JP2005265584A - Biosensor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection surface for a biosensor suppressing nonspecific adsorption, while keeping protein immobilizing function. <P>SOLUTION: This biosensor is characterized as follows: the substrate surface is coated by a hydrophobic polymer compound; a linker is bonded to the surface; and the linker is activated so as to include a charged group and a reactive leaving group. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。   The present invention relates to a biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor. In particular, the present invention relates to a biosensor for use in a surface plasmon resonance biosensor and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the biosensor.

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。   Currently, many measurements using intermolecular interactions such as immune reactions are performed in clinical examinations, etc., but conventional methods require complicated operations and labeling substances, so measurement without the need for labeling substances Several techniques that can detect a change in the amount of a substance bound with high sensitivity are used. For example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, and measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles. SPR measurement technology detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the metal film of the chip by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. The QCM measurement technique is a technique capable of detecting the adsorption / desorption mass at the ng level from the change in the frequency of the oscillator due to the adsorption / desorption of a substance on the gold electrode (device) of the crystal oscillator. In addition, by functionalizing the surface of gold ultrafine particles (nm level), immobilizing a physiologically active substance on the surface, and performing a specific recognition reaction between the physiologically active substances, it is possible to obtain a living body from the sedimentation and arrangement of gold fine particles. Related substances can be detected.

上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。   In any of the above techniques, the surface on which the physiologically active substance is immobilized is important. Hereinafter, the surface plasmon resonance (SPR) most used in this technical field will be described as an example.

一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。   A commonly used measurement chip is composed of a transparent substrate (eg, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, and the metal surface is interposed through the functional group. Immobilize physiologically active substances. The interaction between biomolecules is analyzed by measuring a specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance.

生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。   As a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, a functional group capable of binding to a metal, a linker having a chain length of 10 or more atoms, and a compound having a functional group capable of binding to a physiologically active substance, A measurement chip in which an active substance is immobilized has been reported (see Patent Document 1). In addition, a measurement chip comprising a metal film and a plasma polymerization film formed on the metal film has been reported (see Patent Document 2).

一方、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定する場合、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。   On the other hand, when measuring a specific binding reaction between a physiologically active substance and a sample substance, the sample substance is not necessarily a single component, and for example, the sample substance may be measured in a heterogeneous system such as in a cell extract. Required. In that case, when various kinds of contaminants such as proteins and lipids cause nonspecific adsorption on the detection surface, the measurement and detection sensitivity is remarkably lowered. The above detection surface has a problem that non-specific adsorption is very likely to occur.

この問題を解決するためにいくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面にリンカーを介し、親水性のハイドロゲルを固定化することで、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１、特許文献３及び特許文献４を参照）。しかしながら、この方法でも非特異吸着の抑制性は十分なレベルではなかった。   Several methods have been investigated to solve this problem. For example, a method of suppressing physical adsorption by immobilizing a hydrophilic hydrogel on a metal surface via a linker has been used (see Patent Document 1, Patent Document 3, and Patent Document 4). However, even with this method, the suppression of nonspecific adsorption was not at a sufficient level.

特許第２８１５１２０号Japanese Patent No. 2815120 特開平９−２６４８４３号JP-A-9-264843 米国特許第５４３６１６１号US Pat. No. 5,436,161 特開平８−１９３９４８号公報JP-A-8-193948

本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、蛋白質固定化能を維持しつつ、非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供することを解決すべき課題とした。   The present invention has been made to solve the above-described problems of the prior art. That is, an object of the present invention is to provide a detection surface for a biosensor that suppresses nonspecific adsorption while maintaining protein immobilization ability.

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基板の表面が疎水性高分子化合物で表面被覆されているバイオセンサーにおいて、該疎水性高分子化合物にリンカーを結合させ、該リンカーを荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化することによって、蛋白質固定化能を維持しつつ、非特異吸着を抑制したバイオセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made a linker bind to the hydrophobic polymer compound in the biosensor in which the surface of the substrate is coated with the hydrophobic polymer compound, It has been found that by activating the linker so as to contain a charged group and a reactive leaving group, it is possible to provide a biosensor that suppresses nonspecific adsorption while maintaining protein immobilization ability. It came to complete.

即ち、本発明によれば、基板の表面が疎水性高分子化合物で表面被覆され、さらにその表面にリンカーが結合しており、該リンカーが荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化されていることを特徴とする、バイオセンサーが提供される。   That is, according to the present invention, the surface of the substrate is coated with a hydrophobic polymer compound, and a linker is bonded to the surface, and the linker contains a charged group and a reactive leaving group. A biosensor is provided that is activated as described above.

