JP2005278645A - Mutant bacterium of genus bacillus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。 The present invention relates to a host microorganism, a recombinant microorganism, and a method for producing a protein or polypeptide used for producing a useful protein or polypeptide.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, medicines, daily necessaries such as detergents and cosmetics to various chemical raw materials.
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。一方、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、特に最近では、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。遺伝子組換え技術を用いた生産菌育種の方法として、遺伝子の発現を調節する転写因子、特にＲＮＡポリメラーゼのシグマ因子を増強する例が知られており、例えば、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）において、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）をコードするｒｐｏＤ遺伝子のコピー数を増加させることによりpyoluteorinや2,4-diacetylphloroglucinol等の抗生物質の生産量を増加させた報告例（例えば、非特許文献１参照）や、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicus）においてハウスキーピングなｓｉｇＡ遺伝子を過剰発現させることによりＬ−リジンの発酵生産量を増加させた報告例（例えば、特許文献１参照）などがある。 In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues, and breeding of produced bacteria by genetic techniques such as mutation has been performed as a technique. On the other hand, with the development of microbial genetics and biotechnology, more recently, more efficient breeding of production bacteria using genetic recombination technology has been carried out. Development of host microorganisms for genetic recombination Is underway. As a method for breeding producing bacteria using gene recombination technology, examples of enhancing transcription factors that regulate gene expression, particularly sigma factors of RNA polymerase, are known. For example, Pseudomonas fluorescens In the vegetative growth phase by increasing the copy number of the rpoD gene encoding the major sigma factor (housekeeping sigma factor) involved in the transcription of genes essential for growth in the growth phase of antibiotics such as pyoluteorin and 2,4-diacetylphloroglucinol Increasing fermentative production of L-lysine by overexpressing a housekeeping sigA gene in report examples (see Non-Patent Document 1, for example) with increased production and Corynebacterium glutamicus Report examples (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、これらはいずれも栄養増殖期に於いてハウスキーピングシグマ因子遺伝子の発現を増強するものであった。また、枯草菌（Bacillus subtilis）をはじめとするバチルス属細菌においては、シグマ因子を増強することによって有用物質の生産量を増加させるという報告はこれまでにない。
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする変異バチルス属細菌、また当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することを目的とする。 The present invention relates to a mutant bacterium belonging to the genus Bacillus capable of improving the productivity of a protein or polypeptide, a recombinant microorganism in which a gene encoding a heterologous protein or polypeptide is introduced into the mutant bacterium belonging to the genus Bacillus, and the recombinant microorganism. It aims at providing the manufacturing method of the protein or polypeptide which uses this.
バチルス属細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子が、シグマ因子以外の複数サブユニットから成るＲＮＡポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによって、ゲノム上に数千個存在する遺伝子について、状況に応じた遺伝子の発現制御を行っていると考えられている。例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるＳｉｇＡをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子ＳｉｇＨ、ＳｉｇＦ、ＳｉｇＥ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＫ、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子ＳｉｇＤ、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子ＳｉｇＬ、環境変化への対応を制御するシグマ因子ＳｉｇＢやＥＣＦシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている（ Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。 Bacillus bacteria have a plurality of sigma factors involved in recognition of promoter sequences as subunits of RNA polymerase. Different genes are transcribed by binding sigma factors recognizing different promoters to the RNA polymerase core complex consisting of multiple subunits other than sigma factors. It is considered that gene expression is controlled accordingly. For example, among Bacillus bacteria, 17 sigma factors have been identified for Bacillus subtilis, and SigA, which is a major sigma factor (housekeeping sigma factor) involved in transcription of genes essential for growth in the vegetative growth phase, is identified. First, sigma factors SigH, SigF, SigE, SigG, SigK controlling spore formation process, sigma factor SigD controlling flagellar formation and cell wall lysis, sigma factor SigL controlling metabolism of certain amino acids and sugars, environment The existence of sigma factors such as sigma factor SigB and ECF sigma that control the response to changes is known ( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)).
これらの中で、胞子形成過程を制御するシグマ因子は、図１に示す様に胞子形成過程の進行に伴って順次発現・活性化されることが知られている。即ち、枯草菌が栄養飢餓状態に陥ると、まずリン酸リレー系と呼ばれる複数のタンパク質間での多段階リン酸伝達系を経て胞子形成開始制御因子であるＳｐｏ０Ａのリン酸化が引き起こされる（Cell, 64, 545, (1991)）。リン酸化Ｓｐｏ０Ａ（Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ）の濃度上昇に伴い、ＳｉｇＨの構造遺伝子（ｓｉｇＨ）の発現を抑制しているリプレッサーＡｂｒＢの誘導が抑制され、結果的にｓｉｇＨの転写がＳｉｇＡ依存的に誘導される（J. Bacteriol., 173, 521, (1991)）。ＳｉｇＨが活性化された後、非対象隔膜形成により枯草菌の細胞質は母細胞側と娘細胞側に分割され、次いで娘細胞側でＳｐｏ０Ａ〜ＰとＳｉｇＨが共役してＳｉｇＦの構造遺伝子（ｓｉｇＦ）を含むオペロン（ｓｐｏIIＡＡ−ｓｐｏIIＡＢ−ｓｉｇＦ）の転写を誘導し（Gene, 101, 113, (1991)）、母細胞側ではＳｐｏ０Ａ〜ＰとＳｉｇＡが共役してＳｉｇＥ前駆体の構造遺伝子（ｓｉｇＥ）を含むオペロン（ｓｐｏIIＧＡ−ｓｉｇＥ）の転写を誘導する（J. Bacteriol., 169, 3329, (1987)）。ＳｉｇＦはアンチ−シグマ因子ＳｐｏIIＡＢ及びアンチ−アンチ−シグマ因子ＳｐｏIIＡＡ、更にＳｐｏIIＡＡの脱リン酸化酵素であるＳｐｏIIＥにより活性化を制御されており（Genes Cells, 1, 881 (1996)）、活性化したＳｉｇＦはシグナル伝達タンパクであるＳｐｏIIＲの構造遺伝子（ｓｐｏIIＲ）の転写を誘導する。娘細胞側から分泌されたＳｐｏIIＲは母細胞側の非対象隔膜に局在するＳｉｇＥ前駆体活性化プロテアーゼであるＳｐｏIIＧＡを活性化し、これによってＳｉｇＥの活性化が起こると考えられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 2012, (1995)）。 Among these, it is known that sigma factors that control the sporulation process are sequentially expressed and activated as the sporulation process proceeds as shown in FIG. That is, when Bacillus subtilis falls into a nutrient-starved state, phosphorylation of Spo0A, which is a spore formation initiation regulator, is first caused through a multi-step phosphate transmission system between a plurality of proteins called a phosphate relay system (Cell, 64, 545, (1991)). As the concentration of phosphorylated Spo0A (Spo0A to P) increases, the induction of repressor AbrB that suppresses the expression of the structural gene ( sigH ) of SigH is suppressed, and as a result, transcription of sigH is induced in a SigA-dependent manner. (J. Bacteriol., 173, 521, (1991)). After the activation of SigH, the cytoplasm of Bacillus subtilis is divided into the mother cell side and the daughter cell side by non-target membrane formation, and then Spo0A-P and SigH are coupled on the daughter cell side to form the structural gene ( sigF ) of SigF . ( SeneII - spoIIAB - sigF ) is induced (Gene, 101, 113, (1991)), and on the mother cell side, Spo0A-P and SigA are conjugated to form the structural gene ( sigE ) of the SigE precursor. It induces transcription of the operon containing ( spoIIGA - sigE ) (J. Bacteriol., 169, 3329, (1987)). The activation of SigF is controlled by the anti-sigma factor SpoIIAB, the anti-anti-sigma factor SpoIIAA, and SpoIIE which is a dephosphorylation enzyme of SpoIIAA (Genes Cells, 1, 881 (1996)). Induces transcription of the structural gene ( spoIIR ) of SpoIIR , which is a signal transduction protein. It is believed that SpoIIR secreted from the daughter cell side activates SpoIIGA, a SigE precursor activating protease localized in the non-target diaphragm on the mother cell side, thereby causing SigE activation (Proc. Natl). Acad. Sci. USA, 92, 2012, (1995)).
