JP2005328752A - Method for assaying activity of glycosaminoglycan splitting enzyme - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素の活性測定方法及び活性測定キットに関する。 The present invention relates to a method for measuring the activity of a glycosaminoglycan degrading enzyme and an activity measurement kit.
本明細書中で使用する略号は以下の通りである。
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin）
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）
ＧＡＧａｓｅ: ＧＡＧ分解酵素
ＨＡ：ヒアルロン酸（hyaluronic acid）
ＨＡａｓｅ：ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）
ＨＲＰ：西洋ワサビのペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）
ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γ
ＫＬＨ：キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Keyhole limpet hemocyanin）
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸（2-morpholinoethanesulfonic acid）
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水（phosphate buffer saline）
ＴＭＢ：3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン
特許文献１には、蛋白質が結合したＧＡＧが固着された固相が記載されている。しかし、ＧＡＧａｓｅの活性測定や、ＧＡＧａｓｅの活性測定キット等に関しては何らの記載も示唆もない。
Abbreviations used in this specification are as follows.
BSA: bovine serum albumin
EDC: 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
GAG: glycosaminoglycan
GAGase: GAG degrading enzyme HA: hyaluronic acid
HAase: hyaluronidase
HRP: Horseradish peroxidase
IFN-γ: Interferon-γ
KLH: Keyhole limpet hemocyanin
MES: 2-morpholinoethanesulfonic acid
PBS: phosphate buffered saline
TMB: 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine Patent Document 1 describes a solid phase on which GAG to which a protein is bound is fixed. However, there is no description or suggestion regarding the measurement of GAGase activity or the kit for measuring GAGase activity.
特許文献２には、ＨＡによって被覆した固相を用いたＨＡａｓｅの活性測定方法が記載されている。しかし、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を用いることに関しては記載も示唆もない。
本発明は、ＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定する方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for measuring the activity of GAGase simply, rapidly, inexpensively and with high sensitivity and with good reproducibility and quantitativeness.
本発明の発明者らは上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を作用させ、更にＧＡＧ結合性蛋白質を作用させることにより、検体中のＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速、安価かつ高感度に、再現性・定量性良く測定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have made extensive studies in view of the above problems, and as a result, the sample is allowed to act on a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed, and further a GAG-binding protein is allowed to act on the sample. It has been found that the activity of GAGase can be measured easily, rapidly, inexpensively and with high sensitivity and with good reproducibility and quantitativeness, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は、下記ステップ（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、検体中のＧＡＧａｓｅの活性測定方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
ステップ（Ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅを作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップ。
ステップ（Ｃ）：前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップ。
That is, the present invention provides a method for measuring the activity of GAGase in a specimen (hereinafter referred to as “the method of the present invention”) comprising at least the following steps (A), (B) and (C).
Step (A): A step of bringing a specimen into contact with a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed, and allowing GAGase in the specimen to act on the GAG.
Step (B): A step of bringing a GAG-binding protein into contact with the GAG after the action that is fixed to a solid phase.
Step (C): detecting the GAG-binding protein bound to the GAG after the action.
なかでも、「担体」は「蛋白質」であることが好ましい。 Of these, the “carrier” is preferably a “protein”.
また「ＧＡＧ結合性蛋白質」は標識されたものであることが好ましい。 The “GAG binding protein” is preferably labeled.
また、「ＧＡＧａｓｅ」が「ＨＡａｓｅ」であり、「ＧＡＧ」が「ＨＡ」であり、かつ、「ＧＡＧ結合性蛋白質」が「ＨＡ結合性蛋白質」であるものが好ましい。 Further, it is preferable that “GAGase” is “HAase”, “GAG” is “HA”, and “GAG-binding protein” is “HA-binding protein”.
また本発明は、下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、ＧＡＧａｓｅの活性測定キット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。
構成成分（ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：ＧＡＧ結合性蛋白質。
The present invention also provides a kit for measuring the activity of GAGase (hereinafter referred to as “the kit of the present invention”) comprising at least the following components (a) and (b).
Component (a): a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed.
Component (b): GAG-binding protein.
なかでも、「担体」は「蛋白質」であることが好ましい。 Of these, the “carrier” is preferably a “protein”.
また「ＧＡＧ結合性蛋白質」は標識されたものであることが好ましい。 The “GAG binding protein” is preferably labeled.
また、「ＧＡＧａｓｅ」が「ＨＡａｓｅ」であり、「ＧＡＧ」が「ＨＡ」であり、かつ、「ＧＡＧ結合性蛋白質」が「ＨＡ結合性蛋白質」であるものが好ましい。 Further, it is preferable that “GAGase” is “HAase”, “GAG” is “HA”, and “GAG-binding protein” is “HA-binding protein”.
本発明方法は、これを用いることにより、簡便、迅速、安価かつ高感度に、高い再現性と高い定量性をもって検体中のＧＡＧａｓｅ活性を測定することができ、極めて有用である。さらに本発明キットは、本発明方法のより簡便かつ迅速な実施を可能にすることから非常に有用である。 By using this method, the method of the present invention can measure the GAGase activity in a sample with high reproducibility and high quantitativeness in a simple, rapid, inexpensive and highly sensitive manner, and is extremely useful. Furthermore, the kit of the present invention is very useful because it allows a simpler and faster implementation of the method of the present invention.
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明方法
本発明方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを少なくとも含む、検体中のＧＡＧａｓｅの活性測定方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the best mode for carrying out the invention.
<1> Method of the Present Invention The method of the present invention is a method for measuring the activity of GAGase in a sample, comprising at least the following steps (A) to (C).
ステップ（Ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅを作用させるステップ。 Step (A): A step of bringing a specimen into contact with a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed, and allowing GAGase in the specimen to act on the GAG.
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップ。 Step (B): A step of bringing a GAG-binding protein into contact with the GAG after the action, which is fixed to a solid phase.
ステップ（Ｃ）：前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップ。 Step (C): detecting the GAG-binding protein bound to the GAG after the action.
本発明において「担体」とは、ＧＡＧと、後述する固相との両方に化学的または物理的に結合し得る物質を意味する。 In the present invention, the “carrier” means a substance that can be chemically or physically bound to both GAG and a solid phase described later.
