JP2005336159A - Novel therapeutic use of pigment epithelium-derived factor which inhibits nadph oxidase activity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血管障害を予防または治療するための医薬組成物またはベクターに関し、特に、色素上皮由来因子(PEDF)またはその変異体を活性成分として含有する医薬組成物およびPEDFまたはその変異体をコードする核酸を含むベクターに関する。 The present invention relates to a pharmaceutical composition or vector for preventing or treating vascular disorders, and in particular, encodes a pharmaceutical composition containing pigment epithelium-derived factor (PEDF) or a variant thereof as an active ingredient, and PEDF or a variant thereof. The present invention relates to a vector containing a nucleic acid.
色素上皮由来因子(PEDF)はセリンプロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、当初、ヒト網膜芽細胞腫細胞において強力な神経分化活性を有する因子としてヒト網膜色素上皮細胞の培養上清から精製された(非特許文献1)。最近、PEDFが細胞培養および動物モデルにおいて血管形成を非常に効果的に阻害することが示されている。PEDFは、網膜上皮細胞の成長および移動を阻害し、虚血誘発網膜新血管形成を抑制した(非特許文献2, 3)。
Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is a glycoprotein belonging to the superfamily of serine protease inhibitors, and was originally purified from the culture supernatant of human retinal pigment epithelial cells as a factor with strong neuronal differentiation activity in human retinoblastoma cells. (Non-Patent Document 1). Recently, PEDF has been shown to inhibit angiogenesis very effectively in cell culture and animal models. PEDF inhibited retinal epithelial cell growth and migration and suppressed ischemia-induced retinal neovascularization (Non-patent
網膜は眼球に栄養や酸素を供給するための細小血管がネットワークを構成しているが、糖尿病などで高血糖状態が長く続くとこれらの血管が障害され、透過性の亢進を生じる。この病態がさらに進行し虚血領域が拡大していくと、新生血管を伴う増殖性糖尿病網膜症に至る。PEDFは硝子体に存在しており、そのレベルは眼血管形成疾患において減少していることから、眼に存在するPEDFは増殖性糖尿病網膜症の発症において機能的に重要であることが示唆される(非特許文献4)。しかしながら、PEDFがどのように上皮細胞(EC)の成長および機能を調節するのかは完全には理解されていない。
アテローム性動脈硬化症も同様にECに関連する炎症性繊維増殖疾患であり(非特許文献5)、その病因は、ECにおいて血栓性および炎症性反応を誘導するTNF-αおよびIL-1のような古典的炎症誘発性サイトカインであると考えられる(非特許文献6, 7)。ECはこれらサイトカインに暴露されると、IL-6産生、接着分子の発現および凝血促進活性の誘導を含む、決定的な機能的変化を起こす(非特許文献8-10)。これらサイトカインのシグナル伝達および遺伝子発現は、ECにおける活性酸素種(ROS)の生成に大きく依存している(非特許文献11, 12)。ROSは、網膜症およびアテローム性動脈硬化症において主要な役割を果たす酸化的ストレスを引き起こす。
血管細胞におけるROSは主として、NADPHオキシダーゼにより産生され(非特許文献31)、NADPHオキシダーゼは、細胞の成長、接着分子やサイトカインの遺伝子発現を含む、細胞の病態生理学的応答において不可欠であることが知られている(非特許文献31)。実際、NADPHオキシダーゼは終末糖化産物(AGE)(糖尿病において形成が加速される老齢巨大タンパク質誘導体)によって活性化され、それにより酸化的ストレスとECにおける遺伝子発現の変化とが関連付けられ、糖尿病性ミクロおよびマクロ血管障害が発症すると考えられている(非特許文献32)。
In the retina, small blood vessels for supplying nutrients and oxygen to the eyeball constitute a network. However, if a hyperglycemic state continues for a long time due to diabetes or the like, these blood vessels are damaged, resulting in increased permeability. As this condition progresses further and the ischemic area expands, it leads to proliferative diabetic retinopathy with new blood vessels. PEDF is present in the vitreous and its levels are reduced in ocular angiogenesis, suggesting that PEDF present in the eye is functionally important in the development of proliferative diabetic retinopathy (Non-patent document 4). However, how PEDF regulates epithelial cell (EC) growth and function is not fully understood.
Atherosclerosis is also an inflammatory fibroproliferative disease associated with EC (Non-Patent Document 5), and its etiology is similar to that of TNF-α and IL-1, which induce thrombotic and inflammatory responses in EC It is considered to be a classic anti-inflammatory cytokine (Non-patent
ROS in vascular cells is mainly produced by NADPH oxidase (Non-Patent Document 31), and NADPH oxidase is known to be essential in cell pathophysiological responses, including cell growth and gene expression of adhesion molecules and cytokines. (Non-patent Document 31). In fact, NADPH oxidase is activated by advanced glycation end products (AGE), an aged giant protein derivative that is accelerated in diabetes, thereby correlating oxidative stress with changes in gene expression in EC, diabetic micro and Macrovascular disorders are thought to develop (Non-patent Document 32).
本発明者らは最近、PEDFがROS生成を抑制することによってAGE誘発周皮細胞アポトーシスおよび微小血管上皮細胞傷害を有意に阻害することを示した(非特許文献15, 33)。
そこで、本発明者らは、PEDFが、NADPHオキシダーゼ仲介細胞内シグナル経路を遮断することによって、糖尿病性血管合併症を含む様々なタイプの血管障害の進行を予防し得ると考えた。本発明者らのPEDFについての研究により、PEDFは実際にはNADPHオキシダーゼ活性を抑制すること、特に、ヒト臍帯静脈内皮細胞(以下、HUVECと表記する)においてPEDFがRac活性化を抑制することによりTNF-α誘発性NADPHオキシダーゼ活性を阻害し、その結果NF-κB活性化、IL-6発現、アンジオテンシンII活性および/または終末糖化産物(AGE)情報伝達を阻害することが明らかとなり、それによって本発明を完成させた。
The present inventors have recently shown that PEDF significantly inhibits AGE-induced pericyte apoptosis and microvascular epithelial cell injury by suppressing ROS generation (Non-patent Documents 15 and 33).
Thus, the present inventors thought that PEDF could prevent the progression of various types of vascular disorders including diabetic vascular complications by blocking the NADPH oxidase-mediated intracellular signaling pathway. According to our research on PEDF, PEDF actually suppresses NADPH oxidase activity, in particular, PEDF suppresses Rac activation in human umbilical vein endothelial cells (hereinafter referred to as HUVEC). It has been shown to inhibit TNF-α-induced NADPH oxidase activity, thereby inhibiting NF-κB activation, IL-6 expression, angiotensin II activity and / or advanced glycation end product (AGE) signaling. Completed the invention.
即ち本発明は、以下の発明を提供する:
(1) a) 色素上皮由来因子;
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体;および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群から選択される活性成分を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物; NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種の生成を抑制する該医薬組成物; NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性、アンジオテンシンII活性、および/または終末糖化産物情報伝達を阻害する、該医薬組成物;
具体的には、
NADPHオキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明の医薬組成物;より具体的には、NADPHオキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患より成る群から選択される、該医薬組成物;
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物; NF-κB活性化−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物; IL-6発現−関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択される、本発明の医薬組成物; TNF-α活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物; アンジオテンシンII活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明の医薬組成物; NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明の医薬組成物; 終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である、本発明の医薬組成物;
(2) a) 色素上皮由来因子;または
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体
をコードする核酸を含む、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するためのベクター; NADPHオキシダーゼ仲介活性酸素種生成を抑制するベクター; NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性アンジオテンシンII活性および/または終末糖化産物情報伝達を阻害するベクター;
具体的には、
NADPHオキシダーゼに起因する疾患を予防または治療するための、本発明のベクター;より具体的には、NADPHオキシダーゼに起因する疾患が、血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物情報伝達−関連疾患より成る群から選択される、該ベクター;
さらに具体的には、
血管障害が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター; NF-κB活性化−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター; IL-6発現−関連疾患が、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫より成る群から選択される、本発明のベクター; TNF-α活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター; アンジオテンシンII活性−関連疾患が、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞より成る群から選択される、本発明のベクター; NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症を治療するための本発明のベクター; 終末糖化産物情報伝達−関連疾患が、終末糖化産物生成に伴う糖尿病性血管合併症である、本発明のベクター;に関する。
That is, the present invention provides the following inventions:
(1) a) Pigment epithelium-derived factor;
b) a variant of the factor having a functionally equivalent property to the pigment epithelium-derived factor (a); and
c) a pharmaceutical composition for inhibiting NADPH oxidase activity, comprising an active ingredient selected from the group consisting of a vector comprising a nucleic acid molecule encoding said factor (a) or said variant (b); NADPH oxidase mediated Said pharmaceutical composition that suppresses the production of reactive oxygen species; by inhibiting NADPH oxidase activity, NF-κB activation, IL-6 expression, TNF-α activity, angiotensin II activity, and / or glycation end product signaling Said pharmaceutical composition that inhibits;
In particular,
The pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating a disease caused by NADPH oxidase; more specifically, a disease caused by NADPH oxidase is vascular disorder, NF-κB activation-related disease, IL-6 The pharmaceutical composition selected from the group consisting of expression-related disease, TNF-α activity-related disease, angiotensin II activity-related disease, and advanced glycation end signaling-related disease;
More specifically,
The pharmaceutical composition of the invention, wherein the vascular disorder is selected from the group consisting of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction; NF -κB activation-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, and A pharmaceutical composition of the invention selected from the group consisting of cerebral infarction; IL-6 expression-related disease is coronary event, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, A pharmaceutical composition of the present invention selected from the group consisting of diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma; TNF-α activity -Related diseases consist of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, and cerebral infarction A pharmaceutical composition of the invention selected from the group; angiotensin II activity-related disease is vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and brain A pharmaceutical composition of the present invention selected from the group consisting of infarcts; a pharmaceutical composition of the present invention for treating diabetic vascular complications associated with the production of advanced glycation end products by inhibiting NADPH oxidase activity; Product communication-a pharmaceutical composition of the invention, wherein the associated disease is diabetic vascular complications associated with the production of advanced glycation end products;
(2) a) Pigment epithelium-derived factor; or
b) a vector for inhibiting NADPH oxidase activity, comprising a nucleic acid encoding a variant of the factor having a functionally equivalent property to pigment epithelium-derived factor (a); inhibiting NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species production A vector; inhibiting NADPH oxidase activity to inhibit NF-κB activation, IL-6 expression, TNF-α activity angiotensin II activity and / or terminal glycation product signaling;
In particular,
The vector of the present invention for preventing or treating a disease caused by NADPH oxidase; more specifically, a disease caused by NADPH oxidase is vascular disorder, NF-κB activation-related disease, IL-6 expression The vector selected from the group consisting of a related disease, TNF-α activity-related disease, angiotensin II activity-related disease, and advanced glycation end signaling-related disease;
More specifically,
A vector of the invention wherein the vascular disorder is selected from the group consisting of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction; NF-κB Activation-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, and cerebral infarction A vector of the invention selected from the group consisting of: IL-6 expression-related disease is coronary event, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complication Vector of the present invention selected from the group consisting of disease, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma; TNF-α activity-related The disease is from the group consisting of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney disease, and cerebral infarction The vector of the present invention selected; the group wherein the angiotensin II activity-related disease consists of vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction A vector of the present invention selected from: a vector of the present invention for treating diabetic vascular complications associated with the production of glycation end products by inhibiting NADPH oxidase activity; It relates to the vector of the present invention, which is a diabetic vascular complication associated with the production of a terminal glycation product.
(1) NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物
本発明者らは、後述する実施例に示す2つの異なる方法(図2)によって、PEDFがTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を抑制することを示した。正確な分子機構は明らかでないが、本発明者らの本研究は、PEDFがHUVECにおいてRac活性化を抑制することによりTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を阻害している可能性があることが示唆する。
(1) Pharmaceutical composition for inhibiting NADPH oxidase activity The present inventors have demonstrated that PEDF inhibits TNF-α-induced NADPH oxidase activity by two different methods (FIG. 2) shown in the Examples described later. Indicated. Although the exact molecular mechanism is not clear, our study suggests that PEDF may inhibit TNF-α-induced NADPH oxidase activity by suppressing Rac activation in HUVEC .
