JP2005345193A - Quantitative determination method using nuclear magnetic resonance method and/or diffusion factor measurement method based on nuclear magnetic resonance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核磁気共鳴法及び／又は核磁気共鳴による拡散係数測定法を用いた検査対象の定量方法に関し、特に、核磁気共鳴の拡散係数測定法を用いた内部標準法による検査対象の定量方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying a test object using a nuclear magnetic resonance method and / or a diffusion coefficient measurement method by nuclear magnetic resonance, and in particular, to determine a test object by an internal standard method using a diffusion coefficient measurement method of nuclear magnetic resonance. Regarding the method.
核磁気共鳴（ＮＭＲ）法は、核スピン共鳴に由来する電磁波の吸収を利用した方法として知られ、今日、分子内の原子配置、電子構造、分子の微細構造等の解析に繁用的に使用されている。測定対象は気体・固体・液体が挙げられ、取得したい情報と測定対象に応じて、各種のＮＭＲ装置とＮＭＲ測定法を使用する。 The nuclear magnetic resonance (NMR) method is known as a method that utilizes absorption of electromagnetic waves derived from nuclear spin resonance, and is now frequently used for analysis of atomic arrangement in molecules, electronic structures, molecular microstructures, etc. Has been. Examples of the measurement object include gas, solid, and liquid, and various NMR apparatuses and NMR measurement methods are used according to the information to be acquired and the measurement object.
ＮＭＲにおける拡散係数測定法は、高周波磁場を印加した後、さらに、試料管に異なる種々のパルス磁場勾配を印加し、共鳴信号（以下信号）を取得する。異なるパルス磁場勾配の印加により得られた種々の信号は、パルス磁場勾配の強度に依存して減衰することが知られ、この減衰率により、分子のブラウン運動を評価する一つの指標である拡散係数が算出される。拡散係数は、検査対象となる物質に固有の値であり、先のパルス磁場勾配の強度に応じて、種々の減衰率が得られ、拡散係数を算出することができる。このことは、特定の物質に由来する特定の周波数に由来する信号を消去することが可能であることを意味している。 In the diffusion coefficient measurement method in NMR, after applying a high-frequency magnetic field, various different pulse magnetic field gradients are further applied to a sample tube to obtain a resonance signal (hereinafter referred to as a signal). Various signals obtained by applying different pulsed magnetic field gradients are known to decay depending on the intensity of the pulsed magnetic field gradient, and this decay rate is a diffusion coefficient that is an index for evaluating the Brownian motion of molecules. Is calculated. The diffusion coefficient is a value specific to the substance to be inspected, and various attenuation factors can be obtained according to the intensity of the previous pulse magnetic field gradient, and the diffusion coefficient can be calculated. This means that it is possible to cancel a signal derived from a specific frequency derived from a specific substance.
検査対象物質と内部標準物質とを用いた定量分析は、内部標準法と呼ばれている。内部標準法は、検査対象に参照用標準として内部標準物質を添加し、所望する測定系にて定量分析を行う手法である。測定系にて得た検査対象及び内部標準物質に由来するそれぞれの信号強度から比率を算出し、内部標準物質の含量又は濃度を基準として、目的とする検査対象の含量又は濃度を算出する。 Quantitative analysis using a test target substance and an internal standard substance is called an internal standard method. The internal standard method is a technique in which an internal standard substance is added as a reference standard to a test object and quantitative analysis is performed in a desired measurement system. The ratio is calculated from the signal intensities derived from the test object and the internal standard substance obtained in the measurement system, and the content or concentration of the target test object is calculated based on the content or concentration of the internal standard substance.
定量分析における内部標準物質に必要な特性は、目的とする測定系において良好な定量性を示すことである。また、要求される他の特性として、検査対象に由来する信号に影響を及ぼさないことが挙げられる。さらに、測定系の検査に要求される被検対象の存在形態を満たすことが必要である。 The characteristic required for the internal standard substance in the quantitative analysis is to show good quantitativeness in the target measurement system. Another required characteristic is that the signal derived from the inspection object is not affected. Furthermore, it is necessary to satisfy the existence form of the test object required for the inspection of the measurement system.
拡散係数測定法を含む種々のＮＭＲ法では、一般的に、取得したい情報の如何を問わず、検査対象となる測定系に内部標準物質を添加し、測定に供する。先にも述べたように、内部標準物質を含めた被験対象は、その存在形態が要求される。つまり、水溶性物質を検査対象とする場合、同じく水溶性を示す内部標準物質を測定系に添加する必要があり、有機系溶媒にのみ溶解性を示す物質を検査対象として使用する場合、同じく有機系溶媒に溶解性を示す内部標準物質を添加する必要がある。したがって、例えば、検査対象が水溶性である場合、有機溶媒に溶解性を示す内部標準物質を添加すること、あるいはその逆を行うことは出来ないという問題があった。また、水性溶媒又は有機溶媒にて測定を行う場合、測定毎に内部標準物質を調製し、測定系に添加することは煩雑であるという問題もあった。 In various NMR methods including a diffusion coefficient measurement method, an internal standard substance is generally added to a measurement system to be inspected regardless of the information desired to be obtained and used for measurement. As described above, the test subject including the internal standard substance is required to be present. In other words, when water-soluble substances are to be tested, it is necessary to add internal standards that are also water-soluble to the measurement system, and when substances that are soluble only in organic solvents are used as test objects, It is necessary to add an internal standard substance that is soluble in the system solvent. Therefore, for example, when the test object is water-soluble, there is a problem that it is impossible to add an internal standard substance that is soluble in an organic solvent or vice versa. Moreover, when measuring in an aqueous solvent or an organic solvent, there is also a problem that it is complicated to prepare an internal standard substance for each measurement and add it to the measurement system.
