JP2005283568A - Emission light detection system for minute object - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、励起光を照射することで蛍光ないし燐光という形で微小対象物から放出される当該放出光を高感度に検出する装置に関し、特に当該微小対象物がバイオ化学分析における色素や半導体量子ドット、ないしは色素あるいは半導体量子ドットで標識された微小サンプルであるような場合に好適な微小対象物放出光検出装置に関する。 The present invention relates to an apparatus for highly sensitively detecting the emitted light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence by irradiating excitation light, and in particular, the micro object is a dye or a semiconductor quantum in biochemical analysis. The present invention relates to a minute object emission light detection device suitable for a minute sample labeled with a dot or a dye or a semiconductor quantum dot.
例えば核酸、アミノ酸、蛋白質等、種々なバイオ化学分析において採られる分析手法の一つに、電気泳動法がある。最近では特に、ナノリッタからピコリッタにも及ぶような微小量の溶液サンプルを用いれば足り、これを適当な色素で標識し、コンパクトな電気泳動チップ上で当該サンプルに励起光を照射し、これにより色素の発生する蛍光を分析処理する装置が提案された。本発明者等においても、こうした装置に関し、これまでに下記特許文献１、非特許文献１に開示されているような装置的、方法的工夫を種々、施してきた。
図10(A),(B)には、上記特許文献１、非特許文献１により本発明者等が開示した従来装置の一例が示されているので、これに基づき説明を始めると、まず、図10(A) に示すように、分析用サンプルを収容、載持するチップ10があり、このチップ10には互いに平面的に交差する微細幅のチャネル(溝)15，16が設けられている。一方の溝15は注入チャネル15と呼ばれ、その一端に溶液状のサンプルを入れる井戸状の液溜めであるサンプルリザーバ11が、他端には注入チャネル15を介して流れ出てきたサンプルを受け止める液溜めであるウエイスト（waste)リザーバ12が設けられている。この注入チャネルと交差するもう一方の溝16は分離チャネル16と呼ばれ、その一端側には後述のように電圧を印加する関係で陰極リザーバ13と呼ばれる液溜め13が、他端には陽極リザーバ14と呼ばれる液溜め14が設けられている。各リザーバ11〜14には、それぞれ後述のタイミングで予め決められた電圧を印加するために、図示していないが例えば薄膜状の電極が設けられているか、あるいは針状等の電極が挿入される。なお、溝15，16は、一般には図示のように互いに直交し、平面的に見るとそれらの溝15，16により十字形状が形成される。 FIGS. 10A and 10B show an example of a conventional device disclosed by the present inventors in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, and when the description is started based on this, As shown in FIG. 10 (A), there is a chip 10 that accommodates and carries a sample for analysis, and this chip 10 is provided with channels (grooves) 15 and 16 having fine widths that intersect each other in a plane. . One groove 15 is called an injection channel 15, and a sample reservoir 11, which is a well-like reservoir for storing a solution-like sample at one end thereof, receives a sample that has flowed out through the injection channel 15 at the other end. A waste reservoir 12 is provided as a reservoir. The other groove 16 intersecting with the injection channel is called a separation channel 16, and a liquid reservoir 13 called a cathode reservoir 13 is connected to one end of the channel 16 as described later, and an anode reservoir is connected to the other end. A liquid reservoir 14 called 14 is provided. Although not shown, for example, a thin film electrode or a needle-like electrode is inserted into each of the reservoirs 11 to 14 in order to apply a predetermined voltage at a later-described timing. . The grooves 15 and 16 are generally orthogonal to each other as shown in the figure, and when viewed in plan, the grooves 15 and 16 form a cross shape.
しかるに、サンプルリザーバ11にサンプルを注入した後、サンプルリザーバ11とウエイストリザーバ12の間に適当な電圧を印加すると、当該サンプルは注入チャンネル15内を泳動して行く。この時、陰極リザーバ13、陽極リザーバ14は電位的にフローティングにするか、それらの間に適当なバイアス電圧を印加しておく。適当な時間が経過した後に（通常は10〜60秒程度）電圧を切り替え、陰極リザーバ13と陽極リザーバ14との間に適当なる電圧を印加すると、丁度その時に分離チャンネル16との交差点に至っていたサンプルの一部分（サンプルプラグと呼ばれる）が切り出され、当該分離チャネル16内において電気泳動を開始する。なお、この際には、注入チャンネル15に残ったサンプルが分離チャンネル16に流入しないように、サンプルリザーバ11とウエイストリザーバ12の間に適当なバイアス電圧を印加する。 However, after injecting the sample into the sample reservoir 11 and applying an appropriate voltage between the sample reservoir 11 and the waste reservoir 12, the sample migrates in the injection channel 15. At this time, the cathode reservoir 13 and the anode reservoir 14 are floated in potential, or an appropriate bias voltage is applied between them. After an appropriate time has elapsed (usually about 10 to 60 seconds), the voltage was switched and an appropriate voltage was applied between the cathode reservoir 13 and the anode reservoir 14, and at that time, an intersection with the separation channel 16 was reached. A portion of the sample (referred to as a sample plug) is cut out and electrophoresis begins in the separation channel 16. At this time, an appropriate bias voltage is applied between the sample reservoir 11 and the waste reservoir 12 so that the sample remaining in the injection channel 15 does not flow into the separation channel 16.
最近の半導体微細加工技術を利用すると、各チャネル15，16は精度良く極めて微細な幅に加工でき、従って当該チャネル幅（一般に数十μm)に相当する短いサンプルプラグを生成することができる。チップ10は少なくとも励起光や蛍光の波長に対して極力高い光透過性を有し、かつ、電気泳動に好適な絶縁性も有する必要があるため、実際には二枚のガラス板の貼り合せで作られることが多い。一枚のガラス板10aに各チャネル15，16をリソグラフィ形成（場合により機械的に形成されることもある）した後に、チャネル15，16を上から塞ぎ、かつ、各リザーバ11〜14を形成する縦穴の穿たれたもう一枚のガラス板10b
を熱溶着等により接着する。ガラス基板に代えてプラスチック材料が用いられることもあり、熱溶着、超音波接着、接着剤の援用等により二枚の板部材の結合が図られる。予め述べておくと、この部分の構造に関しては本発明は特段の規定を施さない。分析に適当なる構造のものであれば良く、もちろん、既存のもので構わない。
Using recent semiconductor microfabrication technology, each of the channels 15 and 16 can be processed to a very fine width with high accuracy, and thus a short sample plug corresponding to the channel width (generally several tens of μm) can be generated. Since the chip 10 must have at least as high a light transmittance as possible with respect to the wavelength of excitation light or fluorescence and also have an insulating property suitable for electrophoresis, in practice, the two glass plates are bonded together. Often made. After the channels 15 and 16 are lithographically formed (sometimes mechanically formed) on a single glass plate 10a, the channels 15 and 16 are closed from above and the reservoirs 11 to 14 are formed. Another glass plate 10b with a vertical hole
Are bonded by heat welding or the like. A plastic material may be used in place of the glass substrate, and the two plate members can be joined by heat welding, ultrasonic bonding, the use of an adhesive, or the like. If it says beforehand, this invention does not give special prescription | regulation regarding the structure of this part. Any structure that is suitable for analysis may be used, and of course, an existing structure may be used.
いずれにしても、既存の製造技術でも既に極く短いサンプルプラグを得ることはできるので、最近では短いチャネル長で高い理論段数の電気泳動分離が可能となっているとは言える。分離チャネル16内を泳動するサンプルは、既述したように適当な色素で予め標識されているので、励起光Leにより光照射されると、それとは波長の異なる光、一般的には、蛍光を放出する。そのため、標識されたサンプルプラグが分離チャンネル16中を泳動する中に、大きさや電荷等の違いによって分離されて検出領域Poに到達し、そこで励起光Leの照射を受けた結果として放出した蛍光の強度を、当該サンプルプラグが当該検出領域Poにまで到達するに要した時間に対してプロットすると、各サンプルプラグごとに固有の、いわゆる電気泳動データ（Electropherogram)が得られる。 In any case, it is possible to obtain an extremely short sample plug with the existing manufacturing technology, and it can be said that electrophoretic separation with a high theoretical plate number is possible with a short channel length recently. The sample that migrates in the separation channel 16 is pre-labeled with an appropriate dye as described above, and therefore, when irradiated with the excitation light Le, light having a wavelength different from that, generally fluorescence is emitted. discharge. Therefore, while the labeled sample plug migrates through the separation channel 16, it is separated by the difference in size, charge, etc., and reaches the detection region Po, where the fluorescence emitted as a result of irradiation with the excitation light Le is emitted. When the intensity is plotted with respect to the time required for the sample plug to reach the detection region Po, so-called electrophoresis data (Electropherogram) unique to each sample plug is obtained.
図10(B)には、こうした蛍光を検出する蛍光検出部40の従来構造例が示されている。説明すると、まず、蛍光を検出する半導体光検出素子20がある。これは図示の断面でみると左右一対あるように見える。しかし、実際には例えば平面的に見るとドーナッツ状をなしており、真ん中の透孔41(一般にピンホール状)を介し、サンプルを照射する励起光Leが通される。この励起光Leが光透過性のチップ10に入射し、図10(A)に示した検出領域Poにおいて分離チャネル16内のサンプルを照射すると、当該サンプルから蛍光Lfが発せられる。そして、この蛍光Lfが、蛍光収集用のマイクロレンズ61により望ましくは略々平行化された後、半導体光検出素子20の入射面側に設けられている光学フィルタ50に入射する。光学フィルタ50は通常、石英ガラス52の一表面側にコーティング形成された光学干渉フィルタとして構成され、散乱されて来る励起光Leをできるだけ除去し、蛍光Lfのみを半導体光検出素子20に入射させるために、蛍光Lfの選択透過性を持つ。蛍光収集用マイクロレンズ61は、鋳型成型等によりチップ10と一体に成型することもできるし、あるいは一部仮想線で示すように、専用の基板61’に形成し、これをチップ10の裏面に貼着することで設けることもできる。 FIG. 10B shows an example of a conventional structure of the fluorescence detection unit 40 that detects such fluorescence. To explain, first, there is a semiconductor photodetecting element 20 that detects fluorescence. This appears to be a pair of left and right when viewed in the cross section shown. However, actually, for example, when viewed in a plan view, it has a donut shape, and excitation light Le for irradiating the sample is passed through the central through hole 41 (generally a pinhole shape). When this excitation light Le enters the light-transmitting chip 10 and irradiates the sample in the separation channel 16 in the detection region Po shown in FIG. 10A, fluorescence Lf is emitted from the sample. Then, the fluorescence Lf is made substantially parallel by the microlens 61 for collecting fluorescence, and then enters the optical filter 50 provided on the incident surface side of the semiconductor photodetector 20. The optical filter 50 is usually configured as an optical interference filter coated on one surface side of the quartz glass 52, and removes the scattered excitation light Le as much as possible, so that only the fluorescence Lf is incident on the semiconductor photodetector 20. And selective permeability of fluorescent Lf. The fluorescence collecting microlens 61 can be molded integrally with the chip 10 by molding or the like, or is formed on a dedicated substrate 61 ′ as shown by a virtual line, and this is formed on the back surface of the chip 10. It can also be provided by sticking.
光学干渉フィルタ50や半導体光検出素子20の具体的構造例は既存構造のものであって良く、後に本発明の実施形態に即して説明する所を援用する（換言すれば、本発明はそうした部材50，20の基本的な構造自体には改変を施すものではない）が、半導体光検出素子20は、上記した特許文献１，非特許文献１に開示されているように、望ましくは水素化アモルファスシリコン(a-Si:H)を用いて作製されたフォトダイオードとされる。電気泳動法を援用する場合に限らずとも、a-Si:Hフォトダイオードは下記に列挙するように、種々望ましい特徴を備えているからである。 Specific structural examples of the optical interference filter 50 and the semiconductor photodetecting element 20 may be those of an existing structure, and a place that will be described later in accordance with an embodiment of the present invention is incorporated (in other words, the present invention is such a case). Although the basic structure itself of the members 50 and 20 is not modified), the semiconductor photodetector 20 is preferably hydrogenated as disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 described above. The photodiode is made using amorphous silicon (a-Si: H). This is because the a-Si: H photodiode has various desirable characteristics as listed below, not only when the electrophoresis method is used.
1）バイオ化学分析に有用な色素（例えばFluorescein、Green Fluorescence Protein、TOTO、Ethidium Bromide）の蛍光帯は可視光領域にあり、この領域でa-Si:Hの吸収係数が高い。
2）暗電流が結晶シリコンに比べて数桁低いため、冷却の必要がなく、小型化に有利である。
3）半導体微細加工技術によるパターン形成が可能であって、容易に検出器アレイが作製できる。
4）要すればプラズマ化学気相成長法により安価なガラスやプラスチック基板上に直接形成できるため、大量生産性に優れ、低コスト化が容易である。
1) The fluorescence band of dyes useful for biochemical analysis (for example, Fluorescein, Green Fluorescence Protein, TOTO, Ethidium Bromide) is in the visible light region, and the absorption coefficient of a-Si: H is high in this region.
2) Since the dark current is several orders of magnitude lower than that of crystalline silicon, there is no need for cooling, which is advantageous for downsizing.
3) Patterns can be formed by semiconductor microfabrication technology, and detector arrays can be easily manufactured.
4) Since it can be directly formed on inexpensive glass or plastic substrates by plasma enhanced chemical vapor deposition, it is excellent in mass productivity and easy to reduce costs.
本発明者等は、上記非特許文献１に開示のように、実際に集積型a-Si:Hフォトダイオードを作製し、励起光源としてアルゴンイオンレーザ(488nm)を用いて実験を行った所、その検出限界はFluorescein濃度で17nMであった。これは、これまで報告されていた数例のこの種蛍光検出装置の中で最も優れた検出感度を示すもので、現にマイクロ流体DNA断片解析、アミノ酸鏡像異性体解析等に成功している。 As disclosed in Non-Patent Document 1 above, the present inventors actually fabricated an integrated a-Si: H photodiode and conducted an experiment using an argon ion laser (488 nm) as an excitation light source. The detection limit was 17 nM at the Fluorescein concentration. This shows the best detection sensitivity among several examples of this kind of fluorescence detection apparatus reported so far, and has succeeded in microfluidic DNA fragment analysis, amino acid enantiomer analysis and the like.