本発明で用いることができる担体としては、蛋白質、脂質等が例示されるが、その「担体が結合したＧＡＧ」が後述の固相に固着でき、かつ酵素反応時や洗浄時の条件下においても容易に遊離しないものである限りにおいて特に限定されない。 Examples of the carrier that can be used in the present invention include proteins, lipids and the like, but the “GAG to which the carrier is bound” can be fixed to a solid phase described later, and even under conditions of enzyme reaction and washing. There is no particular limitation as long as it is not easily released.
担体として、好ましくは、アミノ基を多く含有する蛋白質、又は分子量が２，０００以上の蛋白質が挙げられる。なお、これら２つの性質を併有する蛋白質、すなわちアミノ基を多く含有し、かつ分子量２，０００以上の蛋白質が特に好ましい。蛋白質として具体的には、例えば血清アルブミン（ＢＳＡ等）、卵白アルブミン、カゼイン、ＫＬＨ、アビジンなどの動物性タンパク、植物性タンパク、ポリアミノ酸（ポリリジン等）等が例示されるが、血清アルブミンが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。また、蛋白質はいわゆるプロテオグリカンでも良い。上記蛋白質は、例えば天然材料から分離した蛋白質であってもよく、遺伝子工学的手法により製造した組換え蛋白質であってもよい。
担体として脂質を用いる場合には、動物、植物、微生物等の天然物由来の脂質や、化学的若しくは酵素的に合成され若しくは部分的に分解された複合脂質や単純脂質等を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等のいずれをも使用することができる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。これらのうち、リン脂質が特に好ましく、その中でもホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
The carrier is preferably a protein containing a large amount of amino groups or a protein having a molecular weight of 2,000 or more. A protein having both of these two properties, that is, a protein containing a lot of amino groups and having a molecular weight of 2,000 or more is particularly preferred. Specific examples of proteins include animal proteins such as serum albumin (BSA, etc.), ovalbumin, casein, KLH, avidin, plant proteins, polyamino acids (polylysine, etc.), and serum albumin is preferred. BSA is more preferable. The protein may be a so-called proteoglycan. The protein may be, for example, a protein separated from a natural material or a recombinant protein produced by a genetic engineering technique.
When lipids are used as a carrier, lipids derived from natural products such as animals, plants, and microorganisms, complex lipids synthesized chemically or enzymatically, or partially degraded, and simple lipids can be used. Any of glycerolipids such as phospholipids, long chain fatty acids, long chain aliphatic amines, cholesterols, sphingolipids, and ceramides can be used. In particular phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylthreonine, ethanolamine plasmalogen, serine plasmalogen, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylinositol and other phospholipids, monoacylglycerol, diacylglycerol and other glycerolipids such as neutral lipids Is preferred. Of these, phospholipids are particularly preferable, and phosphatidylethanolamine is particularly preferable.
担体を結合させるＧＡＧは、活性測定の対象となるＧＡＧａｓｅの基質となり得るＧＡＧである限りにおいて特に限定されない。「ＧＡＧ」としてはＨＡ、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン等が例示されるが、例えばＨＡａｓｅを活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてＨＡを用いる。同様に、例えば、ヘパラン硫酸分解酵素を活性測定の対象とする場合には、ＧＡＧとしてヘパラン硫酸を用いればよい。活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅは特に限定されないが、ＨＡａｓｅが好ましく、したがって担体を結合させるＧＡＧもＨＡが好ましい。また、担体を結合させるＧＡＧの分子量も特に限定されない。例えば、ＨＡを担体に結合させる場合、当該ＨＡは８糖以上のものが好ましく、重量平均分子量が１万〜２００万程度のものがより好ましく、２万〜１２０万程度のものが特に好ましい。 The GAG to which the carrier is bound is not particularly limited as long as it is a GAG that can be a substrate for GAGase to be subjected to activity measurement. Examples of “GAG” include HA, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate, heparin and the like. For example, when HAase is an activity measurement target, HA is used as GAG. Similarly, for example, when heparan sulfate degrading enzyme is the target of activity measurement, heparan sulfate may be used as GAG. The GAGase for which the activity is measured is not particularly limited, but HAase is preferable, and therefore GAG to which the carrier is bound is also preferably HA. Further, the molecular weight of GAG to which the carrier is bound is not particularly limited. For example, when HA is bound to a carrier, the HA is preferably an octasaccharide or more, more preferably a weight average molecular weight of about 10,000 to 2,000,000, particularly preferably about 20,000 to 1,200,000.
このようなＧＡＧは、公知の方法で製造することができ、また市販のものを用いることもできる。 Such GAG can be produced by a known method, and a commercially available product can also be used.
担体とＧＡＧとを結合させる方法（「担体が結合したＧＡＧ」の製造方法）は、担体とＧＡＧとを結合させることができる方法である限りにおいて限定されず、公知の方法を適宜採用することができる。担体とＧＡＧとの結合の様式も特に限定されないが、共有結合であることが好ましい。 The method for binding the carrier and GAG (the method for producing “carrier-bound GAG”) is not limited as long as it is a method capable of binding the carrier and GAG, and a known method may be adopted as appropriate. it can. The mode of binding between the carrier and GAG is not particularly limited, but is preferably a covalent bond.
ＧＡＧと担体とを共有結合させる方法としては、例えば、特開平３−２８４６９８号公報、特開２０００−９７９４０号公報、特開２０００−６５８３７号公報に記載された方法等を例示することができる。 Examples of the method for covalently bonding GAG and the carrier include the methods described in JP-A-3-284698, JP-A-2000-97940, JP-A-2000-65837, and the like.
例えば、ＧＡＧと担体である蛋白質とを共有結合させる具体的な方法としては以下のような方法が例示される。 For example, the following method is exemplified as a specific method for covalently bonding GAG and a protein as a carrier.
例示（１）：ＧＡＧの還元末端のホルミル基と蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アルキルアミノ結合(-CH2-NH-)である。 Example (1): A method in which a formyl group at the reducing end of GAG reacts with an amino group of a protein to form a Schiff base, which is then reduced using a reducing agent such as trimethylamine borane and covalently bonded. The resulting covalent bond is an alkylamino bond (—CH 2 —NH—).
