JP2005278485A

JP2005278485A - Steroid sulfatase variant, and inhibition of steroid sulfatase activity by using the variant

Info

Publication number: JP2005278485A
Application number: JP2004097157A
Authority: JP
Inventors: Teruo Sugawara; 照夫菅原
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2005-10-13

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for inhibiting a steroid sulfatase (STS) activity for preventing or treating a disease caused by the STS activity such as endometrial cancer and breast cancer; and to provide an inhibiting material usable for inhibiting the STS activity. <P>SOLUTION: The steroid sulfatase (STS) variant obtained by deleting an amino acid sequence at the C-terminus or the N-terminus of the STS exhibits the STS activity-inhibiting effects by reducing the activity of the STS and exhibiting dominant negative effects against the SYS activity. The method for inhibiting the STS activity uses the STS variant. The STS variant usable as the inhibitor of the STS activity, the gene encoding the STS variant, the vector containing the incorporated gene, the preventing and/or treating agent of the disease caused by the STS activity by using the STS variant or the gene thereof, and the like are also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）の変異体、該変異体酵素タンパク質をコードする遺伝子、及びそれらを用いたステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制に関する。 The present invention relates to a mutant of steroid sulfatase (STS), a gene encoding the mutant enzyme protein, and suppression of steroid sulfatase enzyme activity using them.

ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ：ＥＣ３．１．６．２．）は、肝臓、卵巣及び睾丸等の様々な哺乳動物組織に存在し、特に胎盤に多く存在する（. J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）。この酵素は、膜結合タンパク質であり、小胞体（ＥＲ）に局在し、コレステロールサルフェート（cholesterol sulfate）、プロゲステロンサルフェート（progesterone sulfate）、ジヒドロエピアンドロステロンサルフェート（dihydroepiandrosterone sulfate）、及び硫酸エストロン(estrone sulfate)等の、３β−ハイドロキシステロイドサルフェートの脱硫酸化を触媒する（Ann NY Acad Sci 390:16-26, 1982；J Biol Chem 264:13865-13872, 1989；Histochem J 20:41-51, 1988）。 Steroid sulfatase (STS: EC 3.1.6.2.) Is present in various mammalian tissues such as liver, ovary and testis, especially in placenta (. J Clin Endocrinol Metab 25: 278-282). , 1965). This enzyme is a membrane-bound protein, is localized in the endoplasmic reticulum (ER), and contains cholesterol sulfate, progesterone sulfate, dihydroepiandrosterone sulfate, and estrone sulfate. ) And the like (Ann NY Acad Sci 390: 16-26, 1982; J Biol Chem 264: 13865-13872, 1989; Histochem J 20: 41-51, 1988).

ステロイドホルモンの硫酸化形態は、レセプターと結合することができないために不活性となっているが、ＳＴＳによる脱リン酸化後には活性となる（J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）。海面活性剤を使用して、組織由来のミクロソームの画分からＳＴＳが精製されてきた（Steroids 31: 783-798, 1978）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定では、ＳＴＳの分子の大きさは約６３ｋＤａであるが、ゲル濾過分析によるＳＴＳの活性化された状態では外見上、ＳＴＳは１２６ｋＤａタンパク質であると考えられる（J Steroid Biochem 19:1591-1598）。エンドグリコシダーゼＨによるＳＴＳの消化によって、ＳＴＳは２つのＮ−グリコシル化部位を有することが明らかとなった(J Biol Chem 264:13865-13872, 1989)。 The sulfated form of the steroid hormone is inactive because it cannot bind to the receptor, but becomes active after dephosphorylation by STS (J Clin Endocrinol Metab 25: 278-282, 1965). STS has been purified from fractions of tissue-derived microsomes using sea surface activators (Steroids 31: 783-798, 1978). As measured by SDS-PAGE, the molecular size of STS is about 63 kDa, but in the activated state of STS by gel filtration analysis, STS appears to be a 126 kDa protein (J Steroid Biochem 19: 1591-1598). Digestion of STS with endoglycosidase H revealed that STS has two N-glycosylation sites (J Biol Chem 264: 13865-13872, 1989).

Ｘ染色体性魚鱗癬（ＸＬＩ）は、ＳＴＳ酵素活性の欠損によって発症する遺伝性の皮膚障害である。ＳＴＳ酵素活性が欠如すると、表皮に過剰な量のコレステロール硫酸が生じ、角質細胞の物性が変質する（J Clin Invest 74:1414-1421, 1984；J Invest Dermatol 111:784-790, 1998）。ＸＬＩは、暗褐色で多角形の大きな鱗屑で全身の皮膚が鱗屑化することを特徴とする。ＸＬＩは、患者の母親の胎盤又は生後の患者のリンパ球でのＳＴＳ活性を分析することによって診断されてきた（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。ＳＴＳ遺伝子をクローニングし、ほとんどのＸＬＩ患者にＳＴＳ遺伝子の大きな欠失があることが明らかとなった（Recent Prog Horm Res 54:369-394, 1999；Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995；. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994）。しかし、ＳＴＳ遺伝子における点突然変異が、ＳＴＳが完全に欠損した数名のＸＬＩ患者から報告されている。 X-chromosome ichthyosis (XLI) is an inherited skin disorder that develops due to a deficiency in STS enzyme activity. In the absence of STS enzyme activity, excessive amounts of cholesterol sulfate are produced in the epidermis and the physical properties of keratinocytes are altered (J Clin Invest 74: 1414-1421, 1984; J Invest Dermatol 111: 784-790, 1998). XLI is characterized by dark brown, large polygonal scales that cause the skin of the whole body to scale. XLI has been diagnosed by analyzing STS activity in the placenta of the patient's mother or in lymphocytes of the postnatal patient (Hum Mutat (Online) 15: 296, 2000). Cloning the STS gene revealed that most patients with XLI have a large deletion of the STS gene (Recent Prog Horm Res 54: 369-394, 1999; Proc Natl Acad Sci USA 92: 4778-4782, 1995). Clin Chim Acta 226: 13-20, 1994). However, point mutations in the STS gene have been reported from several XLI patients who are completely deficient in STS.

ＳＴＳは、上記するように３β−ハイドロキシステロイドサルフェートの脱硫酸化を触媒するが、ステロイド核の３−位に硫酸基を有するステロイド前駆体又はプロホルモン（ステロイド硫酸）は、ヒト体内におけるステロイド代謝の中間体として重要な役割を果たすことが知られている。例えば、エストロン硫酸及びデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＡ）硫酸は、体内においてエストロン及びエストラジオールのようなエストロゲンの生成における中間体として重要な役割を果たすことが知られている。例えば、エストロン硫酸は、特に、閉経後の女性に特有な主要な循環エストロゲン前駆体の1つの例であることが知られており、そして***の腫瘍におけるエストロンスルファターゼ活性は、エストロゲン形成に関わる他の酵素より１００〜１０００倍大きいことが報告されている（Steroids,50,269-279,1987）。 As described above, STS catalyzes the desulfation of 3β-hydroxysteroid sulfate, but a steroid precursor or prohormone (steroid sulfate) having a sulfate group at the 3-position of the steroid nucleus is an intermediate of steroid metabolism in the human body. It is known to play an important role. For example, estrone sulfate and dehydroepiandrosterone (DHA) sulfate are known to play an important role as intermediates in the production of estrogens such as estrone and estradiol in the body. For example, estrone sulfate is known to be one example of a major circulating estrogen precursor that is unique to postmenopausal women, especially, and estrone sulfatase activity in breast tumors is associated with other estrogen formations It is reported that it is 100 to 1000 times larger than the enzyme (Steroids, 50, 269-279, 1987).

エストロゲン硫酸は、硫酸基のためにレセプターに結合されない。したがって、エストロゲン硫酸が局所でホルモン作用を発揮するためにはＳＴＳにより、脱硫酸化を受けないと作用が発揮されない。近年、子宮内膜癌および乳癌の発育と増殖はエストロゲン依存性であることが報告されている、即ち、エストロンやエストラジオールのようなエストロゲン、特にそれらの過剰生成は、乳癌のような悪性腫瘍に強く関係していることが報告されている。乳癌での高いエストロゲンレベルは、ＳＴＳ（エストロンスルファターゼ）によって、エストロンスルフェートがエストロンへ加水分解されることに起因しているものと考えられている。最近の報告では、ＳＴＳ酵素活性は、エストロン依存性乳癌だけでなく、エストロン類が関与すると考えられる他の疾病、例えば、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮内膜症及び子宮腺筋症等、或いはアンドロゲン類が関与すると考えられる疾病、例えば、前立腺癌等にも関与すると考えられている。 Estrogen sulfate is not bound to the receptor due to sulfate groups. Therefore, in order for estrogen sulfate to exert a hormonal action locally, the action is not exerted unless it is desulfated by STS. In recent years, the growth and growth of endometrial and breast cancer has been reported to be estrogen-dependent, i.e., estrogens such as estrone and estradiol, especially their overproduction, are strongly associated with malignant tumors such as breast cancer. It is reported that it is related. High estrogen levels in breast cancer are thought to be due to the hydrolysis of estrone sulfate to estrone by STS (estrone sulfatase). In a recent report, STS enzyme activity has been shown not only to estrone-dependent breast cancer, but also to other diseases that are thought to involve estrones, such as endometrial cancer, ovarian cancer, endometriosis and adenomyosis. Alternatively, it is also considered to be involved in diseases considered to be associated with androgens, such as prostate cancer.

子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の癌の発育と増殖が、エストロゲン依存性であることから、局所のホルモン環境の形成にＳＴＳが重要な役割を演じていると考えられ、該腫瘍増殖の抑制にＳＴＳ酵素活性の抑制が、化学療法として検討されてきた。今までに、ＳＴＳ酵素活性の抑制には、各種のステロイド系（Cancer Research, 53, 298,1993；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993）及び非ステロイド系（Exoert opinion on therapeutic patents, 9,1083,1999）のインフィビター（阻害物質）が見い出されてきた。 STS plays an important role in the formation of a local hormonal environment because the growth and proliferation of cancers of diseases that are thought to involve estrones such as endometrial cancer and breast cancer are estrogen-dependent. In addition, suppression of STS enzyme activity has been studied as chemotherapy for suppressing tumor growth. To date, various steroidal (Cancer Research, 53, 298,1993; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993) and non-steroidal (Exoert opinion on therapeutic patents, 9 , 1083, 1999), an infibitter (inhibitor) has been found.