好ましくは、本発明のバイオセンサーでは、式（１）、（２）又は（３）の何れかの化合物で活性化されている。

（式中、Ｒは荷電を有する基を表す。Ｘは電子吸引性基を表す。ｎは０〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは１〜４の整数を示す） Preferably, in the biosensor of the present invention, the biosensor is activated with any compound of the formula (1), (2) or (3).

(In the formula, R represents a charged group. X represents an electron-withdrawing group. N represents an integer of 0 to 10, and p and q represent integers of 1 to 4.)

好ましくは、リンカーは式（４）で表されるリンカーである。
Ｘ―Ｌ―Ｙ （４）
（式中、Ｘは、疎水性高分子化合物の官能基と反応しうる基を示し、Ｌは２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質を固定化できる基を示す。） Preferably, the linker is a linker represented by formula (4).
X-L-Y (4)
(In the formula, X represents a group capable of reacting with a functional group of the hydrophobic polymer compound, L represents a divalent linking group, and Y represents a group capable of immobilizing a physiologically active substance.)

好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用することができ、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用することができる。   Preferably, the biosensor of the present invention can be used for non-electrochemical detection, more preferably for surface plasmon resonance analysis.

本発明の別の側面によれば、基板を疎水性高分子化合物でコーティングする工程、該疎水性高分子化合物にリンカーを結合する工程、及びリンカーを、荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化する工程を含む、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。   According to another aspect of the present invention, a step of coating a substrate with a hydrophobic polymer compound, a step of bonding a linker to the hydrophobic polymer compound, and a linker comprising a charged group and a reactive leaving group There is provided a method for producing the biosensor of the present invention described above, which comprises the step of activating to contain the above.

本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している、上記した本発明のバイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, there is provided the biosensor of the present invention as described above, wherein a physiologically active substance is covalently bonded to the surface.
According to still another aspect of the present invention, the biosensor includes a step of bringing the biosensor of the present invention into contact with a physiologically active substance and covalently bonding the physiologically active substance to the surface of the biosensor. A method for immobilizing a physiologically active substance is provided.

本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記した本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する。さらに好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。 According to still another aspect of the present invention, the bioactive substance interacts with the bioactive substance, comprising the step of bringing the biosensor of the present invention in which the bioactive substance is covalently bonded to the surface into contact with the test substance. A method for detecting or measuring a substance is provided.
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method. More preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.

本発明により、蛋白質固定化能を維持しつつ、非特異吸着を抑制したバイオセンサー用検出表面を提供することが可能になった。   According to the present invention, it has become possible to provide a detection surface for a biosensor that suppresses nonspecific adsorption while maintaining the ability to immobilize proteins.

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、基板の表面が疎水性高分子化合物で表面被覆され、さらにその表面にリンカーが結合しており、該リンカーが、荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化されていることを特徴とする。 Embodiments of the present invention will be described below.
In the biosensor of the present invention, the surface of the substrate is coated with a hydrophobic polymer compound, and a linker is bonded to the surface, and the linker contains a charged group and a reactive leaving group. It is characterized by being activated.

本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。   The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.

本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。   The hydrophobic polymer compound used in the present invention is a polymer compound having no water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is 10% or less, more preferably 1% or less, most preferably 0.1% or less. It is.

疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。   Hydrophobic monomers that form hydrophobic polymer compounds include vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. , Fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers, vinyl ketones and the like. The hydrophobic polymer compound may be a homopolymer composed of one type of monomer or a copolymer composed of two or more types of monomers.

本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。   Examples of the hydrophobic polymer compound preferably used in the present invention include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate, polyester, and nylon.

疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。   Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.

浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。   In the dipping method, coating is performed by bringing the substrate into contact with a hydrophobic polymer solution and then bringing the substrate into contact with a liquid not containing the hydrophobic polymer solution. Preferably, the solvent of the hydrophobic polymer compound solution and the solvent of the liquid not containing the hydrophobic polymer compound are the same solvent.

浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。   In the dipping method, a hydrophobic polymer compound layer having a uniform coating thickness can be obtained on the surface of the substrate by appropriately selecting a solvent for coating the hydrophobic polymer compound, regardless of the unevenness, curvature, and shape of the substrate.

浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。   The coating solvent for the dipping method is not particularly limited, and any solvent can be used as long as it dissolves a part of the hydrophobic polymer compound. For example, a formamide solvent such as N, N-dimethylformamide, a nitrile solvent such as acetonitrile, an alcohol solvent such as phenoxyethanol, a ketone solvent such as 2-butanone, and a benzene solvent such as toluene can be used. However, it is not limited to these.

基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。   The solution of the hydrophobic polymer compound to be brought into contact with the substrate may be either a completely dissolved hydrophobic polymer compound or a suspension containing an insoluble component of the hydrophobic polymer compound. The liquid temperature is not particularly limited as long as a part of the hydrophobic polymer compound is dissolved, but is preferably −20 ° C. or higher and 100 ° C. or lower. The liquid temperature may be varied while the substrate is in contact with the hydrophobic polymer compound solution. Although there is no restriction | limiting in particular in the hydrophobic polymer compound density | concentration of a solution, Preferably it is 0.01% or more and 30% or less, More preferably, it is 0.1% or more and 10% or less.

固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。   The time for bringing the solid substrate into contact with the hydrophobic polymer solution is not particularly limited, but is preferably 1 second to 24 hours, more preferably 3 seconds to 1 hour.

疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ³)^1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）^1/2
例として、実施例に使用した疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。 As the liquid not containing the hydrophobic polymer compound, the difference between the SP value of the solvent itself (unit: (J / cm ³ ) ^1/2 ) and the SP value of the hydrophobic polymer compound is 1 or more and 20 or less. Preferably, it is 3 or more and 15 or less. The SP value is represented by the square root of the cohesive energy density between molecules and is also called a solubility parameter. In the present invention, the SP value δ is calculated by the following formula. As the cohesive energy Ecoh and the molar volume V of each functional group, the values specified by Fedors were used (R. F. Fedors, Polym. Eng. Sci., 14 (2), P147, P472 (1974)).
δ = (ΣEcoh / ΣV) ^1/2
As an example, the SP values of the hydrophobic polymer compound and the solvent used in the examples are as follows. Solvent 2-phenoxyethanol: 25.3 against polymethyl methacrylate-polystyrene copolymer (1: 1): 21.0, polymethyl methacrylate : Solvent acetonitrile with respect to 20.3: 22.9, Solvent toluene with respect to polystyrene: 21.6: 18.7.

基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。   The time for contacting the substrate with the liquid not containing the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 1 second or longer and 24 hours or shorter, more preferably 3 seconds or longer and 1 hour or shorter. The liquid temperature is not particularly limited as long as the solvent is in a liquid state, but is preferably −20 ° C. or higher and 100 ° C. or lower. The liquid temperature may be varied while the substrate is in contact with the solvent. When using a solvent that is difficult to volatilize, for the purpose of removing the solvent, the solvent may be replaced with a volatile solvent that dissolves each other after contacting the solvent.

疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。   The coating thickness of the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 3000 angstrom or less.

本発明のバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。   The biosensor of the present invention is preferably a metal surface or metal film coated with a hydrophobic polymer compound. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。   Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering the use for a surface plasmon resonance biosensor, it is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 2000 angstrom or less. If it exceeds 5000 angstroms, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 1 angstrom or more and 100 angstrom or less.

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。   The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。   The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.

次に、本発明で使用するリンカーについて説明する。
本発明のリンカーは、生理活性物質と疎水性高分子化合物を間接的に固定化できるものを言う。固定化する方法としては、静電的相互作用を用いる方法、疎水性相互作用を用いる方法、化学結合を用いる方法などが挙げられるが、化学結合を用いる方法が好ましく用いられる。化学結合には、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合などがあるが、共有結合が最も好ましく用いられる。 Next, the linker used in the present invention will be described.
The linker of the present invention refers to a linker capable of indirectly immobilizing a physiologically active substance and a hydrophobic polymer compound. Examples of the immobilization method include a method using an electrostatic interaction, a method using a hydrophobic interaction, a method using a chemical bond, and the like. A method using a chemical bond is preferably used. The chemical bond includes a covalent bond, an ionic bond, a coordination bond, and a hydrogen bond, and the covalent bond is most preferably used.

本発明で使用するリンカーの具体例としては下記式（４）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ―Ｌ―Ｙ （４）
（式中、Ｘは、疎水性高分子化合物の官能基と反応しうる基を示し、Ｌは２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質を固定化できる基を示す。） Specific examples of the linker used in the present invention include a compound represented by the following formula (4).
X-L-Y (4)
(In the formula, X represents a group capable of reacting with a functional group of the hydrophobic polymer compound, L represents a divalent linking group, and Y represents a group capable of immobilizing a physiologically active substance.)

