JP2005232054A - Method for producing liposome-containing formulation and liposome-containing formulation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、封入物質の内包化率が高く、かつ微細化されたリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤に関する。 The present invention relates to a method for producing a liposome-containing preparation having a high encapsulation rate of an encapsulated substance and containing finely divided liposomes, and a liposome-containing preparation obtained by the method.
リポソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。このリポソームは、内部に有する水相には水溶性の封入物質を、二分子膜の内部には油溶性の封入物質を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できることから、診断、治療、化粧などの様々な分野で用いられてきている。さらに、近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されている。 Liposomes are closed vesicles of bilayer membranes (liposome membranes) formed mainly by phospholipids and have similar structures and functions as biological membranes, and thus have been used as various research materials. Since this liposome can construct a so-called capsule structure that holds a water-soluble encapsulating substance in the aqueous phase inside and an oil-soluble encapsulating substance in the bilayer membrane, it can be used for diagnosis, treatment, makeup, etc. It has been used in various fields. Furthermore, in recent years, application to drug delivery systems (DDS) has been actively studied.
このような封入物質を内包したリポソームは、通常、分散液の状態で製剤として用いられているが、封入物質の保持効率（リポソーム膜構成成分に対する封入物質の内包化率）が高いリポソームを得ることは容易ではなく、所望の効果を得るためには、リポソームが高濃度に分散されたリポソーム含有製剤を用いるか、または多量のリポソーム含有製剤を用いる必要があった。リポソーム含有製剤が高濃度であると製剤粘度が高くなるため、リポソーム含有製剤を生体内に投与する際には、患者に与える負担が大きく、また、リポソーム含有製剤を多量に投与する場合にも同様の問題があった。特に、リポソームが有する薬物内包機能を用いた造影剤は、血管などを介して生体内に投与（注射）するものであるため、投与するリポソーム含有製剤が高濃度であったり、または多量に投与する必要があると、患者に負担を与えるのみならず副作用の懸念があった。したがって、造影剤への応用を考えた場合、造影物質の保持効率（内包化率）が高いリポソーム含有製剤が求められていた。 Liposomes encapsulating such encapsulated substances are usually used as preparations in the form of dispersions, but obtaining liposomes with high retention efficiency of encapsulated substances (inclusion ratio of encapsulated substances relative to liposome membrane constituents). However, in order to obtain a desired effect, it is necessary to use a liposome-containing preparation in which liposomes are dispersed at a high concentration or to use a large amount of a liposome-containing preparation. When the concentration of liposome-containing preparation is high, the viscosity of the preparation increases, so when administering the liposome-containing preparation in vivo, the burden on the patient is large, and the same applies when administering a large amount of liposome-containing preparation. There was a problem. In particular, since a contrast agent using a drug-encapsulating function possessed by liposomes is administered (injected) into a living body via blood vessels or the like, the liposome-containing preparation to be administered is administered at a high concentration or in a large amount. When necessary, there were concerns about side effects as well as burdening patients. Therefore, when considering application to a contrast agent, a liposome-containing preparation having a high contrast substance retention efficiency (encapsulation rate) has been demanded.
この薬物送達システム（ＤＤＳ）においては、封入物質を体内の所望の部位に効率よく到達させる必要があり、リポソームを微細化することが重要である。そのために、従来から、Bangham法や逆相蒸発法（ＲＥＶ法）などで調製されたリポソームの懸濁液を、超音
波照射や機械的せん断力を用いて微細化する方法や、リポソームの懸濁液をメンブランフィルターに高圧下で通すエクストルージョン法などが行われている。しかしながら、従来の方法では、膜物質を溶解する際に使用した有機溶媒が、どうしても微量残留してしまうため、リポソーム膜の強度が低下する傾向があった。そのため、超音波処理やエクストルーダー処理を行うと膜の一部が破壊されて内包化率が低下する問題や、また壊れた膜物質がミセルを形成し、生体内で予期せぬ作用を生じる懸念があった。
In this drug delivery system (DDS), it is necessary to efficiently bring the encapsulated substance to a desired site in the body, and it is important to make the liposome finer. Therefore, conventionally, a liposome suspension prepared by the Bangham method, the reverse phase evaporation method (REV method) or the like is refined using ultrasonic irradiation or mechanical shearing force, or a liposome suspension. An extrusion method is used in which the liquid is passed through a membrane filter under high pressure. However, in the conventional method, since the organic solvent used for dissolving the membrane substance always remains in a very small amount, the strength of the liposome membrane tends to decrease. Therefore, there is a problem that ultrasonic treatment or extruder treatment destroys part of the membrane and lowers the encapsulation rate, and there is a concern that the broken membrane material will form micelles and cause unexpected action in vivo. was there.
また、リポソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、超臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この方法は、製造条件を種々設定することが可能であり、従来のリポソームの懸濁液の製造方法に比べ、比較的容易に粒子径分布が均一なリポソームを調製することができる。したがって、超臨界二酸化炭素を用いた方法は、ＤＤＳ製剤を調製する上で有効な方法である。この方法においては、超臨界二酸化炭素を主要な溶媒として用いるものの、溶媒助剤として使用する有機溶媒の混入が避けられず、この有機溶媒により膜強度が低下する傾向があった。そのため、上記と同様に、内包化率が低下する問題や、生体内で予期せぬ作用を生じる懸念があった。
本発明は、封入物質の内包化率が高くかつ微細化されたリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing a liposome-containing preparation containing liposomes having a high encapsulation rate of encapsulated substances and fine particles, and a liposome-containing preparation obtained by the method.
本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、リポソームの懸濁液を超音波処理する方法であって、
前記リポソームの懸濁液に含まれるリポソームが、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質からなるリン脂質膜内に、水溶性薬剤を含有する水相を内包させてなり、
前記超音波処理が、リポソームの懸濁液を、前記リン脂質の転移温度〜転移温度＋５０℃（ただし１００℃を超えない）に加熱したのち、その温度±１０℃（ただし１００℃を超えない)に保持しながら１０〜１００ｋＨｚの超音波を、１〜６００ｗ／ｍｌ／分照射
することを特徴とする。
The method for producing a liposome-containing preparation according to the present invention is a method of ultrasonically treating a liposome suspension,
The liposome contained in the liposome suspension is obtained by encapsulating an aqueous phase containing a water-soluble drug in a phospholipid membrane composed of a phospholipid having at least a phospholipid having a transition temperature,
The ultrasonic treatment heats the liposome suspension from the transition temperature of the phospholipid to the transition temperature + 50 ° C. (however, not exceeding 100 ° C.), and then the temperature ± 10 ° C. (however, not exceeding 100 ° C.) The ultrasonic waves of 10 to 100 kHz are irradiated with 1 to 600 w / ml / min.
前記リポソームの懸濁液は、超臨界状態の二酸化炭素を用いて調製されていることが好ましい。 The liposome suspension is preferably prepared using carbon dioxide in a supercritical state.
また、本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、水溶性薬剤を少なくとも含有する水溶液と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質を超臨界状態の二酸化炭素中に含んでなる溶液とを、超音波を照射しながら混合する方法であって、
前記超音波照射する際の温度が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃であることを特徴とする。
Further, the method for producing a liposome-containing preparation according to the present invention comprises an aqueous solution containing at least a water-soluble drug, and a solution comprising phospholipid having at least a phospholipid having a transition temperature in carbon dioxide in a supercritical state. , A method of mixing while irradiating with ultrasonic waves,
The temperature at which the ultrasonic irradiation is performed is a temperature which is higher between the critical temperature of carbon dioxide or the transition temperature of phospholipid, which is higher than the transition temperature + 50 ° C.
前記超音波照射は、１０〜１００ｋＨｚの超音波を、１〜６００ｗ／ｍｌ／分照射することが好ましい。 The ultrasonic irradiation is preferably performed by applying an ultrasonic wave of 10 to 100 kHz for 1 to 600 w / ml / min.
