）の配列を示す。このヒト第１９染色体クローンＣＴＤ−３０９３から、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子が、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて単離された。ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子のエキソン配列を大文字で示す。ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子の翻訳領域（すなわち、タンパク質コード領域）に、下線を引く。
【図８】
図８Ａ〜８Ｂは、骨髄由来マクロファージ（図８Ａ）および骨髄由来破骨細胞（図８Ｂ）由来の総ｃＤＮＡプローブを用いた、差し引きｃＤＮＡライブラリー（マウスＯＣ−ＭΦ）における、２５０個の無作為に選択したクローンからのプラスミドＤＮＡのサザンブロットを示す。
【図９】
図９は、それぞれ、マウスＯＳＣＡＲフラグメントＯＣＬ１７８（上段）、破骨細胞特異的遺伝子ＴＲＡＰ（中段）、および破骨細胞特異的遺伝子カテプシンＫ（下段）由来の標識ｃＤＮＡを、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）、骨髄由来破骨細胞（ＢＭＯＣ）および骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）由来のｍＲＮＡに対してハイブリダイズさせた、ノーザンブロットアッセイの結果を示す。
【図１０】
図１０は、マウスＯＳＣＡＲフラグメントＯＣＬ１７８（上段）、ならびに破骨細胞特異的遺伝子ＴＲＡＰ（中段）およびカテプシンＫ（下段）由来の標識ｃＤＮＡを、種々の異なる組織（筋肉、腎臓、脳、心臓、肝臓、肺、腸、胸腺、脾臓、リンパ節、および破骨細胞（ＯＣＬ）を含む）由来のｍＲＮＡに対してハイブリダイズさせた、ノーザンブロットアッセイの結果を示す。
【図１１】
図１１Ａ〜１１Ｃは、ＴＲＡＮＣＥを用いたインビトロ処理によって破骨細胞様の細胞に分化するＲＡＷ２６４．７細胞（ＲＡＷ）由来のｍＲＮＡに対して比較した、マウスＯＳＣＡＲフラグメントＯＣＬ１７８由来の標識ｃＤＮＡを、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）および破骨細胞（ＯＣＬ）由来のｍＲＮＡに対してハイブリダイズさせたノーザンブロットアッセイを示す。図１１Ａは、マクロファージおよび破骨細胞由来のｍＲＮＡを用いたノーザンブロットを、ＴＲＡＮＣＥ投与の０、３および２４時間後に抽出したＲＡＷ２６４．７細胞のｍＲＮＡを用いたノーザンブロットと比較する。図１１Ｂは、ＴＲＡＮＣＥ投与の１、２、３および４日後のＲＡＷ２６４．７細胞 ｍＲＮＡからのノーザンブロットを示す。図１１Ｃは、頭蓋組織および長骨組織から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロットを、破骨細胞（ＢＭＯＣ）由来の骨髄から抽出したｍＲＮＡのノーザンブロットと比較する。
【図１２】
図１２Ａ〜１２Ｂは、マウスＯＳＣＡＲヌクレオチドプローブを用いた、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化したマウスゲノムＤＮＡ（図１２Ａ）およびヒトゲノムＤＮＡ（図１２Ｂ）のサザンブロット分析を示す。
【図１３】
図１３Ａ〜１３Ｂは、アイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１（図１３Ａ）または可溶性ＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（図１３Ｂ）、続いて、ＰＥ結合体化抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いて染色した、初代骨芽細胞のＦＡＣＳ分析からの結果を示す。
【図１４】
図１４は、可溶性ＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドの存在下（黒四角）またはヒトＩｇＧ１の存在下（白四角）のいずれかにて、骨髄細胞を骨芽細胞と共に共培養し、そして示された量のビタミンＤ３を用いて処理した場合に観察された、ＴＲＡＰ（＋）多核破骨細胞の数を示すチャートを示す。
【図１５】
図１５Ａ〜１５Ｃは、破骨細胞先駆体と骨芽細胞との共培養において（図１５Ａ〜Ｃ）、ビタミンＤ３（白四角）、ビタミンＤ３および可溶性ＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（白菱形）、またはビタミンＤ３およびコントロールＩｇＧ１ペプチド（白丸）の存在下で６、７、８、および９日間インキュベートした後にＴＲＡＰ（＋）多核破骨細胞の数を計数した、動力学的実験からのデータをグラフで示す。図１５Ａ〜Ｂにおいて、総骨髄細胞を、破骨細胞前駆体に対して使用したが、図１５Ｃにおいて、Ｍ−ＣＳＦ依存性骨髄浮遊細胞を、共培養実験に使用した。図１５Ｂは、共培養実験において、７日間のインキュベーション後に観察された、ＴＲＡＰ（＋）多核破骨細胞の数を示す棒グラフである。
【図１６】
図１６Ａ〜１６Ｊは、マウス骨髄細胞および骨芽細胞の共培養を用いた象牙質再吸収アッセイからの顕微鏡写真である（Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９３，８：９５３−９６０）。図１６Ａ〜１６Ｅは、象牙質スライス上のＴＲＡＰ（＋）破骨細胞の顕微鏡写真である。図１６Ｆ〜１６Ｊは、細胞を除去した後の対応する象牙質スライスの顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真中の暗い染色部は、象牙質が再吸収した領域を示す。より詳細には、図１６Ａおよび１６Ｆは、それぞれ、増殖培地単独でインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）細胞および象牙質スライスを示す。図１６Ｂおよび１６Ｇは、ビタミンＤ３と共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）細胞（図１６Ｂ）および象牙質スライス（図１６Ｇ）の顕微鏡写真である。ビタミンＤ３および可溶性マウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）破骨細胞および象牙質スライスの顕微鏡写真を、それぞれ、図１６Ｃおよび１６Ｈに示す。図１６Ｄおよび１６Ｉは、ビタミンＤ３およびＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチドと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）破骨細胞（図１６Ｄ）および象牙質スライス（図１６Ｉ）の顕微鏡写真である。図１６Ｅおよび１６Ｊは、それぞれ、ビタミンＤ３およびコントロールＩｇＧ１融合ポリペプチドと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）細胞および象牙質スライスの顕微鏡写真である。
【図１７】
図１７は、図１６Ａ〜１６Ｊに示される象牙質再吸収データからの定量的結果を示す棒グラフである。再吸収のピットは、象牙質スライスについて計数し、この象牙質スライスの上で、マウス破骨細胞前駆体および骨芽細胞の共培養を、増殖培地単独（「培地」）、ビタミンＤ３を有する増殖培地（「Ｖｉｔ．Ｄ３」）、ビタミンＤ３およびＯＳＣＡＲ−Ｉｇを有する増殖培地（「Ｖｉｔ．Ｄ３＋ＯＳＣＡＲ−ＩｇＧ」）、またはビタミンＤ３およびコントロールＩｇＧ１ポリペプチド有する増殖培地（Ｖｉｔ．Ｄ３＋ＩｇＧ）中でインキュベートした。
【図１８】