近年においても、数多くのＳＴＳ酵素活性のインフィビターが開示されている。例えば、非ステロイド系インフィビターとしては、特開２００２−２９３７６８号公報、特開２００２−２０３６２号公報、特表２００３−５１４８０６号公報、特表２００２−５１１４５９号公報、及び特表２０００−５０４７１７号公報等の化合物が挙げられ、ステロイド系インフィビターとしては、特開２００３−２３８４１３号公報、特開２００３−１７６２９７号公報、特開２００２−２５５９９３号公報、特開２０００−３５５５９８号公報、特開２０００−３８３４１号公報、特表２００４−５０６７４２号公報、特表２００３−５０８５４２号公報、特表２００２−５１７４４９号公報、特表２００１−５２４５２５号公報等の化合物が挙げられる。しかしながら、これらはいずれも低分子化学物質を阻害物質（インフィビター）とするものであるから、ヒト等への投与にあたっての化学療法としてのリスクを有し、しかも、阻害物質の酵素活性の抑制は十分ではなく、また、代謝された阻害物質がホルモン様の作用を生じたりして、その抗腫瘍効果は十分ではないという問題があった。
特開２００３−２３８４１３号公報。特開２００３−１７６２９７号公報。特開２００２−２９３７６８号公報。特開２００２−２５５９９３号公報。特開２００２−２０３６２号公報。特開２０００−３５５５９８号公報。特開２０００−３８３４１号公報。特表２００４−５０６７４２号公報特表２００３−５１４８０６号公報。特表２００３−５０８５４２号公報。特表２００２−５１７４４９号公報。特表２００２−５１１４５９号公報。特表２００１−５２４５２５号公報。特表２０００−５０４７１７号公報。 Warren, J.C., et al. J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965。 Choe, B.K., et al. Ann NY Acad Sci 390:16-26, 1982。 Stein, C., et al. J Biol Chem 264:13865-13872, 1989。 Willemsen, R., et al. Histochem J 20:41-51, 1988。 Gauthier, R., et al. Steroids 31: 783-798, 1978。 Noel, H., et al. J Steroid Biochem 19:1591-1598。 Elias, P.M., et al. J Clin Invest 74:1414-1421, 1984。 Zettersten, E., et al. J Invest Dermatol 111:784-790, 1998。 Sugawara, T., et al. Hum Mutat (Online) 15:296, 2000。 Strauss, J. F., et al. Recent Prog Horm Res 54:369-394, 1999。 Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995。 Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994。 James, et al. Steroids,50,269-279,1987。 Cancer Research, 53, 298,1993。 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993。 Exoert opinion on therapeutic patents, 9,1083,199９。 In recent years, a number of inhibitors of STS enzyme activity have been disclosed. For example, as non-steroidal inhibitors, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-293768, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-20362, Japanese Patent Application Publication No. 2003-514806, Japanese Patent Application Publication No. 2002-511459, and Japanese Patent Application Publication No. 2000-504717. Examples of the steroid-based infector include JP-A No. 2003-238413, JP-A No. 2003-176297, JP-A No. 2002-255993, JP-A No. 2000-355598, and JP-A No. 2000-. 38341 gazette, special table 2004-506742 gazette, special table 2003-508542 gazette, special table 2002-517449 gazette, special table 2001-524525 gazette, etc. are mentioned. However, since these all use low-molecular-weight chemical substances as inhibitors (inhibitors), there is a risk as chemotherapy for administration to humans and the like, and suppression of enzyme activity of inhibitors is not possible. In addition, there is a problem that the antitumor effect is not sufficient because the metabolized inhibitor causes a hormone-like action.
JP2003-238413A. JP2003-176297A. JP 2002-293768 A. JP 2002-255993 A. JP 2002-20362 A. JP 2000-355598 A. JP 2000-38341 A. Japanese translation of PCT publication No. 2004-506742 Special table 2003-514806 gazette. Special table 2003-508542 gazette. Japanese translation of PCT publication No. 2002-517449. Japanese translation of PCT publication No. 2002-511459. JP-T-2001-524525. JP 2000-504717 gazette. Warren, JC, et al. J Clin Endocrinol Metab 25: 278-282, 1965. Choe, BK, et al. Ann NY Acad Sci 390: 16-26, 1982. Stein, C., et al. J Biol Chem 264: 13865-13872, 1989. Willemsen, R., et al. Histochem J 20: 41-51, 1988. Gauthier, R., et al. Steroids 31: 783-798, 1978. Noel, H., et al. J Steroid Biochem 19: 1591-1598. Elias, PM, et al. J Clin Invest 74: 1414-1421, 1984. Zettersten, E., et al. J Invest Dermatol 111: 784-790, 1998. Sugawara, T., et al. Hum Mutat (Online) 15: 296, 2000. Strauss, JF, et al. Recent Prog Horm Res 54: 369-394, 1999. Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4778-4782, 1995. Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226: 13-20, 1994. James, et al. Steroids, 50, 269-279, 1987. Cancer Research, 53, 298,1993. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 3, 313,1993. Exoert opinion on therapeutic patents, 9,1083,199.

本発明の課題は、子宮内膜癌や乳癌のようなステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）酵素活性によって引き起こされる疾病の予防、治療に有効で、かつ安全なＳＴＳ酵素活性の抑制方法、及び該ＳＴＳ酵素活性の抑制に用いるインフィビター（抑制物質）を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for inhibiting STS enzyme activity that is effective and safe for the prevention and treatment of diseases caused by steroid sulfatase (STS) enzyme activity such as endometrial cancer and breast cancer. The object is to provide an infitter (suppressing substance) used for the suppression.

本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究する中で、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）のＣ末端のアミノ酸配列、或いは、ＳＴＳのＮ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体が、ＳＴＳ酵素活性を低下し、しかも、ＳＴＳの変異体は、野生型のＳＴＳと複合体を形成し、ＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を示して、野生型のＳＴＳに対して有効なＳＴＳ酵素活性抑制効果を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has intensively studied, and the STS mutant lacking the amino acid sequence at the C-terminal of steroid sulfatase (STS) or the N-terminal of STS is STS enzyme activity is reduced, and a mutant of STS forms a complex with wild-type STS, exhibits a dominant negative effect on STS enzyme activity, and effectively suppresses STS enzyme activity against wild-type STS The inventors have found that the present invention is effective and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、ＳＴＳの変異体を用いるＳＴＳ酵素活性の抑制方法からなり、更には、該ＳＴＳ酵素活性の抑制方法において、ＳＴＳ酵素活性のインフィビター（抑制物質）として用いられるＳＴＳの変異体、該ＳＴＳの変異体の酵素タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、及び、該ＳＴＳ変異体やその遺伝子からなるＳＴＳ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤等からなる。本発明において、ＳＴＳのＣ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体としては、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質を挙げることができ、ＳＴＳのＮ末端のアミノ酸配列を欠失させたＳＴＳの変異体としては、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質を挙げることができる。また、本発明においては、ＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとを、例えば、それらの遺伝子のような形で共に導入して、ＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を発揮することができる。 That is, the present invention comprises a method for inhibiting STS enzyme activity using an STS variant, and further, an STS variant used as an STS enzyme activity inhibitor in the method for inhibiting STS enzyme activity. A gene encoding an enzyme protein of the STS mutant, a vector incorporating the gene, and a preventive and / or therapeutic agent for a disease caused by the STS enzyme activity comprising the STS mutant or the gene . In the present invention, STS mutants lacking the C-terminal amino acid sequence of the STS can include enzyme proteins from which 24 C-terminal amino acids have been deleted. Examples of the mutant of STS from which is deleted include an enzyme protein from which 52 amino acids at the N-terminal have been deleted. In the present invention, a mutant of STS and a wild-type STS can be introduced together, for example, in the form of their genes to exert a dominant negative effect on STS enzyme activity.

本発明の開発の経緯について説明すると、本発明者は以前に、ＳＴＳの遺伝子で１塩基が変化した２つの事例について報告したが、アミノ酸変異体Ｈ４４４Ｒ及びＱ５６０Ｐは、これらの事例で見出されたものである（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。ＳＴＳのＣ末端領域であるＱ５６０Ｐ突然変異体でＳＴＳ酵素活性が損なわれたことから、ＳＴＳ酵素のＣ末端領域はＳＴＳの酵素機能にとって重要であることが推測された（Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。この研究において、ＳＴＳ末端領域の重要性及び酵素活性に対する変異体ＳＴＳの影響について、分子解析を行った。末端を切断されたＳＴＳを調べるために、Ｎ末端とＣ末端とを切断されたＳＴＳ発現ベクターを、ＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳの活性は低下したが、切断されたＣ末端が長くなることによって、Ｃ末端領域を切断されたＳＴＳの活性は更に低下した。 To explain the development of the present invention, the present inventor previously reported two cases in which one base was changed in the gene of STS, but the amino acid variants H444R and Q560P were found in these cases. (Hum Mutat (Online) 15: 296, 2000). Since the STS enzyme activity was impaired in the Q560P mutant, which is the C-terminal region of STS, it was speculated that the C-terminal region of STS enzyme is important for the enzymatic function of STS (Hum Mutat (Online) 15: 296, 2000). In this study, molecular analysis was performed on the importance of the STS terminal region and the effect of mutant STS on enzyme activity. In order to examine the end-cut STS, an N-terminal and C-terminal CTS expression vector was introduced into COS-1 cells. Although the activity of the cleaved STS lacking the N-terminal region was reduced, the activity of the STS cleaved from the C-terminal region was further reduced by increasing the cleaved C-terminus.

パルス−チェイス実験によると、１塩基変異体ＳＴＳ（Ｑ５６０Ｐ）及びＣ末端を切断したＳＴＳ（Ｍ１Ａ６）は、タンパク質の合成や分解に対する効果を及ぼさないが、切断されたＳＴＳタンパク質と野生のＳＴＳタンパク質とが細胞内に存在する場合、Ｃ末端を切断されたＳＴＳはＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果を有することを見い出した。この研究において、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域の両方がＳＴＳ酵素活性に対して重要性であることが明らかとなった。Ｃ末端を切断された変異体は、野生のＳＴＳに対するドミナントネガティブ効果を有するので、この現象を利用することにより、ＳＴＳの酵素活性を有効に抑制することが可能であることが確認された。本発明は、これらの知見によりなされたものである。 According to the pulse-chase experiment, the single-base mutant STS (Q560P) and the CTS cleaved STS (M1A6) have no effect on protein synthesis or degradation, but the cleaved STS protein and the wild STS protein Was found to have a dominant negative effect on STS enzyme activity. In this study, it became clear that both the N-terminal region and the C-terminal region are important for STS enzyme activity. Since the C-terminal mutant has a dominant negative effect on wild STS, it was confirmed that the STS enzyme activity can be effectively suppressed by utilizing this phenomenon. The present invention has been made based on these findings.