本発明の医薬組成物は、NADPHオキシダーゼ障害を予防または治療するために使用することができる。本発明において、予防には再発防止も含む。NADPHオキシダーゼは活性酸素種(ROS)の生成を仲介する。ROSは、過酸化水素のような分子、次亜塩素酸イオンまたはスーパーオキサイドアニオンのようなイオン、ヒドロキシルラジカルのようなラジカルなどであり、殺菌に関与する。しかしながら、ROSは網膜症およびアテローム性動脈硬化症において主要な役割を果たす酸化的ストレスを引き起こす場合がある。
従って本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおける活性酸素種(ROS)生成、NF-κB活性化およびIL-6発現に対するPEDFの効果について検討した。TNF-αは細胞内ROS生成を有意に上昇させ、それはPEDFまたはNADPHオキシダーゼ阻害物質であるジフェニレン・ヨードニウム(以下、DPIと表記する)により完全に抑制された。さらに、PEDFはTNF-αが誘発するNADPHオキシダーゼ活性の上昇を完全に阻害した。PEDFまたは抗酸化剤であるN-アセチルシステインは、TNF-α誘発NF-κB活性化を有意に阻害した。PEDFは、TNF-α誘発IL-6発現をmRNAおよびタンパク質レベルの両者において阻害した。さらに、TNF-αはPEDF mRNAレベルを減少させた。リガンドブロット解析により、HUVECがPEDFに対して結合親和性を有する膜タンパク質を有することが明らかとなった。これらの結果は、PEDFがHUVECにおいてNADPHオキシダーゼ仲介ROS生成を抑制することにより、TNF-α誘発NF-κB活性化およびその後のIL-6過剰発現を阻害することを示している。
The pharmaceutical composition of the present invention can be used to prevent or treat NADPH oxidase disorders. In the present invention, prevention includes prevention of recurrence. NADPH oxidase mediates the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS is a molecule such as hydrogen peroxide, an ion such as a hypochlorite ion or a superoxide anion, a radical such as a hydroxyl radical, and the like, and is involved in sterilization. However, ROS can cause oxidative stress, which plays a major role in retinopathy and atherosclerosis.
Therefore, the present inventors examined the effects of PEDF on reactive oxygen species (ROS) production, NF-κB activation and IL-6 expression in TNF-α-exposed HUVECs. TNF-α significantly increased intracellular ROS production, which was completely suppressed by PEDF or NADPH oxidase inhibitor diphenylene iodonium (hereinafter referred to as DPI). Furthermore, PEDF completely inhibited the increase in NADPH oxidase activity induced by TNF-α. PEDF or the antioxidant N-acetylcysteine significantly inhibited TNF-α-induced NF-κB activation. PEDF inhibited TNF-α-induced IL-6 expression at both the mRNA and protein levels. Furthermore, TNF-α decreased PEDF mRNA levels. Ligand blot analysis revealed that HUVEC has a membrane protein with binding affinity for PEDF. These results indicate that PEDF inhibits TNF-α-induced NF-κB activation and subsequent IL-6 overexpression by suppressing NADPH oxidase-mediated ROS production in HUVEC.
さらに、アンジオテンシンII(AngII)がHUVECにおいて、酸化還元に感受性を有する転写因子であるNF-κBの活性化、ついでMCP-1(Monocyte Chemoattractant protein-1)の発現を顕著に誘発し、これらが抗酸化剤であるN-アセチルシステイン(以下、NACと表記する)同様、PEDFによって完全に阻害されること、およびHUVECにおいてAngIIにて誘発されたROSの発生をNADPHオキシダーゼ阻害剤であるDPIと同様に阻害することを見出した。
また、終末糖化産物(AGE)は、微小血管内皮細胞での分子内活性酸素種の活性を顕著に刺激するが、これらがPEDFによって完全に抑制されること、また、PEDFは、NADPHオキシダーゼ活性における増加と同様に終末糖化産物(AGE)にて誘発されたNADPHオキシダーゼを阻害すること、さらにPEDFは、血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞に対し、有意な抗酸化活性を示すことを明らかにした。さらに、AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対し、有効性を示した。以上の一連の事象を本明細書においては「終末糖化産物(AGE)情報伝達」という。
以上の知見より、本発明はまた、NADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより、NF-κB活性化、IL-6発現、TNF-α活性、アンジオテンシンII活性および/または終末糖化産物(AGE)情報伝達を阻害する医薬組成物を提供する。
Furthermore, angiotensin II (AngII) markedly induces the activation of NF-κB, a transcription factor sensitive to redox, and then the expression of MCP-1 (Monocyte Chemoattractant protein-1) in HUVEC. Like N-acetylcysteine (hereinafter referred to as NAC), which is an oxidizing agent, it is completely inhibited by PEDF, and the generation of ROS induced by AngII in HUVEC is similar to DPI, which is an NADPH oxidase inhibitor. Found to inhibit.
In addition, advanced glycation end products (AGE) significantly stimulate the activity of intramolecular reactive oxygen species in microvascular endothelial cells, but these are completely suppressed by PEDF, and PEDF is also active in NADPH oxidase activity. Inhibition of NADPH oxidase induced by advanced glycation end products (AGE) as well as increase, and PEDF is significant for cells treated with AGE fraction from hemodialysis diabetic (DM-HD) serum It was revealed that it exhibits antioxidant activity. Furthermore, it showed efficacy against retinal vascular permeability in AGE perfused rats. The series of events described above is referred to as “terminal glycation end product (AGE) information transmission” in the present specification.
From the above findings, the present invention also suppresses NADPH oxidase activity, thereby enabling NF-κB activation, IL-6 expression, TNF-α activity, angiotensin II activity and / or advanced glycation end product (AGE) signaling. Pharmaceutical compositions that inhibit are provided.
本発明が目的とする対象疾患はNADPHオキシダーゼに起因する疾患であり、これには例えば血管障害、NF-κB活性化−関連疾患、IL-6発現−関連疾患、TNF-α活性−関連疾患、アンジオテンシンII活性−関連疾患、および終末糖化産物(AGE)情報伝達−関連疾患が包含される。
血管障害には、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞などが含まれる。
The target diseases targeted by the present invention are those caused by NADPH oxidase, such as vascular disorders, NF-κB activation-related diseases, IL-6 expression-related diseases, TNF-α activity-related diseases, Angiotensin II activity-related diseases, and advanced glycation end product (AGE) signaling-related diseases are included.
Vascular disorders include vasculitis, atherosclerosis, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver Diseases, kidney diseases, cerebral infarction and the like are included.
NF-κB活性化−関連疾患の例には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。
転写因子であるNF-κBは、炎症誘発性サイトカインおよび成長因子の遺伝子発現を調節し、血管機能障害およびアテローム性動脈硬化症の発症において中心的役割を果たす(非特許文献34)。本発明者らは本発明において、TNF-αがIL-6発現をNF-κBの活性化を介してmRNAおよびタンパク質レベルで有意に誘導することを発見した。PEDFまたは抗酸化物質NACは、TNF-α誘発NF-κB活性化およびそれに続くIL-6 mRNA発現上昇を有意に阻害するので、PEDFはその抗酸化特性を介してIL-6発現を減少させた可能性があり、本明細書で述べるように本発明者らはそれに関して多くの証拠を示した。
Examples of NF-κB activation-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, Includes kidney disease, and cerebral infarction.
NF-κB, a transcription factor, regulates gene expression of pro-inflammatory cytokines and growth factors and plays a central role in the development of vascular dysfunction and atherosclerosis (Non-patent Document 34). In the present invention, the present inventors have discovered that TNF-α significantly induces IL-6 expression at the mRNA and protein levels through activation of NF-κB. PEDF or antioxidant NAC significantly inhibited TNF-α-induced NF-κB activation and subsequent elevation of IL-6 mRNA expression, so PEDF decreased IL-6 expression through its antioxidant properties It is possible that we have shown a lot of evidence about it as described herein.
IL-6発現−関連疾患の例には、冠動脈イベント、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、脳梗塞、および悪性骨髄腫が含まれる。アテローム性動脈硬化症における全身性炎症反応のほとんどが、IL-6の作用によって説明できる。IL-6はC-反応性タンパク質(CRP)の肝合成の主要な誘導因子であり、また、不安定狭心症の患者におけるIL-6およびCRPの血清レベルの上昇は予後不良と関連がある(非特許文献35, 36)。さらに、最近幾つかの研究により、CRPが一見健康な中年男性における心血管疾患の独立した予測危険因子であり得ることが示された(非特許文献37)。それ故PEDFは、IL-6およびCRP産生を弱めることによって、アテローム性動脈硬化症の進行に対して有利な効果を示し得るであろう。以上のことから、PEDFは、アテローム性動脈硬化症の発達および進行において重要な役割を果たしている可能性がある。 Examples of IL-6 expression-related diseases include coronary events, vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver Diseases, kidney disease, cerebral infarction, and malignant myeloma are included. Most of the systemic inflammatory response in atherosclerosis can be explained by the action of IL-6. IL-6 is a major inducer of hepatic synthesis of C-reactive protein (CRP) and elevated serum levels of IL-6 and CRP are associated with poor prognosis in patients with unstable angina (Non-patent documents 35, 36). In addition, several recent studies have shown that CRP may be an independent predictive risk factor for cardiovascular disease in seemingly healthy middle-aged men (37). Therefore, PEDF could have a beneficial effect on the progression of atherosclerosis by weakening IL-6 and CRP production. From the above, PEDF may play an important role in the development and progression of atherosclerosis.
TNF-α活性−関連疾患の例には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、癌、炎症、関節リウマチ、肝疾患、腎疾患、および脳梗塞が含まれる。TNF-αは、ROSの生成を介して複数の細胞機能に対し多面的作用を発揮する(非特許文献8, 13, 14)。事実、以下に示す実施例は、TNF-αがROS生成、NF-κB活性化およびIL-6発現を誘発することを示す。それに対して、以下に示す実施例はまた、TNF-αによって誘発されるこれら機能が実際にPEDFによって抑制または阻害されたことを示す。即ちPEDFは、TNF-α活性、特にNADPHオキシダーゼ活性に基づくTNF-α活性−関連疾患を予防または治療するのに使用できると考えられる。
Examples of TNF-α activity-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary event, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, cancer, inflammation, rheumatoid arthritis, liver disease, kidney Diseases, and cerebral infarction are included. TNF-α exerts a multifaceted action on a plurality of cell functions through generation of ROS (
アンジオテンシンII活性−関連疾患には、血管炎、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈イベント、高血圧、インシュリン抵抗性、肥満、糖尿病性血管合併症、および脳梗塞が含まれる。アンジオテンシンII(AngII)は、レニン-アンジオテンシン系の支配的なエフェクターであり、血管壁細胞での数多くの炎症性増殖性応答を調整し、そのことにより動脈硬化症を惹起しうることが知られている。本発明者らは、以下の実施例試験結果以外の試験結果も合わせて、PEDFが、AngIIが誘発された血管内皮細胞の活性化を試験管内で阻害し、その機序がNADPHオキシダーゼにより媒介されたROSの発生を抑制することによるものであることを見出した。このことにより、PEDFは動脈硬化症の発症および悪化に重要な予防、治療効果を示すことが判明した。この知見により、本発明は、さらに、PEDFのNADPHオキシダーゼ活性阻害作用によるアンジオテンシンII活性を抑制し、このことからアンジオテンシンII由来の疾患、たとえば、血管障害、特に動脈硬化症等の循環器系疾患の予防または治療剤を提供することができる。 Angiotensin II activity-related diseases include vasculitis, atherosclerosis, acute coronary events, hypertension, insulin resistance, obesity, diabetic vascular complications, and cerebral infarction. Angiotensin II (AngII) is the dominant effector of the renin-angiotensin system and is known to modulate numerous inflammatory proliferative responses in vascular wall cells and thereby cause arteriosclerosis Yes. The present inventors combined the test results other than the test results of the following Examples, and PEDF inhibited the activation of AngII-induced vascular endothelial cells in vitro, and the mechanism was mediated by NADPH oxidase. We found that this was due to the suppression of ROS generation. This revealed that PEDF has an important preventive and therapeutic effect on the onset and exacerbation of arteriosclerosis. Based on this finding, the present invention further suppresses angiotensin II activity due to the inhibitory action of PEDF on NADPH oxidase activity, and as a result, angiotensin II-derived diseases such as vascular disorders, in particular, cardiovascular diseases such as arteriosclerosis. A prophylactic or therapeutic agent can be provided.
本発明は、さらにNADPHオキシダーゼ活性を抑制することにより終末糖化産物(AGE)生成に伴う糖尿病性血管合併症、即ち終末糖化産物(AGE)情報伝達−関連疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
終末糖化産物(AGE)情報伝達−関連疾患には、糖尿病性血管合併症、例えば増殖性糖尿病網膜症等が含まれる。
The present invention further provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic vascular complications associated with the production of glycation end products (AGE), ie, glycation end products (AGE) signaling-related diseases, by further suppressing NADPH oxidase activity. I will provide a.