図１８Ａおよび１８Ｂは、以下：（ａ）Ｍ−ＣＳＦ単独（「Ｍ」）；（ｂ）Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥ（「ＭＴ」）；（ｃ）Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性ヒトＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（「ＭＴ＋ｈＯＳＣＡＲ−ＩｇＧ」）；Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性マウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（「ＭＴ＋ｍＯＳＣＡＲ−ＩｇＧ」）；（ｃ）Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびコントロールＩｇＧ１ポリペプチド（「ＭＴ＋ＩｇＧ」）；ならびに（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチド（「ＭＴ＋ＴＲ−Ｆｃ」）をインキュベートした、ヒト単球細胞培養物を用いた実験からのデータを示す。ＴＲＡＰ（＋）多核破骨細胞の数を、５日（図１８Ａ）および１０日（図１８Ｂ）のインキュベーション後に、各培養において計数した。
【図１９】
図１９Ａ〜１９Ｆは、Ｍ−ＣＳＦ（図１９Ａ）の存在下；Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥ（図１９Ｂ）を用いて；Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性ヒトＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（図１９Ｃ）を用いて；Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性マウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドの存在下（図１９Ｄ）；（ｃ）Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチド（図１９Ｅ）を用い；ならびに、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびヒトＩｇＧ１ポリペプチドを用いて（図１９Ｆ）、５日間インキュベートしたヒト単球細胞の顕微鏡写真を示す。多核ＴＲＡＰ（＋）破骨細胞を、図１９Ｂおよび１９Ｆにおいて矢印で示す。
【図２０】
図２０Ａ〜２０Ｆは、Ｍ−ＣＳＦ（図２０Ａ）の存在下；Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥ（図２０Ｂ）を用いて；Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性ヒトＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（図２０Ｃ）を用いて；Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよび可溶性マウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドの存在下（図２０Ｄ）；（ｃ）Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチド（図２０Ｅ）；ならびに、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＮＣＥおよびヒトＩｇＧ１ポリペプチドを用いて（図２０Ｆ）、１０日間インキュベートしたヒト単球細胞培養物の顕微鏡写真を示す。多核ＴＲＡＰ（＋）破骨細胞を、図２０Ｂおよび２０Ｆにおいて矢印で示す。
【図２１】
図２１Ａ〜２１Ｊは、ヒト単球細胞を用いた象牙質再吸収アッセイ（Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１９９３，８：９５３−９６０）からの顕微鏡写真である。図２１Ａ〜２１Ｅは、象牙質スライス上で培養したＴＲＡＰ（＋）ヒト破骨細胞の顕微鏡写真である。図２１Ｆ〜２１Ｊは、細胞を除去した後の対応する象牙質スライスの顕微鏡写真である。これらの顕微鏡写真中の暗い染色部は、象牙質が再吸収した領域を示す。より詳細には、図２１Ａおよび２１Ｆは、それぞれ、Ｍ−ＣＳＦ単独の存在下でインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）ヒト細胞および象牙質スライスを示す。図２１Ｂおよび２１Ｇは、Ｍ−ＣＳＦおよびＴＲＡＮＣＥと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）ヒト細胞（図２１Ｂ）および対応する象牙質スライス（図２１Ｇ）の顕微鏡写真である。可溶性マウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドの存在下でインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）ヒト細胞の顕微鏡写真を、それぞれ、図２１Ｃおよび２１Ｈに示す。図２１Ｄおよび２１Ｉは、ＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチドと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）ヒト細胞（図２１Ｄ）および対応する象牙質スライス（図２１Ｉ）の顕微鏡写真である。図２１Ｅおよび２１Ｊは、ＩｇＧ１ポリペプチドと共にインキュベートした、ＴＲＡＰ（＋）ヒト細胞（図２１Ｅ）および対応する象牙質スライス（図２１Ｊ）の顕微鏡写真である。
【図２２】
図２２Ａ〜２２Ｆは、増殖培地単独（図２２Ａ）；ビタミンＤ３と共に（図２２Ｂ）；ビタミンＤ３およびヒトＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチドと共に（図２２Ｃ）；ビタミンＤ３およびマウスＯＳＣＡＲ−Ｉｇ融合ポリペプチド（図２２Ｄ）と共に；ビタミンＤ３およびＴＲ−Ｆｃ融合ポリペプチドと共に（図２２Ｅ）；ならびにビタミンＤ３およびヒトＩｇＧ１ポリペプチドと共に（図２２Ｆ）、６日間インキュベートした、マウス骨芽細胞と骨髄細胞との共培養からの顕微鏡写真を示す。
【図２３】
図２３は、図２２Ａ〜２２Ｆに示したマウス共培養からの定量的データをグラフで示す。詳細には、成熟ＴＲＡＰ（＋）多核破骨細胞の数を、図２２Ａ〜２２Ｆに関して、上記の共培養した各々について示す。
【図２４】
図２４Ａ〜Ｂは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物のＳ１スプライス改変体の、ｃＤＮＡ配列（図２４Ａ；配列番号２６）および推定アミノ酸配列（図２４Ｂ；配列番号２５）を示す。各配列の開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を、太字で示す。
【図２５】
図２５Ａ〜Ｂは、ヒトＯＳＣＡＲ遺伝子およびその遺伝子産物のＳ２スプライス改変体の、ｃＤＮＡ配列（図２５Ａ；配列番号２８）および推定アミノ酸配列（図２５Ｂ；配列番号２７）を示す。各配列の開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を、太字で示す。
【図２６】
図２６Ａは、マウスＯＳＣＡＲ遺伝子のＭ３スプライス改変体のｃＤＮＡ配列を示す（図２６Ａ；配列番号３０）。各配列の開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を、太字で示す。両方のｃＤＮＡ転写物によってコードされるＯＳＣＡＲポリペプチド配列を、図２６Ｂ（配列番号２９）に示す。
【図２７】
図２７Ａは、マウスＯＳＣＡＲ遺伝子のＭ４スプライス改変体のｃＤＮＡ配列を示す（図２７Ａ；配列番号３２）。各配列の開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＧＡ）を、太字で示す。両方のｃＤＮＡ転写物によってコードされるＯＳＣＡＲポリペプチド配列を、図２７Ｂ（配列番号３１）に示す。

Claims (108)

  1. 単離されたＯＳＣＡＲポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドがマウスポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  3. 配列番号５（図２Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドが、配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