本発明に係るリポソーム含有製剤は、前記の方法によって製造されたことを特徴とし、リン脂質膜内に内包された水相には、少なくとも非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有することが好ましい。 The liposome-containing preparation according to the present invention is manufactured by the above-described method, and the aqueous phase encapsulated in the phospholipid membrane preferably contains at least a nonionic iodine compound and a preparation aid. .
前記非イオン性ヨウド化合物の５〜３５質量％が、リポソーム内に内包されていることも好ましく、さらに、前記製剤助剤が、緩衝剤、キレート剤、粘度調整剤、および安定剤よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上であることも好ましい。 It is also preferable that 5 to 35% by mass of the nonionic iodide compound is encapsulated in liposomes, and the formulation aid is selected from the group consisting of a buffer, a chelating agent, a viscosity modifier, and a stabilizer. It is also preferable that it is at least one selected.
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液に、またはリポソームの懸濁液を調製する際に、所定の条件で超音波を照射することにより、リポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームが微細化されたリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。 According to the method for producing a liposome-containing preparation of the present invention, the liposome encapsulated substance is encapsulated by irradiating the liposome suspension or ultrasonic waves under predetermined conditions when preparing the liposome suspension. It is possible to produce a liposome-containing preparation in which the conversion rate is improved and the liposome is miniaturized. Furthermore, the liposome-containing preparation obtained by such a production method can be suitably used as a drug carrier or an artificial oxygen carrier.
以下、本発明のリポソーム含有製剤の製造方法について詳細に説明する。 Hereinafter, the production method of the liposome-containing preparation of the present invention will be described in detail.
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法は、調製されたリポソームの懸濁液に所定条件で超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する方法、または超臨界二酸化炭素を反応媒体としたリポソームの調製方法（以下、超臨界二酸化炭素法）によりリポソームの懸濁液を調製する際に超音波を照射する方法、である。 The method for producing the liposome-containing preparation of the present invention is a method for producing a liposome-containing preparation by irradiating the prepared liposome suspension with ultrasonic waves under predetermined conditions, or preparing a liposome using supercritical carbon dioxide as a reaction medium. This is a method of irradiating ultrasonic waves when preparing a suspension of liposomes by a method (hereinafter referred to as supercritical carbon dioxide method).
このような方法により製造されるリポソーム含有製剤は、水溶性封入物質が内包されたリポソームが水性溶媒中に分散している水性分散液として得られる。 The liposome-containing preparation produced by such a method is obtained as an aqueous dispersion in which liposomes encapsulating a water-soluble encapsulating substance are dispersed in an aqueous solvent.
リポソームとしては、多重層膜からなるリポソーム（Multilamellar vesicles; ＭＬＶ）、粒径が大きい一枚膜のＬＵＶからなるリポソーム（Large unilamellar veislcles）
、粒径が５０ｎｍ未満の小さい一枚膜のＳＵＶからなるリポソーム（Small unilamellar vesicles）が挙げられ、これらは混在していてもよい。
As liposomes, multilamellar vesicles (MLV), large unilamellar veislcles with large particle size LUVs
Examples thereof include small unilamellar vesicles composed of small single-film SUVs having a particle size of less than 50 nm, and these may be mixed.
リポソームは、二分子膜小胞体であり、一般には脂質二重膜で構成される。本発明の製造方法に用いられるリポソーム膜構成物質は、膜構成物質として一般に使用されるものであれば特に限定されない。通常は、リポソーム用脂質であるリポソーム形成能を有するリン脂質および／または糖脂質を必須の主要成分とし、それ以外に任意成分として、次の物質を共存させてもよい。任意成分には、脂質膜安定化剤としてのステロール類などのほか、荷電物質としての脂肪酸またはその塩、脂質混合乳化物など、従来から小胞体の形成成分として用いられているものも含まれる。 Liposomes are bilayer vesicles and are generally composed of lipid bilayers. The liposome membrane constituent material used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is generally used as a membrane constituent material. Usually, a phospholipid and / or glycolipid having liposome-forming ability, which is a lipid for liposomes, is an essential main component, and the following substances may coexist as optional components. Optional components include sterols as lipid membrane stabilizers, fatty acids or salts thereof as charged substances, lipid mixed emulsions, and the like conventionally used as components for forming endoplasmic reticulum.
以下、リポソーム含有製剤を調製する際に用いられる各成分について説明する。 Hereinafter, each component used when preparing a liposome containing formulation is demonstrated.
（水溶性薬剤）
本発明で用いられる水溶性薬剤としては、造影性物質、抗がん性物質、抗酸化性物質、抗菌性物質、抗炎症性物質、血行促進性物質、美白物質、肌荒れ防止物質、老化防止物質、発毛促進性物質、保湿性物質、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などの水溶性薬剤が挙げられる。本発明のリポソーム含有製剤は、水溶性薬剤として造影性物質、抗がん性物質を用いることが好ましい。
(Water-soluble drug)
Examples of the water-soluble drug used in the present invention include an imaging substance, an anticancer substance, an antioxidant substance, an antibacterial substance, an anti-inflammatory substance, a blood circulation promoting substance, a whitening substance, a rough skin preventing substance, and an anti-aging substance. , Hair growth-promoting substances, moisturizing substances, hormone agents, vitamins, pigments, and water-soluble drugs such as proteins. The liposome-containing preparation of the present invention preferably uses a contrast-enhancing substance or an anticancer substance as a water-soluble drug.
造影性物質としては、水溶性ヨウド系化合物を用いることができる。水溶性ヨウド系化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低く、投与された人体に対する負荷が小さいためにより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物としてヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6−トリヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。 As the contrast-enhancing substance, a water-soluble iodine compound can be used. The water-soluble iodine-based compound is not particularly defined as long as it has contrast properties, regardless of whether it is ionic or nonionic. In general, a nonionic iodine compound is more desirable because it has a lower osmotic pressure than an ionic iodine compound and a smaller burden on the administered human body. As the water-soluble nonionic iodide compound, a nonionic iodide compound containing phenyl iodide, for example, having at least one 2,4,6-triiodophenyl group is preferable.
そのような非イオン性ヨウド化合物として、具体的には、イオパミドール（Iopamidol
）、イオメプロール(Iomeprol)、イオヘキソール(Iohexol)、イオペントール(Iopentol)
、イオプロミド（Iopromide）、イオシミド(Iosimide)、イオベルソール(Ioversol)、イ
オトロラン(Iotrolan)、イオタズル(Iotasul)、イオジキサノール(Iodixanol)、イオデシノモール(Iodecimol)、（1,3−ビス−（Ｎ−3,5−ビス−［２，３−ジヒドロキシプロピ
ルアミノカルボニル］−2,4,6−トリヨードフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセチルアミノ
）プロパンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
As such a nonionic iodine compound, specifically, iopamidol (Iopamidol)
), Iomeprol, Iohexol, Iopentol
, Iopromide, Iosimide, Ioversol, Iotrolan, Iotasul, Iodixanol, Iodecimol, (1,3-bis- (N-3,5-) Bis- [2,3-dihydroxypropylaminocarbonyl] -2,4,6-triiodophenyl) -N-hydroxyacetylamino) propane. These compounds may be used alone or in combination of two or more.
また、抗がん化合物としては、具体的には、メトトレキサート、ドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトボシド、エリブシチン、カプトデシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスブラチン、ブレドニゾンなどが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。 Specific examples of the anticancer compound include methotrexate, doxorubicin, ebirubicin, daunorubicin, vincristine, vinblastine, etovoside, eribucine, captodecin, paclitaxel, docetaxol, cisbratin, and bradnisone. These compounds may be used alone or in combination of two or more.
なお本明細書において、上記化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。 In addition, in this specification, the said compound may be mentioned including the salt, hydrate, etc. other than a free form.