例示（２）：ＧＡＧの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アルキルアミノ結合(-CH2-NH-)である。 Example (2): After reducing the reducing end of GAG, periodate is oxidized to introduce a free formyl group, this is reacted with an amino group of a protein to form a Schiff base, and then a reducing agent such as trimethylamine borane is added. A method of reducing and covalently bonding using. The resulting covalent bond is an alkylamino bond (—CH 2 —NH—).
例示（３）：ＧＡＧのカルボキシル基と蛋白質のアミノ基とをカルボジイミド等を用いて共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アミド結合(-CO-NH-)である。 Example (3): A method of covalently bonding a carboxyl group of GAG and an amino group of a protein using carbodiimide or the like. The resulting covalent bond is an amide bond (—CO—NH—).
例示（４）：ＧＡＧと蛋白質のアミノ基とをベンゾキノン等を用いて共有結合させる方法。 Example (4): A method of covalently bonding GAG and an amino group of a protein using benzoquinone or the like.
また、ＧＡＧと担体である脂質とを結合させる方法としては、例えば、特開２０００−６５８３７号公報に記載された方法、還元末端限定酸化法、還元末端ラクトン法（特許第２９９７０１８号公報、特許第２９８６５１９号公報、特許第２９８６５１８号公報及び特開平９−３０９７９号公報）、ヘミアセタール法（特開２００３−３３５８０１号公報）等を例示することができる。 Examples of the method of binding GAG and lipid as a carrier include, for example, the method described in JP-A-2000-65837, the reducing end limited oxidation method, the reducing end lactone method (Japanese Patent No. 2999718, Patent No. Examples thereof include Japanese Patent No. 2998619, Japanese Patent No. 2998618 and Japanese Patent Laid-Open No. 9-30979, and the hemiacetal method (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-335801).
このような方法で製造される「担体が結合したＧＡＧ」は、固相に固着して用いられる。 The “carrier-bound GAG” produced by such a method is used by being fixed to a solid phase.
固相は、「担体が結合したＧＡＧ」が固着可能な水不溶性の固相である限りにおいて、その形状、材質等を含め特に限定されない。 The solid phase is not particularly limited, including its shape, material, etc., as long as it is a water-insoluble solid phase on which “carrier-bound GAG” can be fixed.
固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。 Examples of the shape of the solid phase include plates (for example, microplate wells), tubes, beads, membranes, gels, latexes, and the like. Examples of the solid phase material include polystyrene, polypropylene, nylon, and polyacrylamide. Among these, a plate made of polystyrene is preferable.
これらの固相に「担体が結合したＧＡＧ」を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等の固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。 As a method of fixing “carrier-bound GAG” to these solid phases, a general method for preparing an immobilized enzyme such as a physical adsorption method, a covalent bond method, or a comprehensive method (an immobilized enzyme, 1975). , Published by Kodansha, see pages 9 to 75). Among these, the physical adsorption method is preferable because the operation is simple and frequently used.
物理的吸着法として具体的には、例えば次の方法が挙げられ、かつ好ましい。 Specific examples of the physical adsorption method include and are preferably the following methods.
「担体が結合したＧＡＧ」を、ｐＨ７〜１０程度の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置して固着させる方法。 Dissolve “carrier-bound GAG” in a buffer solution of about pH 7 to 10 (for example, phosphate buffer solution, PBS, carbonate buffer solution, etc.), add it to the solid phase, and let stand at 4 ° C. overnight to fix. Method.
なお、この後にブロッキング物質を固相に添加して、「担体が結合したＧＡＧ」が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、植物タンパク分解物等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。 After that, it is preferable to add a blocking substance to the solid phase so as to cover the portion where the “carrier-bound GAG” is not fixed. Examples of such blocking substances include serum albumin, casein, skim milk, gelatin, plant protein degradation products, and the like, and commercially available blocking substances can also be used.
以上の方法で、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を製造することができる。 By the above method, a solid phase to which “GAG having a carrier bound” is fixed can be produced.
ステップ（Ａ）は、このようにして製造された固相に、検体を接触させ、当該ＧＡＧに検体中のＧＡＧａｓｅとを作用させるステップからなる。 Step (A) comprises the steps of bringing the specimen into contact with the solid phase thus produced and allowing GAGase in the specimen to act on the GAG.
検体としては、活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅが含有されているか、含有されている可能性があるものである限りにおいて特に限定されない。また、検体は、予め精製されている必要もない。すなわち、検体中に、活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅ以外のＧＡＧａｓｅや、その他の各種蛋白質等が含有されていても、本発明方法では活性測定の対象とするＧＡＧａｓｅを特異的に測定することができる。 The specimen is not particularly limited as long as it contains or possibly contains GAGase as an activity measurement target. In addition, the specimen need not be purified in advance. That is, even if the sample contains GAGase other than GAGase for which activity is to be measured, and other various proteins, the method of the present invention can specifically measure GAGase for which activity is to be measured. .
検体として具体的には、ＧＡＧａｓｅ溶液、細胞培養上清、組織抽出物、体液（例えば血液、尿等）等が例示される。 Specific examples of the specimen include GAGase solution, cell culture supernatant, tissue extract, body fluid (for example, blood, urine, etc.) and the like.
「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相への検体の接触方法は、当該固相に固着された「担体が結合したＧＡＧ」分子と、検体中のＧＡＧａｓｅ分子とが接触し、酵素反応が惹起される限りにおいて特に限定されない。具体的な例示としては、下記の態様が挙げられる。なお下記の態様はあくまで例示であり、本発明方法がこれらに限定されるものではない。固相と検体とを接触させる方法は、例えば下記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。態様（１）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相に検体を添加して接触させる。態様（２）：検体に、「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相を添加して接触させる。態様（３）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相と検体とを、同時に添加して接触させる。 The method of contacting the sample with the solid phase to which the “carrier-bound GAG” is fixed is such that the “carrier-bound GAG” molecule fixed to the solid phase contacts the GAGase molecule in the sample, and the enzyme reaction As long as is induced, there is no particular limitation. Specific examples include the following embodiments. In addition, the following aspect is an illustration to the last, and this invention method is not limited to these. The method for bringing the solid phase into contact with the specimen can be appropriately determined by those skilled in the art with reference to, for example, the following embodiment. Aspect (1): A specimen is added and brought into contact with a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed. Aspect (2): A solid phase to which “GAG bound to a carrier” is fixed is added to and contacted with a specimen. Aspect (3): The solid phase to which the “carrier-bound GAG” is fixed and the specimen are simultaneously added and brought into contact with each other.