  5. 前記ポリペプチドがヒトポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  6. 請求項５に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号１２（図７Ａ〜図７Ｄ）に示されるゲノム配列中に含まれるＯＳＣＡＲ遺伝子によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドが、配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドが、配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドが、配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
  10. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１６の配列；
    （ｂ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７〜１２２の配列；
    （ｃ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜２２８の配列；
    （ｄ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２９〜２４７の配列；または
    （ｅ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４８〜２６４の配列；
    を含む、単離されたポリペプチド。
  11. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１８の配列；
    （ｂ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２３の配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２４〜２２９の配列；
    （ｄ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３０〜２４８の配列；または
    （ｅ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４９〜２６３の配列；
    を含む、単離されたポリペプチド。
  12. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１８の配列；
    （ｂ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２７の配列；
    （ｃ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２８〜２３３の配列；
    （ｄ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３４〜２５２の配列；または
    （ｅ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２５３〜２６７の配列；
    を含む、単離されたポリペプチド。
  13. 請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、以下：
    （ａ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１３の配列；
    （ｂ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜１１２の配列；
    （ｃ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１１３〜２１８の配列；
    （ｄ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２１９〜２３７の配列；または
    （ｅ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３８〜２５２の配列；
    を含む、単離されたポリペプチド。
  14. アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、請求項３に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  15. 請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号４（図２Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  16. アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、請求項４に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  17. 請求項１６に記載の単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
    （ａ）配列番号１（図１Ａ）；または
    （ｂ）配列番号２（図１Ｂ）；
    に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  18. アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、請求項７に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  19. 請求項１８に記載の単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号６（図３Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  20. アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、請求項８に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  21. 請求項２０に記載の単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号８（図４Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  22. アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、請求項９に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  23. 請求項２２に記載の単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、配列番号１０（図５Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたポリペプチド。
  24. ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  25. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、前記ＯＳＣＡＲポリペプチドが、マウスポリペプチドである、単離された核酸。
  26. 請求項２５に記載の単離された核酸であって、配列番号５（図２Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  27. 請求項２５に記載の単離された核酸であって、該核酸は、配列番号４（図２Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  28. 請求項２５に記載の単離された核酸であって、該核酸は、配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  29. 請求項２８に記載の単離された核酸であって、該核酸は、