Advanced glycation end product (AGE) signaling-related diseases include diabetic vascular complications such as proliferative diabetic retinopathy.
また、本発明者らは本研究において、PEDF単独ではTNF-α暴露HUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性、NF-κBプロモーター活性またはIL-6 mRNAレベルに影響しないことを発見した。つまり、PEDFは基本状態ではECに対して有害な作用を示さないようである。従って本発明の組成物およびベクターは、本明細書記載の数多くの疾患を、より安全に、より都合良く、そして副作用の問題を懸念することなく、予防または治療するのに使用可能である。
この知見により、本発明は、NADPHオキシダーゼに起因する疾患から予防または治療させる医薬組成物および/またはそのためのベクターを提供する。この態様において、本発明は、NADPHオキシダーゼに起因する疾患から予防または治療させるのみであり、過剰の作用を示さない。
In addition, the present inventors have found in this study that PEDF alone does not affect NADPH oxidase activity, NF-κB promoter activity or IL-6 mRNA level in TNF-α-exposed HUVECs. That is, PEDF does not appear to have a detrimental effect on EC in the basic state. Thus, the compositions and vectors of the present invention can be used to prevent or treat a number of diseases described herein more safely, more conveniently, and without concern about side-effect problems.
Based on this finding, the present invention provides a pharmaceutical composition and / or vector for preventing or treating from a disease caused by NADPH oxidase. In this embodiment, the present invention only prevents or treats a disease caused by NADPH oxidase and does not exhibit an excessive effect.
(2) 本発明の医薬組成物に含まれる活性成分
活性成分は、以下より成る群から選択することができる:
a) 色素上皮由来因子;
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体;および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター。
(2)-1. 色素上皮由来因子
色素上皮由来因子(PEDF)のアミノ酸配列および核酸配列は、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1526-1530 (1993)に記載されており、ジーンバンクアクセション番号 M76979で登録されている。参考のため、ヒトPEDFのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号:1および2において示す。本発明によれば、PEDFには、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマのような哺乳類由来の全種類のPEDFが含まれるが、ヒト由来のPEDFが好ましい。
PEDFは、Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような多くの出版物および参考文献に従って、該タンパク質をコードするDNAを発現させることにより産生することができる。特に、発現プラスミドは、本発明のDNAを適切な発現ベクター(例えばpBK-CMV)に挿入することによって構築する。そして、その発現プラスミドを適切な宿主細胞に導入し形質転換細胞を得る。宿主細胞の例には、大腸菌のような原核生物、酵母のような単細胞性真核生物、および昆虫並びに動物のような多細胞性真核生物の細胞が含まれる。発現プラスミドは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法、リポフェクチン法等のような常套的方法により宿主細胞へ導入することができる。所望のタンパク質は、該形質転換体を通常の方法に従い適切な培地中で培養することにより産生される。このようにして得られたタンパク質は、標準的生化学的手法に従って単離精製することができる。
(2) Active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention The active ingredient can be selected from the group consisting of:
a) pigment epithelium-derived factor;
b) a variant of the factor having a functionally equivalent property to the pigment epithelium-derived factor (a); and
c) A vector comprising a nucleic acid molecule encoding the factor (a) or the mutant (b).
(2) -1. Pigment epithelium-derived factor The amino acid sequence and nucleic acid sequence of pigment epithelium-derived factor (PEDF) are described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (4), 1526-1530 (1993). , Registered with Genebank Accession Number M76979. For reference, the amino acid sequence and nucleic acid sequence of human PEDF are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. According to the present invention, PEDF includes all types of PEDF from mammals such as humans, dogs, cats, cows, and horses, with human-derived PEDF being preferred.
PEDF can be produced by expressing the DNA encoding the protein according to many publications and references such as Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). In particular, the expression plasmid is constructed by inserting the DNA of the present invention into an appropriate expression vector (eg pBK-CMV). Then, the expression plasmid is introduced into an appropriate host cell to obtain a transformed cell. Examples of host cells include prokaryotes such as E. coli, unicellular eukaryotes such as yeast, and multicellular eukaryotic cells such as insects and animals. Expression plasmids can be introduced into host cells by conventional methods such as the calcium phosphate method, electroporation method, lipofectin method and the like. The desired protein is produced by culturing the transformant in an appropriate medium according to a usual method. The protein thus obtained can be isolated and purified according to standard biochemical techniques.
本明細書で用いる場合、「PEDFと機能的に同等の性質を有するPEDFの変異体」には、ヒトPEDFと機能的に同等の性質を有するすべての種類のPEDF変異体が含まれる。例えばPEDFの変異体は、US6319687、WO03059248、WO9324529等に記載されている。
PEDF変異体の好ましい例には、ヒトPEDFのアミノ酸配列に対して置換、欠失および/または付加である1つもしくはそれ以上、または幾つかのアミノ酸残基の変化を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトPEDFと機能的に同等の性質を有するPEDFの変異体が含まれる。
ヒトPEDFと機能的に同等の性質とは、ヒトPEDFと同等のNADPHオキシダーゼ活性の抑制を意味する。
本発明の変異体もまた、前述の組換え技術によって調製することができる。
前述のように調製した変異体が機能的に同等の性質を有するか否かは、本明細書で後述する実施例に従って証明することができる。
As used herein, “variants of PEDF functionally equivalent to PEDF” include all types of PEDF variants having properties functionally equivalent to human PEDF. For example, mutants of PEDF are described in US6319687, WO03059248, WO9324529 and the like.
Preferred examples of PEDF variants include amino acid sequences having one or more or several amino acid residue changes that are substitutions, deletions and / or additions to the amino acid sequence of human PEDF, and Variants of PEDF that have functionally equivalent properties to human PEDF are included.
Functionally equivalent to human PEDF means suppression of NADPH oxidase activity equivalent to human PEDF.
Variants of the invention can also be prepared by the recombinant techniques described above.
Whether the mutants prepared as described above have functionally equivalent properties can be proved according to the examples described later in this specification.
PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物はまた、要すれば、常套的な担体を含むことができる。
PEDFまたはその変異体を含有する本発明の医薬組成物は、例えば、皮内、皮下または静脈内注射によって投与することができる。好ましくは、このようなPEDFまたはその変異体は、注射によって病変が存在する部位に直接投与する。そのような製剤中のタンパク質の量は、治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して適宜変化するであろうが、典型的には、毎日(1回または数回に分けて投与することができる)、数日から数ヶ月ごとにPEDFまたはその変異体を0.0001mg-1000 mg、好ましくは0.001mg-100 mg、より好ましくは0.01mg-10mg投与する。
A pharmaceutical composition of the invention containing PEDF or a variant thereof can also optionally include a conventional carrier.
A pharmaceutical composition of the invention containing PEDF or a variant thereof can be administered, for example, by intradermal, subcutaneous or intravenous injection. Preferably, such PEDF or variant thereof is administered directly to the site where the lesion is present by injection. The amount of protein in such a formulation will vary depending on the disease being treated, the age and weight of the patient, etc., but is typically administered daily (in one or several divided doses). PEDF or a variant thereof is administered at 0.0001 mg-1000 mg, preferably 0.001 mg-100 mg, more preferably 0.01 mg-10 mg every few days to several months.
(2)-2. 核酸およびベクター
本発明の医薬組成物が含有する活性成分は、色素上皮由来因子、または色素上皮由来因子のアミノ酸配列に対して置換、欠失および/または付加である1つまたは幾つかのアミノ酸残基の変化を含み、かつ色素上皮由来因子と機能的に同等の性質を有するその変異体をコードする核酸を含むベクターであってよい。
(2) -2. Nucleic acid and vector The active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention is one that is a substitution, deletion and / or addition to the pigment epithelium-derived factor or the amino acid sequence of the pigment epithelium-derived factor. Alternatively, it may be a vector containing a nucleic acid encoding a variant thereof that contains several amino acid residue changes and has functionally equivalent properties to the pigment epithelium-derived factor.
本明細書で用いる場合、「核酸」にはDNAおよびRNAが含まれ、それらは一本鎖または二本鎖であってよい。核酸は、典型的DNA合成または遺伝子工学的方法に従い、例えば”Molecular Cloning”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような標準的テキストの記載に従い容易に調製することができる。 As used herein, “nucleic acid” includes DNA and RNA, which may be single-stranded or double-stranded. Nucleic acids can be readily prepared according to typical DNA synthesis or genetic engineering methods, for example as described in standard texts such as “Molecular Cloning”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
ベクターに組み込まれた核酸を癌患者に投与することにより、PEDFまたはその変異体は癌細胞において高発現する。つまり、これらベクターは、常套的に用いられるように遺伝子治療に有用である。ベクターの例には、前述の核酸をDNAまたはRNAウィルス、例えばレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクチニアウィルス、ポックスウィルス、ポリオウィルス、またはシンドビスウィルスに組み込んで細胞に導入するウイルスベクターが含まれる。これら方法のうち、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスまたはワクチニアウィルスを用いるものが特に好ましい。該ベクターの具体例には、pAd/CMV/V5-DEST Gateway Vector (Invitrogen)が含まれる。 By administering a nucleic acid incorporated into a vector to a cancer patient, PEDF or a variant thereof is highly expressed in cancer cells. That is, these vectors are useful for gene therapy as are routinely used. Examples of vectors include viruses that incorporate the aforementioned nucleic acids into DNA or RNA viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, vaccinia viruses, poxviruses, polioviruses, or Sindbis viruses and introduce them into cells. Vector is included. Of these methods, those using retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus or vaccinia virus are particularly preferred. Specific examples of the vector include pAd / CMV / V5-DEST Gateway Vector (Invitrogen).
本発明のベクターを含有する医薬組成物はまた、要すれば、常套的な担体を含んでも良い。
このようなベクターを含む医薬組成物は、例えば、皮内投与、皮下投与または静脈注射により投与することができる。好ましくは、このようなPEDFまたはその変異体は、病変の存在する部位に直接投与する。そのような製剤中のベクターの量は、予防または治療する疾患、患者の年齢および体重等に依存して変化するであろうが、典型的には、毎日(1回または数回に分けて投与することができる)、数日から数ヶ月ごとに核酸を0.0001mg-100 mg、好ましくは0.001mg-10 mg投与する。
本発明はまた、前述のベクター自身を包含する。
The pharmaceutical composition containing the vector of the present invention may also include a conventional carrier, if desired.
A pharmaceutical composition comprising such a vector can be administered, for example, by intradermal administration, subcutaneous administration or intravenous injection. Preferably, such PEDF or variant thereof is administered directly to the site where the lesion is present. The amount of vector in such formulations will vary depending on the disease to be prevented or treated, the age and weight of the patient, etc., but is typically administered daily (in one or several divided doses). The nucleic acid is administered at 0.0001 mg-100 mg, preferably 0.001 mg-10 mg every few days to several months.
The present invention also encompasses the aforementioned vectors themselves.
(3) 結合タンパク質
本発明者らはさらに、HUVECがPEDFに対する結合親和性を有する膜タンパク質を有するかについて研究した。
前述のように、PEDFがTNF-α誘発性ROS生成を阻害することは、TNF-α暴露HUVECにおけるPEDFの抗酸化機能を示唆する。しかしながら、PEDFがTNF-αの受容体との相互作用を介してその効果を発揮していないかについて調べなければならない。本発明者らは培養HUVECの細胞膜にPEDF特異的結合タンパク質が存在することを初めて明らかにしたので(図6A)、その可能性はなさそうである。該結合データのスキャッチャード解析により、シングルクラスの高親和性受容体であることがわかった(図6B)。PEDFの受容体結合領域のペプチドに対する抗体(非特許文献15)は、PEDFの抗酸化特性を完全に中和した(図1B)。さらに、図6Cに示すように、PEDFはTNF-αとその受容体との結合を妨げなかった。これらを総合すると、本発明者らの結果は、HUVECにおいてTNF-α誘発性ROS生成の阻害に関与するPEDF特異的結合タンパク質が存在することを示唆する。なお、非特許文献30によると、網膜芽細胞腫上にKd 値 1.7-3.6 nM、80-85 kDaの異なるタイプのPEDF結合タンパク質が存在することを報告されていて、細胞タイプ特異的なPEDF受容体が存在している可能性があることを示唆している。
(3) Binding protein The inventors further studied whether HUVEC has a membrane protein with binding affinity for PEDF.