本発明のリポソーム含有製剤をＸ線検査用造影剤として用いる場合、好適なヨウド系化合物としては、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールが好ましい。特にイオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧をさらに低下させる利点がある。 When the liposome-containing preparation of the present invention is used as a contrast medium for X-ray examination, preferred iodo compounds are highly hydrophilic and iomeprol, iopamidol, iotrolan, and iodixanol, which do not increase osmotic pressure even at high concentrations. . In particular, dimer nonionic iodine compounds such as iotrane and iodixanol have the advantage of further reducing the osmotic pressure because the total number of moles is low even when a contrast agent having the same iodine concentration is prepared.
本発明のリポソーム含有製剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の５〜４０質量％、好ましくは５〜３５質量％、より好ましくは１０〜２５質量％であることが望ましい。この内包化率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るため、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。 The concentration of the water-soluble iodo compound in the liposome-containing preparation of the present invention can be arbitrarily set based on factors such as the nature of the contrast compound, the intended route of administration of the preparation, and clinical indicators. The amount of the iodine compound encapsulated in the liposome is typically 5 to 40% by mass, preferably 5 to 35% by mass, and more preferably 10 to 25% by mass of the total iodine compound in the X-ray contrast medium. It is desirable. Since the encapsulation rate is below the limit of the dense packing of the liposome particles, the retention stability of the contrast medium in the liposome is not impaired.
（リン脂質）
また、リン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどに代表されるリン脂質が挙げられる。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
(Phospholipid)
Examples of phospholipids include phospholipids represented by phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, sphingomyelin and the like. Phospholipids derived from egg yolk, soybeans and other animal and plant materials, hydrogenated products thereof, semi-synthetic phospholipids such as hydroxide derivatives, or synthetic processed products are used without limitation. The constituent fatty acid of the phospholipid is not particularly limited, and may be either a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid.
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。 Specific examples of neutral phospholipids include dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dimyristol phosphatidylcholine (DMPC), dioleyl phosphatidylcholine (DOPC), dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanol Examples include amines and distearoyl phosphatidylethanolamine.
上記中性リン脂質のほかに、アニオン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、さらには重合性リン脂質、ならびにカチオン性（正荷電）脂質を含んでもよい。 In addition to the neutral phospholipid, a charged phospholipid such as an anionic phospholipid and a cationic phospholipid, a polymerizable phospholipid, and a cationic (positively charged) lipid may be included.
負に荷電したリン脂質として、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファ
チジルセリン（DSPS）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジミリストイルホスファチジン酸などを挙げることができる。
Negatively charged phospholipids include dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dimyristoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS), distearoylphosphatidylserine (DSPS), dipalmitoylphosphatidylinositol ( DPPI), distearoyl phosphatidylinositol (DSPI), distearoyl phosphatidic acid (DSPA), dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA), dimyristoyl phosphatidic acid and the like.
カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。 Cationic phospholipids include esters of phosphatidic acid and amino alcohol, such as esters of dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA) or distearoyl phosphatidic acid (DSPA) and hydroxyethylenediamine.
本発明において用いられるリン脂質には、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含むことが望ましい。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用する示差熱分析による。 The phospholipid used in the present invention desirably contains at least a phospholipid having a transition temperature. The “(phase) transition temperature” of a phospholipid is a temperature that causes a phase transition between both the gel and liquid crystal states that the phospholipid can take. The measurement is by differential thermal analysis using a differential scanning calorimeter (DSC).
相転移点を有するリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度（以下同じ）：23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水
素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。
Phospholipids having a phase transition point include dimyristoyl phosphatidylcholine (transition temperature (same below): 23-24 ° C), dipalmitoylphosphatidylcholine (41.0-41.5 ° C), hydrogenated soybean lecithin (53 ° C), hydrogenated soybean phosphatidylcholine. (54 ° C.), distearoyl phosphatidyl choline (54.1-58.0 ° C.) and the like.
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。 These phospholipids are usually used alone, but may be used in combination of two or more. However, when two or more kinds of charged phospholipids are used, it is desirable to use them between negatively charged phospholipids or between positively charged phospholipids from the viewpoint of preventing liposome aggregation.
カチオン性脂質の例としては、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS
）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、
２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）およびＮ−［１
−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）などが挙げられる。
Examples of cationic lipids include 1,2-dioleoyloxy-3- (trimethylammonium) propane (DOTAP), N, N-dioctadecylamide glycylspermine (DOGS).
), Dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDAB), N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA),
2,3-dioleoyloxy-N- [2 (spermine-carboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA) and N- [1
-(2,3-Dimyristyloxy) propyl] -N, N-dimethyl-N- (2-hydroxyethyl) ammonium bromide (DMRIE) and the like.
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。 Examples of glycolipids include glycerolipids such as digalactosyl diglyceride and galactosyl diglyceride sulfate, galactosylceramide, galactosylceramide sulfate, lactosylceramide, sphingoglycolipids such as ganglioside G7, ganglioside G6, and ganglioside G4.
必要に応じリポソームの膜構成成分として、上記脂質成分の他に他の成分を加えることもできる。その例として、膜安定化剤またはポリアルキレンオキシド基導入用アンカーとしてコレステロール、コレステロールエステルなどのステロール類、荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなどが挙げられる。 In addition to the above lipid components, other components can be added as membrane constituents of the liposome as necessary. Examples thereof include sterols such as cholesterol and cholesterol esters as membrane stabilizers or anchors for introducing polyalkylene oxide groups, and dialkyl phosphates such as dicetyl phosphate which is a charged substance.
本発明における好ましいリポソームの別の態様として、膜構成成分としてホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群より選ばれるリン脂質を用いることができ、両者を組み合わせてもよい。 As another preferred embodiment of the liposome in the present invention, a phospholipid selected from the group consisting of phosphatidylcholine and phosphatidylserine can be used as a membrane component, and both may be combined.
（製剤助剤）
またリポソームの懸濁液には、製剤助剤が溶解または分散していることが好ましい。「製剤助剤」とは、製剤化に際し封入物質とともに添加されるものであり、各種の物質が適宜使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、キレート化剤、粘度調節剤、安定剤、浸透圧調節剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、パラオキシ安息香酸メチルといった保存剤などが挙げられる。本発明においては、緩衝剤、キレート剤、粘度調整剤、および安定剤よりなる群から選ばれる少なくとも１つ以上用いることが好ましい。
(Formulation aid)
Further, it is preferable that the formulation aid is dissolved or dispersed in the liposome suspension. The “formulation aid” is added together with the encapsulated substance during formulation, and various substances are used as appropriate. Specific examples include various physiologically acceptable buffers, chelating agents, viscosity modifiers, stabilizers, osmotic pressure regulators, antioxidants such as α-tocopherol, and preservatives such as methyl parahydroxybenzoate. It is done. In the present invention, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of a buffer, a chelating agent, a viscosity modifier, and a stabilizer.
このような各成分を用いて、以下のようにして、本発明のリポソーム含有製剤を調製する。 Using each of these components, the liposome-containing preparation of the present invention is prepared as follows.
リポソーム含有製剤の製造方法
本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法としては、実施態様１および実施態様２を挙げることができる。実施態様１は、調製されたリポソームの懸濁液に所定条件で超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する方法であり、実施態様２は、超臨界二酸化炭素法によりリポソームの懸濁液を調製する際に超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する方法である。まず、実施態様１から説明する。
Production method of liposome-containing preparation Examples of the production method of the liposome-containing preparation according to the present invention include Embodiment 1 and Embodiment 2. Embodiment 1 is a method of producing a liposome-containing preparation by irradiating the prepared liposome suspension with ultrasonic waves under predetermined conditions, and Embodiment 2 is a method of producing a liposome suspension by supercritical carbon dioxide method. It is a method for producing a liposome-containing preparation by irradiating ultrasonic waves during preparation. First, Embodiment 1 will be described.