式（４）において、Ｘは疎水性高分子化合物の官能基と反応しうる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。 In the formula (4), X represents a group capable of reacting with the functional group of the hydrophobic polymer compound, preferably an amino group, a carboxyl group, or a leaving group protected by a halogen atom, an amino group, or a protecting group. A carbonyl group having a hydroxyl group, a hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group, an aldehyde group, —NHNH ₂ , —N═C═O, —N═C═S, an epoxy group, or a vinyl group.
The protecting group here is a group that can be deprotected in the reaction system to form a functional group. For example, the protecting group for amino group includes tertbutyloxycarbonyl group (Boc), 9-fluorene group. Examples include nylmethyloxycarbonyl group (Fmoc), nitrophenylsulfenyl group (Nps), dithiasuccinyl group (Dts) and the like.

また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。
ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。
また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。 Moreover, an acyl group etc. are mentioned as a hydroxyl-protecting group.
The leaving group here is a halogen atom, alkoxy group, aryloxy group, alkylcarbonyloxy group, arylcarbonyloxy group, halogenated alkylcarbonyloxy group, alkylsulfonyloxy group, halogenated alkylsulfonyloxy group, arylsulfonyloxy Groups and the like.
As the leaving group, an ester group produced by combining a carboxylic acid, a known dehydration condensation reagent (for example, carbodiimides) and an N-hydroxy compound is also preferably used.

式（４）において、Ｌは２価の連結基を表し、Ｌの総原子数は、２〜１０００であることが好ましい。さらに、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアルキレンオキシ基、置換もしくは無置換のアリーレンオキシ基、もしくは式（４）のＸと別の分子のＹが結合し、構成が連続する２価の連結基であることが好ましい。   In the formula (4), L represents a divalent linking group, and the total number of atoms of L is preferably 2 to 1000. Furthermore, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkyleneoxy group, a substituted or unsubstituted aryleneoxy group, or X in the formula (4) and Y of another molecule are bonded to form a continuous 2 A valent linking group is preferred.

式（４）において、Ｙは生理活性物質を固定化できる基を表し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。
保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。 In the formula (4), Y represents a group capable of immobilizing a physiologically active substance, preferably a halogen atom, an amino group, or an amino group protected by a protective group, a carboxyl group, or a carbonyl group having a leaving group, A hydroxyl group, a hydroxyl group protected by a protecting group, an aldehyde group, —NHNH ₂ , —N═C═O, —N═C═S, an epoxy group, or a vinyl group.
As the protecting group and the leaving group, the same as those described above can be used.

以下に式（４）の化合物の具体例を示すが、本発明で使用できる式（４）の化合物はこれらに限定されるものではない。   Specific examples of the compound of formula (4) are shown below, but the compound of formula (4) that can be used in the present invention is not limited thereto.

本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。   The biosensor of the present invention preferably has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance on the outermost surface of the substrate. Here, the “outermost surface of the substrate” means “the side farthest from the substrate”, and more specifically, “the side farthest from the substrate in the hydrophobic polymer compound coated on the substrate”. Meaning.

本発明のバイオセンサーにおいては、疎水性高分子表面に導入されたリンカーは、（例えば、生理活性物質をバイオセンサー表面に濃縮するための）荷電を有する基と、（例えば、該生理活性物質と共有結合するための）反応性脱離基を含有するように活性化される。具体的には、式（１）、（２）又は（３）で表される反応性脱離基が好ましく用いられる。   In the biosensor of the present invention, the linker introduced on the surface of the hydrophobic polymer comprises a charged group (for example, for concentrating the bioactive substance on the biosensor surface), and (for example, the bioactive substance and It is activated to contain a reactive leaving group (for covalent bonding). Specifically, a reactive leaving group represented by the formula (1), (2) or (3) is preferably used.

式中、Ｒは、荷電を有する基を表す。この場合、対塩を有していても良い。負荷電をもつ基としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、正電荷を持つ基としては、オニウム塩（アンモニウム塩、ピリジニウム塩、スルフォニウム塩、ホスホニウム塩など）などが挙げられる。
式中、Ｘは電子吸引性基を表す。好ましい電子吸引性基の具体例としては、ハロゲン、シアノ、ニトロ基などが挙げられる。
式中、ｎは０〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは１〜４の整数を示す。 In the formula, R represents a charged group. In this case, you may have a counter salt. Examples of the negatively charged group include carboxylate, sulfonate, sulfinate, and phosphate. Examples of the positively charged group include onium salts (such as ammonium salts, pyridinium salts, sulfonium salts, and phosphonium salts).
In the formula, X represents an electron-withdrawing group. Specific examples of preferred electron withdrawing groups include halogen, cyano, nitro group and the like.
In formula, n shows the integer of 0-10, p and q show the integer of 1-4.