なお、これら両者を接触させた後、酵素反応させるために、インキュベートすることが好ましい。インキュベートの条件は、ＧＡＧａｓｅが、担体を介して固相に固着されたＧＡＧに作用してＧＡＧを分解する反応が惹起される条件である限りにおいて特に限定されないが、例えばインキュベートの温度は０℃〜４５℃（例えば３７℃程度）とすることが好ましい。またインキュベートの時間も特に限定されないが、３０分〜２４時間程度を例示することができる。 In addition, after making these both contact, in order to make an enzyme reaction, it is preferable to incubate. Incubation conditions are not particularly limited as long as GAGase acts on GAG fixed to the solid phase via a carrier to cause a reaction to degrade GAG. For example, the incubation temperature is 0 ° C. to It is preferably 45 ° C. (for example, about 37 ° C.). In addition, the incubation time is not particularly limited, but it may be about 30 minutes to 24 hours.
また酵素反応後、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着した「担体が結合したＧＡＧ」が実質的に遊離しない条件で行われる。洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等）を用いることが好ましい。 Moreover, it is preferable to wash | clean the surface of a solid phase with a washing | cleaning liquid after an enzyme reaction. This washing is performed under the condition that the “carrier-bound GAG” fixed to the solid phase is not substantially released. As the washing solution, for example, a buffer solution added with a nonionic surfactant such as a Tween surfactant (for example, phosphate buffer solution, PBS, Tris-HCl buffer solution, borate buffer solution, Good buffer solution, etc.) ) Is preferably used.
以上の操作により、固相に固着された「担体が結合したＧＡＧ」の「ＧＡＧ」部分が検体中のＧＡＧａｓｅの作用によって分解され、分解された後のＧＡＧ（作用後のＧＡＧ）は担体を介して固相に固着されたまま残ることとなる。 By the above operation, the “GAG” portion of “GAG to which the carrier is bound” fixed to the solid phase is decomposed by the action of GAGase in the specimen, and the GAG after the decomposition (post-action GAG) passes through the carrier. And remain attached to the solid phase.
以上のステップ（Ａ）を経た後、ステップ（Ｂ）に移行する。 After the above step (A), the process proceeds to step (B).
ステップ（Ｂ）は、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させるステップである。 Step (B) is a step of bringing a GAG-binding protein into contact with the GAG after the action, which is fixed to a solid phase.
本出願書類において「ＧＡＧ結合性蛋白質」とは、ＧＡＧ（又はその分解物）に結合する性質を有する蛋白質を意味する。同様に本出願書類においては、例えば、ＨＡに結合する性質を有する蛋白質を「ＨＡ結合性蛋白質」、ヘパラン硫酸に結合する性質を有する蛋白質を「ヘパラン硫酸結合性蛋白質」のように記載する。 In the present application document, “GAG-binding protein” means a protein having a property of binding to GAG (or a degradation product thereof). Similarly, in the present application documents, for example, a protein having the property of binding to HA is described as “HA-binding protein”, and a protein having the property of binding to heparan sulfate is described as “heparan sulfate-binding protein”.
本発明方法において、ＧＡＧ結合性蛋白質は、「担体が結合したＧＡＧ」の「ＧＡＧ」部分に結合する性質を有する蛋白質を用いる。当該ＧＡＧ結合性蛋白質には、ネイティブなＧＡＧを認識する蛋白質や、例えばリアーゼ等によるＧＡＧの分解物を認識する蛋白質等が包含される。 In the method of the present invention, as the GAG-binding protein, a protein having a property of binding to the “GAG” portion of “carrier-bound GAG” is used. The GAG-binding protein includes a protein that recognizes native GAG, a protein that recognizes a degradation product of GAG by, for example, lyase, and the like.
例えば、当該ＧＡＧがＨＡである場合にはＨＡ結合性蛋白質を用いる。同様に、例えば当該ＧＡＧがヘパラン硫酸である場合には、ヘパラン硫酸結合性蛋白質を用いる。 For example, when the GAG is HA, an HA binding protein is used. Similarly, for example, when the GAG is heparan sulfate, a heparan sulfate binding protein is used.
このようなＧＡＧ結合性蛋白質として、具体的には以下のものが例示されるが、所定のＧＡＧに結合する性質を有する蛋白質である限りにおいて、これらに限定されるものではない。
（１）ＨＡ結合性蛋白質：
ＨＡ結合性のプロテオグリカン（例えば、軟骨プロテオグリカン、軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、軟骨プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ消化物（特許第２７３２７１８号公報）等）、プロテオグリカンのコア蛋白質（例えば、軟骨プロテオグリカンのコア蛋白質等）、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン、ＣＤ４４、これらの蛋白質のＨＡ結合部位を含む部分蛋白質、あるいは該部分蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質、ＨＡを認識する抗体（特開平９−１２６００号公報参照）等。特に軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、さらにはウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物が好ましい。なお、ウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ＨＡバインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。
（２）ＨＡ以外のＧＡＧに結合性の蛋白質：
ＨＡ以外のＧＡＧに対する各種モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ＨＩＰ(ヘパラン硫酸結合性蛋白質)、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）等のＧＡＧ結合性成長因子、フィブロネクチン等のＧＡＧ結合性蛋白質等。例えば、ケラタン硫酸結合性のものとしてモノクローナル抗体5D4、コンドロイチン硫酸結合性のものとしてモノクローナル抗体CS-56、MC21C、MO225、2H6、473A12、1-B-5、2-B-6及び3-B-3、デルマタン硫酸結合性のものとして、モノクローナル抗体6-B-6及びヘパリンコファクターII、ヘパラン硫酸結合性のものとして、モノクローナル抗体10E4、3G10、HepSS-1及び3G10並びにＨＩＰ（子宮上皮ヘパラン硫酸結合性蛋白質）、ＦＧＦ及びＩＦＮ−γ、ヘパリン結合性のものとして、ＦＧＦ、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンチトロンビンIII、ヘパリンコファクターII、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン。なお、ここに挙げられているモノクローナル抗体は、生化学工業株式会社から販売されている。
Specific examples of such a GAG-binding protein include the following, but the GAG-binding protein is not limited to these as long as the protein has the property of binding to a predetermined GAG.
