JP2005272357A - Anticancer agent - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an anticancer agent which excels in safety and has a new mechanism of action. <P>SOLUTION: A fermentation product obtained from a microorganism belonging to Pseudallescheria sp. inhibits the proliferation of an IGF-1 dependent cancer cell. Since the sensitivity pattern suggests a new mechanism of action, the compound is a new type of an anticancer agent, and particularly a compound useful as a therapeutic agent for an IGF-1 dependent cancer such as breast cancer, large bowel cancer, and brain tumor. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は乳癌等のヒト癌細胞の増殖抑制作用を有する新規化合物、及びこれを有効成分とする医薬組成物、殊に抗癌剤に関する。また、該化合物産生能を有する新規菌株、並びに該菌株を用いた該化合物の製造方法にも関する。   The present invention relates to a novel compound having an activity of inhibiting the growth of human cancer cells such as breast cancer, and a pharmaceutical composition comprising this as an active ingredient, in particular, an anticancer agent. The present invention also relates to a novel strain capable of producing the compound and a method for producing the compound using the strain.

癌の治療は、大きく分けて、外科的手術、抗癌剤による化学療法、放射線療法の３つがある。このうち、外科的手術は初期の癌には有効であるが、転移を伴う場合は効力が限られたものとなってしまうことが多い。また放射線は正常な組織への障害があり、放射線療法をすべての癌に適用することはできない。また多くの抗癌剤は、未だに副作用の問題があり、また初期治療で有効性を示した抗癌剤でも、耐性細胞の出現や再発によって治療に用いることができなくなる場合がある。よって、副作用の少ない、癌細胞選択的な細胞増殖抑制作用を有する新しい抗癌剤が切望されている。
増殖因子の１つであるIGF-1は、プロインスリンと相同性の高いポリペプチドであり、インスリンレセプターと構造的に極めて類似したレセプター型チロシンキナーゼである。その生理作用としては主に細胞増殖の促進とアポトーシスの抑制が報告されている。乳癌や肺癌をはじめとした多くのヒト癌細胞において、IGF-1の分泌促進やIGF-1レセプターの過剰発現が観察されている(Biochem Biophys Res Commun, 274, 845-851, 2000)。また、IGF-1レセプターの中和抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチドはin vivoにおいて高い抗腫瘍活性を示すことが報告されている(Nature, 363, 45-45, 1993)。一方、大腸癌ではIGF-1依存的に転移能が亢進することが知られている(Cancer Res, 46, 4613-4619, 1986)。また、癌細胞に特徴的な足場非依存的な増殖もIGF-1によって顕著に増強される(Nature, 363, 45-45, 1993)。このように、IGF-1が発癌に深く関与することを示唆する報告は数多くあり、IGF-1レセプターを介するシグナル伝達を阻害する物質は有用な抗癌剤となりうることが期待されている。
There are three main types of cancer treatment: surgery, chemotherapy with anticancer drugs, and radiation therapy. Of these, surgical operations are effective for early cancers, but often have limited efficacy when accompanied by metastasis. Radiation also has damage to normal tissues, and radiotherapy cannot be applied to all cancers. Many anticancer agents still have problems of side effects, and even anticancer agents that have shown effectiveness in initial treatment may not be usable for treatment due to the appearance or recurrence of resistant cells. Therefore, a new anticancer agent having a cancer cell-selective cell growth inhibitory action with few side effects is eagerly desired.
One growth factor, IGF-1, is a polypeptide with high homology to proinsulin and is a receptor tyrosine kinase that is structurally very similar to the insulin receptor. As its physiological action, mainly promotion of cell proliferation and suppression of apoptosis have been reported. Increased secretion of IGF-1 and overexpression of IGF-1 receptor have been observed in many human cancer cells including breast cancer and lung cancer (Biochem Biophys Res Commun, 274, 845-851, 2000). In addition, neutralizing antibodies and antisense oligonucleotides of IGF-1 receptor have been reported to exhibit high antitumor activity in vivo (Nature, 363, 45-45, 1993). On the other hand, it is known that metastatic ability increases in colorectal cancer in an IGF-1-dependent manner (Cancer Res, 46, 4613-4619, 1986). In addition, anchorage-independent growth characteristic of cancer cells is also markedly enhanced by IGF-1 (Nature, 363, 45-45, 1993). Thus, there are many reports that suggest that IGF-1 is deeply involved in carcinogenesis, and it is expected that substances that inhibit signal transduction through the IGF-1 receptor can be useful anticancer agents.