更に娘細胞側ではＳｉｇＦがＳｉｇＧの構造遺伝子（ｓｉｇＧ）の転写を誘導し、母細胞側ではＳｉｇＥがＳｉｇＫの構造遺伝子（ｓｉｇＫ）の転写を誘導するが、娘細胞側でのＳｉｇＧの活性化は母細胞側でのＳｉｇＥの活性化の後に起こり、母細胞側でＳｉｇＫの活性化はこの後に起こる（Mol. Microbiol., 31, 1285, (1999)）。 Further induce transcription SigF is the structural gene of SigG (sigG) the daughter cells side and SigE in the mother cell side induces the transcription of a structural gene of SigK (SIGK), activation of SigG on the daughter cell side SigE activation occurs on the mother cell side, and SigK activation occurs on the mother cell side (Mol. Microbiol., 31, 1285, (1999)).
栄養増殖期には主としてＳｉｇＡがＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合して、ＳｉｇＡが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導しているが、上記の様な機構により、胞子形成期に入って他のシグマ因子が活性化されると、ＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合するシグマ因子の置換が起こり、ＳｉｇＡと会合するＲＮＡポリメラーゼの量は相対的に低下することが報告されている（J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)）。この為、胞子形成期以降、ＳｉｇＡにより認識されるプロモーターからの転写量は相対的に低下するものと考えられる。 In the vegetative growth phase, SigA mainly associates with the RNA polymerase core complex and induces transcription of a gene or operon having a promoter recognized by SigA. It is reported that when other sigma factors are activated, substitution of the sigma factor associated with the RNA polymerase core complex occurs and the amount of RNA polymerase associated with SigA is relatively reduced (J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)). For this reason, it is considered that the transcription amount from the promoter recognized by SigA relatively decreases after the spore formation stage.
斯かる状況の下、本発明者らは、胞子形成期において特異的に認識、発現されるプロモーター配列を、主に栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子であるＳｉｇＡの遺伝子に連結させることにより、ＳｉｇＡの遺伝子の発現を栄養増殖期後の胞子形成期において増強することができ、当該シグマ因子とＲＮＡポリメラーゼコア複合体との結合量を増加させ、これによって胞子形成期以降の異種タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上が図れることを見出した。 Under such circumstances, the present inventors have identified a promoter sequence that is specifically recognized and expressed in the spore formation phase, SigA, which is a major sigma factor involved in transcription of a gene essential for growth mainly in the vegetative growth phase. By linking to the above gene, the expression of the SigA gene can be enhanced in the sporulation phase after the vegetative growth phase, and the amount of binding between the sigma factor and the RNA polymerase core complex is increased. It has been found that the productivity of heterologous proteins or polypeptides can be improved after the period.
すなわち本発明は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌を提供するものである。 That is, the present invention relates to a mutated Bacillus bacterium having a DNA on the genome or on a plasmid, wherein a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation stage is linked upstream of the sigA gene or a gene corresponding to the gene. Is to provide.
また本発明は、当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供するものである。 The present invention also provides a recombinant microorganism in which a gene encoding a heterologous protein or polypeptide is introduced into the mutant Bacillus bacterium, and a method for producing a protein or polypeptide using the recombinant microorganism.
また本発明は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、バチルス属細菌のゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築することを特徴とする変異バチルス属細菌の構築方法。 Further, the present invention has DNA on the genome or plasmid of a Bacillus bacterium, in which a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation stage is linked upstream of the sigA gene or a gene corresponding to the gene. A method for constructing a mutant Bacillus bacterium characterized by comprising:
本発明の微生物によれば、該異種タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができる。 According to the microorganism of the present invention, the heterologous protein or polypeptide can be produced efficiently.
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present invention, the identity of the amino acid sequence and the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to compare (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
本発明の変異バチルス属細菌は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、そのゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築したものである。 The mutant Bacillus genus bacterium of the present invention has a DNA on the genome or on a plasmid, which is linked to a sigA gene or a promoter sequence specifically recognized and transcribed in the sporulation stage upstream of the gene corresponding to the gene. It is constructed to have.
斯かる変異バチルス属細菌を構築するための親微生物としては、胞子形成を行うことを特徴とするバチルス属細菌であれば、その由来は限定されず、野生型のものでも変異を施したものでもよい。中でも本発明において用いられるバチルス属細菌の好ましい例は、全ゲノム情報が明らかにされている、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ハロドランス（Bacillus halodulans）などが挙げられ、特に、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から枯草菌が好ましい。 As a parental microorganism for constructing such a mutant Bacillus genus, the origin thereof is not limited as long as it is a Bacillus bacterium characterized by performing spore formation, either wild type or mutated Good. Among them, preferable examples of Bacillus bacteria used in the present invention include Bacillus subtilis , Bacillus cereus , Bacillus halodulans, etc. whose whole genome information has been clarified. In particular, Bacillus subtilis is preferable because genetic engineering and genome engineering techniques are established, and it has the ability to secrete and produce proteins outside the cells.
枯草菌のｓｉｇＡ遺伝子とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をいい、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を示す。 The sigA gene of Bacillus subtilis refers to a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the gene corresponding to the gene is 70% or more, preferably 80% or more in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. More preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more.
斯かるｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、胞子形成期特異的に認識、転写されるプロモーター配列を連結するが、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としては、天然由来のものでも、天然由来を改変したものでも、或いは化学合成したものでも良い。 A promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the spore formation stage is linked upstream of the sigA gene or a gene corresponding to the sigA gene. It may be naturally derived, modified from naturally derived, or chemically synthesized.
例えば枯草菌においては、以下（１）〜（６）の何れかの特徴をもつプロモーター配列が挙げられる。
（１）Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡにて認識、転写されるプロモーター配列
（２）ＳｉｇＨにて認識、転写されるプロモーター配列
（３）ＳｉｇＦにて認識、転写されるプロモーター配列
（４）ＳｉｇＥにて認識、転写されるプロモーター配列
（５）ＳｉｇＧにて認識、転写されるプロモーター配列
（６）ＳｉｇＫにて認識、転写されるプロモーター配列
For example, in Bacillus subtilis, a promoter sequence having any of the following characteristics (1) to (6) can be mentioned.