As mentioned above, inhibition of TNF-α-induced ROS generation by PEDF suggests an antioxidant function of PEDF in TNF-α-exposed HUVECs. However, it must be investigated whether PEDF exerts its effect through interaction with the receptor of TNF-α. Since the present inventors have revealed for the first time that PEDF-specific binding protein exists in the cell membrane of cultured HUVEC (FIG. 6A), the possibility is unlikely. Scatchard analysis of the binding data revealed a single class high affinity receptor (FIG. 6B). Antibodies against peptides in the receptor binding region of PEDF (Non-patent Document 15) completely neutralized the antioxidant properties of PEDF (FIG. 1B). Furthermore, as shown in FIG. 6C, PEDF did not interfere with the binding of TNF-α to its receptor. Taken together, our results suggest that there are PEDF-specific binding proteins involved in the inhibition of TNF-α-induced ROS production in HUVEC. According to
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、いかなる意味おいてもこれら実施例に限定されるものではない。全ての値を平均 ± SEMで示した。特に示さない限り、統計学的比較のため、one-way ANOVA に続いて Scheffe F testを行った。
本参考例および実施例において用いたTNF-α、DPI、ルシゲニン、NADH、NADPH、NACおよびピロリジンジチオカルバメート(PDTC)は、Sigma (St. Louis、MO)より購入した。CDP-Star 化学発光システムおよび125I-TNF-α は、Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, United Kingdom)より購入した。IL-6 ELISA システムは、Biosource (Camarillo, CA)より得た。
The invention is further illustrated by the following examples, which are not intended to limit the invention in any way. All values are shown as mean ± SEM. Unless otherwise indicated, one-way ANOVA was followed by Scheffe F test for statistical comparison.
TNF-α, DPI, lucigenin, NADH, NADPH, NAC and pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) used in this Reference Example and Examples were purchased from Sigma (St. Louis, MO). CDP-Star chemiluminescence system and 125 I-TNF-α were purchased from Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, United Kingdom). The IL-6 ELISA system was obtained from Biosource (Camarillo, CA).
以下の実施例において本発明者らは、TNF-αによって誘発されるROS(活性酸素種)産生について調べるためHUVECを使用した。TNF-αは、多くの細胞機能に対してROSの生成を介して多面的作用を発揮する(非特許文献8, 13, 14)。そこで本発明者らは初めにTNF-αを用いて、HUVECにおいてPEDFがTNF-α誘発細胞内ROS生成を阻害できるか、およびどのように阻害するかについて調べた。次に本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおけるNF-κB活性化およびそれに続くIL-6発現に対するPEDFの効果について検討した。
In the examples below, we used HUVEC to examine ROS (reactive oxygen species) production induced by TNF-α. TNF-α exerts pleiotropic effects on many cell functions through the generation of ROS (
参考例1 PEDFタンパク質の精製
PEDFタンパク質は既報のようにして精製した(非特許文献15)。精製PEDFタンパク質のSDS-PAGE解析により分子量約50kDaの一本のバンドが示され、それは抗ヒトPEDFモノクローナル抗体と陽性反応を示した(非特許文献15)。ヒトPEDFに対するポリクローナル抗体もまた、既報のように調製した(非特許文献15)。
Reference Example 1 Purification of PEDF protein
PEDF protein was purified as previously reported (Non-patent Document 15). SDS-PAGE analysis of the purified PEDF protein showed a single band with a molecular weight of about 50 kDa, which showed a positive reaction with the anti-human PEDF monoclonal antibody (Non-patent Document 15). A polyclonal antibody against human PEDF was also prepared as previously reported (Non-patent Document 15).
PEDF-発現ベクターおよびPEDF精製のための発現ベクターの調製について簡単に説明する。
PEDF cDNAは、初めにヒト胎盤cDNAライブラリー(Clontech, Palo Alto, CA)より単離し、既報のように哺乳類発現ベクターであるpBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA)に挿入した(非特許文献35)。
簡単に説明すると、該cDNAライブラリーからPEDFをコードする遺伝子を以下の条件のPCRにより単離した:
PCR プライマー
Fw : 5’-CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3’ (配列番号:3)
Rev : 5’-CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3’ (配列番号:4)
x 10 pfu バッファー 4 μl
dNTP (各2mM) 4 μl
プライマー (Fw) (10 μM) 4 μl
プライマー (Rev) (10 μM) 4 μl
鋳型 (200 mg)
pfuポリメラーゼ(STRATAGENE) 0.5 μl
蒸留水 /合計40 μl
PCR条件(Parkin Elmer 2400)
(ステップ 1 x 1)
95℃ 5min
(ステップ 2 x 30)
95℃ 0.5min
60℃ 0.5min
72℃ 1.5min
(ステップ 3 x 1)
72℃ 10min
4℃ ∞min
増幅確認後、PCR産物をpBluescript II KSのSma Iサイトにライゲートした。制限酵素消化およびシークエンスによって構造を確認し、また、5’側にXba Iサイトを含むことも確認した。
Xba IおよびHind III(ブラント)で切断したPEDF PCR産物を、pBK-CMV (STRATAGENE)のNhe I(ブラント)およびXba Iサイトの間に挿入し、PEDF-発現ベクターであるプラスミドpBK-CMV-PEDFを得た。
The preparation of PEDF-expression vector and expression vector for PEDF purification is briefly described.
PEDF cDNA was first isolated from a human placenta cDNA library (Clontech, Palo Alto, Calif.) And inserted into a mammalian expression vector pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, Calif.) As previously reported (non-patent literature). 35).
Briefly, a gene encoding PEDF was isolated from the cDNA library by PCR under the following conditions:
PCR primers
Fw: 5'-CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3 '(SEQ ID NO: 3)
Rev: 5'-CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3 '(SEQ ID NO: 4)
x 10 pfu buffer 4 μl
dNTP (2 mM each) 4 μl
Primer (Fw) (10 μM) 4 μl
Primer (Rev) (10 μM) 4 μl
Mold (200 mg)
pfu polymerase (STRATAGENE) 0.5 μl
Distilled water / 40 μl total
PCR conditions (Parkin Elmer 2400)
(Step 1 x 1)
95 ℃ 5min
(Step 2 x 30)
95 ° C 0.5 min
60 ℃ 0.5min
72 ℃ 1.5min
(Step 3 x 1)
72 ℃ 10min
4 ℃ ∞min
After confirming amplification, the PCR product was ligated to the Sma I site of pBluescript II KS. The structure was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing, and the Xba I site was also confirmed to be contained on the 5 ′ side.
The PEDF PCR product cleaved with Xba I and Hind III (Brant) is inserted between the Nhe I (Brant) and Xba I sites of pBK-CMV (STRATAGENE), and the plasmid pBK-CMV-PEDF is the PEDF-expression vector. Got.
次に、PEDF精製のための発現ベクターを以下の手順に従い構築した。
His-Tag用オリゴDNA、
5’-AATTCCATCATCATCATCATCATTAAT-3’ (配列番号:5)および
5’-CTAGATTAATGATGATGATGATGATGG -3’ (配列番号:6)を合成し、互いにアニールさせた。PEDFのストップコドンを取り除き3’末端にEco RI サイトを挿入するため、5’-CGGAATTCGGGGCCCCTGGGGTCC -3’ (配列番号:7)並びに前述のFw プライマー (配列番号:4)、および鋳型としてpBK-CMV-PEDFを用いてPCRによりオリゴDNAを合成した。増幅産物をBgl IIおよびEco RIで切断し、切断産物を前述のアニール済His Tag用オリゴDNAにライゲートした。ライゲート産物をBgl IIおよびXba Iで切断した精製pBK-CMV-PEDFに挿入した。構造を制限酵素消化およびシークエンスによって確認した
翻訳エンハンサーを挿入するため、pcDNA4-HisMax (Invitrogen)からSac IおよびXba Iを用いて単離したエンハンサー部分をpBluescript II KSの同じ制限酵素サイトにライゲートした。クローンの単離後、該ベクターをNco Iサイト (ブラント)およびBam HIサイトで切断し、ベクターバックボーンを得た。
Next, an expression vector for purifying PEDF was constructed according to the following procedure.
Oligo DNA for His-Tag,
5'-AATTCCATCATCATCATCATCATTAAT-3 '(SEQ ID NO: 5) and
5′-CTAGATTAATGATGATGATGATGATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6) was synthesized and annealed to each other. In order to remove the PEDF stop codon and insert an Eco RI site at the 3 ′ end, 5′-CGGAATTCGGGGCCCCTGGGGTCC-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and the aforementioned Fw primer (SEQ ID NO: 4), and pBK-CMV- as a template. Oligo DNA was synthesized by PCR using PEDF. The amplification product was cleaved with Bgl II and Eco RI, and the cleaved product was ligated to the aforementioned annealed His Tag oligo DNA. The ligated product was inserted into purified pBK-CMV-PEDF cut with Bgl II and Xba I. To insert a translation enhancer whose structure was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing, the enhancer portion isolated from pcDNA4-HisMax (Invitrogen) using Sac I and Xba I was ligated to the same restriction enzyme site of pBluescript II KS. After isolation of the clone, the vector was cleaved at the Nco I site (Brant) and Bam HI site to obtain a vector backbone.
PEDFの5’末端を修飾するため、5’-GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC -3’ (配列番号:8) (PEDF 5'末端にSph I サイトを挿入)並びに5’-TTAGGTACCATGGATGTCTGGGCT -3’ (配列番号:9)、および鋳型としてpBK-CMV-PEDFを用いてオリゴDNAを合成し、合成産物をpGEM-T easy (Promega)に挿入した。クローンを単離し、そしてSph Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断した。その結果生じた断片を前述のベクターバックボーンに挿入した。
得られたベクターをSac Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断して翻訳エンハンサー−PEDF5’部分を取り出した。翻訳エンハンサー−PEDF5’部分を含む断片を、Nhe Iサイト(ブラント)およびBam HIサイトで切断した3’His-Tag含有pBK-CMV-PEDFにライゲートし、PEDF精製のための発現ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素消化および配列決定によって確認した。
In order to modify the 5 ′ end of PEDF, 5′-GCATGCAGGCCCTGGTGCTACTCC -3 ′ (SEQ ID NO: 8) (Sph I site inserted into PEDF 5 ′ end) and 5′-TTAGGTACCATGGATGTCTGGGCT -3 ′ (SEQ ID NO: 9), And oligo DNA was synthesized using pBK-CMV-PEDF as a template, and the synthesized product was inserted into pGEM-T easy (Promega). Clones were isolated and cut at the Sph I site (Brant) and Bam HI site. The resulting fragment was inserted into the vector backbone described above.
The obtained vector was cleaved at the Sac I site (Brant) and the Bam HI site, and the translation enhancer-PEDF 5 ′ portion was taken out. The fragment containing the translation enhancer-PEDF 5 'part was ligated to 3'His-Tag-containing pBK-CMV-PEDF cleaved at the Nhe I site (Brant) and Bam HI site to obtain an expression vector for purification of PEDF. The resulting vector was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing.
参考例2 HUVECストックの調製
HUVEC(Clonetics, CC-2517)を、2 % ウシ胎児血清、0.4 % ウシ脳抽出物、10 ng/ml ヒト上皮細胞増殖因子および1 μg/ml ヒドロコルチゾンを添加したEBM培地中で培養した。実施例において、TNF-α処理は上皮細胞増殖因子およびヒドロコルチゾンを含まない培地中で行った。
Reference Example 2 Preparation of HUVEC stock
HUVEC (Clonetics, CC-2517) was cultured in EBM medium supplemented with 2% fetal bovine serum, 0.4% bovine brain extract, 10 ng / ml human epidermal growth factor and 1 μg / ml hydrocortisone. In the examples, TNF-α treatment was performed in a medium without epidermal growth factor and hydrocortisone.
実施例1 HUVECにおけるROS生成に対するPEDFの効果(1)
本発明者らは初めに、PEDFがTNF-αに暴露されたHUVECにおいてROS(活性酸素種)生成を阻害できるかについて検討した。
HUVECを10 ng/ml TNF-αで示した時間処理し、その後細胞内のROS生成を蛍光プローブ CM-H2DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) を用いて既報のようにして検出した(非特許文献18, 19)。図1Aに示すように、ROS生成は4時間で上昇し始め、24時間で最大に達した;10 ng/ml TNF-αで24時間インキュベートすると、細胞内ROS生成が約1.4倍増加した。10 ng/mlより高い濃度のTNF-αはHUVECに対して毒性を示す。
Example 1 Effect of PEDF on ROS generation in HUVEC (1)
The inventors first examined whether PEDF can inhibit ROS (reactive oxygen species) production in HUVEC exposed to TNF-α.