すなわち具体的には本発明は、ステロイドスルファターゼの変異体を用いることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項１）や、ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項２）や、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項２記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項３）や、ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＮ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項４）や、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項４記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項５）からなる。 Specifically, the present invention specifically relates to a method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity characterized by using a mutant of steroid sulfatase (Claim 1), or the mutant of steroid sulfatase is a C-terminal deletion enzyme of steroid sulfatase. The method of inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 1 or claim 2, wherein the steroid sulfatase C-terminal deletion enzyme is an enzyme in which 24 C-terminal amino acids have been deleted. The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 2 or claim 3 wherein the steroid sulfatase mutant is an N-terminal deletion enzyme protein of steroid sulfatase. The steroid sulfatase enzyme activity of claim 1 5. The steroid sulfatase enzyme activity according to claim 4, wherein the C-terminal deletion enzyme of the control method (Claim 4) or the C-terminal deletion enzyme of steroid sulfatase is an enzyme protein from which 52 amino acids at the N-terminus have been deleted. It consists of the suppression method (Claim 5).

また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体と野生型のステロイドスルファターゼとの複合体を用いることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項６）や、ステロイドスルファターゼ変異体の酵素活性の抑制が、ステロイドスルファターゼのドミナントネガティブ変異によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項７）や、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子を導入し、発現することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を、共に導入することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法（請求項９）からなる。 Moreover, this invention uses the complex of the mutant of the steroid sulfatase in any one of Claims 1-5, and the wild type steroid sulfatase, The suppression method of the steroid sulfatase enzyme activity of Claim 1 characterized by the above-mentioned ( 6. The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to any one of claims 1 to 6, wherein inhibition of the enzyme activity of the steroid sulfatase mutant is caused by a dominant negative mutation of steroid sulfatase (claim). Item 7), a method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity, which comprises introducing and expressing a gene encoding a mutant of the steroid sulfatase according to any one of claims 1 to 5 (claim 8), Item 6. The steroid sulfatase mutation according to any one of Items 1 to 5 The gene that encodes a gene encoding a wild-type steroid sulfatase, consisting both methods inhibition of steroid sulfatase enzyme activity, which comprises introducing (claim 9).

さらに本発明は、請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体（請求項１０）や、請求項１０記載のステロイドスルファターゼ変異体からなるステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター（請求項１１）や、ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする請求項８記載の遺伝子（請求項１２）や、請求項９記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子とからなるステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子（請求項１３）や、請求項１２又は１３記載の遺伝子を組込んだ遺伝子発現用ベクター（請求項１４）や、ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を共に組込んだ、ステロイドスルファターゼ変異体及び野生型ステロイドスルファターゼ遺伝子発現用ベクター（請求項１５）や、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターからなることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター（請求項１６）や、請求項１０記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターを含有することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤（請求項１７）からなる。 Furthermore, the present invention relates to a steroid sulfatase mutant having the inhibitory action on the steroid sulfatase enzyme activity according to any one of claims 1 to 6 (claim 10) and a steroid sulfatase enzyme activity comprising the steroid sulfatase mutant according to claim 10. A gene according to claim 8 (claim 12) encoding a steroid sulfatase mutant having inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity (claim 11), or a steroid sulfatase mutant according to claim 9 A gene encoding an enzyme protein comprising an encoding gene and a wild-type steroid sulfatase encoding gene having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity (Claim 13), or the gene according to Claim 12 or 13 gene A steroid sulfatase mutant and a wild type, which incorporate both a current vector (Claim 14), a gene encoding a steroid sulfatase mutant having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity, and a gene encoding a wild type steroid sulfatase A steroid sulfatase gene expression vector (claim 15), a gene according to claim 12 or claim 13, or a vector according to claim 14 or 15, an inhibitor of steroid sulfatase enzyme activity (claim 16) Or a steroid sulfatase mutant having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity according to claim 10, a gene according to claim 12 or claim 13, or a vector according to claim 14 or 15. A preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by steroid sulfatase enzyme activity (claim 17).

子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の癌の発育と増殖が、エストロゲン依存性であることから、局所のホルモン環境の形成にＳＴＳが重要な役割を演じていると考えられ、該腫瘍増殖の抑制のために、低分子化化学物質によるＳＴＳ酵素活性の抑制が、化学療法として検討されてきた。そして、今までに、ＳＴＳ酵素活性の抑制には、各種のステロイド系及び非ステロイド系のインフィビター（阻害物質）が見い出されてきた。しかしながら、これらはいずれも低分子化学物質を阻害物質（インフィビター）とするものであるから、ヒト等への投与にあたっての化学療法としてのリスクを有し、しかも、阻害物質の酵素活性の抑制は十分ではなく、また、ステロイド系のインフィビター等においては、代謝された阻害物質がホルモン様の作用を生じたりして、その抗腫瘍効果は十分ではないという問題があった。 STS plays an important role in the formation of a local hormonal environment because the growth and proliferation of cancers of diseases that are thought to involve estrones such as endometrial cancer and breast cancer are estrogen-dependent. In order to suppress the tumor growth, suppression of STS enzyme activity by a low molecular weight chemical has been studied as a chemotherapy. Until now, various steroidal and non-steroidal infibiters (inhibitors) have been found for the suppression of STS enzyme activity. However, since these all use low-molecular-weight chemical substances as inhibitors (inhibitors), there is a risk as chemotherapy for administration to humans and the like, and suppression of enzyme activity of inhibitors is not possible. In addition, in the case of steroidal infibiters and the like, there is a problem that the antitumor effect is not sufficient because the metabolized inhibitor causes a hormone-like action.

そこで、本発明により、ＳＴＳの変異体を用いることにより、子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病におけるＳＴＳ酵素活性を効果的に抑制することができる。本発明においては、ＳＴＳ酵素活性のインフィビター（抑制物質）として、ＳＴＳの変異体の導入により、或いは該ＳＴＳの変異体の酵素タンパク質をコードする遺伝子、又は該遺伝子を組込んだベクター等を、遺伝子の形で導入し、発現することにより、ＳＴＳ変異体の野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ効果の発揮により、安全かつ効果的な方法でＳＴＳ酵素活性の抑制を行うことができる。また、本発明のＳＴＳ変異酵素自体には、ステロイドスルファターゼの酵素活性はないため、遺伝子導入しても、従来のステロイド系のインフィビター（阻害物質）が有していたＳＴＳ酵素活性の亢進作用はない。 Therefore, according to the present invention, by using a mutant of STS, it is possible to effectively suppress STS enzyme activity in diseases considered to involve estrones such as endometrial cancer and breast cancer. In the present invention, as an STS enzyme activity inhibitor (inhibitor), a gene encoding an STS mutant enzyme protein, a vector encoding the gene, or the like, By introducing and expressing in the form of a gene, the STS enzyme activity can be suppressed in a safe and effective manner by exerting a dominant negative effect on the wild-type STS of the STS mutant. Further, since the STS mutant enzyme of the present invention itself does not have the enzyme activity of steroid sulfatase, even if the gene is introduced, the STS enzyme activity enhancing action that a conventional steroid-based infibitator (inhibitor) has has been Absent.

したがって、本発明の方法は、子宮内膜癌や乳癌等のエストロン類が関与すると考えられる疾病の予防又は治療のために、従来、開発されてきた低分子化学物質による化学療法に代えて、これらの疾病の予防又は治療のための安全で、かつ効果的な新しい疾病の予防又は治療方法を提供するものである。例えば、ＳＴＳ変異体と野生型のＳＴＳとの遺伝子を、共導入することにより、ＳＴＳ変異体の野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ作用を発揮して、ＳＴＳ酵素活性を抑制することが可能であり、ＳＴＳ酵素活性が関与する疾病に対する遺伝子治療が可能となる。 Therefore, the method of the present invention replaces the conventionally developed chemotherapy with low molecular weight chemicals for the prevention or treatment of diseases thought to involve estrones such as endometrial cancer and breast cancer. The present invention provides a safe and effective method for preventing or treating new diseases for the prevention or treatment of other diseases. For example, by co-introducing a gene of an STS mutant and a wild-type STS, it is possible to exert a dominant negative action on the wild-type STS of the STS mutant and suppress the STS enzyme activity, Gene therapy for diseases involving STS enzyme activity becomes possible.

本発明は、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）の変異体を用いることによりＳＴＳ酵素活性の抑制を行う方法よりなる。ＳＴＳは、肝臓、卵巣及び睾丸等の様々な哺乳動物組織に存在し、特に、特に胎盤に多く存在する公知の酵素タンパク質であり（J Clin Endocrinol Metab 25:278-282, 1965）、該ＳＴＳタンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードする塩基配列は、配列表の配列番号１及び２に示される（J. Biol. Chem. 264:13865-13872,1989）。また、該ＳＴＳタンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードする塩基配列についての情報は、ＮＣＢＩのデーターベースにおいて、アクセッションＮｏ．：ＮＰ０００３４２によってアクセスすることができる。
本発明において、ＳＴＳの酵素活性を抑制するためのＳＴＳの変異体としては、特に、ＳＴＳのＣ末端欠失酵素タンパク質、或いはＮ末端欠失酵素タンパク質のようなＳＴＳのトランケートタイプのものが用いられる。該ＳＴＳのＣ末端欠失酵素タンパク質としては、特に好ましくは、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質を用いることができる。また、該ＳＴＳのＮ末端欠失酵素タンパク質としては、特に好ましくは、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質を用いることができる。 The present invention comprises a method of inhibiting STS enzyme activity by using a steroid sulfatase (STS) variant. STS is a known enzyme protein that exists in various mammalian tissues such as liver, ovary, and testis, and is particularly abundant in the placenta (J Clin Endocrinol Metab 25: 278-282, 1965). The amino acid sequence and the nucleotide sequence encoding the protein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing (J. Biol. Chem. 264: 13865-13872, 1989). In addition, information on the amino acid sequence of the STS protein and the base sequence encoding the protein can be found in the accession no. : Can be accessed by NP000342.
In the present invention, as an STS mutant for suppressing STS enzyme activity, an STS truncated type protein such as an STS C-terminal deletion enzyme protein or an N-terminal deletion enzyme protein is used. . As the STS C-terminal deletion enzyme protein, an enzyme protein in which 24 C-terminal amino acids have been deleted can be used particularly preferably. In addition, as the STS N-terminal deletion enzyme protein, an enzyme protein in which 52 N-terminal amino acids have been deleted can be used particularly preferably.