そこで本発明は、既存の内部標準物質を用いつつ、ＮＭＲ法及び／又はＮＭＲ法による拡散係数測定法における測定系に検査対象とともに共存させ、当該測定法を首尾よく実施することのできる方法を提供するとともに、当該測定系を用いて、検査対象の定量分析を繁用的かつ簡便に実施する方法をも提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a method that allows the measurement method in the NMR method and / or the diffusion coefficient measurement method based on the NMR method to coexist with the object to be tested and can be implemented successfully while using the existing internal standard substance. In addition, an object of the present invention is to provide a method for performing quantitative analysis of a test object in a conventional and simple manner using the measurement system.
本発明は、上記の目的を達成するために鋭意努力を重ねた結果、以下に示す発明をするに至った。 As a result of diligent efforts to achieve the above object, the present invention has led to the following inventions.
つまり、請求項１に記載の発明は、核磁気共鳴法及び／又は核磁気共鳴による拡散係数測定法を用いた定量方法であって：検査対象を有する第１相と内部標準物質を有する第２相とを前記測定法により、単一の測定にて、検査対象スペクトルと内部標準スペクトルとを得る測定工程；前記の各スペクトルから特定の信号を同定し、検査対象特定信号と内部標準物質特定信号とを得る同定工程；及び前記の各特定信号に基づいて、前記検査対象の含量を算出する算出工程；を有し、前記第１相及び前記第２相は、それぞれ第１部材及び第２部材に充填されていることを特徴とする。これにより、内部標準物質を調製し、測定毎に測定系へと導入するという煩雑な操作を行うことなく、繁用的且つ簡便に検査対象を定量することが可能となる。なお、第１相に検査対象を、第２相に内部標準物質を充填する、と記載しているが、第１相及び第２相は、相互に交換可能である。
That is, the invention described in
内部標準物質を含む第２相が充填されている第２部材は、毛細管であることが好ましく、封止されていることが更に好ましい。このことにより、上述に加え、一度調製した内部標準物質の溶液を再度調製することなく本発明に従った方法に使用することが可能となり、さらなる繁用性及び簡便性を達成することが可能となる。 The second member filled with the second phase containing the internal standard substance is preferably a capillary, and more preferably sealed. As a result, in addition to the above, it is possible to use the once prepared internal standard substance solution in the method according to the present invention without re-preparing, and to achieve further versatility and convenience. Become.
また、内部標準物質を含む第２相が充填されている第２部材は、本願における核磁気共鳴を実施する装置内部に固定されていてもよい。このことにより、検査対象を有する第１相が充填されている第１部材のみを上記装置内に適用することにより本発明の定量方法を実行することが可能となり、上述に加え、さらに利便性が向上される。 Further, the second member filled with the second phase containing the internal standard substance may be fixed inside the apparatus for performing nuclear magnetic resonance in the present application. This makes it possible to execute the quantification method of the present invention by applying only the first member filled with the first phase having the inspection object in the apparatus, and in addition to the above, further convenience is provided. Be improved.
さらに、検査対象を有する第１相が充填されている第１部材と内部標準物質を含む第２相が充填されている第２部材とが一体化された部材として構成されていてもよい。例えば、このような部材の例として、二重管を挙げることができる。また、内部標準物質を含む第２相が充填されている第２部材は、ガラス製であることが好ましい。 Further, the first member filled with the first phase having the inspection target and the second member filled with the second phase containing the internal standard substance may be configured as an integrated member. For example, a double pipe can be mentioned as an example of such a member. Moreover, it is preferable that the 2nd member with which the 2nd phase containing an internal standard substance is filled is glass.
本発明における内部標準物質は、ＮＭＲ法及び／又はＮＭＲによる拡散係数測定法を行った際、検査対象物質に由来する信号と異なる信号を与える物質であればよい。また、内部標準物質の分子量は、検査対象物質の分子量よりも大きいことが好ましく、例えば、高重合ジメチルポリシロキサンなどの、高分子量を有する内部標準物質を用いてもよい。 The internal standard substance in the present invention may be any substance that gives a signal different from the signal derived from the substance to be inspected when the NMR method and / or the diffusion coefficient measurement method by NMR is performed. The molecular weight of the internal standard substance is preferably larger than the molecular weight of the substance to be inspected. For example, an internal standard substance having a high molecular weight such as highly polymerized dimethylpolysiloxane may be used.
これら本発明における定量方法は、水素核核磁気共鳴であってもよい。 These quantitative methods in the present invention may be hydrogen nuclear magnetic resonance.
ＮＭＲ法を用いて、繁用的かつ簡便に検査対象を定量する方法を提供する。 Provided is a method for quantitatively and easily quantifying a test object using an NMR method.
（本発明における核磁気共鳴による拡散係数測定法を用いた定量方法の概略）
本発明は、種々の化合物を定量する方法に関する。本発明に係る定量方法は、ＮＭＲスペクトルを得る測定工程と、得たスペクトルから定量の用に供する信号を同定する同定工程と、同定した信号を用いて、検査対象物質の含量及び／又は濃度を算出する算出工程とから構成されている。また、上記測定工程では、検査対象と内部標準物質とを測定しており、且つ、検査対象と内部標準物質とは、物理的に隔離された第１相及び第２相中に存在していることを特徴としている。
(Outline of quantification method using diffusion coefficient measurement method by nuclear magnetic resonance in the present invention)
The present invention relates to a method for quantifying various compounds. The quantification method according to the present invention includes a measurement step for obtaining an NMR spectrum, an identification step for identifying a signal to be used for quantification from the obtained spectrum, and the content and / or concentration of a test substance using the identified signal. And a calculation step for calculating. In the measurement step, the test object and the internal standard substance are measured, and the test object and the internal standard substance exist in the physically separated first phase and second phase. It is characterized by that.