HUVECs were treated with 10 ng / ml TNF-α for the time indicated, and then intracellular ROS generation was detected using the fluorescent probe CM-H 2 DCFDA (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) as previously reported. (Non-patent documents 18, 19). As shown in FIG. 1A, ROS production began to rise at 4 hours and reached a maximum at 24 hours; incubation with 10 ng / ml TNF-α for 24 hours increased intracellular ROS production by approximately 1.4-fold. Concentrations of TNF-α higher than 10 ng / ml are toxic to HUVEC.
1 または 10 nMのPEDF、50 nM DPI、または5 μg/ml 抗PEDF抗体(Abs)の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間処理し、その後細胞内ROS生成を前述のように検出した。ROS生成の比率は無添加の対照の値に対するものであり、縦軸に示している。結果は図1Bに示す。PEDFまたはDPIは、TNF-αが誘発するROS生成の上昇を完全に阻害することがわかった。
PEDFに対するポリクローナル抗体をPEDFと組み合わせて添加すると、TNF-α暴露HUVECにおけるPEDFの抗酸化効果は完全に消失した。10 nM PEDFは、無細胞系におけるキサンチン/キサンチンオキシダーゼ反応によるスーパーオキサイド生成を阻害しない。これらの結果は、PEDF自身がフリーラジカル除去作用を有するのではないことを示唆する。
Treat HUVEC for 24 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 1 or 10 nM PEDF, 50 nM DPI, or 5 μg / ml anti-PEDF antibody (Abs) Intracellular ROS generation was detected as described above. The ratio of ROS generation is relative to the value of the control without addition, and is shown on the vertical axis. The results are shown in FIG. 1B. PEDF or DPI was found to completely inhibit the increase in ROS production induced by TNF-α.
When a polyclonal antibody against PEDF was added in combination with PEDF, the antioxidant effect of PEDF in TNF-α-exposed HUVEC was completely abolished. 10 nM PEDF does not inhibit superoxide production by the xanthine / xanthine oxidase reaction in a cell-free system. These results suggest that PEDF itself does not have a free radical scavenging action.
実施例2 HUVECにおけるROS生成に対するPEDFの効果(2)
実施例1において、PEDFはDPIと同様に、TNF-αが誘発するROS生成の上昇を完全に阻害することが示された。しかし、DPIのような薬理学的阻害物質はある標的細胞に対して完全に特異的ではないので、ここでは、PEDFのROS生成阻害の機序について調べた。本発明者らは、TNF-α暴露HUVECにおけるROS生成がNADPHオキシダーゼによるものであることをさらに検討するため、DN-RacT17N(ドミナント−ネガティブ・ヒトRac-1変異体)過剰発現技術を用いて実験を行った。DN-RacT17は、NADPHオキシダーゼに不可欠な構成要素であるGTPase Rac-1(非特許文献28)の作用が完全に遮断されている。
既報のように(非特許文献17)、DN-RacT17N 発現ベクター(堀口博士から供与)(非特許文献16) または空のベクターを、HUVECに一過性にトランスフェクトした。DN-RacT17N-トランスフェクトおよび模擬トランスフェクトHUVECを、10 ng/ml TNF-αで24時間処理し、ROSを定量的に解析した。ROS生成の比率は、TNF-αなしでの模擬トランスフェクト対照細胞の値に対するものである。図1Cに示すように、DN-RacT17Nの過剰発現により、TNF-α誘発性のROS生成上昇は完全に阻害された。
Example 2 Effect of PEDF on ROS generation in HUVEC (2)
In Example 1, PEDF was shown to completely inhibit TNF-α-induced increase in ROS production, similar to DPI. However, since pharmacological inhibitors such as DPI are not completely specific for certain target cells, here we investigated the mechanism of PEDF inhibition of ROS production. In order to further investigate that ROS generation in TNF-α-exposed HUVECs is due to NADPH oxidase, we conducted experiments using DN-RacT17N (dominant-negative human Rac-1 mutant) overexpression technology. Went. DN-RacT17 completely blocks the action of GTPase Rac-1 (Non-patent Document 28), which is an essential component of NADPH oxidase.
As previously reported (Non-patent document 17), DN-RacT17N expression vector (provided by Dr. Horiguchi) (Non-patent document 16) or an empty vector was transiently transfected into HUVEC. DN-RacT17N-transfected and mock-transfected HUVEC were treated with 10 ng / ml TNF-α for 24 hours, and ROS was quantitatively analyzed. The ratio of ROS production is relative to the value of mock transfected control cells without TNF-α. As shown in FIG. 1C, overexpression of DN-RacT17N completely inhibited TNF-α-induced increase in ROS production.
本発明者らは次に、TNF-αがHUVECにおいてRac-1発現および活性化を介してROS生成を誘導し得るかについて検討した。
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間で処理し、その後逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により解析した。下のパネルは、Rac-1 遺伝子誘導を定量的に表したものを示す。データはβ-アクチンmRNA由来シグナルの強度によってノーマライズし、対照と対比している。図1Dに示すように、TNF-αは、中程度に、しかし有意にRac-1 mRNAレベルを上昇させ、それは10 nM PEDFによって完全に抑制された。その後、Rac Activation Assay Kit (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)を用いてRac活性を測定した。10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理した。図1Eに示すように、Rac-GTP プルダウンアッセイにより、TNF-αは有意にRacを活性化し、それはまた、PEDF処理によって完全に阻害されることがわかった。
We next examined whether TNF-α could induce ROS production through Rac-1 expression and activation in HUVEC.
HUVECs were treated with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 10 nM PEDF for 4 hours and then analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The lower panel shows a quantitative representation of Rac-1 gene induction. Data are normalized by the intensity of the β-actin mRNA-derived signal and contrasted with the control. As shown in FIG. 1D, TNF-α moderately but significantly increased Rac-1 mRNA levels, which were completely suppressed by 10 nM PEDF. Then, Rac activity was measured using Rac Activation Assay Kit (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY). HUVECs were treated for 24 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 10 nM PEDF. As shown in FIG. 1E, the Rac-GTP pull-down assay showed that TNF-α significantly activated Rac, which was also completely inhibited by PEDF treatment.
これらの知見は、NADPHオキシダーゼの重要な構成要素の1つであるRac-1がTNF-α誘発性ROS生成に直接関与し、またPEDFの分子標的であることを示唆する。一方、一酸化窒素合成酵素阻害物質である N-ω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル、キサンチンオキシダーゼ阻害物質であるオキシプリノール、またはミトコンドリアNADPHデヒドロゲナーゼ阻害物質であるロテノンは、HUVECにおけるTNF-α誘発性ROS生成に影響しない。本発明者らはまた、PEDFはTNF-α暴露HUVECにおけるアポトーシス性細胞死を増加させないことを見出している。これらの結果は、TNF-α暴露HUVECに対するPEDFの抗酸化効果が、単純にそのアポトーシス促進性に起因するものではないことを示唆している。 These findings suggest that one of the key components of NADPH oxidase, Rac-1, is directly involved in TNF-α-induced ROS generation and is a molecular target for PEDF. On the other hand, N-ω-nitro-L-arginine methyl ester, a nitric oxide synthase inhibitor, oxypurinol, a xanthine oxidase inhibitor, or rotenone, a mitochondrial NADPH dehydrogenase inhibitor, induced TNF-α in HUVEC Does not affect sex ROS generation. We have also found that PEDF does not increase apoptotic cell death in TNF-α-exposed HUVECs. These results suggest that the antioxidant effect of PEDF on TNF-α-exposed HUVECs is not simply due to its pro-apoptotic properties.
実施例3 HUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果
本発明者らは次に、PEDFが実際にNADPHオキシダーゼ活性を抑制できるかについて検討した。
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理し、その後、1 mM EGTA、150 mM スクロース、電子受容体として5 μM ルシゲニン、および基質として100 μM NADPHを含有するリン酸緩衝液(50 mM, pH 7.0)における発光アッセイにより、NADPHオキシダーゼ活性を測定した (非特許文献20)。図2Aに示すように、TNF-αはNADPHオキシダーゼ活性を有意に上昇させ、それは10 nM PEDFによって完全に抑制された。TNF-αによって誘発されるNADPHオキシダーゼ活性の上昇度は、ROS生成の上昇度と近似していた。TNF-αはNADPHオキシダーゼ活性を約1.3倍に上昇させた。PEDF単独ではHUVECにおけるNADPHオキシダーゼ活性には影響しない。
Example 3 Effect of PEDF on NADPH oxidase activity in HUVEC Next, the inventors examined whether PEDF can actually suppress NADPH oxidase activity.
Treatment of HUVEC with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 10 nM PEDF for 24 hours, followed by 1 mM EGTA, 150 mM sucrose, 5 μM lucigenin as an electron acceptor, and NADPH oxidase activity was measured by a luminescence assay in a phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) containing 100 μM NADPH as a substrate (Non-patent Document 20). As shown in FIG. 2A, TNF-α significantly increased NADPH oxidase activity, which was completely suppressed by 10 nM PEDF. The increase in NADPH oxidase activity induced by TNF-α approximated the increase in ROS production. TNF-α increased NADPH oxidase activity by about 1.3 times. PEDF alone does not affect NADPH oxidase activity in HUVEC.
10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間で処理した。その後、2 μM ジヒドロエチジウムを含有するフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地で細胞をインキュベートした。30分後、共焦点レーザー顕微鏡によって細胞を画像化した。図2Bに示すように、ジヒドロエチジウムによる細胞染色によっても、PEDFがHUVECにおいてTNF-α誘発NADPHオキシダーゼ活性を阻害することが明らかとなった。TNF-αは、HUVECにおけるNADPHオキシダーゼの重要な構成要素の1つであるp22phoxまたはgp91phoxのmRNAレベルを上昇させなかった。 HUVECs were treated for 24 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 10 nM PEDF. The cells were then incubated in phenol red-free Dulbecco's modified Eagle's medium containing 2 μM dihydroethidium. After 30 minutes, the cells were imaged with a confocal laser microscope. As shown in FIG. 2B, cell staining with dihydroethidium also revealed that PEDF inhibited TNF-α-induced NADPH oxidase activity in HUVEC. TNF-α did not increase mRNA levels of p22phox or gp91phox, one of the key components of NADPH oxidase in HUVEC.
実施例4 HUVECにおけるNF-κBプロモーター活性に対するPEDFの効果
ROS (活性酸素種)は、転写因子NF-κBの活性化を介して数多くの遺伝子発現を調節する(非特許文献29)。それ故本発明者らは、PEDFがHUVECにおいてTNF-αが誘発するNF-κB転写活性を減弱することができるかについて調べた。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に連結されたNF-κBプロモーターを含むプラスミドは、Dr. Fujita T(Department of Tumor Cell Biology, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science)より提供していただいた(非特許文献21)。1 または 10 nMのPEDFまたは抗酸化物質である1 mM NAC の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間処理し、その後既報のようにNF-κBルシフェラーゼ活性を測定した(非特許文献17)。ルシフェラーゼ活性の比率は対照の値に対するものである。図3Aに示すように、TNF-αはNF-κBプロモーター活性を有意に上昇させた。PEDFおよび抗酸化物質NACは、部分的ではあるものの有意にTNF-α誘発性のNF-κBプロモーター活性上昇を抑制することがわかった。
Example 4 Effect of PEDF on NF-κB promoter activity in HUVEC
ROS (reactive oxygen species) regulates the expression of numerous genes through the activation of the transcription factor NF-κB (Non-patent Document 29). We therefore investigated whether PEDF can attenuate NF-κB transcriptional activity induced by TNF-α in HUVEC.
A plasmid containing the NF-κB promoter linked upstream of the luciferase reporter gene was provided by Dr. Fujita T (Department of Tumor Cell Biology, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science) (Non-patent Document 21). Treat HUVEC for 4 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 1 or 10 nM PEDF or the
NF-κB p65活性を測定するために、核タンパク質を抽出し、それらのNF-κB p65コンセンサス配列に対する結合活性をTansFactorキットを用いて測定した。10 nM PEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを4時間処理した。TransFactor 抽出キット(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を用いて細胞から核タンパク質を抽出し、TransFactor NF-κB p65 キット(BD Biosciences Clontech)を用いてNF-κB p65コンセンサス配列に対するそれらの結合活性を測定した。図3Bに示すように、TNF-αはNF-κB p65活性を上昇させ、それはPEDFによって有意に阻害された。 In order to measure NF-κB p65 activity, nucleoproteins were extracted and their binding activity to the NF-κB p65 consensus sequence was measured using the TansFactor kit. HUVECs were treated for 4 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 10 nM PEDF. Nucleoproteins are extracted from cells using the TransFactor extraction kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Calif.), And their binding activity to the NF-κB p65 consensus sequence using the TransFactor NF-κB p65 kit (BD Biosciences Clontech). It was measured. As shown in FIG. 3B, TNF-α increased NF-κB p65 activity, which was significantly inhibited by PEDF.