本発明で用いられるＳＴＳの変異体の調製は、ＳＴＳをコードする遺伝子から公知の遺伝子工学手法を用いて行うことができる。例えば、ＳＴＳをコードする遺伝子の５´末端或いは３´末端から、所定のアミノ酸配列に対応する塩基配列を削除し、ＳＴＳの変異体のアミノ酸配列に対応する遺伝子を構築し、該遺伝子を適当な発現ベクターに組込んで、宿主細胞に導入し、発現することにより、取得することができる。本発明で用いられるＳＴＳの変異体は、野生型のＳＴＳと複合体を形成し、野生型のＳＴＳに対するドミナントネガティブ作用により、ＳＴＳの酵素活性の抑制を行うことが見い出されているので、本発明の実施の態様の1つとしてＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとを共に導入して、ＳＴＳの酵素活性の抑制を行うことが可能である。 The STS mutant used in the present invention can be prepared from a gene encoding STS using a known genetic engineering technique. For example, the base sequence corresponding to a predetermined amino acid sequence is deleted from the 5 ′ end or 3 ′ end of the gene encoding STS, a gene corresponding to the amino acid sequence of the STS mutant is constructed, and the gene is It can be obtained by incorporating it into an expression vector, introducing it into a host cell and expressing it. It has been found that the mutant of STS used in the present invention forms a complex with wild-type STS and suppresses the enzyme activity of STS by dominant negative action on wild-type STS. As one of the embodiments, it is possible to introduce the STS mutant and the wild type STS together to suppress the enzyme activity of the STS.

本発明のＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体は、ＳＴＳのインフィビターとして用いて、子宮内膜癌や乳癌のようなＳＴＳ酵素活性が関与する疾病の予防及び／又は治療を行うことができる。ＳＴＳ酵素活性が関与する疾病としては、子宮内膜癌や乳癌の他に、エストロン類が関与すると考えられる他の疾病、例えば、卵巣癌、子宮内膜症及び子宮腺筋症等、或いはアンドロゲン類が関与すると考えられる疾病、例えば、前立腺癌等が挙げられる。 The STS mutant having an inhibitory effect on STS enzyme activity of the present invention is used as an STS inhibitor to prevent and / or treat diseases involving STS enzyme activity such as endometrial cancer and breast cancer. Can do. As diseases involving STS enzyme activity, in addition to endometrial cancer and breast cancer, other diseases considered to involve estrones such as ovarian cancer, endometriosis and uterine adenomyosis, and androgens Diseases that are thought to be involved, such as prostate cancer.

本発明のＳＴＳ変異体タンパク質を、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有する医薬として投与する場合には、公知の製剤形態に製剤化し、公知の投与方法を用いて投与することができる。すなわち、その医薬組成物の製剤に当っては薬理上許容される担体又は希釈剤とともに医薬組成物に製剤化することができる。本発明の医薬組成物の剤型としては、外用剤、経口投与剤、注射剤などが挙げられ、それぞれの剤型にあった投与方法で投与される。投与方法としては、注射による投与が好ましい。注射による投与には全身投与と局所投与がある。全身投与としては静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、皮内注射などが挙げられ、局所投与としては腫瘍内注射などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、いずれの方法にも用いることができるが、各種癌種への適用性を考慮して全身投与或いは局部投与を検討するのが好ましい。また、薬剤の性質から静脈内注射を選択することもできる。 When the STS mutant protein of the present invention is administered as a medicament having an inhibitory effect on STS enzyme activity, it can be formulated into a known preparation form and administered using a known administration method. That is, the pharmaceutical composition can be formulated into a pharmaceutical composition together with a pharmacologically acceptable carrier or diluent. Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention include an external preparation, an oral administration agent, an injection, and the like. As an administration method, administration by injection is preferable. Administration by injection includes systemic administration and local administration. Systemic administration includes intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intradermal injection and the like, and local administration includes intratumoral injection. The pharmaceutical composition of the present invention can be used in any method, but it is preferable to examine systemic administration or local administration in consideration of applicability to various cancer types. Intravenous injection can also be selected from the nature of the drug.

本発明のＳＴＳ変異体タンパク質は、該ＳＴＳ変異体タンパク質をコードする遺伝子の形で、生体細胞内に導入し、発現してＳＴＳ酵素活性を抑制することができる。該遺伝子の導入は、公知の遺伝子導入手段を用いることができる。該遺伝子の導入に際しては、適当な発現ベクターを用いることが望ましい。本発明においては、ＳＴＳの変異体と野生型のＳＴＳとのドミナントネガティブ効果によるＳＴＳ酵素活性の抑制効果を誘発するために、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体をコードする遺伝子と野生型のＳＴＳをコードする遺伝子を共に組込んだ、ＳＴＳ変異体及び野生型ＳＴＳ遺伝子発現用ベクターを用いることが好ましい態様として挙げることができる。 The STS mutant protein of the present invention can be introduced into a living cell and expressed in the form of a gene encoding the STS mutant protein to suppress STS enzyme activity. For the introduction of the gene, known gene introduction means can be used. For the introduction of the gene, it is desirable to use an appropriate expression vector. In the present invention, in order to induce an inhibitory effect on STS enzyme activity due to a dominant negative effect between a mutant of STS and a wild-type STS, a gene encoding an STS mutant having an inhibitory action on STS enzyme activity and a wild-type A preferred embodiment is to use an STS mutant and a wild-type STS gene expression vector in which a gene encoding a type STS is incorporated.

本発明において、ＳＴＳ酵素活性の抑制作用を有するＳＴＳの変異体をコードする遺伝子を、遺伝子治療の形で生体内に導入するには、本発明で用いる遺伝子を含有する遺伝子治療用の導入用ベクターまたは該ベクターにより本発明で用いる遺伝子を導入した細胞を用いて実施することができる。該遺伝子治療用の導入用ベクターを用いて遺伝子を導入する場合には、本発明で用いる遺伝子を染色体外に維持するようなベクターを用いて細胞に導入することができる。この場合において当該遺伝子は、染色体外の位置から細胞により発現できる。遺伝子導入用ベクターとしては、当該分野において既に知られている各種のベクターをもちいることができる。遺伝子導入用ベクターの標的とする細胞への導入は、当該分野において既に知られている各種の細胞にＤＮＡを導入する方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、ウイルス形質導入などに従い容易に実施することができる。 In the present invention, in order to introduce a gene encoding an STS mutant having an inhibitory effect on STS enzyme activity into a living body in the form of gene therapy, an introduction vector for gene therapy containing the gene used in the present invention. Alternatively, it can be carried out using a cell into which the gene used in the present invention has been introduced by the vector. When a gene is introduced using the introduction vector for gene therapy, the gene used in the present invention can be introduced into a cell using a vector that maintains outside the chromosome. In this case, the gene can be expressed by the cell from an extrachromosomal location. As the vector for gene introduction, various vectors already known in the art can be used. Introduction of a vector for gene introduction into a target cell is easily performed according to a method of introducing DNA into various cells already known in the art, such as electroporation, calcium phosphate coprecipitation, viral transduction and the like. be able to.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

（ＳＴＳ変異体のＳＴＳ酵素活性の解析）
［方法］
（プラスミドの構築）
ヒトＳＴＳｃＤＮＡからのＥｃｏＲＩフラッグメントをｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１に挿入することにより、フルレングスのＳＴＳタンパク質をコードするヒトＳＴＳｃＤＮＡ（２．０ｋｂ）発現ベクター（ｐＳＴＳ）を調製した（Stein,C., et al ,J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。「Transformer Site Directed Mutagenesis kit 」（CLONTECH Laboratories. Inc.社製、Palo Alto, CA）を用いて、Ｘ染色体性魚鱗癬の原因となるＱ５６０ＰとＨ４４４Ｒの変異体を生成し、プラスミドｐＱ５６０Ｐ及びｐＨ４４４Ｒを前述のように産生した（Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782, 1995）。ＰＣＲによりヒトＳＴＳｃＤＮＡをテンプレートとして用いて様々なトランケートＳＴＳ発現コンストラクト（truncated STS expression constructs）を調製し、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位でｐＳＶ×ＳＰＯＲＴ１にクローンした。切断されたＳＴＳタンパク質を図１に示す。 (Analysis of STS enzyme activity of STS mutant)
[Method]
(Plasmid construction)
A human STS cDNA (2.0 kb) expression vector (pSTS) encoding a full-length STS protein was prepared by inserting an EcoRI fragment from human STS cDNA into pSV SPORT 1 (Stein, C., et al, J. Biol. Chem., 264: 13865-13872, 1989). Using the “Transformer Site Directed Mutagenesis kit” (CLONTECH Laboratories. Inc., Palo Alto, Calif.), Mutants of Q560P and H444R causing X-chromosome ichthyosis are generated, and plasmids pQ560P and pH444R are described above. (Sugawara, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4778-4782, 1995). Various truncated STS expression constructs were prepared by PCR using human STS cDNA as a template and cloned into pSV × SPORT1 at the EcoRI restriction enzyme site. The cleaved STS protein is shown in FIG.

ＳＴＳ遺伝子の５’−及び３’−非翻訳領域を欠如するＭ１Ａ４は、ＳＴＳタンパク質のフルレングスをコードする。Ｍ１Ａ５（Ｃ−１１）はＣ末端１１アミノ酸を欠如し、Ｍ１Ａ６（Ｃ−２４）は同様に、グルタミン５６０を含むＣ末端２４アミノ酸を欠如する。Ｍ２Ａ４（Ｎ−２４）は、ミクロソームに対するシグナルペプチドをコードする初めの２４Ｎ末端アミノ酸を欠如し、Ｍ３Ａ４（Ｎ−５２）は、Ｎ−グリコシル化部位であるコドン４７（Ａｓｎ）を含む初めの５２Ｎ末端アミノ酸を欠如する。Ｍ２Ａ６（Ｎ−２４Ｃ−２４）は、Ｎ末端２４アミノ酸とＣ末端２４アミノ酸を欠如し、Ｍ３Ａ６（Ｎ−５２Ｃ−２４）は、Ｎ末端５２アミノ酸とＣ末端２４アミノ酸とを欠如する。 M1A4, which lacks the 5'- and 3'-untranslated regions of the STS gene, encodes the full length of the STS protein. M1A5 (C-11) lacks the C-terminal 11 amino acids and M1A6 (C-24) similarly lacks the C-terminal 24 amino acids, including glutamine 560. M2A4 (N-24) lacks the first 24 N-terminal amino acid encoding the signal peptide for microsomes, and M3A4 (N-52) is the first 52 N-terminal containing codon 47 (Asn), the N-glycosylation site. Lack of amino acids. M2A6 (N-24 C-24) lacks the N-terminal 24 amino acids and the C-terminal 24 amino acids, and M3A6 (N-52 C-24) lacks the N-terminal 52 amino acids and the C-terminal 24 amino acids.