(1) Promoter sequence that is released from transcriptional repression by AbrB with increasing Spo0A to P concentration, and recognized and transcribed by SigA (2) Promoter sequence that is recognized and transcribed by SigH (3) By SigF Recognized and transcribed promoter sequence (4) Promoter sequence recognized and transcribed by SigE (5) Promoter sequence recognized and transcribed by SigG (6) Promoter sequence recognized and transcribed by SigK
一般に、シグマ因子は転写開始点の上流１０塩基及び３５塩基付近に存在する数塩基の配列を認識して結合するとされており、それぞれ−１０領域、−３５領域と呼ばれている。両領域の配列、両領域間の距離は、シグマ因子毎にそれぞれ共通な特徴を持つことが知られており、コンセンサス配列と呼ばれている。従って、前記（１）〜（６）のプロモーター配列には、（１'）Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡのコンセンサス配列を含む配列、（２'）ＳｉｇＨのコンセンサス配列を含む配列、（３'）ＳｉｇＦのコンセンサス配列を含む配列、（４'）ＳｉｇＥのコンセンサス配列を含む配列、（５'）ＳｉｇＧのコンセンサス配列を含む配列、（６'）ＳｉｇＫのコンセンサス配列を含む配列等が例示できる。
これまでに報告されている枯草菌各シグマ因子のコンセンサス配列を表１に示す。
In general, sigma factors recognize and bind to sequences of several bases existing in the vicinity of 10 bases and 35 bases upstream of the transcription start point, and are referred to as -10 region and -35 region, respectively. The arrangement of both regions and the distance between both regions are known to have common characteristics for each sigma factor, and are called consensus sequences. Therefore, the promoter sequences of (1) to (6) include (1 ′) a sequence that is released from transcriptional repression by AbrB as the Spo0A to P concentration increases, and contains a consensus sequence of SigA, (2 ′) A sequence comprising a consensus sequence of SigH, (3 ′) a sequence comprising a consensus sequence of SigF, (4 ′) a sequence comprising a consensus sequence of SigE, (5 ′) a sequence comprising a consensus sequence of SigG, (6 ′) a sequence of SigK Examples include sequences including consensus sequences.
Table 1 shows the consensus sequence of each sigma factor of Bacillus subtilis reported so far.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
配列中、ＲはＡまたはＧ、ＷはＡまたはＴ、Ｎは任意の塩基をそれぞれ示す。また大文字は保存性が高く、小文字は保存性が低いことを表す。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the sequence, R represents A or G, W represents A or T, and N represents any base. Upper case letters indicate high storability and lower case letters indicate low storability.
また、これまでに報告されているＡｂｒＢの認識結合配列は、ＷａＷＷｔｔｔＷＣＡＡａａａａＷ（ＷはＡまたはＴを示す。また大文字は保存性が高く、小文字は保存性が低いことを示す）で表される（J. Bacteriol., 177, 6999, (1995)）。
以上の様に、本発明に於ける胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列とは、前記（１）〜（６）、或いは（１'）〜（６'）の何れかの特徴を有するものである。
The AbrB recognition and binding sequence reported so far is represented by WaWWttttWCAAaaaW (W indicates A or T. Uppercase letters indicate high conservation and lowercase letters indicate low conservation) (J Bacteriol., 177, 6999, (1995)).
As described above, the promoter sequence specifically recognized and transcribed during the spore formation stage in the present invention is any one of the above (1) to (6) or (1 ′) to (6 ′). It has characteristics.
（１）または（１'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表２に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（２）または（２'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表３に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（３）または（３'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表４に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（４）または（４'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表５に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（５）または（５'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表６に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（６）または（６'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表７に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられる。 Among promoter sequences having the characteristics of either (1) or (1 ′), those derived from nature include Bacillus subtilis genes and operon promoters shown in Table 2, and (2) or (2 Among the promoter sequences having any of the characteristics of '), naturally-occurring promoter sequences include the Bacillus subtilis gene or operon promoter shown in Table 3, and either of (3) or (3') Among promoter sequences having characteristics, those derived from nature include Bacillus subtilis genes and operon promoters shown in Table 4, and the promoter sequences having the characteristics of either (4) or (4 ′) Among these, naturally occurring ones include Bacillus subtilis genes or operon promoters shown in Table 5, and a promoter having any of the characteristics (5) or (5 ′) Among the ter sequences, those derived from nature include Bacillus subtilis genes and operon promoters shown in Table 6, and among the promoter sequences having the characteristics of either (6) or (6 ′), natural Examples of the origin include Bacillus subtilis genes and operon promoters shown in Table 7.
尚、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature, 390, 249-256, (1997) で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。 The names, numbers and functions of each gene in the table were reported in Nature, 390, 249-256, (1997), and published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: //Bacillus.genome.ad.jp/, updated June 17, 2003), based on genome data of Bacillus subtilis.
（Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria; biochemistry, physiology, and molecular genetics, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp757, (1993)、J. Bacteriol., 177, 6999, (1995)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria; biochemistry, physiology, and molecular genetics, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp757, (1993), J. Bacteriol., 177, 6999, (1995))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002))
In the table, for the operon, the first gene name of the transcription unit is shown.
以上の様に、本発明に於いて用いられる胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としての好適な例としては、前記（１）〜（６）、或いは（１'）〜（６'）の何れかの特徴をもつプロモーターが挙げられる。一方、枯草菌において、ＳｉｇＥはＲＮＡポリメラーゼに対してＳｉｇＡより高い親和性を示すとの報告例もあることから（J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)）、より好適には、ＳｉｇＥが活性化する以前に転写が活性化するプロモーターを利用することが好ましい。より好ましい当該プロモーター配列としては、Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（１）又は（１'）に相当）、又はＳｉｇＨにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（２）又は（２'）に相当）が挙げられる。 As described above, preferable examples of the promoter sequence specifically recognized and transcribed during the spore formation stage used in the present invention include (1) to (6) or (1 ′) to (1) Promoters having any of the characteristics of 6 ′) can be mentioned. On the other hand, in Bacillus subtilis, there is a report example that SigE shows higher affinity for RNA polymerase than SigA (J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)). It is preferable to use a promoter that activates transcription before activation. More preferably, the promoter sequence is a promoter sequence (corresponding to the above (1) or (1 ′)) that is recognized and transcribed by SigA after the suppression of transcription by AbrB is released as the Spo0A to P concentration increases. Examples thereof include promoter sequences that are recognized and transcribed by SigH (corresponding to (2) or (2 ′) above).