一方、レプトグラフィウム レンドベルギ（Leptographium lundbergii）株（NRRL12527)の培養物から得られた、下式で示される抗真菌活性を有する抗生物質（JM971-A、B及びC）が報告されている（特許文献１参照）。このうち、JM971-BはR1、R2がそれぞれH,メチルの化合物である。しかし、その立体構造については記載が無い。

（式中、R1及びR2は同一又は異なって、H又はメチル。） On the other hand, antibiotics (JM971-A, B and C) having antifungal activity represented by the following formula obtained from a culture of Leptographium lundbergii strain (NRRL12527) have been reported (patents) Reference 1). Among these, JM971-B is a compound in which R1 and R2 are H and methyl, respectively. However, there is no description about the three-dimensional structure.

(Wherein R1 and R2 are the same or different and are H or methyl.)

ドイツ公開特許第3333553号公報German Published Patent No. 3333553

今なお新規の抗癌剤の創製が期待されており、本発明が解決しようとする課題は、安全性に優れ、新しい作用機作を持つ抗癌剤を提供することである。   The creation of a novel anticancer agent is still expected, and the problem to be solved by the present invention is to provide an anticancer agent having excellent safety and a new mechanism of action.

かかる実情において、本発明者らは、癌細胞に対して選択的に作用する新しい抗癌剤の発見をめざし、IGF-1感受性のヒト乳癌細胞を用いて、IGF-1による細胞の増殖または生存を選択的に抑制する物質を鋭意探索した。その結果、シュードアレッシェリア属に属する微生物より得られた化合物が、IGF-1感受性の乳癌、大腸癌並びに脳腫瘍等の癌細胞の増殖を良好に抑制することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下式（Ｉ）で示される化合物（以下、化合物Ｉと略記する）またはその製薬学的に許容される塩、並びに該化合物を有効成分とする医薬組成物、並びに抗癌剤、殊にIGF-1依存性癌の治療剤に関する。

In this situation, the present inventors have selected the growth or survival of cells by IGF-1 using IGF-1 sensitive human breast cancer cells with the aim of finding new anticancer agents that act selectively on cancer cells. We have eagerly searched for substances to suppress. As a result, the present inventors have found that a compound obtained from a microorganism belonging to the genus Pseudorescherlia can satisfactorily suppress the growth of cancer cells such as IGF-1 sensitive breast cancer, colon cancer and brain tumor, and thus completed the present invention.
That is, the present invention relates to a compound represented by the following formula (I) (hereinafter abbreviated as Compound I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient, and an anticancer agent, In particular, it relates to a therapeutic agent for IGF-1-dependent cancer.

また、本発明は化合物Iを産生する新規微生物並びに該微生物を用いた化合物Ｉの製造方法にも関する。   The present invention also relates to a novel microorganism producing Compound I and a method for producing Compound I using the microorganism.

本発明化合物は、ヒト癌細胞のIGF-1依存的な増殖に対して、良好な抑制活性を有するので、各種の腫瘍、特にIGF-1依存性を有する乳癌、肺癌、大腸癌及び脳腫瘍等の癌の治療剤として有用である。   Since the compound of the present invention has a good inhibitory activity against IGF-1-dependent proliferation of human cancer cells, it can be used for various tumors, particularly breast cancer, lung cancer, colon cancer, brain tumor and the like having IGF-1-dependency. It is useful as a therapeutic agent for cancer.

以下、本発明につき詳述する。
本発明の化合物Iは、シュードアレッシェリア属に属する当該物質生産菌を栄養培地にて培養し、当該物質を蓄積させた培養物から常法により分離することによって容易に入手することができる。当該物質の製造方法において使用する微生物は、シュードアレッシェリア属に属し当該物質の生産能を有する微生物であればいずれも用いることができる。このような微生物としては、例えば、沖縄県石垣市で採集された土壌より分離されたシュードアレッシェリア属に属する糸状菌シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株を挙げることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The compound I of the present invention can be easily obtained by culturing the substance-producing bacterium belonging to the genus Pseudorescherlia in a nutrient medium and separating it from a culture in which the substance is accumulated by a conventional method. Any microorganism can be used as long as it belongs to the genus Pseudorescherlia and has the ability to produce the substance. Examples of such microorganisms include the fungus Pseudallescheria sp. QN23319 belonging to the genus Pseudallescheria sp., Isolated from soil collected in Ishigaki City, Okinawa Prefecture.

