JP2005270093A - Gene participating in estimating postoperative prognosis of breast cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子に関する。さらに、この遺伝子を使った乳癌の術後予後の検査方法、乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のスクリーニング方法、及び乳癌の術後予後の診断キットに関する。 The present invention relates to genes involved in postoperative prognosis prediction of breast cancer. Furthermore, the present invention relates to a method for examining postoperative prognosis of breast cancer using this gene, a screening method for cancer therapeutic agents that control postoperative prognosis of breast cancer, and a diagnostic kit for postoperative prognosis of breast cancer.
乳癌は女性の癌死亡率の上位原因に位置する疾患であるが、いまだに生物学的見地からの悪性度、生存予後を規定する有力な因子は見出されていない。 Breast cancer is a disease that is one of the top causes of cancer mortality in women, but there are still no influential factors that define the malignancy and survival prognosis from a biological standpoint.
エストロゲンレセプター（ＥＲ）の状態はヒト乳癌についての、臨床及び生物学的な症状の1つの決定要素である。 アジュバントホルモン治療は、年齢、閉経期の状態、 腋窩リンパ節（axillary node）の関与、あるいは腫瘍径にかかわらずＥＲ陽性の乳癌患者において通常有効である；しかしながら、ＥＲ陰性乳癌は、この治療方法に対して抵抗性がある（非特許文献１−２）。ＥＲ陰性腫瘍を持っている患者が、化学療法に対して同じ応答をいつも示すものではない。そして、現存する指標では、臨床の症状によりこのタイプの乳癌を分別することができないことから、手術後の予後は、多様であると言える（非特許文献３−４）。 Estrogen receptor (ER) status is one determinant of clinical and biological symptoms for human breast cancer. Adjuvant hormone therapy is usually effective in patients with ER-positive breast cancer regardless of age, menopausal status, axillary node involvement, or tumor size; On the other hand, there is resistance (Non-Patent Document 1-2). Patients with ER negative tumors do not always show the same response to chemotherapy. And with existing indices, this type of breast cancer cannot be classified according to clinical symptoms, so it can be said that the prognosis after surgery is diverse (Non-patent Documents 3-4).
また、リンパ節転移の無い乳癌患者（node陰性乳癌；n0）の予後は、転移乳癌患者におけるよりは良い。しかし、日本において、本発明者らは、node陰性乳癌患者の16％が最初の手術後5年以内に再発することを見出している（非特許文献５）。 Also, the prognosis of breast cancer patients without node metastasis (node-negative breast cancer; n0) is better than that of patients with metastatic breast cancer. However, in Japan, the present inventors have found that 16% of node-negative breast cancer patients relapse within 5 years after the first operation (Non-patent Document 5).
乳癌患者の術後予後予測は、現在利用できるアジュバント（adjuvant）治療の観点から重要性が増している。術後に再発しそうな患者を同定することに役立つ遺伝子マーカーは、ハイリスクな患者に適当な術前アジュバント療法を行い得る利益をもたらし、不要かつ煩雑で不快な副作用をもたらすことが阻止可能となる。 Postoperative prognosis prediction for breast cancer patients is becoming increasingly important from the standpoint of currently available adjuvant treatment. Genetic markers that help identify patients who are likely to relapse after surgery provide the benefit of appropriate preoperative adjuvant therapy for high-risk patients and prevent unwanted, cumbersome and unpleasant side effects .
従来、個々の患者のための術後の処置決定は腫瘍径及びステージ、リンパ節への転移、臨床病理学的因子による診断、及びホルモンレセプターの検索などにより行われてきたが、決定的な方法ではなかった（非特許文献６−１１）。 Conventionally, postoperative treatment decisions for individual patients have been made by tumor diameter and stage, metastasis to lymph nodes, diagnosis by clinicopathological factors, and search for hormone receptors, but the decisive method (Non-Patent Document 6-11).
近年、術後の乳癌患者の予後マーカーとして遺伝子の変異の重要性を決定しようとしたものがある。これらの遺伝子の変異にはp53の変異（非特許文献１２）、いくつかの対立遺伝子でのヘテロ接合性の欠失（非特許文献１３）、BRCA2遺伝子（非特許文献１４）、WT1遺伝子（非特許文献１５）、HER2/neu遺伝子（非特許文献１６）、及びKi-67遺伝子（非特許文献１７）の異常な発現を含む。しかしながら、癌が多遺伝子の異常の集積による疾患であることを考えると、有効な予後予測手段とは言いがたい。 In recent years, there have been attempts to determine the importance of gene mutations as prognostic markers for postoperative breast cancer patients. These gene mutations include p53 mutations (Non-patent document 12), heterozygous deletions at several alleles (Non-patent document 13), BRCA2 gene (Non-patent document 14), WT1 gene (non-patent document 12). Patent Document 15), HER2 / neu gene (Non-Patent Document 16), and Ki-67 gene (Non-Patent Document 17) abnormal expression. However, considering that cancer is a disease caused by accumulation of abnormalities in multiple genes, it is difficult to say that it is an effective prognostic predictor.
さらに、近年各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされ塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションに代表されるような、各種の核酸−核酸間ハイブリダイゼーション反応や各種のＰＣＲ反応を利用した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限があるが、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、及び方法論が開発されてきた。 Furthermore, genome projects in various organisms have been promoted in recent years, and many genes and their base sequences including human genes are being clarified rapidly. The function of a gene whose sequence has been clarified can be examined by various methods. As one of the promising methods, gene expression analysis using known nucleotide sequence information is known. For example, methods using various nucleic acid-nucleic acid hybridization reactions and various PCR reactions, as represented by Northern hybridization, have been developed, and the relationship between various genes and their expression of biological functions is examined by this method. Can do. Although these methods limit the number of genes that can be applied, a large number are required to perform a comprehensive and systematic analysis of a very large number of genes at the individual level as revealed through today's genome project. A new analysis method called a DNA microarray method (DNA chip method) and a methodology have been developed that enable collective expression analysis of genes.
ＤＮＡマイクロアレイとしては、リソグラフィー技術を応用して区画化された多数のセル上にＤＮＡ合成を行ったもの（特許文献１）、基盤上に溝又は穴で区画を形成し、該区画の内壁にプローブを固定化したもの（特許文献２−３）、チップ上に固定するプローブ量を多くするために、アクリルアミド等のゲルにプローブを固定したマイクロアレイ（特許文献４−５）等、多数の形状物が知られている。 As a DNA microarray, DNA synthesis is performed on a large number of compartmentalized cells by applying a lithography technique (Patent Document 1), a compartment is formed on a base with grooves or holes, and a probe is formed on the inner wall of the compartment In order to increase the amount of probe immobilized on the chip (Patent Document 2-3), a microarray (Patent Document 4-5) in which the probe is immobilized on a gel such as acrylamide is used. Are known.
本発明者らの一部は、先に新規なマイクロアレイ及びその製造法を開発した（特許文献６−７）。該発明は、核酸固定化ゲルを保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作製し、この配列体を配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより薄片をえるものである。この薄片は固定化核酸二次元高密度配列体、すなわちＤＮＡマイクロアレイとして使用される。 Some of the present inventors have previously developed a novel microarray and a method for producing the same (Patent Documents 6-7). In the present invention, a nucleic acid-immobilized gel-holding fiber array that holds a nucleic acid-immobilized gel is prepared, and the array is cut in a direction that intersects the fiber axis of the array to obtain a flake. This slice is used as an immobilized nucleic acid two-dimensional high-density array, that is, a DNA microarray.
最近の研究により、癌診断のための新規な遺伝子マーカーの同定にｃＤＮＡマイクロアレイ技術が有効であることがわかった。現在までに、数人の研究者が乳癌のマイクロアレイ分析を行っているが、乳癌の術後予後予測の可能な乳癌遺伝子発現特性のデータを記述したものはない（非特許文献１８−２４）。一つの例外として、リンパ節の転移陰性腫瘍の特定のプロフィールが、遠隔転移への進行前の短い間隔を予測することを示す。（非特許文献２５）。
本発明の目的は、乳癌における遺伝子発現をゲノムワイドにかつ網羅的に解析した結果に基づき、乳癌患者の術後予後を遺伝子発現の観点から予測する画期的な手段を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a revolutionary means for predicting the postoperative prognosis of breast cancer patients from the viewpoint of gene expression based on the results of genome-wide and exhaustive analysis of gene expression in breast cancer. To do.
本発明は、ヒト遺伝子の遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイにより網羅的に解析し、様々な状態にある乳癌の遺伝子発現機能を比較することにより、乳癌術後予後予測システムを確立した。 In the present invention, gene expression of a human gene is comprehensively analyzed by a DNA microarray, and a breast cancer postoperative prognosis prediction system is established by comparing gene expression functions of breast cancer in various states.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）の遺伝子（群）である。
（１） 乳癌の術後予後予測に関与する以下の定義の少なくとも１よりなる遺伝子；
１）エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5y-Dグループ）と数年以上無病（disease-free）生存した患者からの遺伝子（5y-Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
２）手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、手術後5年以内に再発したn0乳癌患者からの遺伝子（5Y-Rグループ）と5年以上の間無病生存した患者からの遺伝子（5Y-Fグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
３）原発性乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5Dグループ）と数年以上無病生存した患者からの遺伝子（5Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
（２） 原発性乳癌の術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin、
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。
（３） 原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin。
（４） 原発性乳癌の術後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。
（５） 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31.、
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。
（６） 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、術後予後予測に関与する予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31.。
（７） 手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、術後予後予測に関与する予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子；
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。
（８） エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、術後予後予測に関与する以下の配列より選ばれる遺伝子；
Hs.108504/ FLJ20113/ ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs.194691/ RAI3/ retinoic acid induced 3
Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3
Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein
Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429/ ATP5G3/
ATP synthase, H+transporting,mitochondrialF0complex,subunitc(subunit9)isoform3
Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene
Hs.99987/ ERCC2/
excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency,complementationgroup2
Y12781/ Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417/ KIAA1205 protein
cl.21783/ Hypothetical protein
Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422/ Hypothetical protein
Hs.112718/ EST
Hs.115880/ EST
Hs.126495/ EST
That is, this invention is the gene (group) of the following (1)-(8).
(1) a gene comprising at least one of the following definitions involved in predicting postoperative prognosis of breast cancer;
1) Genes from breast cancer patients who died within 5 years after surgery (5y-D group) and genes from patients who have survived disease-free for more than a few years (5y-S group) ) And marker gene groups that could be distinguished by their expression functions.
2) No lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0) Breast cancer patients who relapsed within 5 years after surgery (5Y-R group) and disease-free survival for more than 5 years Marker gene group that can be distinguished from the gene (5Y-F group) from the selected patient by its expression function.
3) In primary breast cancer, a gene from a breast cancer patient who died within 5 years after surgery (5D group) and a gene from a patient who survived disease-free for more than a few years (5S group) should be distinguished by their expression function. Marker gene group
(2) a gene selected from the following sequences involved in postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin,
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
(3) a gene selected from the following highly expressed in a group having a good prognosis involved in the prediction of postoperative prognosis of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin.
(4) a gene selected from the following highly expressed in a poor prognosis group involved in postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
(5) A gene selected from the following sequences involved in the prediction of postoperative prognosis in breast cancer that did not metastasize to lymph nodes at the time of surgery (node negative) (n0);
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
(6) A gene selected from the following highly expressed in a poor-prognosis group involved in postoperative prognosis in breast cancer that did not metastasize to lymph nodes at the time of surgery (node negative) (n0);
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
(7) A gene selected from the following highly expressed in a group having a good prognosis involved in postoperative prognosis in breast cancer that did not metastasize to lymph nodes at the time of surgery (node negative) (n0);
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
(8) a gene selected from the following sequences involved in postoperative prognosis prediction in estrogen receptor-negative breast cancer;
Hs.108504 / FLJ20113 / ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550 / MYH9 / myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs. 194691 / RAI3 / retinoic acid induced 3
Hs. 1975 / TDRD3 / tudor domain containing 3
Hs.203952 / TRRAP / transformation / transcription domain-associated protein
Hs.278607 / GSA7 / ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429 / ATP5G3 /
ATP synthase, H + transporting, mitochondrialF0complex, subunitc (subunit9) isoform3
Hs.75305 / AIP / aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170 / PIM1 / pim-1 oncogene
Hs.99987 / ERCC2 /
excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency, complementationgroup2
Y12781 / Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417 / KIAA1205 protein
cl.21783 / Hypothetical protein
Hs.112628 / Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345 / Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996 / weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422 / Hypothetical protein
Hs.112718 / EST
Hs.115880 / EST
Hs.126495 / EST
また本発明は、上記（８）の内、予後の悪い群で高発現する遺伝子である。さらに本発明は、上記（１）〜（９）のいずれかの遺伝子が搭載されたＤＮＡマイクロアレイ、上記（１）〜（９）のいずれかの遺伝子に特異的なプローブが搭載されたＤＮＡマイクロアレイであり、好ましくは、ＤＮＡマイクロアレイが繊維型マイクロアレイである。 In addition, the present invention is a gene that is highly expressed in a group with a poor prognosis among the above (8). Furthermore, the present invention relates to a DNA microarray on which any one of the genes (1) to (9) is mounted, and a DNA microarray on which a probe specific to any one of the genes (1) to (9) is mounted. Preferably, the DNA microarray is a fiber type microarray.
前記遺伝子は乳癌の術後予後のマーカー遺伝子として使用することができる。さらには、乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のマーカー遺伝子としても使用することができる。 The gene can be used as a marker gene for postoperative prognosis of breast cancer. Furthermore, it can also be used as a marker gene for a cancer therapeutic agent that controls the postoperative prognosis of breast cancer.
また、当該マーカー遺伝子は試薬として包含することができ、診断キットとして使用することができる。当該試薬キットにはマーカー遺伝子が搭載されたＤＮＡマイクロアレイ、好ましくは繊維型マイクロアレイを包含する。 The marker gene can be included as a reagent and used as a diagnostic kit. The reagent kit includes a DNA microarray on which a marker gene is mounted, preferably a fiber type microarray.