ここで少し一般的な話に戻ると、こうした蛍光検出装置で達成すべき最終目標は、いわゆるラボ・オン・チップ、ないしMicro Total Analysis System (=μTAS)の実現である。すなわち、全ての分析プロセスに必要な素子、装置系を単一のチップ上に搭載させ、しかも、そのチップを小型化することで、“現場（point-of-care）”分析を可能にすることである。上記特許文献１や非特許文献１が開示される以前の実情でも、確かに蛍光検出分析方法の概念は確立したものがあり、実際にもマイクロ流体電気泳動の場合、96から384チャネルを用いた高速遺伝子判別が行われていた。また、マイクロ流体バルブやポンプが提案され、微小流体の大規模な並列操作が可能になってきてもいたし、このようなマイクロ流体バルブやポンプを用いた、マイクロ流体細胞ソータ（Sorter）や大規模集積された微小チャンバの中で、蛋白質結晶化の条件がコンビナトリアル最適化できるようにもなってきていた。 Here, returning to a little general story, the ultimate goal to be achieved with such a fluorescence detection device is the realization of a so-called lab-on-chip or Micro Total Analysis System (= μTAS). In other words, it is possible to perform “point-of-care” analysis by mounting the elements and equipment necessary for all analysis processes on a single chip and miniaturizing the chip. It is. Even in the actual situation before the disclosure of Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, the concept of the fluorescence detection analysis method is certainly established, and in the case of microfluidic electrophoresis, 96 to 384 channels were actually used. High-speed gene discrimination was performed. Microfluidic valves and pumps have also been proposed, and it has become possible to operate microfluids in parallel on a large scale. Using such microfluidic valves and pumps, microfluidic cell sorters (Sorter) and large scales In integrated microchambers, protein crystallization conditions have become combinatorially optimized.
しかし、電気泳動等における分析プロセスやサンプル前処理プロセスがマイクロチップ上に集積化、小型化され、さらに部分的には大規模集化されるようになってきていたにも拘わらず、マイクロ流体ラボ・オン・チップの高感度分析には、光電子増倍管、CCD、光学干渉フィルタ、レーザ等から構成されるレーザ誘起蛍光検出システムが使われることが殆どであって、到底、持ち運びの自由な“現場”分析に適当な装置とは言い難かった。その点、本発明者等が提案した上述の装置系によれば、“現場”で、低サンプル消費、かつ、高速なバイオ化学分析が可能となる礎が築かれた。従って、これを発展させて、ラボ・オン・チップを構築、実現できれば、いわゆるバイオテロを蒙ったときの病原菌の検出や同定、遺伝病の判定、ストレス・モニタ等を即時性を持って行うに十分有用であり、大きな産業的インパクトを見込むことができる。 However, despite the fact that analysis processes and sample pretreatment processes in electrophoresis etc. have been integrated and miniaturized on a microchip, and partly on a large scale, the microfluidic laboratory・ For on-chip high-sensitivity analysis, laser-induced fluorescence detection systems composed of photomultiplier tubes, CCDs, optical interference filters, lasers, etc. are mostly used. It was hard to say that it was a suitable device for on-site analysis. In that respect, the above-described apparatus system proposed by the present inventors has laid the foundation for enabling low-sample consumption and high-speed biochemical analysis “on-site”. Therefore, if this can be developed and a lab-on-chip can be constructed and realized, it is sufficient to detect and identify pathogens in the event of so-called bioterrorism, determine genetic diseases, and monitor stress with immediacy. It is useful and can have a big industrial impact.
ところが、ここで一番、問題になってきたのが、励起光源の選択自由度の乏しさや検出感度の不十分さである。例えば既述の通り、上記非特許文献１ではアルゴンイオンレーザを用いていたが、これでは究極的な検出系の一体化、小型化は望めない。ただ、これを例えば、既に市販されているSHG(Second Harmonic Generation）素子を用いた青緑光半導体レーザ（例えばNovalux社Protera488、Coherent社Sapphire等)に置き換えれば、光源まで含めての小型化も可能なため、一応、“現場”マイクロ流体ラボ・オン・チップに必要なコンパクトな蛍光検出システムを実現できるかのように思われる。実際、これで十分なバイオ化学分析も多い。 However, the biggest problems here are the lack of flexibility in selecting the excitation light source and the insufficient detection sensitivity. For example, as described above, the non-patent document 1 uses an argon ion laser, but with this, the ultimate detection system integration and miniaturization cannot be expected. However, if this is replaced with a blue-green semiconductor laser (for example, Novalux Protera488, Coherent Sapphire, etc.) using a commercially available SHG (Second Harmonic Generation) element, it is possible to reduce the size including the light source. Therefore, it seems that the compact fluorescence detection system necessary for “on-site” microfluidic lab-on-chip can be realized. In fact, this is often sufficient for biochemical analysis.
が、しかし、DNAや蛋白質の分析等、様々な局面で、より高感度な検出技術が求められているのも事実で、実際にはさらに一桁以上、検出限界を下げることが要求されている。集積型a-Si:H光検出素子を用いた場合、上記のようなレーザ光源を用いると、そのレーザ散乱光によるバックグランド光電流が高く、ノイズレベルが検出限界を決めている。これは、集積型蛍光検出装置に共通する課題である。 However, it is also true that more sensitive detection technology is required in various aspects such as DNA and protein analysis, and in fact, it is required to lower the detection limit by an order of magnitude or more. . When an integrated a-Si: H photodetection element is used, if the above laser light source is used, the background photocurrent due to the laser scattered light is high, and the noise level determines the detection limit. This is a problem common to integrated fluorescence detection devices.
一方、多重度の高いバイオ分析を実現するには、アレイ化が容易で、生産性に優れた面発光レーザとの集積化が実用的であると考えられる。しかし、この点については、既述した特許文献１、非特許文献１では詳しく考察を施していない。そこで例えば、用い得る面発光レーザとして、あえて候補を挙げてみると、バイオ化学分析に適した発振波長範囲の青緑光面発光レーザとして、ZnSe系材料により構築されたものがある。しかしこれは、極低温77Kでのレーザ発振であり、さらに、ZnSe系材料はイオン性が高いために、一般的に短寿命である。到底、実用的な素子とはなり得ない。 On the other hand, in order to realize bioanalysis with a high degree of multiplicity, it is considered practical to integrate with a surface emitting laser that can be easily arrayed and has excellent productivity. However, this point has not been considered in detail in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 described above. Thus, for example, as surface emitting lasers that can be used, there are those constructed from ZnSe-based materials as blue-green surface emitting lasers having an oscillation wavelength range suitable for biochemical analysis. However, this is a laser oscillation at a cryogenic temperature of 77 K, and furthermore, ZnSe-based materials have a high ionicity, and thus generally have a short life. It cannot be a practical element at all.
青色LED(発光ダイオード)や青紫色レーザでよく知られたGaN系材料ならば、光励起面発光レーザが報告されてはいる。が、電流注入型はレーザ共振器を構成するために一般的に用いられる分布ブラッグ反射(Distributed Bragg Reflection：DBR)ミラーやＰ層の低抵抗化等に技術的な課題があるし、発振波長的にも問題がある。現在、電流注入型で信頼性の高い面発光レーザの中で、最も短波長な光を発振できるのはGaInAlP-GaAs面発光レーザの650nm程度であるが、これでは効率よく励起できる色素が限定されてしまい、ここで述べているようなバイオ化学分析に有用な色素は励起できない。 For GaN-based materials well known for blue LEDs (light emitting diodes) and blue-violet lasers, photoexcited surface emitting lasers have been reported. However, the current injection type has technical problems in reducing the resistance of the distributed Bragg reflection (DBR) mirror and the P layer, which are generally used to construct a laser resonator, and the oscillation wavelength There is also a problem. Currently, the shortest wavelength light among the current injection type and highly reliable surface-emitting lasers can oscillate at about 650 nm of the GaInAlP-GaAs surface-emitting laser, but this limits the dyes that can be excited efficiently. Thus, dyes useful for biochemical analysis as described here cannot be excited.
面発光レーザを用いるという点だけに着目するのであれば、下記非特許文献２に開示されているように、AlGaAs面発光レーザを用い、光学干渉フィルタ、GaAsフォトダイオードをGaAs基板上にモノリシックに集積化した蛍光検出装置もある。ここでは光学干渉フィルタにはGaAs系面発光レーザの分布ブラッグ反射ミラーを用いており、すべてGaAs系材料で構成されている。従って、既に成熟しているGaAs系面発光レーザの製造技術と全く同じ技術で生産できるという利点はある。また、多重度の高いバイオ化学分析にも適しているとは言える。しかし、この非特許文献２に開示されている内容では検出限界がどの程度なのか不明であり、実際、バイオ化学分析を行うには至っていない。また、GaAs系材料であるので、レーザの発振波長はやはり近赤外領域にあり（773nm)、原理的にレーリー散乱が低いという利点があるものの、FluoresceinやGreen Fluorescence Protein、TOTO等のようなバイオ化学分析に有用な色素を励起することはできない波長である。
本発明はこのような現状に鑑みてなされたもので、励起光源の発する励起光波長上の制約から解放して、すなわち、用い得る励起光源の選択自由度を増すと共に、各種バイオ化学分析で用いる色素を効果的に励起することができ、なおかつ高感度であって、また、最終的にはラボ・オン・チップを実現し得る原理構造をも提案する蛍光検出装置を提供せんとするものである。 The present invention has been made in view of such a situation, and is freed from restrictions on the wavelength of the excitation light emitted by the excitation light source, that is, increases the degree of freedom of selection of usable excitation light sources and is used in various biochemical analyses. It is intended to provide a fluorescence detection device that can effectively excite a dye, has high sensitivity, and ultimately proposes a principle structure that can realize a lab-on-chip. .
なお、上記では色素から放出される蛍光の検出に関して説明してきたが、最近では有機分子である色素に代わるバイオ化学分析の蛍光標識として、吸収スペクトルが波長的にブロードで励起光源の選択自由度がありながら、蛍光スペクトルは波長的にシャープで波長多重分析に好適であり、光劣化（Photobleaching）が小さい等の観点から半導体量子ドットも注目されている。そこで、本書冒頭において述べているように、本発明はこのような新しい蛍光標識にも対応できる装置の提供をも目標とする。さらに蛍光検出だけでなく、一般に蛍光よりも長波長側にピーク波長が位置する燐光の検出にも好適な装置を提供せんとする。従って、励起光照射により微小対象物から放出される蛍光、燐光は、総称して微小対象物からの放出光と概念する。 In the above, the detection of the fluorescence emitted from the dye has been described, but recently, as a fluorescent label for biochemical analysis in place of the dye that is an organic molecule, the absorption spectrum is broad in wavelength and the degree of freedom of selection of the excitation light source is large. However, the semiconductor quantum dots are also attracting attention from the viewpoints that the fluorescence spectrum is sharp in wavelength and suitable for wavelength multiplexing analysis, and that photobleaching is small. Therefore, as described at the beginning of this document, the present invention also aims to provide an apparatus that can cope with such a new fluorescent label. Furthermore, an apparatus suitable not only for fluorescence detection but also for phosphorescence in which the peak wavelength is generally located on the longer wavelength side than fluorescence is provided. Therefore, the fluorescence and phosphorescence emitted from the minute object by the excitation light irradiation are collectively referred to as the emitted light from the minute object.
本発明者は上記目的を達成するため、まず第一の発明として、
励起光源の発する励起光の照射を受けて微小対象物が蛍光または燐光という形で放出する放出光を半導体光検出素子により検出する微小対象物放出光検出装置であって；
励起光の光路途中に挿入され、励起光を収束し、その光強度密度を高めて微小対象物を照射させることで、当該微小対象物から二光子吸収による放出光を発生させるためのマイクロ収束レンズを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置を提案する。
In order to achieve the above object, the present inventor firstly as a first invention,
A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
A micro-converging lens that is inserted in the optical path of the excitation light, converges the excitation light, increases the light intensity density, and irradiates the minute object, thereby generating emission light by two-photon absorption from the minute object. Having
We propose a micro object emission light detection device characterized by the following.
また、第二の発明として、
励起光源の発する励起光の照射を受けて微小対象物が蛍光または燐光という形で放出する放出光を半導体光検出素子により検出する微小対象物放出光検出装置であって；
励起光の光路途中に挿入された一対のミラーから成るマイクロ共振器を有し；
当該これら一対のミラーの間に微小対象物が配置されており；
マイクロ共振器の多重反射機能により励起光の実効強度を高めた状態で当該励起光を微小対象物に照射させることで、当該微小対象物から二光子吸収による放出光を発生させること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置も提案する。
As a second invention,
A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
A microresonator comprising a pair of mirrors inserted in the optical path of the excitation light;
A micro object is disposed between the pair of mirrors;
Irradiating the micro object with the excitation light in a state where the effective intensity of the excitation light is increased by the multiple reflection function of the microresonator, thereby generating emission light by two-photon absorption from the micro object;
A micro-object emission light detection device characterized by the above is also proposed.
ここにおいて、マイクロ共振器を構成する一対のミラーは、代表的には分布ブラッグ反射ミラーであって良く、また、励起光源とマイクロ共振器の間の光路途中には、励起光を収束するマイクロ収束レンズや、これに加え、収束された励起光を平行化してマイクロ共振器に入射させる凹レンズを設けて良い。 Here, the pair of mirrors constituting the microresonator may typically be a distributed Bragg reflection mirror, and in the middle of the optical path between the excitation light source and the microresonator, the microfocusing for converging the excitation light. In addition to this, a concave lens that collimates the focused excitation light and makes it incident on the microresonator may be provided.
さらに、第三の発明として、
励起光源の発する励起光の照射を受けて微小対象物が蛍光または燐光という形で放出する放出光を半導体光検出素子により検出する微小対象物放出光検出装置であって；
励起光が照射されると短パルスレーザ発振し、瞬間的にピーク光強度を高めてから当該短パルスレーザ光を励起光として微小対象物に照射させることで、当該微小対象物から二光子吸収による放出光を発生させるQスイッチレーザを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置も提案する。
Furthermore, as a third invention,
A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
When the excitation light is radiated, a short pulse laser oscillates, and the peak light intensity is instantaneously increased, and then the short object is irradiated with the short pulse laser light as the excitation light. Having a Q-switched laser that generates emitted light;
A micro-object emission light detection device characterized by the above is also proposed.
こうした第一〜第三の発明と異なり、通常の一光子吸収を利用しても上記目的を達成し得る第四の発明として、本発明者はまた、
励起光源の発する励起光の照射を受けて微小対象物が蛍光または燐光という形で放出する放出光を半導体光検出素子により検出する微小対象物放出光検出装置であって；
励起光の倍波を効率的に生成して微小対象物を照射させることで、当該微小対象物から一光子吸収による放出光を発生させるために、励起光の光路途中に設けられている共振器内に挿入されたSHG素子を有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置も提案する。
Unlike the first to third inventions, as a fourth invention that can achieve the above-described object even by utilizing ordinary one-photon absorption, the present inventor also provides:
A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
A resonator provided in the optical path of the excitation light in order to efficiently generate a double wave of the excitation light and irradiate the minute object to generate emission light by one-photon absorption from the minute object. Having a SHG element inserted in the inside;
A micro-object emission light detection device characterized by the above is also proposed.