（実施態様１）
本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、その実施態様１においては、まずリポ
ソームの懸濁液を調製する。
(Embodiment 1)
In Embodiment 1 of the method for producing a liposome-containing preparation according to the present invention, a liposome suspension is first prepared.
実施態様１においてリポソームの懸濁液は、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有する脂質膜構成物質などを含有する超臨界二酸化炭素と、水溶性薬剤などの封入物質等を含有する水溶液とを混合することにより形成される。二酸化炭素は、その臨界温度が３１．１℃、臨界圧力が７５．３ｋｇ／ｃｍ2と比較的扱いやすく、そのガスは不活性である
ため残存しても人体に無害であり、さらに高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により好適である。本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、通常３２〜１００℃、好ましくは３２〜８０℃である。かかる温度範囲の中でも特に好適な温度は、使用するリン脂質の相転移温度またはそれより上である。圧力は、通常５０〜５００ｋｇ／ｃｍ2、好ましくは９０〜１５０ｋｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１００〜１２０ｋｇ／ｃｍ2範囲である。また、高温下に脂質類を水中で強制的に
融和させる方法でないために、高温による脂質類の変性、たとえばリン脂質が加水分解してリゾ体を生じたり、不飽和成分の過酸化が起きるといった問題もない。
In Embodiment 1, the suspension of liposomes is mixed with supercritical carbon dioxide containing a lipid membrane constituent having at least a phospholipid having a transition temperature and an aqueous solution containing an encapsulating substance such as a water-soluble drug. Is formed. Carbon dioxide is relatively easy to handle with a critical temperature of 31.1 ° C. and a critical pressure of 75.3 kg / cm 2, and the gas is inert so it is harmless to the human body even if it remains. Is preferable because it is inexpensive and easily available. The temperature of carbon dioxide in the supercritical state (including subcritical state) used in the production method of the present invention is usually 32 to 100 ° C, preferably 32 to 80 ° C. A particularly suitable temperature within such a temperature range is at or above the phase transition temperature of the phospholipid used. The pressure is usually in the range of 50 to 500 kg / cm 2 , preferably 90 to 150 kg / cm 2 , particularly preferably 100 to 120 kg / cm 2 . In addition, because it is not a method for compulsorily compatibilizing lipids in water at high temperatures, modification of lipids at high temperatures, for example, phospholipids are hydrolyzed to form lyso forms, and unsaturated components are peroxidized. There is no problem.
リポソームの懸濁液の調製は、具体的には以下のように行なわれる。 The preparation of the liposome suspension is specifically performed as follows.
まず、圧力容器に、リポソームの脂質膜構成物質としてリン脂質および脂質膜安定化物質などを仕込む。脂質膜構成物質として上記リン脂質を、好ましくはカチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類、グリコール類から少なくとも１種選ばれた化合物とともに混合して仕込む。脂質膜構成物質を仕込んだ後、この圧力容器に備えられた加熱手段により所定の温度に加熱して全体を融解させた後、マグネティックスターラー等の攪拌手段により攪拌させながら、液体二酸化炭素を加える。さらに、圧力容器内を上記の圧力および温度として、液体二酸化炭素を超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。次いで、超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素に、リポソームの脂質膜構成物質としてリン脂質および脂質膜安定化物質などを混合する。 First, a phospholipid, a lipid membrane stabilizing substance, and the like are charged in a pressure vessel as a lipid membrane constituent material of a liposome. The above phospholipid as a lipid membrane constituent is preferably at least one selected from cationic phospholipids, polyalkylene oxide modified phospholipids, compounds having a polyalkylene oxide group, compounds having a polyethylene glycol group, sterols, and glycols. Mix together with the compound. After the lipid membrane constituent material is charged, the whole is melted by heating to a predetermined temperature by a heating means provided in the pressure vessel, and then liquid carbon dioxide is added while stirring by a stirring means such as a magnetic stirrer. Further, the liquid carbon dioxide is brought into a supercritical state or a subcritical state with the above pressure and temperature inside the pressure vessel. Next, a phospholipid, a lipid membrane stabilizing substance, and the like are mixed with the carbon dioxide in a supercritical (or subcritical) state as a lipid membrane constituent material of the liposome.
次いで、この超臨界二酸化炭素を攪拌しながら、その中に、封入物質、必要に応じて前記製剤助剤を含む水溶液を２回以上に分けて添加し、あるいは少量ずつ連続的に添加して混合する。具体的には該水溶液を、１分当り該超臨界二酸化炭素容量の１／１０００〜１／５容量、好ましくは１／５００〜１／１０容量、より好ましくは１／２００〜１／２０容量の割合で添加することがよい。 Next, while stirring the supercritical carbon dioxide, the encapsulated substance and, if necessary, the aqueous solution containing the above-mentioned formulation aid are added in two or more times, or added in small portions continuously and mixed. To do. Specifically, the aqueous solution is 1/1000 to 1/5 volume, preferably 1/500 to 1/10 volume, more preferably 1/200 to 1/20 volume of the supercritical carbon dioxide capacity per minute. It is better to add in proportions.
封入物質のリポソーム内への内包化の効率は、リポソーム用脂質の脂質総量と封入物質などを含む水溶液との比率によっても左右される。ここでいう脂質総量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。上記水溶液１リットル（Ｌ）に対し脂質総量が１５〜１５０ｍmoles 、好ましくは３０〜１２０ｍmolesの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍmolesの範囲の割合で混合すると、水溶性封入物質のリポソーム内への内包化が良好に進行し、結果的にその封入物質の保持効率も向上する。 The efficiency of the encapsulation of the encapsulated substance in the liposome also depends on the ratio between the total lipid amount of the lipid for liposome and the aqueous solution containing the encapsulated substance. The total amount of lipid here is the total mass of all phospholipids, sterols and other added lipids constituting the liposome membrane. When the total amount of lipid is mixed in a ratio of 15 to 150 mmoles, preferably 30 to 120 mmoles, more preferably 50 to 100 mmoles per 1 liter (L) of the aqueous solution, the water-soluble encapsulating substance is encapsulated in the liposome. The process proceeds well, and as a result, the retention efficiency of the encapsulated material is improved.
上記のようにして超臨界二酸化炭素と水溶液とが混合された混合溶液を調製した後に、圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出すると、封入物質を内包するリポソームが分散しているリポソームの懸濁液が生成する。 After preparing a mixed solution in which supercritical carbon dioxide and an aqueous solution are mixed as described above, when the pressure vessel is depressurized and carbon dioxide is discharged, the suspension of liposomes in which the liposomes encapsulating the encapsulated material are dispersed is dispersed. A turbid liquid is formed.
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包化率、封入物質のリポソーム内の保持率が高い。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、有機溶剤を使用せずに非イオン性かつ水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することができる本法は、本発明のリポソーム含有製
剤の製造には有用な方法である。
The liposome preparation method using supercritical or subcritical carbon dioxide has higher liposome production rate, encapsulation rate of the encapsulated substance, and retention rate of the encapsulated substance in the liposome than the conventional method. Furthermore, this method, which can be applied on an industrial scale, can efficiently encapsulate a nonionic and water-soluble substance in a liposome without using an organic solvent, is useful for producing the liposome-containing preparation of the present invention. Is a useful method.