本発明の手法により、完全に新規の乳癌関連遺伝子を見出すと同時に、それらの遺伝子が乳癌の悪性化に深く関与し、最終的には乳癌患者の予後に影響を及ぼしていることを発見した。さらには見出された遺伝子の発現状態を評価する数式を構築することにより、まったく新規かつ有効な乳癌術後予後予測システムを開発した。癌が遺伝子の異常による疾患であることを考慮すると、遺伝子発現の観点から見た本発明のシステムは従来の予後評価法とはまったく異なる、癌の生物学的本質を捉えた画期的な予後予測システムであると考えられる。 Through the method of the present invention, it was found that completely new breast cancer-related genes were discovered, and at the same time, these genes were deeply involved in the malignant transformation of breast cancer and ultimately affected the prognosis of breast cancer patients. Furthermore, a completely new and effective postoperative breast cancer prognosis prediction system was developed by constructing mathematical formulas to evaluate the expression status of the genes found. Considering that cancer is a disease caused by a genetic abnormality, the system of the present invention from the viewpoint of gene expression is completely different from conventional prognostic evaluation methods, and has a revolutionary prognosis that captures the biological essence of cancer. It is considered to be a prediction system.
本発明の一つの態様である乳癌の術後予後予測に関与するマーカー遺伝子群は、エストロゲンレセプター陰性乳癌、node陰性乳癌及び原発性乳癌において、外科手術後5年以内に死亡あるいは再発した患者、及び5年以上の間生存した患者からの遺伝子の発現機能をｃＤＮＡマイクロアレイで分析することにより得られたものである。 A marker gene group involved in postoperative prognosis prediction of breast cancer according to one embodiment of the present invention is a patient who died or relapsed within 5 years after surgery in estrogen receptor negative breast cancer, node negative breast cancer, and primary breast cancer, and It was obtained by analyzing the gene expression function from a patient who survived for more than 5 years by cDNA microarray.
具体的には、本発明の態様の一つは、乳癌の術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる以下の定義の少なくとも１よりなる遺伝子である；
１）エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5y-Dグループ）と数年以上無病（disease-free）生存した患者からの遺伝子（5y-Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
２）手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、手術後5年以内に再発したn0乳癌患者からの遺伝子（5Y-Rグループ）と5年以上の間無病生存した患者からの遺伝子（5Y-Fグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
３）原発性乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5Dグループ）と数年以上無病生存した患者からの遺伝子（5Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
Specifically, one aspect of the present invention is a gene consisting of at least one of the following definitions selected from known sequences involved in postoperative prognosis prediction of breast cancer;
1) Genes from breast cancer patients who died within 5 years after surgery (5y-D group) and genes from patients who have survived disease-free for more than a few years (5y-S group) ) And marker gene groups that could be distinguished by their expression functions.
2) No lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0) Breast cancer patients who relapsed within 5 years after surgery (5Y-R group) and disease-free survival for more than 5 years Marker gene group that can be distinguished from the gene (5Y-F group) from the selected patient by its expression function.
3) In primary breast cancer, a gene from a breast cancer patient who died within 5 years after surgery (5D group) and a gene from a patient who survived disease-free for more than a few years (5S group) should be distinguished by their expression function. Marker gene group
本発明の乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子は、Random-permutationテスト、Mann-Whitneyテストを用いてｃＤＮＡマイクロアレイのデータを評価することにより得られたものである。本発明は遺伝子発現機能をｃＤＮＡマイクロアレイと半定量PCR実験とを組み合わせて評価することにより、臨床レベルにおいてより役立つアプローチを提示する。 The gene involved in the postoperative prognosis prediction of breast cancer of the present invention is obtained by evaluating cDNA microarray data using a Random-permutation test and a Mann-Whitney test. The present invention presents a more useful approach at the clinical level by assessing gene expression function in combination with cDNA microarrays and semi-quantitative PCR experiments.
本発明では、乳癌患者の遺伝子発現機能を評価することにより、原発性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子を同定した。
具体的には、本発明の態様の一つは原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる以下の配列より選ばれる遺伝子である；
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin、
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。
In the present invention, genes involved in predicting the postoperative prognosis of primary breast cancer were identified by evaluating the gene expression function of breast cancer patients.
Specifically, one of the aspects of the present invention is a gene selected from the following sequences selected from known sequences involved in the postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin,
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
上記の遺伝子のいくつかは腫瘍細胞の増殖又は遠隔転移に関連していると考えられる。例えば、heat shock protein HSP 90-alphaは、多くのキナーゼのシャペロンであり、癌細胞の成長を促進する可能性がある（Neckers,L.(2002)TrendsMolMed 8, S55-61.）。malate dehydrogenaseは、好気性及び嫌気性代謝に伴うエネルギーに関連する重要な酵素であり、malatedehydrogenaseの活性は扁平上細胞癌の腫瘍マーカーに関連する（Ross,C.D.,etal. (2000) Otolaryngol HeadNeck Surg 122, 195-200.）。NADHdehydrogenase(ubiquinone)1 beta subcomplex,3(NDUFB3)はミトコンドリアの電子伝達系に属しており、乳癌細胞株であるMDA-MB-231においてNDUFB3を含む領域の染色体異常が顕著である（Xie,D.,etal.(2002)IntJ Oncol 21, 499-507.）。 Some of the above genes are thought to be associated with tumor cell growth or distant metastasis. For example, heat shock protein HSP 90-alpha is a chaperone of many kinases and may promote cancer cell growth (Neckers, L. (2002) Trends MolMed 8, S55-61.). Malate dehydrogenase is an important enzyme related to energy associated with aerobic and anaerobic metabolism, and the activity of malatedehydrogenase is related to tumor markers of squamous cell carcinoma (Ross, CD, etal. (2000) Otolaryngol HeadNeck Surg 122 , 195-200.). NADHdehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3) belongs to the mitochondrial electron transport system, and chromosomal abnormalities in the region containing NDUFB3 are prominent in the breast cancer cell line MDA-MB-231 (Xie, D. et al. (2002) IntJ Oncol 21, 499-507.).
上記の原発性乳癌の術後予後予測に関与する10遺伝子は予後の良い群（5Sグループ）と予後の悪い群（5Yグループ）とで異なる発現を示し、10遺伝子のうち7遺伝子は予後の良い群（5Sグループ）で高発現する遺伝子である。
すなわち、本発明の態様の一つは、原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である；
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin。
The above 10 genes involved in the prediction of postoperative prognosis of primary breast cancer show different expression in the good prognosis group (5S group) and the poor prognosis group (5Y group), 7 out of 10 genes have good prognosis It is a highly expressed gene in the group (5S group).
That is, one of the embodiments of the present invention is a gene selected from the following highly expressed in a group having a good prognosis selected from known sequences involved in the postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin.
上記の原発性乳癌の術後予後予測に関与する10遺伝子のうち3遺伝子は予後の悪い群（5Yグループ）で高発現する遺伝子である。すなわち、本発明の態様の一つは、原発性乳癌の術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である；
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。
Of the 10 genes involved in the postoperative prognosis prediction of primary breast cancer, 3 genes are highly expressed in the poor prognosis group (5Y group). That is, one of the aspects of the present invention is a gene selected from the following highly expressed in a poor-prognosis group selected from known sequences involved in postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
ここで、原発性乳癌の予測指標(PI)を以下のように定義し、乳癌の術後予後予測に用いることができる；
予測指標(PI)＝（乳癌組織における上記の予後の良い群で高発現する7遺伝子の正規化した発現比率の合計）−（乳癌組織における上記の予後の悪い群で高発現する3遺伝子の正規化した発現比率の合計）。
Here, the predictive index (PI) of primary breast cancer can be defined as follows and used for predicting postoperative prognosis of breast cancer;
Predictive index (PI) = (sum of normalized expression ratios of 7 genes highly expressed in the above-mentioned group with good prognosis in breast cancer tissue)-(normality of 3 genes highly expressed in the above-mentioned group with poor prognosis in breast cancer tissue) Total expression ratio).
本発明では、乳癌患者の遺伝子発現機能を評価し、node陰性乳癌の術後予後予測に関与する10遺伝子を同定した。
具体的には、本発明の一つの態様は、手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる以下の配列より選ばれる遺伝子である；
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31.、
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。
In the present invention, gene expression function of breast cancer patients was evaluated, and 10 genes involved in predicting postoperative prognosis of node-negative breast cancer were identified.
Specifically, one embodiment of the present invention is selected from the following sequences selected from known sequences involved in the prediction of postoperative prognosis in breast cancer that did not metastasize to lymph nodes at the time of surgery (node negative) (n0) Gene
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
上記のnode陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子には腫瘍細胞の増殖、遠隔転移に関与する遺伝子が含まれる。例えば、galectin 1は細胞分化を制御するオートクライン型癌抑制因子である（AxelH,etal. (2003) Int. J. Cancer, 103: 370-379.）。また、癌転移を活性化する遺伝子が含まれる。 The genes involved in the postoperative prognosis prediction of node negative breast cancer include genes involved in tumor cell growth and distant metastasis. For example, galectin 1 is an autocrine tumor suppressor that controls cell differentiation (AxelH, etal. (2003) Int. J. Cancer, 103: 370-379.). Also included are genes that activate cancer metastasis.
上記のnode陰性乳癌の術後予後予測に関与する10遺伝子は予後の良い群（5Y-Fグループ）と予後の悪い群（5Y-Rグループ）とで異なる発現を示し、10遺伝子のうち3遺伝子は予後の悪い群（5Y-Rグループ）で高発現する遺伝子である。すなわち、本発明の一つの態様は手術時にnode陰性乳癌において、術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる予後の悪い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である；
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31。
The 10 genes involved in the prediction of postoperative prognosis for node-negative breast cancer are expressed differently in the good prognosis group (5Y-F group) and the poor prognosis group (5Y-R group). Is a gene that is highly expressed in the poor prognosis group (5Y-R group). That is, one embodiment of the present invention is a gene selected from the following highly expressed in a poor prognosis group selected from known sequences involved in postoperative prognosis prediction in node-negative breast cancer at the time of surgery;
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
上記のnode陰性乳癌の術後予後予測に関与する10遺伝子のうち7遺伝子は予後の良い群（5Y-Fグループ）で高発現する遺伝子である。すなわち、本発明の一つの態様はnode陰性乳癌において、術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる予後の良い群で高発現する以下から選ばれる遺伝子である；
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。
Of the 10 genes involved in the prediction of postoperative prognosis of node negative breast cancer, 7 genes are highly expressed in the group with good prognosis (5Y-F group). That is, one embodiment of the present invention is a gene selected from the following highly expressed in a group having a good prognosis selected from known sequences involved in postoperative prognosis prediction in node-negative breast cancer;
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
ここで、node陰性乳癌の予後スコア(PS)を以下のように定義し、乳癌の術後予後予測に用いることができる；
予後スコア(PS)＝（乳癌組織における上記の予後の悪い群で高発現する3遺伝子の正規化した発現比率の合計）−（乳癌組織における上記の予後の良い群で高発現する7遺伝子の正規化した発現比率の合計）。
Here, the prognostic score (PS) of node-negative breast cancer can be defined as follows and used to predict postoperative prognosis of breast cancer;
Prognostic score (PS) = (sum of normalized expression ratios of 3 genes that are highly expressed in the above-mentioned poor prognosis group in breast cancer tissue)-(normality of 7 genes that are highly expressed in the above-mentioned good prognosis group in breast cancer tissue) Total expression ratio).
本発明では、乳癌患者の遺伝子発現機能を評価することにより、エストロゲンレセプター陰性の乳癌の術後予後予測に関与する20遺伝子を同定した。
具体的には、本発明の一つの態様は、エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる以下の配列より選ばれる遺伝子である；
Hs.108504/ FLJ20113/ ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs.194691/ RAI3/ retinoic acid induced 3
Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3
Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein
Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429/ ATP5G3/ ATPsynthase,H+transporting,mitochondrialF0complex,subunitc(subunit9)isoform 3
Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene
Hs.99987/ ERCC2/ excisionrepaircross-complementingrodentrepairdeficiency,complementationgroup2
Y12781/ Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417/ KIAA1205 protein
cl.21783/ Hypothetical protein
Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422/ Hypothetical protein
Hs.112718/ EST
Hs.115880/ EST
Hs.126495/ EST。
In the present invention, 20 genes involved in the prediction of postoperative prognosis of estrogen receptor-negative breast cancer were identified by evaluating the gene expression function of breast cancer patients.
Specifically, one embodiment of the present invention is a gene selected from the following sequences selected from known sequences involved in postoperative prognosis prediction in estrogen receptor negative breast cancer:
Hs.108504 / FLJ20113 / ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550 / MYH9 / myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs. 194691 / RAI3 / retinoic acid induced 3
Hs. 1975 / TDRD3 / tudor domain containing 3
Hs.203952 / TRRAP / transformation / transcription domain-associated protein
Hs.278607 / GSA7 / ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429 / ATP5G3 / ATPsynthase, H + transporting, mitochondrialF0complex, subunitc (subunit9) isoform 3
Hs.75305 / AIP / aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170 / PIM1 / pim-1 oncogene
Hs.99987 / ERCC2 / excisionrepaircross-complementingrodentrepairdeficiency, complementationgroup2
Y12781 / Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417 / KIAA1205 protein
cl.21783 / Hypothetical protein
Hs.112628 / Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345 / Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996 / weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422 / Hypothetical protein
Hs.112718 / EST
Hs.115880 / EST
Hs.126495 / EST.
上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子には腫瘍細胞の増殖又は遠隔転移に関連する遺伝子が含まれる。例えば、PIM1はセリン/スレオニンキナーゼであり、前立腺がんの臨床結果とその発現には相関性がある（Oesterreich,S.,etal.(1996) Clin Cancer Res, 2, 1199-1206.）。また、TRRAP蛋白質は哺乳類HAT複合体のサブユニットであり、TRRAPのアンチセンスRNAは乳癌細胞のエストロゲン依存性の成長を阻害する。 Genes involved in the postoperative prognosis prediction of estrogen receptor negative breast cancer include genes associated with tumor cell growth or distant metastasis. For example, PIM1 is a serine / threonine kinase, and there is a correlation between the clinical outcome of prostate cancer and its expression (Oesterreich, S., etal. (1996) Clin Cancer Res, 2, 1199-1206.). TRRAP protein is a subunit of mammalian HAT complex, and TRRAP antisense RNA inhibits estrogen-dependent growth of breast cancer cells.
上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する20遺伝子は、予後の悪い群（5y-Dグループ）で高発現する。すなわち、本発明の一つの態様は、予後の悪い群で高発現する、前記のエストロゲンレセプターに対して陰性の乳癌において、術後予後予測に関与する既知配列から選ばれる遺伝子である。 The 20 genes involved in the postoperative prognosis prediction of estrogen receptor negative breast cancer are highly expressed in the poor prognosis group (5y-D group). That is, one aspect of the present invention is a gene selected from known sequences involved in predicting postoperative prognosis in the aforementioned breast cancer negative for estrogen receptor, which is highly expressed in a group with poor prognosis.