(1) HA binding protein:
HA-binding proteoglycans (eg, cartilage proteoglycans, trypsin digests of cartilage proteoglycans, chondroitinase ABC digests of cartilage proteoglycans (Japanese Patent No. 2732718), proteoglycan core proteins (eg, cartilage proteoglycan core proteins, etc.) ), Link protein, hyaluronectin, CD44, a partial protein containing the HA binding site of these proteins, or a fusion protein of the partial protein with another protein, an antibody that recognizes HA (see Japanese Patent Laid-Open No. 9-12600) etc. In particular, trypsin digests of cartilage proteoglycans, and trypsin digests of bovine nasal cartilage proteoglycans are preferred. The tryptic digest of bovine nasal cartilage proteoglycan is sold as “HA binding protein” by Seikagaku Corporation.
(2) Proteins that bind to GAGs other than HA:
GAG binding of various monoclonal antibodies and polyclonal antibodies against GAGs other than HA, HIP (heparan sulfate binding protein), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), etc. GAG-binding proteins such as sex growth factor and fibronectin. For example, monoclonal antibody 5D4 as keratan sulfate-binding, monoclonal antibody CS-56, MC21C, MO225, 2H6, 473A12, 1-B-5, 2-B-6 and 3-B- as chondroitin sulfate-binding 3. Monoclonal antibody 6-B-6 and heparin cofactor II as dermatan sulfate binding, monoclonal antibodies 10E4, 3G10, HepSS-1 and 3G10 and HIP (uterine epithelial heparan sulfate binding) FGF, IFN-γ, heparin-binding FGF, heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), antithrombin III, heparin cofactor II, fibronectin, vitronectin and laminin. The monoclonal antibodies listed here are sold by Seikagaku Corporation.
これらのＧＡＧ結合性蛋白質の由来は特に限定されない。例えば天然材料や細胞等から分離した蛋白質であっても、遺伝子工学的手法により製造した組換え蛋白質であってもよい。 The origin of these GAG-binding proteins is not particularly limited. For example, it may be a protein isolated from natural materials or cells, or a recombinant protein produced by genetic engineering techniques.
なお、ＧＡＧ結合性蛋白質は標識物質で標識されていることが、ステップ（Ｃ）において検出が容易であることから好ましい。 The GAG-binding protein is preferably labeled with a labeling substance because it can be easily detected in step (C).
ＧＡＧ結合性蛋白質の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位元素等が挙げられるが、通常の蛋白質の標識に可能なものであれば特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等（「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法(Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照)、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭63-17843号公報記載の方法等から適宜選択できる。 Labeling substances used for labeling GAG-binding proteins include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, acetylcholinesterase, etc.), fluorescent dyes (luminol, fluorescein isothiocyanate (FITC), etc.), chemiluminescent substances , Biotin, avidin, radioisotope, and the like, but are not particularly limited as long as they can be labeled with ordinary proteins. The labeling method is a known method suitable for the labeling substance, for example, glutaraldehyde method, periodate crosslinking method, maleimide crosslinking method, carbodiimide method, activated ester method, etc. ("Protein Chemistry (below)", Tokyo Chemical Dojin , Published in 1987). For example, when using biotin as a labeling substance, a method using a hydrazide derivative of biotin (see Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994), or when using fluorescein isothiocyanate The method can be appropriately selected from the methods described in JP-B 63-17843.
なお、ビオチンで標識されたウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ビオチン標識ＨＡバインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。 The tryptic digest of bovine nasal cartilage proteoglycan labeled with biotin is sold as “Biotin-labeled HA binding protein” by Seikagaku Corporation.
また、ＧＡＧ結合性蛋白質が予め標識されたものでなく、ステップ（Ｃ）においてＧＡＧ結合性蛋白質を検出する際に、例えば、ＧＡＧ結合性蛋白質を認識する標識された抗体とＧＡＧ結合性蛋白質とを反応させることにより最終的に標識され得る態様であってもよい。 In addition, when the GAG-binding protein is not labeled in advance and is detected in step (C), for example, a labeled antibody that recognizes the GAG-binding protein and a GAG-binding protein are used. The mode which can be finally labeled by making it react may be sufficient.
固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに、ＧＡＧ結合性蛋白質を接触させる方法は、当該固相に固着された「前記作用後のＧＡＧ」分子と、当該ＧＡＧ結合性蛋白質とが接触する限りにおいて特に限定されない。具体的には前記のステップ（Ａ）における接触方法と同様の態様が例示されるが、それらはあくまで例示であり、本発明方法がこれらの態様に限定されるものではない。接触させる順序や方法は、前記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。 In the method of bringing a GAG-binding protein into contact with the GAG after the action fixed to the solid phase, the “GAG after the action” molecule fixed to the solid phase contacts the GAG-binding protein. As long as it is not particularly limited. Specifically, although the same aspects as the contact method in the step (A) are exemplified, they are merely examples, and the method of the present invention is not limited to these aspects. A person skilled in the art can appropriately determine the order and method of contacting with reference to the above embodiment.
また、両者を接触させた後の反応やインキュベート等に関しても、前記のステップ（Ａ）と同様である。 Further, the reaction and incubation after contacting both are the same as in the above step (A).
以上のステップ（Ｂ）を経た後に、ステップ（Ｃ）に移行する。 After the above step (B), the process proceeds to step (C).
ステップ（Ｃ）は、前記作用後のＧＡＧに結合した前記ＧＡＧ結合性蛋白質を検出するステップである。 Step (C) is a step of detecting the GAG-binding protein bound to the GAG after the action.
本発明方法は、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質を検出することにより、検体中のＧＡＧａｓｅ活性を測定することができる。 The method of the present invention can measure the GAGase activity in a specimen by detecting a GAG-binding protein bound to the GAG after the action, which is fixed to a solid phase.