本菌株の菌学的性状は次の通りである。
１．各種培地における性状
ポテトデキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、ツァペック寒天培地で、24℃、2週間培養した場合、発育は速やかでコロニーの大きさは50 mm以上に達する。どの培地においても、コロニー表面は綿毛状で、初め白色、次第に灰褐色となる。裏面は淡黄色からやがて灰褐色となる。気生菌糸中または寒天中に淡褐色〜黒色の子のう殻と分生子を多数形成する。可溶性色素は生成しない。ポテトデキストロース寒天培地で培養した場合、生育温度範囲は15〜40℃であり、最適生育温度は、24〜32℃である。
２．顕微鏡下における特徴
ポテトデキストロース寒天培地に生育した菌株を顕微鏡下で観察した。菌糸は無色で隔壁を有し、表面は平滑で、培地上に有性世代と無性世代を形成する。有性世代では、子のう殻は、球形、直径 120〜200μmで、孔口はなく閉子のう殻となる。子のうは、球形から亜球形で、8個の子のう胞子を生じ、成熟時に消失する。子のう胞子は１細胞性、卵円形、褐色、平滑で、大きさは 7〜8×4〜5μmである。無性世代では、スケドスポリウム (Scedosporium) 様の分生子が認められ、単純な長短の分生子柄に１個または複数個のアネロ型分生子が形成される。分生子は１細胞性、卵円形または楕円形、褐色、平滑、大きさは5〜8×4〜6μmで、基部が裁断状である。 The bacteriological properties of this strain are as follows.
1. Properties in various media When cultivated on potato dextrose agar medium, malt extract agar medium, and Czapek agar medium at 24 ° C for 2 weeks, the growth is rapid and the colony size reaches 50 mm or more. In any medium, the surface of the colony is fluffy, initially white and gradually grayish brown. The back side turns from light yellow to grayish brown. Many light brown to black offspring husks and conidia are formed in aerial hyphae or agar. No soluble pigment is produced. When cultured on a potato dextrose agar medium, the growth temperature range is 15 to 40 ° C, and the optimum growth temperature is 24 to 32 ° C.
2. Features under the microscope Strains grown on potato dextrose agar were observed under the microscope. The mycelium is colorless and has partition walls, the surface is smooth, and forms sexual and asexual generations on the medium. In the sexual generation, the pupa has a spherical shape, a diameter of 120 to 200 μm, has no hole, and becomes a closed husk. The offspring is spherical to subspherical, giving rise to 8 offspring spores that disappear at maturity. The ascospore is unicellular, oval, brown, smooth, and has a size of 7-8 × 4-5 μm. In the asexual generation, conidia like Scedosporium is recognized, and one or more anero-type conidia are formed in simple long and short conidia. The conidia are unicellular, oval or oval, brown, smooth, 5-8 × 4-6 μm in size, and the base is cut.

以上の菌学的性状より、本菌株は子のう菌類に属し、子のう胞子などの形態的特徴から不整子のう菌綱のミクロアスカス (Microascus) 科に属すると考えられる。そこで、各種文献 (von Arx, J. A. 1973. The Genera Petriellidium and Pithoascus (Microascaceae). Persoonia 7: 365-375など) より検索したところ、本菌株は子のうや無性世代などの特徴からシュードアレッシェリア属 (Pseudallescheria) の一菌種と判断された。したがって、本菌株をシュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria) QN23319と呼称することにした。なお、本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19742号として寄託されている。   Based on the above bacteriological properties, this strain belongs to the Ascomycota fungus and is considered to belong to the Microascus family of the arachnoid fungus class due to its morphological characteristics such as Ascospore. Therefore, when searching from various literatures (von Arx, JA 1973. The Genera Petriellidium and Pithoascus (Microascaceae). Persoonia 7: 365-375, etc.) It was judged as one species of the genus (Pseudallescheria). Therefore, this strain was designated as Pseudallescheria QN23319. This strain is deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as a deposit number FERM P-19742.

培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。
培養に用いられる培地としては、シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria) QN23319株等の、本発明化合物生産能を有するシュードアレッシェリア属の微生物が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地に添加する栄養物として公知のものを使用できる。培地の組成は、例えば炭素源としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、マルトース、トレハロース、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が挙げられる。窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。 Culturing is performed according to the culture method of general microorganisms.
The medium used for the culture may be any medium containing a nutrient source used by a microorganism of the genus Pseudallescheria having the ability to produce the compound of the present invention, such as Pseudallescheria QN23319, a synthetic medium, Semi-synthetic media or natural media are used. Known nutrients to be added to the medium can be used. Examples of the composition of the medium include carbon sources such as D-glucose, D-fructose, inositol, D-mannitol, D-mannose, maltose, trehalose, starch, glucose, dextrin, glycerin, vegetable oil and the like. Nitrogen sources include meat extract, peptone, gluten meal, cottonseed meal, soybean meal, peanut meal, fish meal, corn steep liquor, dry yeast, yeast extract, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, uric acid and other organic and inorganic nitrogen sources Is used. As metal salts, sulfates such as sodium, potassium, magnesium, calcium, zinc, iron and cobalt, nitrates, carbonates, phosphates and the like are added as necessary. Furthermore, if necessary, a production promoting substance or an antifoaming agent such as methionine, cysteine, cystine, thiosulfate, methyl oleate, lard oil, silicone oil, and surfactant can be added.