以下では、本発明をより深く理解すべく、（１）上記の測定工程、（２）第１相及び第２相、（３）第１相と第２相とを物理的に分離するために用いる第１部材及び第２部材、（４）検査対象、（５）内部標準物質、（６）上記の同定工程、（７）検量線の作成、（８）上記の算出工程、の順に述べる。 In the following, in order to better understand the present invention, (1) the above measurement process, (2) the first phase and the second phase, and (3) the physical separation of the first phase and the second phase. The first member and the second member to be used, (4) test object, (5) internal standard substance, (6) the identification step, (7) preparation of calibration curve, and (8) the calculation step will be described in this order.
（１）測定工程
核磁気共鳴による拡散係数測定法は、特定溶媒中での化合物のブラウン運動を計測する方法として用いられている。核磁気共鳴において化合物に通常の核磁気共鳴法（パルス磁場勾配を印加しない条件）を実行する場合と、パルス磁場勾配を印加する条件で実行する場合とでは、それぞれにより得られるスペクトルにおける信号は、印加するパルス磁場勾配の強度に依存して減衰する。ブラウン運動を計測する場合、この減衰の度合いを定量的に評価することにより、特定溶媒中での化合物の挙動を計測している。
(1) Measurement process The diffusion coefficient measurement method by nuclear magnetic resonance is used as a method for measuring the Brownian motion of a compound in a specific solvent. In the case of executing a normal nuclear magnetic resonance method (a condition in which a pulsed magnetic field gradient is not applied) on a compound in nuclear magnetic resonance, and in a case of executing under a condition in which a pulsed magnetic field gradient is applied, the signal in the spectrum obtained by each is It attenuates depending on the intensity of the applied pulse magnetic field gradient. When measuring the Brownian motion, the behavior of a compound in a specific solvent is measured by quantitatively evaluating the degree of attenuation.
本発明における核磁気共鳴による拡散係数測定法は、上述のパルス磁場勾配の印加による減衰なる現象を利用している。パルス磁場勾配の印加による減衰において、対象となる化合物の分子量と印加するパルス磁場勾配の強度とは反比例関係であることが知られている。つまり、同一の化合物に異なるパルス磁場勾配ＦＧＡ及びＦＧＢ（ＦＧＡ＞ＦＧＢ）を印加すると、それぞれ得たスペクトルにおける特定の信号強度Ａ及びＢは、Ａ＜Ｂの関係にある。 The method of measuring the diffusion coefficient by nuclear magnetic resonance in the present invention uses the phenomenon of attenuation due to the application of the pulse magnetic field gradient described above. It is known that in the attenuation by applying a pulse magnetic field gradient, the molecular weight of the target compound and the intensity of the applied pulse magnetic field gradient are inversely related. That is, when different pulse magnetic field gradients FG A and FG B (FG A > FG B ) are applied to the same compound, specific signal intensities A and B in the obtained spectra are in a relationship of A <B.
本発明では、この関係を利用し、目的とする化合物を定量している。本来ならば、単一の化合物でありながら複雑なスペクトルを与える場合であっても、印加するパルス磁場勾配を種々変更することにより、同一化合物に由来する特定の信号を減衰させることにより、他の信号と識別し、本発明において検査対象の定量を可能としている。本発明による定量方法を構成する測定工程では、第１部材に充填されている第１相に含まれている検査対象と第２部材に充填されている第２相に含まれている内部標準物質とを、単一の核磁気共鳴測定にて測定し、下述の各スペクトルを得る。 In the present invention, this relationship is used to quantify the target compound. Originally, even in the case of giving a complex spectrum even though it is a single compound, by changing various pulse magnetic field gradients applied, it is possible to attenuate other signals by attenuating specific signals derived from the same compound. It is discriminated from the signal, and in the present invention, the inspection object can be quantified. In the measuring step constituting the quantification method according to the present invention, the test object contained in the first phase filled in the first member and the internal standard substance contained in the second phase filled in the second member Are measured by a single nuclear magnetic resonance measurement to obtain the following spectra.
複数の検査対象を単一の核磁気共鳴測定にて測定する場合、個々の検査対象に由来する信号が重なり合うことも想定される。かかる場合には、パルス磁場勾配を印加し、重なり合う信号を消失させることにより、目的とする信号のみをスペクトルとして検出し、定量の用に供することが可能となる。 When measuring a plurality of inspection objects by a single nuclear magnetic resonance measurement, it is assumed that signals derived from the individual inspection objects overlap. In such a case, by applying a pulse magnetic field gradient and eliminating overlapping signals, only the target signal can be detected as a spectrum and used for quantification.
本発明で用いる拡散係数測定法は、公知の方法を用いても良く、例えば、スティミュレーテッド・エコー法を挙げることができる。また、核磁気共鳴の対象となる核種は、水素核（１Ｈ）であってもよく、他の核種（１３Ｃ、１９Ｆ、２９Ｓｉ、３１Ｐ）であってもよい。 As the diffusion coefficient measurement method used in the present invention, a known method may be used, and examples thereof include a stimulated echo method. The nuclide to be subjected to nuclear magnetic resonance may be a hydrogen nucleus (1H) or another nuclide ( 13 C, 19 F, 29 Si, 31 P).