    （ａ）配列番号１（図１Ａ）に示されるヌクレオチド配列；または
    （ｂ）配列番号２（図１Ｂ）に示されるヌクレオチド配列；
    を含む、単離された核酸。
  30. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、前記ＯＳＣＡＲポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、単離された核酸。
  31. 請求項３０に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列；または
    （ｃ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  32. 請求項３１に記載の単離された核酸であって、該核酸は、配列番号６（図３Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  33. 請求項３１に記載の単離された核酸であって、該核酸は、配列番号８（図４Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  34. 請求項３１に記載の単離された核酸であって、該核酸は、配列番号１０（図５Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  35. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１６の配列；
    （ｂ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７〜１２２の配列；
    （ｃ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜２２８の配列；
    （ｄ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２２９〜２４７の配列；または
    （ｅ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４８〜２６４の配列；
    を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  36. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１８の配列；
    （ｂ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２３の配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２４〜２２９の配列；
    （ｄ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３０〜２４８の配列；または
    （ｅ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４９〜２６３の配列；
    を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  37. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１８の配列；
    （ｂ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２７の配列；
    （ｃ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２８〜２３３の配列；
    （ｄ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３４〜２５２の配列；または
    （ｅ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２５３〜２６７の配列；
    を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  38. 請求項２４に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１３の配列；
    （ｂ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜１１２の配列；
    （ｃ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１１３〜２１８の配列；
    （ｄ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２１９〜２３７の配列；または
    （ｅ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２３８〜２５２の配列；
    を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  39. 請求項３０に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるゲノムＯＳＣＡＲヌクレオチド配列；および、必要に応じて
    （ｂ）該ゲノムＯＳＣＡＲヌクレオチド配列と天然では結合していない、非内因性ヌクレオチド配列；
    からなる、単離された核酸。
  40. 請求項３９に記載の単離された核酸であって、前記ゲノムＯＳＣＡＲヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド７６８〜８４１の配列；
    （ｂ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド８４２〜１８１８の配列；
    （ｃ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１８１９〜１８５１の配列；
    （ｄ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１８５２〜１９９７の配列；
    （ｅ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１９９８〜２００９の配列；
    （ｆ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２０１０〜４４３９の配列；
    （ｇ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４４４０〜４７４２の配列；
    （ｈ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４７４３〜５０１３の配列；
    （ｉ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５０１４〜５２９５の配列；
    （ｊ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５２９６〜５８０９の配列；および
    （ｋ）配列番号１２（図７Ａ〜７Ｄ）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド５８１０〜６４９９の配列；
    からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる、単離された核酸。
  41. 単離された核酸であって、請求項３に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  42. 請求項４１に記載の単離された核酸であって、配列番号４（図２Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
  43. 単離された核酸であって、請求項４に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  44. 請求項４３に記載の単離された核酸であって、
    （ａ）配列番号１（図１Ａ）；または
    （ｂ）配列番号２（図１Ｂ）；
    に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