第一〜第三の発明におけるように、二光子吸収を利用する場合、より具体的な限定としては、励起光の波長は半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より長く、放出光の波長は半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より短い関係になるようにし、特に、励起光の波長は近赤外領域の波長とする。 As in the first to third inventions, when two-photon absorption is used, a more specific limitation is that the wavelength of the excitation light is longer than the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor photodetector, and the wavelength of the emitted light. Is shorter than the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor photodetecting element. In particular, the wavelength of the excitation light is a wavelength in the near infrared region.
また、微小対象物の放出する放出光は当該放出光に対して選択透過性を有する光学フィルタを介して半導体光検出素子に入射させるのが良い。その上で、望ましくは、光学フィルタ及び半導体光検出素子の側壁にあって少なくとも励起光の散乱光が入射する可能性のある側壁部分は遮蔽膜により覆う。 Moreover, it is preferable that the emitted light emitted from the minute object is incident on the semiconductor photodetecting element through an optical filter having selective transparency to the emitted light. In addition, preferably, at least the side wall portion on the side wall of the optical filter and the semiconductor light detection element where the scattered light of the excitation light may enter is covered with a shielding film.
構造的には、半導体光検出素子と上記の光学フィルタとを有する放出光検出部が平面的に見て円形またはｎを整数３以上の数としてｎ角形形状の立体形状をなし、この立体形状の一部に円形もしくはｎ角形形状の透孔が開いていて、励起光はこの透孔内を通過するように構成するのが望ましい。この場合、やはり最も一般的なのは、放出光検出部を平面的に見て円形、透孔も円形、すなわち全体として見てドーナッツ形状にすることである。 Structurally, the emission light detection unit having the semiconductor light detection element and the optical filter has a circular shape or an n-gonal solid shape where n is an integer of 3 or more in plan view. It is desirable that a circular or n-shaped through hole is partially opened, and the excitation light passes through the through hole. In this case, the most common is that the emission light detection unit is circular when viewed in plan and the through hole is circular, that is, a donut shape as a whole.
さらに、マイクロ収束レンズは、半導体光検出素子の構築されている基板に設けることも、微小対象物を載持する光透過性のチップに設けることもできる。 Furthermore, the micro converging lens can be provided on a substrate on which a semiconductor light detection element is constructed, or can be provided on a light-transmitting chip that carries a minute object.
構造簡易化という点では、半導体光検出素子を微小対象物が載持される光透過性のチップに一体的に形成するのが良く、全体の並列化という点では、励起光源と半導体光検出素子を同一の基板上に形成するのが望ましい。もちろん、マイクロ収束レンズもこの基板上に一体化できる場合がある。 In terms of simplification of the structure, it is preferable to integrally form the semiconductor light detection element on a light-transmitting chip on which a minute object is mounted. In terms of parallelization as a whole, the excitation light source and the semiconductor light detection element Are preferably formed on the same substrate. Of course, there are cases where a micro-converging lens can also be integrated on this substrate.
この際、励起光源は面発光レーザ、半導体光検出素子はa-Si:H材料を用いて作製されたフォトダイオードまたは光伝導体とすることが有利である。 In this case, it is advantageous to use a surface emitting laser as the excitation light source and a photodiode or photoconductor manufactured using an a-Si: H material as the semiconductor light detection element.
さらに進めて、半導体光検出素子と励起光源との組み合わせを一つのモジュールとして見た場合、このモジュールを複数個、一次元または二次元的に並設してモジュールアレイを構成させた装置も有用であり、さらに、このモジュールまたはモジュールアレイを一次元方向または二次元方向、あるいは三次元方向に走査する走査機構を設けることも種々の応用を産む。 Further, when the combination of the semiconductor light detection element and the excitation light source is viewed as one module, an apparatus in which a module array is configured by arranging a plurality of modules one-dimensionally or two-dimensionally is also useful. Furthermore, providing a scanning mechanism for scanning the module or the module array in a one-dimensional direction, a two-dimensional direction, or a three-dimensional direction also produces various applications.
また、半導体光検出素子を複数に分割し、微小対象物の放出する放出光がそれぞれ異なる分光特性を持つ光学フィルタを介してこの半導体光検出素子の分割部分の各々に入射するように図ると、波長多重分析も可能になる。 Further, when the semiconductor light detection element is divided into a plurality of parts and the emitted light emitted from the minute object is incident on each of the divided parts of the semiconductor light detection element via optical filters having different spectral characteristics, Wavelength multiplexing analysis is also possible.
第一〜第三の本発明によると、色素や半導体量子ドット、ないしは色素あるいは半導体量子ドットで標識された微小サンプル等、励起光を照射することで蛍光を放出する微小対象物や燐光を放出する微小対象物を二光子吸収により励起するので、既に述べた理由から半導体光検出素子として望ましいa-Si:Hフォトダイオードを用いた場合、微小対象物から可視光領域の放出光を発生させるにも、実際の励起光波長は二光子吸収原理を用いない場合に比して倍の波長であって良いことになる。従って例えば、微小対象物の光吸収ピークが500nm程度の波長である場合、その倍の1000nm程度の波長の光を発生する励起光源を用いることができる。これは励起光源選択の自由度を大幅に高めるもので、種々既存の半導体励起光源の中から安定かつ使い勝手の良いものを使うことができるようになる。上記の波長関係は、より一般的には、本発明の特定の態様における具体的な限定に従い、励起光の波長は半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より長く、放出光の波長は半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より短い関係にある、とした場合に対応し、特に励起光の波長は近赤外領域の波長とする限定に従うことで、選択できる半導体励起光源は多くなり、安定なものを用いることができる。 According to the first to third aspects of the present invention, a minute object such as a dye or a semiconductor quantum dot, or a minute sample labeled with the dye or the semiconductor quantum dot, or the like, emits a minute object or phosphorescence that emits fluorescence when irradiated with excitation light. Since a minute object is excited by two-photon absorption, if an a-Si: H photodiode, which is desirable as a semiconductor photodetector, is used for the reasons already described, emission light in the visible light region can be generated from the minute object. The actual excitation light wavelength may be twice that of the case where the two-photon absorption principle is not used. Therefore, for example, when the light absorption peak of the minute object has a wavelength of about 500 nm, an excitation light source that generates light having a wavelength of about 1000 nm, which is twice that wavelength, can be used. This greatly increases the degree of freedom in selecting the excitation light source, and it becomes possible to use a variety of existing semiconductor excitation light sources that are stable and easy to use. The above wavelength relationship is more generally in accordance with a specific limitation in a particular aspect of the present invention, where the wavelength of the excitation light is longer than the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor photodetector and the wavelength of the emitted light is the semiconductor. Corresponding to the case where the relationship is shorter than the wavelength corresponding to the band gap of the photodetecting element, the number of selectable semiconductor excitation light sources is increased by following the limitation that the wavelength of the excitation light is in the near infrared region. A stable material can be used.
さらに、そもそも、半導体光検出素子には上記のようにa-Si:H系の採用が一番望ましいが、これに限らず、一般的に半導体材料ということだけに展開して考えても、二光子吸収を起こすことは極めて有用である。半導体の吸収係数はエネルギが高くなる程に大きくなるが、通常の一光子吸収の場合、励起光波長は常に放出光波長より短いので、励起光波長での半導体光検出素子の吸収係数は放出光波長での吸収係数より常に大きくなる宿命にある。従って半導体光検出素子への励起光の散乱による漏れ込み等を考えると、そうした励起光ないしその散乱光に対する感度が高く、サンプルからの放出光に対する感度が低いという点で、どうしてもSN比（信号対雑音比）が低下しがちである。ところが、二光子吸収による励起を図ると、望ましいことにこの関係が逆転し、半導体光検出素子の吸収係数は励起光波長で低く、放出光波長で高くなるため、原理的にSN比が高くなる。 Furthermore, in the first place, it is most desirable to use a-Si: H system for the semiconductor photodetecting element as described above. However, the present invention is not limited to this. It is extremely useful to cause photon absorption. The absorption coefficient of the semiconductor increases as the energy increases, but in the case of normal one-photon absorption, the excitation light wavelength is always shorter than the emission light wavelength, so the absorption coefficient of the semiconductor photodetector at the excitation light wavelength is the emission light. The fate is always greater than the absorption coefficient at the wavelength. Therefore, considering leakage due to scattering of excitation light into the semiconductor light detection element, the SN ratio (signal pair) is inevitably in that the sensitivity to the excitation light or the scattered light is high and the sensitivity to the light emitted from the sample is low. The noise ratio tends to decrease. However, when excitation by two-photon absorption is attempted, this relationship is desirably reversed, and the absorption coefficient of the semiconductor photodetection element is low at the excitation light wavelength and high at the emission light wavelength, so in principle the SN ratio is high. .
換言すれば、二光子吸収を起こさせるために相当、励起光強度密度を高めても、バックグラウンド光電流による半導体光検出素子の感度低下の惧れは大幅に低下させることができる。さらに、本発明の上記構成に認められるように、マイクロ収束レンズ、マイクロ共振器やピーク強度の高いQスイッチ短パルスレーザ光を用いることで、効率的に二光子吸収を起こすことも可能である。マイクロ収束レンズの採用により、焦点近傍のみを選択的に励起することができるため、共焦点蛍光検出システムに近い空間フィルタリングが可能となり、その意味でもバックグランド光を低減させることができる。また、レーザ光散乱のうち、レーリー散乱によるものは、励起光の波長が二倍になれば、(1/2)4=1/16に低下させることができるので、この点でも長波長光を励起光として用い得る効果は高いものがある。 In other words, even if the excitation light intensity density is increased considerably to cause two-photon absorption, the risk of a decrease in sensitivity of the semiconductor photodetector due to the background photocurrent can be greatly reduced. Furthermore, as can be seen from the above configuration of the present invention, it is possible to efficiently cause two-photon absorption by using a micro-converging lens, a micro-resonator, or a Q-switched short pulse laser beam having a high peak intensity. By adopting a micro-converging lens, only the vicinity of the focal point can be selectively excited, so that spatial filtering close to that of the confocal fluorescence detection system is possible, and in this sense, background light can be reduced. In addition, laser light scattering caused by Rayleigh scattering can be reduced to (1/2) 4 = 1/16 when the wavelength of the excitation light is doubled. There are high effects that can be used as excitation light.
二光子吸収に依らずとも、第四の本発明によれば、共振器構造中にSHG素子を介在させるので、十分な光強度を持つ倍波として、サンプルプラグを照射する励起光を得ることができ、技術的に成熟した既存の半導体励起光源を用いることができる。 Regardless of the two-photon absorption, according to the fourth aspect of the present invention, since the SHG element is interposed in the resonator structure, it is possible to obtain excitation light that irradiates the sample plug as a double wave having sufficient light intensity. It is possible to use existing semiconductor excitation light sources that are technically mature.
さらに、本発明の特定の態様に従い、微小対象物の発する放出光を、当該放出光に対して選択透過性を有する光学フィルタを介して半導体光検出素子に入射させるようにした場合、この光学フィルタ及び半導体光検出素子の側壁にあって少なくとも励起光の散乱光が入射する可能性のある側壁部分は遮蔽膜により覆うようにすると、さらに低ノイズ化が図れ、これによっても感度を十分に向上させることができる。 Further, according to a specific aspect of the present invention, when the emitted light emitted from the minute object is incident on the semiconductor photodetecting element through the optical filter having selective transmission with respect to the emitted light, the optical filter In addition, if at least the side wall portion where the scattered light of the excitation light may enter is covered with a shielding film on the side wall of the semiconductor light detection element, noise can be further reduced, and this also sufficiently improves the sensitivity. be able to.
本発明によると、以上のように性能的に有利になるだけではなく、実質的に用いる励起光源の選択自由度が増し、かつ材料の相性の組み合わせも解決できて、光検出素子と集積化することも容易にできるようになるということから、ラボ・オン・チップの実現に大いに近づくことができる。特に、本発明の特定の態様に従う面発光レーザ一体型a-Si:H放出光検出モジュールは生産性に優れ、低コスト化が可能であり、多重度の高い並列バイオ化学分析に大きな役割を果たすものと思われる。 According to the present invention, not only is it advantageous in terms of performance as described above, but also the degree of freedom of selection of the excitation light source to be used is substantially increased, and the combination of the compatibility of materials can be solved, so that it can be integrated with the light detection element This makes it much easier to achieve lab-on-chip. In particular, the surface-emitting laser integrated a-Si: H emission photodetection module according to a specific embodiment of the present invention is excellent in productivity, can be reduced in cost, and plays a major role in parallel biochemical analysis with high multiplicity. It seems to be.
本発明はまた、上記のような構造原理であるので、電気泳動法を用いての分析にのみ限ることなく、検出限界が大幅に改善されることから、より広範なバイオ分析に応用可能であって、大概すれば、蛍光検出ベースのあらゆるタイプのマイクロ流体ラボ・オン・チップの実現に極めて有効な手段を与え、DNAチップ（DNA microarray）、プロテイン・チップ等の蛍光検出システムにも有利に適用できる。例えばDNAフラグメント解析、DNAシークエンシング、ポロニー・シークエンシング、RNA解析、たんぱく質分離、アミノ酸解析、細胞ソーティング、ドラッグ・スクーリング等に関しての応用も考えられるし、さらにはPCRと電気泳動を集積・結合したデバイスと組み合わせることで、“現場”病原菌検出、同定、石油分解等の有用菌の検出、同定等にも有効と思われる。 Since the present invention is based on the structure principle as described above, the detection limit is greatly improved without being limited only to the analysis using the electrophoresis method. Therefore, the present invention can be applied to a wider range of bioanalysis. In general, it provides an extremely effective means for realizing all types of microfluidic lab-on-chips based on fluorescence detection, and can be advantageously applied to fluorescence detection systems such as DNA microarrays and protein chips. it can. For example, DNA fragment analysis, DNA sequencing, polony sequencing, RNA analysis, protein separation, amino acid analysis, cell sorting, drug schooling, etc. can be considered, and devices that integrate and combine PCR and electrophoresis In combination, it seems to be effective for detecting and identifying "in-situ" pathogenic bacteria, and detecting and identifying useful bacteria such as petroleum degradation.