（２）第１相及び第２相
本発明において、第１相及び第２相は、それぞれ、検査対象及び内部標準物質を含有する均一な溶液で構成される。かかる溶液を調製すべく用いる溶媒は、ＮＭＲ法にて公知のものを用いることが可能で、検査対象及び／又は内部標準物質の物性並びに対象とする核種に応じて種々選択可能である。例えば、水素核にて実施する核磁気共鳴の場合、重水、重クロロホルム、重メタノール、重アセトン、重アセトニトリル、重ベンゼン、重ジメチルホルムアミド、重ジメチルスルフォキシド、重ピリジン、重トルエンなどを挙げることができる。また、対象物質及び内部標準物質の極性が異なり、異なる溶媒を用いなければ測定の用に供することが出来ない場合であっても差し支えない。重要なことは、対象物質及び内部標準物質の溶媒に対する溶解性を考慮するのみで本発明における定量方法を実施することができる。
(2) 1st phase and 2nd phase In this invention, a 1st phase and a 2nd phase are comprised with the uniform solution containing a test object and an internal standard substance, respectively. As a solvent used for preparing such a solution, a known solvent can be used in the NMR method, and various kinds of solvents can be selected depending on the physical properties of the inspection target and / or internal standard substance and the target nuclide. For example, in the case of nuclear magnetic resonance performed in a hydrogen nucleus, heavy water, heavy chloroform, heavy methanol, heavy acetone, heavy acetonitrile, heavy benzene, heavy dimethylformamide, heavy dimethyl sulfoxide, heavy pyridine, heavy toluene, etc. Can do. In addition, even if the polarities of the target substance and the internal standard substance are different and cannot be used for measurement unless different solvents are used, there is no problem. Importantly, the determination method of the present invention can be carried out only by considering the solubility of the target substance and the internal standard substance in the solvent.
（３）第１部材及び第２部材
ＮＭＲ法における試料管に使用可能な材料は、信号の検出のために印加される高周波磁場及び試料によって誘起された高周波磁場を十分に透過することが必要である。つまり、測定セルの材料は、ＮＭＲ法に由来した一般的な要素として、非磁性であり、且つ、非導電性でなければならない。また、好ましくは、測定周波数帯に妨害となるノイズ成分を発生しない部材を用いる。最も好適には、ガラス製である。
(3) First member and second member The material that can be used for the sample tube in the NMR method needs to sufficiently transmit the high-frequency magnetic field applied for signal detection and the high-frequency magnetic field induced by the sample. is there. In other words, the material of the measurement cell must be non-magnetic and non-conductive as a general element derived from the NMR method. Preferably, a member that does not generate an interference noise component in the measurement frequency band is used. Most preferably, it is made of glass.
特に本発明で用いる第１部材と第２部材とは、物理的に隔離されていることが好ましい。組み合わせの一例として、第１部材としてＮＭＲ用試料管を用い、第２部材として封止した毛細管を用いる。また、第１部材と第２部材とが一体的に成形された部材を用いることも可能であって、例として二重管を挙げることができる。 In particular, the first member and the second member used in the present invention are preferably physically separated. As an example of the combination, an NMR sample tube is used as the first member, and a sealed capillary tube is used as the second member. Moreover, it is also possible to use a member in which the first member and the second member are integrally formed, and a double tube can be given as an example.
さらに、内部標準物質を有する第２相を充填された第２部材は、本発明における測定工程において用いる装置の内部に保持されてもよい。例えば、試料管を導入する核磁気共鳴装置のプローブ内の底部に載置し、その上部に検査対象を有する第１相を充填された第１部材を挿入し測定することも可能である。 Furthermore, the 2nd member filled with the 2nd phase which has an internal standard substance may be hold | maintained inside the apparatus used in the measurement process in this invention. For example, it is possible to place a first member filled with a first phase having a test object on the bottom of a probe of a nuclear magnetic resonance apparatus into which a sample tube is introduced, and perform measurement.
もちろん、ＮＭＲ測定に必要な上述した条件を満たす要件を備えていれば、これら例示した条件以外の部材を用い、或いはかかる部材を種々の存在形態にて保持・載置することも可能である。 Of course, as long as the above-mentioned conditions necessary for NMR measurement are satisfied, members other than those exemplified above can be used, or such members can be held and placed in various forms.
また、かかる部材の材質は、磁性を有さない材質であればよく、例えば、ガラス、石英、テフロン（登録商標）、ジルコニア、アルミナ、窒化珪素、窒化アルミナ等を用いることが可能である。もちろん、ＮＭＲ法に用いることの出来る材料であれば、上記に限定されるものではない。 Moreover, the material of this member should just be a material which does not have magnetism, For example, glass, quartz, Teflon (trademark), a zirconia, an alumina, a silicon nitride, an alumina nitride etc. can be used. Of course, the material is not limited to the above as long as it can be used for the NMR method.
