JP2005341961A - ヒト歯髄細胞の分化誘導方法及び象牙質再生用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法。
【選択図】 なし
Description
好ましくは、1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3の培地中の濃度は1×10-8〜1×10-5mol/lであり、デキサメタゾンの培地中の濃度は1×10-9〜1×10-6mol/lであり、β−グリセロホスフェートの培地中の濃度は1〜30mmol/lである。
好ましくは、担体がセラミック系担体である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した分化誘導された象牙芽細胞を含む、象牙質再生用細胞組成物が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む、象牙質の再生方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記方法により再生された象牙質が提供される。
本発明による分化誘導された象牙芽細胞の製造方法は、ヒト歯髄細胞またはヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを特徴とする。
(i)分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を培養する工程(一次培養);
(ii)当該細胞を担体に播種して培養する工程(二次培養);及び
(iii)当該細胞を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートを含む培地中で培養する工程(分化誘導):
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
(1)採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者(29歳女性)の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10%抗生剤入りPBS溶液にて保存した。
2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM培地とNutrient Mixture F-12を1:1で混合した(以下DMEM/F12と略す)培地に15%血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした後、37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
ALPase活性の測定にはp-Nitrophenyl phosphate tablets sets(SIGMA社製)を使用した。細胞播種後、7日間および10日間経過したプレートの培養上清を吸引除去し、PBS溶液で洗浄した後、パラニトロフェニルリン酸(以下PNPPと略す)溶液を各ウェルに800μlずつ添加して、37℃、5% CO2条件下で6分間反応させた。0.2NのNaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、96穴プレートに200μl添加し、マイクロプレートリーダー(TECAN社製GENios)を用いて415nmの吸光度を測定した。
測定した結果を、図1(ind(-))に示す。
なお、以下の比較例2においては、(1)採取保存、(2)細胞回収、(4)測定は、比較例1と同じ条件下で行っており、条件の異なる静置培養と結果についてのみ詳述する。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には1ng/mlTGF-β1、10-8mol/l1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3を添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図1(TGF+VD)に示す。
(6)採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者(24歳女性)の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10%抗生剤入りPBS溶液にて保存した。
2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM培地とNutrient Mixture F-12を1:1で混合した(以下DMEM/F12と略す)培地に15%血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、4 回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした後、37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
ALPase活性の測定にはp-Nitrophenyl phosphate tablets sets(SIGMA社製)を使用した。細胞播種後、7日間および10日間経過したプレートの培養上清を吸引除去し、PBS溶液で洗浄した後、パラニトロフェニルリン酸(以下PNPPと略す)溶液を各ウェルに800μlずつ添加して、37℃、5%CO2条件下で6分間反応させた。0.2NのNaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、96穴プレートに200μl添加し、マイクロプレートリーダー(TECAN社製GENios)を用いて415nmの吸光度を測定した。
測定した結果を、図2(ind(-))に示す。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、4回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には100μmol/lアスコルビン酸、10-8 mol/lDexamethasone、2.9mmol/ l リン酸二水素カリウム、20mmol/l HEPES([2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸)を添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図2(Dex+KH2PO4)に示す。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には10mmol/lβ-Glycerophosphate、10-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図2(βGly+Dex)に示す。
(11)採取保存
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者(22歳女性)の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10%抗生剤入りPBS溶液にて保存した。
2mg/mlコラゲナーゼをDMEM培地に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を50分間酵素処理した。得られた組織を25ml用のピペットを用いて10分間ピペッティングした。25mlの上澄み液を遠心分離して細胞を回収した。得られた細胞をDMEM培地とNutrient Mixture F-12を1:1で混合した(以下DMEM/F12と略す)培地に15%血清を入れた培地にて5回洗浄した後、70μmセルストレイナーでろ過し、遠心分離することによって細胞を回収した。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした後、37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
ALPase活性の測定にはp-Nitrophenyl phosphate tablets sets(SIGMA社製)を使用した。細胞播種後、7日間および10日間経過したプレートの培養上清を吸引除去し、PBS溶液で洗浄した後、パラニトロフェニルリン酸(以下PNPPと略す)溶液を各ウェルに800μlずつ添加して、37℃、5%CO2条件下で6分間反応させた。0.2NのNaOH溶液を等量加えて反応を停止させ、96穴プレートに200μl添加し、マイクロプレートリーダー(TECAN社製GENios)を用いて415nmの吸光度を測定した。
測定した結果を、図3(ind(-))に示す。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には10mmol/lβ-Glycerophosphate、10-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図3(βGly+Dex)に示す。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には100μmol/lアスコルビン酸、10-6mol/l1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、10mmol/lβ-Glycerophosphate、10-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図1(VD+βGly+Dex)に示す。
回収した細胞を15%血清入りDMEM/F12培地に100μmol/lの濃度でアスコルビン酸を添加して37℃、5%CO2条件下で培養を行ない、2回継代した細胞をトリプシン-EDTAにて細胞培養用フラスコから剥離した後、12ウェルプレートに1×104個/well播種をした。培養には100μmol/lアスコルビン酸、10-6mol/l1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、10mmol/lβ-Glycerophosphate、10-8mol/ l Dexamethasoneを添加した15%血清入りDMEM/F12培地を用いて37℃、5%CO2条件下で静置培養を行なった。
測定した結果を、図3(VD+βGly+Dex)に示す。
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者(21歳男性)の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10%抗生剤入りPBS溶液にて保存した。
医師によるインフォームドコンセントの得られた患者(21歳男性)の智歯を使用した。治療のため抜歯した智歯をタービンで削り、歯髄を露出させ、無菌的に歯髄組織を採取し、10%抗生剤入りPBS溶液にて保存した。
Claims (10)
- 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを含む、分化誘導された象牙芽細胞の製造方法。
- 細胞を担体上で培養する、請求項1に記載の方法。
- 1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3の培地中の濃度が1×10-8〜1×10-5mol/lであり、デキサメタゾンの培地中の濃度が1×10-9〜1×10-6mol/lであり、β−グリセロホスフェートの培地中の濃度が1〜30mmol/lである、請求項1又は2に記載の方法。
- (i)分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を培養する工程、(ii)当該細胞を担体に播種して培養する工程、及び(iii)当該細胞を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートを含む培地中で培養する工程、を含む、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 担体がセラミック系担体である、請求項4に記載の方法。
- 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを含む分化誘導された象牙芽細胞の製造方法により得られる、分化誘導された象牙芽細胞。
- 請求項6に記載の分化誘導された象牙芽細胞を含む、象牙質再生用細胞組成物。
- 請求項1から5の何れかに記載の方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む、象牙質の再生方法。
- 分離したヒト歯髄細胞又はヒト歯髄細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を1,25(ジヒドロキシ)ビタミンD3、デキサメタゾン及びβ−グリセロホスフェートの存在下で培養することを含む分化誘導された象牙芽細胞の製造方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞を培養することを含む象牙質の再生方法により再生された象牙質。
- 請求項1から5の何れかに記載の方法により得られる分化誘導された象牙芽細胞、又は請求項5記載の方法により再生された象牙質を患者に移植することを含む、歯科患者の治療方法。
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