本発明におけるリポソームの多くは、通常、多重層膜リポソームとして存在するが、一枚膜リポソームもまた混在していてもよい。ここにいう一枚膜リポソームとは、リン脂質二重層が実質的に1つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察において、レプリカが概ね1つの層として認められ
るリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを一枚膜と判定し、２つ以上の段差が認められるものを「多重層膜」と判定している。多重層膜からなるリポソーム（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）は、リポソーム膜の二分子膜を剥がしてその多重層をなるべく薄くすることが望ましい。一枚膜リポソームは、多重層膜リポソームに比べ、封入容量が大きく、さらに封入効率が高い。したがって、投与する脂質量も大きくならないため、一枚膜リポソームの割合が多い方が望ましい。
Many of the liposomes in the present invention are usually present as multilamellar liposomes, but single membrane liposomes may also be present. The single membrane liposome here is a liposome composed of a membrane (unilamellar vesicle) in which a phospholipid bilayer substantially forms one layer. Here, “substantially” means that the liposome is composed of a phospholipid bilayer in which the replica is generally recognized as one layer in the following transmission electron microscope (TEM) observation by the Freeze fracture replica method. It means that That is, the observed particles of the carbon film having no step are determined as a single film, and those having two or more steps are determined as a “multilayer film”. As for the liposome (multilamellar vesicles; MLV) which consists of a multilayer film, it is desirable to peel the bilayer membrane of a liposome film and to make the multilayer as thin as possible. Single membrane liposomes have a larger encapsulation capacity and higher encapsulation efficiency than multilamellar liposomes. Therefore, since the amount of lipid to be administered does not increase, it is desirable that the ratio of single membrane liposomes is large.
このように調製されたリポソームの懸濁液に、所定の条件で超音波を照射してリポソーム含有製剤を製造する。 A liposome-containing preparation is produced by irradiating the thus prepared liposome suspension with ultrasonic waves under predetermined conditions.
（超音波照射）
このように調製されたリポソームの懸濁液を、前記リン脂質の転移温度〜転移温度＋５０℃（ただし１００℃を超えない）に加熱したのち、その温度±１０℃（ただし１００℃を超えない)に保持しながら所定の条件で超音波を照射する。
(Ultrasonic irradiation)
After the liposome suspension thus prepared is heated to the transition temperature of the phospholipid to the transition temperature + 50 ° C. (but not exceeding 100 ° C.), the temperature ± 10 ° C. (however, not exceeding 100 ° C.) And irradiating with ultrasonic waves under predetermined conditions.
照射条件は、リポソームの懸濁液に含有されるリポソームの形態、粒子径分布、内包化率等により適宜選択されるが、１０〜１００ｋＨｚ、好ましくは１５〜４５ｋＨｚの超音波を、１〜６００ｗ／ｍｌ／分、好ましくは５〜５００ｗ／ｍｌ／分照射することが望ましい。照射量は、使用する超音波分散機の定格出力、照射する分散液の量、照射する時間から計算することができる。 Irradiation conditions are appropriately selected depending on the form of the liposome contained in the liposome suspension, the particle size distribution, the encapsulation rate, and the like, but an ultrasonic wave of 10 to 100 kHz, preferably 15 to 45 kHz, is applied to 1 to 600 w / It is desirable to irradiate ml / min, preferably 5 to 500 w / ml / min. The irradiation amount can be calculated from the rated output of the ultrasonic disperser to be used, the amount of the dispersion liquid to be irradiated, and the irradiation time.
このようにリン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となって流動性が高まり、さらに、その状態で超音波処理を行うことにより、実質的に有機溶媒などの溶解助剤を用いなくても、効率的にリポソームの封入物質の内包化率を向上させることができ、かつリポソームを微細化することができる。さらに、溶解助剤により膜強度が低下することがないため、その後の工程においても内包化率が低下することがない。 When heated above the transition temperature of the phospholipid in this way, the phospholipid having the transition temperature becomes a liquid crystal state and the fluidity is increased. Further, by performing ultrasonic treatment in that state, the organic solvent, etc. Even if the solubilizing agent is not used, the encapsulation rate of the encapsulated substance of the liposome can be improved efficiently and the liposome can be miniaturized. Furthermore, since the film strength is not reduced by the dissolution aid, the encapsulation rate is not reduced in the subsequent steps.
本発明に用いられるリポソームの懸濁液としては、上記したように超臨界二酸化炭素法で調製したリポソームの懸濁液を用いることが好ましい。この方法で調製されたリポソームの懸濁液は、粒子径分布が均一なリポソームを含有しているため、本発明の上記超音波処理によって、上記と同様にリポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームがより微細化され、さらに粒子径分布が均一なリポソーム含有製剤が得られる。 As the liposome suspension used in the present invention, a liposome suspension prepared by the supercritical carbon dioxide method as described above is preferably used. Since the liposome suspension prepared by this method contains liposomes having a uniform particle size distribution, the above-described ultrasonic treatment of the present invention improves the encapsulation rate of the encapsulated substance of the liposome as described above. At the same time, the liposome is further refined, and a liposome-containing preparation having a uniform particle size distribution is obtained.
リポソームの懸濁液の超音波処理は、具体的には、次のようにして行うことができる。 Specifically, the ultrasonic treatment of the liposome suspension can be performed as follows.
上述のようにリポソームの懸濁液を調製した後、
（１）得られたリポソームの懸濁液を容器内で攪拌しながら、上記条件で超音波を照射する方法、
（２）得られたリポソームの懸濁液を循環させて、上記条件で超音波が照射されている箇所を通過させる方法、
（３）得られたリポソームの懸濁液を容器内で攪拌しないで、上記条件で超音波を照射す
る方法、などによりリポソームの懸濁液の超音波処理を行うことができる。上記（２）の方法により行う場合は、超音波処理時間は超音波が照射されていた累積時間から求める。本発明においては、製造工程が簡易である上記（１）の方法で超音波処理を行うことが好ましい。
After preparing a suspension of liposomes as described above,
(1) A method of irradiating ultrasonic waves under the above conditions while stirring the obtained liposome suspension in a container,
(2) A method of circulating a suspension of the obtained liposome and passing a portion irradiated with ultrasonic waves under the above conditions,
(3) The liposome suspension can be sonicated by a method of irradiating ultrasonic waves under the above conditions without stirring the obtained liposome suspension in a container. In the case of performing the method (2) above, the ultrasonic treatment time is obtained from the accumulated time during which the ultrasonic wave was irradiated. In the present invention, it is preferable to perform ultrasonic treatment by the method (1) above, which has a simple manufacturing process.
本発明においては、上記のように超音波が照射されたリポソームの懸濁液を、さらに濾過することが好ましい。 In the present invention, it is preferable to further filter the liposome suspension irradiated with ultrasonic waves as described above.
（濾過）
超音波が照射されたリポソームの懸濁液の濾過は、所定の孔径を有する濾過膜を通過させて濾過することが好ましく、エクストルーダーを使用して濾過することが望ましい。この濾過膜としては、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができ、その孔径は０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ましくは０．１５〜０．２μｍの範囲が望ましい。
(filtration)
Filtration of the suspension of liposomes irradiated with ultrasonic waves is preferably carried out through a filtration membrane having a predetermined pore size, and is desirably carried out using an extruder. As the filtration membrane, a polycarbonate type, a cellulose type or the like can be used as appropriate, and the pore diameter is 0.05 to 0.4 μm, preferably 0.1 to 0.4 μm, more preferably 0.15. A range of 0.2 μm is desirable.
具体的には、上記孔径を有するフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。この静圧式押出し装置としては、各種の静圧式押出し装置、たとえば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製）などを挙げることができる。これにより脂質分子の配向が均一であり、水分散性が良好なリポソーム用脂質が得られる。押出し濾過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に記載されている。 Specifically, uniform liposomes having optimum dimensions can be efficiently prepared by passing through a hydrostatic extrusion apparatus equipped with a filter having the above pore diameter. Examples of the hydrostatic extrusion device include various hydrostatic extrusion devices such as “Extruder” (trade name, manufactured by NOF Liposome), “Liponizer” (trade name, manufactured by Nomura Microscience), and the like. As a result, a lipid for liposomes having a uniform orientation of lipid molecules and good water dispersibility can be obtained. The extrusion filtration method is described in, for example, Biochim. Biophys. Acta 557, 9 (1979).