前記（１）又は（１'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表１に示した枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーター配列が挙げられ、中でも特に好適な例としては、枯草菌のｓｉｇＨのプロモーター配列が挙げられる。枯草菌のｓｉｇＨのプロモーター配列は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号９８７〜１０２７の塩基配列、好ましくは塩基番号９８７〜１０４７の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１０４７の塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１０４７塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。 Among promoter sequences having the characteristics of (1) or (1 ′) above, naturally-occurring promoter sequences include the Bacillus subtilis genes or operon promoter sequences shown in Table 1, and particularly preferred among them. Examples include the promoter sequence of Bacillus subtilis sigH . The promoter sequence of Bacillus subtilis sigH includes the nucleotide sequence of nucleotide numbers 987 to 1027, preferably the nucleotide sequence of nucleotide numbers 987 to 1047, more preferably the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 1047 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence is within 5000 base pairs, preferably within 2000 base pairs, more preferably within 1047 base pairs, and has the same promoter function as the promoter of the gene.
また前記（２）又は（２'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表２に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、中でも特に好適な例としては枯草菌のｓｐｏIIＡＡ−ｓｐｏIIＡＢ−ｓｉｇＦオペロン（ｓｐｏIIＡオペロン）のプロモーター配列が挙げられる。枯草菌のｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター配列は、配列番号３に示す塩基配列における塩基番号１０８１〜１１１０の塩基配列、好ましくは塩基番号１０８１〜１１１８の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１１４３の塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１１４３塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。 Among the promoter sequences having the characteristics of (2) or (2 ′) above, naturally-occurring promoter sequences include Bacillus subtilis genes and operon promoters shown in Table 2, and particularly preferred among them. Examples include the promoter sequence of Bacillus subtilis spoIIAA - spoIIAB - sigF operon ( spoIIA operon). The promoter sequence of the spoIIA operon of Bacillus subtilis is the base sequence of base numbers 1081-1110, preferably the base sequence of base numbers 1081-1118, more preferably the base sequence of base numbers 1-1143 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. A base sequence having a base length of 5000 base pairs or less, preferably 2000 base pairs or less, more preferably 1143 base pairs or less, and having the same promoter function as the promoter of the gene.
また、本発明で用いられる胞子形成期特異的に認識、発現されるプロモーター配列としては、表１〜表６記載の枯草菌の各遺伝子或いは各オペロンのプロモーター配列に相当する配列も含まれる。例えば、枯草菌のｓｉｇＨ遺伝子のプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号９８７〜１０２７の塩基配列、好ましくは塩基番号１０８１〜１１１８の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１１４３の塩基配列に対して、１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１０４７塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片が挙げられる。 The promoter sequence specifically recognized and expressed in the sporulation phase used in the present invention also includes sequences corresponding to the Bacillus subtilis genes or the operon promoter sequences described in Tables 1 to 6. For example, the sequence corresponding to the promoter sequence of the sigH gene of Bacillus subtilis is the base sequence of base numbers 987 to 1027 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably the base sequence of base numbers 1081 to 1118, more preferably the base number A base length of 5000 base pairs or less, preferably 2000 base pairs or less, more preferably 1047 bases, including a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted or inserted with respect to the base sequence of 1 to 1143 Examples thereof include a DNA fragment having a nucleotide sequence within a pair and having the same promoter function as the promoter of the gene.
また、ｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号３で示される塩基配列における塩基番号１０８１〜１１１０の塩基配列、好ましくは塩基番号１０８１〜１１１８の塩基配列、更に好ましくは塩基番号１〜１１４３の塩基配列に対して、１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１１１８塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該オペロンのプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片が挙げられる。 The sequence corresponding to the promoter sequence of the spoIIA operon is the base sequence of base numbers 1081-1110, preferably the base sequence of base numbers 1081-1118, more preferably the base numbers 1-1 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. A base length of 5000 base pairs or less, preferably 2000 base pairs or less, more preferably 1118 base pairs or less, including a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted or inserted with respect to the base sequence of 1143 And a DNA fragment having the same promoter function as that of the operon.
更に、本発明で用いられる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列には、表２又は表３記載の枯草菌の遺伝子又は、枯草菌のオペロンを構成する遺伝子のオーソログ（ortholog）遺伝子のプロモーター配列、好適には、バチルス属細菌由来の当該オーソログ遺伝子のプロモーター配列も含まれる。オーソログ遺伝子は、インターネットで公開されるMicrobial Genome Database（MBGD、http://mbgd.genome.ad.jp/) のCreate/view Orthologous gene tableプログラムを利用することによって見出すことができる。枯草菌ｓｉｇＨ遺伝子のオーソログ遺伝子の例としては、バチルス・ハロドランスのｓｉｇＨ（ＢＨ０１１５）遺伝子や、バチルス・セレウスのＢＣ０１１４遺伝子などが挙げられる。また、枯草菌のｓｐｏIIＡオペロンを構成する各遺伝子のオーソログとしては、バチルス・ハロドランスのｓｉｇＦ（ＢＨ１５３８）遺伝子、ｓｐｏIIＡＢ（ＢＨ１５３７）遺伝子、又ｓｐｏIIＡＡ（ＢＨ１５３６）、バチルス・セレウスのＢＣ４０７２遺伝子、ＢＣ４０７３遺伝子、又ＢＣ４０７４遺伝子などが挙げられる。 Furthermore, the promoter sequence recognized by the sigma factor specifically involved in transcription during the spore formation phase used in the present invention includes the Bacillus subtilis gene described in Table 2 or Table 3 or the gene constituting the Bacillus subtilis operon. Also included is a promoter sequence of the ortholog gene, preferably a promoter sequence of the ortholog gene derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus. Orthologous genes can be found by using the Create / view Orthologous gene table program of the Microbial Genome Database (MBGD, http://mbgd.genome.ad.jp/) published on the Internet. Examples of orthologous genes of Bacillus subtilis sigH gene include Bacillus halodolans sigH (BH0115) gene and Bacillus cereus BC0114 gene. The orthologs of the genes constituting the spoIIA operon of Bacillus subtilis include the Bacillus halodolans sigF (BH1538) gene, spoIIAB (BH1537) gene, spoIIAA (BH1536), Bacillus cereus BC4072 gene, BC4073 gene, BC4074 gene etc. are mentioned.
斯かる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列は、上記のプロモーター配列を単独で用いる他、複数種を組み合わせて用いることができる。 The promoter sequence recognized by the sigma factor specifically involved in transcription during such spore formation can be used in combination of a plurality of types in addition to the above promoter sequence alone.
胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列が枯草菌のｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に結合してなるＤＮＡは、例えば、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流に存在するＳｉｇＡ認識プロモーター配列の上流又は下流に、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入することによってゲノム上に構築することができる。尚、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入する部位は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流であればよいが、ｓｉｇＡ構造遺伝子の上流側に隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、１０００塩基対以内の領域がより好ましく、５００塩基対以内の領域が更に好ましく、１〜１９８塩基対の領域が特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まない場合には、該ＤＮＡ断片をｓｉｇＡ構造遺伝子より１５塩基対以上、上流に挿入することが望ましい。 A DNA formed by binding a promoter sequence specifically recognized and transcribed in the spore-forming stage upstream of the sigA gene of Bacillus subtilis or a gene corresponding to the gene is, for example, the sigA gene originally present on the Bacillus subtilis genome. It can be constructed on the genome by inserting a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation phase, upstream or downstream of the SigA recognition promoter sequence existing upstream. The site for inserting a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation stage may be upstream of the sigA gene or a gene corresponding to the gene, but upstream of the sigA structural gene. The adjacent region within 2000 base pairs is preferable, the region within 1000 base pairs is more preferable, the region within 500 base pairs is more preferable, and the region of 1 to 198 base pairs is particularly preferable. However, when a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation phase does not contain an appropriate ribosome binding site sequence, the DNA fragment is more than 15 base pairs upstream of the sigA structural gene. It is desirable to insert.
