JP2005352034A - 蛍光観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 特定の波長光による色収差や励起光の調整時に発生する光軸ずれを確実に補正することができる蛍光観察装置を提供する。
【解決手段】 干渉フィルタ１１の傾き角度から、干渉フィルタ１１を透過する光の特定波長を求め、この特定波長に合わせて可変ミラー１４の面形状を決定する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、医学、生物学などの研究分野において生物組織からの蛍光を観察する蛍光観察装置に関するものである。

従来、蛍光観察装置として、医学および生物学などの分野において生物組織細胞上で蛍光標識を施した蛋白や遺伝子などを観察するものとして蛍光顕微鏡が知られている。

ところで、このような蛍光顕微鏡を用いて、蛍光標本を観察する場合、標本の位置や形状を分かりやすくするため、特定の蛍光色素の蛍光像の明るさだけを調整できることを望まれる。

そこで、従来、特許文献１に開示されたものが提案されている。図５は、特許文献１の落射蛍光顕微鏡の要部の概略構成を示すもので、水銀ランプやキセノンランプなどの比較的連続的な波長を持つ光源１０１から発生する光を励起フィルタ１０２に入射して特定の波長光を選択し、この選択された光を、励起光波長域では反射特性を有し、蛍光波長域では透過特性を有するダイクロイックミラー１０３で反射させ、励起光として対物レンズ１０４を介して標本１０５に照射し、標本１０５より発せられる蛍光をダイクロイックミラー１０３を透過し、吸収フィルタ１０６により蛍光波長域のみ透過させることにより蛍光観察を可能にしている。そして、このような構成において、励起フィルタ１０２手前の光源１０１からの光の光路中に、透過波長帯域をシフトして、複数の狭帯域励起光の光量比を可変可能とするような透過波長シフト用の干渉フィルタ１０７を配置し、この透過波長シフト用の干渉フィルタ１０７を傾くように回転させることで、多重染色された標本１０５について、各蛍光色素の励起光量比を調整することにより、蛍光色素ごとの標本蛍光像の明るさを簡単に調整できるようにしている。
特開平５−１５０１６４号公報 特開平１１−１０１９４２号公報

ところで、このような多重染色された標本１０５の各蛍光色素ごとの標本蛍光像を観察するような場合、観察光学系を構成する対物レンズ１０４などの光学素子は、透過する光の波長によって屈折率が異なるため、標本１０５から発せられる蛍光に複数の波長が含まれていると、各蛍光の波長ごとに結像位置がずれて、色収差が生じてしまう。

このため、特許文献１のものは、透過波長シフト用干渉フィルタ１０７を用いることで、多波長の励起光量比を調整することができるものの、色収差を補正する手段がないため、対物レンズ１０４などの光学素子に色収差が発生してしまう。また、特許文献１のものは、蛍光色素の励起光量比を調整する時に、透過波長シフト用の干渉フィルタ１０７を傾くように回転させているので、この干渉フィルタ１０７を透過した光が屈折により光源１０１からの光に対して、光軸ずれが生じてしまうという問題もあった。

一方、顕微鏡における色収差補正を行なうものとして、特許文献２に開示されるように波面変調器を用いたものが提案されている。つまり、この特許文献２のものは、顕微鏡の対物レンズ手前に波面変調器としてのアダプティブミラーを配置し、このアダプティブミラーの表面を変形させ、光の波面を変調することにより、対物レンズの焦点位置を移動させて収差を補正するようにしている。

しかし、蛍光顕微鏡において、多波長の励起光で蛍光標本を励起するような場合、つまり、励起光として複数の波長幅または複数の波長帯域のものが用いられるような場合、蛍光顕微鏡上で、色収差を発生しているのは、どの波長、または波長帯域の光によるものかを区別することが極めて難しく、このため、特許文献２のものでは、特定の波長または波長帯域による色収差を補正することができない。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、特定の波長光による色収差や励起光の調整時に発生する光軸ずれを確実に補正することができる蛍光観察装置を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、光源と、前記光源からの光を標本上に照射する照明光学系と、前記照明光学系に回転可能に設けられ、傾き角度に応じて前記光源から発せられる光の透過波長帯域をシフト可能にした光学素子と、前記光学素子の出射側に設けられ、光の波面変調を可能とした波面変調手段と、前記光学素子の傾き角度に応じて前記波面変調手段の光の波面変調を制御し色収差の補正を可能とした制御手段とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、異なる波長帯域のレーザ光を発生するレーザ光源と、前記光源からのレーザ光を標本上に照射する照明光学系と、前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する走査手段と、前記照明光学系に回転可能に設けられ、傾き角度に応じて前記レーザ光源から発せられるレーザ光の透過波長帯域をシフト可能にした光学素子と、前記光学素子の出射側に設けられ、光の波面変調を可能とした波面変調手段と、前記光学素子の傾き角度に応じて前記波面変調手段の光の波面変調を制御し色収差の補正を可能とした制御手段とを具備したことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、さらに前記波面変調手段を移動させる駆動手段を有し、前記制御手段は、前記光学素子の傾き角度に応じて前記駆動手段による前記波面変調手段の移動を制御し、前記光学素子の傾きによる光軸ずれを補正可能としたことを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記光学素子は、干渉フィルタからなることを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記波面変調手段は、反射面の形状を変形可能とした可変ミラーからなることを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項４または５記載の発明において、前記制御手段は、前記干渉フィルタの傾き角度と透過光波長の関係と、透過光波長に対する前記可変ミラーの面形状の制御量の関係をそれぞれデータベースとして記憶し、前記干渉フィルタの傾き角度に応じて前記データベースより透過光波長を求めるとともに、該透過光波長から前記可変ミラーの面形状の制御量を求め、該可変ミラーの面形状を決定するようにしたことを特徴としている。