ここで、上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する遺伝子の発現に基づいて、以下のように乳癌の術後予後を予測することができる；
（１）上記のエストロゲンレセプター陰性乳癌の術後予後予測に関与する20遺伝子の乳癌組織における発現量を母集団における平均値と比較し、各遺伝子発現量が母集団の平均値の２倍以上であるならば、1点を付与、
（２）（１）の操作を各20遺伝子について行い、合計点数が8点以上ならば、予後不良とする。
Here, the postoperative prognosis of breast cancer can be predicted as follows based on the expression of the genes involved in the postoperative prognosis prediction of the above-described estrogen receptor negative breast cancer;
(1) Compare the expression level of the 20 genes involved in the postoperative prognosis prediction of the above-mentioned estrogen receptor-negative breast cancer in breast cancer tissue with the average value in the population, and each gene expression level is more than twice the average value in the population If there is, give 1 point,
(2) Perform the operation in (1) for each 20 genes, and if the total score is 8 or more, the prognosis is poor.
上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、マーカーとして乳癌の術後予後の検査に用いることができる。すなわち、本発明の一つの態様は、前記遺伝子をマーカーにする乳癌の術後予後の検査方法である。 The gene associated with the prediction of postoperative prognosis of breast cancer can be used as a marker for the examination of postoperative prognosis of breast cancer. That is, one aspect of the present invention is a method for examining postoperative prognosis of breast cancer using the gene as a marker.
上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、マーカーとして乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のスクリーニングに用いることができる。すなわち、本発明の一つの態様は、前記の遺伝子をマーカーにする乳癌の術後予後を制御する癌治療薬のスクリーニング方法である。 The gene associated with the prediction of postoperative prognosis of breast cancer can be used as a marker for screening for cancer therapeutic agents that control the postoperative prognosis of breast cancer. That is, one aspect of the present invention is a method for screening a cancer therapeutic agent that controls postoperative prognosis of breast cancer using the gene as a marker.
上記の乳癌の術後予後予測に関連する遺伝子は、マーカーとして乳癌の術後予後の診断に用いることができる。また、上記遺伝子に対して特異的なプローブを設計し、それらプローブをマーカーとして使用することもできる。それらプローブは例えば、ダイナコム社製ProbeQuest（登録商標）により設計することが可能である。すなわち、本発明の一つの態様は、前記の遺伝子をマーカーにする試薬を含む乳癌の術後予後の診断キットである。 The gene associated with the prediction of postoperative prognosis of breast cancer can be used as a marker for diagnosis of postoperative prognosis of breast cancer. In addition, probes specific to the above genes can be designed and used as markers. These probes can be designed by, for example, ProbeQuest (registered trademark) manufactured by Dynacom. That is, one embodiment of the present invention is a diagnostic kit for postoperative prognosis of breast cancer comprising a reagent using the above gene as a marker.
上記の診断キットはマイクロアレイを包含することができる。すなわち、本発明の一つの態様は、前記診断キットがマイクロアレイを包含するものである診断キットである。 The diagnostic kit can include a microarray. That is, one embodiment of the present invention is a diagnostic kit in which the diagnostic kit includes a microarray.
上記マイクロアレイを包含するものである診断キットのマイクロアレイには繊維型マイクロアレイが含まれる。ここで、繊維型マイクロアレイの調製方法については、前記特許文献６−７を引用する。すなわち、本発明の一つの態様は、マイクロアレイが繊維型マイクロアレイである前記診断キットである。 The microarray of the diagnostic kit including the microarray includes a fiber type microarray. Here, for the preparation method of the fiber type microarray, the above-mentioned patent documents 6-7 are cited. That is, one embodiment of the present invention is the diagnostic kit, wherein the microarray is a fiber type microarray.
次に、実施例により本発明の実施の態様を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Next, embodiments of the present invention will be specifically described by way of examples. However, the present invention is not limited to the examples.
エストロゲンレセプター陰性乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の評価 Evaluation of gene expression function for predicting postoperative prognosis in estrogen receptor negative breast cancer
（組織サンプル）
日本医科大学並びに癌研究会の倫理委員会より承認されたガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得た後、癌研究会付属病院（東京）において1995-1997年に手術を受けた乳癌患者から原発性乳癌及び隣接する正常乳腺からの組織を採取した。組織は速やかに凍結され、-80°Cで保存された。954人の患者について、その全員を5年以上の間あるいは死亡時まで臨床的に追跡し、手術後5年以内に死亡したエストロゲンレセプター陰性乳癌の患者10人（5y-D）、及び5年以上の間無病生存した患者10人（5y-S）から試料を選んだ。両方の患者グループの臨床のバックグラウンドは、年齢、リンパ節転移、腫瘍径と組織型において一致させた（表１）。
(Tissue sample)
After obtaining informed consent in accordance with the guidelines approved by the Nippon Medical University and the Ethics Committee of the Cancer Research Society, primary breast cancer and breast cancer patients who underwent surgery in 1995-1997 at the Cancer Research Institute Hospital (Tokyo) Tissue from adjacent normal mammary glands was collected. Tissues were quickly frozen and stored at -80 ° C. 95 patients with 10 patients with estrogen receptor-negative breast cancer who died within 5 years after surgery (5y-D) and more than 5 years Samples were selected from 10 patients (5y-S) who survived disease-free during. The clinical background of both patient groups was matched in age, lymph node metastasis, tumor diameter and histology (Table 1).
（乳癌の20症例の臨床的特徴） (Clinical characteristics of 20 cases of breast cancer)
すべての患者は癌研究会付属病院の「乳癌のための手術後の臨床のプロトコル」に従って手術後のアジュバント治療を受けた。 各症例での アジュバント治療の選択は、外科手術のタイプ、リンパ節関与の状態、及び局所あるいは遠隔転移の存在に基づいて厳密に決定した。本発明の研究においては、患者のいずれもがアジュバント化学療法の前に遠隔転移を持っておらず、外科手術の前に放射線療法あるいは化学療法を受けていなかった。 All patients received post-surgical adjuvant treatment according to “Post-operative clinical protocol for breast cancer” at the Cancer Institute Hospital. The choice of adjuvant treatment in each case was strictly determined based on the type of surgery, the status of lymph node involvement, and the presence of local or distant metastases. In the study of the present invention, none of the patients had distant metastases prior to adjuvant chemotherapy and had not received radiation therapy or chemotherapy prior to surgery.
（臨床病理（Clinicopathological）パラメータ）
次のパラメータを調べた：組織型、腫瘍径及び浸潤（t因子）、リンパ節関与（lymph node involvement）、及びエストロゲンレセプター（ER）とプロゲステロンレセプター（PgR）の状態。腫瘍をTNM分類と日本の乳癌学会（1989）の組織分類によって、次のタイプに分類した；noninvasivetubular（1a）、invasivepapillotubular（a1）、invasivesolid-tubular（a2）、invasivescirrhouscarcinoma（a3）、及び他の特別なタイプ（b）。分類は基本的に世界保健機構の乳癌組織分類と同じである。ｔ因子は、組織学的TNM分類に従って次のタイプに分類した；最大寸法が2ｃｍ以下の腫瘍（t1）、皮膚又は胸筋への浸潤のない、最大寸法が2ｃｍ以上の腫瘍（t2）、皮膚あるいは胸筋への浸潤のあるもの（t3）。
(Clinicopathological parameters)
The following parameters were examined: tissue type, tumor diameter and invasion (t factor), lymph node involvement, and estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PgR) status. Tumors were classified into the following types according to the TNM classification and histological classification of the Japanese Breast Cancer Society (1989): noninvasivetubular (1a), invasivepapillotubular (a1), invasivesolid-tubular (a2), invasivescirrhouscarcinoma (a3), and other special Type (b). The classification is basically the same as the World Health Organization's breast cancer tissue classification. The t-factor was classified into the following types according to the histological TNM classification: tumors with a maximum dimension of 2 cm or less (t1), tumors without skin or pectoral muscle invasion, tumors with a maximum dimension of 2 cm or more (t2), skin Or with invasion to the pectoral muscle (t3).
（cDNAマイクロアレイのデザインと構成）
UniGene データベースから選択した25,344の cDNAsにより、” ゲノムワイド cDNA マイクロアレイ“を構築した。当該cDNAsは種々のヒト器官から分離されたpoly(A)+RNAを使いRT-PCRで作成された。PCR産物を、ArraySpotterGenerationIII（Amersham Biosciences）を使ってタイプ7のスライド・ガラス（AmershamBiosciences UKLimited、Buckinghamshire、UK）にスポットした。各スライドは、384のハウスキーピング遺伝子を含む。
(Design and configuration of cDNA microarray)
A “genome-wide cDNA microarray” was constructed from 25,344 cDNAs selected from the UniGene database. The cDNAs were prepared by RT-PCR using poly (A) + RNA isolated from various human organs. PCR products were spotted on Type 7 glass slides (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK) using ArraySpotter Generation III (Amersham Biosciences). Each slide contains 384 housekeeping genes.
（RNAの調製及び増幅）
腫瘍原料を採取後直ちに-80℃で急速凍結した。RNAを、TRIzol（Invitrogen Inc.、Carlsbad、CA、 USA）を使って抽出し、さらにRNeasykits(QuiagenInc.、Valencia、CA)を使って精製した。各RNAの純度を、分光測光法及び1.2％変性ホルムアミドゲル上で電気泳動することにより評価した。高純度RNAは、1.8-2.0の吸光度比（260nm/280nm）を持ち、ホルムアミドゲル電気泳動上で28S/18Sリボゾーマルバンドが1.8以上の比率を有するサンプルとして定義した。1ユニットのDNaseI（EpicentreTechnologies、Madison、WI）（1unit/μl）で処理後、出発原料として各試料からRNAの2μgを用いてT7RNAポリメラーゼによるRNA増幅を行った。増幅を2回行い、RNeasykits（QuiagenInc.、Valencia、CA）で、増幅されたRNA（aRNA）を精製した。各aRNAの量を分光光度計により測定し、その品質をホルムアミドゲル電気泳動によりチェックした。
(Preparation and amplification of RNA)
Immediately after collection of the tumor material, it was snap frozen at -80 ° C. RNA was extracted using TRIzol (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) and further purified using RNeasykits (Quiagen Inc., Valencia, CA). The purity of each RNA was assessed by spectrophotometry and electrophoresis on a 1.2% denaturing formamide gel. High-purity RNA was defined as a sample having an absorbance ratio of 1.8-2.0 (260 nm / 280 nm) and a 28S / 18S ribosomal band having a ratio of 1.8 or higher on formamide gel electrophoresis. After treatment with 1 unit of DNaseI (EpicentreTechnologies, Madison, WI) (1 unit / μl), RNA amplification by T7 RNA polymerase was performed using 2 μg of RNA from each sample as a starting material. Amplification was performed twice, and the amplified RNA (aRNA) was purified with RNeasykits (Quiagen Inc., Valencia, Calif.). The amount of each aRNA was measured with a spectrophotometer and the quality was checked by formamide gel electrophoresis.
（aRNAの標識、ハイブリダイゼーション及びスキャニング）
マイクロアレイ分析のcDNAを、aRNAから調製した。乳癌及び正常乳腺組織からのaRNA（5〜10μg）を、aminoallyl-cDNAlabelingkits（Ambion、Austin、TX）を使いCy5（癌試料）とCy3（正常試料）で標識した。Cy3-とCy5-標識cDNAプローブを混合し、95℃で5分加熱した後、30秒氷で急冷し、マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。混合されたプローブを、microarrayhybridizationsolutionversion 2（Amersham Biosciences UK Limited、Buckinghamshire、UK）を50％終濃度のホルムアミド(Sigma-AldrichCorp.、St.Louis、MO、USA)に添加した。15時間40℃でのハイブリダイゼーションの後に、マイクロアレイスライドを、最初に1xSSCと0.2％SDSによって、10分間55℃で洗浄し、次いで2回0.1xSSC/0.2％SDSで各1分間室温で洗浄した。全ての処理は、AutomatedSlideProcessorSystem（Amersham）で行った。各ハイブリダイゼーションのシグナル強度を、Gene Pix 4000A（AxonInstruments,Inc.、FosterCity、CA、USA）でスキャニングし、Gene Pix 3.0 (Axon Instruments)で分光測光法により評価した。スキャンされたシグナルを、以下の文献記載の方法（thetotalgenenormalization method）で正規化した（Yang YH, Dudoit S, Luu P, et al. (2002)NucleicAcidsRes 30,e15; Manos EJ, Jones DA.(2001) Cancer Res 61: 433-438）。
(ARNA labeling, hybridization and scanning)
Microarray analysis cDNA was prepared from aRNA. ARNA (5-10 μg) from breast cancer and normal breast tissue was labeled with Cy5 (cancer sample) and Cy3 (normal sample) using aminoallyl-cDNAlabelingkits (Ambion, Austin, TX). Cy3- and Cy5-labeled cDNA probes were mixed, heated at 95 ° C. for 5 minutes, then rapidly cooled on ice for 30 seconds and hybridized to the microarray. The mixed probe was added microarray hybridization solution version 2 (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK) to 50% final concentration of formamide (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA). After hybridization for 15 hours at 40 ° C., the microarray slides were first washed with 1 × SSC and 0.2% SDS for 10 minutes at 55 ° C., then twice with 0.1 × SSC / 0.2% SDS for 1 minute each at room temperature. All treatments were performed with Automated Slide Processor System (Amersham). The signal intensity of each hybridization was scanned with Gene Pix 4000A (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA) and evaluated spectrophotometrically with Gene Pix 3.0 (Axon Instruments). The scanned signal was normalized by the totalgenenormalization method (Yang YH, Dudoit S, Luu P, et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, e15; Manos EJ, Jones DA. (2001) Cancer Res 61: 433-438).
（シグナル分析及び異なる発現を示す遺伝子の選択）
各ハイブリダイゼーションのシグナル強度を、Gene Pix Pro 3.0（Axon Instruments, Inc.、Foster City、 CA、USA）により測光法で評価した。癌とコントロール間のmRNA発現量を正規化するために、各遺伝子発現のCy5：Cy3比率を調整した。その結果、ハウスキーピング遺伝子の平均化されたLog（Cy5：Cy3比率）はゼロであった。27個のハウスキーピング遺伝子は、Webサイトhttp://www.nhgri.nih.gov/DIR/LCG/ARRAY/expn.htmlのハウスキーピングパネルから援用した。各マイクロアレイスライドについて、（Ｓ／Ｎ）比のカットオフ値を3.0に設定した。そして、Cy3とCy5のシグナル強度が、カットオフ値より低い遺伝子は検討から除外した。
(Signal analysis and selection of genes showing different expression)
The signal intensity of each hybridization was evaluated photometrically with Gene Pix Pro 3.0 (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA). To normalize the mRNA expression level between cancer and control, the Cy5: Cy3 ratio of each gene expression was adjusted. As a result, the averaged log (Cy5: Cy3 ratio) of the housekeeping gene was zero. Twenty-seven housekeeping genes were incorporated from the housekeeping panel on the website http://www.nhgri.nih.gov/DIR/LCG/ARRAY/expn.html. For each microarray slide, the (S / N) ratio cut-off value was set to 3.0. Then, genes whose Cy3 and Cy5 signal intensities were lower than the cutoff value were excluded from the study.