また、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列をｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流側に連結したＤＮＡはＰＣＲなどの方法によって構築することも可能である。尚、連結部位からｓｉｇＡ構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流配列に由来する配列は、０〜２０００塩基対であることが好ましく、０〜１０００塩基対であることがより好ましく、０〜５００塩基対であることが更に好ましく、０〜１９８塩基対であることが特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まない場合には、連結部位からｓｉｇＡ構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流配列に由来する配列は１５塩基対以上であることが望ましい。本発明変異バチルス属細菌を構築するためには、このようにして構築したＤＮＡを新たに親バチルス属細菌へ導入すれば良い。 In addition, DNA in which a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation stage is linked to the upstream side of the sigA gene or a gene corresponding to the gene can be constructed by a method such as PCR. The sequence derived from the upstream sequence of the sigA gene originally present on the Bacillus subtilis genome between the ligation site and the sigA structural gene is preferably 0 to 2000 base pairs, and preferably 0 to 1000 base pairs. More preferably, it is more preferably 0 to 500 base pairs, and particularly preferably 0 to 198 base pairs. However, when a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation phase does not contain a sequence of an appropriate ribosome binding site, the original Bacillus subtilis between the ligation site and the sigA structural gene The sequence derived from the upstream sequence of the sigA gene present on the genome is preferably 15 base pairs or more. In order to construct the mutant Bacillus bacterium of the present invention, the DNA thus constructed may be newly introduced into the parent Bacillus bacterium.
例えば胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片とｓｉｇＡ遺伝子等を含むＤＮＡ断片を連結したＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法により調製し、親バチルス属細菌内で複製可能なプラスミドベクターにクローニングして取り込ませる方法を用いることができる。特に、本発明変異バチルス属細菌を構築するための親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合、複製可能なプラスミドベクターとしてはpUB110（Plasmid, 15, 93, (1986)）、pC194（J. Bacteriol., 150, 815, (1982)）、pTX14-3（Plasmid, 30, 119, (1993)）をはじめとして既に報告のある多数のプラスミドベクターを利用することが可能である。 For example, a DNA fragment comprising a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed during the spore formation stage and a DNA fragment containing a sigA gene or the like is prepared by a method such as PCR and can be replicated in the parent Bacillus bacterium A method of cloning and incorporating into a plasmid vector can be used. In particular, when Bacillus subtilis is used as a parental Bacillus bacterium for constructing the mutant Bacillus of the present invention, plasmid vectors that can be replicated include pUB110 (Plasmid, 15, 93, (1986)), pC194 (J. Bacteriol. , 150, 815 (1982)), pTX14-3 (Plasmid, 30, 119, (1993)), and many other previously reported plasmid vectors can be used.
或いは、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片がｓｉｇＡ遺伝子等を含むＤＮＡ断片の上流に連結したＤＮＡ断片を、相同組換え等の方法によってゲノム上に導入することができる。相同組換えを利用してゲノム上にＤＮＡ断片を導入する方法については既にいくつかの報告があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990)等）、それらの方法に従うことによって、本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。 Alternatively, a DNA fragment in which a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the sporulation stage is linked upstream of a DNA fragment containing a sigA gene or the like is introduced into the genome by a method such as homologous recombination. Can do. There have already been several reports on methods for introducing DNA fragments into the genome using homologous recombination (Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990), etc.). The mutant Bacillus bacterium of the invention can be obtained.
以下、より具体的にＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 51, (1989)）により調製された胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片とｓｉｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片を調製し、相同組換えを利用することによりゲノム上に当該ＤＮＡ断片を導入する方法について説明するが、本発明における当該ＤＮＡ断片の導入方法は下記に限定されるものではない。 More specifically, a DNA fragment containing a promoter sequence specifically recognized and transcribed in the sporulation phase prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 51, (1989)) A method for preparing a DNA fragment linked with a DNA fragment containing a sigA gene and introducing the DNA fragment into the genome by utilizing homologous recombination will be described. The method for introducing the DNA fragment in the present invention is described below. It is not limited.
本発明において、まず１回目のＰＣＲにより胞子形成期において特異的に認識、転写される胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、ハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、当該プロモーター配列を含むＤＮＡ断片の下流末端にハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端にはハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図２）。 In the present invention, a DNA fragment containing a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed in the spore formation phase, which is specifically recognized and transcribed by the first PCR, and a structural gene fragment of housekeeping sigma factor In addition, for example, at the downstream end of the DNA fragment containing the promoter sequence, 10-30 base pair sequences upstream of the structural gene fragment of housekeeping sigma factor, Furthermore, primers designed so that 10-30 base pair sequences downstream of the structural gene fragment of housekeeping sigma factor are added to the upstream end of the drug resistance marker gene fragment (FIG. 2).
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、当該プロモーター配列を含む断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、当該プロモーター配列を含む断片の下流末端及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端に付加したｓｉｇＡ遺伝子断片配列において、ｓｉｇＡ遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、ｓｉｇＡ遺伝子の上流に胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列が連結され、且つ薬剤耐性マーカー遺伝子がその下流に連結されたＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。 Next, using the three types of PCR fragments prepared in the first round as a template, and performing the second round of PCR using the upstream primer of the fragment containing the promoter sequence and the downstream primer of the drug resistance marker gene fragment, the promoter In the sigA gene fragment sequence added to the downstream end of the fragment containing the sequence and the upstream end of the drug resistance marker gene fragment, annealing with the sigA gene fragment occurs, and as a result of PCR amplification, transcription in the sporulation phase is upstream of the sigA gene. It is possible to obtain a DNA fragment in which a promoter sequence recognized by a sigma factor specifically involved is linked, and a drug resistance marker gene is linked downstream thereof (FIG. 2).
胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列として枯草菌のｓｉｇＨ遺伝子、或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを、薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表８に示したプライマーセットを用い、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B. A. White, Humana Press, pp251 (1993)、Gene, 77,61, (1989)等）に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、所望のＤＮＡ断片を得ることができる。 Table 8 shows, for example, the case where the sigH gene of Bacillus subtilis or the promoter of the spoIIA operon is used as a promoter sequence specifically recognized and transcribed in the spore formation stage and the chloramphenicol resistance gene is used as a drug resistance marker gene. Using a primer set, using a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc., the book (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BA White, Humana Press, pp251 (1993), Gene, 77, 61, (1989) etc.), the desired DNA fragment can be obtained by performing SOE-PCR under the usual conditions.