本発明によれば、特定の波長光による色収差や励起光の調整時に発生する光軸ずれを確実に補正することができる蛍光観察装置を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態の蛍光観察装置としての蛍光顕微鏡の概略構成を示している。

図１において、１０は落射照明用の光源で、この光源１０には、水銀ランプやキセノンランプといった比較的連続的な波長を持つものが用いられる。

光源１０から発せられる光の光路上には、光学素子としての干渉フィルタ１１、励起フィルタ１２およびダイクロイックミラー１３などで構成される照明光光学系が配置されている。

干渉フィルタ１１は、基板上に交互に積み重ねた薄膜の干渉効果を利用した光学フィルタからなるもので、光軸に対して回転可能（傾け可能）に設けられ、光軸に対する傾き角度に応じて光源１０から発せられる光の透過波長帯域をシフト可能にしている。この場合、干渉フィルタ１１の最大透過率の光波長と傾き角度の関係は、
ｍλ＝２ｎｔｃｏｓθ
（ここで、ｍは干渉次数、λは最大透過率の光波長、ｎはスペーサをなす薄膜部の屈折率、ｔはスペーサをなす薄膜部の厚み、θは入射（傾き）角度である。）
で表すことができる。これにより、ｍ、ｎ、ｔを一定とすれば、最大透過率の光波長λは、入射角度θと比例の関係となるので、周囲を完全に遮蔽された干渉フィルタを用いた場合、入射（傾き）角度θに応じて唯一の透過ピークを選択して光を透過させることができるようになる。

励起フィルタ１２は、特定の波長光を選択するものである。また、ダイクロイックミラー１３は、励起フィルタ１２で選択された励起光波長域では反射特性を有し、蛍光波長域では透過特性を有するものである。

干渉フィルタ１１の出射側となるダイクロイックミラー１３の反射光路には、光の波面変調を可能とした光波面変調手段としての可変ミラー１４が配置されている。可変ミラー１４の反射光路には、反射ミラー１６、対物レンズ１７を介して不図示のステージ上に載置された標本１８が配置されている。

可変ミラー１４には、制御手段として制御部１５が接続されている。この制御部１５は、干渉フィルタ１１の傾き角度に基づいて可変ミラー１４の面形状を決定するためのもので、不図示の複数の電極に対し電圧を印加することで、ミラー面形状を微小に変形可能としている。つまり、ここでの可変ミラー１４は、反射面が平坦になっている状態では、光学的なパワーがなく、反射面を反射した光を平行光のまま出射し、制御部１５により不図示の電極に電圧が印加されると、反射面を微小に変形（湾曲）し、反射面を反射した光を若干の発散光または収束光として出射するようになり、このときの反射された光の波面の変調により色収差を補正できるようになっている。

また、制御部１５は、干渉フィルタ１１の傾き角度と透過光波長の関係と、透過光波長に対する可変ミラー１４の面形状の制御量の関係をそれぞれデータベースとして記憶しており、干渉フィルタ１１の傾き角度からデータベースを用いて透過光の波長を求め、さらにこの透過光波長から可変ミラー１４の面形状の制御量を求めて、可変ミラー１４の面形状を決定するようにしている。

次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。

いま、光源１０から照明光が発せられると、この照明光は、干渉フィルタ１１を介して励起フィルタ１２に入射され、選択された波長光がダイクロイックミラー１３で反射し、さらに可変ミラー１４、反射ミラー１６で反射し、励起光として対物レンズ１７を介して標本１８に照射される。そして、この励起光により標本１８から蛍光が発せられると、この蛍光は、対物レンズ１７、ダイクロイックミラー１３を透過し、不図示の観察光学系により蛍光観察される。