  45. 単離された核酸であって、請求項７に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  46. 請求項４５に記載の単離された核酸であって、配列番号６（図３Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
  47. 単離された核酸であって、請求項８に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  48. 請求項４７に記載の単離された核酸であって、配列番号８（図４Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
  49. 単離された核酸であって、請求項９に記載のポリペプチドをコードする核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  50. 請求項４９に記載の単離された核酸であって、配列番号１０（図５Ａ）に示されるヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸。
  51. 単離された核酸であって、請求項３９に記載の核酸の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
  52. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項２４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  53. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項２８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  54. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項３０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  55. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項３５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  56. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項３６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  57. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項３７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  58. 発現制御配列と作動可能に結合した請求項３８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  59. 請求項２４に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  60. 請求項２８に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  61. 請求項３０に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  62. 請求項３５に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  63. 請求項３６に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  64. 請求項３７に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  65. 請求項３８に記載の核酸を発現するように遺伝的に改変された、宿主細胞。
  66. ＯＳＣＡＲポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  67. 請求項３に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  68. モノクローナル抗体である、請求項６７に記載の抗体。
  69. 請求項４に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  70. モノクローナル抗体である、請求項６９に記載の抗体。
  71. 請求項７に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  72. モノクローナル抗体である、請求項７１に記載の抗体。
  73. 請求項８に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  74. モノクローナル抗体である、請求項７３に記載の抗体。
  75. 請求項９に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体。
  76. モノクローナル抗体である、請求項７５に記載の抗体。
  77. 破骨細胞の活性を増加させるための方法であって、該方法は、該破骨細胞を、該破骨細胞により発現されるＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を増加させる化合物と接触させる工程を包含する、方法。
  78. 請求項７７に記載の方法であって、前記ＯＳＣＡＲ遺伝子産物は、
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号５（図２Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列；または
    （ｅ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    を有するポリペプチドを含む、方法。
  79. 請求項７７に記載の方法であって、前記化合物が、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドである、方法。
  80. 請求項７９に記載の方法であって、前記化合物が、前記ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に特異的に結合する抗体である、方法。
  81. 骨吸収を増加させるための方法であって、該方法は、請求項７７に記載の方法に従って破骨細胞の活性を増加させる工程を包含する、方法。
  82. 破骨細胞の活性を減少させるための方法であって、該方法は、該破骨細胞を、該破骨細胞により発現されるＯＳＣＡＲ遺伝子産物の活性を減少させる化合物と接触させる工程を包含する、方法。
  83. 請求項８２に記載の方法であって、前記ＯＳＣＡＲ遺伝子産物は、
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号５（図２Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列；または
    （ｅ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    を有するポリペプチドを含む、方法。
  84. 請求項８２に記載の方法であって、前記化合物が、ＯＳＣＡＲ特異的リガンドが前記ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に結合することを妨げる、方法。
  85. 請求項８４に記載の方法であって、前記化合物が、可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドを含む、方法。
  86. 請求項８５に記載の方法であって、前記可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドが、
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７〜１２２の配列；