（細胞の培養及び遺伝子導入）
サル腎臓ＣＯＳ−１細胞をRIKEN BANK社（筑波、日本）より入手した。ＣＯＳ−１細胞を３５ｍｍのプラスチックシャーレで育て、１０％ＦＣＳとゲンタマイシン（gentamicin）、５０μｇ／ｍｌを補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。前述のように、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche Molecular Biochemicals社製、Mannheim, Germany）を用いて、野生型のＳＴＳｃＤＮＡ及び切断された変異体ＳＴＳｃＤＮＡ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。 (Cell culture and gene transfer)
Monkey kidney COS-1 cells were obtained from RIKEN BANK (Tsukuba, Japan). COS-1 cells were grown in a 35 mm plastic dish and cultured in Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, gentamicin, and 50 μg / ml. As described above, FuGENE 6 (manufactured by Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) was used to introduce a gene into COS-1 cells using wild-type STS cDNA and a cleaved mutant STS cDNA expression vector (Stein, C , et al, J. Biol. Chem., 264: 13865-13872, 1989).

野生型のＳＴＳｃＤＮＡ及び切断された突然変異体ＳＴＳで、いくつかの培養物を共遺伝子導入した。４００μｌの溶解緩衝液（Promega Corp.社製、Madison, WI）中で細胞抽出物を調製し、細胞を４８時間培養した。培養の終わりに、ＳＴＳ酵素活性を評価するために培養液を回収し、ウエスタンブロット法を行った。リン酸緩衝食塩水で細胞を２度洗浄し、２００μｌのＳＴＳ溶解緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍＭ、Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ１%、プロテイナーゼ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals社製）１ｘ］中で細胞抽出物を調製した。BCA protein assay kit（Pierce社製、Rockford, IL）を用いてタンパク質濃度を測定した。検出事項の一般性を確かめるために、細胞の調製が異なる３つの別個の場合において各実験を行った。 Several cultures were co-transfected with wild-type STS cDNA and the truncated mutant STS. Cell extracts were prepared in 400 μl lysis buffer (Promega Corp., Madison, Wis.) And cells were cultured for 48 hours. At the end of the culture, the culture solution was collected and subjected to Western blotting in order to evaluate the STS enzyme activity. The cells were washed twice with phosphate buffered saline, and the cell extract was washed in 200 μl of STS lysis buffer [Tris-HCl 10 mM, Triron-X 1%, proteinase inhibitor (Roche Molecular Biochemicals) 1 ×]. Prepared. Protein concentration was measured using BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL). To confirm the generality of the detection, each experiment was performed in three separate cases with different cell preparations.

（ＳＴＳ酵素活性）
ＳＴＳ酵素活性を前述の方法で分析した（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）２０ｍＭ、５０，０００ｄｐｍの７−［³Ｈ］dehydroepiandrosterone サルフェート（ＤＨＥＡＳ）（１６Ｃｉ／ｍｍｏｌ, New England Nuclear社製、Boston）、ＤＨＥＡＳ１０ｎｍｏｌ、１％Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ−１００及び２５μｌの酵素源(enzyme source)を含む反応混合物を３７℃で１時間培養した。培養の終わりに、ベンゼンを加えて脱リン酸化したＤＨＥＡを抽出し、３ｍｌのシンチレーション混合物を加えて液体シンチレーションカウンターで分析した。１時間、１ｍｇで、１ｐｍｏｌのＤＨＥＡＳ加水分解を触媒する酵素の量を活性の１単位として定義した。 (STS enzyme activity)
STS enzyme activity was analyzed by the method described above (Stein, C., et al, J. Biol. Chem., 264: 13865-13872, 1989). Tris-HCI (pH 8.0) 20 mM, 50,000 dpm 7- [ ³ H] dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) (16 Ci / mmol, New England Nuclear, Boston), DHEAS 10 nmol, 1% Triron-X-100 and The reaction mixture containing 25 μl of enzyme source was incubated at 37 ° C. for 1 hour. At the end of the culture, DHEA dephosphorylated by adding benzene was extracted, 3 ml of scintillation mixture was added and analyzed in a liquid scintillation counter. The amount of enzyme that catalyzes 1 pmol of DHEAS hydrolysis at 1 mg for 1 hour was defined as one unit of activity.

（ウエスタンブロット法による解析）
３５ｍｍ組織培養皿が同数の細胞を受け取ることができるように、サブコンフルエントなＣＯＳ−１細胞の培養物を播種した。遺伝子導入の後、ウエスタンブロット法で解析を行うために、ＣＯＳ−１細胞抽出物を収集した。次に、１０μｇの細胞抽出物に１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。先述のように、電気泳動法の後、ヒトＳＴＳでウサギを免疫化することによって調製したウサギ抗ＳＴＳ血清(rabbit anti-STS serum)で免疫検出するために、ゲルをニトロセルロース膜に転移させた（Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226:13-20, 1994）。 (Analysis by Western blotting)
Subconfluent cultures of COS-1 cells were seeded so that a 35 mm tissue culture dish could receive the same number of cells. After gene transfer, COS-1 cell extracts were collected for analysis by Western blotting. Next, 10% of the cell extract was subjected to 12% SDS-PAGE. As described above, after electrophoresis, the gel was transferred to a nitrocellulose membrane for immunodetection with rabbit anti-STS serum prepared by immunizing rabbits with human STS. (Sugawara, T., et al. Clin Chim Acta 226: 13-20, 1994).

ウサギポリクローナル抗ＳＴＳを、１：１０００の希釈で第一抗体（primary antibody）として使用した。２５℃で１時間培養を行った後、１：１０，０００で希釈したぺルオキシダーゼ結合抗ウサギヤギ抗体(horse radish-peroxidase-conjugated affinity pure goat anti-rabbit antibody)（Roche Molecular Biochemicals社製）で、ブロットを更に２５℃で６０分培養した。ＥＣＬウェスタンブロット法検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech社製、Uppsala, Sweden）を用いて、シグナルを化学発光によって検出した。続いて、その膜をFuji RX-Uフィルム（Fuji Co.社製、東京、日本）に露出した。 Rabbit polyclonal anti-STS was used as the primary antibody at a dilution of 1: 1000. After culturing at 25 ° C. for 1 hour, a peroxidase-conjugated anti-rabbit goat antibody diluted by 1: 10,000 (manufactured by Roche Molecular Biochemicals) The blot was further incubated at 25 ° C. for 60 minutes. Signals were detected by chemiluminescence using ECL Western blotting detection reagent (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Subsequently, the film was exposed to Fuji RX-U film (Fuji Co., Tokyo, Japan).

（ノーザンブロットによる解析とｃＤＮＡプローブの調製）
１００ｍｍプラスチックシャーレで継代培養した１日後にＣＯＳ−１細胞を培養し、次に様々な種類のｐＳＴＳで遺伝子導入し、ＦｕＧＥＮＥ６を用いて変異体ＳＴＳｃＤＮＡ発現ベクターを切断した。ＣＯＳ−１細胞からの全ＲＮＡの調製、培養及び単離の手順は、詳細に先述されている（Stein,C. ,et al, J. Biol. Chem.,264:13865-13872,1989）。ノーザンブロットによる解析については、各シャーレから３０μｇの全ＲＮＡを電気泳動法で分離し、ナイロン膜に転移させた（Biodyne, ICN, Glen Cove, NY）。核酸検出キットの標準的なプロトコールに従って、シグナルの検出を行った（Roche Molecular Biochemicals社製）。ヒトＳＴＳｃＤＮＡでノーザンブロットのプローブをした（probe）。ｐＳｐｏｒｔ−１におけるヒトＳＴＳｃＤＮＡをＳａIIで直線化した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡ標識キット（Roche Molecular Biochemicals社製）を用いたインビトロ転写によって、ジゴキシゲニン標識ヒトＳＴＳプローブ(Digoxigenin-labeled human STS probes)を産生した。 (Analysis by Northern blot and preparation of cDNA probe)
One day after subculture in a 100 mm plastic petri dish, COS-1 cells were cultured, and then introduced with various types of pSTS, and FuGENE 6 was used to cleave the mutant STS cDNA expression vector. The procedure for the preparation, culture and isolation of total RNA from COS-1 cells has been previously described in detail (Stein, C., et al, J. Biol. Chem., 264: 13865-13872, 1989). For analysis by Northern blot, 30 μg of total RNA from each dish was separated by electrophoresis and transferred to a nylon membrane (Biodyne, ICN, Glen Cove, NY). Signal detection was performed according to the standard protocol of the nucleic acid detection kit (Roche Molecular Biochemicals). Northern blots were probed with human STS cDNA. Human STS cDNA in pSport-1 was linearized with SaII. Digoxigenin-labeled human STS probes were produced by in vitro transcription using T7 RNA polymerase and RNA labeling kit (Roche Molecular Biochemicals).

（インビトロ転写）
インビトロで、Ｓｐ６ＲＮＡポリメラーゼに基づくＴＮＴ結合網状赤血球溶解システム（Sp6 RNA polymerase-based TNT-coupled reticulocyte lysate system）（Promega Corp.社製）を用いて、製造者の説明書に従ってＳＴＳタンパク質を合成した。５００ナノグラムのｐＳＴＳ又は切断された発現ベクターを、インビトロ転移反応混合物と混合した。３０度で９０分間、ＳＰ６ＴＮＴＲＮＡポリメラーゼで転移反応を行った。１０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液(sample buffer)を添加し、５分間加熱し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次にウエスタンブロット法による解析を行った。 (In vitro transcription)
In vitro, STS protein was synthesized using Sp6 RNA polymerase-based TNT-coupled reticulocyte lysate system (Promega Corp.) according to the manufacturer's instructions. 500 nanograms of pSTS or cleaved expression vector was mixed with the in vitro transfer reaction mixture. Transfer reaction was performed with SP6 TNT RNA polymerase at 30 degrees for 90 minutes. 10 μl of 2 × SDS sample buffer was added, heated for 5 minutes, 12% SDS-PAGE was performed, and then analyzed by Western blotting.