本発明の望ましい態様として、前記押出し濾過は、リポソームの懸濁液を転移温度を有するリン脂質の転移温度以上、好ましくは“転移温度＋１０℃”以上に加温し、その後、細孔のある膜を通すことが好ましい。この「転移温度＋１０℃以上」とは、用いるリン脂質の種類と組成にもよるが、３５℃から６５℃程度である。 In a preferred embodiment of the present invention, the extrusion filtration is performed by heating the liposome suspension to a temperature higher than the transition temperature of a phospholipid having a transition temperature, preferably “transition temperature + 10 ° C.” or higher, and then a membrane having pores. It is preferable to pass through. The “transition temperature + 10 ° C. or higher” is about 35 ° C. to 65 ° C., depending on the type and composition of the phospholipid used.
加圧押出し濾過の操作では、このようにリン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、流動性が高まる。本発明の製造方法によるリポソーム用脂質は、規則正しい配向を有する均一な脂質膜を構成しているため、水溶性封入物質を封入した粘度の高いリポソーム懸濁液であっても、フィルターの目詰まりを起こすことなく粒径の揃ったリポソームを作製することができる。 In the operation of pressure extrusion filtration, when the temperature is higher than the transition temperature of the phospholipid as described above, the phospholipid having the transition temperature becomes a liquid crystal state and the fluidity is increased. Since the lipid for liposomes according to the production method of the present invention constitutes a uniform lipid membrane having a regular orientation, even a highly viscous liposome suspension encapsulating a water-soluble encapsulating substance can clog the filter. Liposomes with a uniform particle size can be produced without waking up.
このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。引き続きリポソームを、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により未保持の封入物質を除去して精製してもよい。濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のリポソーム含有製剤が調製される。 Incorporation of such an “extrusion” operation step has the advantage that, in addition to the above sizing, it is possible to exchange liposome dispersions, remove undesirable substances, and filter sterilization. Subsequently, the liposome may be purified by removing unretained encapsulated material by a method such as centrifugation, ultrafiltration, or gel filtration. Operations such as concentration, dilution, and lyophilization may be optionally performed. Subsequently, the liposome-containing preparation of the present invention is prepared through preparation processes such as sterilization and packaging.
次に、本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法の実施態様２について説明する。 Next, Embodiment 2 of the method for producing a liposome-containing preparation according to the present invention will be described.
（実施態様２）
本発明の実施態様２は、上述した実施態様１の超臨界二酸化炭素法によるリポソーム懸濁液の調製法において、水溶性薬剤を少なくとも含有する水溶液と、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質を超臨界状態の二酸化炭素中に含んでなる溶液とを混合する際に、所定条件で超音波を照射するリポソーム含有製剤の製造方法である。実施態様２におけるリポソーム含有製剤の製造は、基本的には実施態様１と同様の条件で行い、実質的に溶解助剤を使用しない。
(Embodiment 2)
Embodiment 2 of the present invention is a phospholipid having at least an aqueous solution containing at least a water-soluble drug and a phospholipid having a transition temperature in the method for preparing a liposome suspension by the supercritical carbon dioxide method of Embodiment 1 described above. Is a method for producing a liposome-containing preparation in which an ultrasonic wave is irradiated under a predetermined condition when mixing with a solution comprising carbon dioxide in a supercritical state. The production of the liposome-containing preparation in Embodiment 2 is basically performed under the same conditions as in Embodiment 1 and substantially no dissolution aid is used.
実施態様２においては、超音波照射する際の温度（すなわち、超臨界二酸化炭素を生成させる温度）が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃、の範囲であることが好ましい。また、超音波照射条件は、リポソームの形態、粒子径分布、内包化率等により適宜選択されるが、１０〜１００ｋＨｚ、好ましくは１５〜４５ｋＨｚの超音波を、１〜６００ｗ／ｍｌ／分、好ましくは５〜５００ｗ／ｍｌ／分照射することが望ましい。照射量は、使用する超音波分散機の定格出力、照射する分散液の量、照射する時間から計算することができる。 In Embodiment 2, the temperature at which the ultrasonic irradiation is performed (that is, the temperature at which supercritical carbon dioxide is generated) is the higher of the critical temperature of carbon dioxide or the transition temperature of phospholipid, which is higher than the transition temperature + 50 ° C. A range is preferable. The ultrasonic irradiation conditions are appropriately selected depending on the form of the liposome, the particle size distribution, the encapsulation rate, etc., but the ultrasonic wave of 10 to 100 kHz, preferably 15 to 45 kHz, preferably 1 to 600 w / ml / min. Is preferably irradiated at 5 to 500 w / ml / min. The irradiation amount can be calculated from the rated output of the ultrasonic disperser to be used, the amount of the dispersion liquid to be irradiated, and the irradiation time.
このような条件下で超音波処理を行うことにより、実質的に有機溶媒などの溶解助剤を用いなくても、効率的にリポソームの封入物質の内包化率を向上させるとともに、リポソームを微細化することができる。さらに、溶解助剤により膜強度が低下することがないため、その後の工程においても内包化率が低下することがない。 By performing sonication under such conditions, the encapsulation rate of liposome encapsulated substances can be improved efficiently and the size of the liposomes can be refined, even without substantially using a solubilizing agent such as an organic solvent. can do. Furthermore, since the film strength is not reduced by the dissolution aid, the encapsulation rate is not reduced in the subsequent steps.
本発明においては、上記のように超音波が照射してリポソームの懸濁液を調製した後、実施態様１と同様にして濾過することが好ましく、さらに濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のリポソーム含有製剤が調製される。 In the present invention, after preparing a liposome suspension by irradiation with ultrasonic waves as described above, it is preferable to filter in the same manner as in Embodiment 1, and further operations such as concentration, dilution, and lyophilization are optional. You may go to Subsequently, the liposome-containing preparation of the present invention is prepared through preparation processes such as sterilization and packaging.
リポソーム含有製剤
本発明のリポソーム含有製剤は、リポソームの平均粒子径が５０〜８００ｎｍであることが望ましい。リポソームの粒径は、体内の特定部位に取り込ませる場合には、２００ｎｍよりも小さくすることが好ましく、体内の捕食細胞に取り込ませる場合には２００ｎｍ以上が望ましい。
Liposome-containing preparation The liposome-containing preparation of the present invention preferably has an average particle size of the liposome of 50 to 800 nm. The liposome particle size is preferably smaller than 200 nm when incorporated into a specific site in the body, and preferably 200 nm or more when incorporated into predatory cells in the body.
さらに、リポソーム含有製剤中のリポソームは、封入物質がリポソーム膜構成成分に対して、１〜１０、好ましくは２〜８、より好ましくは３〜６の重量比となる量で内包されていることが望ましい。 Furthermore, the liposome in the liposome-containing preparation is encapsulated in an amount such that the encapsulated substance is in a weight ratio of 1 to 10, preferably 2 to 8, more preferably 3 to 6 with respect to the liposome membrane constituent. desirable.
このように、リポソーム含有製剤は、リポソームの封入物質の内包化率が向上しているため、生体内に投与するリポソーム含有製剤は少量で済み、患者に与える負担が小さく、特に、薬物送達システム（ＤＤＳ）を用いた造影剤に適用される場合においては、患者に与える負担がさらに軽減される。 Thus, since the liposome-containing preparation has an improved encapsulation rate of the encapsulated substance in the liposome, the amount of the liposome-containing preparation to be administered into the living body is small, and the burden on the patient is small. When applied to a contrast medium using DDS), the burden on the patient is further reduced.
このような本発明のリポソーム含有製剤は、特に限定されず、化粧料、皮膚外用剤、内服薬、造影剤などに適用することができる。本発明においては、上記効果が得られることから造影剤に好適に用いることができる。 Such a liposome-containing preparation of the present invention is not particularly limited, and can be applied to cosmetics, external preparations for skin, internal medicines, contrast agents and the like. In this invention, since the said effect is acquired, it can use suitably for a contrast agent.