かくして得られたＤＮＡ断片を、例えば枯草菌ゲノム上に導入する場合、枯草菌細胞内にて複製出来ないプラスミドベクター、例えばｐＭＷ２１９（ニッポンジーン）にクローニングし、コンピテント法等によって細胞内に取り込ませると、プラスミド上のハウスキーピングシグマ因子の遺伝子領域と、ゲノム上のｓｉｇＡ遺伝子領域の間で相同組換えが生じ、薬剤耐性マーカーによる選択によって、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が結合したｓｉｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片がプラスミドベクターと共にゲノム上に導入された細胞を分離することができる（図２）。即ち、表３に示したプライマーセットを用いて調製したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１９にクローニングしたプラスミドを枯草菌細胞内に取り込ませた場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ｓｉｇＨ遺伝子、或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター領域とｓｉｇＡ遺伝子が連結したＤＮＡ断片がゲノム上に導入されていることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認すればよい。 When the DNA fragment thus obtained is introduced into the Bacillus subtilis genome, for example, it is cloned into a plasmid vector that cannot replicate in Bacillus subtilis cells, such as pMW219 (Nippon Gene), and incorporated into the cells by a competent method or the like. Homologous recombination occurs between the housekeeping sigma factor gene region on the plasmid and the sigA gene region on the genome, and a promoter sequence that is specifically recognized and transcribed during sporulation by selection with a drug resistance marker. Cells in which the DNA fragment containing the sigA gene bound thereto has been introduced onto the genome together with the plasmid vector can be isolated (FIG. 2). That is, when a plasmid obtained by cloning a DNA fragment prepared using the primer set shown in Table 3 into pMW219 is incorporated into Bacillus subtilis cells, colonies that grow on an agar medium containing chloramphenicol are isolated, The introduction of a DNA fragment in which the sigH gene or the promoter region of the spoIIA operon and the sigA gene are linked may be confirmed by PCR or the like using the genome as a template.
以上は主に親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合について示したが、他のバチルス属細菌についても同様にして本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。 Although the above has mainly shown the case where Bacillus subtilis is used as the parent Bacillus bacterium, the mutant Bacillus bacterium of the present invention can be obtained in the same manner for other Bacillus bacteria.
かくして得られたバチルス属細菌を用いることにより、異種タンパク質又はポリペプチドの生産において、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の転写、並びにタンパク生産に関わる種々の遺伝子の転写を行うＳｉｇＡが胞子形成期に発現増強される為、生産性の向上が達成される。
すなわち、ＳｉｇＡによって認識されるプロモーターの下流に目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を結合させた後、これを本発明により得られた変異バチルス属細菌に導入することによって、栄養増殖期のみならず、胞子形成期に於いても目的のタンパク質又はポリペプチドの生産が継続するため、親バチルス属細菌に比べ、著量の目的タンパク質又はポリペプチドを生産する。
By using the Bacillus bacterium thus obtained, in the production of a heterologous protein or polypeptide, SigA, which transcribes a gene encoding the heterologous protein or polypeptide, and various genes involved in protein production, is sporulated. Therefore, productivity is improved.
That is, after binding a gene encoding a target protein or polypeptide downstream of a promoter recognized by SigA, the gene is introduced into the mutant Bacillus bacterium obtained according to the present invention, so that only in the vegetative growth phase. Rather, since the production of the target protein or polypeptide continues even during the spore formation stage, a significant amount of the target protein or polypeptide is produced compared to the parent Bacillus bacterium.
目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）又はバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−６４株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。 The target protein or polypeptide gene is not particularly limited, and includes various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, diagnostics, bioactive peptides, and the like. In addition, industrial enzymes are classified according to their functions: oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, isomerase, and synthase (Ligase / Synthetase). ) And the like, and preferred examples include genes for hydrolases such as cellulase, α-amylase, and protease. Specifically, cellulases belonging to Family 5 are listed in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309 (1991)), and among them, cellulases derived from microorganisms, particularly from Bacillus bacteria. As a more specific example, Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) or Bacillus sp. KSM-64 strain (FERM) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 BP-2886) -derived alkaline cellulase or an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more identity with the amino acid sequence. Cellulase.
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３８株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。 Specific examples of α-amylase include α-amylase derived from microorganisms, and liquefied amylase derived from bacteria belonging to the genus Bacillus is particularly preferable. As a more specific example, alkaline amylase derived from the Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, or 70%, preferably 80%, from the amino acid sequence. %, More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more, amylase having an amino acid sequence. The amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specific examples of proteases include serine proteases, metal proteases, and the like derived from microorganisms, particularly from Bacillus bacteria. As a more specific example, an alkaline protease derived from the Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, or 70%, preferably 80% of the amino acid sequence. More preferred is a protease comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
一方、前述の様に目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に枯草菌ＳｉｇＡなどのハウスキーピングシグマ因子によって認識されるプロモーター配列が結合されている必要があり、更に、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、リボソーム結合部位および開始コドンを含む翻訳開始領域、又、分泌用シグナルペプチド領域が適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）、ＫＳＭ−６４株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子のハウスキーピングシグマ因子で転写されるプロモーターを含む転写開始制御領域、翻訳開始領域、分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。 On the other hand, as described above, the target protein or polypeptide gene needs to have a promoter sequence recognized by a housekeeping sigma factor such as Bacillus subtilis SigA upstream, and further a control region related to translation and secretion. That is, it is desirable that a translation initiation region including a ribosome binding site and an initiation codon and a signal peptide region for secretion are bound in an appropriate form. For example, the bacterium belonging to the genus Bacillus described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-210081 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-190793, that is, KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM-64 strain (FERM BP-2886) A transcription initiation control region containing a promoter transcribed by the housekeeping sigma factor of the cellulase gene of, a translation initiation region, a signal peptide region for secretion, more specifically, nucleotide numbers 1 to 659 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the base sequence, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the cellulase gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, Preferably, a DNA fragment comprising a base sequence having an identity of 95% or more, particularly preferably 98% or more, or any of the above DNA fragments part of the nucleotide sequence consisting of deletion nucleotide sequence of, desirably is properly coupled with the structural gene of the target protein or polypeptide.
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明の変異バチルス属細菌に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。また、当該ＤＮＡ断片に本発明の変異バチルス属細菌ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、本発明の変異バチルス属細菌ゲノムに直接組み込むことによっても目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。 By incorporating a recombinant plasmid in which a DNA fragment containing the above target protein or polypeptide gene and an appropriate plasmid vector are combined into the mutant Bacillus bacterium of the present invention by a general transformation method, Peptide productivity can be improved. The productivity of the target protein or polypeptide can also be obtained by using a DNA fragment in which an appropriate homologous region with the mutant Bacillus genus genome of the present invention is bound to the DNA fragment, and directly integrating into the mutant Bacillus genus genome of the present invention. Can be improved.
本発明の変異バチルス属細菌を宿主とした目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。 Production of the target protein or polypeptide using the mutant Bacillus bacterium of the present invention as a host is performed by inoculating the strain in a medium containing an anabolic carbon source, a nitrogen source, and other essential components, and using a normal microbial culture method. Culture may be performed, and after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified.