（４）検査対象
検査対象は、１Ｈを有する化合物であれば、いずれの化合物を用いることも可能であって、ほとんど水素を構成分子として有する化合物のほぼすべてを定量することが可能である。例示すると、人工的に合成された化合物や天然由来の複合化合物を挙げることができ、例えば、非環式、単環式、縮合多環式、架橋環式、スピロ型、環集合型、テルペン類などの炭化水素類、酸素、窒素、ハロゲン、イオウ、セレン、テルルなどを含むヘテロ化合物、ビタミン、カロテノイド、レチノイド、トコフェロール、単糖・多糖類、アルカロイドなど天然由来の複合化合物、アミノ酸、脂質、核酸、ステロイド、タンパクなど生体由来の複合化合物等を挙げることができる。本発明において、検査対象は、一種類であっても複数種類の化合物であってもよい。
(4) Test object As long as the test object is a compound having 1 H, any compound can be used, and almost all compounds having hydrogen as a constituent molecule can be quantified. Illustrative examples include artificially synthesized compounds and naturally occurring composite compounds, such as acyclic, monocyclic, condensed polycyclic, bridged cyclic, spiro, ring assembly, terpenes Such as hydrocarbons, hetero compounds including oxygen, nitrogen, halogen, sulfur, selenium, tellurium, etc., natural compounds such as vitamins, carotenoids, retinoids, tocopherols, monosaccharides / polysaccharides, alkaloids, amino acids, lipids, nucleic acids And complex compounds derived from living bodies such as steroids and proteins. In the present invention, the test object may be one type or a plurality of types of compounds.
検査対象の定量可能範囲は、下述する検査対象に係る検量線の線形性を保持している範囲内であり、この定量可能範囲は検査対象の溶媒中での挙動や印加するパルス磁場勾配の強度等に依存するが、概ね０．１〜数ｍｇ／ｍＬ溶媒程度である。 The quantifiable range of the test object is within the range that maintains the linearity of the calibration curve related to the test object described below, and this quantifiable range is the behavior of the solvent in the test object and the pulse magnetic field gradient to be applied. Although it depends on strength and the like, it is about 0.1 to several mg / mL solvent.
（５）内部標準物質
本発明における定量方法において、用いることの出来る内部標準物質（又は基準物質とも呼ばれている）は、パルス磁場勾配を印加した際、検査対象由来の特定の信号が減衰し消去される前にピークが消去されることのない物質を選択する必要がある。検査対象及び／又は内部標準物質の分子量とパルス磁場勾配による信号の減衰とは正比例関係（つまり、同じパルス磁場勾配を印加した条件において、異なる分子量を有する化合物の特定の信号は、分子量が小さい化合物に由来する信号の強度の方が消去されやすい）にあることが知られている。このことから、内部標準物質として用いる物質は、検査対象よりも大きな分子量を有するものを用いる。また、検査対象に由来するピークと重なり合うことがない物質を用いる。本発明における第１相又は第２相を構成する上記の溶媒に由来するピークを内部標準物質として用いることも可能であるが、検査対象に由来する信号と重なる場合があることを考慮すべきである。本発明において用いることが可能な内部標準物質は、上記の溶媒に加え、上記要件に適した物質に加え、任意の分子量を有した化合物で入手が容易な高重合ジメチルポリシロキサンなどを挙げることができる。
(5) Internal standard substance The internal standard substance (or also referred to as a reference substance) that can be used in the quantification method of the present invention attenuates a specific signal derived from the test object when a pulse magnetic field gradient is applied. It is necessary to select a substance whose peak is not erased before it is erased. The molecular weight of the test object and / or internal standard substance and the signal attenuation due to the pulse magnetic field gradient are directly proportional to each other (that is, a specific signal of a compound having a different molecular weight is a compound having a small molecular weight under the same pulse magnetic field gradient applied condition). It is known that the intensity of the signal derived from is more easily erased). For this reason, the substance used as the internal standard substance has a molecular weight larger than that of the test object. In addition, a substance that does not overlap with the peak derived from the inspection object is used. Although it is possible to use a peak derived from the above-mentioned solvent constituting the first phase or the second phase in the present invention as an internal standard substance, it should be considered that it may overlap with a signal derived from a test object. is there. Examples of the internal standard substance that can be used in the present invention include a highly polymerized dimethylpolysiloxane that can be easily obtained as a compound having an arbitrary molecular weight in addition to the above-mentioned solvent, a substance suitable for the above requirements, and the like. it can.
内部標準物質に由来する信号は、検査対象に由来する信号強度と極端に異なることは避けることが望ましく、この場合、検査対象及び／又は内部標準物質の濃度を種々調節すればよい。また、毛細管内封標準物の調製は、測定する検査対象の信号等から分離している物質を選び適当な重溶媒に溶解させ、一端が封止された市販のガラス製毛細管に入れ上部を炎で加熱すること等で封管する。かかる毛細管は、予め一端が封止されている部材を用いることも可能であるが、両端が開放している毛細管を用いてもよい。かかる場合、炎で加熱すること等で一端を封止し、上述の内部標準物質を含有する溶媒溶液を充填した後、再度他端を封止することにより、毛細管内封標準物を調製することができる。この操作により、上述した第２相を充填された第２部材が得られ、本発明の定量方法に供することが可能となる。 It is desirable to avoid that the signal derived from the internal standard substance is extremely different from the signal intensity derived from the test object. In this case, the concentration of the test object and / or the internal standard substance may be variously adjusted. In addition, a capillary sealed standard is prepared by selecting a substance separated from the signal to be inspected to be measured, dissolving it in an appropriate heavy solvent, and placing it in a commercially available glass capillary tube with one end sealed. Seal the tube by heating with, etc. For such a capillary tube, a member whose one end is sealed in advance can be used, but a capillary tube whose both ends are open may be used. In such a case, one end is sealed by heating with a flame, etc., and after filling with the solvent solution containing the above-mentioned internal standard substance, the other end is sealed again to prepare a capillary encapsulated standard. Can do. By this operation, the second member filled with the second phase described above is obtained, and can be used in the determination method of the present invention.