培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は１５〜４０℃の範囲、好ましくは２４〜３２℃付近で行われる。培地のｐＨは約５〜９、好ましくは約６〜８の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常１〜１０日程度、好ましくは４〜８日程度である。   As a culture condition, it is generally advantageous to perform the culture under an aerobic condition, and the culture temperature is in the range of 15 to 40 ° C, preferably around 24 to 32 ° C. Good results are obtained when the pH of the medium is adjusted to a range of about 5-9, preferably about 6-8. The culture period is appropriately set according to the composition of the medium and the temperature conditions, but is usually about 1 to 10 days, preferably about 4 to 8 days.

培養物より目的とする本発明物質を単離するには、微生物が産生する代謝産物に用いる通常の抽出、精製の手段が適宣利用できる。例えば培養物質中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養液に酢酸エチル等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養液を適宜の坦体に接触させ、濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を抽出することができる。例えば、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＣＨＰ−２０、又はダイヤイオンＳＰ−９００のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させる。次いでメタノール、エタノール、アセトン、ブタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を段階的に又は連続的に変化させることが有利である。酢酸エチル、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する場合には、培養濾液にこれらの溶媒を加え、良く振とうし、該物質を抽出する。次に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分は、シリカゲル、ＯＤＳ等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、ＯＤＳを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の定法により、さらに純粋に分離精製することができる。すなわち、活性を指標として、適当な溶剤に対する溶解性及び溶解度の差等を利用する一般の生理活性物質の製造に用いられる手段によって、分離、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、又は任意の順序に組合せ、反復して適用できる。   In order to isolate the target substance of the present invention from the culture, conventional extraction and purification means used for metabolites produced by microorganisms can be used appropriately. For example, the substance in the culture substance can be extracted by adding the organic medium that is not miscible with water, such as ethyl acetate, to the culture liquid obtained by filtering the culture liquid as it is or by adding a filter aid to the culture or filtering. To do. Further, the substance can be extracted by bringing the culture solution into contact with an appropriate carrier, adsorbing the produced substance in the filtrate, and then eluting with a suitable solvent. For example, the substance is adsorbed by contacting with a porous adsorption resin such as Amberlite XAD-2, Diaion HP-20, Diaion CHP-20, or Diaion SP-900. Next, the substance is eluted using a mixed solution of water such as methanol, ethanol, acetone, butanol, acetonitrile, and water. In this case, it is advantageous to change the mixing ratio of the organic solvent stepwise or continuously. When extracting with an organic solvent such as ethyl acetate or chloroform, these solvents are added to the culture filtrate and shaken well to extract the substance. Next, the substance-containing fraction obtained by using each of the above operating methods is obtained by column chromatography using silica gel, ODS, etc., centrifugal liquid-liquid partition chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) using ODS, etc. According to the conventional method, separation and purification can be performed more purely. That is, it is separated and purified by means used for the production of general physiologically active substances using the activity as an index and utilizing the difference in solubility and solubility in an appropriate solvent. These methods can be used alone as necessary, or can be combined and repeated in any order.

本発明化合物Ｉの製薬学的に許容される塩としては、酸若しくは塩基との製薬学的に許容される塩である。塩基との塩としては、好ましくは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなど無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミンなどの有機塩基、又は、リジン、オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。酸との塩としては、好ましくは、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸もしくはリン酸等との無機酸、又はギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸等との酸付加塩が挙げられる。これらの塩は常法の造塩反応を用いて化合物Ｉから入手できる。更に本発明は、化合物Ｉ又はその塩の各種の水和物や溶媒和物及び結晶多形の物質をも包含する。   The pharmaceutically acceptable salt of the compound I of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt with an acid or a base. Preferred salts with bases include inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium and aluminum, organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine, or salts with basic amino acids such as lysine and ornithine. be able to. The salt with an acid is preferably an inorganic acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid or phosphoric acid, or formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid. And acid addition salts with fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, methanesulfonic acid or ethanesulfonic acid. These salts can be obtained from Compound I using conventional salt-forming reactions. Further, the present invention also includes various hydrates and solvates of compound I or a salt thereof and a polymorphic substance.