（パルス−チェイス実験）
標識化(metabolic labeling)１日前に、ｐＳＴＳ（２．０μｇ）又は突然変異体ＳＴＳ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。メチオニンを含まないＤＭＥＭでＣＯＳ−１細胞を１５分間培養し、［³⁵Ｓ］メチオニン（０．４ｍＣｉ／ｍｌ）で３０分間標識した。標識した後、メチオニン４ｍＭを含む放射性培地をＤＭＥＭと置換し、細胞を表示された時間培養した。次にリン酸緩衝食塩水で細胞を洗浄し、４００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ５０ｍＭ、ノデットＰ−４０１％、デオキシコール酸０．１％、ＳＤＳ０．１％、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ＰＭＳＦ０．１ｍＭ及びプロテイナーゼ阻害剤１ｘ）中に掻き落とした。 (Pulse-chase experiment)
One day prior to metabolic labeling, COS-1 cells were transfected with pSTS (2.0 μg) or mutant STS expression vectors. COS-1 cells were cultured for 15 minutes in DMEM without methionine and labeled with [ ³⁵ S] methionine (0.4 mCi / ml) for 30 minutes. After labeling, the radioactive medium containing 4 mM methionine was replaced with DMEM and the cells were cultured for the times indicated. Next, the cells were washed with phosphate buffered saline, and 400 μl of RIPA buffer (Tris-HCL 50 mM, Nodette P-40 1%, deoxycholic acid 0.1%, SDS 0.1%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM) Dithiothreitol 1 mM, PMSF 0.1 mM and proteinase inhibitor 1x).

２０μｌのプロテインＧセファロース（Amersham Pharmacia Biotech社製）で、３０分間４℃で細胞抽出物からの同分割量のタンパク質で事前に処理した。遠心分離後、上清を１μｌの抗ＳＴＳ血清で３時間４℃で培養し、ロッキングプラットフォーム上で、２０μｌのプロテインＧセファロースで一晩４℃で培養した。５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で再懸濁することにより、免疫複合体を洗浄し、遠心分離によって回収した。１０μｌの２×ＳＤＳ標本緩衝液にペレットを再懸濁し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルを乾燥し、Fuji RX-U filmに露出した。 Pretreated with 20 μl Protein G Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) for 30 minutes at 4 ° C. with the same aliquot of protein from the cell extract. After centrifugation, the supernatant was incubated with 1 μl of anti-STS serum for 3 hours at 4 ° C. and on a rocking platform with 20 μl protein G sepharose overnight at 4 ° C. Immune complexes were washed by resuspending in 500 μl RIPA buffer and collected by centrifugation. The pellet was resuspended in 10 μl of 2 × SDS sample buffer followed by SDS-PAGE. The gel was dried and exposed to Fuji RX-U film.

［結果］
ＳＴＳは、Ｎ−末端領域のアスパラギン４７残基で、メチオニン及びＮ−グリコシル化部位で始まる、２３アミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを有する。本発明者らは、ＳＴＳ遺伝子の１塩基が変化したＸＬＩの事例や、ＳＴＳの酵素活性を欠如した変異体であるアミノ酸変異体Ｑ５６０Ｐについて先に報告した（Sugawara, T., et al. Hum Mutat (Online) 15:296, 2000）。哺乳動物細胞でＳＴＳ変異体を発現させるために、ＳＴＳ変異体発現ベクターを調製した。変異体がメチオニンから翻訳するように、切断されたＳＴＳ変異体のＮ末端領域にＡＴＧを加え、同様に、切断されたＳＴＳ変異体のＣ末端領域にターミナルコドンＴＡＧを加えた（図１）。 [result]
STS has an N-terminal signal peptide of 23 amino acids, starting with methionine and an N-glycosylation site at 47 residues of asparagine in the N-terminal region. The present inventors previously reported the case of XLI in which one base of the STS gene was changed and the amino acid mutant Q560P, which is a mutant lacking the enzyme activity of STS (Sugawara, T., et al. Hum Mutat). (Online) 15: 296, 2000). In order to express the STS mutant in mammalian cells, an STS mutant expression vector was prepared. In order for the mutant to translate from methionine, ATG was added to the N-terminal region of the cleaved STS variant, and similarly a terminal codon TAG was added to the C-terminal region of the cleaved STS variant (FIG. 1).

酵素活性に対する切断された（トランケート）ＳＴＳの効果を調べるために、切断されたＳＴＳ発現ベクターを、内因性ＳＴＳ酵素を発現しないＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入し、ＳＴＳ酵素活性を分析した（図２）。空(the mock)遺伝子導入におけるＳＴＳの酵素活性レベルは低く、ＣＯＳ−１細胞によって産生された、切断されたＳＴＳ酵素活性のレベルは、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生されたものよりも低かった。ＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳの活性レベルは、切断されたＣ末端領域のアミノ酸の数によって大きく低下した。Ｃ−５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６を切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞が産生したＳＴＳ酵素活性は、野生のＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞と比較して６．４％であり、空遺伝子導入の場合とほぼ等しかった。切断されたＭ１Ａ６発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞が産生したＳＴＳ酵素活性は、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１と比較して、６．４％であった。 In order to examine the effect of a truncated (truncated) STS on enzyme activity, the cleaved STS expression vector was introduced into COS-1 cells that do not express endogenous STS enzyme and analyzed for STS enzyme activity (FIG. 2). ). The level of STS enzyme activity in the mock gene transfer is low, and the level of cleaved STS enzyme activity produced by COS-1 cells is observed by COS-1 cells transfected with the wild STS expression vector. It was lower than that produced. The activity level of STS in COS-1 cells was greatly reduced by the number of cleaved C-terminal region amino acids. The STS enzyme activity produced by COS-1 cells transfected with an expression vector cleaved from M1A6 lacking the C-52 amino acid was 6.4 compared to COS-1 cells transfected with wild STS. %, Which was almost equal to the case of empty gene transfer. The STS enzyme activity produced by COS-1 cells transfected with the cleaved M1A6 expression vector was 6.4% compared to COS-1 transfected with the wild STS expression vector.

Ｃ−５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６ベクターを持つＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳ酵素活性は、疑似遺伝子導入の場合とほぼ等しかった。或いは、（Ｍ１Ａ６を切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞におけるステロイドスルファターゼ酵素活性は、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における場合の６．４％であった。Ｃ末端の５２アミノ酸を欠如したＭ１Ａ６を導入するＣＯＳ−１細胞のＳＴＳ活性は、偽の遺伝子導入をされたＣＯＳ−１細胞の酵素活性とほぼ等しかった）。Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳの活性レベルは低下したが、ＳＴＳ酵素活性レベルの低下率は、野生のＳＴＳ（Ｍ２Ａ４及びＭ３Ａ４）で遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における場合と比較すると、中程度であった。
ｐＭ２Ａ４及びｐＭ３Ａ４で遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞における酵素活性は２７％であり、野生のＳＴＳｃＤＮＡで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞においては２５％であった。Ｃ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳ発現ベクター（Ｍ１Ａ６、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）をＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入すると、ＳＴＳ酵素活性はＣＯＳ−１細胞において完全に損なわれた。 The STS enzyme activity in COS-1 cells with the M1A6 vector lacking the C-52 amino acid was almost equal to that of pseudogene transfer. Alternatively, the steroid sulfatase enzyme activity in COS-1 cells transfected with an expression vector cleaved with M1A6 was 6.4% in COS-1 cells transfected with a wild STS expression vector The STS activity of COS-1 cells into which M1A6 lacking 52 amino acids at the C-terminal was introduced was almost equal to the enzyme activity of COS-1 cells into which a pseudogene had been introduced). Although the level of STS activity in COS-1 cells transfected with cleaved STS lacking the N-terminal region was reduced, the rate of decrease in STS enzyme activity level was transduced with wild STS (M2A4 and M3A4). Compared to that in COS-1 cells, it was moderate.
Enzyme activity in COS-1 cells transfected with pM2A4 and pM3A4 was 27% and in COS-1 cells transfected with wild STS cDNA was 25%. When transduced STS expression vectors lacking the C-terminal region (M1A6, M2A6 and M3A6) were transfected into COS-1 cells, STS enzyme activity was completely impaired in COS-1 cells.

ＣＯＳ−１細胞における切断されたタンパク質の発現を調べるために、様々な種類の切断されたＳＴＳ発現ベクターが遺伝子導入されているＣＯＳ−１細胞由来の抽出物に、ウェスタンブロット法による解析を行った（図３−A）。Ｃ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ１Ａ５及びＭ１Ａ６）のタンパク質レベルは、ＣＯＳ−１細胞における野生のＳＴＳタンパク質のレベルとほぼ等しかった。Ｃ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳをＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した場合は、タンパク質の翻訳は損なわれなかった。一方、Ｎ末端領域を欠如した切断されたＳＴＳ（Ｍ２Ａ４、Ｍ３Ａ４、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）のタンパク質酵素レベルは低下した。検出された抗ヒトＳＴＳ血清によって検出された切断されたタンパク質の分子サイズは、野生のＳＴＳのものより小さく、タンパク質量も野生のＳＴＳのものより少なかった。切断されたＳＴＳの発現を調べるために、切断されたＳＴＳ発現プラスミドで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞からの全ＲＮＡを用いて、ノーザンブロット法による解析を行った（図３−B）。切断された発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞においては、ＳＴＳｍＲＮＡレベルは不変であった。このような観察から、切断されたＳＴＳの転写は、野生のＳＴＳの転写と等しい効果を有することが示される。 To examine the expression of cleaved protein in COS-1 cells, Western blot analysis was performed on extracts derived from COS-1 cells into which various types of cleaved STS expression vectors had been introduced. (FIG. 3-A). The protein levels of CTS truncated STS (M1A5 and M1A6) were approximately equal to the level of wild STS protein in COS-1 cells. When transduced CTS-1 cells lacking the C-terminal region were transfected into COS-1 cells, protein translation was not impaired. On the other hand, the protein enzyme levels of cleaved STS lacking the N-terminal region (M2A4, M3A4, M2A6 and M3A6) were reduced. The molecular size of the cleaved protein detected by the detected anti-human STS serum was smaller than that of wild STS and the amount of protein was also less than that of wild STS. In order to examine the expression of the cleaved STS, analysis by Northern blotting was performed using total RNA from COS-1 cells that had been transfected with the cleaved STS expression plasmid (FIG. 3-B). In COS-1 cells transfected with the cleaved expression vector, STS mRNA levels were unchanged. Such observations indicate that cleaved STS transcription has the same effect as wild STS transcription.