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
[Example]
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
なお、非イオン性ヨウド化合物としては以下のものを用いた。 In addition, the following was used as a nonionic iodine compound.
非イオン性ヨウド化合物
商品名：オイバロミン150（コニカミノルタエムジー（株）製Ｘ線造影剤：イオパミド
ールを306.2mg/ml含有（ヨード含有量150mg/ml））
［実施例１］
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）860mgと、コレステロール384mgとを、60℃に加熱したステンレス製の圧力容器に仕込み、蓋をした。しばらく放置して全体が融解
するのを確認した後、圧力容器内をマグネティックスターラーで攪拌しながら、圧力50kg/cm2の液化二酸化炭素130ｇを圧力容器内に注入した。注入後、圧力容器の体積を減少さ
せることにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに圧力を、120kg/cm2まで加圧した
。その後、100ｍｌのオイバロミン150をHPLCの送液ポンプを利用し、1ml/minの流速で圧
力容器内に注入した。
Nonionic iodine compound trade name: Oibaromin 150 (X-ray contrast agent manufactured by Konica Minolta MG Co., Ltd .: containing 306.2 mg / ml of iopamidol (iodine content of 150 mg / ml))
[Example 1]
Dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) 860 mg and cholesterol 384 mg were charged into a stainless steel pressure vessel heated to 60 ° C. and capped. After confirming that the whole was melted by leaving for a while, 130 g of liquefied carbon dioxide having a pressure of 50 kg / cm 2 was injected into the pressure vessel while stirring the inside of the pressure vessel with a magnetic stirrer. After the injection, the volume of the pressure vessel was reduced to bring the carbon dioxide into a supercritical state, and the pressure was further increased to 120 kg / cm 2 . Thereafter, 100 ml of euvalomin 150 was injected into the pressure vessel at a flow rate of 1 ml / min using an HPLC liquid feed pump.
注入終了後、圧力容器内の二酸化炭素を約20分かけて徐々に抜き、常圧に戻した後、中の溶液を取り出した。得られた溶液の一部を生理食塩水１Ｌにて３回透析を行い、少量のエタノールを加えてリポソームを壊し、遠心分離後、分光光度計で242nmのイオパミドー
ルの吸収を測定することにより、リポソーム中に内包されていたイオパミドールの定量を行った。その結果、内包化率が15％であることが分かった。その後、得られた溶液を超音波分散機（商品名：UH-600-SR（セスエムティー社製） 出力600W、周波数20ｋHz）で5分間処理（115w/ml/分）し、内包化率を測定したところ、15％と変化がなかった。
After completion of the injection, the carbon dioxide in the pressure vessel was gradually withdrawn over about 20 minutes and returned to normal pressure, and then the solution inside was taken out. A portion of the resulting solution was dialyzed 3 times with 1 L of physiological saline, a small amount of ethanol was added to break the liposomes, and after centrifugation, the absorption of 242 nm of iopamidol was measured with a spectrophotometer. The amount of iopamidol encapsulated inside was quantified. As a result, it was found that the encapsulation rate was 15%. The resulting solution is then treated for 5 minutes (115 w / ml / min) with an ultrasonic disperser (trade name: UH-600-SR (manufactured by SSM Corporation), output 600 W, frequency 20 kHz), and the encapsulation rate is measured. As a result, there was no change of 15%.
さらに、この溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3
回、孔径0.3μmの混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造影剤）を調製した。このリポソーム含有製剤の内包化率を測定したところ15％で変化がなかった。また、得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径は210nmであった。
Further, this solution was subjected to 3 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 1 μm and 3 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.45 μm in an extruder heated to 80 ° C.
The mixture was filtered 6 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.3 μm to prepare a liposome-containing preparation (contrast agent). When the encapsulation rate of this liposome-containing preparation was measured, there was no change at 15%. Further, when the particle size of the obtained liposome-containing preparation was measured with a light scattering particle size measuring device (Malvern, Zetasizer 1000), the average particle size was 210 nm.
［比較例］
クロロホルム420mlに、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）860mgと、コレステロール384mgとを溶解した。この溶液に、ジイソプロピルエーテルを420ml加え、さらに、オイバロミン150を15ｍｌ加え、60℃に加熱した後、超音波を5分間かけエマルションを作成した。得られたエマルションをロータリーエバポレーターにかけ、45℃にて約50mlになるまで濃縮した。この中に、オイバロミン150を30ｍｌ、純水を20ml加え、再度40mlに
なるまで濃縮し、さらにオイバロミン150を55ｍｌ、純水を25ml加え、再度80mlになるま
で濃縮した。この後、純水にて100mlとした。
[Comparative example]
Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) 860 mg and cholesterol 384 mg were dissolved in 420 ml of chloroform. To this solution was added 420 ml of diisopropyl ether, and 15 ml of euvalomin 150 was further added. After heating to 60 ° C., an ultrasonic wave was applied for 5 minutes to prepare an emulsion. The obtained emulsion was subjected to a rotary evaporator and concentrated to about 50 ml at 45 ° C. To this, 30 ml of euvalomin 150 and 20 ml of pure water were added and concentrated again to 40 ml. Further, 55 ml of euvalomin 150 and 25 ml of pure water were added, and concentrated again to 80 ml. Then, it was made up to 100 ml with pure water.
得られた溶液の一部を取り、上記実施例１と同様な方法で内包化率を測定したところ、ほぼ理論値どおり15％であった。この後、超音波分散機（商品名：UH-600-SR（セスエム
ティー社製） 出力600W、周波数20ｋHz）で5分間処理（115w/ml/分）し、内包化率を測
定したところ、5％となった。
When a part of the obtained solution was taken and the encapsulation rate was measured by the same method as in Example 1, it was 15% almost as theoretically. After this, it was treated for 5 minutes (115 w / ml / min) with an ultrasonic disperser (trade name: UH-600-SR (manufactured by SMT Co., Ltd.) output 600 W, frequency 20 kHz), and the encapsulation rate was measured. %.
さらに、この溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3
回、孔径0.3μmの混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造影剤）を調製した。この造影剤の内包化率を測定したところ3％に内包化率が下
がった。この結果から、超音波処理の途中およびエクストルーダー処理の途中でリポソームが壊れ、内包化率が下がったものと推測される。
Further, this solution was subjected to 3 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 1 μm and 3 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.45 μm in an extruder heated to 80 ° C.
The mixture was filtered 6 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.3 μm to prepare a liposome-containing preparation (contrast agent). When the encapsulation rate of this contrast agent was measured, the encapsulation rate dropped to 3%. From this result, it is presumed that the liposome was broken during the ultrasonic treatment and during the extruder treatment, and the encapsulation rate was lowered.
また、得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径は240nmであった。 Moreover, when the particle size of the obtained liposome-containing preparation was measured with a light scattering particle size measuring apparatus (Malvern, Zetasizer 1000), the average particle size was 240 nm.
［実施例２］
ステンレス製の圧力容器内に、28kHzの振動子（4392C．（株）カイジョー）を入れ、その上にジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）860mgと、コレステロール384mgとを入れ、蓋をした。その後、圧力容器全体を電熱ヒーターにて、60℃に加熱した後、圧力容器内をさらにマグネティックスターラーで攪拌しながら、圧力50kg/cm2の液化二酸化炭素
130ｇを圧力容器内に注入した。注入後、超音波発信機（4021型、（株）カイジョー）の
スイッチを入れた。さらに、圧力容器の体積を減少させることにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに120kg/cm2まで加圧した。その後、100ｍｌのオイバロミン150 をHPLCの送液ポンプを利用し、1ml/minの流速で圧力容器内に注入した。
[Example 2]
A 28 kHz vibrator (4392C. Kaijo Co., Ltd.) was placed in a stainless steel pressure vessel, and 860 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and 384 mg of cholesterol were placed on it, and the lid was capped. After that, the whole pressure vessel was heated to 60 ° C with an electric heater, and then liquefied carbon dioxide with a pressure of 50 kg / cm 2 while stirring the inside of the pressure vessel with a magnetic stirrer.