（Mann-Whitney テスト）
5y-Dと5y-S腫瘍間で、明らかに異なる発現を示した遺伝子を検討するために、Mann-Whitneyテストを、一連のサンプルXに適用した。Xは、各遺伝子及び各サンプルのCy5/Cy3シグナル強度比率である（OnoK,TanakaT, Tsunoda T, et al. (2000) Cancer Res 2000; 60: 5007-5011）。 U値を、両グループの少なくとも5サンプルで有意なシグナルを与えた各遺伝子について計算した。Ｕ値が23より低いか、あるいは77より大きい遺伝子を選択した。U値は、各Ｘ値に基づく各遺伝子の、5y-Dグループに対する5y-Sグループを計算しているので、23より低いU値は、5y-Dグループに比べ5y-Sグループにおいて高発現するものと評価した。しかしながら、77より大きなU値を持つ遺伝子は、5y-Sグループに比べ5y-Dグループにおいて高発現するものと評価した。この基準によると、183遺伝子が5y-Sグループで高発現しており、31遺伝子が5y-Sグループで高発現していた。したがって、2つのグループ間での中間発現値が2倍以上の差異を示す遺伝子のみを（μXD/μXS < 0.5あるいは > 2.0、μXDとμXSがそれぞれ5y-Dあるいは5y-Sグループの平均Ｘ値を示す）予後関連の遺伝子と定義した。その結果、全部で110遺伝子が選ばれた。そのうち90遺伝子が5y-D腫瘍群で高いレベルで発現しており、20遺伝子が5y-S腫瘍群で高いレベルで発現していた。
(Mann-Whitney test)
The Mann-Whitney test was applied to a series of samples X to examine genes that showed distinctly different expression between 5y-D and 5y-S tumors. X is the Cy5 / Cy3 signal intensity ratio of each gene and each sample (OnoK, TanakaT, Tsunoda T, et al. (2000) Cancer Res 2000; 60: 5007-5011). U values were calculated for each gene that gave a significant signal in at least 5 samples of both groups. Genes with U values lower than 23 or greater than 77 were selected. U value is calculated for 5y-S group for 5y-D group of each gene based on each X value, so U value lower than 23 is more highly expressed in 5y-S group than 5y-D group It was evaluated as a thing. However, genes with U values greater than 77 were evaluated to be highly expressed in the 5y-D group compared to the 5y-S group. According to this standard, 183 genes were highly expressed in the 5y-S group and 31 genes were highly expressed in the 5y-S group. Therefore, only genes that show a difference of more than twice the intermediate expression value between the two groups (μXD / μXS < 0.5 or > 2.0, μXD and μXS are the mean X values of the 5y-D or 5y-S group, respectively. It was defined as a prognostic gene. As a result, a total of 110 genes were selected. Of these, 90 genes were expressed at high levels in the 5y-D tumor group, and 20 genes were expressed at high levels in the 5y-S tumor group.
（Random-permutationテスト）
さらにMann-Whitneyテストによって選択された110遺伝子の価値を評価するために、permutationテストを行った。そしてグループ差異に関連する遺伝子の可能性、Ps、もまた想定した。各遺伝子を、発現ベクターｖ（ｇ）＝（X1、X2、---、X20）（Xiは最初のサンプル群におけるi番目のサンプルの遺伝子発現レベルを示す）で表すとき、理想的発現パターンはc＝（c1、c2 、---、c20）（i番目のサンプルがS又はDグループに属するかによりci＝＋1又は0となる）で表現される。
遺伝子と グループ差異Pgc間の相関は、次のように定義された：すなわち、 Pgc ＝ （μＳ−μD） / （ δS ＋δD ）；μＳ（μD）とδS（δD）は、新規に定義されたS（又はD）グループにおいて、各サンプルの該遺伝子“ｇ”のlog2Xの標準偏差を示す。
permutationテストは、ｃの座標を入れ換えることにより行った。すべてのpermutation間で相関値、 Pgcを計算した。これらの手順は10000回にわたり繰り返し行った。偶然に、2つのグループを分類する遺伝子の可能性を示すp値が、選択された110遺伝子の各々について評価された。最終的に、5y-Dケースで高発現する71遺伝子と、5y-Sケースで低発現する15遺伝子を選別した。
(Random-permutation test)
In addition, a permutation test was performed to evaluate the value of 110 genes selected by the Mann-Whitney test. We also assumed the possibility of genes related to group differences, Ps. When each gene is represented by an expression vector v (g) = (X1, X2, ---, X20) (Xi indicates the gene expression level of the i-th sample in the first sample group), the ideal expression pattern is c = (c1, c2, ---, c20) (ci = + 1 or 0 depending on whether the i-th sample belongs to the S or D group).
Correlation between genes and groups differences Pgc was defined as follows: That is, Pgc = (μ S -μ D ) / (δ S + δ D); μ S (μ D) and δ S (δ D) Indicates the log 2 X standard deviation of the gene “g” of each sample in the newly defined S (or D) group.
The permutation test was performed by exchanging the coordinates of c. The correlation value, Pgc, was calculated among all permutations. These procedures were repeated 10,000 times. Coincidentally, a p-value indicating the potential of the genes that classify the two groups was evaluated for each of the 110 genes selected. Finally, 71 genes highly expressed in the 5y-D case and 15 genes low expressed in the 5y-S case were selected.
（半定量(Semi-quantitative)RT-PCR）
RNA（2μｇ）を、DNase I（Epicentre Technologies、Madison、WI、USA）で処理し、ReverscriptIIreversetranscriptase（和光純薬(株)、大阪、日本）とオリゴ（dT）12-18プライマーを使って単鎖ｃDNAを逆転写させた。単鎖cDNAsは、量的なコントロールとしてGAPD（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）の発現をモニタリングすることにより次のPCR増幅のために濃度調整を行った。各PCRは、GeneAmpPCRシステム9700（AppliedBiosystems、Foster City、CA、USA）を用い1xPCRバッファー30μｌ量で、以下の反応条件で行った；
94℃5分、
（94℃30秒、60℃30秒、及び72℃30分）を25-35サイクル。
RT-PCRに使ったプライマー配列は以下である:
配列番号1 GAPD (control) forward, 5'-GGA AGGTGA AGG TCG GAG T-3'
配列番号2 reverse, 5'-TGG GTG GAA TCA TAT TGGAA-3';
配列番号3 Hs.108504F, 5’-ACA CTT CAT CTG CTCCCT CAT AG-3’;
配列番号4 Hs.108504R, 5’CTG CCT AGA CCT GAGGAC TGT AG-3’;
配列番号5 Hs.146550F, 5’ACT GAG GCC TTT TGGTAG TCG-3’;
配列番号6 Hs.146550R, 5’TCT CTT TAT TGT GATGCT CAG TGG-3’;
配列番号7 Hs.194691F, 5’AAA TCC TTC TCG TGT GTTGAC TG-3’;
配列番号8 Hs.194691R, 5’CAG TCA TGA GGG CTA AAAACT GA-3’;
配列番号9 Hs.1975F, 5'GAA GAC AAC AAG TTT TAC CGG G-3';
配列番号10 Hs.1975R, 5’ATG GTT TTA TTG ACG GCAGAA G-3’;
配列番号11 Hs.203952F, 5’AGG ACA CGT CCT CTCCTC TCT C-3’;
配列番号12 Hs.203952R, 5’TAA AGC TAG CGA AGGAAC GTA CA-3’;
配列番号13 Hs.278607F, 5'TCC CTT CTG TTT CCT CAG TGT T-3';
配列番号14 Hs.278607R, 5'CCT GCC CCG ATA AAA ATA TCT AC -3';
配列番号15 Hs.429F, 5’TTG ACC TTA AGC CTC TTTTCC TC-3’;
配列番号16 Hs.429R, 5’ATA ACG TAC ATT CCC ATGACA CC-3’;
配列番号17 Hs.75305F, 5’ACT TTC AAG ATG GGACCA AGG-3’;
配列番号18 Hs.75305R, 5’ATA TAC ACA GAA GCATGA CGC AG-3’;
配列番号19 Hs.81170F, 5’TTG CTG GAC TCT GAAATA TCC C-3’;
配列番号20 Hs.81170R, 5’TTC CCC TGT ACA GTATTT CAC TCA-3’;
配列番号21 Hs.99987F, 5’GTT CCA GAT TCG TGA GAA TGA CT-3’;
配列番号22 Hs.99987R, 5’CTG AGC AAT CTG CTC TAT TCC C-3’;
配列番号23 Y12781F, 5’ACC AGT AAC AAC TGT GGGATG G-3’;
配列番号24 Y12781R, 5’CAA ATG AGC TAC AAC ACACAA GG-3’;
配列番号25 Hs.104417F, 5’CCC CCT CCA CCT TGTACA TAA T-3’;
配列番号26 Hs.104417R, 5’GTT TTC GTT TGG CTGGTT GTG-3’;
配列番号27 cl.21783F, 5’GTC TGA GAT TTT ACTGCA CCG-3’;
配列番号28 cl.21783R, 5’GGA TGG AGC TGG AGGATA TTA-3’;
配列番号29 Hs.112628F, 5’ATT GCT AAG GAT AAGTGC TGC TC-3’;
配列番号30 Hs.112628R, 5’TGT CAG TAT AGA AGCCTG TGG GT-3’;
配列番号31 Hs.170345F, 5’GCA TCT GAA TGT CTT TCT CCC TA-3’;
配列番号32 Hs.170345R, 5’TTC TTA GGC CAT CCC TTT TCT AC-3’;
配列番号33 Hs.53996F, 5’CCA TAG GAT CTT GACTCC AAC AG-3’;
配列番号34 Hs.53996R, 5’ACT GGG AGT GGA GGAAAT TAG AG-3’;
配列番号35 Hs.55422F, 5’CTA ATG TAA GCT CCATTG GGA TG-3’;
配列番号36 Hs.55422R, 5’CAA ACT GCA AAC TAGCTC CCT AA-3’;
配列番号37 Hs.112718F, 5'AAG ACT AAG AGG GAA AAT GTG GG-3';
配列番号38 Hs.112718R, 5'AGG TAA CCC AAA GTG ACA AAC CT-3';
配列番号39 Hs.115880F, 5'TTA AGT GAG TCT CCT TGG CTG AG-3';
配列番号40 Hs.115880R, 5'AGG GCC CCT ATA TCC AAT ACC TA-3';
配列番号41 Hs.126495F, 5’GAT CTT TCA AGA TGAGCC AAG GT-3’;
配列番号42 Hs.126495R, 5’AGT CAT TCA GAA GCCATT GAG AC-3’
(Semi-quantitative RT-PCR)
RNA (2 μg) was treated with DNase I (Epicentre Technologies, Madison, WI, USA), and single-stranded cDNA using Reverscript II reverse transcriptase (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) and oligo (dT) 12-18 primer Was reverse transcribed. Single-stranded cDNAs were adjusted for concentration for subsequent PCR amplification by monitoring the expression of GAPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) as a quantitative control. Each PCR was performed using GeneAmpPCR system 9700 (AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA) in an amount of 30 μl of 1 × PCR buffer under the following reaction conditions;
94 ° C for 5 minutes,
(94 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 minutes) 25-35 cycles.