すなわち、ネイティブなＧＡＧを認識するＧＡＧ結合性蛋白質を用いる場合には、固相ＧＡＧと検体とのインキュベーションの後、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が多ければ、固相に固着されたＧＡＧがあまり分解されておらず、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が低いと判定される。逆に、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が少なければ、固相に固着されたＧＡＧがよく分解されており、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が高いと判定される。
リアーゼ等によるＧＡＧの分解物を認識するＧＡＧ結合性蛋白質を用いる場合には、固相に固着されている前記作用後のＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が多ければ、固相に固着されたＧＡＧが分解されており、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が高いと判定される。逆に、固相ＧＡＧに結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出量が少なければ、固相に固着されたＧＡＧがあまり分解されておらず、検体中のＧＡＧａｓｅ活性が低いと判定される。固相に固着されている「前記作用後のＧＡＧ」に結合したＧＡＧ結合性蛋白質の検出は、ＧＡＧ結合性蛋白質に特異的に反応する抗体を用いて行ってもよく、またステップ（Ｂ）においてＧＡＧ結合性蛋白質を標識物質で標識したものを用いた場合には、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。
That is, when a GAG binding protein that recognizes native GAG is used, after the incubation of the solid phase GAG and the specimen, detection of the GAG binding protein bound to the GAG after the action fixed to the solid phase is detected. If the amount is large, it is determined that the GAG fixed to the solid phase is not degraded so much and the GAGase activity in the specimen is low. On the contrary, if the detected amount of the GAG-binding protein bound to the GAG after the action fixed to the solid phase is small, the GAG fixed to the solid phase is well decomposed and the GAGase activity in the sample is high. It is determined.
When a GAG-binding protein that recognizes a degradation product of GAG by lyase or the like is used, if the detected amount of the GAG-binding protein bonded to the GAG after the action is fixed to the solid phase, it is fixed to the solid phase. It is determined that the GAG that has been degraded is high and the GAGase activity in the sample is high. On the other hand, if the detected amount of the GAG-binding protein bound to the solid phase GAG is small, it is determined that the GAG fixed to the solid phase is not degraded so much and the GAGase activity in the sample is low. The detection of the GAG-binding protein bound to “GAG after the action” fixed to the solid phase may be performed using an antibody that specifically reacts with the GAG-binding protein, and in step (B) When a GAG-binding protein labeled with a labeling substance is used, a person skilled in the art can appropriately select a detection method according to the labeling substance used.
例えば、標識物質としてビオチンを使用した場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとストレプトアビジンとを結合させ、次いでストレプトアビジン等に結合した酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光、発光、放射能等を測定する方法等が挙げられる。 For example, when biotin is used as the labeling substance, an enzyme (eg, peroxidase) to which streptavidin or the like is bound is added to bind biotin and streptavidin, and then the substrate of the enzyme bound to streptavidin or the like Examples include a method of adding a chromogenic substrate and measuring the degree of color development of the product by the enzyme reaction by a change in absorbance. Moreover, when using a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a radioactive substance, etc., the method etc. which measure the fluorescence of the solution after reaction, light emission, a radioactivity, etc. are mentioned.
本発明方法において、検体中のＧＡＧａｓｅ活性は、予め既知活性のＧＡＧａｓｅ標準液を用いてＧＡＧａｓｅ活性と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線や関係式等を作成しておき、未知活性の検体についての検出結果と前記検量線や関係式等とを用いることにより求めることができる。 In the method of the present invention, a GAGase activity in a sample is prepared in advance using a standard GAGase standard solution having a known activity, a calibration curve, a relational expression, etc. regarding the relationship between the GAGase activity and the detection result (for example, absorbance) of the labeled substance It can be determined by using the detection result of the unknown activity sample, the calibration curve, the relational expression, and the like.
また、ＧＡＧａｓｅの活性の値として、ＧＡＧａｓｅの活性の常用対数値を用いてもよい。したがって、「ＧＡＧａｓｅの活性の常用対数値」と標識物質の検出結果との関係について検量線や関係式等を作成してもよい。 In addition, a common logarithmic value of GAGase activity may be used as the value of GAGase activity. Therefore, a calibration curve, a relational expression, or the like may be created for the relationship between the “common logarithm of GAGase activity” and the detection result of the labeling substance.
また、測定の対象とするＧＡＧａｓｅ活性は、ＧＡＧａｓｅの濃度であってもよい。したがって、本発明における「活性測定」の語には、純然たる「活性」の測定のみならず、濃度の測定も含まれる。
＜２＞本発明キット
本発明活性測定キットは、下記構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む、ＧＡＧａｓｅの活性測定キットである。
構成成分（ａ）：「担体が結合したＧＡＧ」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：ＧＡＧ結合性蛋白質。
Further, the GAGase activity to be measured may be the concentration of GAGase. Accordingly, the term “activity measurement” in the present invention includes not only pure “activity” measurement but also concentration measurement.
<2> Invention Kit The activity measurement kit of the present invention is a GAGase activity measurement kit including at least the following components (a) and (b).
Component (a): a solid phase to which “carrier-bound GAG” is fixed.
Component (b): GAG-binding protein.
（ａ）の固相及び（ｂ）の蛋白質についての説明は、前記の＜１＞本発明方法と同様である。 The explanation of the solid phase of (a) and the protein of (b) is the same as in <1> the method of the present invention.
本発明活性測定キットは、上記の構成成分（ａ）及び（ｂ）を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式等の作成のための標準となる既知活性のＧＡＧａｓｅ標準品、標識物質の検出試薬、ＧＡＧ結合性蛋白質を標識する試薬、あるいはＧＡＧ結合性蛋白質を検出する試薬（標識された、当該蛋白質に対する抗体等）等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、前記ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。 The activity measurement kit of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least the components (a) and (b) described above, and further, a GAGase standard product of known activity that becomes a standard for preparing a calibration curve, a relational expression, A reagent for detecting a labeling substance, a reagent for labeling a GAG-binding protein, a reagent for detecting a GAG-binding protein (labeled antibody against the protein, etc.) and the like can be added as a constituent component. In addition to these components, the blocking substance, washing solution, specimen dilution solution, enzyme reaction stop solution, and the like may be included.
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。 These components can be stored in separate containers and stored as a kit that can be used according to the method of the present invention at the time of use.
本発明キットを用いたＧＡＧａｓｅの測定は、前記＜１＞の本発明方法に従って行うことができる。 The measurement of GAGase using the kit of the present invention can be performed according to the method of the present invention <1>.
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
＜１＞材料・試薬等
・ＨＡ：以下の３種類のＨＡを使用した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
<1> Materials, Reagents, etc. HA: The following three types of HA were used.