（６）同定工程
本発明における定量方法では、上述の測定法により得られたスペクトルのうち、特定の信号に着目する。特定の化合物に由来するスペクトルには、通常、複数の信号が観察されるが、かかる複数の信号が、いずれの化合物に由来するかを同定することが必要である。
(6) Identification step In the quantification method in the present invention, attention is paid to a specific signal in the spectrum obtained by the above-described measurement method. In a spectrum derived from a specific compound, a plurality of signals are usually observed, but it is necessary to identify which compound the plurality of signals are derived from.
本発明において、一回の測定で得られるスペクトルには、通常、複数の信号が観察される。単一の信号がいずれの化合物に由来するかを同定する手法として繁用されているのは、測定の対象となっている一種類の化合物に関するスペクトルとで比較する手法である。また、特定の信号は、上述した複数の強度にてパルス磁場勾配を印加し減衰の程度（正の減衰又は負の減衰であってもよい）を比較して、単一の化合物に由来する特定の信号を同定する。一般に、本発明に用いる核磁気共鳴を用いた拡散係数測定法では、複数の化合物を有する被検対象に由来する複数の信号は、かかる複数の化合物の種類により影響を受けないことから、単一の化合物にて検討したスペクトルと比較して信号を同定する手法は有効である。一般的なＮＭＲ法では、信号の発現する周波数位置や信号の形態（シングレットやダブレット等）が重要な情報として用いられるが、本発明における同定工程では、信号の強度が重要な情報であって、信号の発現周波数は、定量の対象とする信号の発現位置を示すのみで、定量値を得るべく、単一の化合物に由来するいずれの信号を用いても差し支えない。重要なことは、検査対象を用いて得たスペクトルにおける信号と、下述する検量線作成において対象とした信号とが同一であることである。 In the present invention, a plurality of signals are usually observed in a spectrum obtained by a single measurement. What is frequently used as a method for identifying which compound a single signal is derived from is a method for comparison with a spectrum relating to one type of compound to be measured. In addition, the specific signal is derived from a single compound by applying a pulse magnetic field gradient at the above-described multiple intensities and comparing the degree of attenuation (which may be positive attenuation or negative attenuation). Identify the signal. In general, in the diffusion coefficient measurement method using nuclear magnetic resonance used in the present invention, a plurality of signals derived from a test subject having a plurality of compounds are not affected by the types of the plurality of compounds. A method for identifying a signal in comparison with the spectrum studied with the above compound is effective. In a general NMR method, the frequency position where the signal is expressed and the form of the signal (singlet, doublet, etc.) are used as important information, but in the identification step of the present invention, the signal strength is important information, The expression frequency of the signal only indicates the expression position of the signal to be quantified, and any signal derived from a single compound may be used to obtain a quantitative value. What is important is that the signal in the spectrum obtained by using the inspection target is the same as the signal targeted in the calibration curve creation described below.
（７）検量線の作成
本発明の定量方法において、検査対象とする化合物を用いて検量線を作成しておく。種々の濃度の検査対象を含有する溶媒溶液を調製し本発明における測定工程を実行して得られた特定の信号に着目し、上述の通り、信号強度を定量的に評価する。検査対象の一つを、内部標準物質とともに測定系に導入し、得た信号を用いて特定のピークに由来する積分値を算出し、内部標準物質の積分値とで標準化し検量線を作成する。通常この検量線は線形性を示し、相関関係を示す１次関数にて表示し、検査対象毎に作成した検量線を用いて、未知濃度の検査対象物質を定量する際、検査対象の定量値を得るべく、かかる１次関数を用いる。相関関係を示す１次関数の相関係数又は決定係数は、０．９以上１、好ましくは０．９５以上１以下、さらに好ましくは０．９９以上１以下である。
(7) Creation of calibration curve In the quantification method of the present invention, a calibration curve is created using a compound to be examined. Focusing on a specific signal obtained by preparing solvent solutions containing test objects of various concentrations and executing the measurement process in the present invention, the signal intensity is quantitatively evaluated as described above. One of the test objects is introduced into the measurement system together with the internal standard substance, and the integrated value derived from the specific peak is calculated using the obtained signal, and the standard value is created with the integral value of the internal standard substance to create a calibration curve . Normally, this calibration curve shows linearity and is displayed as a linear function indicating the correlation, and when quantifying a test substance of unknown concentration using a calibration curve created for each test object, the quantitative value of the test object Such a linear function is used to obtain The correlation coefficient or determination coefficient of the linear function indicating the correlation is 0.9 or more, preferably 0.95 or more and 1 or less, and more preferably 0.99 or more and 1 or less.
（８）算出工程
上述の同定工程により同定した信号を用いて、所望する化合物の定量に供する。内部標準法により、所望する化合物の含量を算出する。かかる信号を用いた定量では、通常、（１）ピーク高さ、（２）ピーク幅、（３）ピーク面積、という３種類の化合物情報が想定される。いずれの方法を用いても差し支えないが、所望する化合物の実際の含有量を出来るだけ反映していることが重要であり、例えば、ベースラインと信号とで囲まれる部分を積分することによりピーク面積を算出することが挙げられる。なお、便宜上、以下では、定量を行う上で用いる化合物情報をピーク面積として記述するが、他の情報であっても差し支えなく、適宜、以下の文章を読み変えるものとする。
(8) Calculation step Using the signal identified in the identification step described above, it is used for quantification of the desired compound. The content of the desired compound is calculated by an internal standard method. In quantification using such a signal, usually three types of compound information are assumed: (1) peak height, (2) peak width, and (3) peak area. Either method can be used, but it is important to reflect the actual content of the desired compound as much as possible. For example, the peak area can be obtained by integrating the portion surrounded by the baseline and the signal. Is calculated. For convenience, in the following, compound information used for quantification will be described as a peak area, but other information may be used, and the following sentences will be read as appropriate.