The primer sequences used for RT-PCR are:
SEQ ID NO: 1 GAPD (control) forward, 5'-GGA AGGTGA AGG TCG GAG T-3 '
SEQ ID NO: 2 reverse, 5'-TGG GTG GAA TCA TAT TGGAA-3 ';
SEQ ID NO: 3 Hs. 108504F, 5'-ACA CTT CAT CTG CTCCCT CAT AG-3 ';
SEQ ID NO: 4 Hs. 108504R, 5 'CTG CCT AGA CCT GAGGAC TGT AG-3';
SEQ ID NO: 5 Hs. 146550F, 5'ACT GAG GCC TTT TGGTAG TCG-3 ';
SEQ ID NO: 6 Hs. 146550R, 5'TCT CTT TAT TGT GATGCT CAG TGG-3 ';
SEQ ID NO: 7 Hs. 194691F, 5'AAA TCC TTC TCG TGT GTTGAC TG-3 ';
SEQ ID NO: 8 Hs. 194691R, 5'CAG TCA TGA GGG CTA AAAACT GA-3 ';
SEQ ID NO: 9 Hs. 1975F, 5'GAA GAC AAC AAG TTT TAC CGG G-3 ';
SEQ ID NO: 10 Hs. 1975R, 5'ATG GTT TTA TTG ACG GCAGAA G-3 ';
SEQ ID NO: 11 Hs. 203952F, 5'AGG ACA CGT CCT CTCCTC TCT C-3 ';
SEQ ID NO: 12 Hs. 203952R, 5'TAA AGC TAG CGA AGGAAC GTA CA-3 ';
SEQ ID NO: 13 Hs. 278607F, 5'TCC CTT CTG TTT CCT CAG TGT T-3 ';
SEQ ID NO: 14 Hs. 278607R, 5'CCT GCC CCG ATA AAA ATA TCT AC -3 ';
SEQ ID NO: 15 Hs. 429F, 5'TTG ACC TTA AGC CTC TTTTCC TC-3 ';
SEQ ID NO: 16 Hs. 429R, 5'ATA ACG TAC ATT CCC ATGACA CC-3 ';
SEQ ID NO: 17 Hs. 75305F, 5'ACT TTC AAG ATG GGACCA AGG-3 ';
SEQ ID NO: 18 Hs. 75305R, 5'ATA TAC ACA GAA GCATGA CGC AG-3 ';
SEQ ID NO: 19 Hs.81170F, 5'TTG CTG GAC TCT GAAATA TCC C-3 ';
SEQ ID NO: 20 Hs.81170R, 5'TTC CCC TGT ACA GTATTT CAC TCA-3 ';
SEQ ID NO: 21 Hs. 99987F, 5 'GTT CCA GAT TCG TGA GAA TGA CT-3';
SEQ ID NO: 22 Hs. 99987R, 5'CTG AGC AAT CTG CTC TAT TCC C-3 ';
SEQ ID NO: 23 Y12781F, 5 'ACC AGT AAC AAC TGT GGGATG G-3';
SEQ ID NO: 24 Y12781R, 5'CAA ATG AGC TAC AAC ACACAA GG-3 ';
SEQ ID NO: 25 Hs.104417F, 5'CCC CCT CCA CCT TGTACA TAA T-3 ';
SEQ ID NO: 26 Hs. 104417R, 5'GTT TTC GTT TGG CTGGTT GTG-3 ';
SEQ ID NO: 27 cl.21783F, 5'GTC TGA GAT TTT ACTGCA CCG-3 ';
SEQ ID NO: 28 cl.21783R, 5'GGA TGG AGC TGG AGGATA TTA-3 ';
SEQ ID NO: 29 Hs. 112628F, 5'ATT GCT AAG GAT AAGTGC TGC TC-3 ';
SEQ ID NO: 30 Hs. 112628R, 5'TGT CAG TAT AGA AGCCTG TGG GT-3 ';
SEQ ID NO: 31 Hs. 170345F, 5'GCA TCT GAA TGT CTT TCT CCC TA-3 ';
SEQ ID NO: 32 Hs. 170345R, 5'TTC TTA GGC CAT CCC TTT TCT AC-3 ';
SEQ ID NO: 33 Hs.53996F, 5'CCA TAG GAT CTT GACTCC AAC AG-3 ';
SEQ ID NO: 34 Hs.53996R, 5'ACT GGG AGT GGA GGAAAT TAG AG-3 ';
SEQ ID NO: 35 Hs. 55422F, 5 'CTA ATG TAA GCT CCATTG GGA TG-3';
SEQ ID NO: 36 Hs. 55422R, 5'CAA ACT GCA AAC TAGCTC CCT AA-3 ';
SEQ ID NO: 37 Hs. 112718F, 5'AAG ACT AAG AGG GAA AAT GTG GG-3 ';
SEQ ID NO: 38 Hs. 112718R, 5'AGG TAA CCC AAA GTG ACA AAC CT-3 ';
SEQ ID NO: 39 Hs. 115880F, 5'TTA AGT GAG TCT CCT TGG CTG AG-3 ';
SEQ ID NO: 40 Hs. 115880R, 5'AGG GCC CCT ATA TCC AAT ACC TA-3 ';
SEQ ID NO: 41 Hs. 126495F, 5'GAT CTT TCA AGA TGAGCC AAG GT-3 ';
SEQ ID NO: 42 Hs.126495R, 5'AGT CAT TCA GAA GCCATT GAG AC-3 '
（RT-PCR産物のシグナル強度測定と予後スコアの計算）
PCR産物を、2％のアガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって検出した。ゲルをSpot Density法でデジタル画像処理システム（AlphaImager3300；AlphaInnotech、San Leandro、CA、USA）でスキャンした。各バンドの2次元領域を構築し、その密度をIDV（IntegratedDensityValue）と定義したピクセル強度(遺伝子発現)を得た。各グループにおけるIDVの差異の重要性を、Student'st-テストで評価した。その結果、t-テストで0.05以下のp値を示した20遺伝子を候補として選択した（表２）；すなわち、当該20遺伝子の発現レベルは、5y-Dグループにおいて5y-Sグループに対して有意に高値であった。この情報を用いて、本発明者らは術後予後を予測するスコアリングシステムの確立を試みた。その際、各遺伝子は、各サンプルの発現レベルが20サンプルの平均発現レベルより高いか否かにより決定した。もしサンプルの発現レベルが、平均の2倍以上であるならば、付加的に＋1点を与えた。次に各サンプルのために全票（予後スコア）を得るためにすべての20遺伝子の点を合計した。その結果、8点以上のサンプルの場合は、悪い予後の表示と評価した。他方、8点以下の場合は、好ましい予後を表示していると評価した。
(Signal intensity measurement of RT-PCR product and calculation of prognostic score)
PCR products were detected by 2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. The gel was scanned with a digital image processing system (AlphaImager 3300; Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) with the Spot Density method. A two-dimensional region of each band was constructed, and pixel intensity (gene expression) was defined with the density defined as IDV (IntegratedDensityValue). The importance of IDV differences in each group was assessed with the Student'st-test. As a result, 20 genes that showed a p-value of 0.05 or less in the t-test were selected as candidates (Table 2); that is, the expression level of the 20 genes was significant in the 5y-D group compared to the 5y-S group It was overpriced. Using this information, the inventors attempted to establish a scoring system that predicts postoperative prognosis. At that time, each gene was determined based on whether the expression level of each sample was higher than the average expression level of 20 samples. If the expression level of the sample was more than twice the average, an additional +1 point was given. All 20 gene points were then summed to obtain a full vote (prognostic score) for each sample. As a result, in the case of 8 or more samples, it was evaluated as a poor prognostic indication. On the other hand, when the score was 8 or less, it was evaluated that a favorable prognosis was displayed.
（予後スコアリングシステムの20候補遺伝子） (20 candidate genes for prognostic scoring system)
（結果）
エストロゲンレセプター陰性乳癌組織で、有意に高発現している257遺伝子を明らかにし、同様に低発現している378遺伝子を明らかにした。5y-Dと5y-Sグループ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、マイクロアレイのデータを、Mann-WhitneyテストとRandom-permutationテストにより分析した。
その結果、5y-D腫瘍において全71遺伝子（10 EST と仮想タンパク質をコードしている9遺伝子を含む）が、共通して高発現のグループに分類された。これに対して、15遺伝子（3ESTを含む）が共通して低発現のグループに分類された（図１）。
(result)
In estrogen receptor-negative breast cancer tissue, 257 genes that were significantly expressed were clarified, and 378 genes that were also expressed in a low level were clarified. Microarray data were analyzed by Mann-Whitney test and Random-permutation test to identify genes that expressed differently between 5y-D and 5y-S groups.
As a result, all 71 genes (including 9 genes encoding 10 ESTs and hypothetical proteins) in 5y-D tumors were commonly classified into high-expression groups. On the other hand, 15 genes (including 3EST) were commonly classified into a low expression group (FIG. 1).
5y-Dグループで高発現する遺伝子は、癌細胞の増殖及び転移に関与する以下の遺伝子を含む；matrix metalloproteinase 2（MMP2）、heatshockprotein27 (HSPB 1、Pim-1oncogene （PIM1）及びtransformation/transcriptiondomain-associatedprotein(TRRAP)。
5y-Dグループで低発現する遺伝子は、 HLA-C (major histocompatibility complex, class I, C)及び特異的なキナーゼの遺伝子を含む。ＤＮＡ修復、転写、シグナル伝達、細胞骨格及び接着性と関係がある多くの遺伝子が、2つのグループ間で異なる発現を示した。
Highly expressed genes in the 5y-D group include the following genes involved in cancer cell growth and metastasis; matrix metalloproteinase 2 (MMP2), heatshockprotein27 (HSPB 1, Pim-1oncogene (PIM1), and transformation / transcriptiondomain-associated protein (TRRAP).
Genes that are lowly expressed in the 5y-D group include HLA-C (major histocompatibility complex, class I, C) and specific kinase genes. Many genes related to DNA repair, transcription, signal transduction, cytoskeleton and adhesion showed differential expression between the two groups.
マイクロアレイのデータの信頼性を確かめるために、5y-Dグループで高発現する20遺伝子を選び（ Hs.108504 、Hs.146550 、Hs.194691、Hs.1975、Hs.203952、Hs.278607、Hs.429、Hs.75305 、Hs.81170 、Hs.99987 、Y12781、Hs.104417、 cl.21783、Hs.112628 、Hs.170345、Hs.53996、Hs.55422、Hs.112718、Hs.115880及びHs.126495 ）、半定量RT-PCR によって該遺伝子の発現レベルを調べた。その結果はマイクロアレイのデータと一致し、5y-Dと5y-Sグループを区別するための統計学的な意義を有していた（代表的なデータを図２で示す）。 To confirm the reliability of the microarray data, 20 genes highly expressed in the 5y-D group were selected (Hs.108504, Hs.146550, Hs.194691, Hs.1975, Hs.203952, Hs.278607, Hs. 429, Hs.75305, Hs.81170, Hs.99987, Y12781, Hs.104417, cl.21783, Hs.112628, Hs.170345, Hs.53996, Hs.55422, Hs.112718, Hs.115880 and Hs. 126495), the expression level of the gene was examined by semi-quantitative RT-PCR. The results were consistent with the microarray data and had statistical significance for distinguishing between 5y-D and 5y-S groups (representative data is shown in FIG. 2).
マーカー遺伝子の発現プロフィールを使って、手術後の予後を予測するスコアリングシステムを構築するために、前述の方法で予後スコアを計算した。簡略には、マーカー遺伝子が次の基準に従って選択された；
（１）調べた症例の少なくとも60％でカットオフレベルより高いシグナル強度を示す；
（２）│μD − μS │が1.0以下である。ここでμD（μS）は、5y-D（5y-S）のケースでの対数変換相対発現比率から導かれる平均値示す。
In order to construct a scoring system that uses marker gene expression profiles to predict prognosis after surgery, prognostic scores were calculated as described above. Briefly, marker genes were selected according to the following criteria:
(1) at least 60% of the examined cases show a signal intensity higher than the cut-off level;
(2) | μ D −μ S | is 1.0 or less. Here, μ D (μ S ) represents an average value derived from the logarithmic transformation relative expression ratio in the case of 5y-D (5y-S).
次に、発現機能により 5y-Dグループと 5y-Sグループとを区別することができたマーカー遺伝子を同定するためにMann-Whitney テストとRandom-permutationテストを行った。関連するマイクロアレイの結果を、半定量RT-PCR実験により確認した。Student'st-テストにより、20遺伝子を予後マーカーとして選別した（表２）。 Next, Mann-Whitney test and Random-permutation test were performed to identify marker genes that could distinguish 5y-D group and 5y-S group by expression function. Relevant microarray results were confirmed by semi-quantitative RT-PCR experiments. 20 genes were selected as prognostic markers by Student'st-test (Table 2).
本発明の予後スコア（PS）により、20人の患者を、予後不良と予測される10人（PSが11以上）と、予後良好と予測される10人（PSが11未満）に分けた。その結果、手術後の経過との対比により、本発明のスコアリングシステムは5y-Dケースでは80％、5y-Sケースでは100％の正確さにおいて信頼性があることを示した（図３Ａ）。 According to the prognostic score (PS) of the present invention, 20 patients were divided into 10 (PS is 11 or more) predicted to have a poor prognosis and 10 (PS is less than 11) predicted to have a good prognosis. As a result, it was shown that the scoring system of the present invention is reliable in accuracy of 80% in the 5y-D case and 100% in the 5y-S case by comparison with the course after the operation (FIG. 3A). .
本発明の予後スコアリングシステムを使い、追加5症例について調べた（図３Ｂ ）。 当該システムは、2ケース（PS ＞ 11；患者TD-1、及びTD-2）で不良予後を、3ケース（PS＜11；患者TD-3、TS-1、及びTS-2）で良好予後を予測した。その結果、当該スコアリングシステムは、これら5症例の実際の臨床結果に関して80％の正確性であった。 Using the prognostic scoring system of the present invention, five additional cases were examined (FIG. 3B). The system has a poor prognosis in 2 cases (PS> 11; patients TD-1 and TD-2) and a good prognosis in 3 cases (PS <11; patients TD-3, TS-1 and TS-2) Predicted. As a result, the scoring system was 80% accurate with respect to the actual clinical results of these 5 cases.
node陰性の乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の評価 Evaluation of gene expression function for predicting postoperative prognosis in node-negative breast cancer
（組織サンプル）
組織サンプルは実施例１で記述した手法と同様に採取した。手術後5年以内に再発したnode陰性（ｎ0）癌の患者（5Y-R）12人、及び5年以上の間無病生存した患者（5Y-F）12人からの腫瘍について、遺伝子発現を検討した。両方の患者グループの臨床バックグラウンドは、年齢、リンパ節転移、腫瘍径、ホルモン受容体の状態、及び病理組織において一致させた（表３）。フォローアップの中間期間は、7.8年、最初の手術と再発の間の平均期間は、5Y-Rグループで2.7年であった。尚、すべての患者は実施例１で記載したアジュバント治療を受けた。
(Tissue sample)
Tissue samples were collected in the same manner as described in Example 1. Examination of gene expression in 12 patients with node-negative (n0) cancer (5Y-R) who relapsed within 5 years after surgery and 12 patients who survived disease for more than 5 years (5Y-F) did. The clinical background of both patient groups was matched in age, lymph node metastasis, tumor diameter, hormone receptor status, and histopathology (Table 3). The median follow-up period was 7.8 years, and the average period between the first surgery and relapse was 2.7 years in the 5Y-R group. All patients received the adjuvant treatment described in Example 1.
（臨床病理データ） (Clinical pathology data)
b TNM分類：日本乳癌学会のTNM分類に従って臨床学的に分類された
c D.F.I：発病しない期間（disease free interval）
b TNM classification: clinically classified according to the TNM classification of the Japan Breast Cancer Society
c DFI: Disease free interval
（臨床病理（Clinicopathological）パラメータ）
実施例１で記述した手法で臨床病理パラメータを調べた。組織学的グレードは、Elastonand Ellis（Abrams JS.BreastCancer2001; 8: 298-304.）の方法により評価した。リンパ管浸潤は、欠如か陽性で評価した（例えば、癌周辺のリンパ管に癌細胞が一つ又はそれ以上存在する場合、陽性と評価した）。脂肪浸潤（Fatinvasion）は、欠如か陽性かで評価した（例えば癌が、間質組織にまで浸潤している場合、陽性と評価した）。
(Clinicopathological parameters)
Clinicopathological parameters were examined by the method described in Example 1. Histological grade was evaluated by the method of Elaston and Ellis (Abrams JS. Breast Cancer 2001; 8: 298-304.). Lymphatic invasion was assessed as absent or positive (eg, positive if one or more cancer cells are present in the lymphatic vessels surrounding the cancer). Fat invasion (Fatinvasion) was evaluated by lack or positive (eg, if cancer has invaded stromal tissue, it was evaluated as positive).