タンパク質合成プロセスに対する、Ｎ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ２Ａ４、Ｍ３Ａ４、Ｍ２Ａ６及びＭ３Ａ６）の効果を判定するために、インビトロ転写／翻訳を用いてプラスミド発現の効果を調べた（図４）。翻訳生成物にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いてウエスタンブロット法による解析を行った。インビトロ転写／翻訳反応混合物中のＳＴＳ翻訳生成物の量を測定した。ＳＴＳ（Ｍ２Ａ４及びＭ２Ａ６）のＮ末端領域シグナルペプチドを欠如した切断されたＳＴＳのタンパク質合成に対して、明らかな効果が示されなかった。ＳＴＳのＮ末端領域は、翻訳プロセスに対しては小さな効果を有するに過ぎない。 To determine the effect of N-terminally truncated STS (M2A4, M3A4, M2A6 and M3A6) on the protein synthesis process, the effect of plasmid expression was examined using in vitro transcription / translation (FIG. 4). The translation product was subjected to SDS-PAGE followed by Western blot analysis. The amount of STS translation product in the in vitro transcription / translation reaction mixture was measured. No obvious effect was shown on protein synthesis of cleaved STS lacking the N-terminal region signal peptide of STS (M2A4 and M2A6). The N-terminal region of STS has only a small effect on the translation process.

Ｃ末端１塩基変異体ＳＴＳ（Ｑ５６０Ｐ）及びＣ末端を切断されたＳＴＳ（Ｍ１Ａ６）が、ＳＴＳタンパク質の合成及び分解に対する効果を有するかどうかを判定するために、パルス−チェイス実験を行った。（図５）。ＣＯＳ−１細胞を野生のＳＴＳ、Ｍ１Ａ６及びＱ５６０Ｐ発現プラスミドで遺伝子導入し、続いて［³⁵Ｓ］メチオニンで代謝的に標識した。パルス後（the pulse period）２４時間までの野生型のＳＴＳ、Ｍ１Ａ６及びＱ５６０Ｐ変異体の標識したタンパク質レベルは、時間の経過と共に低下した。１塩基変異体Ｑ５６０Ｐで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞とＮ末端領域を切断されたＳＴＳとに関するパルス−チェイス実験の結果を、野生のＳＴＳ発現ベクターで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞に関するパルス−チェイス実験の結果と比較した。Ｃ末端１塩突然変異体と切断された変異タンパク質の両方は、野生のＳＴＳと同程度に速やかにＣＯＳ−１細胞から消失することが、結果から明らかになった。ＳＴＳタンパク質の合成は、ＳＴＳのＣ末端変異体からは影響を受けない。Ｃ末端２４アミノ酸残基を欠如したＭ１Ａ６は、ＣＯＳ−１細胞におけるＳＴＳ酵素活性レベルを減少させた（表１）。 To determine whether the C-terminal single base mutant STS (Q560P) and the C-terminal truncated STS (M1A6) have an effect on STS protein synthesis and degradation, pulse-chase experiments were performed. (FIG. 5). COS-1 cells were transfected with wild STS, M1A6 and Q560P expression plasmids, followed by metabolic labeling with [ ³⁵ S] methionine. The labeled protein levels of wild type STS, M1A6 and Q560P mutants decreased up to 24 hours after the pulse period. Pulse-chase experiment results for COS-1 cells transfected with the single base mutant Q560P and STS cleaved at the N-terminal region, and results of pulse-related experiments for COS-1 cells transfected with a wild STS expression vector The result of the chase experiment was compared. The results revealed that both the C-terminal 1 salt mutant and the truncated mutant protein disappeared from COS-1 cells as quickly as wild STS. STS protein synthesis is not affected by C-terminal mutants of STS. M1A6, which lacks the C-terminal 24 amino acid residue, reduced the level of STS enzyme activity in COS-1 cells (Table 1).

１μｇの野生のＳＴＳと１μｇのＭ１Ａ６を切断された発現ベクターの両方が導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生される酵素活性レベルは低下する。野生のＳＴＳ及びＭ１Ａ６が共導入されたＣＯＳ−１細胞における酵素活性は、野生のＳＴＳだけが導入されたＣＯＳ−１の場合の４３．６±５．７％であった。１μｇのＨ４４４ＲＳＴＳ変異体発現ベクターが導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された酵素活性は、野生のＳＴＳプラスミドが遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された場合の、１１±０．２５％に過ぎなかった。野生型のＳＴＳ及びＨ４４４Ｒが遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された酵素活性は、野生のＳＴＳ細胞だけを遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生された場合とほぼ等しかった。

The level of enzyme activity produced by COS-1 cells introduced with both 1 μg of wild STS and 1 μg of M1A6 cleaved expression vector is reduced. The enzyme activity in COS-1 cells co-introduced with wild STS and M1A6 was 43.6 ± 5.7% in the case of COS-1 into which only wild STS was introduced. Enzyme activity produced by COS-1 cells transfected with 1 μg of H444R STS variant expression vector is 11 ± 0.25% when produced by COS-1 cells transfected with a wild STS plasmid. It was only. The enzyme activity produced by COS-1 cells transfected with wild-type STS and H444R was almost equal to that produced by COS-1 cells transfected with only wild STS cells.

野生のＳＴＳの産生に対するＭ１Ａ６の用量依存性の効果について測定するために、０．０１μｇから３μｇのＭ１Ａ６を１μｇの野生のＳＴＳ発現ベクターでＣＯＳ−１細胞に共導入し、ＳＴＳ酵素活性における低下率を分析した（図６）。０．０１μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、及び０．５μｇのＭ１Ａ６と１μｇの野生のＳＴＳを共遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞によって産生されたＳＴＳ酵素活性のレベルは、それぞれ９１％、８７％、７１％、及び５０％低下した。切断されたＳＴＳタンパク質又は野生のタンパク質が細胞に存在する場合に、切断されたＳＴＳの効果には、野生のＳＴＳに対してドミナントネガティブ効果が見られた。ＳＴＳタンパク質レベルに対する切断されたＳＴＳの効果を調べるために、切断されたＳＴＳと野生のＳＴＳプラスミドとが遺伝子導入された細胞由来の抽出物のウェスタンブロット解析を行った（図７）。野生のＳＴＳと切断されたＳＴＳで遺伝子導入されたＣＯＳ−１細胞中の切断されたＳＴＳを含むＳＴＳのレベルは、切断されたＳＴＳタンパク質の量から影響を受けなかった。 To determine the dose-dependent effect of M1A6 on wild STS production, 0.01 μg to 3 μg of M1A6 was co-introduced with 1 μg of wild STS expression vector into COS-1 cells and the rate of decrease in STS enzyme activity Was analyzed (FIG. 6). The levels of STS enzyme activity produced by COS-1 cells co-transfected with 0.01 μg, 0.05 μg, 0.1 μg, and 0.5 μg M1A6 and 1 μg wild STS were 91% and 87%, respectively. %, 71%, and 50%. When cleaved STS protein or wild protein was present in the cells, the effect of cleaved STS showed a dominant negative effect on wild STS. To examine the effect of cleaved STS on STS protein levels, Western blot analysis of extracts from cells transfected with cleaved STS and wild STS plasmids was performed (FIG. 7). The level of STS including cleaved STS in COS-1 cells transfected with wild STS and cleaved STS was not affected by the amount of cleaved STS protein.

［図の説明］
図１、人工的な切断されたＳＴＳタンパク質。
切断されたＳＴＳ変異体タンパク質を図に示す。Ｎ−Ｘ又はＣ−Ｙは、野生のＳＴＳタンパク質のそれぞれＮ末端又はＣ末端からのアミノ酸残基が示す数を欠如する。Ｘ及びＹはペプチドの数を示す。Ｎ−２４は野生のＳＴＳからのシグナルペプチドをコードする、最初のＮ末端２４アミノ酸残基を欠如する。Ｎ−５２は、残基がアスパラギンコドン４７であるＮグリコシル化部位を含む、最初の５２Ｎ末端アミノ酸を欠如する。Ｃ−２４は、コドン５６０のグルタミンを含むＳＴＳタンパク質のＣ末端領域を欠如する。数字は、各画分のＮ又はＣ末端の境界を規定するアミノ酸を表す。野生のＳＴＳは５８３アミノ酸を有する。ＳＴＳｃＤＮＡ及び変異体ＳＴＳｃＤＮＡをｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１発現ベクターに挿入して、切断されたＳＴＳタンパク質を発現した。 [Figure Description]
Figure 1. Artificially cut STS protein.
The cleaved STS mutant protein is shown in the figure. N—X or C—Y lacks the number indicated by amino acid residues from the N-terminus or C-terminus, respectively, of the wild STS protein. X and Y indicate the number of peptides. N-24 lacks the first N-terminal 24 amino acid residues encoding a signal peptide from wild STS. N-52 lacks the first 52 N-terminal amino acid, including the N-glycosylation site whose residue is asparagine codon 47. C-24 lacks the C-terminal region of the STS protein containing glutamine at codon 560. The numbers represent the amino acids that define the N- or C-terminal boundary of each fraction. Wild STS has 583 amino acids. STS cDNA and mutant STS cDNA were inserted into the pSV-SPORT-1 expression vector to express the cleaved STS protein.

図２、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性。
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−１（偽）、ｐＳＴＳｃＤＮＡ、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ５、ｐＳＴＳ−Ｍ１Ａ６、ｐＳＴＳ−Ｍ２Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ３Ａ４、ｐＳＴＳ−Ｍ２Ａ６及びｐＳＴＳ−Ｍ３Ａ６をＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。ＳＴＳ溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１％、プロテイナーゼ阻害剤１ｘ）中の遺伝子導入された細胞抽出物におけるＳＴＳ活性を分析した。切断されたＳＴＳ酵素活性を、野生のＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するパーセントとして表した。 FIG. 2, STS enzyme activity of cleaved STS.
pSV-SPORT-1 (false), pSTS cDNA, pSTS-M1A4, pSTS-M1A5, pSTS-M1A6, pSTS-M2A4, pSTS-M3A4, pSTS-M2A6 and pSTS-M3A6 were introduced into COS-1 cells. STS activity was analyzed in gene-transfected cell extracts in STS lysis buffer (Tris-HCl 10 mM, Triton-X 1%, proteinase inhibitor 1x). Cleaved STS enzyme activity was expressed as a percentage of STS enzyme activity of wild STS.