以上より、胞子形成期におけるｓｉｇＡ遺伝子の転写効率が向上したバチルス属細菌を構築することができ、当該変異バチルス属細菌を組換え生産の宿主細胞として用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。 As described above, a Bacillus bacterium having improved transcription efficiency of the sigA gene during the spore formation stage can be constructed, and if the mutant Bacillus bacterium is used as a host cell for recombinant production, a useful protein or polypeptide can be efficiently produced. Can be produced.
以下、実施例を用いて、本発明の変異バチルス属細菌の構築方法と、当該変異バチルス属細菌を宿主として用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。 Hereinafter, the construction method of the mutant Bacillus bacterium of the present invention and the method for producing cellulase using the mutant Bacillus bacterium as a host will be specifically described with reference to Examples.
実施例１ 胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドの構築
図２に示す方法と同様にして、ｓｉｇＨ遺伝子プロモーター或いはｓｐｏIIＡオペロンプロモーターをｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結したＤＮＡ断片を、１回交差の相同組換えを利用して枯草菌ゲノム上へ導入する為のプラスミドの構築を行った。即ち、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に示したｓｉｇＡｆとｓｉｇＡｒのプライマーセットを用いてｓｉｇＡ遺伝子を含む１．２ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより調製した。同様に表８に示したｓｉｇＨＵｆとｓｉｇＨＵｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてゲノム上のｓｉｇＨ遺伝子の上流に隣接するｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターを含む１．０ｋｂ断片（Ｂ）を調製した。同様に表８に示したｓｉｇＦＵｆとｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてゲノム上のｓｐｏIIＡオペロンの上流に隣接し、ｓｉｇＦ遺伝子の転写を司るｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを含む１．１ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。またプラスミドｐＣ１９４（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型とし、表８に示したＣｍＦＷとＣｍｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む０．９ｋｂ断片（Ｄ）を調製した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｄ）３断片を混合して鋳型とし、表８に示したｓｉｇＨＵｆとＣｍＦＷのプライマーセットを用いたＳＯＥ-ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、ｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターがｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が逆向きに結合した３．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ）を得た。同様に（Ａ）（Ｃ）（Ｄ）３断片を混合して鋳型とし、表８に示したｓｉｇＦＵｆとＣｍＦＷのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｃ）（Ａ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、ｓｐｏIIＡオペロンプロモーターがｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が逆向きに結合した３．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｆ）を得た。３．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ）と３．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｆ）をそれぞれ枯草菌細胞内では複製できない大腸菌用プラスミドベクターｐＭＷ２１９のＳｍａＩ制限酵素切断点に挿入し、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドｐＭＷＰＨｓｉｇＡ及びｐＭＷＰＦｓｉｇＡを構築した。
Example 1 Construction of a plasmid for introducing a sigA gene having a promoter that is specifically transcribed during the spore formation phase into the Bacillus subtilis genome In the same manner as shown in FIG. 2, the sigH gene promoter or spoIIA operon promoter is replaced with sigA. A plasmid was constructed to introduce a DNA fragment ligated upstream of the structural gene onto the Bacillus subtilis genome using homologous recombination in one cross. Specifically, a 1.2 kb fragment (A) containing the sigA gene was prepared by PCR using genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template and using the sigAf and sigAr primer sets shown in Table 8. Similarly, a 1.0 kb fragment (B) containing a sigH gene promoter adjacent to the upstream of the sigH gene on the genome was prepared using the sigHUf and sigHUr-sigA primer sets shown in Table 8. Similarly, using the sigFUf and sigFUr-sigA primer sets shown in Table 8, a 1.1 kb fragment (C) containing the promoter of the spoIIA operon adjacent to the upstream of the spoIIA operon on the genome and controlling the transcription of the sigF gene was prepared. did. A 0.9 kb fragment containing the chloramphenicol resistance gene using the plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) as a template and the primer set of CmFW and Cmr-sigA shown in Table 8 (D) was prepared. Subsequently, the obtained 3 fragments of (A), (B), and (D) were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the sigHUf and CmFW primer sets shown in Table 8 was performed. ) (A) (D), 3.1 kb DNA in which the promoter of the sigH gene is linked upstream of the sigA structural gene and the chloramphenicol resistance gene is further linked downstream Fragment (E) was obtained. Similarly, the 3 fragments (A), (C), and (D) were mixed to form a template, and SOE-PCR using the sigFUf and CmFW primer sets shown in Table 8 was performed to obtain the 3 fragments as (C) (A ) A DNA fragment (F) of 3.2 kb in which the spoIIA operon promoter is linked upstream of the sigA structural gene and the chloramphenicol resistance gene is linked in the reverse direction downstream of the sigA structural gene. Got. A 3.1 kb DNA fragment (E) and a 3.2 kb DNA fragment (F) were inserted into the Sma I restriction enzyme cleavage point of the plasmid vector pMW219 for E. coli that cannot replicate in Bacillus subtilis cells, respectively, and specific for the sporulation phase. Plasmids pMWPHsigA and pMWPFsigA for introducing a sigA gene having a promoter transcribed into Bacillus subtilis into the genome of Bacillus subtilis were constructed.
また上記のプライマーのうち、ｓｉｇＡｆ及びｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡに代えて、それぞれ表８に示すｓｉｇＡｍｆ及びｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡｍを用いて同様の操作を行うことにより、ｐＭＷＰＦｓｉｇＡにおけるｓｉｇＡ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が開始コドンとして認識されない（ＡＴＡ）に置換されたｐＭＷＰＦｓｉｇＡｍを構築した。 In addition, among the above primers, the sigA gene start codon (ATG) in pMWPFsigA is changed to start codon by performing the same operation using sigAmf and sigFUr-sigAm shown in Table 8 instead of sigAf and sigFUr-sigA, respectively. PMWPFsigAm was constructed that was replaced by (ATA) not recognized as.
実施例２ 胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子の枯草菌１６８株ゲノムへの導入 胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子、又は開始コドン（ＡＴＧ）が（ＡＴＡ）に置換されたｓｉｇＡ遺伝子（ｓｉｇＡｍ）を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドｐＭＷＰＨｓｉｇＡ、ｐＭＷＰＦｓｉｇＡ、及びｐＭＷＰＦｓｉｇＡｍを用いてコンピテント法によりそれぞれ枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、ゲノム上のｓｉｇＡ遺伝子とプラスミド上のｓｉｇＡ遺伝子又はｓｉｇＡｍの間での相同組換えにより、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ又はｓｉｇＡｍが、１．２ｋｂ断片（Ｄ）と共にゲノム内に挿入されたことを確認し、これらを１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び１６８ＰＦｓｉｇＡｍ株と命名した。 Example 2 Introduction of SigA gene having a promoter specifically transcribed during sporulation into the genome of Bacillus subtilis 168 SigA gene having a promoter specifically transcribed during sporulation, or an initiation codon (ATG) 168 strains of Bacillus subtilis were transformed by the competent method using plasmids pMWPHsigA, pMWPFsigA, and pMWPFsigAm for introducing the sigA gene ( sigAm ) substituted for (ATA) into the Bacillus subtilis genome, respectively. Colonies that grew on the LB agar medium containing cole were isolated as transformants. By performing PCR using the genome extracted from the obtained transformant as a template, it is specifically transcribed at the spore formation stage by homologous recombination between the sigA gene on the genome and the sigA gene or sigAm on the plasmid. It was confirmed that sigA or sigAm having the above promoter was inserted into the genome together with the 1.2 kb fragment (D), and these were designated as 168PHsigA strain, 168PFsigA strain, and 168PFsigAm strain.