（cDNAマイクロアレイの調製）
25,344の cDNAsを有する、”ゲノムワイド cDNAマイクロアレイキット（Amersham Biosciences UK Limited、Buckinghamshire、UK）“を使用した。PCR産物は、ArraySpotterGenerationIII（Amersham Biosciences）を使い、タイプ7ガラススライド（AmershamBiosciences）上にスポットした。
(Preparation of cDNA microarray)
A “genome-wide cDNA microarray kit (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK)” with 25,344 cDNAs was used. PCR products were spotted on Type 7 glass slides (Amersham Biosciences) using ArraySpotter Generation III (Amersham Biosciences).
（RNAの調製と増幅）
実施例１で記述した手法と同様にRNAの調製と増幅を行った。
(RNA preparation and amplification)
RNA was prepared and amplified in the same manner as described in Example 1.
（aRNAの標識、ハイブリダイゼーション及びスキャニング）
実施例１で記述した手法と同様にaRNAのラベリング、ハイブリダイゼーション及びスキャニングを行った。
(ARNA labeling, hybridization and scanning)
In the same manner as described in Example 1, aRNA labeling, hybridization, and scanning were performed.
（Mann-Whitney テスト）
無病及び再発グループ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、正規化したシグナルを、一連のXに適用されたMann-Whitneyテストにより分析した。ここでXは、各遺伝子と各試料についてのCy5/Cy3signal強度比である。2つのグループ間で、発現強度において2倍以上の差異を示す遺伝子を選んだ。3.0以下のシグナル−ノイズ比の遺伝子は分析から除外した。
U値を、両グループの少なくとも5試料で有意のシグナルを与えた各遺伝子について計算した。37より低い或いは107より大きいU値を持つ遺伝子を選択した。U値は、各X値に基づき各遺伝子について5Y-Rグループに対する5Y-Fグループについて計算したので、37より低いU値を持つ遺伝子は、5Y-Rグループに比べて5Y-Fグループで、高発現すると判断した（第一カテゴリー）。一方、107より大きいU値を持つ遺伝子は、5Y-Fグループに比べて5Y-Rグループで、高発現すると判断された（第二カテゴリー）。
この方法で、第一カテゴリーで78遺伝子、第二カテゴリーで55遺伝子を同定した。そこで、2つのグループ間の中間発現値の2倍以上の差異を示したもののみを予後関連遺伝子と定義した（μXR/μXF <0.5あるいは>2.0、ここでμXRとμXFは、各5Y-R又は5Y-Fグループの平均的X値を示す）。全部で、98遺伝子が選ばれ、そのうち64遺伝子が5Y-F腫瘍で高い発現レベルを示し、34遺伝子が5Y-R腫瘍で有意に高い発現レベルを示した。
(Mann-Whitney test)
Normalized signals were analyzed by Mann-Whitney test applied to a series of Xs to identify genes that showed differential expression between disease free and relapse groups. Here, X is the Cy5 / Cy3signal intensity ratio for each gene and each sample. Genes that showed more than a two-fold difference in expression intensity between the two groups were selected. Genes with a signal-to-noise ratio below 3.0 were excluded from the analysis.
U values were calculated for each gene that gave a significant signal in at least 5 samples of both groups. Genes with U values lower than 37 or higher than 107 were selected. U values were calculated for 5Y-F groups versus 5Y-R groups for each gene based on each X value, so genes with U values lower than 37 were higher in the 5Y-F group than in the 5Y-R group. It was judged that it developed (first category). On the other hand, genes with U values greater than 107 were judged to be highly expressed in the 5Y-R group compared to the 5Y-F group (second category).
This method identified 78 genes in the first category and 55 genes in the second category. Therefore, only those that showed a difference of more than twice the intermediate expression value between the two groups were defined as prognostic-related genes (μX R / μX F < 0.5 or > 2.0, where μX R and μX F are Shown are average X values for 5Y-R or 5Y-F groups). In total, 98 genes were selected, 64 of which showed high expression levels in 5Y-F tumors and 34 genes showed significantly higher expression levels in 5Y-R tumors.
（Random-permutationテスト）
Mann-Whitney テストで選ばれた遺伝子の価値を評価するために、permutation テストを行い、そして各選択された遺伝子のグループ差異（Ps）への相関があることを評価した。各遺伝子が、発現ベクターｖ（ｇ）＝（X1、X2、----、X24）（Xiがサンプルの最初のセットでiサンプルの遺伝子の発現レベルを示す）で表現されるとき、理想化した発現パターンがｃ＝（c1、c2、----、c24）（iサンプルがFかRグループに属するかでci＝＋1又は0となる）で表現される。
遺伝子と グループ差異Pgc間の相関は、次のように定義された：すなわち、 Pgc ＝ (μF+μR)/(sF+sR)；μF（μR）と sF（sR）は、新規に定義された”F”又は“R”グループにおいて、各サンプルの該遺伝子”ｇ”のlog2Xの標準偏差を示す。
permutationテストは、ｃの座標を入れ換えることによって行われた。すべてのpermutationの間に、相関値、 Pgcsを計算した。これらの手順は10000回、繰り返して行われた。偶然に、2つのグループを分類する遺伝子の可能性を暗示するp値が、選択された58遺伝子の各々のために評価された。
(Random-permutation test)
In order to evaluate the value of the genes selected in the Mann-Whitney test, a permutation test was performed and evaluated to be correlated to the group difference (Ps) of each selected gene. Idealized when each gene is expressed by the expression vector v (g) = (X1, X2, ----, X24) (Xi represents the expression level of the gene of the i sample in the first set of samples) The expression pattern is expressed as c = (c1, c2, ----, c24) (ci = + 1 or 0 depending on whether the i sample belongs to the F or R group).
The correlation between gene and group difference Pgc was defined as follows: Pgc = (μF + μR) / (sF + sR); μF (μR) and sF (sR) were newly defined In the “F” or “R” group, the log 2 X standard deviation of the gene “g” of each sample is shown.
The permutation test was performed by exchanging the coordinates of c. Correlation values, Pgcs, were calculated between all permutations. These procedures were repeated 10,000 times. Coincidentally, p-values implied the possibility of genes that classify the two groups were evaluated for each of the 58 genes selected.
（半定量RT-PCR）
RNA（5μｇ）を、DNase I （Epicentre Technologies、Madison、WI、USA）（1unit/μl ）で処理後、ReverscriptIIreversetranscriptase（和光純薬(株)、大阪、日本）と0.5μg/μloligo（dT）12-18プライマーを使って単鎖cDNAを逆転写させた。単鎖cDNAsの各調製物を、量的なコントロールとしてGAPDHをモニタリングすることにより、次のPCR増幅のために希釈した。全てのPCRは、GeneAmpPCRシステム9700（AppliedBiosystems、Foster City、CA、USA）を用い、1xPCRバッファー30μl量で以下の反応条件により行った；
94℃2分、
（94℃30秒、58-62℃30秒、及び72℃30秒）を27-35サイクル、
72℃5分。
GAPDHのRT-PCRのためのプライマー配列は以下である:
配列番号43 (forward) 5'-GGA AGG TGA AGG TCG GAG T-3'
配列番号44 (reverse) 5'-TGG GTG GAA TCA TAT TGG AA -3'
(Semi-quantitative RT-PCR)
RNA (5 μg) was treated with DNase I (Epicentre Technologies, Madison, WI, USA) (1 unit / μl), then Reverscript II reverse transcriptase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) and 0.5 μg / μloligo (dT) 12- Single-stranded cDNA was reverse transcribed using 18 primers. Each preparation of single-stranded cDNAs was diluted for subsequent PCR amplification by monitoring GAPDH as a quantitative control. All PCRs were performed using GeneAmpPCR system 9700 (AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA) with 30 μl of 1 × PCR buffer under the following reaction conditions;
94 ° C for 2 minutes,
(94 ° C 30 seconds, 58-62 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 seconds) 27-35 cycles,
72 ° C for 5 minutes.
The primer sequences for GAPDH RT-PCR are:
SEQ ID NO: 43 (forward) 5'-GGA AGG TGA AGG TCG GAG T-3 '
SEQ ID NO: 44 (reverse) 5'-TGG GTG GAA TCA TAT TGG AA -3 '
（半定量PCRのプライマー（無病グループで高発現する遺伝子）） (Semi-quantitative PCR primer (gene highly expressed in disease free group))
（半定量PCRのプライマー（再発グループで高発現する遺伝子）） (Semi-quantitative PCR primer (gene highly expressed in relapse group))
（RT-PCR産物のシグナル強度測定と予後スコアの計算）
RT-PCR産物のシグナル強度を実施例１で記述した手法と同様に測定・評価し、t-テストで0.05以下のp値を示した10遺伝子を候補として選んだ；そのうち3遺伝子の発現レベルは、5y-Fグループに対して5y-Rグループで高かった。そして、7遺伝子の発現レベルは、5y-Rグループに対して5y-Fグループでより高かった。このインフォメーションを使って、node陰性乳癌の術後予後を予測するスコアリングシステムの確立を試みた。
(Signal intensity measurement of RT-PCR product and calculation of prognostic score)
The signal intensity of the RT-PCR product was measured and evaluated in the same manner as described in Example 1, and 10 genes that showed a p-value of 0.05 or less in the t-test were selected as candidates; It was higher in the 5y-R group than in the 5y-F group. And the expression level of 7 genes was higher in 5y-F group than in 5y-R group. Using this information, we attempted to establish a scoring system to predict the postoperative prognosis of node-negative breast cancer.
各遺伝子の対象とする発現レベルを得るために、GAPDH発現に対するその発現比率（ER）を次の式によって計算した；
遺伝子AのER = 癌サンプルXの遺伝子Aの半定量PCR(エチジウムブロマイド染色したバンドの強度) の16-bit のイメージングスコア/癌サンプルXの遺伝子AのGAPDHの16-bitのイメージングスコア
In order to obtain the targeted expression level of each gene, its expression ratio (ER) to GAPDH expression was calculated by the following formula;
ER of gene A = 16-bit imaging score of semiquantitative PCR (intensity of ethidium bromide stained band) of gene A of cancer sample X / 16-bit imaging score of GAPDH of gene A of cancer sample X
（node陰性乳癌の術後予後を予測するスコアリングシステムの定義）
node陰性乳癌の術後の遺伝子予後指標を構築するため、予後スコア（PS）を定義した；（5Y-Fグループに比べて5Y-Rグループで高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計）−（5Y-Rグループに比べて5Y-Fグループで高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計）
(Definition of scoring system to predict postoperative prognosis of node-negative breast cancer)
To establish a postoperative genetic prognostic indicator for node-negative breast cancer, we defined a prognostic score (PS); (the sum of the normalized expression ratios of genes highly expressed in the 5Y-R group compared to the 5Y-F group) − (Total normalized expression ratio of genes highly expressed in 5Y-F group compared to 5Y-R group)
2つのグループ間の発現比の有意さはStudent's t-テストで評価した。全ての統計手法は、Statview version 5.0（SASInstitute、Cary、NC）によった。 The significance of the expression ratio between the two groups was evaluated by Student's t-test. All statistical methods were based on Statview version 5.0 (SAS Institute, Cary, NC).
（結果）
ゲノムワイドな遺伝子発現を検討した24の乳がん患者の臨床病理所見を表３に要約した。本発明者らは、手術後5年以上の間無病生存した12例のnode陰性乳癌患者（5Y-F）、及び外科手術の後に5年の内に乳癌が再発した12例のnode陰性乳癌患者（5Y-R）からの腫瘍について、25,344のヒト遺伝子から構成されるcDNAマイクロアレイによる遺伝子発現を検討した。臨床のバックグラウンドは、2つのグループの間で、年齢、腫瘍径、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体、及び病理学的に合致させた。
(result)
Table 3 summarizes the clinicopathological findings of 24 breast cancer patients who examined genome-wide gene expression. We have 12 node-negative breast cancer patients (5Y-F) who survived disease more than 5 years after surgery, and 12 node-negative breast cancer patients whose breast cancer recurred within 5 years after surgery For tumors from (5Y-R), gene expression was examined using a cDNA microarray composed of 25,344 human genes. Clinical background was matched between the two groups in age, tumor diameter, estrogen and progesterone receptors, and pathologically.
cDNA マイクロアレイ のデータを、Mann-Whitney テストとRandom-permutationテストにより分析し、5Y-R及び5Y-F腫瘍間で異なる発現を示す遺伝子を同定した。このフィルターで全58遺伝子を選び、そのうち21遺伝子が5Y-R腫瘍で有意に強く発現した。そして37遺伝子が5Y-F腫瘍で高い発現レベルを示した。 cDNA microarray data were analyzed by Mann-Whitney test and Random-permutation test to identify genes that expressed differently between 5Y-R and 5Y-F tumors. All 58 genes were selected with this filter, 21 of which were significantly strongly expressed in 5Y-R tumors. And 37 genes showed high expression level in 5Y-F tumor.
5Y-R 腫瘍に比べて5Y-F腫瘍で高発現する37遺伝子には、6つのESTs と1つの仮想たんぱく質があった（表５Ａ、各グループ間での発現の差異を“foldchange”として示す）。 The 37 genes that are highly expressed in 5Y-F tumors compared to 5Y-R tumors had 6 ESTs and 1 hypothetical protein (Table 5A, expression differences between groups are shown as “foldchange”) .
（5Y-R腫瘍に比べて5Y-F腫瘍で有意に高発現する遺伝子） (Genes that are significantly higher expressed in 5Y-F tumors than in 5Y-R tumors)
表５Ｂ は5Y-Rグループ において高発現する21遺伝子をリストにした。その5つがESTs で、一つが仮想たんぱく質をコードする。58遺伝子のこのパネルから、次のような基準で術後予後のマーカーを選んだ；（１）症例の少なくとも60％に位置するカットオフレベルより高いシグナル強度をもつ；（２）|μR-μF|>1.0、ここでμR(μF)は、5Y-R又は5Y-F症例における対数変換発現比率から導かれる平均値示す。 Table 5B lists 21 genes that are highly expressed in the 5Y-R group. Five of them are ESTs, and one encodes a virtual protein. From this panel of 58 genes, postoperative prognostic markers were selected according to the following criteria: (1) with signal intensity higher than the cut-off level located in at least 60% of cases; (2) | μR-μF |> 1.0, where μR (μF) represents an average value derived from the logarithmic transformation expression ratio in 5Y-R or 5Y-F cases.