特に、色素に代えて半導体量子ドットを用いた場合、その重量の大きさがあまり障害にならないDNAチップ分析等においては、半導体量子ドットの二光子吸収断面積が桁違いに大きい分、蛍光検出や燐光を検出する場合に格段に効果的である。 In particular, when a semiconductor quantum dot is used instead of a dye, the two-photon absorption cross-sectional area of the semiconductor quantum dot is an order of magnitude larger in DNA chip analysis or the like where the size of the weight is not a major obstacle. This is particularly effective when detecting phosphorescence.
さらに、本発明の特定の態様に従い、励起光源と半導体光検出素子のセットをモジュールとして一次元ないしは二次元にアレイ化した場合、さらに応用使途は広がる。また、単一のモジュールまたはモジュールアレイを一次元ないし二次元、あるいはまた、さらに三次元に走査可能とすると、より応用範囲は広がり、例えば単に分析の並列処理化のためだけではなく、前述した二光子吸収の空間選択性（フィルタリング）の効果により、微小対象物のイメージング等も可能となる。 Further, in accordance with a specific aspect of the present invention, when the set of the excitation light source and the semiconductor light detection element is arrayed as a module in one dimension or two dimensions, the application usage is further expanded. Further, if a single module or module array can be scanned in one, two, or even three dimensions, the range of application is further expanded. For example, not only for parallel processing of analysis, Due to the effect of spatial selectivity (filtering) of photon absorption, it is possible to image a minute object.
図１には本発明の望ましい実施形態の一つが示されている。なお、既に図10(A),(B)に即して述べた従来例の各構成要素に付した符号を始め、他の図面中にて用いる符号も、同一の符号は同一ないし同様で良い構成要素を示し、従って各構成要素に関しどこかで説明した内容は特に断らない限り、他においても援用でき、繰り返しての説明は避けることがある。 FIG. 1 shows one preferred embodiment of the present invention. Note that the reference numerals used in the other drawings, including the reference numerals already given to the components of the conventional example described with reference to FIGS. 10A and 10B, may be the same or similar. The constituent elements are shown, and therefore, the contents described elsewhere with respect to each constituent element can be used in other places unless otherwise noted, and repeated description may be avoided.
さて、この図１に示す本発明実施形態は、既に述べた電気泳動法を用いてのサンプル分析に適用するように構成されたものであることを想定しており、従って励起光Leの照射を受けることで放出光としてこの場合蛍光を発する微小対象物は、既述のようにガラスないしプラスチック基板から構成されたチップ10内の分離チャネル16を通る色素標識されたサンプルプラグ（これ自体は図示せず）である。 Now, it is assumed that the embodiment of the present invention shown in FIG. 1 is configured to be applied to sample analysis using the electrophoresis method already described. The minute object that emits fluorescence in this case as the emission light when received is a dye-labeled sample plug (not shown itself) that passes through the separation channel 16 in the chip 10 composed of a glass or plastic substrate as described above. )).
励起光Leはこの実施形態では励起光源30として選ばれた面発光レーザ30により発振された光であるが、便宜上、当該面発光レーザ30についての説明は後に回し、励起光Leの照射を受けて発せられた蛍光Lfが、既に従来例に即して説明した蛍光収集用マイクロレンズ61を介して平行化された後に入射する蛍光(放出光)検出部40の側から説明する。蛍光検出部40内に備えられる半導体光検出素子20として望ましいのは、a-Si:H材料により構成されたa-Si:Hフォトダイオード20である。一般にa-Si:H膜は、SiH4ガスあるいは水素希釈されたSiH4ガスをプラズマで分解し、生成した活性種を基板に導くことで（プラズマ化学気相成長法）、200℃程度の低温でも高品質に作製可能である。不純物ドーピングは、この原料ガスに、不純物ガスB2H6あるいはPH3を添加するだけであり、それぞれP型、N型のa-Si:Hが得られる。このように低温プロセスで済むお陰で、a-Si:Hフォトダイオードはガラスやプラスチックなどの安価な基板に直接形成することができる。図示する実施形態でもそうした場合が想定されている。ただし、本発明ではこのa-Si:Hフォトダイオード20の構造それ自体を特に規定するものではなく、公知既存の構造のものを援用できるが、ここで簡単に図示されているフォトダイオードの作製手順につき述べておく。 The excitation light Le is light oscillated by the surface emitting laser 30 selected as the excitation light source 30 in this embodiment. However, for convenience, the description of the surface emitting laser 30 will be deferred later, and the excitation light Le is irradiated. The emitted fluorescence Lf will be described from the side of the fluorescence (emitted light) detection unit 40 that enters after being collimated through the fluorescence collecting microlens 61 that has already been described with reference to the conventional example. A semiconductor photodetecting element 20 provided in the fluorescence detection unit 40 is preferably an a-Si: H photodiode 20 made of an a-Si: H material. In general, a-Si: H films are produced by decomposing SiH 4 gas or hydrogen-diluted SiH 4 gas with plasma and introducing the generated active species to the substrate (plasma chemical vapor deposition method). But it can be made with high quality. For impurity doping, only impurity gas B 2 H 6 or PH 3 is added to this source gas, and P-type and N-type a-Si: H are obtained, respectively. Thanks to this low temperature process, a-Si: H photodiodes can be directly formed on inexpensive substrates such as glass and plastic. Such a case is also assumed in the illustrated embodiment. However, in the present invention, the structure itself of the a-Si: H photodiode 20 is not particularly specified, and a known existing structure can be used, but the photodiode manufacturing procedure illustrated here is simply illustrated. I will mention.
まず透明基板28、例えばガラス基板28上にスパッタ等によりクロム等、適当なる導電材料の裏面電極27を形成する。その上にN型a-Si:H膜26、真性a-Si:H膜25、P型a-Si:H膜24を順次積層形成した後、例えばITO等により受光側の透明導電膜23を形成する。電極も含めたa-Siフォトダイオード20のパターン形成はフォトリソグラフィにより適時行い、中心に透孔（ピンホール）41を有するドーナッツ形状とする。こうした構造で裏面電極27に開けられたピンホールは、励起光Leに対してアパーチャとして働く。 First, a back electrode 27 of a suitable conductive material such as chromium is formed on a transparent substrate 28, for example, a glass substrate 28, by sputtering or the like. An N-type a-Si: H film 26, an intrinsic a-Si: H film 25, and a P-type a-Si: H film 24 are sequentially stacked thereon, and then the transparent conductive film 23 on the light receiving side is formed by, for example, ITO. Form. The pattern formation of the a-Si photodiode 20 including the electrodes is performed by photolithography at an appropriate time to form a donut shape having a through hole (pinhole) 41 at the center. The pinhole opened in the back electrode 27 with such a structure works as an aperture for the excitation light Le.
上述のように、この場合はPIN型として構成されたフォトダイオード20の側壁は、SiN等による適当な絶縁膜22で覆い、その上にアルミ等、適当な金属21で被覆し、この金属膜21を受光側透明導電膜23と電気的に接触させることで、裏面電極に対向するもう一方の電極としている。このa-Si:Hフォトダイオード20上に、SiNあるいはSiO等による絶縁膜53を形成し、CMP(Chemical Mechanical Polishing)法等を援用してその表面を平坦化した後、その上に光学フィルタ50を形成する。光学フィルタ50は光学干渉フィルタとして構成するのが普通であり、例えばZnS/YF3等の光学干渉フィルタ50を形成する。蛍光Lfに対する選択透過性（励起光Leの遮断性）を有するこうした光学干渉フィルタ50の作製についてはよく知られており、本発明でも任意に適用可能なため、ここではその詳細は記述しない。 As described above, in this case, the side wall of the photodiode 20 configured as a PIN type is covered with an appropriate insulating film 22 made of SiN or the like, and further covered with an appropriate metal 21 such as aluminum or the like. Is in electrical contact with the light-receiving side transparent conductive film 23, thereby forming the other electrode facing the back electrode. An insulating film 53 made of SiN or SiO or the like is formed on the a-Si: H photodiode 20, and its surface is flattened by using a CMP (Chemical Mechanical Polishing) method or the like, and then an optical filter 50 is formed thereon. Form. The optical filter 50 is usually configured as an optical interference filter, and an optical interference filter 50 such as ZnS / YF 3 is formed. The production of such an optical interference filter 50 having selective transmission with respect to the fluorescent light Lf (blocking property of the excitation light Le) is well known and can be arbitrarily applied to the present invention, so that details thereof will not be described here.
ただ、本発明の一形態に従い、特徴的なことに、光学干渉フィルタ50の側壁は遮光膜51により覆われている。この遮光膜51は励起光波長を極力通し難いものであればその材質は任意であって、光遮断性を持つ塗膜等であっても良いが、金属膜でも良いので、フォトダイオード20の電極材質として用いたと同じアルミを選ぶと、製造工程上、便利である。こうした遮光膜51を設けると、フォトダイオード20の側壁を覆う金属電極21と相俟って、特にピンホール41に向いている光フィルタの側壁を介し、散乱して来た励起光がフォトダイオード20に入射するのを妨げることができ、これがSN比を向上する上で大きな効果を発揮する。 However, according to one embodiment of the present invention, the side wall of the optical interference filter 50 is characteristically covered with the light shielding film 51. The light shielding film 51 can be made of any material as long as it is difficult to transmit the excitation light wavelength as much as possible. The light shielding film 51 may be a coating film having light shielding properties, but may be a metal film. Choosing the same aluminum as the material is convenient for the manufacturing process. When such a light shielding film 51 is provided, coupled with the metal electrode 21 covering the side wall of the photodiode 20, in particular, the excitation light scattered through the side wall of the optical filter facing the pinhole 41 is reflected in the photodiode 20. Can be prevented, and this has a great effect on improving the S / N ratio.
フォトダイオード20の構築されている基板28の裏面側（図中、下側）には、望ましいことに面発光レーザ30（Vertical Cavity Surface Emitting Laser Diode：VCSEL）が一体に形成されている。もっとも、用いる面発光レーザ30の構造自体は任意公知のものを採用することができる。図示の場合に即し、一般的な構成例について言えば、構築基板36上における積層構造として、N型分布ブラッグ反射(Distributed Bragg Reflection：DBR) ミラー34、量子井戸を有する活性層33、P型分布ブラッグ反射ミラー32、そして電流方向両端の電極31、35があり、これらは有機金属気相成長法(MOCVD)や分子線ビームエピタキシ法により作製されている。一対の電極31，35からN型分布ブラッグ反射ミラー34、およびP型分布ブラッグ反射ミラー32を介してキャリアが注入され、活性層33において再結合し、発光する（活性層に直接電極を形成する場合もある)。この時、二つの分布ブラッグ反射ミラーは共振器を形成し、誘導放出を促進する。通常、分布ブラッグ反射ミラーは20〜30周期程度のAlAs/GaAs積層構造により構成することができ、N型分布ブラッグ反射ミラー34にはSe不純物、P型分布ブラッグ反射ミラー32にはZn不純物をドープしておく。 A surface emitting laser 30 (Vertical Cavity Surface Emitting Laser Diode: VCSEL) is preferably integrally formed on the back surface side (lower side in the figure) of the substrate 28 on which the photodiode 20 is constructed. However, any known structure can be adopted as the structure of the surface emitting laser 30 to be used. In accordance with the case shown in the drawing, as for a general configuration example, as a laminated structure on the construction substrate 36, an N-type distributed Bragg reflection (DBR) mirror 34, an active layer 33 having a quantum well, a P-type There are a distributed Bragg reflector 32 and electrodes 31 and 35 at both ends in the current direction, and these are fabricated by metal organic chemical vapor deposition (MOCVD) or molecular beam epitaxy. Carriers are injected from the pair of electrodes 31 and 35 through the N-type distributed Bragg reflecting mirror 34 and the P-type distributed Bragg reflecting mirror 32, recombine in the active layer 33, and emit light (form an electrode directly on the active layer). In some cases). At this time, the two distributed Bragg reflector mirrors form a resonator and promote stimulated emission. Normally, a distributed Bragg reflector mirror can be composed of an AlAs / GaAs laminated structure of about 20 to 30 periods. The N-type distributed Bragg reflector mirror 34 is doped with Se impurities and the P-type distributed Bragg reflector mirror 32 is doped with Zn impurities. Keep it.
活性層33は、例えば980nm前後の光を出す面発光レーザ光の場合、Ga(1-x)InxAs/GaAs量子井戸構造(x=0.2程度)とすることができ、望ましくは反応性イオンビーム等によってメサ構造を形成した後、湿式AlAs層選択酸化を行うことで電流狭窄領域が形成されたものである。AlO層は低屈折率であるので、GaAs/AlAs領域をコア、GaAs/AlO領域をクラッドとする導波路構造も得ることができ、電流と同時に光の閉じ込め構造も実現されている。こうした構造は低しきい値、高効率レーザ発振の手法として重要であり、既に良く知られている。 For example, in the case of a surface emitting laser beam that emits light at around 980 nm, the active layer 33 can have a Ga (1-x) In x As / GaAs quantum well structure (x = 0.2), preferably reactive ions. After the mesa structure is formed by a beam or the like, the current confinement region is formed by performing wet AlAs layer selective oxidation. Since the AlO layer has a low refractive index, a waveguide structure having a GaAs / AlAs region as a core and a GaAs / AlO region as a cladding can be obtained, and an optical confinement structure is realized simultaneously with current. Such a structure is important as a technique for low threshold, high efficiency laser oscillation and is already well known.
しかるに、この実施形態の本発明装置を作製する場合には、GaAs基板等、適当なる基板上に面発光レーザ30を構築する工程とフォトダイオード20、光フィルタ50を含む蛍光受光系を構築する工程を独立とすることができ、上記のような材料組み合わせ例で、励起光源と蛍光受光系の集積化が行える。これはもとより、極めてポータブルなラボ・オン・チップを実現する上で望ましいことは言うまでもない。 However, when manufacturing the device of the present invention of this embodiment, a step of constructing the surface emitting laser 30 on a suitable substrate such as a GaAs substrate and a step of constructing a fluorescence receiving system including the photodiode 20 and the optical filter 50 Can be made independent of each other, and the excitation light source and the fluorescence light receiving system can be integrated in the above material combination example. Needless to say, this is desirable for realizing a very portable lab-on-chip.