化合物Ｉを有効成分として含有する医薬組成物は，当分野において通常用いられている薬剤用担体，賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤，吸入剤等による経口投与，又は，静注，筋注等の注射剤，坐剤，点眼剤，眼軟膏，経皮用液剤，軟膏剤，経皮用貼付剤，経粘膜液剤，経粘膜貼付剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。   A pharmaceutical composition containing Compound I as an active ingredient can be prepared by a commonly used method using a pharmaceutical carrier, excipient and the like which are usually used in the art. Oral administration with tablets, pills, capsules, granules, powders, solutions, inhalants, etc., or injections such as intravenous and intramuscular injections, suppositories, eye drops, ophthalmic ointments, transdermal solutions, Any form of parenteral administration such as an ointment, a transdermal patch, a transmucosal liquid, a transmucosal patch and the like may be used.

本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つ又はそれ以上の活性物質が，少なくとも一つの不活性な賦形剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は，常法に従って，不活性な添加剤，例えば滑沢剤や崩壊剤，溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。   As the solid composition for oral administration according to the present invention, tablets, powders, granules and the like are used. In such solid compositions, one or more active substances are present in at least one inert excipient such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, metasilicate. Mixed with magnesium aluminate acid. The composition may contain an inert additive such as a lubricant, a disintegrant, and a solubilizing agent according to a conventional method. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating or a gastric or enteric coating agent.

経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳剤，液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な溶剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤，懸濁化剤のような補助剤，甘味剤，矯味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の液剤，懸濁剤，乳剤を含有する。水性の溶剤としては，例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は，さらに等張化剤、防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤，溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。 Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and commonly used inert solvents such as purified water, ethanol . In addition to the inert solvent, the composition may contain adjuvants such as solubilizers, wetting agents, and suspending agents, sweeteners, corrigents, fragrances, and preservatives.
Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of the aqueous solvent include distilled water for injection and physiological saline. Examples of the non-aqueous solvent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (trade name), and the like. Such compositions may further contain isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, and solubilizing agents. These are sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of bactericides, or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving or suspending it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.

通常、経口投与の場合、化合物Ｉの１日の投与量は約0.001から100mg/kg、好ましくは0.01〜50mg/kgが適当である。静脈内注射の場合、1日の投与量は約0.0001から50mg/kg、好ましくは、約0.001から20mg/kgが、それぞれ適当であり、これを1日1回乃至複数回に分けて投与することが好ましい。投与頻度、投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
本発明の医薬組成物は、通常癌治療に用いられる医薬品類と併用することもできる。このような医薬品としては、アドリアマイシン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、タキソール等の抗癌剤、モルヒネ等の痛み止め成分、ステロイド剤等が挙げられる。またこれらの医薬品類との併用にあたっては、合剤として同一製剤として投与してもよく、あるいは、同一若しくは異なる投与経路で投与される別の製剤として、同時に若しくは別々に投与されてもよい。投与量、投与方法は、個々の医薬品類に応じて適宜選択される。 Usually, in the case of oral administration, the daily dose of Compound I is about 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.01 to 50 mg / kg. In the case of intravenous injection, the daily dose is about 0.0001 to 50 mg / kg, preferably about 0.001 to 20 mg / kg, which should be administered once to several times a day. Is preferred. The administration frequency and dosage are appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex and the like.
The pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with pharmaceuticals usually used for cancer treatment. Examples of such pharmaceuticals include anticancer agents such as adriamycin, mitomycin, 5-fluorouracil, irinotecan and taxol, pain relieving components such as morphine, steroids and the like. In combination with these pharmaceuticals, they may be administered as the same preparation as a mixture, or may be administered simultaneously or separately as separate preparations administered by the same or different administration routes. The dosage and administration method are appropriately selected according to the individual pharmaceutical products.