上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の生理活性物質と共有結合するための反応性脱離基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。   In the biosensor surface obtained as described above, a physiologically active substance is covalently bonded via a reactive leaving group for covalently bonding to the physiologically active substance, thereby providing a physiological surface on the metal surface or metal film. The active substance can be immobilized.

本発明のバイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。   The physiologically active substance immobilized on the biosensor surface of the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement target, and examples thereof include immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, non-molecular compounds, and the like. Examples include immune proteins, immunoglobulin-binding proteins, sugar-binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, or polypeptides or oligopeptides having ligand binding ability.

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。   Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。   The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme and the like can be used. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。 The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。 The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.

生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。   When the physiologically active substance is a protein or nucleic acid such as an antibody or an enzyme, the immobilization can be performed by covalently bonding to a functional group on the metal surface using the amino group, thiol group or the like of the physiologically active substance. .

上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。   The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.

即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。 That is, according to the present invention, the biosensor of the present invention on which a physiologically active substance is immobilized is brought into contact with a test substance to thereby interact with the physiologically active substance immobilized on the biosensor. A method of detecting and / or measuring a substance to be provided is provided.
As the test substance, for example, a sample containing a substance that interacts with the above physiologically active substance can be used.

本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。   In the present invention, the interaction between the physiologically active substance immobilized on the biosensor surface and the test substance is preferably detected and / or measured by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.

本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。   According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.

表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。   The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。   The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.

表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。   As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。   In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.

上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。   In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.

この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。   If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.

そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。   In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.

また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。   Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.

上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。   In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.

なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。   In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.

また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。   In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.

試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。   If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, a rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and a human IgG antibody can be used as the specific substance.

なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。   Note that, in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of the total reflection attenuation angle (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application No. 2000-398309 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.

さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。   Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.

本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 When the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

実施例１：
（１）センサーチップの作成
（１−１）デキストランで表面被覆されたセンサーチップの作製（比較例）
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、エタノール／水（80/20）中11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。 Example 1:
(1) Preparation of sensor chip (1-1) Preparation of sensor chip surface-coated with dextran (comparative example)
1cm (1cm cover glass deposited with gold so that the thickness of the gold film is 500 angstroms was treated with Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, then ethanol / water (80/20) A 5.0 mM solution of 11-hydroxy-1-undecanthiol in the solution was added so as to come into contact with the gold film, and surface treatment was performed for 18 hours at 25 ° C. Thereafter, ethanol was used 5 times and ethanol / water mixed solvent 1 time. Washed 5 times with water.

次に、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面を10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）に接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で４時間反応を進行させた。表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。   Next, the surface coated with 11-hydroxy-1-undecanthiol was brought into contact with a 10 wt% epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixture of 0.4 M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether) The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator. The surface was washed twice with ethanol and five times with water.

次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理を施した表面上に接触させた。ここで、デキストランは、平均分子量50万のPharmacia製Dextran T-500と、平均分子量4万のPharmacia製Dextran T-40のいずれかを用いて表１に示す試料を作成した。さらに振盪インキュベーター中で25℃、20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。   Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of a 25% by weight dextran (T500, Pharmacia) aqueous solution, and the solution was brought into contact with the epichlorohydrin-treated surface. Here, for dextran, samples shown in Table 1 were prepared using either Pharmacia Dextran T-500 having an average molecular weight of 500,000 or Pharmacia Dextran T-40 having an average molecular weight of 40,000. Furthermore, it incubated at 25 degreeC for 20 hours in the shaking incubator. The surface was washed 10 times with 50 ° C. water.

続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、振盪インキュベーター中で28℃、16時間インキュベートした。さらに表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。   Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated at 28 ° C. for 16 hours in a shaking incubator. Further, the surface was washed with water, and then the above procedure was repeated once.