さて、光フィルタ50の側壁を覆うように本発明者の工夫で新たに設けられた遮光膜51の存在を除けば、他の個々の要素は既存のものであって良いのに対し、本発明による特徴的な構成は、励起光の光路途中に設けられている励起光収束用のマイクロ収束レンズ62の存在に認められる。このマイクロ集束レンズ62は、その焦点を、励起光Leの照射を受けると蛍光を発する微小対象物（この実施形態では分離チャネル16内のサンプルプラグ）上、もしくは少なくともその近傍に置くようにされている。特にこの実施形態では、当該マイクロ収束レンズ62はフォトダイオード20を支持するガラス基板28に一体に設けられていて、ピンホール41の部分に位置している。これは、基板材質が上記のようにガラスの場合には鋳型形成により簡単に作製できるからである。もっとも、最近ではフォトレジストのリフロー等を利用した半導体微細加工技術により、半導体やガラス材料のマイクロレンズも任意に形成できるので、選択した基板材質の如何により、それぞれに便利な手法で作製すれば良い。もちろん、プラスチック基板を用いる場合にも鋳型成型その他、便利な手法が存在する。 Now, except for the presence of the light shielding film 51 newly provided by the inventors to cover the side wall of the optical filter 50, other individual elements may be existing, whereas the present invention The characteristic configuration by is recognized by the presence of the micro-convergence lens 62 for converging the excitation light provided in the optical path of the excitation light. The micro focusing lens 62 is arranged so that its focal point is placed on, or at least in the vicinity of, a micro object that fluoresces when irradiated with the excitation light Le (in this embodiment, the sample plug in the separation channel 16). Yes. In particular, in this embodiment, the micro converging lens 62 is provided integrally with the glass substrate 28 that supports the photodiode 20 and is located in the pinhole 41 portion. This is because when the substrate material is glass as described above, it can be easily produced by mold formation. However, recently, microlenses of semiconductors and glass materials can be arbitrarily formed by semiconductor microfabrication technology using reflow of photoresist, etc., so it can be made by a convenient method depending on the selected substrate material. . Of course, when a plastic substrate is used, there are other convenient methods such as molding.
いずれにしても、本発明に従い、こうしたマイクロ収束レンズ62が設けられていると、面発光レーザ30により放出された、例えば近赤外980nm程度の波長であって良い励起光Leも、マイクロ集束レンズ62により集光されて分離チャンネル16内を泳動するサンプルプラグを高い光強度密度を持って照射することができる。そのため、励起レーザ光Leより短波長の吸収ピークを有する色素、あるいは色素により標識されたサンプルであっても、それを二光子吸収により励起するために、実効的に発振波長の半分の波長490nmに相当するエネルギでの励起を可能とすることができ、事実、近赤外光の二光子励起された色素は可視光蛍光を放出する。発生した蛍光は、蛍光収集用マイクロレンズ61により収集してほぼ平行化させ、光学干渉フィルタ50にほぼ垂直に入射させて励起光成分を除去し、a-Si:Hフォトダイオード20に入射させて光電変換させる。なお、一般に、キャリア収集効率を最適化するために、a-Si:Hフォトダイオード20には数ボルト程度の逆バイアス電圧を印加しておくのが普通である。 In any case, according to the present invention, when such a micro focusing lens 62 is provided, the excitation light Le emitted from the surface emitting laser 30, which may have a wavelength of, for example, about 980 nm in the near infrared, is also generated by the micro focusing lens. The sample plug condensed by 62 and migrating in the separation channel 16 can be irradiated with a high light intensity density. Therefore, even a dye having an absorption peak with a shorter wavelength than the excitation laser beam Le, or a sample labeled with a dye, is effectively reduced to a wavelength of 490 nm, which is half the oscillation wavelength, in order to excite it by two-photon absorption. Excitation with comparable energy can be enabled, and in fact, two-photon excited dyes of near infrared light emit visible light fluorescence. The generated fluorescence is collected by the fluorescence-collecting microlens 61 and made almost parallel, and is made to enter the optical interference filter 50 almost perpendicularly to remove the excitation light component, and is made to enter the a-Si: H photodiode 20. Make photoelectric conversion. In general, in order to optimize the carrier collection efficiency, a reverse bias voltage of about several volts is usually applied to the a-Si: H photodiode 20.
このような二光子吸収による遷移確率は、光の強度の自乗に比例するので、本実施形態においてガラス基板28上に形成したマイクロレンズ62によりレーザ光を集光することの効果は極めて大きい。比較的、低レーザ・パワーで二光子吸収を実現できること、また、焦点近傍（対象物近傍）のみを選択的に励起することができるため、共焦点蛍光検出システムに近い空間フィルタリングが可能となり、バックグランド光を低減させることができること、等の利点がある。レーザ光散乱の中、レーリー散乱によるものも、励起光Leの波長が倍になることで、(1/2)4=1/16に低下させることができる。 Since the transition probability due to such two-photon absorption is proportional to the square of the light intensity, the effect of condensing the laser light by the microlens 62 formed on the glass substrate 28 in this embodiment is extremely large. The two-photon absorption can be realized with relatively low laser power, and only the vicinity of the focus (near the object) can be selectively excited, enabling spatial filtering close to that of the confocal fluorescence detection system. There are advantages such as reduction of ground light. Among laser light scattering, the one caused by Rayleigh scattering can be reduced to (1/2) 4 = 1/16 by doubling the wavelength of the excitation light Le.
また特に、既に説明もしたが、通常の一光子吸収の場合、励起光波長は常に蛍光波長より短いので、励起光波長での半導体光検出素子の吸収係数は蛍光波長での吸収係数より常に大きくなり、ためにSN比を低下させ得る宿命にある所、二光子吸収ではその関係を実質的に逆転できる。特に、半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長に比べて、励起光の波長が長く、蛍光のピーク波長が短い場合には、蛍光波長での半導体光検出素子の吸収係数が励起光波長の吸収係数より桁違いに大きくなるので、高感度蛍光検出に有利である。a-Si:Hの場合、そのバンドギャップ、すなわち、通常の結晶半導体におけるバンドギャップに相当する光学的エネルギギャップEo(いわゆるTauc gap)は典型的には1.7eV程度であり、波長で言えば730nm程度に対応するので、例えば、励起光を980nmとすると、Eoに相当する波長より十分長く、一方、二光子吸収で励起される色素の蛍光波長は、通常、980nmの半分の波長である490nmより数十nm程度長いだけであり、Eoに相当する波長より十分短く、上記の関係を満たす。 In particular, as already explained, in the case of normal one-photon absorption, the excitation light wavelength is always shorter than the fluorescence wavelength, so the absorption coefficient of the semiconductor photodetector at the excitation light wavelength is always larger than the absorption coefficient at the fluorescence wavelength. Therefore, where it is destined to reduce the signal-to-noise ratio, the relationship can be substantially reversed in two-photon absorption. In particular, when the wavelength of excitation light is long and the peak wavelength of fluorescence is short compared to the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor light detection element, the absorption coefficient of the semiconductor light detection element at the fluorescence wavelength is equal to the excitation light wavelength. Since it becomes an order of magnitude larger than the absorption coefficient, it is advantageous for highly sensitive fluorescence detection. In the case of a-Si: H, the band gap, that is, the optical energy gap Eo (so-called Tauc gap) corresponding to the band gap in a normal crystal semiconductor is typically about 1.7 eV, and the wavelength is 730 nm. For example, if the excitation light is 980 nm, it is sufficiently longer than the wavelength corresponding to Eo, while the fluorescence wavelength of the dye excited by two-photon absorption is usually 490 nm, which is half the wavelength of 980 nm. It is only a few tens of nanometers long, sufficiently shorter than the wavelength corresponding to Eo, and satisfies the above relationship.
図２として挙げた特性図を見ると、そのことが良く理解される。着目すべきポイントはそれぞれ矢印で示しているが、a-Si:Hの光吸収係数は、光学的エネルギギャップEo以上の可視光域から、Eo以下の近赤外域にかけて（例えば490nmから980nmにかけて）、四桁以上も低下している。つまり、本実施形態では、もし仮に、励起光Leがフォトダイオード20側に漏れ込んだとしても、その感度は蛍光波長に対する感度よりも十分に低いことになる。従って逆に、二光子吸収を実現するために励起光Leの強度を増加させても、レーザ散乱光によるバックグランド光電流は大きく低減させ得ることになり、感度の大幅な向上が見込まれる。 This can be better understood by looking at the characteristic diagram given as FIG. The points to be noted are indicated by arrows, but the light absorption coefficient of a-Si: H ranges from the visible light region above the optical energy gap Eo to the near infrared region below Eo (for example, from 490 nm to 980 nm). , Has fallen more than four digits. That is, in this embodiment, even if the excitation light Le leaks to the photodiode 20 side, the sensitivity is sufficiently lower than the sensitivity to the fluorescence wavelength. Therefore, conversely, even if the intensity of the excitation light Le is increased in order to realize two-photon absorption, the background photocurrent due to the laser scattered light can be greatly reduced, and a significant improvement in sensitivity is expected.
まして、本実施形態におけるように、フォトダイオード20や光学干渉フィルタ50の側壁を遮光膜51や電極21で遮光した構造にすれば、SN比はさらに向上し、実際上、これによってもまた、大きな感度向上が認められる。なお、図示していないが、チップ10、マイクロレンズ61，62、ガラス基板28、面発光レーザ30等の表面に、適宜、反射防止膜を施すことも、レーザ散乱光によるバックグランド光電流を低減する上で効果的である。 Furthermore, as in the present embodiment, if the side walls of the photodiode 20 and the optical interference filter 50 are shielded by the light shielding film 51 and the electrode 21, the SN ratio is further improved. Sensitivity improvement is recognized. Although not shown in the figure, an antireflection film is appropriately provided on the surface of the chip 10, the microlenses 61 and 62, the glass substrate 28, the surface emitting laser 30, and the like to reduce the background photocurrent due to the laser scattered light. It is effective in doing.
遮光のための構造51，21は、実質的には励起光Leの通る光路に向いた面だけであっても良い場合もある。すなわち、一般化して言えば、少なくとも励起光Leの散乱光が入射する可能性のある側壁部分に遮蔽膜51を設けたり電極21で被覆したりすれば良く、例えば、図示の場合、電極21の外周部は外部との電気接触のため必要であるが、遮蔽膜51の外周部は不要であり、ピンホール41に向いた内側壁部分にのみ施しても良い。ただ、制作上はフォトダイオード20や光学干渉フィルタ50の内外両側壁に一連に設けても、手間は同じでありながら、より完全な遮光性が得られる。また、図示実施形態では蛍光検出部が幾何的形状としてはドーナッツ形状に構成され、その中央部分の透孔ないしピンホール41を介して励起光Leが通過する構造になっているが、本発明はこうした構造にのみ限定的な応用を絞られるものではない。励起光源30と蛍光受光素子20とが例えば単に並設されているような場合でも、二光子吸収を起こさせるためのマイクロ収束レンズ62の組み込みはもとより可能である。この点は、以下に触れる本発明の他の実施形態でも同様である。さらにドーナッツ形状も円形形状に限らない。透孔を囲む立体形状として蛍光検出部40が構成されていれば良くて、平面的に見て四角形その他のｎ（ｎ≧3)角形形状の蛍光検出部40の一部（一般には中央）に円形もしくはｎ角形形状の透孔41が開いていて、そこを励起光Leが通過するようになっていても構わない。 In some cases, the light shielding structures 51 and 21 may be substantially only the surface facing the optical path through which the excitation light Le passes. That is, generally speaking, it is only necessary to provide a shielding film 51 or cover with an electrode 21 on at least a side wall portion where the scattered light of the excitation light Le may enter. The outer peripheral portion is necessary for electrical contact with the outside, but the outer peripheral portion of the shielding film 51 is not necessary and may be applied only to the inner wall portion facing the pinhole 41. However, in terms of production, even if it is provided in series on both the inner and outer side walls of the photodiode 20 and the optical interference filter 50, a more complete light-shielding property can be obtained with the same effort. Further, in the illustrated embodiment, the fluorescence detection unit is configured in a donut shape as a geometric shape, and has a structure through which excitation light Le passes through a through hole or pinhole 41 in the center portion. Limited applications are not limited to these structures. Even in the case where the excitation light source 30 and the fluorescence light receiving element 20 are simply arranged in parallel, for example, it is possible to incorporate the micro converging lens 62 for causing two-photon absorption. This also applies to other embodiments of the present invention described below. Further, the donut shape is not limited to a circular shape. It is sufficient that the fluorescence detection unit 40 is configured as a three-dimensional shape surrounding the through-hole, and a part of the fluorescence detection unit 40 having a quadrangle or other n (n ≧ 3) square shape (generally the center) in plan view. A circular or n-square shaped through hole 41 may be opened, and the excitation light Le may pass therethrough.
本発明による二光子吸収を用いた色素励起の効用、すなわち、バックグランド光電流の低減および光励起の空間選択性は、面発光レーザ30を用いた場合に限らず、通常の端面放射レーザを用いた場合にも有効に作用することは当然である。図１に示した蛍光検出装置において面発光レーザ30を通常の半導体レーザに置き換えることもできるが、図３に示すような構造的工夫により、さらに低コストなデバイスとして本発明蛍光検出装置を提供することもできる。 The utility of dye excitation using two-photon absorption according to the present invention, that is, the reduction of background photocurrent and the spatial selectivity of photoexcitation is not limited to the case of using the surface emitting laser 30, but a normal edge emitting laser is used. Of course, it works effectively in some cases. Although the surface emitting laser 30 can be replaced with a normal semiconductor laser in the fluorescence detection apparatus shown in FIG. 1, the fluorescence detection apparatus of the present invention is provided as a further low-cost device by the structural device shown in FIG. You can also.
例えば微小対象物がやはり電気泳動法におけるサンプルプラグである場合、既に説明してきたように、それはガラスないしプラスチック製のチップ10を有するので、半導体光検出素子としてa-Si:Hフォトダイオード20を用いるならば、そのチップ10を蛍光検出部の構築基板として流用することができる。図示の場合、まず、チップ10の裏面に光学フィルタ50が設けられ、以降、通常の作製手法に従い、絶縁膜53を介した後に透明電極23の上にこれまで説明したと同様で良い構造のフォトダイオード20が形成されている。図１の実施形態では裏面電極とされていた電極27に相当する電極27が、この実施形態ではフォトダイオード20の側壁をも覆う遮光構造21の一部をなしている。同様に、望ましくは光学フィルタ50の少なくともピンホール41に向いた内側壁、一般には外側壁をも含めて、そこにも遮光膜51が形成されていることも、図１に示した実施形態と同様であり、全体形状もまた、ドーナッツ形状を想定している。ただ、この実施形態では、透明導電膜23との電気的接触を図る必要から、遮光膜51には金属等、導電性を有するものが求められる。この遮光膜51が、フォトダイオード20の一方の電極の一部を構成する訳である。 For example, if the micro object is also a sample plug in electrophoresis, as already described, it has a glass or plastic chip 10, and therefore an a-Si: H photodiode 20 is used as a semiconductor photodetector. Then, the chip 10 can be used as a construction substrate for the fluorescence detection unit. In the illustrated case, first, an optical filter 50 is provided on the back surface of the chip 10, and thereafter, a photo of a structure similar to that described above may be provided on the transparent electrode 23 after passing through the insulating film 53 according to a normal manufacturing method. A diode 20 is formed. An electrode 27 corresponding to the electrode 27 that was the back electrode in the embodiment of FIG. 1 forms part of the light shielding structure 21 that also covers the side wall of the photodiode 20 in this embodiment. Similarly, the light shielding film 51 is preferably formed on the optical filter 50, including at least the inner wall facing the pinhole 41, generally the outer wall, as in the embodiment shown in FIG. It is the same, and the whole shape also assumes a donut shape. However, in this embodiment, since it is necessary to make electrical contact with the transparent conductive film 23, the light shielding film 51 is required to have conductivity such as metal. This light shielding film 51 constitutes a part of one electrode of the photodiode 20.