以下、実施例にて具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
グルコース3%、コーンスティープリカー1%、乾燥酵母0.5%、ファーマメディア0.5%、大豆粉0.5%、炭酸カルシウム0.2%よりなる培地（滅菌前pH6.5）を100mlずつ500ml容の三角フラスコに分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地にポテトデキストロース寒天培地に良く生育させたシュードアレッシェリア エスピー QN23319株をかき取って接種し、24℃、200回転／分の条件で6日間振とう培養し、種培養液とした。次にデキストリン4%、グルコース1%、麦芽エキス0.5%、ポリペプトン0.5%、大豆粉0.5%、酵母エキス0.2%、リン酸水素ニカリウム1%よりなる培地（滅菌前pH6.5）を20本の500ml容の三角フラスコに100mlずつ分注し、121℃で20分間滅菌した。この培地に前記種培養液を2mlずつ接種し、24℃、200回転／分の条件で6日間、振盪培養した。
培養液(2L)を遠心分離して得た菌体にアセトン1Lを加えて活性物質を抽出した。アセトンを濃縮除去し、等量の酢酸エチルを加えて2回抽出した。有機溶媒層を濃縮した後、クロロホルム?メタノール（5 : 1）にてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、粗精製物を得た。さらに、センシュー科学製PEGASIL-ODSカラム（粒径7μ、内径2 cmラ25 cm）を用いて、0.1% トリフルオロ酢酸を含む65%メタノールにて高速液体クロマトグラフィーを行い、無色粉末の化合物Ｉ（13.5 mg）を得た。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1
Dispense 100 ml each of 500 ml Erlenmeyer flask into a medium consisting of 3% glucose, 1% corn steep liquor, 0.5% dry yeast, 0.5% pharmame media, 0.5% soy flour, and 0.2% calcium carbonate. And sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. The medium was scraped and inoculated with Pseudorescherlia sp. Strain QN23319 well grown on potato dextrose agar medium, and cultured with shaking at 24 ° C. and 200 rpm for 6 days to obtain a seed culture solution. Next, 500 ml of 20 medium containing 4% dextrin, 1% glucose, 0.5% malt extract, 0.5% polypeptone, 0.5% soy flour, 0.2% yeast extract and 1% dipotassium hydrogen phosphate (pH 6.5 before sterilization) 100 ml each was dispensed into a small Erlenmeyer flask and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes. 2 ml of the seed culture solution was inoculated into this medium, and cultured with shaking at 24 ° C. and 200 rpm for 6 days.
To the cells obtained by centrifuging the culture solution (2 L), 1 L of acetone was added to extract the active substance. Acetone was concentrated and removed, and an equal amount of ethyl acetate was added and extracted twice. After the organic solvent layer was concentrated, silica gel column chromatography was performed with chloroform / methanol (5: 1) to obtain a crude product. Furthermore, high performance liquid chromatography was performed using 65% methanol containing 0.1% trifluoroacetic acid using a PEGASIL-ODS column (particle diameter 7μ, inner diameter 2 cm, 25 cm) manufactured by Senshu Kagaku. 13.5 mg) was obtained.

化合物Ｉは下記の物理化学的性状を示した。
色及び形状 ： 無色粉末
融点 ： 123〜127℃
旋光度 [α]_D ²⁴ ： -21° (c 0.35, メタノール)
分子式 ： C₂₁H₃₅NO₂
高分解能FABマススペクトル：
Found： 334.2740 (M+H) ⁺
Calcd： 334.2746
紫外吸収スペクトル ・_max nm(・) ：
MeOH 225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M HCl-MeOH 225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M NaOH-MeOH 227 (4,300), 240 (3,600), 286 (1,100)
赤外吸収スペクトル ν_max(KBr) cm^-1： 3200, 1680, 1210, 1140
¹H-NMRスペクトル（500Hz、重アセトン中）： 図1の通り
¹³C-NMRスペクトル（125Hz、重アセトン中）： 図2の通り
以上の結果より、化合物Iは以下の構造を有する化合物であると決定した。

Compound I exhibited the following physicochemical properties.
Color and shape: colorless powder Melting point: 123-127 ° C
Optical rotation [α] _D ²⁴ : -21 ° (c 0.35, methanol)
Molecular formula: C ₂₁ H ₃₅ NO ₂
High resolution FAB mass spectrum:
Found: 334.2740 (M + H) ⁺
Calcd: 334.2746
UV absorption spectrum ・_max nm (・) ：
MeOH 225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M HCl-MeOH 225 (5,500), 278 (1,100)
0.01 M NaOH-MeOH 227 (4,300), 240 (3,600), 286 (1,100)
Infrared absorption spectrum ν _max (KBr) cm ^-1 : 3200, 1680, 1210, 1140
¹ H-NMR spectrum (500 Hz in heavy acetone): As shown in Fig. 1.
¹³ C-NMR spectrum (125 Hz, in heavy acetone): As shown in FIG. 2 From the above results, Compound I was determined to be a compound having the following structure.