この状態で、干渉フィルタ１１を光軸に対して傾けると、このときの干渉フィルタ１１の傾き角度に応じた最大透過率の光波長が特定波長光として選択される。また、干渉フィルタ１１の傾き角度の情報は、制御部１５に送られる。制御部１５は、予め記憶されているデータベースに基づいて、傾き角度に対応する透過光波長を求め、さらに、この透過光波長から、対応する可変ミラー１４の面形状の制御量を求める。そして、これら求められたデータにより、可変ミラー１４の不図示の電極に印加する電圧を決定し、反射面を微小に変形（湾曲）させる。

これにより、可変ミラー１４の反射面を反射した光は、若干の発散光または収束光として出射するようになり、このときの反射光の波面の変調により、干渉フィルタ１１で設定された特定波長の光による色収差を確実に補正することができる。

以下、同様にして、干渉フィルタ１１の傾き角度を変更して、他の特定波長の光を選択しても、制御部１５に記憶されたデータベースに基づいて、最適な可変ミラー１４の面形状が決定されるようになり、各特定波長の光による色収差を確実に補正することができるようになる。

従って、このようにすれば、干渉フィルタ１１の傾き角度から、干渉フィルタ１１を透過する光の特定波長を求め、この特定波長に合わせて可変ミラー１４の面形状を決定するようにしたので、励起光として複数の波長幅または複数の波長帯域のものが用いられるような場合でも、それぞれの励起光による色収差を確実に補正することができる。

この場合、干渉フィルタ１１の傾き角度を計測する手段を設けるようにすれば、この計測手段で計測した角度を制御部１５に入力することで、干渉フィルタ１１を傾けて励起光を選択するのと連動して、可変ミラー１４の面形状を決定して励起光による色収差を補正することができるようになる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図２は、本発明の第２の実施の形態の蛍光観察装置としての蛍光顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、可変ミラー１４は、制御部１５により制御される駆動手段としての駆動部２０によって平行移動量を制御できるようになっている。ところで、干渉フィルタ１１は、傾くように回転させるため、干渉フィルタ１１を透過した光が屈折して光源１０からの照明光に対して、光軸ずれが生じてしまうことがある。

このときの光軸ずれ量ｈは、図３に示すように、干渉フィルタ１１の厚さをｔ、屈折率をｎ、傾き角をθ、光軸ずれ量をｈとすると、
ｈ＝ｔ・ｓｉｎθ（１−ｃｏｓθ／（ｎ²−ｓｉｎ²θ）^1/2）
で表わすことができる。

そして、制御部１５は、上式を記憶していて、干渉フィルタ１１の傾き角度θの情報が与えられると、上式を用いて光軸ずれ量ｈを計算し、この結果を用いて、駆動部２０を介して、可変ミラー１４を平行移動させることができるようになっている。

このような構成において、励起光の波長をシフトさせるために、干渉フィルタ１１を光軸に対して傾けると、干渉フィルタ１１を透過した光は、光軸（図示実線）からずれて、図２に示す点線に沿って進むようになる。このときの制御部１５は、干渉フィルタ１１の傾き角度に基づいて上式から光軸ずれ量ｈを計算する。そして、この計算結果を用いて、駆動部２０により可変ミラー１４を図示実線位置から図示破線位置に平行移動させる。これにより、可変ミラー１４で反射された光は、もとの光軸（図示実線）上に戻るようになり、光軸ずれを補正することができる。

従って、このようにしても、第１の実施の形態で述べたと同様、干渉フィルタ１１の傾き角度から、干渉フィルタ１１を透過する光の特定波長を求め、この特定波長に合わせて可変ミラー１４の面形状を決定することで、色収差の補正を確実に行うことができる。さらに、干渉フィルタ１１の傾き角度に合わせて、駆動部２０により可変ミラー１４を平行移動させることにより、干渉フィルタ１１の傾き動作に原因する光軸ずれを確実に補正することもできる。

この場合も、干渉フィルタ１１の傾き角度を計測する手段を設けるようにすれば、この計測手段で計測した角度を制御部１５に入力することで、干渉フィルタ１１を傾けて励起光を選択するのと連動して、可変ミラー１４を平行移動させることで、光軸ずれを補正することができるようになる。

（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。

図４は、本発明の第３の実施の形態の蛍光観察装置としての走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図４において、３０はレーザ光源で、このレーザ光源３０は、異なる波長のレーザ光を発生可能にしたものである。

レーザ光源３０から発せられるレーザ光の光路上には、光学素子としての干渉フィルタ３１およびダイクロイックミラー３２などで構成される照明光光学系が配置されている。

干渉フィルタ３１は、第１の実施の形態で述べたと同じもので、光軸に対して回転可能（傾け可能）に設けられ、光軸に対する傾き角度に応じてレーザ光源３０から発せられるレーザ光の透過波長帯域をシフト可能にしている。また、ダイクロイックミラー３２は、干渉フィルタ３１で選択された励起光波長域では反射特性を有し、蛍光波長域では透過特性を有するものである。