（5Y-F腫瘍に比べて5Y-R腫瘍で有意に高発現する遺伝子） (Genes that are significantly higher expressed in 5Y-R tumors than in 5Y-F tumors)
5Y-Rに比べ5Y-F腫瘍で高発現する7遺伝子 (Hs.94653、M13436、Hs.5002、D67025、M80469、Hs.4864、及びHs.106326；p=0.0018、0.0011、0.001、0.008、0.0081、0.0018及び0.001；各Student'st-テストによる)及び5Y-R腫瘍で比較的高発現する3遺伝子（AF058701、AI066764、及びx15940；p=0.0351、0.00161及び0.0001；各Student'st-テストによる）が基準に合致し、予後マーカーとして選択した（表６）。 7 genes highly expressed in 5Y-F tumor compared to 5Y-R (Hs.94653, M13436, Hs.5002, D67025, M80469, Hs.4864, and Hs.106326; p = 0.0018, 0.0011, 0.001, 0.008, 0.0081 , 0.0018 and 0.001; according to each Student'st-test) and 3 genes relatively highly expressed in 5Y-R tumors (AF058701, AI066764 and x15940; p = 0.0351, 0.00161 and 0.0001; according to each Student'st-test) Met criteria and was selected as a prognostic marker (Table 6).
（node陰性乳癌の予後マーカーとして選別した遺伝子） (Gene selected as a prognostic marker for node-negative breast cancer)
GAPDH発現に対する正規化後半定量RT-PCR実験でこれらのマーカーの発現を確認した。図３は、乳癌再発（5Y-Rグループ）の12患者からのサンプルで高発現する3つのマーカー遺伝子のRT-PCRの結果を示す。図４は、5Y-F（5年生存）グループで高発現する7つのマーカー遺伝子の結果を示す。これら10遺伝子の発現比率を予後指標の定義に用いた。 The expression of these markers was confirmed in a late-quantitative quantitative RT-PCR experiment for GAPDH expression. FIG. 3 shows RT-PCR results of three marker genes highly expressed in samples from 12 patients with breast cancer recurrence (5Y-R group). FIG. 4 shows the results of 7 marker genes highly expressed in the 5Y-F (5 year survival) group. The expression ratio of these 10 genes was used to define the prognostic index.
予後スコア (PS)を次のように定義した；
PS = （5Y-R腫瘍で高発現する3遺伝子の正規化した発現比率の合計）− （5Y-F腫瘍で高発現する7遺伝子の正規化した発現比率の合計）
Prognostic score (PS) was defined as:
PS = (sum of normalized expression ratios of 3 genes highly expressed in 5Y-R tumors)-(sum of normalized expression ratios of 7 genes highly expressed in 5Y-F tumors)
検討した24ケースの予後スコアを、各マーカー遺伝子の発現比率と共に、表７に要約した。PSシステムは、3より高い予後スコアを有する症例R1からR12については、不良予後を予測した。一方、-16より低いスコアの症例F1からF12については、良好予後を予測した。この予測は、実際のこれらの臨床結果と、100％の正確性で一致した（図５）。5Y-Rグループの平均PSは9.44、そして5Y-Fグループの平均PSは-28.92であった。 The prognostic scores of the 24 cases examined are summarized in Table 7 together with the expression ratio of each marker gene. The PS system predicted a poor prognosis for cases R1 to R12 with a prognostic score higher than 3. On the other hand, good prognosis was predicted for cases F1 to F12 with a score lower than -16. This prediction matched 100% accuracy with these actual clinical results (FIG. 5). The average PS for the 5Y-R group was 9.44, and the average PS for the 5Y-F group was -28.92.
（node陰性乳癌再発の予後スコア） (Prognosis score of node-negative breast cancer recurrence)
原発性乳癌における術後予後予測の遺伝子発現機能の評価 Evaluation of gene expression function in predicting postoperative prognosis in primary breast cancer
（組織サンプル）
組織サンプルは実施例１記載の手法と同様に採取した。1995-1997年の期間において、乳癌のための手術を受けて、5年以上の間または死亡時まで臨床的に追跡調査された954人の患者の中から、手術後5年以内に死亡した10例と手術後5年以上の間無病生存した10例を標本として選んだ。2つの患者グループの臨床背景は年齢、リンパ節への転移、腫瘍径と組織型に関して、可能な限り厳密に一致させた（表８）。最終的な予知システムをテストするのに用いた追加20ケースの臨床背景を表９に要約した。
(Tissue sample)
Tissue samples were collected in the same manner as described in Example 1. During the period 1995-1997, those who died within 5 years after surgery out of 954 patients who had undergone surgery for breast cancer and were clinically followed for more than 5 years or until death We selected 10 cases and 10 cases who survived disease more than 5 years after surgery. The clinical backgrounds of the two patient groups were matched as closely as possible in terms of age, lymph node metastasis, tumor diameter and histology (Table 8). The clinical background of the additional 20 cases used to test the final prediction system is summarized in Table 9.
（マイクロアレイ分析に用いた患者の臨床的プロフィール） (Patient clinical profile used for microarray analysis)
（RT-PCR分析に用いた患者の臨床的プロフィール） (Clinical profile of patients used for RT-PCR analysis)
（臨床病理（Clinicopathological）パラメータ）
実施例１で記術した手法で臨床病理パラメータを調べた。
(Clinicopathological parameters)
Clinicopathological parameters were examined by the technique described in Example 1.
（cDNAマイクロアレイの調製）
実施例２で記述した手法でcDNAマイクロアレイの調製を行った。
(Preparation of cDNA microarray)
A cDNA microarray was prepared by the method described in Example 2.
（RNA抽出とRNA増幅）
RNAをTRIzol（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で抽出した。変性RNAを除去するため、各々の抽出されたRNA（1μｇ）を、3.0%ホルムアルデヒド変性ゲル上で電気泳動した。DNA混入を除去するため、RNeasyキット（QIAGEN、Valencia、CA）を用いて精製した。MessageAmpaRNAキット（Ambion、Austin、TX）によるT7ＲＮＡポリメラーゼベースの増幅を行い、マイクロアレイ分析に用いるRNAを調製した。最初の増幅では、RNA（5μg）を鋳型として用いた。その後、最初に増幅されたRNA（aRNA）（2μg）を、二回目の増幅のための鋳型とした。増幅されたaRNAsはRNeasy精製キットで精製し、各aRNAの量を分光光度計により測定した。
(RNA extraction and RNA amplification)
RNA was extracted with TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). In order to remove denatured RNA, each extracted RNA (1 μg) was electrophoresed on a 3.0% formaldehyde denaturing gel. To remove DNA contamination, it was purified using the RNeasy kit (QIAGEN, Valencia, CA). T7 RNA polymerase-based amplification with MessageAmpaRNA kit (Ambion, Austin, TX) was performed to prepare RNA for microarray analysis. In the initial amplification, RNA (5 μg) was used as a template. Thereafter, the first amplified RNA (aRNA) (2 μg) was used as a template for the second amplification. The amplified aRNAs were purified with the RNeasy purification kit, and the amount of each aRNA was measured with a spectrophotometer.
（aRNAの標識、ハイブリダイゼーション及びデータ分析）
Amino Allyl cDNA 標識キット（Ambion、Austin、TX）により、二回目の増幅による蛍光プローブ作成用aRNA（5μｇ）を用いて、ハイブリダイゼーションプローブを作成した。癌RNA及び正常なコントロールRNAに由来するプローブを、Cy5またはCy3のMono-Reactive'Dye（AmershamBioscienceUK Limited、Buckinghamshire、UK）で各々標識した。
(ARNA labeling, hybridization and data analysis)
Hybridization probes were prepared using the amino allyl cDNA labeling kit (Ambion, Austin, TX) with aRNA (5 μg) for fluorescent probe preparation by the second amplification. Probes derived from cancer RNA and normal control RNA were each labeled with Cy5 or Cy3 Mono-Reactive'Dye (Amersham Bioscience UK Limited, Buckinghamshire, UK).
非結合色素を除去するために、標識プローブを、QIA quick PCR精製キット（QIAGEN、Valencia、CA）で精製した。腫瘍及び正常RNAからの蛍光標識プローブの各々10pmolを、4xマイクロアレイハイブリダイゼーション・バッファー（Amersham（UK））及び脱イオン化したホルムアミドと混合した。プローブ混合物を、40℃で15時間cDNAアレイにハイブリダイズさせた。その後、5分間で1回、その後10分間で2回にわたり0.2%SDSを含む0.1xSSCで洗浄した。全ての手順は、AutomatedSlideProcessorSystem（Amersham）で実行した。それぞれのハイブリダイゼーションのシグナル強度は、Gene Pix 4000（Amersham）で読み取り、GenePixPro3.0（Axon Instruments, Inc.、Foster City、CA、USA）によって評価した。読み取ったシグナルは、totalgenenormalizationmethod（Yang,Y.H.,Dudoit,S., Luu, P., Lin, D.M., Peng, V.,Ngai,J., and Speed,T.P. (2002). Nucleic Acids Res 30, e15.；Manos, E.J., andJones,D.A.(2001).Cancer Res 61, 433-438. ）によって正規化した。 To remove unbound dye, the labeled probe was purified with a QIA quick PCR purification kit (QIAGEN, Valencia, CA). 10 pmol each of fluorescently labeled probes from tumor and normal RNA were mixed with 4x microarray hybridization buffer (Amersham (UK)) and deionized formamide. The probe mixture was hybridized to the cDNA array at 40 ° C. for 15 hours. Thereafter, the cells were washed with 0.1 × SSC containing 0.2% SDS once for 5 minutes and then twice for 10 minutes. All procedures were performed with an Automated Slide Processor System (Amersham). The signal intensity of each hybridization was read with Gene Pix 4000 (Amersham) and evaluated by GenePixPro3.0 (Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA). The signal read was totalgenenormalizationmethod (Yang, YH, Dudoit, S., Luu, P., Lin, DM, Peng, V., Ngai, J., and Speed, TP (2002). Nucleic Acids Res 30, e15. Manos, EJ, and Jones, DA (2001). Cancer Res 61, 433-438.
生存者と死亡者のグループ間で異なる発現を示す遺伝子を確認するために、正規化したシグナルを、Mann-Whitneyテストで分析した；正規化したシグナルを一連のXに適用した。Xとはそれぞれの遺伝子及びサンプルのためのCy5/Cy3シグナル強度比率である（Ono,K.,etal.(2000).Cancer Res 60, 5007-5011.）。Mann-Whitneyテストで0のＵ値を示した遺伝子と2つのグループ間で発現強度が2.0倍以上の違いを示したものを選んだ。S/N比が3.0未満の遺伝子は、検討から除外した。 In order to identify genes that expressed differently between survivor and death groups, the normalized signal was analyzed with the Mann-Whitney test; the normalized signal was applied to a series of Xs. X is the Cy5 / Cy3 signal intensity ratio for each gene and sample (Ono, K., etal. (2000). Cancer Res 60, 5007-5011.). The genes that showed a U value of 0 in the Mann-Whitney test and those that showed a difference of more than 2.0 times in expression intensity between the two groups were selected. Genes with an S / N ratio of less than 3.0 were excluded from the study.
（半定量RT-PCR及び遺伝子発現比率）
マイクロアレイのデータを検証するため、本発明者らはRNA（10μg）を逆転写することにより、半定量RT-PCR実験をした。転写されたcDNAの濃度を調整するため、GAPDHを内部コントロールとして選び、半定量RT-PCRを実行した（Ono,K.,etal.(2000).CancerRes 60,5007-5011.）。GAPDHのプライマーは、5'-ggaaggtgaaggtcggagt-3（Foward）、及び5-tgggtggaatcatattggaa-3（Reverse）であった。プライマーの濃度を調整した後に、半定量RT-PCRを生存者と死亡者のグループからのサンプルで、選別した遺伝子について実行した。当該遺伝子（表１０）の各々のためのプライマーは、NCBIGenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のシーケンス情報とウェブサイト（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）上のプライマー3に基づいて設計した。各半定量PCR実験は、テンプレートとして濃度を調整したcDNA（1μl）、5UのTakaraEXTaq（Takara、大津、日本）、1xPCRバッファー（10mMのTris-HCl、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2）、10nMのdNTPsと10pmolの前方及び後方プライマーで30μl総量にて行った。
配列番号160 ggaaggtgaaggtcggagt
配列番号161 tgggtggaatcatattggaa
(Semi-quantitative RT-PCR and gene expression ratio)
In order to validate the microarray data, we performed semi-quantitative RT-PCR experiments by reverse transcribing RNA (10 μg). In order to adjust the concentration of the transcribed cDNA, GAPDH was selected as an internal control and semi-quantitative RT-PCR was performed (Ono, K., etal. (2000). CancerRes 60, 5007-5011.). GAPDH primers were 5′-ggaaggtgaaggtcggagt-3 (Foward) and 5-tgggtggaatcatattggaa-3 (Reverse). After adjusting the primer concentration, semi-quantitative RT-PCR was performed on the selected genes with samples from groups of survivors and deaths. Primers for each of the genes (Table 10) are NCBIGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sequence information and website (http://www-genome.wi.mit. edu / cgi-bin / primer / primer3_www.cgi) based on primer 3. Each semi-quantitative PCR experiment consisted of a template-adjusted cDNA (1 μl), 5 U TakaraEXTaq (Takara, Otsu, Japan), 1 × PCR buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 ), 10 nM The total amount of dNTPs and 10 pmol of front and rear primers was 30 μl.
SEQ ID NO: 160 ggaaggtgaaggtcggagt
SEQ ID NO: 161 tgggtggaatcatattggaa
（半定量ＰＣＲのプライマー） (Primer for semi-quantitative PCR)
生存者と死亡者のグループの間で遺伝子発現の強度を評価するために、各半定量PCR産物（8μl）を、2.5%アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。各々の染色されたサンプルの強度は、バックグラウンド校正を用いてAlphaImager3300（Alpha Inonotech、San Leandro、CA）により測定した。各遺伝子の発現レベルを得るために、その発現比率を、GAPDHの発現レベルで正規化した。 In order to assess the intensity of gene expression between survivor and dead groups, each semi-quantitative PCR product (8 μl) was electrophoresed on a 2.5% agarose gel and stained with ethidium bromide. The intensity of each stained sample was measured with an AlphaImager 3300 (Alpha Inonotech, San Leandro, Calif.) Using background calibration. In order to obtain the expression level of each gene, the expression ratio was normalized with the expression level of GAPDH.