便利なことに、この実施形態では、励起光Leを収束するマイクロ収束レンズ62も、ピンホール41内の位置でチップ10の裏面を加工することで得られている。製法上、有利なことは顕かである。同様に、図中においてチップ10の上部にマイクロ収束レンズ62を形成し、励起光Leをチップ10を挟んで半導体光検出素子20に対向する側から入射させることも可能である。ただ、いずれの構造の場合にも、光学フィルタ50はa-Si:Hの製膜温度200℃に耐性のある材料、例えばSiO/TiO等の材料を使う必要はある。さらに、この図３に示される実施形態では、図１の実施形態では用いられていた蛍光収集用のマイクロレンズ61は必要とされていない。チップ10の分離チャネル16より下の部分の厚みを十分薄くすると、半導体光検出素子20の受光面が小さい場合でも十分な光を収集することが可能となり、別途な部材としてのレンズを用いている訳ではないが、近接効果レンズと呼ばれる構造が組み込まれていることになるからである。こうした構造も、集積度を上げるための重要な一構造例となり得る。 Conveniently, in this embodiment, the micro converging lens 62 that converges the excitation light Le is also obtained by processing the back surface of the chip 10 at a position in the pinhole 41. The advantages of the manufacturing method are obvious. Similarly, in the drawing, it is possible to form a micro converging lens 62 on the chip 10 and to make the excitation light Le enter from the side facing the semiconductor light detection element 20 with the chip 10 interposed therebetween. However, in any structure, the optical filter 50 needs to use a material resistant to an a-Si: H film forming temperature of 200 ° C., for example, a material such as SiO / TiO. Further, in the embodiment shown in FIG. 3, the microlens 61 for collecting fluorescence used in the embodiment of FIG. 1 is not required. If the thickness of the portion below the separation channel 16 of the chip 10 is made sufficiently thin, it becomes possible to collect sufficient light even when the light receiving surface of the semiconductor photodetecting element 20 is small, and a lens as a separate member is used. This is because a structure called a proximity effect lens is incorporated. Such a structure can also be an important structural example for increasing the degree of integration.
なお、マイクロ収束レンズ62は、チップ10の裏面に直接にではなく、一部分まで仮想線で示すように、専用の基板62’に形成して、この基板62’をチップ10の裏面に貼着しても良い。そもそも、図中に仮想線62”で示すように、マイクロ収束レンズ62は別途な部材として形成し、励起光Leの光路途中の適当な位置に設けても良い。この点は図１に示した実施形態においてもそうして構わないし、後述する他の実施形態においても同様のことが言える。 Note that the micro-converging lens 62 is formed not on the back surface of the chip 10 directly, but on a dedicated substrate 62 ′ as shown in phantom lines up to a part, and this substrate 62 ′ is adhered to the back surface of the chip 10. May be. In the first place, as indicated by a virtual line 62 ″ in the drawing, the micro converging lens 62 may be formed as a separate member and provided at an appropriate position in the optical path of the excitation light Le. This point is shown in FIG. This may be the case in the embodiment, and the same can be said in other embodiments described later.
さらに、平面形状の屈折率分布型レンズ（セルフォックレンズ）を用いることも可能であるし、近接効果レンズを用いる場合、光学フィルタ50に入射するレーザ散乱光や蛍光に入射角度分布があるので、当該光学フィルタ50としては光学干渉フィルタに代え、色ガラスフィルタ等の光学吸収フィルタを使用したり、あるいは光学干渉フィルタとそれを併用したりすることが望ましい場合もある。また、多チャンネルを並列に分析する際はスキャナ等を用いることになる。 Furthermore, it is possible to use a planar refractive index distribution type lens (Selfoc lens), and when using a proximity effect lens, there is an incident angle distribution in the laser scattered light and fluorescence incident on the optical filter 50. As the optical filter 50, it may be desirable to use an optical absorption filter such as a colored glass filter instead of the optical interference filter, or to use the optical interference filter in combination with the optical interference filter. Also, a scanner or the like is used when analyzing multiple channels in parallel.
ところでa-Si:H薄膜は、既述したようにガラスやプラスチックのような安価な基板に直接形成できるだけでなく、GaAsなどの異種基板にも集積することできる。これは、製膜プロセスが200℃程度の低温であること、及びアモルファス構造であることから、格子整合性が問われないことに由来する。そこで、図４に示すような構造も容易に得ることができる。すなわち、同一の基板36、例えばGaAs基板36上に、励起光源30も半導体光検出素子20もモノリシックに集積形成することができる。図示の場合はドーナッツ形状に形成されている半導体光検出素子の中央の透孔41内の基板36上に面発光レーザ30が形成されている。各素子の内部構造等はこれまで説明した来た所と同様で良いので、再度の説明は控える。他の実施形態における図面中に付したと同一の符号は同一ないし類似の構成要素を示すことは既に述べた通りである。 By the way, the a-Si: H thin film can be directly formed on an inexpensive substrate such as glass or plastic as described above, and can also be integrated on a dissimilar substrate such as GaAs. This originates from the fact that the film-forming process is at a low temperature of about 200 ° C. and the amorphous structure is not questioned because of the amorphous structure. Therefore, a structure as shown in FIG. 4 can be easily obtained. That is, the excitation light source 30 and the semiconductor light detection element 20 can be monolithically integrated on the same substrate 36, for example, the GaAs substrate 36. In the illustrated case, a surface emitting laser 30 is formed on a substrate 36 in a through hole 41 in the center of a semiconductor photodetector element formed in a donut shape. Since the internal structure and the like of each element may be the same as those described so far, the description thereof will be omitted. As already described, the same reference numerals as those in the drawings in other embodiments denote the same or similar components.
ただ、本発明の特徴的構成の一つであるマイクロ収束レンズ62について言えば、本図に示すように、半導体微細加工技術を利用し、蛍光収集用のマイクロレンズ61の頂上部に設けることも可能である。なお、予め述べておくと、それは屈折率分型レンズであったり、球面凸レンズであったり、非球面凸レンズであったりする場合もある。製造上、また収束に都合の良いものを選択すれば良い。 However, as for the micro converging lens 62 which is one of the characteristic configurations of the present invention, as shown in the figure, it may be provided on the top of the microlens 61 for collecting fluorescence by using a semiconductor microfabrication technology. Is possible. Note that, in some cases, it may be a refractive index separation lens, a spherical convex lens, or an aspheric convex lens. A product that is convenient for manufacturing and convergence may be selected.
GaAs基板36は、例えば980nmのような近赤外光を透過させることもできるので、図５に示すように、GaAs基盤36を挟んで面発光レーザ30をa-Si:Hフォトダイオード20の裏側にモノリシックに集積することもできる。マイクロ収束レンズ62は、この場合、図示の通り、面発光レーザ30の存在している位置部分でGaAs基板36の他面上（a-Si:Hフォトダイオード20の設けられている面上）の透孔41内に形成してもちろん良い。基板上のみならず、図示していないが蛍光収集用マイクロレンズ61の頂上部にもマイクロ収束レンズを形成することもでき、そのようにするとレーザ光集光の開口数を大きくし易いため、励起体積を小さくでき、実効的な光強度を上げることができることになって、より低パワーで二光子吸収を実現することもできる。いずれにしても、図４，図５に示したような、面発光レーザ30とフォトダイオード20のモノリシック集積構造は、より生産性に優れており、低コスト化が可能である。 Since the GaAs substrate 36 can transmit near infrared light such as 980 nm, for example, the surface emitting laser 30 is placed on the back side of the a-Si: H photodiode 20 with the GaAs substrate 36 interposed therebetween as shown in FIG. Can also be monolithically integrated. In this case, as shown in the drawing, the micro converging lens 62 is located on the other surface of the GaAs substrate 36 (on the surface where the a-Si: H photodiode 20 is provided) at the position where the surface emitting laser 30 exists. Of course, it may be formed in the through hole 41. Although not shown, a micro-converging lens can be formed not only on the substrate but also on the top of the fluorescence collecting micro-lens 61, which makes it easy to increase the numerical aperture for condensing the laser beam. Since the volume can be reduced and the effective light intensity can be increased, two-photon absorption can be realized with lower power. In any case, the monolithic integrated structure of the surface emitting laser 30 and the photodiode 20 as shown in FIGS. 4 and 5 is more excellent in productivity and can be reduced in cost.
さらに、本発明では、図６に示すように、分離チャンネル16を挟み込むように一対のミラーR1，R2を有するマイクロ共振器FPR を設けた構造も提案できる。これら一対のミラーR1，R2は好ましくは代表的に分布ブラッグ反射ミラーであって良く、材料構造的には望ましくは誘電体多層膜構造であって良い。 Further, in the present invention, as shown in FIG. 6, a structure in which a microresonator FPR having a pair of mirrors R1 and R2 so as to sandwich the separation channel 16 can be proposed. The pair of mirrors R1 and R2 may preferably be a distributed Bragg reflection mirror, and may preferably have a dielectric multilayer structure as a material structure.
このように、マイクロ共振器FPR 内に位置する分離チャネル16内のサンプルプラグを、望ましくはマイクロ収束レンズ62により収束し、さらに好ましくは凹レンズ63によりほぼ平行化した面発光レーザ30からの励起光Leで照射すると、当該励起光Leはマイクロ共振器FPR の一対のミラーR1，R2で多重反射する。 In this way, the sample plug in the separation channel 16 located in the microresonator FPR is preferably converged by the micro-converging lens 62, and more preferably, the excitation light Le from the surface-emitting laser 30 approximately parallelized by the concave lens 63. , The excitation light Le is multiple-reflected by the pair of mirrors R1 and R2 of the microresonator FPR.
そこで、面発光レーザ30の温度、注入電力を変えることにより励起光Leの波長を変化させ、共振条件を満たすようにすれば、マイクロ共振器FPR内の光強度は飛躍的に増し、当然、二光子吸収を起こす確率も極めて高まる。 Therefore, if the wavelength of the pumping light Le is changed by changing the temperature and injection power of the surface emitting laser 30 so that the resonance condition is satisfied, the light intensity in the microresonator FPR increases dramatically. The probability of causing photon absorption is also greatly increased.
実際、本発明者の実験によれば、図中で下側に位置し、励起光Leの入射を受けるミラーR1の反射率を0.96、透過率を0.04、上側のミラーR2の反射率を0.996とするマイクロ共振器FPR内の実効的な光強度は、これがない場合に比べて325倍となり、二光子吸収の確率は10000倍以上にも増大した。 Actually, according to the experiment by the present inventor, the reflectance of the mirror R1, which is located on the lower side in the figure and receives the excitation light Le, is 0.96, the transmittance is 0.04, and the reflectance of the upper mirror R2 is 0.996. The effective light intensity in the microresonator FPR is 325 times that without this, and the probability of two-photon absorption has increased to 10,000 times or more.
こうした構造で用いるミラーR1，R2は上記のように分布ブラッグ反射ミラーとするのが良く、また、原理的にはその材質は半導体であっても誘電体であっても良いが、先に述べたように、例えばSiO2/HfO2のような誘電体膜多層膜構造の方が光透過性のチップ10との材料的な相性を考えると有利である。 The mirrors R1 and R2 used in such a structure are preferably distributed Bragg reflection mirrors as described above. In principle, the material may be a semiconductor or a dielectric. Thus, for example, a dielectric film multilayer structure such as SiO 2 / HfO 2 is more advantageous in view of material compatibility with the light-transmitting chip 10.
光透過性のチップ10内へのマイクロ共振器FPRの組み込み形成も様々な方法で可能であるが、例えば既に図10(A),(B)に即して説明した通り、二枚のガラス板10a，10bの貼り合わせでチップ10を構築するのならば、ガラス板10a，10bのそれぞれの片側に分布ブラッグ反射ミラーを蒸着、スパッタリング、イオンプレーティング等により形成し、一枚のガラス板のブラッグ反射ミラー上にSiO2をプラズマCVD等により製膜してからチャネルをリソグラフィ形成した後に、もう一枚のガラス板を接着する等の手法を採ることができる。また、チップ10の作製後に、その外側の両面に分布ブラッグ反射ミラーを形成する方法もある。 Various methods can be used to incorporate the microresonator FPR into the light-transmitting chip 10. For example, as already described with reference to FIGS. 10 (A) and 10 (B), two glass plates are used. If the chip 10 is constructed by bonding 10a and 10b, a distributed Bragg reflector is formed on each side of the glass plates 10a and 10b by vapor deposition, sputtering, ion plating, etc. After forming SiO 2 on the reflection mirror by plasma CVD or the like and then forming the channel by lithography, a method of adhering another glass plate can be employed. There is also a method in which a distributed Bragg reflector mirror is formed on both outer surfaces of the chip 10 after fabrication.
一般に、チャンネルのエッチングは等方性のウェットエッチングにより行われるため、その断面は矩形部分の両側に四分の一円を合成した形状になるが、共振器の光閉じ込め効率を失わないためには、励起光Leは分離チャネル16の中心の矩形部分のみを通過させることが望ましい。ウェットエッチングであってもブラッグ反射ミラーがエッチストップ層である場合やドライエッチングを用いれば、チャンネルの断面を矩形にすることも可能であり、理想的ではある。 In general, channel etching is performed by isotropic wet etching, so the cross section has a shape that combines a quarter circle on both sides of the rectangular part, but in order not to lose the optical confinement efficiency of the resonator Desirably, the excitation light Le passes only through the rectangular portion at the center of the separation channel 16. Even in the case of wet etching, if the Bragg reflector mirror is an etch stop layer or if dry etching is used, the channel cross section can be made rectangular, which is ideal.