実施例5 HUVECにおけるIL-6 mRNAおよびタンパク質レベルに対するPEDFの効果
本発明者らは次にPEDFがHUVECにおいてIL-6の発現に影響し得るかについて検討した。
10 nM PEDF、1 mM NAC 、またはNF-κB の阻害物質である10 μM PDTC (ピロリジンジチオカルバメート)の存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きで4時間処理したHUVECよりポリ(A)+RNAを単離し、既報のようにして半定量的RT-PCRによって解析した(非特許文献26)。増幅のためのポリ(A)+RNA鋳型量(30 ng)およびサイクル数(Rac-1遺伝子につき28サイクル;IL-6およびPEDF遺伝子につき35サイクル;β-アクチン遺伝子につき22サイクル)は、反応が直線的に進行する定量的範囲(シグナル強度を鋳型量およびサイクル数の関数としてプロットすることによって決定)において選択した(非特許文献27)。半定量的RT-PCRにおいて用いたプライマー 配列は、ヒトRac-1につき5’-ACCCCTTCTGACTGAGCAATATGCC-3’(配列番号:10)および5’-CAATAGGCAAAGCGACTACAGGAGG-3’(配列番号:11)(非特許文献22)、ヒトIL-6 mRNAにつき5’-CCTTCTCCACAAGCGCCTTC-3’(配列番号:12)および5’-GGCAAGTCTCCTCATTGAATC-3’(配列番号:13)(非特許文献23)およびヒトPEDF mRNAにつき5’-TCACAGGCAAACCCATCAAGCTGAC-3’(配列番号:14)および5’-GCCTTCGTGTCCTGTGGAATCTGCT-3’(配列番号:15)(非特許文献24)であった。ヒトIL-6およびPEDF cDNAを検出するための内部オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブは、それぞれ5’-TCAATTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGT-3’(配列番号:16)および5’-CGCCCCATCCTCGTTCCACTCAAAGCC-3’(配列番号:17)であった。ヒトβ-actin mRNAを検出するために半定量的RT-PCRで使用した上流および下流プライマーの配列は、既報のものを同じである(非特許文献25)。
Example 5 Effect of PEDF on IL-6 mRNA and protein levels in HUVEC We next examined whether PEDF could affect IL-6 expression in HUVEC.
HUVEC treated with or without 10 nM PEDF, 1 mM NAC, or 10 μM PDTC (pyrrolidine dithiocarbamate), an inhibitor of NF-κB, with or without 10 ng / ml TNF-α Poly (A) + RNA was further isolated and analyzed by semi-quantitative RT-PCR as described previously (Non-patent Document 26). The amount of poly (A) + RNA template for amplification (30 ng) and number of cycles (28 cycles for Rac-1 gene; 35 cycles for IL-6 and PEDF genes; 22 cycles for β-actin gene) Selected in a linearly proceeding quantitative range (determined by plotting signal intensity as a function of template amount and number of cycles) (27). The primer sequences used in semi-quantitative RT-PCR were 5′-ACCCCTTCTGACTGAGCAATATGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 10) and 5′-CAATAGGCAAAGCGACTACAGGAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 11) per human Rac-1. ), 5′-CCTTCTCCACAAGCGCCTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 12) and 5′-GGCAAGTCTCCTCATTGAATC-3 ′ (SEQ ID NO: 13) (Non-Patent Document 23) per human IL-6 mRNA and 5′-TCACAGGCAAACCCATCAAGCTGAC per human PEDF mRNA -3 ′ (SEQ ID NO: 14) and 5′-GCCTTCGTGTCCTGTGGAATCTGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 15) (Non-patent Document 24). The internal oligodeoxyribonucleotide probes for detecting human IL-6 and PEDF cDNA were 5'-TCAATTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 16) and 5'-CGCCCCATCCTCGTTCCACTCAAAGCC-3' (SEQ ID NO: 17), respectively. . The upstream and downstream primer sequences used in semi-quantitative RT-PCR to detect human β-actin mRNA are the same as previously reported (Non-patent Document 25).
図4Aに示すように、TNF-αはIL-6 mRNAレベルを有意に上昇させ、それは、PEDF、NAC、またはNF-κBの阻害物質であるPDTC(ピロリジンジチオカルバメート)によって、部分的ではあるものの有意に阻害された。PEDF、NACまたはPDTC(ピロリジンジチオカルバメート)単独ではIL-6 mRNAレベルには影響しなかった。 As shown in FIG. 4A, TNF-α significantly increased IL-6 mRNA levels, although partially due to PDTC (pyrrolidine dithiocarbamate), an inhibitor of PEDF, NAC, or NF-κB. Significantly inhibited. PEDF, NAC or PDTC (pyrrolidine dithiocarbamate) alone did not affect IL-6 mRNA levels.
その後、1または10 nMのPEDFの存在または非存在下、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きでHUVECを24時間処理した。培地中に放出されたIL-6タンパク質は、ELISAキットを用いて製造元の説明に従い測定した。PEDFは、TNF-α暴露HUVECからのIL-6タンパク質の分泌を有意に阻害することも明らかとなった(図4B)。 Thereafter, HUVECs were treated for 24 hours with or without 10 ng / ml TNF-α in the presence or absence of 1 or 10 nM PEDF. IL-6 protein released into the medium was measured using an ELISA kit according to the manufacturer's instructions. PEDF was also found to significantly inhibit IL-6 protein secretion from TNF-α-exposed HUVECs (FIG. 4B).
実施例6 HUVECにおけるPEDF結合タンパク質
本発明者らは次に、HUVECがPEDFに対して結合親和性を示す細胞表面タンパク質を有するかについて検討した。
HUVEC由来の界面活性剤溶解性細胞膜タンパク質を15 %ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリデンジフルオライドメンブランに転写した。既報のように(非特許文献15)、メンブランと30 nM フルオレセン標識PEDFを、分子20倍過剰量の非標識PEDFタンパク質の非存在(レーン 1)または存在(レーン 2)下インキュベートした。その結果生じた免疫複合体をCDP-Star 化学発光システムにより視覚化した。図6Aに示すように、分子量約60 kDaのHUVEC膜タンパク質が、フルオレセン標識PEDFタンパク質と結合した。結合シグナルは、分子20倍過剰量の非標識PEDFタンパク質の存在下ではほとんど検出できず、これにより培養HUVECの膜抽出物に対するフルオレセン標識PEDFの結合の特異性が確認された。さらに、10 ng/ml TNF-αを処理すると、HUVECにおける膜に対するPEDF結合が約1.3倍上昇する。
Example 6 PEDF binding protein in HUVEC We next examined whether HUVEC has a cell surface protein that exhibits binding affinity for PEDF.
Surfactant-soluble cell membrane proteins derived from HUVEC were separated on a 15% polyacrylamide gel and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane. As previously reported (Non-Patent Document 15), membranes and 30 nM fluorescein-labeled PEDF were incubated in the absence (lane 1) or presence (lane 2) of a 20-fold excess of unlabeled PEDF protein. The resulting immune complex was visualized by CDP-Star chemiluminescence system. As shown in FIG. 6A, a HUVEC membrane protein having a molecular weight of about 60 kDa bound to a fluorescein-labeled PEDF protein. The binding signal was hardly detectable in the presence of a 20-fold excess of unlabeled PEDF protein, confirming the specificity of the binding of fluorescein-labeled PEDF to cultured HUVEC membrane extracts. Furthermore, treatment with 10 ng / ml TNF-α increases PEDF binding to the membrane in HUVEC by about 1.3 fold.
本発明者らは次に、PEDF結合プロファイルを解析し、その物理化学的パラメーターを測定した。放射性標識PEDFは、既報のようにして(非特許文献15)精製PEDFタンパク質と125Iから調製した。HUVECを示した濃度の125I-PEDFタンパク質と、分子20倍過剰量の分子非標識PEDFタンパク質の非存在(黒丸)または存在(非特異的結合、白丸)下インキュベートした。特異的PEDF結合は既報のように測定した(非特許文献15)。全結合から非特異的結合を差し引くことにより特異的結合(黒四角)を計算した。全ての実験ポイントを4例の平均で示した。図6Bに示すように、結合データのスキャッチャード解析により、解離定数(Kd) 84.7 nMのシングルクラス結合部位 (HUVEC 1 細胞につきBmax = 51,000 部位)であることがわかった。
We next analyzed the PEDF binding profile and measured its physicochemical parameters. Radiolabeled PEDF was prepared from purified PEDF protein and 125 I as previously reported (Non-patent Document 15). Incubation was carried out with 125 I-PEDF protein at a concentration indicating HUVEC in the absence (black circle) or presence (non-specific binding, white circle) of a 20-fold excess of molecular unlabeled PEDF protein. Specific PEDF binding was measured as previously reported (Non-patent Document 15). Specific binding (black squares) was calculated by subtracting nonspecific binding from total binding. All experimental points were shown as an average of 4 cases. As shown in FIG. 6B, Scatchard analysis of the binding data revealed a single class binding site (B max = 51,000 sites per
本発明者らは次に、PEDFがHUVECにおいてTNF-αの受容体結合を阻害するかについて検討した (125I-TNF-α結合アッセイ)。10 nM PEDFの存在または非存在下、HUVECを10 ng/ml 125I-TNF-αと4 ℃で90分間インキュベートし、その後細胞を1 M NaOHで溶解し、細胞溶解物の放射活性を既報のように測定した(非特許文献15)。Unpaired t test を行った; p<0.05 を有意と判断した。図6Cに示すように、PEDFはTNF-αの受容体に対する結合に影響しなかった。 We next examined whether PEDF inhibits TNF-α receptor binding in HUVEC ( 125 I-TNF-α binding assay). Incubate HUVEC with 10 ng / ml 125 I-TNF-α for 90 min at 4 ° C in the presence or absence of 10 nM PEDF, then lyse the cells with 1 M NaOH and report the radioactivity of the cell lysate as previously reported. (Non-patent document 15). An unpaired t test was performed; p <0.05 was considered significant. As shown in FIG. 6C, PEDF did not affect the binding of TNF-α to the receptor.
実施例7 PEDFの抗動脈硬化症作用
(1)HUVECにおけるAngII誘発性NF-κBプロモーター活性に対するPEDFの効果
HUVECを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのアンジオテンシンII(AngII)にて4時間処理し、NF-κBルシフェラーゼ活性を測定した。AngII未処理も試験した。
すなわち、HUVECを、2%牛胎児血清(FBS)、0.4%牛脳抽出物、10ng/mLヒト上皮成長因子および1μg/mLヒドロコルチゾンを追加したEBM培地にて培養した。AngII処理は、前記培地から上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除いた培地で行った。また、ルシフェラーゼアッセイの測定は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にNF-κBプロモーターを接続させたプラスミドを用いて、Yamagishi SらによるJ. Cardiovasc. Pharmacol. 2004; 43: 724-730に記載の方法によった。
結果を図7に示す。図7から明らかなように、AngIIはNF-κBプロモーター活性を顕著に増加させるが、PEDFはその作用を完全に抑制した。
Example 7 Anti-atherosclerotic action of PEDF (1) Effect of PEDF on AngII-induced NF-κB promoter activity in HUVEC
HUVEC were treated with 100 nM angiotensin II (AngII) in the presence or absence of 10 nM PEDF for 4 hours, and NF-κB luciferase activity was measured. AngII untreated was also tested.
That is, HUVEC were cultured in EBM medium supplemented with 2% fetal bovine serum (FBS), 0.4% bovine brain extract, 10 ng / mL human epidermal growth factor and 1 μg / mL hydrocortisone. AngII treatment was performed in a medium in which epidermal growth factor and hydrocortisone were removed from the medium. The luciferase assay was measured by the method described in Yamagata S et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 2004; 43: 724-730, using a plasmid in which the NF-κB promoter was connected upstream of the luciferase reporter gene. It was.
The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 7, AngII significantly increased NF-κB promoter activity, while PEDF completely suppressed the action.