さらに、本発明では、検査対象とともに内部標準物質を用いて測定を行い、検査対象及び内部標準物質に由来するピーク面積をそれぞれ取得する。得た各ピーク面積を標準化することにより、所望の検査対象の含量を算出する。 Further, in the present invention, measurement is performed using the internal standard substance together with the test object, and the peak areas derived from the test object and the internal standard substance are respectively acquired. By standardizing each obtained peak area, the content of a desired test object is calculated.
（実施例１：低分子量の化合物を検査対象として用いた例）
検量線用標準溶液の調製：トリメチルシロキシケイ酸（以下、化合物Ａと略す）、ポロブチレングリコール／ＰＰＧ−９／１コポリマー（以下、化合物Ｂと略す）及びｔ−ブチルメトキシジベンゾイルメタン（以下、化合物Ｃと略す）を各々約１５０ｍｇを正確にはかり取り、各々アセトンを加え溶解した後、正確に１００ｍＬ（それぞれＡ溶液、Ｂ溶液及びＣ溶液と略す）にメスアップする。次いでＡ、Ｂ及びＣ溶液を１ｍＬずつとり１０ｍＬのスクリュー管に合わせ、水浴上でアセトンを留去する。
(Example 1: Example using low molecular weight compound as test object)
Preparation of standard solution for calibration curve: trimethylsiloxysilicic acid (hereinafter abbreviated as compound A), polybutylene glycol / PPG-9 / 1 copolymer (hereinafter abbreviated as compound B) and t-butylmethoxydibenzoylmethane (hereinafter abbreviated as “compound A”) About 150 mg of each compound (abbreviated as Compound C) is accurately weighed, and acetone is added to dissolve each. Next, 1 mL each of the A, B, and C solutions is taken and combined with a 10 mL screw tube, and acetone is distilled off on a water bath.
標準試料の入ったスクリュー管に重クロロホルム１ｍＬを加え溶解した後、一部をＮＭＲ用試料管に移し、検量線用標準溶液とする。 After 1 mL of deuterated chloroform is added to the screw tube containing the standard sample and dissolved, a part is transferred to the NMR sample tube to obtain a standard solution for the calibration curve.
被検体用試料溶液の調製：Ａ溶液、Ｂ溶液及びＣ溶液を任意に加えて調製した混合溶液の一部を取り１０ｍＬのスクリュー管に入れ水浴上でアセトンを留去する。このスクリュー管に重クロロホルム１ｍＬを加え溶解した後、一部をＮＭＲ用試料管に移し被検体用試料溶液１とする。
Preparation of sample solution for specimen: A part of the mixed solution prepared by arbitrarily adding A solution, B solution and C solution is taken, put into a 10 mL screw tube, and acetone is distilled off on a water bath. After 1 mL of deuterated chloroform is added to the screw tube and dissolved, a part thereof is transferred to the NMR sample tube and used as the
毛細管内封標準物の調製：重クロロホルム５ｍＬを１０ｍＬのスクリュー管に入れ、内封標準物（ジクロロメタン）２００ｍｇを加えて混合する。この溶液を市販の毛細管（融点測定用：内径１ｍｍ）に高さ４ｃｍ以上満たした後、上部を加熱・封管し、毛細管内封標準物１とする。
Preparation of capillary sealed standard: Put 5 mL of deuterated chloroform into a 10 mL screw tube, add 200 mg of sealed standard (dichloromethane) and mix. After filling this solution in a commercially available capillary tube (for melting point measurement: 1 mm inside diameter) with a height of 4 cm or more, the upper part is heated and sealed to obtain a capillary sealed
ＮＭＲ測定：
検量線用標準溶液又は被検体用試料溶液１と、毛細管内封標準物１とを各々ＮＭＲ用試料管に入れ、以下のＮＭＲ測定条件１にて、１Ｈ−ＮＭＲを測定しスペクトルを得る。
NMR measurement:
A calibration curve standard solution or
ＮＭＲ測定条件１：
装置：日本電子社製・ＥＣＡ−４００ １Ｈ核：４００ＭＨｚ
測定核：１Ｈ
測定法：１Ｈ シングルパルス（４５°パルス）
繰り返し時間：８秒
積算回数：６４回
図１は、検量線用標準スペクトル及び被検体用スペクトル例を示した。毛細管内封標準物の積分値を１００としたときの化合物Ａ、Ｂ、Ｃに由来する代表ピークの積分値を用いて、化合物Ａ、Ｂ及びＣを定量する。
NMR measurement condition 1:
Apparatus: JEOL Ltd./ECA-400 1 H core: 400 MHz
Measurement nucleus: 1 H
Measurement method: 1 H single pulse (45 ° pulse)
Repetition time: 8 seconds Integration count: 64 times FIG. 1 shows an example of a standard curve for a standard curve and a spectrum for a subject. The compounds A, B, and C are quantified using the integrated values of the representative peaks derived from the compounds A, B, and C when the integrated value of the capillary sealed standard is 100.