（１−２）疎水性高分子で表面被覆されたセンサーチップの作製（本発明）
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレート（以下PMMAと呼ぶ）のメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、PMMA膜の厚さは200オングストロームであった。 (1-2) Production of sensor chip surface-coated with hydrophobic polymer (present invention)
1cm (1cm cover glass) with gold deposited to a thickness of 500 angstroms was treated with Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, then spin coater (MODEL ASS-303 , Made by ABLE) and rotated at 1000 rpm, 50 μl of methyl ethyl ketone solution (2 mg / ml) of polymethyl methacrylate (hereinafter referred to as PMMA) was dropped in the center of the gold vapor-deposited cover glass, and the rotation was stopped after 2 minutes. When the film thickness was measured by a measurement method (In-Situ Ellipsometer MAUS-101, manufactured by Five Lab), the thickness of the PMMA film was 200 Å.

作成したPMMAで被覆された金チップをNaOH水溶液（１Ｎ）に40℃16時間浸漬した後、水で3回洗浄し、表面にカルボキシル基を導入した。さらに、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（400mM）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（100mM）の1:1混合液に25℃30分浸漬し、水で3回洗浄した。その試料を、本発明のリンカーに相当する5−アミノ吉草酸溶液（１M、ｐH8.5）に25℃30分浸漬し、水で3回洗浄した。以上の操作により、リンカーを導入したPMMA被覆センサーチップを得た。   The gold chip coated with PMMA thus prepared was immersed in an aqueous NaOH solution (1N) at 40 ° C. for 16 hours and then washed three times with water to introduce carboxyl groups on the surface. Further, it was immersed in a 1: 1 mixture of 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) and N-hydroxysuccinimide (100 mM) for 30 minutes at 25 ° C. and washed three times with water. The sample was immersed in a 5-aminovaleric acid solution (1M, pH 8.5) corresponding to the linker of the present invention at 25 ° C. for 30 minutes and washed three times with water. By the above operation, a PMMA-coated sensor chip into which a linker was introduced was obtained.

また、上記の操作において、PMMAに換えて、メチルメタクリレートとスチレンの1:1共重合ポリマー（以下MMA/Stコポリマーと呼ぶ）を用いることで、リンカーを導入したMMA/Stコポリマー被覆センサーチップを得た。以上のようにして表１に示すセンサーチップ試料No.1〜8を作成した。   In the above operation, instead of PMMA, a 1: 1 copolymer of methyl methacrylate and styrene (hereinafter referred to as MMA / St copolymer) is used to obtain a MMA / St copolymer-coated sensor chip with a linker introduced. It was. As described above, sensor chip samples Nos. 1 to 8 shown in Table 1 were prepared.

（２）センサーチップの性能評価：
（２−１）蛋白質（トリプシン）固定化量の評価
作成したバイオセンサー表面に、トリプシン（Trypsin Bovine Pancreas TPCK-treated、WOR社製）の固定化を試みた。表1の試料No.1〜8のセンサーチップを表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、1−エチル−2,3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（400mM）と、下記構造の活性化剤（１）（100mM）あるいは活性化剤（２）（100mM）との混合液300μLを流速10μL/minで測定セルに流した。 (2) Sensor chip performance evaluation:
(2-1) Evaluation of protein (trypsin) immobilization amount Trypsin (Trypsin Bovine Pancreas TPCK-treated, manufactured by WOR) was immobilized on the surface of the biosensor. The sensor chips of sample Nos. 1 to 8 in Table 1 were placed on the cartridge block of a surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000, manufactured by Biacore), and 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM), 300 μL of a mixed solution of activator (1) (100 mM) or activator (2) (100 mM) having the following structure was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min.

次に、トリプシン溶液（10μg/ml、酢酸バッファー（ｐH5.5））100μlを流速10μl/minで測定セルに注入することで、トリプシンを各試料表面に共有結合で固定化した。その後、エタノールアミン・HCｌ溶液（１M、ｐH8.5）100μlを流速10μl/minで測定セルに流し、センサー表面を不活性化した。トリプシン注入前と注入終了から３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量をトリプシンの固定化量（RU値）とした。結果を表１に示す。   Next, trypsin was immobilized on each sample surface by covalent bonding by injecting 100 μl of a trypsin solution (10 μg / ml, acetate buffer (pH 5.5)) into the measurement cell at a flow rate of 10 μl / min. Thereafter, 100 μl of ethanolamine / HCl solution (1M, pH 8.5) was flowed into the measuring cell at a flow rate of 10 μl / min to inactivate the sensor surface. The amount of change in resonance signal (RU value) before trypsin injection and 3 minutes after the end of injection was defined as the amount of immobilized trypsin (RU value). The results are shown in Table 1.

（２−２）結合検出の評価
表１の試料No.１〜8において以下の方法でトリプシンの阻害剤であるロイペプチン（CHM社製）の結合検出を試みた。 (2-2) Evaluation of binding detection In samples Nos. 1 to 8 in Table 1, binding detection of leupeptin (manufactured by CHM), which is an inhibitor of trypsin, was attempted by the following method.