鶏冠由来のＨＡ（１）：重量平均分子量約９０万のヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業株式会社製）
鶏冠由来のＨＡ（２）：重量平均分子量約９０万のヒアルロン酸ナトリウム（商品名：アルツ（登録商標）、生化学工業株式会社製）
ブタ皮由来のＨＡ：重量平均分子量約４万〜６万のヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業株式会社製）
・ＨＡａｓｅ：ウシ睾丸由来のＨＡａｓｅ（生化学工業株式会社製）
・ＥＤＣ溶液：ＥＤＣを０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液に溶解して１００ ｍｇ/ｍｌとなるように調製した。
・ＭＥＳ溶液：２．１ｇのＭＥＳを１００ ｍｌの蒸留水に溶解し、５Ｍの水酸化カリウムでｐＨ ５．５にした後、これを０．２２ μｍ 孔径のフィルター（コーニング社製）を用いて濾過滅菌した。
＜２＞方法と結果
（１）ＢＳＡが結合したＨＡ（ＢＳＡ結合ＨＡ）の調製
１０ｍｇ／ｍｌのＨＡ（鶏冠由来のＨＡ（２））を０．１ Ｍ ＭＥＳ溶液で調製した。このＨＡ溶液 １ ｍｌに、１０ｍｇ/ｍｌ ＢＳＡ溶液（プロテアーゼを含まないもの；生化学工業株式会社製）０．５ｍｌ、ＥＤＣ溶液 ５０μｌを加え、常温（１５〜２５℃）で２４時間反応させ、ＢＳＡ結合ＨＡの溶液を得た。
（２）ＢＳＡ結合ＨＡが固着された９６ウェルプレートの調製
９６ウェルプレート（Nalgenunc社製）の各ウェルに、ＰＢＳを用いてＢＳＡ結合ＨＡ中のＢＳＡ濃度として１０μｇ/ｍｌとなるように調製したＢＳＡ結合ＨＡ（鶏冠由来のＨＡ（２））溶液を５０μｌ加えた。これを４℃で一晩静置した。溶液を除去した後に、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで２回リンスした。各ウェルにブロッキング液（２％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を２００μｌずつ加え、室温で２時間静置した。その後ブロッキング液を除去し、乾燥庫で２〜３時間静置した。
（３）ＨＡａｓｅの活性測定
５０ ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ ６）/１５０ ｍＭ 塩化ナトリウム溶液にＨＡａｓｅを加え、ＨＡａｓｅ活性が１００Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、１Ｕ／ｍｌとなるように混合溶液を調製し、これらを検体とした。上記プレートのウェルを１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回リンスし、この溶液を除いた後、この検体１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートして反応させた。反応溶液を除去した後、プレートのウェルを、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ １００ μｌで２回リンスした。
HA derived from chicken crown (1): Sodium hyaluronate having a weight average molecular weight of about 900,000 (manufactured by Seikagaku Corporation)
HA derived from chicken crown (2): Sodium hyaluronate having a weight average molecular weight of about 900,000 (trade name: Alz (registered trademark), manufactured by Seikagaku Corporation)
HA derived from pig skin: sodium hyaluronate having a weight average molecular weight of about 40,000 to 60,000 (manufactured by Seikagaku Corporation)
・ HAase: HAase (made by Seikagaku Corporation)
-EDC solution: EDC was dissolved in a 0.1 M MES solution to prepare 100 mg / ml.
MES solution: 2.1 g of MES was dissolved in 100 ml of distilled water, adjusted to pH 5.5 with 5 M potassium hydroxide, and then used with a 0.22 μm pore size filter (manufactured by Corning). Filter sterilized.
<2> Method and Results (1) Preparation of HA with BSA (BSA-binding HA) 10 mg / ml HA (HA (2) derived from chicken crown) was prepared with a 0.1 M MES solution. To 1 ml of this HA solution, 0.5 ml of a 10 mg / ml BSA solution (without protease; manufactured by Seikagaku Corporation) and 50 μl of EDC solution are added and reacted at room temperature (15-25 ° C.) for 24 hours. A solution of bound HA was obtained.
(2) Preparation of 96-well plate to which BSA-bound HA was fixed BSA prepared in each well of a 96-well plate (manufactured by Nalgenunc) using PBS so that the BSA concentration in BSA-bound HA was 10 μg / ml. 50 μl of the bound HA (cob-derived HA (2)) solution was added. This was left at 4 ° C. overnight. After removing the solution, each well was rinsed twice with 200 μl PBS. 200 μl of blocking solution (2% BSA / PBS) was added to each well and allowed to stand at room temperature for 2 hours. Thereafter, the blocking solution was removed, and the mixture was allowed to stand for 2 to 3 hours in a drying cabinet.
(3) Measurement of HAase activity HAase was added to a 50 mM sodium acetate (pH 6) / 150 mM sodium chloride solution, and a mixed solution was prepared so that the HAase activity was 100 U / ml, 10 U / ml, 1 U / ml, These were used as specimens. The wells of the plate were rinsed twice with PBS containing 1% BSA, and after removing this solution, 100 μl of this specimen was added to each well and incubated at 37 ° C. for 4 hours for reaction. After removing the reaction solution, the wells of the plate were rinsed twice with 100 μl of PBS containing 1% BSA.
上記反応後のプレートの各ウェルに、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで希釈した「ビオチン標識されたＨＡ結合性蛋白質」（ビオチン標識ＨＡバインディングプロテイン；生化学工業株式会社製）の溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートして反応させた。反応後の上清を完全に除去し、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回リンスした。 A solution of “biotin-labeled HA binding protein” (biotin-labeled HA binding protein; manufactured by Seikagaku Corporation) diluted with PBS containing 1% BSA was added to each well of the plate after the reaction, and 37 The reaction was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. The supernatant after the reaction was completely removed and rinsed twice with PBS containing 1% BSA.
各ウェルに、ＰＢＳで溶解した「アビジン標識されたＨＲＰ」（Vector社製）溶液（１％ＢＳＡを含有する）１００ μl（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。上清を除去し、各ウェルをＰＢＳで２回リンスした。各ウェルにＴＭＢ １００ μlを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。各ウェルに１Ｍの塩酸を１００ μl添加した後、４５０ ｎｍにおける吸光度（対照波長（６３０ ｎｍ）における吸光度の測定値で補正したもの）を測定した。ＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図１に示す。 To each well, 100 μl (1 μg / ml) of an “avidin-labeled HRP” (Vector) solution (containing 1% BSA) dissolved in PBS was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The supernatant was removed and each well rinsed twice with PBS. 100 μl of TMB was added to each well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After adding 100 μl of 1M hydrochloric acid to each well, the absorbance at 450 nm (corrected by the measured absorbance at the control wavelength (630 nm)) was measured. The relationship between the HAase activity and the absorbance at 450 nm is shown in FIG.