(2)HUVECにおけるAngII誘発性MCP-1 mRNAおよびタンパク質レベル上昇に対するPEDFの効果
MCP-1はNF-κB標的遺伝子の一つであり、in vitroおよびin vivoにて単球に対する走化性を誘発する。そこで、PEDFが、HUVECにてMCP-1の発現にどのような影響を与えるか実験した。MCP-1 mRNAに対する効果の試験は、HUVECから単離されたPoly(A)+RNAを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのAngIIにて4時間処理し、RT-PCRにて測定した。AngII未処理も試験した。RT-PCR法は、Yamagishi SらによるDiabetologia.1998; 41: 1435-1441に記載された方法にて行った。MCP-1タンパク質に対する効果の試験は、HUVECを10 nMのPEDFの存在下または非存在下に、100 nMのAngIIにて24時間処理し、培地中に生じたMCP-1タンパク質をELIZA法にて測定した。AngII未処理も試験した。
結果を図8に示す。図8AおよびBに示すように、AngIIはmRNAおよびタンパク質レベルにてMCP-1の発現を顕著に増加させたが、これはPEDFによって完全に阻害された。
(2) Effect of PEDF on AngII-induced MCP-1 mRNA and protein level increase in HUVEC
MCP-1 is one of the NF-κB target genes and induces chemotaxis to monocytes in vitro and in vivo. Therefore, we examined how PEDF affects the expression of MCP-1 in HUVEC. To test the effect on MCP-1 mRNA, Poly (A) + RNA isolated from HUVEC was treated with 100 nM AngII for 4 hours in the presence or absence of 10 nM PEDF, RT-PCR Measured at AngII untreated was also tested. The RT-PCR method was performed by the method described in Yamabeishi S et al. Diabetologia. 1998; 41: 1435-1441. To test the effect on MCP-1 protein, HUVEC was treated with 100 nM AngII in the presence or absence of 10 nM PEDF for 24 hours, and MCP-1 protein produced in the medium was analyzed by ELIZA method. It was measured. AngII untreated was also tested.
The results are shown in FIG. As shown in FIGS. 8A and B, AngII significantly increased MCP-1 expression at the mRNA and protein levels, which was completely inhibited by PEDF.
(3)HUVECにおけるAngII誘発性分子内ROS発生に対するPEDFの効果
ROSはNF-κBの転写活性化を通して動脈硬化を誘発する遺伝子の発現を調整することが知られている(たとえば、Griendling KKらによるCir. Res. 1994; 74: 1141-1148参照)。一方、抗酸化剤であるNACがAngIIに暴露されたHUVECでのNF-κBの活性化およびMCP-1発現に作用することを見出している。これらから、AngIIにより発生するROSがPEDFの分子標的となる可能性がある。そこで、HUVECにおける分子内ROS発生に対するPEDFの効果を調べた。まず、AngIIのROS発生への効果を調べた。実験は、HUVECを図9Aに示された時間をかけて100 nMのAngIIで処理し、生成したROSを蛍光プローブであるCM-H2DCFDA(米国Molecular Probe Inc.)を用いて定量分析した(検出手法は、たとえば、Yamagishi S.らによるJ. Biol. Chem. 2001; 276: 25096-25100等に記載されている)。図9Aに示すように、ROSはAngIIにより4時間後から発生し始め、24時間で最大となる。100 nMのAngIIでの24時間培養では、1.4倍のROS発生が観測された。そこで、そのROS発生に対するPEDFの効果を調べた。HUVECを1 nMまたは10 nMのPEDF、10 nMのPEDFに50μg/mLの抗PEDF抗体を共存させたもの、および50 nMのDPIの存在下または非存在下に100 nMのAngIIにて24時間処理し、上記と同様にROSを定量した。その結果、図9Bに示したように、PEDFは濃度依存的にAngIIにより誘発されたROSの増加を抑制し、10 nMのPEDFにて完全に抑制された。これに抗PEDF抗体(たとえば、Yamagishi S.らによるJ. Mol. Cell. Cardiol. 2004; 37: 497-506参照)を共存させた系では、抑制作用が中和されたことから、HUVECに対し、PEDFが特異的に作用することが分かる。また、NADPHオキシダーゼ阻害剤として知られているDPIが、ROS発生を抑制したことから、PEDFの分子作用機序はNADPHオキシダーゼの抑制であると考えられる。
(3) Effect of PEDF on AngII-induced intramolecular ROS generation in HUVEC
ROS is known to modulate the expression of genes that induce arteriosclerosis through transcriptional activation of NF-κB (see, eg, Cir. Res. 1994; 74: 1141-1148 by Griendling KK et al.). On the other hand, it has been found that NAC, an antioxidant, acts on NF-κB activation and MCP-1 expression in HUVEC exposed to AngII. From these, ROS generated by AngII may be a molecular target of PEDF. Therefore, the effect of PEDF on intramolecular ROS generation in HUVEC was investigated. First, the effect of AngII on ROS generation was examined. In the experiment, HUVEC was treated with 100 nM AngII for the time shown in FIG. 9A, and the produced ROS was quantitatively analyzed using a fluorescent probe CM-H 2 DCFDA (Molecular Probe Inc., USA) ( The detection method is described in, for example, Yamazaki S. et al., J. Biol. Chem. 2001; 276: 25096-25100). As shown in FIG. 9A, ROS begins to occur after 4 hours with Ang II and is maximal at 24 hours. In 24-hour culture with 100 nM AngII, 1.4-fold ROS generation was observed. Therefore, the effect of PEDF on the occurrence of ROS was investigated. HUVEC treated with 1 nM or 10 nM PEDF, 10 nM PEDF with 50 μg / mL anti-PEDF antibody, and 100 nM AngII in the presence or absence of 50 nM DPI for 24 hours ROS was quantified in the same manner as described above. As a result, as shown in FIG. 9B, PEDF suppressed the increase of ROS induced by AngII in a concentration-dependent manner, and was completely suppressed by 10 nM PEDF. In the system where anti-PEDF antibody (for example, J. Mol. Cell. Cardiol. 2004; 37: 497-506 by Yamagishi S. et al.) Coexisted, the inhibitory action was neutralized. It can be seen that PEDF acts specifically. Moreover, since DPI known as a NADPH oxidase inhibitor suppressed ROS generation, the molecular action mechanism of PEDF is considered to be suppression of NADPH oxidase.
(4)HUVECにおけるAngII誘発性NADPHオキシダーゼ活性に対するPEDFの効果
上記実施例等により、PEDFがNADPHオキシダーゼ活性を阻害して、AngIIに作用していることが示唆されたが、それを本実験により確認した。
HUVECを1 nMまたは10 nMのPEDF、10 nMのPEDFと5μg/mLの抗PEDF抗体との共存系の存在下または非存在下に100 nMのAngIIにて24時間処理し、細胞を均質液調製用緩衝液(20 mMのHepes、pH7.0、100 mMの塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する1 mMのEDTA)に懸濁し、基質としてのNADPH(100μM)を含有する50 mMのリン酸緩衝液(pH7.0、さらに1 mMのEDTA、150 nMのショ糖および電子受容体としての5μMのルシゲニンを含有する)中にてリン光分析にてNADPHを測定した(たとえば、Griendling KKによるCir. Res. 1994; 74: 1141-1148参照)。
結果を図10に示す。図10から明らかなように、PEDFは濃度依存的にAngIIにより誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を抑制し、一方、抗PEDF抗体を共存させると、その抑制効果が中和されることが示された。
(4) Effect of PEDF on AngII-induced NADPH oxidase activity in HUVEC The above examples suggested that PEDF inhibited NADPH oxidase activity and acted on AngII. This was confirmed by this experiment. did.
HUVECs were treated with 100 nM Ang II in the presence or absence of 1 nM or 10 nM PEDF, 10 nM PEDF and 5 μg / mL anti-PEDF antibody for 24 hours to prepare cells in a
The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 10, PEDF suppressed the concentration of the NADPH oxidase activity induced by AngII in a concentration-dependent manner. On the other hand, when the anti-PEDF antibody was coexisted, the inhibitory effect was neutralized.
実施例8 NADPHオキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖化産物(AGE)生成に伴う糖尿病性血管合併症への適用
(1) 微小血管内皮細胞での細胞内活性酸素種の生成およびNADPHオキシダーゼ活性に対する作用
(a) ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞(以下、血管内皮細胞という)を、1Mまたは10MのPEDF、50MのDPIまたは終末糖化産物(AGE)の受容体(RAGE)mRNAに対するアンチセンスDNA(10μM)の存在下または非存在下に所定濃度のAGE処理牛血清アルブミン(AGE-BSA)または非糖化牛血清アルブミンにて24時間処理し、その後、活性酸素種(ROS)を定量的に解析した。ここで、AGE-BSAは非特許文献15に記載された方法により調製した。すなわち、牛血清アルブミン(50mg/ml)を0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中にて0.1MD-グリセルアルデヒドとともに無菌下に7日間培養することにより調製した。未反応還元糖は、リン酸緩衝化生理食塩水で透析することにより除去した。対照となる非糖化牛血清アルブミンは還元糖を存在させないことを除いて同一の条件にてインキュベーションし作製した。得られた調製物にエンドトキシンが含まれていないことを確認した(使用機器:Endospecy ES-20S, 生化学工業(株))。RAGE mRNAに対するアンチセンスDNAは、Yamagishi, S.らによるFEBS Lett. 1996, 384:103-106に記載された方法に準拠して調製した。活性酸素種の細胞内生成は、Yamagishi, S.らによるKidney Int., 2003, 63:464-473に記載された方法に準拠して蛍光プローブ(CM-H2DCFDA, Molecular Probes Inc.)を用いて測定した。その結果を図11(a)に示す。図中、*は100μg/mlのAGE-BSAにて処理した値に対してP<0.01にて有意であることを示す。BSAは非糖化牛血清アルブミンによる処理の結果を、AGEsはAGE処理牛血清アルブミンによる処理の結果を示す。本図から明らかなように、PEDFはAGEにより修飾された血清アルブミンからのROS生成に対し、DPIよりも優れた抑制作用を示した。
Example 8 Application to diabetic vascular complications associated with the production of advanced glycation end products (AGE) by inhibiting NADPH oxidase activity
(1) Production of intracellular reactive oxygen species in microvascular endothelial cells and effects on NADPH oxidase activity
(a) Antisense DNA (10 μM) for human adult skin microvascular endothelial cells (hereinafter referred to as vascular endothelial cells) to 1M or 10M PEDF, 50M DPI or advanced glycation end product (AGE) receptor (RAGE) mRNA Was treated with AGE-treated bovine serum albumin (AGE-BSA) or non-glycated bovine serum albumin at a predetermined concentration in the presence or absence of sucrose for 24 hours, and then reactive oxygen species (ROS) were quantitatively analyzed. Here, AGE-BSA was prepared by the method described in Non-Patent Document 15. Specifically, bovine serum albumin (50 mg / ml) was prepared by culturing under aseptic conditions with 0.1 MD-glyceraldehyde in 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.4) for 7 days. Unreacted reducing sugar was removed by dialysis against phosphate buffered saline. Non-glycated bovine serum albumin as a control was prepared by incubation under the same conditions except that no reducing sugar was present. It was confirmed that the obtained preparation did not contain endotoxin (equipment used: Endospecy ES-20S, Seikagaku Corporation). Antisense DNA against RAGE mRNA was prepared according to the method described in FEBS Lett. 1996, 384: 103-106 by Yamagishi, S. et al. Intracellular generation of reactive oxygen species is performed using a fluorescent probe (CM-H2DCFDA, Molecular Probes Inc.) according to the method described in Kidney Int., 2003, 63: 464-473 by Yamagishi, S. et al. It was measured. The result is shown in FIG. 11 (a). In the figure, * indicates that the value treated with 100 μg / ml of AGE-BSA is significant at P <0.01. BSA indicates the result of treatment with non-glycated bovine serum albumin, and AGEs indicates the result of treatment with AGE-treated bovine serum albumin. As is clear from this figure, PEDF showed an inhibitory action superior to DPI on ROS production from serum albumin modified with AGE.