図３、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現。
ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、切断されたＳＴＳ発現ベクターをＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。（Ａ）抗ヒトＳＴＳ血清を用いて、１０μｇの細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った。（Ｂ）共遺伝子導入処理の２４時間後に、ＲＮＡをＣＯＳ−１細胞から抽出した。野生のヒトＳＴＳＲＮＡプローブを用いて、全ＲＮＡ（３０μｇ）にノーザンブロット解析を行った。 FIG. 3. Expression of cleaved STS protein and STS gene.
Using FuGENE 6, the cleaved STS expression vector was introduced into COS-1 cells. (A) Western blot analysis was performed on 10 μg of cell extract using anti-human STS serum. (B) RNA was extracted from COS-1 cells 24 hours after the co-gene transfer treatment. Northern blot analysis was performed on total RNA (30 μg) using a wild human STS RNA probe.

図４、インビトロ翻訳システムにおける、切断されたＳＴＳタンパク質。
翻訳されたタンパク質をインビトロシステムで合成した。１０μｌのインビトロで翻訳された生成物に、抗ヒトＳＴＳ血清を用いてウエスタンブロット解析を行った。 Figure 4. Cleaved STS protein in an in vitro translation system.
The translated protein was synthesized in an in vitro system. Western blot analysis was performed on 10 μl of the in vitro translated product using anti-human STS serum.

図５、野生のＳｔＡＲ（ｐＳＴＳ）、変異体ＳＴＳ（ｐＱ５６０Ｐ）及び切断されたＳＴＳ（ｐＳＴＳＭ１Ａ６）発現プラスミドでの遺伝子導入に関するパルス−チェイス実験の結果。
ＦｕＧＥＮＥ６を用いて、ｐＳＴＳ、ｐＱ５６０Ｐ及びｐＳＴＳＭ１Ａ６（２μｇ／プレート）でＣＯＳ−１細胞を遺伝子導入した。遺伝子導入後、ＣＯＳ−１細胞を［³⁵Ｓ］メチオニンで３０分間パルスラベルし(pulse-labeled)、過剰量の冷たいメチオニンで追跡し、続いてタンパク質の抗ヒトＳＴＳ血清とＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて免疫沈降を行った。野生のＳＴＳ（Ａ）、突然変異体ＳＴＳ（Ｂ）、及び切断されたＳＴＳ（Ｃ）のオートラジオグラムを示す。各実験は、２つの別々な状況で行われた。 FIG. 5. Results of pulse-chase experiments for gene transfer with wild StAR (pSTS), mutant STS (pQ560P) and cleaved STS (pSTSM1A6) expression plasmids.
COS-1 cells were transfected with pSTS, pQ560P and pSTSM1A6 (2 μg / plate) using FuGENE 6. After gene transfer, COS-1 cells were pulse-labeled with [ ³⁵ S] methionine for 30 minutes, followed by an excess of cold methionine, followed by protein anti-human STS serum and SDS-PAGE. Immunoprecipitation was performed. Autoradiograms of wild STS (A), mutant STS (B), and truncated STS (C) are shown. Each experiment was performed in two separate situations.

図６、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果。
ｐＳＴＳ１μｇと切断されたＳＴＳ発現ベクターの増加量とでＣＯＳ−１細胞を共遺伝子導入した。示された値は、野生のＳＴＳ活性のパーセンテージとして表された、各処理グループが３つの同型培養を含む少なくとも３つの別個の実験からのＳＴＳ酵素活性の平均値±標準誤差である。 Figure 6. Dominant negative effect on STS enzyme activity of cleaved STS.
COS-1 cells were co-transfected with 1 μg of pSTS and an increased amount of the cleaved STS expression vector. Values shown are the mean ± standard error of STS enzyme activity from at least 3 separate experiments, where each treatment group contained 3 homotypic cultures, expressed as a percentage of wild STS activity.

図７、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果。
抗ＳＴＳ抗体を用いてＣＯＳ−１細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った。 Figure 7. Dominant negative effect on STS enzyme activity of cleaved STS.
Western blot analysis was performed on COS-1 cell extracts using anti-STS antibodies.

本発明の実施例において構築された、人工的に切断されたＳＴＳ変異体タンパク質の構造を示す図である。It is a figure which shows the structure of STS mutant protein cut | disconnected artificially constructed | assembled in the Example of this invention. 本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのそれぞれのＳＴＳ酵素活性について示す図である。In the Example of this invention, it is a figure shown about each STS enzyme activity of cut | disconnected STS. 本発明の実施例において、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現について、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of a Western blot analysis about the expression of the cut | disconnected STS protein and a STS gene. 本発明の実施例において、切断されたＳＴＳタンパク質及びＳＴＳ遺伝子の発現について、ノーザンブロット解析の結果を示す図である。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of a Northern blot analysis about the expression of the cut | disconnected STS protein and a STS gene. 本発明の実施例において、インビトロ翻訳システムにおける、切断されたＳＴＳタンパク質について、インビトロで翻訳された生成物に、抗ヒトＳＴＳ血清を用いてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of having performed the Western blot analysis using the anti-human STS serum to the product translated in vitro about the cut | disconnected STS protein in an in vitro translation system. 本発明の実施例において、野生のＳｔＡＲ（ｐＳＴＳ）、突然変異体ＳＴＳ（ｐＱ５６０Ｐ）及び切断されたＳＴＳ（ｐＳＴＳＭ１Ａ６）発現プラスミドでの遺伝子導入に関するパルス−チェイス実験の結果を示す図である。。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of the pulse-chase experiment regarding gene transfer in wild StAR (pSTS), mutant STS (pQ560P), and the cut | disconnected STS (pSTSM1A6) expression plasmid. . 本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果について、ｐＳＴＳと切断されたＳＴＳ発現ベクターの増加量とでＣＯＳ−１細胞を共遺伝子導入した結果を示す図である。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of co-introducing a COS-1 cell by pSTS and the increase amount of the cut | disconnected STS expression vector about the dominant negative effect with respect to the STS enzyme activity of the cut | disconnected STS. 本発明の実施例において、切断されたＳＴＳのＳＴＳ酵素活性に対するドミナントネガティブ効果について、抗ＳＴＳ抗体を用いてＣＯＳ−１細胞抽出物にウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of having performed the western blot analysis to the COS-1 cell extract about the dominant negative effect with respect to STS enzyme activity of the cut | disconnected STS using an anti- STS antibody.

Claims

ステロイドスルファターゼの変異体を用いることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 A method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity, comprising using a mutant of steroid sulfatase.

ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 1, wherein the steroid sulfatase mutant is a C-terminal deletion enzyme protein of steroid sulfatase.

ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｃ末端のアミノ酸の２４個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項２記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 2, wherein the C-terminal deletion enzyme of steroid sulfatase is an enzyme protein from which 24 C-terminal amino acids have been deleted.

ステロイドスルファターゼの変異体が、ステロイドスルファターゼのＮ末端欠失酵素タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 1, wherein the steroid sulfatase mutant is an N-terminal deletion enzyme protein of steroid sulfatase.

ステロイドスルファターゼのＣ末端欠失酵素が、Ｎ末端のアミノ酸の５２個を欠失させた酵素タンパク質であることを特徴とする請求項４記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 5. The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 4, wherein the C-terminal deletion enzyme of steroid sulfatase is an enzyme protein from which 52 amino acids at the N-terminus have been deleted.

請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体と野生型のステロイドスルファターゼとの複合体を用いることを特徴とする請求項１記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 6. The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to claim 1, wherein a complex of the mutant steroid sulfatase according to any one of claims 1 to 5 and a wild-type steroid sulfatase is used.

ステロイドスルファターゼ変異体の酵素活性の抑制が、ステロイドスルファターゼのドミナントネガティブ変異によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 The method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity according to any one of claims 1 to 6, wherein inhibition of the enzyme activity of the steroid sulfatase mutant is caused by a dominant negative mutation of steroid sulfatase.

請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子を導入し、発現することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 A method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity, which comprises introducing and expressing a gene encoding a mutant of the steroid sulfatase according to any one of claims 1 to 5.

請求項１〜５のいずれか記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を、共に導入することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制方法。 A method for inhibiting steroid sulfatase enzyme activity, which comprises introducing both a gene encoding a mutant of the steroid sulfatase according to any one of claims 1 to 5 and a gene encoding a wild-type steroid sulfatase.

請求項１〜６のいずれか記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体。 The steroid sulfatase variant which has the inhibitory action of the steroid sulfatase enzyme activity in any one of Claims 1-6.

請求項１０記載のステロイドスルファターゼ変異体からなるステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター。 The inhibitor of the steroid sulfatase enzyme activity which consists of a steroid sulfatase variant of Claim 10.

ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする請求項８記載の遺伝子。 The gene according to claim 8, which encodes a mutant of steroid sulfatase having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity.

請求項９記載のステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子とからなるステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子。 A gene encoding an enzyme protein having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity, comprising a gene encoding a mutant of the steroid sulfatase according to claim 9 and a gene encoding a wild-type steroid sulfatase.

請求項１２又は１３記載の遺伝子を組込んだ遺伝子発現用ベクター。 A gene expression vector incorporating the gene according to claim 12 or 13.

ステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼの変異体をコードする遺伝子と野生型のステロイドスルファターゼをコードする遺伝子を共に組込んだ、ステロイドスルファターゼ変異体及び野生型ステロイドスルファターゼ遺伝子発現用ベクター。 A vector for expressing a steroid sulfatase mutant and a wild type steroid sulfatase gene, which incorporates a gene encoding a mutant of a steroid sulfatase having an inhibitory action on steroid sulfatase enzyme activity and a gene encoding a wild type steroid sulfatase.

請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターからなることを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性のインヒビター。 An inhibitor of steroid sulfatase enzyme activity, comprising the gene according to claim 12 or claim 13 or the vector according to claim 14 or 15.

請求項１０記載のステロイドスルファターゼ酵素活性の抑制作用を有するステロイドスルファターゼ変異体、請求項１２或いは請求項１３記載の遺伝子、又は請求項１４或いは１５記載のベクターを含有することを特徴とするステロイドスルファターゼ酵素活性によって引き起こされる疾病の予防及び／又は治療剤。

A steroid sulfatase enzyme comprising the steroid sulfatase mutant having an inhibitory action on the steroid sulfatase enzyme activity according to claim 10, the gene according to claim 12 or claim 13, or the vector according to claim 14 or 15. A preventive and / or therapeutic agent for diseases caused by activity.