発現比率は、以下の公式によって定義された：遺伝子Aの発現比率 = 癌サンプルX 中の遺伝子Aの半定量PCRの16ビットのイメージングスコア（エチジウムブロマイドで染色したバンドの強度）/癌サンプルX中のGAPDHの16ビットのイメージングスコア Expression ratio was defined by the following formula: expression ratio of gene A = 16-bit imaging score of semi-quantitative PCR of gene A in cancer sample X (band intensity stained with ethidium bromide) / in cancer sample X GAPDH 16-bit imaging score
（原発性乳癌の予後指標（PI）の定義）
本発明者らは、5Ｓグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計から、5Dのグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計を差し引くことにより、原発性乳癌の予後指標（PI）を定義した。2つのグループ間の発現比率の有意性はStudent'st-テストで評価した。5S及び5Dのグループ間のPIの比較はMann-Whitneyテストにより行った。全ての統計はStatviewversion5.0を使って保管した（SASInstitute Inc.、Cary、NC）。
(Definition of prognostic index (PI) for primary breast cancer)
By subtracting the sum of the normalized expression ratios of genes highly expressed in the 5D group from the sum of the normalized expression ratios of genes highly expressed in the 5S group, the present inventors have established a prognostic index for primary breast cancer. (PI) was defined. Significance of the expression ratio between the two groups was evaluated by Student'st-test. Comparison of PI between 5S and 5D groups was performed by Mann-Whitney test. All statistics were stored using Statview version 5.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
（結果）
18,432のヒト遺伝子からなるcDNAマイクロアレイ上で、8人の乳癌患者からの腫瘍のゲノムワイドな遺伝子発現機能を調べた。患者のうちの4人は手術後5年以上の間無病生存し（5S）、4人は5年以内で、乳癌で死亡した（5D）。臨床病理学的背景は、2つのグループ間で年齢、腫瘍径、リンパ節転移、ホルモンレセプター状態と組織型について可能な限り厳密に一致させた（表８）。
(result)
The genome-wide gene expression function of tumors from 8 breast cancer patients was examined on a cDNA microarray consisting of 18,432 human genes. Four of the patients survived disease more than 5 years after surgery (5S) and 4 died of breast cancer within 5 years (5D). Clinicopathological background was matched as closely as possible between the two groups for age, tumor diameter, lymph node metastasis, hormone receptor status and tissue type (Table 8).
5Dと5Sのグループ間で異なる発現を示す遺伝子を同定するために、本発明者らはMann-Whitney テストによってcDNA マイクロアレイのデータを分析した。これらの遺伝子のうちの6つのESTs/仮想タンパク質である合計23遺伝子は、Mann-Whitneyテストで0のU値を示し、5Sグループにおいて高発現する遺伝子である（表１１）。 To identify genes that expressed differently between 5D and 5S groups, we analyzed cDNA microarray data by the Mann-Whitney test. Of these genes, a total of 23 genes, which are 6 ESTs / virtual proteins, are U-values of 0 in the Mann-Whitney test and are highly expressed in the 5S group (Table 11).
（マイクロアレイ分析の解析による生存グループで高発現する遺伝子群） (A group of genes that are highly expressed in the survival group by microarray analysis)
表１２は、5Dの腫瘍において一般に高発現しており、6つのESTs/仮想タンパク質を含み、Mann-Whitney テストでゼロのU値を持つ21遺伝子を記載する。表において、“foldchange”として、2つのグループ間の遺伝子発現の違いを示す。 Table 12 lists 21 genes that are generally highly expressed in 5D tumors, contain 6 ESTs / virtual proteins, and have a U value of zero in the Mann-Whitney test. In the table, “foldchange” indicates the difference in gene expression between the two groups.
（マイクロアレイ分析の解析による死亡グループで高発現する遺伝子群） (A gene group that is highly expressed in the death group by microarray analysis)
5Sグループにおいて高発現する23遺伝子及び5Dグループにおいて高発現する21遺伝子から、以下の基準に従って術後予後の予測マーカーを選んだ；（１）マイクロアレイ分析では、全ての症例の5S及び5D間のシグナル強度の違いが2.0倍より大きい；（２）半定量PCRの5S及び5D間のシグナル強度が有意に異なる（Student'st-テストによるp値<0.05）；（３）半定量PCRの結果は、独立した3回の実験によって再確認した。5S腫瘍において高発現する7遺伝子、及び5D腫瘍において高発現する3遺伝子は予後マーカーを選択するこれらの基準を満たした。 From 23 genes highly expressed in the 5S group and 21 genes highly expressed in the 5D group, predictive markers for postoperative prognosis were selected according to the following criteria: (1) In microarray analysis, signals between 5S and 5D in all cases Difference in intensity is greater than 2.0 times; (2) Signal intensity between 5S and 5D of semi-quantitative PCR is significantly different (p value <0.05 by Student'st-test); (3) Results of semi-quantitative PCR are: Reconfirmed by three independent experiments. Seven genes highly expressed in 5S tumors and three genes highly expressed in 5D tumors met these criteria for selecting prognostic markers.
5Sグループにおいて高発現する7遺伝子は、pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、complement component C1r、dihydropyrimidinase-like 3（DPYSL3）、proteintyrosinekinase9-like（PTK9L）、carboxypeptidase E（CPE）、α-tubulinとβ-tubulinをコードしている遺伝子から構成されている。これらのマーカー遺伝子のStudent'st-テストのp値は、それぞれ0.00039、0.0012、0.0042、0.036、0.039、0.034と0.00069であった。 Seven genes highly expressed in 5S group are pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP), complement component C1r, dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3), proteintyrosinekinase9-like (PTK9L), carboxypeptidase E (CPE), α-tubulin And a gene encoding β-tubulin. The Student's-test p-values for these marker genes were 0.00039, 0.0012, 0.0042, 0.036, 0.039, 0.034 and 0.00069, respectively.
5Dグループにおいて高発現する3つのマーカー遺伝子は、heat shock protein HSP 90-alpha gene、malatedehydrogenase、及びNADHdehydrogenase(ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)をコードしていた。当該遺伝子のStudent'st-テストのp値は、それぞれ0.05、0.0055及び0.011であった。 Three marker genes highly expressed in the 5D group encoded heat shock protein HSP 90-alpha gene, malatedehydrogenase, and NADHdehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3). The p value of Student'st-test for the gene was 0.05, 0.0055 and 0.011, respectively.
本発明者らは、半定量RT-PCRの実験結果を、内部コントロールとしてGAPDHで正規化し評価することによりマーカー遺伝子の選択を検証した。 The present inventors verified the selection of marker genes by normalizing and evaluating the results of semi-quantitative RT-PCR with GAPDH as an internal control.
本発明者らは無作為に選んだ追加20症例を調べるために半定量PCRを行った。これらの患者のうちの10人は手術後5年以内に乳癌で死亡し、そして、残りの10人は5年以上の間無病生存した。図７は、5S腫瘍において高発現する7つのマーカー遺伝子のRT-PCRの結果を示す。図８は、5D腫瘍において高発現する3つのマーカー遺伝子のRT-PCRの結果示す。 We performed semi-quantitative PCR to examine 20 additional randomly selected cases. Ten of these patients died of breast cancer within 5 years after surgery, and the remaining 10 survived disease-free for more than 5 years. FIG. 7 shows RT-PCR results of seven marker genes that are highly expressed in 5S tumors. FIG. 8 shows the results of RT-PCR of three marker genes that are highly expressed in 5D tumors.
本発明者らは、次のように予後指標（PI）を定義した：（5Sグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計）−（5Dグループにおいて高発現する遺伝子の正規化した発現比率の合計）。選ばれたマーカー遺伝子の発現比率と共に、更なる試験例のための予後指標を、表１３にまとめた。 We defined prognostic indicators (PI) as follows: (sum of normalized expression ratios of genes highly expressed in 5S group)-(normalized expression of genes highly expressed in 5D group) Sum of ratio). Table 13 summarizes the prognostic indicators for further test examples along with the expression ratios of the selected marker genes.
（遺伝子の発現比率と予後指標） (Gene expression ratio and prognostic index)
PIは、5Sグループの全10症例（S1からS10）の高い予後指標（>7）及び5Ｄグループの全10症例（D1からD10）の予後指標（<7）（図9）の実際の臨床結果を正確に予測した。5SグループのPIは21.2であった、そして、5DグループのPIは-0.7であった。ここでPI値7は、明らかに5S腫瘍と5D腫瘍を区別していた（p=0.0002）。 PI is the actual clinical outcome of the high prognostic index (> 7) in all 10 cases (S1 to S10) in the 5S group and the prognostic index (<7) in all 10 cases (D1 to D10) in the 5D group (Figure 9) Was accurately predicted. The 5S group PI was 21.2 and the 5D group PI was -0.7. Here, a PI value of 7 clearly distinguished 5S and 5D tumors (p = 0.0002).
本発明の術後予後予測システムは、乳癌患者の術後リスクの予測に有効である。さらに、本発明の乳癌関連遺伝子の広範囲に及び遺伝子発現リストは乳癌の進行についての様々な情報を提供するとともに、乳癌治療の潜在的ターゲット分子の予測が可能となる。 The postoperative prognosis prediction system of the present invention is effective in predicting the postoperative risk of breast cancer patients. In addition, the broad range of breast cancer-related genes of the present invention and gene expression lists provide a variety of information about breast cancer progression and allow prediction of potential target molecules for breast cancer treatment.
Claims (19)
１）エストロゲンレセプター陰性の乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5y-Dグループ）と数年以上無病（disease-free）生存した患者からの遺伝子（5y-Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
２）手術時にリンパ節への転移がなかった（node陰性）（n0）乳癌において、手術後5年以内に再発したn0乳癌患者からの遺伝子（5Y-Rグループ）と5年以上の間無病生存した患者からの遺伝子（5Y-Fグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。
３）原発性乳癌において、外科手術後5年以内に死亡した乳癌患者からの遺伝子（5Dグループ）と数年以上無病生存した患者からの遺伝子（5Sグループ）とが、その発現機能によって区別することができたマーカー遺伝子群。 A gene comprising at least one of the following definitions involved in predicting postoperative prognosis of breast cancer;
1) Genes from breast cancer patients who died within 5 years after surgery (5y-D group) and genes from patients who have survived disease-free for more than a few years (5y-S group) ) And marker gene groups that could be distinguished by their expression functions.
2) No lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0) Breast cancer patients who relapsed within 5 years after surgery (5Y-R group) and disease-free survival for more than 5 years Marker gene group that can be distinguished from the gene (5Y-F group) from the selected patient by its expression function.
3) In primary breast cancer, a gene from a breast cancer patient who died within 5 years after surgery (5D group) and a gene from a patient who survived disease-free for more than a few years (5S group) should be distinguished by their expression function. Marker gene group
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin、
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。 A gene selected from the following sequences involved in the postoperative prognosis prediction of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin,
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP)、
complement component C1r、
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3)、
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L)、
carboxypeptidase E (CPE)、
alpha-tubulin、
beta-tubulin。 A gene selected from the following highly expressed in a good-prognostic group involved in the prediction of postoperative prognosis of primary breast cancer;
pro-alpha-1 type 3 collagen (PIIIP),
complement component C1r,
dihydropyrimidinase-like 3 (DPYSL3),
protein tyrosine kinase 9-like (PTK9L),
carboxypeptidase E (CPE),
alpha-tubulin,
beta-tubulin.
heat shock protein HSP 90-alpha gene、
malate dehydrogenase、
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3)。 A gene selected from the following that is highly expressed in a poor prognosis group involved in postoperative prognosis of primary breast cancer;
heat shock protein HSP 90-alpha gene,
malate dehydrogenase,
NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta subcomplex, 3 (NDUFB3).
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31.、
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。 A gene selected from the following sequences involved in the prediction of postoperative prognosis in breast cancer with no lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0);
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
AF058701/ DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3) 、
AI066764/ lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)、
x15940/ ribosomal protein L31.。 Genes selected from the following that are highly expressed in the poor prognosis group involved in postoperative prognosis in breast cancer with no lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0);
AF058701 / DNA polymerase zeta catalytic subunit (REV3),
AI066764 / lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1),
x15940 / ribosomal protein L31.
Hs.94653/ neurochondrin(KIAA0607)、
M13436/ ovarian beta-A-inhibin、
Hs.5002/ copper chaperone for superoxide dismutase; CCS、
D67025/ proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3、
M80469/ MHC class I HLA-J gene、
Hs.4864/ ESTs、
Hs.106326/ ESTs。 A gene selected from the following that is highly expressed in a good-prognostic group involved in postoperative prognosis in breast cancer with no lymph node metastasis at the time of surgery (node negative) (n0);
Hs.94653 / neurochondrin (KIAA0607),
M13436 / ovarian beta-A-inhibin,
Hs.5002 / copper chaperone for superoxide dismutase; CCS,
D67025 / proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 3,
M80469 / MHC class I HLA-J gene,
Hs.4864 / ESTs,
Hs.106326 / ESTs.
Hs.108504/ FLJ20113/ ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550/ MYH9/ myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs.194691/ RAI3/ retinoic acid induced 3
Hs.1975/ TDRD3/ tudor domain containing 3
Hs.203952/ TRRAP/ transformation/transcription domain-associated protein
Hs.278607/ GSA7/ ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429/ ATP5G3/
ATP synthase, H+transporting,mitochondrialF0complex,subunitc(subunit9)isoform3
Hs.75305/ AIP/ aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170/ PIM1/ pim-1 oncogene
Hs.99987/ ERCC2/
excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency,complementationgroup2
Y12781/ Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417/ KIAA1205 protein
cl.21783/ Hypothetical protein
Hs.112628/ Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345/ Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996/ weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422/ Hypothetical protein
Hs.112718/ EST
Hs.115880/ EST
Hs.126495/ EST A gene selected from the following sequences involved in postoperative prognosis prediction in estrogen receptor negative breast cancer;
Hs.108504 / FLJ20113 / ubiquitin-specific protease otubain 1
Hs.146550 / MYH9 / myosin, heavy polypeptide 9, non-muscle
Hs. 194691 / RAI3 / retinoic acid induced 3
Hs. 1975 / TDRD3 / tudor domain containing 3
Hs.203952 / TRRAP / transformation / transcription domain-associated protein
Hs.278607 / GSA7 / ubiquitin activating enzyme E1-like protein
Hs.429 / ATP5G3 /
ATP synthase, H + transporting, mitochondrialF0complex, subunitc (subunit9) isoform3
Hs.75305 / AIP / aryl hydrocarbon receptor interacting protein
Hs.81170 / PIM1 / pim-1 oncogene
Hs.99987 / ERCC2 /
excision repaircross-complementingrodentrepairdeficiency, complementationgroup2
Y12781 / Transducin (beta) like 1 protein
Hs.104417 / KIAA1205 protein
cl.21783 / Hypothetical protein
Hs.112628 / Hypothetical protein: MGC43581
Hs.170345 / Hypothetical protein FLJ13710
Hs.53996 / weakly similar to zinc finger protein 135
Hs.55422 / Hypothetical protein
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Hs.115880 / EST
Hs.126495 / EST
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