(b) 血管内皮細胞を10nMのPEDFの存在下または非存在下に100μg/ml のAGE-BSAまたは非糖化牛血清アルブミンにて24時間処理し、NADPHオキシダーゼ活性をルミネッセンス法により測定した。すなわち、細胞を緩衝液(20mM Hepes、pH7.0、100mM塩化カリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する1mM EDTA)に懸濁し、細胞ホモジネートを非特許文献20に記載した方法により、1mMEDTA、150mMショ糖、電子アクセプターとして5μMルシジェニンおよび基質として100μM NADPHを含有する50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中にてルミネッセンス法により測定した。結果を図11(b)に示す。本図から明らかなように、PEDFはAGEにより修飾された血清アルブミン処理細胞において、優れたNADPHオキシダーゼ抑制作用を示した。
本実験(a),(b)に用いた血管内皮細胞であるヒト成人皮膚微小血管内皮細胞(Clonetics Corp.)は、5%牛胎児血清、0.4%牛脳抽出物、10ng/mlヒト上皮成長因子および1μg/mlヒドロコルチゾンを追加したエオシン・メチレン・ブルー培地にて培養した。AGE処理は、ヒト上皮成長因子およびヒドロコルチゾンを除いた培地中にて行った。
(b) Vascular endothelial cells were treated with 100 μg / ml AGE-BSA or non-glycated bovine serum albumin in the presence or absence of 10 nM PEDF for 24 hours, and NADPH oxidase activity was measured by the luminescence method. That is, the cells were suspended in a buffer solution (20 mM Hepes, pH 7.0, 100 mM potassium chloride, 1 mM EDTA containing a protease inhibitor cocktail), and the cell homogenate was prepared according to the method described in
Human adult skin microvascular endothelial cells (Clonetics Corp.), the vascular endothelial cells used in this experiment (a) and (b), are 5% fetal bovine serum, 0.4% bovine brain extract, 10 ng / ml human epithelial growth. The cells were cultured in eosin methylene blue medium supplemented with factors and 1 μg / ml hydrocortisone. AGE treatment was performed in a medium excluding human epidermal growth factor and hydrocortisone.
(2) 微小血管内皮細胞における血清AGE分画に対する効果
インフォームドコンセントを得た血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清または健康人(Normal)血清から常法によりAGE分画を得、その分画を用いて微小血管内皮細胞を10nMPEDFの存在下または非存在下に24時間処理した。活性酸素種であるスーパーオキサイドの産生を定量的に分析した結果を図12に示す。ここで、スーパーオキサイド生成は、上記のように処理して得た細胞を3μMジヒドロエチジウムを含むフェノールレッドフリーのダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)にて培養し、30分後に蛍光強度を測定し、細胞をレーザースキャニング共焦点顕微鏡にて画像化し、定量化した。本図から明らかなように、PEDFは血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞からの活性酸素種産生を有意に抑制した。
(2) Effect on serum AGE fractionation in microvascular endothelial cells AGE fraction was obtained from hemodialysis diabetic (DM-HD) serum or healthy human (Normal) serum with informed consent by a conventional method, and the fractionation Were used to treat microvascular endothelial cells in the presence or absence of 10 nMPEDF for 24 hours. The results of quantitative analysis of the production of superoxide, which is a reactive oxygen species, are shown in FIG. Here, superoxide generation is performed by culturing the cells obtained by the above treatment in phenol red-free Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 3 μM dihydroethidium, and measuring the fluorescence intensity after 30 minutes. Were imaged and quantified with a laser scanning confocal microscope. As is clear from this figure, PEDF significantly suppressed the production of reactive oxygen species from cells treated with the AGE fraction from hemodialysis diabetic patient (DM-HD) serum.
(3) AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対する静脈投与での効果
Adamis, A.P.らの方法(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000, 44: 2155-2162)に準じて血液網膜関門(Blood retinal barrier, 以下、BRBという)損傷に対するPEDFの効果を実験した。すなわち、SD系ラットを麻酔処置後、FITC抱合デキストラン(4.4kDa, Sigma社)を静脈注射した。10〜15分後、血液サンプルをとり、各ラットをリン酸緩衝化生理食塩水にて灌流した。灌流後、網膜を採取し、重量を測定し、均質化してFITC抱合デキストランを抽出した。BRB損傷を[(a)/(b)]/[(c)x(d)]の式により計算した。ここで、(a)は網膜内FITC抱合デキストラン量(μg)を、(b)は、網膜重量(g)を、(c)は血漿中のFITC抱合デキストラン濃度(μg/mL)を、(d)は循環時間(h)を示す。図13に示したように、AGE-BSA処置群において、PEDF投与群は非投与群に比べ、有意な効果を発揮した。
(3) Effects of intravenous administration on retinal vascular permeability in AGE perfused rats
According to the method of Adamis, AP et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000, 44: 2155-2162), the effect of PEDF on blood retinal barrier (hereinafter referred to as BRB) damage was examined. That is, SD rats were anesthetized and then intravenously injected with FITC-conjugated dextran (4.4 kDa, Sigma). After 10-15 minutes, blood samples were taken and each rat perfused with phosphate buffered saline. After perfusion, the retina was collected, weighed and homogenized to extract FITC-conjugated dextran. BRB damage was calculated by the formula of [(a) / (b)] / [(c) x (d)]. Here, (a) is the amount of FITC-conjugated dextran (μg) in the retina, (b) is the retinal weight (g), (c) is the FITC-conjugated dextran concentration in plasma (μg / mL), (d ) Indicates the circulation time (h). As shown in FIG. 13, in the AGE-BSA treatment group, the PEDF administration group exhibited a significant effect compared to the non-administration group.
実施例8は、PEDFが終末糖化産物(AGE)による微小血管内皮細胞での分子内活性酸素種を抑制し、終末糖化産物(AGE)にて誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を阻害し、また、PEDFが血液透析糖尿病患者(DM-HD)血清からのAGE分画で処理した細胞に対し、有意な活性を示すことを明らかにした。さらに、AGE灌流ラットでの網膜血管浸透性に対し、有効性を示した。 Example 8 shows that PEDF suppresses intramolecular reactive oxygen species in microvascular endothelial cells caused by terminal glycation products (AGE), inhibits NADPH oxidase activity induced by terminal glycation products (AGE), and PEDF. Showed significant activity against cells treated with AGE fraction from hemodialysis diabetic (DM-HD) serum. Furthermore, it showed efficacy against retinal vascular permeability in AGE perfused rats.
考察
本発明において本発明者らは、PEDFがHUVECにおいてTNF-α誘発NF-κB活性化およびIL-6発現を、NADPHオキシダーゼ仲介ROS(活性酸素種)生成から回復させることにより阻害することを、以下の証拠に基づき示した:[1] TNF-αはHUVECにおいて細胞内ROS(活性酸素種)生成を有意に刺激し、それは、PEDF、NADPHオキシダーゼ阻害物質であるDPI(実施例1参照)、またはDN-RacT17N (ドミナント−ネガテブ・ヒトRac-1 変異体)の過剰発現(実施例2参照)によって完全に抑制された;
[2] PEDFはTNF-αの誘発するNADPHオキシダーゼ活性上昇を完全に抑制した(実施例3参照);および、
[3] PEDFまたは抗酸化剤NACは、TNF-α誘発NF-κB活性化およびIL-6発現を有意に阻害した(実施例4および5参照)。実施例7からは、PEDFが濃度依存的にAngIIにより誘発されたNADPHオキシダーゼ活性を有意に抑制することが示された。また、実施例8からは、PEDFがNADPHオキシダーゼ活性を抑制することによる終末糖化産物(AGE)生成に伴う糖尿病性血管合併症が予防または治療できる可能性が示された。
DISCUSSION In the present invention, we inhibit PEDF by restoring TNF-α-induced NF-κB activation and IL-6 expression in HUVEC from NADPH oxidase-mediated ROS (reactive oxygen species) production, Based on the following evidence: [1] TNF-α significantly stimulates intracellular ROS (reactive oxygen species) production in HUVEC, which is PEDF, NADPH oxidase inhibitor DPI (see Example 1), Or completely suppressed by overexpression of DN-RacT17N (dominant-negative human Rac-1 mutant) (see Example 2);
[2] PEDF completely suppressed TNF-α-induced increase in NADPH oxidase activity (see Example 3); and
[3] PEDF or antioxidant NAC significantly inhibited TNF-α-induced NF-κB activation and IL-6 expression (see Examples 4 and 5). Example 7 showed that PEDF significantly suppressed the NADPH oxidase activity induced by AngII in a concentration-dependent manner. Moreover, from Example 8, it was shown that PEDF could prevent or treat diabetic vascular complications associated with the production of advanced glycation end products (AGE) by suppressing NADPH oxidase activity.
PEDFは10 nMでTNF-α誘発性ROS産生を対照レベル以下に減少させる一方で、TNF-αの非存在下ではROS生成に影響を及ぼさないことは興味深いことであった。本発明者らは正確なメカニズムを理解していないが、以下のように説明できるであろう。HUVECにおけるPEDF遺伝子発現に対するTNF-αの効果を検討するため、10 ng/ml TNF-αで、またはそれ抜きで4時間処理したHUVECよりポリ(A)+RNAを単離し、RT-PCRにより解析した。図5に示すように、TNF-αはHUVECにおいてPEDF mRNAレベルを減少させることがわかった。従って本発明者らは、PEDF mRNAの減少は、逆にその機能的結合タンパク質の上昇をもたらし、それによって外部から投与されたPEDFのROS生成に対する阻害効果を増強している可能性があると推測している。TNF-α処理によりHUVECにおける膜に対するPEDF結合は約1.3倍増加し、このことは本発明者らの推測を支持している。TNF-αが誘発するPEDF mRNA減少のメカニズムは本発明者らの研究からは明らかではない。本発明者らはごく最近、培養ECおよび周皮細胞の両者において、酸化的ストレス条件下PEDF mRNAレベルが抑制されることを発見したので、TNF-α誘発性ROS生成がPEDF mRNAレベルの抑制に関与しているのかもしれない。どのようなメカニズムにせよ、TNF-αによるPEDF発現の減少は、酸化的ストレス誘発細胞障害をさらに悪化させるであろう。 It was interesting that PEDF reduced TNF-α-induced ROS production below control levels at 10 nM, while not affecting ROS production in the absence of TNF-α. The inventors do not understand the exact mechanism, but can be explained as follows. To examine the effect of TNF-α on PEDF gene expression in HUVEC, poly (A) + RNA was isolated from HUVEC treated with or without 10 ng / ml TNF-α and analyzed by RT-PCR did. As shown in FIG. 5, TNF-α was found to decrease PEDF mRNA levels in HUVEC. Therefore, we speculate that a decrease in PEDF mRNA may conversely increase its functional binding protein, thereby enhancing the inhibitory effect of externally administered PEDF on ROS production. doing. TNF-α treatment increased PEDF binding to the membrane in HUVECs by approximately 1.3-fold, which supports our speculation. The mechanism of PEDF mRNA reduction induced by TNF-α is not clear from our study. The present inventors have recently discovered that PEDF mRNA levels are suppressed under oxidative stress conditions in both cultured ECs and pericytes, so that TNF-α-induced ROS generation is effective in suppressing PEDF mRNA levels. It may be involved. Whatever the mechanism, the decrease in PEDF expression by TNF-α will further exacerbate oxidative stress-induced cell damage.
Claims (18)
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体;および
c) 該因子(a)または該変異体(b)をコードする核酸分子を含むベクター
より成る群から選択される活性成分を含有する、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するための医薬組成物。 a) pigment epithelium-derived factor;
b) a variant of the factor having a functionally equivalent property to the pigment epithelium-derived factor (a); and
c) A pharmaceutical composition for inhibiting NADPH oxidase activity, comprising an active ingredient selected from the group consisting of a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the factor (a) or the mutant (b).
b) 色素上皮由来因子(a)と機能的に同等な性質を有する該因子の変異体
をコードする核酸を含む、NADPHオキシダーゼ活性を抑制するためのベクター。 a) pigment epithelium-derived factor; or
b) A vector for suppressing NADPH oxidase activity, comprising a nucleic acid encoding a variant of the factor having a property equivalent to that of the pigment epithelium-derived factor (a).
The vector according to claim 16, wherein the glycation end product signal transduction-related disease is diabetic vascular complication associated with end glycation end product generation.
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- 2004-12-24 JP JP2004373636A patent/JP2005336159A/en active Pending
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2005
- 2005-04-27 WO PCT/JP2005/007989 patent/WO2005105130A1/en not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009007256A (en) * | 2007-06-26 | 2009-01-15 | Kao Corp | Nadh/nadph oxidase inhibitor |
JP2014070057A (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-21 | Oriza Yuka Kk | INHIBITING AGENT FOR ACTIVE OXYGEN PRODUCTION AND FIBROBLAST DISORDER DUE TO TNF-α |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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WO2005105130A1 (en) | 2005-11-10 |
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