実施例２
化合物Ｉのヒト乳癌細胞（MCF-7、T47D、MDA-MB-231、HBC-4）、ヒト子宮頸癌細胞（HeLa）、ヒト骨肉腫細胞（Saos-2）、ヒト結腸癌細胞（Colo320DM）に対する増殖抑制効果を以下の方法にて測定した。
なお、MCF-7細胞、HBC-4細胞、HeLa細胞及びSaos-2細胞は10％牛胎児血清(FBS)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中、37℃、5%CO₂存在下で、又、MDA-MB-231細胞及びColo320DM細胞は10％FBSを含むRPMI1640培地中、37℃、5%CO₂存在下で培養した。
(1) 5×10⁴cells/mlの細胞を100μlずつ96穴マイクロプレートに播種した。MCF-7細胞には30 ng/mlのIGF-1含有無血清培地を、他の細胞には50 ng/mlのIGF-1含有無血清培地を用い、コントロールとして0.5% FBS含有培地を用いた。
(2) 細胞接着後、希釈試料を添加し、72時間培養した。
(3) 10μlの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド(MTT, 5 mg/ml)を各ウェルに添加し、さらに2時間培養した。培地を除去し、生成したホルマザンを溶解するためジメチルスルホキシド(DMSO)を100μl加えた。
(4) ORGANON TEKUNIKA製96穴マイクロプレートリーダー（OTリーダー510）にて、検査波長450 nm、対数波長630 nmで比色定量し、吸光度を求めた。相対細胞数は、試料無添加の吸光度を100%として計算した。
(5) それぞれの細胞に対するIC₅₀値は、相対細胞数を片対数グラフ上にプロットし、近似曲線を作成することにより算出した。 Example 2
Compound I human breast cancer cells (MCF-7, T47D, MDA-MB-231, HBC-4), human cervical cancer cells (HeLa), human osteosarcoma cells (Saos-2), human colon cancer cells (Colo320DM) The growth-inhibitory effect on was measured by the following method.
MCF-7 cells, HBC-4 cells, HeLa cells and Saos-2 cells are in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C in the presence of 5% CO ₂ . In addition, MDA-MB-231 cells and Colo320DM cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ .
(1) 100 μl of 5 × 10 ⁴ cells / ml cells were seeded in a 96-well microplate. For MCF-7 cells, serum-free medium containing 30 ng / ml of IGF-1 was used, and for other cells, serum-free medium containing 50 ng / ml of IGF-1 was used, and medium containing 0.5% FBS was used as a control. .
(2) After cell attachment, a diluted sample was added and cultured for 72 hours.
(3) 10 μl of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, 5 mg / ml) was added to each well and further cultured for 2 hours. The medium was removed and 100 μl of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to dissolve the produced formazan.
(4) The absorbance was determined by colorimetric determination at an inspection wavelength of 450 nm and a logarithmic wavelength of 630 nm using an ORGANON TEKUNIKA 96-well microplate reader (OT reader 510). The relative cell number was calculated with the absorbance with no sample added as 100%.
(5) The IC ₅₀ value for each cell was calculated by plotting the relative cell number on a semilogarithmic graph and creating an approximate curve.

結果： 化合物Ｉの各細胞に対するIC₅₀値(ng/ml)を表１に示す。化合物IはMCF-7細胞およびT47D細胞に対して低濃度でIGF-1依存的な増殖を抑制した。これに対して0.5%FBS存在下では全ての細胞において増殖抑制効果は認められず、高濃度で非特異的な細胞毒性が観察された。

実施例３
実施例２で用いたMCF-7細胞に対する化合物Iの増殖抑制作用を実施例２と同様にMTT法によって調べた。その結果を図３に示す。化合物Iは30 ng/mlのIGF-1存在下で濃度依存的にMCF-7細胞の増殖を抑制し、そのIC₅₀値は9.7 ng/mlであった。一方、化合物Iは無血清培地中でも増殖抑制活性を示したが、0.5%のFBSを含む培地中では増殖阻害はほとんど認められなかった（図３参照）。
以上の結果より、本発明化合物はIGF-1依存性の細胞の増殖または生存を選択的に抑制することが確認され、癌細胞に対して選択的に作用する新しいタイプの抗癌剤になり得ることが示唆された。
実施例４
財団法人癌研究会癌化学療法センターに依頼し、ヒト培養癌細胞パネル（ＨＣＣパネル）によるスクリーニングを実施した。ＨＣＣパネルは、肺癌、胃癌、大腸癌、卵巣癌、脳腫瘍、乳癌、腎癌、前立腺癌、及びメラノーマの系からなる。これらを一つのパネルとして扱い、in vitro薬剤感受性試験を行い、その薬剤に対する感受性パターン(Finger Print)を得、既存の抗癌剤との作用様式を比較できる。
スクリーニングは、癌細胞を９６ウェルプレートにまき込み、翌日検体溶液を添加、２日間培養後、細胞増殖をスルホローダミンＢによる比色定量で測定した。測定結果はコンピューターに入力し、GI50（コントロールに比べ増殖を50％に抑制する濃度(M)）を求めた
結果：下表に記載の癌種において増殖阻害活性が認められた。また、そのFinger Printから、新規作用機作をもつことが示唆された。