上記（２−１）の方法でトリプシンを固定した後、表面プラズモン共鳴バイオセンサーにセンサーチップを装着したまま、ランニングバッファーとしてHBS-Nバッファー（ビアコア社製）を測定セルに流し、その後、ロイペプチン溶液（10μg/ml）100μlを流速10μl/minで測定セルに注入した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/lである。ロイペプチン溶液の注入後、再びHBS-Nバッファー（ビアコア社製）を測定セルに流した。ロイペプチン注入前と注入終了から３分後の共鳴シグナル（RU値）変化量をロイペプチンの固定化量（RU値）とした。結果を表１に示す。   After fixing trypsin by the above method (2-1), with the surface plasmon resonance biosensor attached to the sensor chip, the HBS-N buffer (Biacore) was passed through the measurement cell as a running buffer, and then the leupeptin solution 100 μl (10 μg / ml) was injected into the measuring cell at a flow rate of 10 μl / min. The composition of the HBS-N buffer is HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic Acid) 0.01 mol / l (pH 7.4) and NaCl 0.15 mol / l. After the injection of leupeptin solution, HBS-N buffer (Biacore) was again flowed into the measurement cell. The amount of change in the resonance signal (RU value) before the injection of leupeptin and 3 minutes after the end of the injection was defined as the amount of leupeptin immobilized (RU value). The results are shown in Table 1.

（２−３）非特異吸着の評価
センサー表面に対する非特異的な蛋白質の吸着はノイズの原因となるため、極力少ないほうが好ましい。表１の試料１〜8において以下の方法でアビジン（ナカライテスク製）の非特異吸着性を調べた。 (2-3) Evaluation of non-specific adsorption Since non-specific protein adsorption on the sensor surface causes noise, it is preferable that the amount be as small as possible. In samples 1 to 8 in Table 1, the nonspecific adsorption property of avidin (manufactured by Nacalai Tesque) was examined by the following method.

1の試料No.1〜8のセンサーチップを表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、1−エチル−2,3−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（400mM）と、活性化剤（１）（100mM）あるいは活性化剤（２）（100mM）との混合液300μLを流速10μL/minで測定セルに流した。次に、エタノールアミン・HCｌ溶液（１M、ｐH8.5）100μlを流速10μl/minで測定セルに流し、センサー表面を不活性化した。その後、アビジン溶液（0.5mg/ml）300μlを流速10μl/minで測定セルに注入した。細胞抽出液注入前と注入終了から3分後の共鳴シグナル（RU値）変化量をアビジンの非特異吸着量（RU値）とした。結果を表１に示す。   The sensor chip of sample Nos. 1 to 8 of 1 is placed on the cartridge block of the surface plasmon resonance biosensor (Biacore 3000, manufactured by Biacore), and activated with 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) 300 μL of the mixture of the agent (1) (100 mM) or the activator (2) (100 mM) was passed through the measurement cell at a flow rate of 10 μL / min. Next, 100 μl of ethanolamine / HCl solution (1M, pH 8.5) was flowed into the measuring cell at a flow rate of 10 μl / min to inactivate the sensor surface. Thereafter, 300 μl of the avidin solution (0.5 mg / ml) was injected into the measurement cell at a flow rate of 10 μl / min. The amount of change in resonance signal (RU value) before the cell extract injection and 3 minutes after the end of the injection was taken as the nonspecific adsorption amount (RU value) of avidin. The results are shown in Table 1.

表１の結果から、本発明の構成により、蛋白質固定化量能と非特異吸着防止能の両立した、検出感度に優れたセンサーチップを提供できることがわかる。   From the results in Table 1, it can be seen that the sensor chip having excellent detection sensitivity and having both the protein immobilization ability and the nonspecific adsorption prevention ability can be provided by the constitution of the present invention.