実施例３ 枯草菌変異株のアルカリセルラーゼ分泌生産評価
実施例２にて得られた３種類の枯草菌変異株（１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び１６８ＰＦｓｉｇＡｍ株）、及び対照として枯草菌１６８株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ（特開２０００-２１００８１号公報）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表９に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。一方、宿主として１６８ＰＦｓｉｇＡｍを用いた場合のアルカリセルラーゼ分泌量は、対照の１６８株（野生型）と同等であったことから、１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株に於ける高生産化が、ゲノム上に新たに付加されたｓｉｇＨ遺伝子或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを持つｓｉｇＡ遺伝子により、ＳｉｇＡが生産されたことによるものと推定された。
Example 3 Evaluation of Alkaline Cellulase Secretion Production of Bacillus subtilis Mutant Strains Bacillus subtilis mutants obtained in Example 2 (168PHsigA strain, 168PFsigA strain and 168PFsigAm strain), and Bacillus subtilis 168 strain as a control DNA fragment (3.1 kb) encoding alkaline cellulase (JP 2000-210081) derived from SP ( Bacillus sp.) KSM-S237 strain (FERM BP-7875) is Bam HI restriction of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) Recombinant plasmid pHY-S237 inserted at the enzyme cleavage point was introduced by protoplast transformation method. The resulting strain was cultured with shaking in 10 mL of LB medium overnight at 37 ° C., and 0.05 mL of this culture was further added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl. 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the alkaline cellulase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline cellulase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 9, when 168PHsigA strain or 168PFsigA strain was used as the host, higher secretory production of alkaline cellulase was observed as compared to the control 168 strain (wild type). On the other hand, when 168PFsigAm was used as the host, the amount of alkaline cellulase secreted was the same as that of the control 168 strain (wild type), so that high production in the 168PHsigA strain or 168PFsigA strain was newly introduced on the genome. It was estimated that SigA was produced by the sigA gene having the added sigH gene or spoIIA operon promoter.
実施例４ 枯草菌変異株のアルカリプロテアーゼ分泌生産評価
実施例３にてアルカリセルラーゼ生産性向上が認められた１６８ＰＨｓｉｇＡ株及び１６８ＰＦｓｉｇＡ株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼ生産性評価を行った。
バチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)）をコードする1.3kbのDNA断片（Ｇ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。次いで、得られた（Ｇ）（Ｈ）の2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片（Ｉ）を得た。得られた1.8 kbのDNA断片（I）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。
構築したプラスミドpHYKAP(S237p)を１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び対照として枯草菌１６８株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を実施例３と同様の条件にて３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表１１に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。
Example 4 Evaluation of Alkaline Protease Secretion Production of Bacillus subtilis Mutant Strains In order to confirm the effectiveness in production of other proteins or polypeptides of 168PHsigA strain and 168PFsigA strain in which alkaline cellulase productivity improvement was observed in Example 3, As described above, the productivity of alkaline protease derived from Bacillus was evaluated.
Using genomic DNA extracted from Bacillus clausii strain KSM-K16 (FERM BP-3376) as a template, PCR was performed using the S237pKAPpp-F and KAPter-R (BglII) primer sets shown in Table 10, A 1.3 kb DNA fragment (G) encoding an alkaline protease having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)) was amplified. Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, PCR was performed using the S237ppp-F2 (BamHI) and S237pKAPpp-R primer sets shown in Table 10. Then, a 0.6 kb DNA fragment (H) containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) was amplified. Next, the obtained 2 fragments of (G) and (H) are mixed and used as a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and KAPter-R (BglII) primer sets shown in Table 10 is performed. As a result, a 1.8 kb DNA fragment (I) having an alkaline protease gene linked downstream of the promoter region of the alkaline cellulase gene was obtained. The resulting 1.8 kb DNA fragment (I) was inserted into Bam HI- Bgl II restriction enzyme cleavage point of a shuttle vector pHY300PLK (Yakult), was constructed alkaline protease productivity evaluation plasmid pHYKAP (S237p).
The constructed plasmid pHYKAP (S237p) was introduced into the 168PHsigA strain, the 168PFsigA strain, and the Bacillus subtilis 168 strain as a control by the protoplast transformation method. The strain thus obtained was subjected to shaking culture for 3 days under the same conditions as in Example 3. After the culture, the alkaline protease activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of the alkaline protease secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 11, when the 168PHsigA strain or the 168PFsigA strain was used as the host, a higher secretory production of alkaline protease was observed compared to the control 168 strain (wild type).
実施例５ 枯草菌変異株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例３及び４にてアルカリセルラーゼ及びアルカリプロテアーゼ生産性向上が認められた１６８ＰＨｓｉｇＡ株及び１６８ＰＦｓｉｇＡ株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を更に確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアミラーゼ生産性評価を行った。
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するアルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)）をコードする1.5kbのDNA断片（Ｊ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｋ）を増幅した。次いで、得られた（Ｊ）（Ｋ）の2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｌ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｌ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
構築したプラスミドpHYK38(S237ps)を１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び対照として枯草菌１６８株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を実施例３と同様の条件にて５日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。この結果、表１２に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、上記変異株が種々のタンパク質又はポリペプチド生産において有効であることが示された。
Example 5 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production of Bacillus subtilis Mutant Strains The efficacy of other 168PHsigA strains and 168PFsigA strains in which alkaline cellulase and alkaline protease productivity improvements were observed in Examples 3 and 4 were further improved. In order to confirm, amylase productivity evaluation from the genus Bacillus was performed as follows.
Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, using the primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 10 PCR was performed to amplify a 1.5 kb DNA fragment (J) encoding an alkaline amylase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)). In addition, using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, the S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 10 were used. PCR was performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment (K) containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) and the region encoding the secretory signal sequence. Next, the obtained 2 fragments of (J) and (K) are mixed and used as a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 10 is performed. Thus, a 2.1 kb DNA fragment (L) in which the alkaline amylase gene was linked downstream of the promoter region of the alkaline cellulase gene and the region encoding the secretory signal sequence was obtained. The obtained 2.2 kb DNA fragment (L) was inserted into the Bam HI- Xba I restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
The constructed plasmid pHYK38 (S237ps) was introduced into the 168PHsigA strain, 168PFsigA strain, and Bacillus subtilis 168 strain as a control by the protoplast transformation method. The strain thus obtained was subjected to shaking culture for 5 days under the same conditions as in Example 3. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 12, when the 168PHsigA strain or 168PFsigA strain was used as the host, a higher secretion of alkaline amylase was observed compared to the control 168 strain (wild type), and the above mutant strain Has been shown to be effective in the production of various proteins or polypeptides.
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