また、ファブリペロー共振器における良く知られた安定共振条件を実現するために、分布ブラッグ反射ミラーR1，R2に湾曲を持たせてもよい。同様な理由で、励起光Leは完全に平行化する必要はなく、その意味から、凹レンズ63は必ずしも必要でない場合もある。また、幾何配置的な改変もさまざま考えられ、励起光源30と半導体光検出素子20は、やはり同一の基板上に作製した構造とすることもできる。この幾何的配置構造の自由性は、以下に述べる図７，８に図示する実施形態でも同様である。 Further, in order to realize a well-known stable resonance condition in the Fabry-Perot resonator, the distributed Bragg reflection mirrors R1 and R2 may be curved. For the same reason, it is not necessary for the excitation light Le to be completely collimated, and for this reason, the concave lens 63 may not be necessarily required. Various geometrical modifications are also conceivable, and the excitation light source 30 and the semiconductor light detection element 20 can also be formed on the same substrate. The freedom of this geometric arrangement structure is the same in the embodiments shown in FIGS.
ところで、連続光よりもピーク光強度の高いパルス光を用いた方が二光子吸収による放出光の発生を効率的に起こすことができることは知られている。そこで、本発明では、図７に示すような実施形態も提案する。すなわち、この実施形態では、面発光レーザ30からの光（波長λ1)照射でQスイッチレーザQSLが励起され、ここから短パルスレーザ光（波長λ2＞λ1)が励起光Leとして出射されるようになっており、これが分離チャネル16内のサンプルプラグを照射する。 By the way, it is known that use of pulsed light having a higher peak light intensity than continuous light can efficiently generate emission light by two-photon absorption. Therefore, the present invention also proposes an embodiment as shown in FIG. That is, in this embodiment, the Q-switched laser QSL is excited by irradiation with light (wavelength λ1) from the surface emitting laser 30, and short pulse laser light (wavelength λ2> λ1) is emitted therefrom as excitation light Le. This illuminates the sample plug in the separation channel 16.
QスイッチレーザQSLの原理自体は周知であって、本発明においては、特に受動QスイッチレーザQSLの利得媒質GM（例えばNd:YAG、Nd:YVO4、Yb:YAG等）と可飽和吸収体SA（例えばCr:YAG等）の端面に所定の透過率，反射率の一対のミラー（望ましくは分布ブラッグ反射ミラー）R3，R4を形成して既述の波長λ2の光に対しての共振器を構成させ、一方で、利得媒質GMと可飽和吸収体SAの間に第三のミラー（これも望ましくは分布ブラッグ反射ミラー）R5を挿入して波長λ2の光は透過させさるが波長λ1の光は反射する構成とすると、利得媒質GMを効率的に励起すると共に面発光レーザ30からの光が分離チャンネル16内に侵入することを効率的に防ぐことができる。実際、こうした構造により、励起光Leとしてのレーザ光強度は瞬間的に桁違いに増すことができ、二光子吸収による蛍光強度も飛躍的に高めることができた。 The principle of the Q-switched laser QSL itself is well known. In the present invention, in particular, the gain medium GM (for example, Nd: YAG, Nd: YVO 4 , Yb: YAG, etc.) of the passive Q-switched laser QSL and the saturable absorber SA. A pair of mirrors (preferably distributed Bragg reflection mirrors) R3 and R4 having a predetermined transmittance and reflectance are formed on the end face (for example, Cr: YAG, etc.) to provide a resonator for the light having the wavelength λ2 described above. On the other hand, a third mirror (also desirably a distributed Bragg reflector mirror) R5 is inserted between the gain medium GM and the saturable absorber SA to transmit light of wavelength λ2 but light of wavelength λ1. If it is configured to reflect, it is possible to efficiently excite the gain medium GM and efficiently prevent the light from the surface emitting laser 30 from entering the separation channel 16. In fact, with such a structure, the intensity of the laser beam as the excitation light Le can be instantaneously increased by orders of magnitude, and the fluorescence intensity due to two-photon absorption can be dramatically increased.
さらに、利得媒質GMに半導体を用いると、QスイッチレーザQSLの発振波長を容易に制御できる等で有利であり、半導体利得媒質中に量子井戸を形成するとキャリア閉じ込め効果によりレーザ発振効率を上げることもできる。特に、本発明の場合のように、バイオ分析に有効な色素を励起するためには、GaAs基板上のInGaAsから成る量子井戸が適している。また、可飽和吸収体SAについても半導体を用いると（こうした構造は、ミラーと半導体可飽和吸収体SAが一体となったSESAM(SEmiconducotr Saturable Absorber Mirrors)として知られている）、吸収帯域が広いという長所があり、量子井戸構造や製膜温度の工夫により吸収回復時間や吸収が飽和する光強度を制御できる。更には、利得媒質GMの利得曲線と可飽和吸収体SAの吸収帯域に十分な重なりが生じるようにInとGaの組成およびInGaAs量子井戸層の厚みを定めて、同一の半導体基板上に一体として作製した場合は、実装プロセスが不要となり、素子の小型化と信頼性の向上、更には生産コストの低減に大きな役割を果たす。 Furthermore, the use of a semiconductor for the gain medium GM is advantageous because the oscillation wavelength of the Q-switched laser QSL can be easily controlled, and the formation of a quantum well in the semiconductor gain medium can increase the laser oscillation efficiency due to the carrier confinement effect. it can. In particular, as in the case of the present invention, a quantum well made of InGaAs on a GaAs substrate is suitable for exciting a dye effective for bioanalysis. Also, if a semiconductor is used for the saturable absorber SA (this structure is known as SESAM (SEmiconducotr Saturable Absorber Mirrors) in which the mirror and the semiconductor saturable absorber SA are integrated), the absorption band is wide. There is an advantage, and it is possible to control the absorption recovery time and the light intensity at which the absorption is saturated by devising the quantum well structure and the film forming temperature. Furthermore, the composition of In and Ga and the thickness of the InGaAs quantum well layer are determined so that there is sufficient overlap between the gain curve of the gain medium GM and the absorption band of the saturable absorber SA, and they are integrated on the same semiconductor substrate. When manufactured, the mounting process becomes unnecessary, and it plays a major role in reducing the size and improving the reliability of the element, and further reducing the production cost.
なお、着目したいのは、図６、図７に示された実施形態におけるそれぞれ重要な構成要素の全ては同軸に配置されており、容易に並列化できるデザインであることである。もちろん、既に、図４、図５の実施形態に即し説明したように、面発光レーザ30とフォトダイオード20をモノリシック集積することもできるし、図３に示した実施形態のようにフォトダイオード20と光学フィルタ50を光透過性のチップ10にモノリシック集積した構造に改変することもできる。 It should be noted that all the important components in the embodiments shown in FIGS. 6 and 7 are arranged coaxially and can be easily parallelized. Of course, the surface emitting laser 30 and the photodiode 20 can be monolithically integrated as already described with reference to the embodiment of FIGS. 4 and 5, or the photodiode 20 as in the embodiment shown in FIG. The optical filter 50 can be modified to a monolithically integrated structure on the light transmissive chip 10.
ここで、並列可能なデザインに重点を置くのであれば、図８に示すように、ガラス基板18の裏側にブラッグ反射ミラーR6を製膜し、面発光レーザ30の分布ブラッグ反射ミラー34との間で形成される共振器に、KTP(=KTiOPO4)、KDP(=KH2PO4)、あるいはPPLN(=Periodically Poled LiNbO3)等のSHG素子を挿入する構造とすることもでき、これにより効率的に倍波を生成することができる。この場合には、通常の一光子吸収でもバイオ分析に有用な色素を励起できる。 Here, if the emphasis is placed on the parallel design, a Bragg reflection mirror R6 is formed on the back side of the glass substrate 18 as shown in FIG. The SHG element such as KTP (= KTiOPO 4 ), KDP (= KH 2 PO 4 ), or PPLN (= Periodically Poled LiNbO 3 ) can be inserted into the resonator formed by A harmonic can be generated automatically. In this case, a dye useful for bioanalysis can be excited even by ordinary one-photon absorption.
ところで、図１，４〜８の各図に即して説明してきた本発明による放出光検出装置は、図９に示すように、面発光レーザ30と蛍光検出部40を中心とする一体集積化構造を一つのモジュール70とした場合、このモジュール70を一次元ないしは二次元にアレイ化した構造に展開できる。本図に示されているモジュール70は、マイクロ収束レンズ62が基板36上に設けられていない点では相違するものの、概ね図５に示したものに対応するが、図１、図４〜８に図示した構造に置き換えても構わない。各モジュール70にはそれぞれ対応してマイクロ収束レンズ62と蛍光収集用のマイクロレンズ61とが備えられ、これらは一体のレンズモジュール80として励起光および蛍光の光路途中に設けられている。 By the way, as shown in FIG. 9, the emission light detection apparatus according to the present invention, which has been described with reference to FIGS. 1 and 4 to 8, is integrated as a single unit with a surface emitting laser 30 and a fluorescence detection unit 40 as the center. When the structure is a single module 70, the module 70 can be developed into a structure in which one-dimensional or two-dimensional arrays are formed. The module 70 shown in the figure is substantially the same as that shown in FIG. 5 although it is different in that the micro-converging lens 62 is not provided on the substrate 36. However, the module 70 shown in FIGS. The structure shown in the figure may be replaced. Each module 70 is provided with a micro converging lens 62 and a microlens 61 for collecting fluorescence corresponding to each module 70, and these are provided as an integral lens module 80 in the optical path of excitation light and fluorescence.
一次元にアレイ化した装置では、例えば複数の電気泳動のチャネルを並列的に分析することができるし、チャネルの長さ方向に沿って配置すれば、ある時間におけるチャネル内のイメージ像を得ることができる。後者は等電点電気泳動(Isoelectric Focusing：IEF)の分析に適している。等電点電気泳動は、下記の非特許文献３に認められるゲル電気泳動(SDS-PAGE)と組み合わせて用いられ、蛋白質分析に中心的な役割を果たしている。最近、マイクロ流体二次元電気泳動（IEF + SDS-PAGE）デバイスのデザインが報告されたが、二組のモジュール70を一次元アレイ化したものを用いれば、こうしたデザインにより簡単に対応できる。本発明に従うこのようなモジュールアレイは、従来のレーザ誘起蛍光検出スキャナと異なり、マイクロ流体ラボ・オン・チップのデザインに全く制約を課さないという大きな利点がある。
また、既に述べたように、本発明によると二光子吸収による励起は励起光焦点近傍に限定することができるので、実効的な空間フィルタリングの効果を有する。そのため、図９の下半分に模式的に示すように、図１，４〜７に示した構造に即するモジュール70を用いるならば、その二次元アレイ70’を、やはり二次元配置された対象物収容チップ10’に対し、例えば圧電素子を用いた走査機構90により三次元的に走査できるようにすると、対象物の立体イメージ画像を得ることもできる。例えば、ソフトリソグラフィにより、自己集合化単分子膜（Self-Assembled Monolayer：SAM）のパターン形成を行い、細胞をアレイ上に固定、配置したガラスチップ10’、あるいは酸素透過性があり、バイオ適合性のあるPDMS（Poly Dimethyl Siloxane）とガラス基板を用いて微小容器中で培養される細胞アレイチップ10’を用いることで、当該細胞アレイを並列にイメージングすることができ、この場合、多数の細胞を並列に観測できるので、ドラッグ・スクリーニング等に有用なものとなる。もちろん、必要に応じ、一次元方向のみ、二次元方向のみの走査であって良い場合もあるし、単一のモジュール70をのみ走査可能としての応用使途も考えられる。 Further, as already described, according to the present invention, excitation by two-photon absorption can be limited to the vicinity of the excitation light focal point, and thus has an effective spatial filtering effect. Therefore, as schematically shown in the lower half of FIG. 9, if the module 70 conforming to the structure shown in FIGS. 1 and 4 to 7 is used, the two-dimensional array 70 ′ is also a two-dimensionally arranged object. If the object accommodation chip 10 ′ can be scanned three-dimensionally, for example, by a scanning mechanism 90 using a piezoelectric element, a three-dimensional image of the object can be obtained. For example, a self-assembled monolayer (SAM) pattern is formed by soft lithography, and a cell chip 10 'in which cells are fixed and arranged on the array, or oxygen permeable and biocompatible. Cell array chip 10 'cultured in a micro container using PDMS (Poly Dimethyl Siloxane) and glass substrate can be used to image the cell array in parallel. Since it can be observed in parallel, it is useful for drug screening. Of course, if necessary, scanning in only one-dimensional direction or only in two-dimensional direction may be performed, and application use in which only a single module 70 can be scanned can be considered.
なお、二光子吸収は利用しないが、図８に示された構造に従うモジュールをこの図９に示されるように二次元アレイ化することもできる。この場合、上述の空間フィルタリングの効果がないので、対象物の立体イメージ画像のイメージングをする時の分解能は二光子吸収と比べると悪くはなるが、それで問題にならならない場合もあるし、データ処理の如何により、分解能を上げることもできる。また、図８には示していなかったが、やはり、図９に示されているように、マイクロ収束レンズ62を励起光路途中に挿入した方が分解能は上がる。その光照射面積を微小化することが、一光子吸収の場合、効果的である。 Although two-photon absorption is not used, modules according to the structure shown in FIG. 8 can be two-dimensionally arrayed as shown in FIG. In this case, since there is no effect of the spatial filtering described above, the resolution when imaging a stereoscopic image of an object is worse than that of two-photon absorption, but this may not be a problem, and data processing may not be a problem. However, the resolution can be increased. Although not shown in FIG. 8, as shown in FIG. 9, the resolution increases when the micro converging lens 62 is inserted in the excitation light path. In the case of one-photon absorption, it is effective to reduce the light irradiation area.