例えば、化合物Ｃを例にとる。
被検体用試料溶液中の化合物Ｃ量＝（１６．９４／２２．９３）×検量線用標準溶液中の化合物Ｃ量（１．４９ｍｇ）＝１．１０ｍｇ
（実施例２：高分子量を有する検査対象を用いた定量例）
混合試料中の化合物Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の定量例
検量線用標準溶液の調製：フルクトース（Ｍｗ：１８０）（以下、化合物Ｄと略す）、ポリ塩化ジメチルメチレンピペリジニウム（Ｍｗ：約１５万）（以下、化合物Ｅと略す）、カチオン化ヒドロキシエチルセルロース（Ｍｗ：約２００万）（以下、化合物Ｆと略す）を正確に秤量し、重水１ｍＬを加えて濃度の異なる３水準の混合溶液を調製し、ＮＭＲ用試料管に移し、それぞれ検量線用標準溶液１、２及び３とする。
For example, take Compound C as an example.
Compound C amount in sample solution for specimen = (16.94 / 22.93) × Amount of compound C in standard solution for calibration curve (1.49 mg) = 1.10 mg
(Example 2: Quantitative example using test object having high molecular weight)
Example of quantification of compounds A, B, C (D, E, F) in mixed sample Preparation of standard solution for calibration curve: fructose (Mw: 180) (hereinafter abbreviated as compound D), polydimethylmethylenepiperidinium chloride (Mw: about 150,000) (hereinafter abbreviated as compound E), cationized hydroxyethyl cellulose (Mw: about 2 million) (hereinafter abbreviated as compound F) are accurately weighed, and 1 mL of heavy water is added to vary the concentration. A mixed solution of a standard is prepared, transferred to an NMR sample tube, and used as calibration
被検体用試料溶液の調製：任意に加えて調製した化合物Ｄ、Ｅ及びＥの混合物に重水１ｍＬを加えて、ＮＭＲ用試料管に移し、被検体用試料溶液２とする。 Preparation of sample solution for specimen: 1 mL of heavy water is added to a mixture of compounds D, E, and E, which are optionally added, and transferred to an NMR sample tube to obtain specimen solution 2 for specimen.
毛細管内封標準物の調製：毛細管内封標準物（高重合ジメチルポリシロキサン；平均分子量１００万）１００ｍｇを１０ｍＬスクリュー管にはかり取り、重クロロホルム１ｍＬを加えて溶解する。この溶液を市販の毛細管（融点測定用：内径１ｍｍ）に高さ４ｃｍ以上満たした後、上部を加熱・封管し、毛細管内封標準物２とした。
Preparation of capillary sealed standard: 100 mg of capillary sealed standard (highly polymerized dimethylpolysiloxane; average
ＮＭＲ測定：
検量線用標準溶液１、２及び３又は被検体用試料溶液２と、毛細管内封標準物２とを、各々ＮＭＲ用試料管に入れ、パルス磁場勾配をかけた自己拡散係数測定法を用いて、以下のＮＭＲ測定条件２にて測定した
ＮＭＲ測定条件２：
装置：日本電子社製・ＥＣＡ−４００ １Ｈ核：４００ＭＨｚ
パルス磁場勾配ユニット：最大パルス磁場勾配強度；２３００ Ｇａｕｓｓ／ｃｍ
測定核：１Ｈ
測定法：シュテミュレイテッドエコー法
拡散時間：４０ｍｓ
パルス磁場勾配幅：１ｍｓ
パルス磁場勾配強度：化合物Ａ測定用；０ Ｇａｕｓｓ／ｃｍ
化合物Ｂ測定用；６００ Ｇａｕｓｓ／ｃｍ
化合物Ｃ測定用；２０００ Ｇａｕｓｓ／ｃｍ
図２は、上述の通り測定して得た１Ｈ−ＮＭＲを測定しスペクトルを示している。それぞれの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、内封標準物の積分値を１．００としたときの化合物Ｄ、Ｅ及びＦに由来する代表ピークの積分値を用いて、上述の算出式から、化合物Ｄ、Ｅ及びＦの量を算出した。
NMR measurement:
The calibration
Apparatus: JEOL Ltd./ECA-400 1 H core: 400 MHz
Pulse magnetic field gradient unit: Maximum pulse magnetic field gradient strength; 2300 Gauss / cm
Measurement nucleus: 1 H
Measurement method: Stemulated echo method Diffusion time: 40 ms
Pulse magnetic field gradient width: 1 ms
Pulse magnetic field gradient strength: for compound A measurement; 0 Gauss / cm
For compound B measurement; 600 Gauss / cm
For compound C measurement; 2000 Gauss / cm
FIG. 2 shows a spectrum obtained by measuring 1 H-NMR obtained by measurement as described above. In each 1 H-NMR spectrum, using the integral value of the representative peak derived from compounds D, E and F when the integral value of the enclosed standard is 1.00, the compound D , E and F were calculated.
例えば、化合物Ｆを例にとる。 For example, take Compound F as an example.
Claims (7)
検査対象を有する第１相と内部標準物質を有する第２相とを前記測定法により、単一の測定にて、検査対象スペクトルと内部標準スペクトルとを得る測定工程；
前記の各スペクトルから特定の信号を同定し、検査対象特定信号と内部標準物質特定信号とを得る同定工程；及び
前記の各特定信号に基づいて、前記検査対象の含量を算出する算出工程；
を有し、
前記第１相及び前記第２相は、それぞれ第１部材及び第２部材に充填されていることを特徴とする定量方法。 A quantitative method using a nuclear magnetic resonance method and / or a diffusion coefficient measurement method by nuclear magnetic resonance:
A measurement step of obtaining a test target spectrum and an internal standard spectrum by a single measurement of the first phase having a test target and the second phase having an internal standard substance by the measurement method;
An identification step of identifying a specific signal from each of the spectra and obtaining a test target specific signal and an internal standard specific signal; and a calculation step of calculating a content of the test target based on each of the specific signals;
Have
The first phase and the second phase are filled in a first member and a second member, respectively.
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