また、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図２に示す。なお、図２中の小さなグラフは、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値が−２〜０の範囲における直線性及びその相関係数を示すものである。 Moreover, the relationship between the common logarithm value of HAase activity and the light absorbency in 450 nm is shown in FIG. In addition, the small graph in FIG. 2 shows the linearity in the range whose common logarithm value of HAase activity is -2 to 0, and its correlation coefficient.
この結果から、少なくともＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との間に一定の相関があることが示された。さらに、少なくとも当該常用対数値が−２〜０の範囲においては両者の相関に直線性がみられ、その相関係数は０．９９と非常に高かった。このことから、本発明方法によってＨＡａｓｅの活性を簡便、迅速かつ高感度に、定量性良く測定できることが示された。
（４）再現性の確認と、他のＨＡを用いた場合の結果
再現性を確認するために、鶏冠由来のＨＡ（２）を用いて前記（１）〜（３）と同様に再度実験を行った。
From this result, it was shown that there is a certain correlation between at least the common logarithm of HAase activity and the absorbance at 450 nm. Furthermore, at least when the common logarithmic value was in the range of −2 to 0, the correlation between the two was linear, and the correlation coefficient was as high as 0.99. From this, it was shown that the activity of HAase can be measured easily, rapidly, with high sensitivity and with high quantitativeness by the method of the present invention.
(4) Confirmation of reproducibility and results when other HA is used In order to confirm reproducibility, experiments were performed again in the same manner as in (1) to (3) above using HA derived from chicken crown (2). went.
また、鶏冠由来のＨＡ（２）に代えて、鶏冠由来のＨＡ（１）及びブタ皮由来のＨＡを用いて、前記（１）〜（３）と同様に実験を行った。これらそれぞれのＨＡを用いた場合のＨＡａｓｅ活性と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図３に示す。 Moreover, it replaced with HA (2) derived from a chicken crown, and experimented similarly to said (1)-(3) using HA (1) derived from a chicken crown, and HA derived from a pig skin. FIG. 3 shows the relationship between the HAase activity and the absorbance at 450 nm when each of these HAs is used.
また、これらそれぞれについてのＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との関係を図４に示す。なお図３及び図４中、黒丸印は鶏冠由来のＨＡ（１）を、黒四角印は鶏冠由来のＨＡ（２）を、黒菱形印はブタ皮由来のＨＡをそれぞれ用いた時の結果を示す。 Moreover, the relationship between the common logarithm value of HAase activity about each of these and the light absorbency in 450 nm is shown in FIG. 3 and 4, the black circles indicate the results obtained when the chicken crown-derived HA (1) is used, the black squares indicate the results obtained when the chicken crown-derived HA (2) is used, and the black diamonds indicate the results obtained when the pig skin-derived HA is used. Show.
鶏冠由来のＨＡ（２）を用いた場合、前記と同様の結果が得られた。このことから、本発明方法の高い再現性が確認された。 When HA (2) derived from chicken crown was used, the same result as described above was obtained. From this, the high reproducibility of the method of the present invention was confirmed.
また、鶏冠由来のＨＡ（２）以外のＨＡを用いた場合でも、ＨＡａｓｅ活性の常用対数値と４５０ｎｍにおける吸光度との間に一定の相関があり、両者の相関に直線性が認められることが示された。 In addition, even when HA other than chicken crown-derived HA (2) is used, there is a certain correlation between the common logarithm of the HAase activity and the absorbance at 450 nm, indicating that the correlation between the two is linear. It was done.
これらの結果から、本発明方法によってＧＡＧａｓｅの活性を簡便、迅速かつ高感度に、再現性・定量性良く測定できることが示された。 From these results, it was shown that the activity of GAGase can be measured easily, quickly and with high sensitivity and good reproducibility and quantitativeness by the method of the present invention.
本発明方法は、ＧＡＧａｓｅの簡便、迅速、高感度な活性測定に利用することができる。また本発明キットは、ＧＡＧａｓｅのより簡便かつ迅速な活性測定に利用することができる。 The method of the present invention can be used for GAGase simple, rapid and highly sensitive activity measurement. In addition, the kit of the present invention can be used for easier and faster activity measurement of GAGase.
Claims (8)
ステップ（Ａ）：「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相に検体を接触させ、当該グリコサミノグリカンに検体中のグリコサミノグリカン分解酵素を作用させるステップ。
ステップ（Ｂ）：固相に固着されている前記作用後のグリコサミノグリカンに、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させるステップ。
ステップ（Ｃ）：前記作用後のグリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出するステップ。 A method for measuring the activity of a glycosaminoglycan degrading enzyme in a specimen, comprising at least the following steps (A) to (C).
Step (A): A step in which a specimen is brought into contact with a solid phase to which “a carrier-bound glycosaminoglycan” is fixed, and the glycosaminoglycan-degrading enzyme in the specimen is allowed to act on the glycosaminoglycan.
Step (B): A step of bringing a glycosaminoglycan-binding protein into contact with the glycosaminoglycan after the action, which is fixed to a solid phase.
Step (C): detecting the glycosaminoglycan-binding protein bound to the glycosaminoglycan after the action.
構成成分（ａ）：「担体が結合したグリコサミノグリカン」が固着された固相。
構成成分（ｂ）：グリコサミノグリカン結合性蛋白質。 A kit for measuring the activity of a glycosaminoglycan degrading enzyme, comprising at least the following components (a) and (b).
Component (a): a solid phase on which “a glycosaminoglycan to which a carrier is bound” is fixed.
Component (b): glycosaminoglycan binding protein.
The activity measurement kit according to any one of claims 5 to 7, wherein the glycosaminoglycan is hyaluronic acid.
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| JP2000097940A (en) * | 1998-09-22 | 2000-04-07 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Method and kit for measuring glycosaminoglycan |
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2004
- 2004-05-19 JP JP2004149800A patent/JP2005328752A/en active Pending
Patent Citations (2)
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