Results: Table 1 shows the IC ₅₀ values (ng / ml) of each compound I cell. Compound I suppressed IGF-1-dependent proliferation at low concentrations on MCF-7 and T47D cells. In contrast, in the presence of 0.5% FBS, no growth inhibitory effect was observed in all cells, and nonspecific cytotoxicity was observed at high concentrations.

Example 3
The growth inhibitory action of Compound I on MCF-7 cells used in Example 2 was examined by the MTT method as in Example 2. The result is shown in FIG. Compound I inhibited the growth of MCF-7 cells in a concentration-dependent manner in the presence of 30 ng / ml of IGF-1, and its IC ₅₀ value was 9.7 ng / ml. On the other hand, Compound I showed growth inhibitory activity even in a serum-free medium, but almost no growth inhibition was observed in a medium containing 0.5% FBS (see FIG. 3).
From the above results, it was confirmed that the compound of the present invention selectively suppresses the proliferation or survival of IGF-1-dependent cells, and can be a new type of anticancer agent that selectively acts on cancer cells. It was suggested.
Example 4
A request was made from the Cancer Chemotherapy Center of the Foundation for Cancer Research, and screening was performed using a human cultured cancer cell panel (HCC panel). The HCC panel consists of the following systems: lung cancer, stomach cancer, colon cancer, ovarian cancer, brain tumor, breast cancer, kidney cancer, prostate cancer, and melanoma. Treat these as a single panel, conduct in vitro drug sensitivity tests, obtain a sensitivity pattern (Finger Print) for the drug, and compare the mode of action with existing anticancer drugs.
In the screening, cancer cells were placed in a 96-well plate, the sample solution was added the next day, and after 2 days of culture, cell proliferation was measured by colorimetric determination with sulforhodamine B. The measurement results were input into a computer, and GI50 (concentration (M) that suppresses the growth to 50% compared to the control) was determined. The Finger Print also suggested a new mechanism of action.

化合物Ｉの¹H-NMRスペクトルを示す図である。 ¹ is a diagram showing a ¹ H-NMR spectrum of Compound I. FIG. 化合物Ｉの¹³C-NMRスペクトルを示す図である。1 is a diagram showing a ¹³ C-NMR spectrum of Compound I. FIG. IGF-1含有培地、無血清培地、若しくはFBS含有培地中でのMCF-7細胞に対する化合物Iの増殖抑制作用を示す図であるIt is a figure which shows the growth inhibitory effect of the compound I with respect to MCF-7 cell in an IGF-1 containing medium, a serum-free medium, or a FBS containing medium.

Claims (7)

下式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。

A compound represented by the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

請求項１に記載される化合物またはその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the compound according to claim 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 抗癌剤である請求項２記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 2, which is an anticancer agent. IGF-1依存性癌の治療剤である請求項３記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 3, which is a therapeutic agent for IGF-1-dependent cancer. シュードアレッシェリア属に属し、請求項１記載の化合物の産生能を有する微生物を培養し、得られた培養物から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項１記載の化合物の製造方法。 The compound according to claim 1, wherein the compound according to claim 1 belongs to the genus Pseudorescherlia and has the ability to produce the compound according to claim 1, and the compound according to claim 1 is collected from the obtained culture. Manufacturing method. シュードアレッシェリア属に属する微生物がシュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株（FERM P-19742号）及びその変異体である請求項５記載の製造方法。 6. The method according to claim 5, wherein the microorganism belonging to the genus Pseudorescheria is Pseudallescheria sp. QN23319 strain (FERM P-19742) and variants thereof. シュードアレッシェリア エスピー (Pseudallescheria sp.) QN23319株（FERM FERM P-19742号号）及び請求項１記載の化合物の産生能を有するその変異体。 A Pseudallescheria sp. QN23319 strain (FERM FERM P-19742) and a variant thereof capable of producing the compound according to claim 1.

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