130 g was injected into the pressure vessel. After the injection, the ultrasonic transmitter (4021 type, Kaijo Corporation) was turned on. Furthermore, by reducing the volume of the pressure vessel, carbon dioxide was brought into a supercritical state and further pressurized to 120 kg / cm 2 . Thereafter, 100 ml of euvalomin 150 was injected into the pressure vessel at a flow rate of 1 ml / min using an HPLC liquid feed pump.
注入終了後、超音波振動子のスイッチを切り、圧力容器内の二酸化炭素を約20分かけて徐々に抜き、大気圧に戻した後、中の溶液を取り出した。得られた溶液の一部を、実施例１と同様にして内包化率を測定したところ、内包化率は16％であった。さらに、得られた溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.3μm
の混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造影剤）を調製した。この造影剤の内包化率を測定したところ16％で変化がなかった。また、得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径は220nmであった。
After completion of the injection, the ultrasonic vibrator was turned off, and the carbon dioxide in the pressure vessel was gradually removed over about 20 minutes to return to atmospheric pressure, and then the solution inside was taken out. When the encapsulation rate of a part of the obtained solution was measured in the same manner as in Example 1, the encapsulation rate was 16%. Further, the obtained solution was heated 3 times with a mixed cellulose membrane filter with a pore size of 1 μm, 3 times with a mixed cellulose membrane filter with a pore size of 0.45 μm, and a pore size of 0.3 μm with an extruder heated to 80 ° C.
The mixture was filtered 6 times with a mixed cellulose membrane filter to prepare a liposome-containing preparation (contrast agent). When the encapsulation rate of this contrast medium was measured, there was no change at 16%. Further, when the particle size of the obtained liposome-containing preparation was measured with a light scattering particle size measuring device (Malvern, Zetasizer 1000), the average particle size was 220 nm.
［実施例３］
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）860mgと、コレステロール384mgと、ＰＥＧ化脂質（日本油脂（株）製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）384mgとを用いた以外は、実施例
１と同様な方法で、リポソーム化を行った。得られた溶液の一部を、実施例１と同様にして内包化率を測定したところ、内包化率は20％であった。さらに、得られた溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3
回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.2μmの混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造影剤）を調製した。この造影剤の内包化率を測定したところ20％で変化がなかった。また、得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径は170nmであった。
[Example 3]
Liposomeization was performed in the same manner as in Example 1 except that 860 mg of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), 384 mg of cholesterol, and 384 mg of PEGylated lipid (manufactured by NOF Corporation, SUNBRIGHT DSPE-020CN) were used. It was. A part of the obtained solution was measured for the encapsulation rate in the same manner as in Example 1. As a result, the encapsulation rate was 20%. Further, the obtained solution was filtered with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 1 μm using an extruder heated to 80 ° C.
The mixture was filtered 3 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.45 μm and 6 times with a mixed cellulose membrane filter having a pore size of 0.2 μm to prepare a liposome-containing preparation (contrast agent). When the encapsulation rate of this contrast agent was measured, there was no change at 20%. Further, when the particle size of the obtained liposome-containing preparation was measured with a light scattering particle size measuring device (Malvern, Zetasizer 1000), the average particle size was 170 nm.
［造影剤の投与］
実施例１〜３で得られた造影剤を、2mg/kg用量となるように肝癌発癌ラットにそれぞれ尾静脈から投与した。投与後、１時間後にラットをジエチルエーテルで麻酔し、ラット全身のＸ線画像を撮影したところ、腫瘍部分がいずれもはっきり識別できた。12時間後に再度ジエチルエーテルで麻酔し、ラット全身のＸ線画像を撮影したところ、造影剤によるコントラスト補強が認められず、かろうじて識別できるレベル（造影剤を入れなくても識別できるレベル）であった。
[Contrast agent administration]
The contrast agents obtained in Examples 1 to 3 were each administered from the tail vein to hepatocarcinogenic rats so that the dose was 2 mg / kg. One hour after administration, the rat was anesthetized with diethyl ether, and when an X-ray image of the whole body of the rat was taken, all of the tumor portions could be clearly identified. 12 hours later, anesthesia with diethyl ether was performed again, and when an X-ray image of the whole body of the rat was taken, contrast enhancement by contrast medium was not observed, and it was barely discriminable (a level that could be discriminated without adding contrast medium) .
（肝癌発癌ラットの作製）
特開2002-95382号公報に従い、肝癌発癌ラットを作製した。Ｆ３４４系雄ラット（５週齢）にCDAA食にて１週間飼育後に、DEN 20mg/kg体重を腹腔内に単回投与し、CDAA食にて
通算で64週間飼育し、さらに普通食（CRF-1）にて8週間以上飼育することにより、肝癌発癌ラットを作製した。
(Preparation of hepatocarcinogenic rat)
According to Japanese Patent Laid-Open No. 2002-95382, hepatocarcinogenic rats were prepared. F344 male rats (5-week-old) were bred on CDAA diet for 1 week, then DEN 20mg / kg body weight was administered once intraperitoneally, and were bred for 64 weeks on CDAA diet. Rats with hepatocarcinogenesis were prepared by rearing in 1) for at least 8 weeks.
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液に、またはリポソームの懸濁液を調製する際に、所定の条件で超音波を照射することにより、リポソームの封入物質の内包化率が向上するとともにリポソームが微細化されたリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。 According to the method for producing a liposome-containing preparation of the present invention, the liposome encapsulated substance is encapsulated by irradiating the liposome suspension or ultrasonic waves under predetermined conditions when preparing the liposome suspension. It is possible to produce a liposome-containing preparation in which the conversion rate is improved and the liposome is miniaturized. Furthermore, the liposome-containing preparation obtained by such a production method can be suitably used as a drug carrier or an artificial oxygen carrier.
Claims (8)
前記リポソームの懸濁液に含まれるリポソームが、転移温度を有するリン脂質を少なくとも有するリン脂質からなるリン脂質膜内に、水溶性薬剤を含有する水相を内包させてなり、
前記超音波処理が、リポソームの懸濁液を、前記リン脂質の転移温度〜転移温度＋５０℃（ただし１００℃を超えない）に加熱したのち、その温度±１０℃（ただし１００℃を超えない)に保持しながら１０〜１００ｋＨｚの超音波を、１〜６００ｗ／ｍｌ／分照射
することを特徴とするリポソーム含有製剤の製造方法。 A method for producing a liposome-containing preparation, wherein a liposome suspension is sonicated, comprising:
The liposome contained in the liposome suspension is obtained by encapsulating an aqueous phase containing a water-soluble drug in a phospholipid membrane composed of a phospholipid having at least a phospholipid having a transition temperature,
The ultrasonic treatment heats the liposome suspension from the transition temperature of the phospholipid to the transition temperature + 50 ° C. (however, not exceeding 100 ° C.), and then the temperature ± 10 ° C. (however, not exceeding 100 ° C.) A method for producing a liposome-containing preparation, characterized by irradiating with 1 to 600 w / ml / min of ultrasonic waves of 10 to 100 kHz while being held at the same time.
前記超音波照射する際の温度が、二酸化炭素の臨界温度もしくはリン脂質の転移温度のいずれか高い温度〜転移温度＋５０℃であることを特徴とするリポソーム含有製剤の製造方法。 A method for producing a liposome-containing preparation comprising mixing an aqueous solution containing a water-soluble drug and a solution containing phospholipids having at least a phospholipid having a transition temperature in carbon dioxide in a supercritical state while irradiating with ultrasonic waves Because
The method for producing a liposome-containing preparation, characterized in that a temperature at the time of ultrasonic irradiation is higher than a critical temperature of carbon dioxide or a transition temperature of phospholipid, which is higher than the transition temperature + 50 ° C.
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