以上、本発明の望ましい実施形態に就き説明したが、本発明要旨構成に即する限り、任意の改変、応用は自由である。また、さらなる改変例も種々考えられ、例えばa-Si:Hフォトダイオード20を複数に分割し、その各々に異なる分光特性を持つ光学フィルタを集積化すると、波長多重分析も可能になる。例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシンをそれぞれに異なる波長の蛍光を放出する色素で標識することで、DNAシークエンシングのような分析も可能となる。図10に示したような細胞のイメージングでは、このような波長多重分析により、複数の生体物質を同時に追跡することができる。走査機構との組み合わせは応用範囲を一層広げることは顕かである。既に述べた通り、放出光として蛍光を検出するにしても、それは半導体量子ドットないしそれにより標識された微小対象物からの蛍光である場合にも本発明は全く同様に有利に適用可能であることは顕かであるし、蛍光のみならず、燐光の検出に好適なことも顕かである。 As mentioned above, although preferred embodiment of this invention was described, as long as it suits the summary structure of this invention, arbitrary modifications and applications are free. Various further modifications are also conceivable. For example, if the a-Si: H photodiode 20 is divided into a plurality of parts and optical filters having different spectral characteristics are integrated in each of them, wavelength multiplexing analysis is possible. For example, by labeling adenine, guanine, thymine, and cytosine with dyes that emit fluorescence of different wavelengths, analysis such as DNA sequencing becomes possible. In cell imaging as shown in FIG. 10, a plurality of biological substances can be tracked simultaneously by such wavelength multiplexing analysis. It is obvious that the combination with the scanning mechanism further expands the application range. As described above, even if fluorescence is detected as emitted light, the present invention can be applied to the same advantage when the fluorescence is from a semiconductor quantum dot or a micro object labeled thereby. It is obvious that it is suitable for detecting not only fluorescence but also phosphorescence.
なお、半導体光検出素子としてはこれまで述べてきたフォトダイオードに代えて、いわゆる光伝導体も用いることができる。この光伝導体を用いた素子も、それ自体は極めて周知であるので、これまで説明してきた半導体光検出素子に代えて組み込むことは当業者にとって何の困難性もない。また、フォトダイオードにしても、その材料は上述して来たようにa-Si:Hが望ましいものの、これに限定されるものではない。原料ガスを変えるだけで同様な方法で容易に作製可能な合金材料、例えば、水素化アモルファス・シリコン・ゲルマニウム合金、水素化アモルファス・シリコン・カーバイド合金等も含む。これらの合金はa-Si:Hに比べ、それぞれ長波長、短波長光に対する感度が高い。また、水素希釈率等の作製条件を変えるだけで、同様な方法で容易に作製できる微結晶シリコンやその合金材料も利用可能である。励起光源30として面発光レーザを用いる場合にも、GaInAs/GaAs系の面発光レーザのみならず、より短波長光を発振するGaAlAs/GaAs系等、より長波長光を発振するGaInAsN/GaAs系等も利用可能である。 As the semiconductor photodetecting element, a so-called photoconductor can be used instead of the photodiode described so far. Since an element using this photoconductor is also very well known, there is no difficulty for those skilled in the art to incorporate it in place of the semiconductor photodetector element described so far. In addition, although the photodiode is preferably a-Si: H as described above, it is not limited to this. Also included are alloy materials that can be easily manufactured by the same method by changing the raw material gas, such as hydrogenated amorphous silicon silicon germanium alloy, hydrogenated amorphous silicon silicon carbide alloy, and the like. These alloys are more sensitive to long and short wavelength light than a-Si: H, respectively. Further, microcrystalline silicon and its alloy material that can be easily manufactured by the same method can be used only by changing the manufacturing conditions such as the hydrogen dilution rate. When using a surface emitting laser as the excitation light source 30, not only a GaInAs / GaAs surface emitting laser, but also a GaAlAs / GaAs system that oscillates shorter wavelength light, a GaInAsN / GaAs system that oscillates longer wavelength light, etc. Is also available.
10 光透過性のチップ
11 サンプルリザーバ
12 ウエイストリザーバ
13 陰極リザーバ
14 陽極リザーバ
15 注入チャネル
16 分離チャネル
20 半導体光検出素子
30 励起光源
40 蛍光検出部
41 透孔（ピンホール）
50 光学フィルタ
61 蛍光収集用マイクロレンズ
62 励起光収束用マイクロ収束レンズ
63 凹レンズ
70 励起光源と蛍光検出部とから構成されたモジュール
80 レンズモジュール
90 走査機構
Le 励起光
Lf 蛍光
FPR 共振器
R1，R2，R3，R4，R5，R6 ミラー
QSL Qスイッチレーザ
GM 利得媒質
SA 可飽和吸収体
SHG SHG素子
10 Light-transmitting chip
11 Sample reservoir
12 Waste reservoir
13 Cathode reservoir
14 Anode reservoir
15 injection channels
16 separation channels
20 Semiconductor photodetector
30 Excitation light source
40 Fluorescence detector
41 Through hole (pinhole)
50 Optical filter
61 Microlens for fluorescence collection
62 Micro-focusing lens for pumping light convergence
63 concave lens
70 Module composed of excitation light source and fluorescence detector
80 Lens module
90 Scanning mechanism
Le excitation light
Lf fluorescence
FPR resonator
R1, R2, R3, R4, R5, R6 mirrors
QSL Q-switched laser
GM gain medium
SA saturable absorber
SHG SHG element
Claims (29)
該励起光の光路途中に挿入され、該励起光を収束し、その光強度密度を高めて上記微小対象物を照射させることにより、該微小対象物から二光子吸収で上記放出光を放出させるためのマイクロ収束レンズを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
Inserting in the optical path of the excitation light, converging the excitation light, increasing the light intensity density and irradiating the micro object, thereby emitting the emitted light from the micro object by two-photon absorption Having a micro-converging lens;
A device for detecting light emitted from a minute object.
該励起光の光路途中に挿入された一対のミラーから成るマイクロ共振器を有し；
該一対のミラーの間に上記微小対象物が配置されており；
該マイクロ共振器が該一対のミラー間での多重反射機能により上記励起光の実効強度を高めた状態で該励起光を該微小対象物に照射させることで、該微小対象物から二光子吸収による放出光を発生させること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
A microresonator comprising a pair of mirrors inserted in the optical path of the excitation light;
The micro object is disposed between the pair of mirrors;
By irradiating the micro object with the excitation light in a state where the effective intensity of the excitation light is increased by the multi-reflection function between the pair of mirrors, the micro resonator causes two-photon absorption from the micro object. Generating emitted light;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光源からの光照射により短パルスレーザを生成し、瞬間的にピーク光強度を高めてから該短パルスレーザ光を上記励起光として上記微小対象物に照射させることで、該微小対象物から二光子吸収による放出光を発生させるQスイッチレーザを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
A short pulse laser is generated by light irradiation from the excitation light source, and the peak light intensity is instantaneously increased, and then the short pulse laser light is irradiated as the excitation light to the minute object. Having a Q-switched laser that generates emission light by two-photon absorption;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光源の発する光の倍波を生成して上記励起光とし、該励起光を上記微小対象物に照射することで該微小対象物から一光子吸収による放出光を発生させるために、該励起光の光路途中に設けられている共振器内に挿入されたSHG素子を有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device for detecting emission light emitted from a micro object in the form of fluorescence or phosphorescence upon irradiation with excitation light emitted from an excitation light source;
In order to generate a double wave of the light emitted from the excitation light source to generate the excitation light, and to emit emission light by one-photon absorption from the micro object by irradiating the micro object with the excitation light, the excitation light Having an SHG element inserted in a resonator provided in the optical path of the light;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記微小対象物の放出する放出光は、該放出光に対して選択透過性を有する光学フィルタを介して上記半導体光検出素子に入射すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The emitted light emitted from the minute object is incident on the semiconductor photodetecting element through an optical filter having selective transmission with respect to the emitted light;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子は、上記微小対象物を載持する光透過性のチップに一体的に形成されていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The semiconductor photodetecting element is formed integrally with a light-transmitting chip carrying the micro object;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光源は面発光レーザであること：
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The excitation light source is a surface emitting laser:
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子はa-Si:H材料を用いて作製されたフォトダイオードであること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The semiconductor photodetection element is a photodiode fabricated using an a-Si: H material;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子はa-Si:H材料を用いて作製された光伝導体であること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The semiconductor photodetector is a photoconductor fabricated using a-Si: H material;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光源と上記半導体光検出素子は、同一の基板上に形成されていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The excitation light source and the semiconductor light detection element are formed on the same substrate;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子と上記励起光源との組み合わせが一つのモジュールを構成し；
該モジュールが複数個、一次元または二次元的に並設されてモジュールアレイを構成していること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
A combination of the semiconductor photodetecting element and the excitation light source constitutes one module;
A plurality of the modules are arranged one-dimensionally or two-dimensionally to form a module array;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子と上記励起光源との組み合わせが一つのモジュールを構成し；
該モジュールを一次元方向または二次元方向、あるいは三次元方向に走査する走査機構を有すること：
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
A combination of the semiconductor photodetecting element and the excitation light source constitutes one module;
Having a scanning mechanism for scanning the module in a one-dimensional direction, a two-dimensional direction, or a three-dimensional direction:
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子と上記励起光源との組み合わせが一つのモジュールを構成し；
該モジュールが複数個、一次元または二次元的に並設されてモジュールアレイを構成していると共に；
上記モジュールを一次元方向または二次元方向、あるいは三次元方向に走査する走査機構を有すること：
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
A combination of the semiconductor photodetecting element and the excitation light source constitutes one module;
A plurality of the modules are arranged side by side in one or two dimensions to form a module array;
Having a scanning mechanism that scans the module in one, two or three dimensions:
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記微小対象物は色素または半導体量子ドットであるか、色素あるいは半導体量子ドットで標識された微小サンプルであること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3, and 4,
The micro object is a dye or a semiconductor quantum dot or a micro sample labeled with a dye or a semiconductor quantum dot;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光の波長は上記半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より長く、上記放出光の波長は該半導体光検出素子のバンドギャップに相当する波長より短い関係にあること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to any one of claims 1, 2, 3;
The wavelength of the excitation light is longer than the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor light detection element, and the wavelength of the emitted light is shorter than the wavelength corresponding to the band gap of the semiconductor light detection element;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光源と上記マイクロ共振器の間の光路途中には、上記励起光を収束するマイクロ収束レンズが設けられるか、または上記励起光を収束するマイクロ収束レンズと、これにより収束された上記励起光を平行化して上記マイクロ共振器に入射させる凹レンズが設けられていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to claim 2,
In the middle of the optical path between the excitation light source and the micro resonator, a micro convergence lens for converging the excitation light is provided, or a micro convergence lens for converging the excitation light, and the excitation light converged thereby A concave lens that collimates the light and enters the microresonator;
A device for detecting light emitted from a minute object.
該励起光の光路途中に挿入され、該励起光を収束し、その光強度密度を高めて上記微小対象物を照射させることにより、該微小対象物から二光子吸収で上記放出光を放出させるためのマイクロ収束レンズを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 3,
Inserting in the optical path of the excitation light, converging the excitation light, increasing the light intensity density and irradiating the micro object, thereby emitting the emitted light from the micro object by two-photon absorption Having a micro-converging lens;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記Qスイッチレーザが利得媒体と可飽和吸収体から構成された受動型であること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 3,
The Q-switched laser is a passive type composed of a gain medium and a saturable absorber;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記Qスイッチレーザの利得媒体が半導体量子井戸構造であって、可飽和吸収体も半導体量子井戸構造であること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 19. The micro-object emission light detection device according to claim 18, wherein
The gain medium of the Q-switched laser is a semiconductor quantum well structure, and the saturable absorber is also a semiconductor quantum well structure;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記Qスイッチレーザの利得媒体と可飽和吸収体がGaAs基板上に成長されたInGaAsから成る量子井戸であり；
該利得媒質の利得曲線と該可飽和吸収体の吸収帯域に重なりが生じるようにInとGaの組成及びInGaAs量子井戸層の厚みが定められること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 19. The micro-object emission light detection device according to claim 18, wherein
A quantum well consisting of InGaAs in which the gain medium and saturable absorber of the Q-switched laser are grown on a GaAs substrate;
The composition of In and Ga and the thickness of the InGaAs quantum well layer are determined so that the gain curve of the gain medium and the absorption band of the saturable absorber overlap.
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記Qスイッチレーザの利得媒質と可飽和吸収体が同一半導体基板上に一体として形成されていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 19. The micro-object emission light detection device according to claim 18, wherein
The gain medium of the Q-switched laser and the saturable absorber are integrally formed on the same semiconductor substrate;
A device for detecting light emitted from a minute object.
該励起光の光路途中に挿入され、該励起光を収束し、その光照射面積を微小化して上記微小対象物を照射させるマイクロ収束レンズを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A minute object emission light detection device according to claim 4,
Having a micro-converging lens that is inserted in the optical path of the excitation light, converges the excitation light, reduces the light irradiation area, and irradiates the minute object;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記マイクロ収束レンズは、上記半導体光検出素子の構築されている基板に設けられていること：
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to any one of claims 1, 16, 17, and 22,
The micro-converging lens is provided on a substrate on which the semiconductor photodetecting element is constructed:
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記マイクロ収束レンズは、上記微小対象物を載持する光透過性のチップに形成されていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to any one of claims 1, 16, 17, and 22,
The micro-converging lens is formed on a light-transmitting chip that carries the minute object;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記励起光の波長は近赤外領域の波長であること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 5,
The excitation light has a wavelength in the near infrared region;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記微小対象物の放出する放出光を収集および平行化し、該光学フィルタに導くマイクロレンズを有すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 5,
Having a microlens that collects and collimates the emitted light emitted by the micro object and guides it to the optical filter;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記光学フィルタ及び上記半導体光検出素子の側壁にあって少なくとも上記励起光の散乱光が入射する可能性のある側壁部分は遮蔽膜により覆われていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 5,
A side wall portion of the optical filter and the semiconductor photodetecting element on which the scattered light of the excitation light may be incident is covered with a shielding film;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子と上記光学フィルタとを有する放出光検出部は、平面的に見て円形またはｎを整数３以上の数としてｎ角形形状の立体形状をなし；
該立体形状の一部に円形もしくはｎ角形形状の透孔が開いており；
上記励起光は該透孔内を通過するように構成されていること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。 A micro-object emission light detection device according to claim 5,
The emission light detection unit having the semiconductor photodetecting element and the optical filter has a circular shape or a three-dimensional shape of an n-gon shape when n is a number equal to or larger than an integer 3 when seen in a plan view;
A circular or n-gonal through-hole is opened in a part of the three-dimensional shape;
The excitation light is configured to pass through the through hole;
A device for detecting light emitted from a minute object.
上記半導体光検出素子は複数に分割され；
上記微小対象物の放出する放出光は、該放出光に対してそれぞれ異なる分光特性を持つ光学フィルタを介して上記半導体光検出素子の分割部分の各々に入射すること；
を特徴とする微小対象物放出光検出装置。
A micro-object emission light detection device according to claim 5,
The semiconductor photodetector element is divided into a plurality of parts;
The emitted light emitted by the minute object is incident on each of the divided portions of the semiconductor photodetecting element through optical filters having different spectral characteristics with respect to the emitted light;
A device for detecting light emitted from a minute object.
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