    （ｂ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜２２８の配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２３の配列；
    （ｄ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２４〜２２９の配列；
    （ｅ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２７の配列；
    （ｆ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２８〜２３３の配列；
    （ｇ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜１１２の配列；または
    （ｈ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１１３〜２１８の配列；
    を含む、方法。
  87. 請求項８４に記載の方法であって、前記可溶性ＯＳＣＡＲポリペプチドが、融合ポリペプチドである、方法。
  88. 請求項８４に記載の方法であって、前記化合物が、
    （ａ）前記ＯＳＣＡＲ遺伝子産物に特異的に結合する、抗体；または
    （ｂ）前記ＯＳＣＡＲ特異的リガンドに特異的に結合する、抗体；
    を含む、方法。
  89. 骨吸収を減少させるための方法であって、該方法は、請求項８２に記載の方法に従って破骨細胞の活性を減少させる工程を包含する、方法。
  90. 細胞を破骨細胞として同定するための方法であって、該方法は、該細胞によるＯＳＣＡＲ遺伝子の発現を検出する工程を包含し、該ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現の検出により、該細胞が破骨細胞として同定される、方法。
  91. 請求項９０に記載の方法であって、前記ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現が、ＯＳＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することによって検出される、方法。
  92. 請求項９０に記載の方法であって、前記ＯＳＣＡＲ遺伝子の発現が、ＯＳＣＡＲポリペプチドを検出することによって検出される、方法。
  93. ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
    （ａ）試験化合物を、ＯＳＣＡＲポリペプチドに、該試験化合物が該ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合することを可能にするに十分な条件下で接触させる工程；および
    （ｂ）該ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合した該試験化合物を検出する工程、
    を包含し、該ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合した該試験化合物の検出により、該試験化合物が、ＯＳＣＡＲポリペプチドに結合する化合物として同定される、方法。
  94. 請求項９３に記載の方法であって、前記ＯＳＣＡＲポリペプチドが、
    （ａ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号５（図２Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｃ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｄ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１７〜１２２の配列；
    （ｇ）配列番号３（図１Ｃ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜２２８の配列；
    （ｈ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２３の配列；
    （ｉ）配列番号７（図３Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２４〜２２９の配列；
    （ｊ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１９〜１２７の配列；
    （ｋ）配列番号９（図４Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２８〜２３３の配列；
    （ｌ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１４〜１１２の配列；または
    （ｍ）配列番号１１（図５Ｂ）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１１３〜２１８の配列；
    を含む、方法。
  95. 請求項９３に記載の方法であって、前記試験化合物が、ポリペプチドである、方法。
  96. 請求項９５に記載の方法であって、前記ポリペプチドが、破骨細胞、胚線維芽細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、ＳＴ２骨芽様細胞、肺上皮細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞、ｈＦＯＢ１．１９細胞、またはＣＯＳ−１細胞により発現される、方法。
  97. 個体における骨成長関連障害を処置するための方法であって、該方法は、請求項８１に記載の方法に従って、該個体における骨吸収を増加させる工程を包含する、方法。
  98. 請求項９７に記載の方法であって、前記骨成長関連障害が大理石骨病である、方法。
  99. 個体における骨成長関連障害を処置するための方法であって、該方法は、請求項８９に記載の方法に従って、該個体における骨吸収を減少させる工程を包含する、方法。
  100. 請求項９９に記載の方法であって、前記骨成長関連障害が骨粗鬆症である、方法。
  101. 請求項２に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号２９（図２６Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  102. 請求項２に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号３１（図２７Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  103. 請求項５に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号２５（図２４Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  104. 請求項５に記載の単離されたポリペプチドであって、配列番号２７（図２５Ｂ）に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  105. 請求項２５に記載の単離された核酸であって、配列番号３０（図２６Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  106. 請求項２５に記載の単離された核酸であって、配列番号３２（図２７Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  107. 請求項３０に記載の単離された核酸であって、配列番号２６（図２４Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
  108. 請求項３０に記載の単離された核酸であって、配列番号２８（図２５Ａ）に示されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
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