以下、本発明の効果を詳細に説明する。試料No.1、3、5、7の比較により、比較例の活性化剤(1)を使った場合は、本発明のセンサーチップの固定化量は極めて低く実用に耐えない。しかしながら、本発明の活性化剤(2)を使った場合は、本発明のセンサーチップでは、劇的に蛋白質固定化量が向上し、試料No.6、8は試料No.2、４の蛋白質固定化量を上回る。試料No.1〜4で活性化剤(2)を用いた効果が小さいのは、それらの試料がより多くのカルボン酸を含有するため、荷電反発効果による活性化剤（２）の反応性低下が寄与しているものと推測される。また、本発明の試料No.6、8は非特異吸着防止能も優れており、さらに阻害剤の検出感度も最も良好であった。この活性化剤（２）に特有の傾向は、デキストラン分子量の大きい方がより顕著に現れた。試料No.6、8の条件で、蛋白質固定化能と非特異吸着防止能を両立するセンサー表面を提供できることがわかった。   Hereinafter, the effect of the present invention will be described in detail. According to the comparison of sample Nos. 1, 3, 5, and 7, when the activator (1) of the comparative example was used, the immobilized amount of the sensor chip of the present invention was extremely low and could not withstand practical use. However, when the activator (2) of the present invention is used, in the sensor chip of the present invention, the amount of protein immobilized is dramatically improved, and sample Nos. 6 and 8 are the proteins of samples No. 2 and 4. Exceeds the amount of immobilization. The reason why the effect of using the activator (2) in samples No. 1 to 4 is small is that the reactivity of the activator (2) is reduced due to the charge repulsion effect because these samples contain more carboxylic acid. Is presumed to have contributed. Samples Nos. 6 and 8 of the present invention were also excellent in the ability to prevent nonspecific adsorption, and the detection sensitivity of the inhibitors was the best. The tendency peculiar to this activator (2) appeared more markedly when the dextran molecular weight was larger. It was found that a sensor surface having both protein immobilization ability and nonspecific adsorption prevention ability can be provided under the conditions of sample Nos. 6 and 8.

Claims (11)

基板の表面が疎水性高分子化合物で表面被覆され、さらにその表面にリンカーが結合しており、該リンカーが荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化されていることを特徴とする、バイオセンサー。 The surface of the substrate is coated with a hydrophobic polymer compound, and a linker is bonded to the surface, and the linker is activated to contain a charged group and a reactive leaving group. A biosensor characterized by 式（１）、（２）又は（３）の何れかの化合物で活性化されている、請求項１に記載のバイオセンサー。

（式中、Ｒは荷電を有する基を表す。Ｘは電子吸引性基を表す。ｎは０〜１０の整数を示し、ｐ及びｑは１〜４の整数を示す） The biosensor according to claim 1, wherein the biosensor is activated with any compound of formula (1), (2) or (3).

(In the formula, R represents a charged group. X represents an electron-withdrawing group. N represents an integer of 0 to 10, and p and q represent integers of 1 to 4.) リンカーが式（４）で表されるリンカーである、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
Ｘ―Ｌ―Ｙ （４）
（式中、Ｘは、疎水性高分子化合物の官能基と反応しうる基を示し、Ｌは２価の連結基を示し、Ｙは生理活性物質を固定化できる基を示す。） The biosensor according to claim 1 or 2, wherein the linker is a linker represented by formula (4).
X-L-Y (4)
(In the formula, X represents a group capable of reacting with a functional group of the hydrophobic polymer compound, L represents a divalent linking group, and Y represents a group capable of immobilizing a physiologically active substance.) 非電気化学的検出に使用される、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。 The biosensor according to any one of claims 1 to 3, which is used for non-electrochemical detection. 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。 The biosensor according to any one of claims 1 to 4, which is used for surface plasmon resonance analysis. 基板を疎水性高分子化合物でコーティングする工程、該疎水性高分子化合物にリンカーを結合する工程、及びリンカーを、荷電を有する基と反応性脱離基とを含有するように活性化する工程を含む、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。 Coating a substrate with a hydrophobic polymer compound, bonding a linker to the hydrophobic polymer compound, and activating the linker to contain a charged group and a reactive leaving group The manufacturing method of the biosensor in any one of Claim 1 to 5 containing. 生理活性物質が共有結合により表面に結合している、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。 The biosensor according to any one of claims 1 to 5, wherein the physiologically active substance is bound to the surface by a covalent bond. 請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。 A biosensor comprising a bioactive substance in a biosensor comprising the step of bringing the biosensor according to any one of claims 1 to 5 into contact with the bioactive substance and covalently binding the bioactive substance to the surface of the biosensor. How to immobilize. 生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。 Detecting or measuring a substance that interacts with the bioactive substance, comprising the step of bringing the biosensor according to any one of claims 1 to 5 and a test substance into contact with each other, wherein the bioactive substance is covalently bonded to the surface. how to. 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項９に記載の方法。 The method according to claim 9, wherein a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method. 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項９又は１０に記載の方法。 The method according to claim 9 or 10, wherein a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.