干渉フィルタ３１の出射側となるダイクロイックミラー３２の反射光路には、光の波面変調を可能とした光波面変調手段として面形状が変形可能な可変ミラー３３が配置されている。また、可変ミラー３３の反射光路には、走査手段としてのスキャナ３４、対物レンズ３５を介して不図示のステージ上に載置された標本３６が配置されている。

スキャナ３４は、直交する２方向に光を偏向するための不図示の２枚のミラーを有し、これらのミラーにより標本３６上のレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

可変ミラー３３には、駆動部３７を介して制御部３８が接続されている。これら駆動部３７と制御部３８は、第１および第２の実施の形態で述べたと同じもので、干渉フィルタ３１の傾き角度に基づいて、可変ミラー１４の面形状を決定したり、可変ミラー３３を平行移動させるような制御を行なうようになっている。

従って、このようにしても、干渉フィルタ３１を傾けるように回転し、レーザ光の透過波長帯域をシフトすることにより、レーザ光源３０から標本３６を励起するレーザ光の波長を選択することができる。

また、制御部３８は、干渉フィルタ３１の傾き角度に基づいて可変ミラー３３の面形状を決定することにより、可変ミラー３３を反射される光の波面の変調により色収差を補正することができ、さらに、干渉フィルタ３１の傾き角度から光軸ずれ量を計算し、この結果を用いて、駆動部３７を介して可変ミラー３３を平行移動させることにより、干渉フィルタ３１の傾きによる光軸ずれも補正することができる。

これにより、このような走査型レーザ顕微鏡についても、標本３６を励起するレーザ光の波長に応じて色収差を確実に補正できるとともに、光軸ずれも補正することができることになる。

この実施の形態では、色収差と光軸ずれの両方の補正を可能としたものについて述べているが、第１の実施の形態と同様に色収差の補正のみ行なうものにも適用することができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態に適用される蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態に適用される蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 第２の実施の形態に用いられる干渉フィルタの概略構成を示す図。 本発明の第３の実施の形態に適用される走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。 従来の落射蛍光顕微鏡の要部の概略構成を示す図。

符号の説明

１０…光源、１１…干渉フィルタ
１２…励起フィルタ、１３…ダイクロイックミラー
１４…可変ミラー、１５…制御部、１６…反射ミラー
１７…対物レンズ、１８…標本
２０…駆動部、３０…レーザ光源
３１…干渉フィルタ、３２…ダイクロイックミラー
３３…可変ミラー、３４…スキャナ
３５…対物レンズ、３６…標本
３７…駆動部、３８…制御部

Claims (6)

1. 光源と、
   前記光源からの光を標本上に照射する照明光学系と、
   前記照明光学系に回転可能に設けられ、傾き角度に応じて前記光源から発せられる光の透過波長帯域をシフト可能にした光学素子と、
   前記光学素子の出射側に設けられ、光の波面変調を可能とした波面変調手段と、
   前記光学素子の傾き角度に応じて前記波面変調手段の光の波面変調を制御し色収差の補正を可能とした制御手段と
   を具備したことを特徴とする蛍光観察装置。
2. 異なる波長帯域のレーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記光源からのレーザ光を標本上に照射する照明光学系と、
   前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する走査手段と、
   前記照明光学系に回転可能に設けられ、傾き角度に応じて前記レーザ光源から発せられるレーザ光の透過波長帯域をシフト可能にした光学素子と、
   前記光学素子の出射側に設けられ、光の波面変調を可能とした波面変調手段と、
   前記光学素子の傾き角度に応じて前記波面変調手段の光の波面変調を制御し色収差の補正を可能とした制御手段と
   を具備したことを特徴とする蛍光観察装置。
3. さらに前記波面変調手段を移動させる駆動手段を有し、
   前記制御手段は、前記光学素子の傾き角度に応じて前記駆動手段による前記波面変調手段の移動を制御し、前記光学素子の傾きによる光軸ずれを補正可能としたことを特徴とする請求項１または２記載の蛍光観察装置。
4. 前記光学素子は、干渉フィルタからなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光観察装置。
5. 前記波面変調手段は、反射面の形状を変形可能とした可変ミラーからなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光観察装置。
6. 前記制御手段は、前記干渉フィルタの傾き角度と透過光波長の関係と、透過光波長に対する前記可変ミラーの面形状の制御量の関係をそれぞれデータベースとして記憶し、前記干渉フィルタの傾き角度に応じて前記データベースより透過光波長を求めるとともに、該透過光波長から前記可変ミラーの面形状の制御量を求め、該可変ミラーの面形状を決定するようにしたことを特徴とする請求項４または５記載の蛍光観察装置。

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