JP2005230521A - 体液成分検出デバイス及び体液成分検出システム - Google Patents
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Abstract
【課題】 長期にわたって連続測定可能であり、高精度な測定が可能であり、衛生面において優れた体液成分検出デバイス及び体液成分検出システムを提供すること。
【解決手段】 液成分検出システム１は、体液成分検出デバイス３と体外検出装置５とから構成される。体液成分検出デバイス３はバイオセンサ６と微生物収容部７と外殻９とを備えており、バイオセンサ６はセンシング部１５と電子デバイス１７とを備えている。微生物収容部７は、センシング部１５の電極が差し込まれた袋状のマイクロチューブ包括膜１９と、その中に複数収容された小胞状のポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１と、更にその中に収容されたＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３とを有している。
【選択図】 図２
【解決手段】 液成分検出システム１は、体液成分検出デバイス３と体外検出装置５とから構成される。体液成分検出デバイス３はバイオセンサ６と微生物収容部７と外殻９とを備えており、バイオセンサ６はセンシング部１５と電子デバイス１７とを備えている。微生物収容部７は、センシング部１５の電極が差し込まれた袋状のマイクロチューブ包括膜１９と、その中に複数収容された小胞状のポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１と、更にその中に収容されたＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３とを有している。
【選択図】 図２
Description
本発明は、体内に留置し、体液成分を連続的に計測可能な体液成分検出デバイス及び体液成分検出システムに関する。
糖尿病による合併症を軽減するためには、常に血糖値をコントロールする必要があるが、重傷の糖尿病患者は自身で血糖値をコントロールできないため、観血型の血糖値測定器を用い、頻繁に指から血液を採取して血糖値を測定し、その測定値に基づいて血糖をコントロールするための処置を行っている。
しかしながら、指から採取した血液を測定する方法では、連続的に測定を行うことは困難である。そこで、連続測定可能な血糖値計が求められている。
連続測定可能な血糖値計としては、穿刺針を備えたバイオセンサ部を人体に埋め込み計測するタイプ（Medtronic社製 MINMED）が知られている。また、体外から多波長の光を照射し、その反射スペクトルを分析することで連続的に血糖値を計測する技術が知られている（特許文献１、特許文献２参照）。
特開平９−１８２７３９号公報
特表平１１−５０５４５１号公報
連続測定可能な血糖値計としては、穿刺針を備えたバイオセンサ部を人体に埋め込み計測するタイプ（Medtronic社製 MINMED）が知られている。また、体外から多波長の光を照射し、その反射スペクトルを分析することで連続的に血糖値を計測する技術が知られている（特許文献１、特許文献２参照）。
しかしながら、バイオセンサ部を人体に埋め込み計測するタイプのセンサは、バイオセンサに必要な酵素（血糖値検出化学反応工程で必須の酵素）が短期間で失活してしまうため、３日程度しか血糖値を連続測定することができないという問題、バイオセンサの検出部分にたんぱく質が付着するため、検出性能が劣化してしまうという問題、及び穿刺針を体内留置させることで感染症の危険があるという問題がある。
また、反射スペクトルを分析する方法では、体内血糖値成分の吸収波長は他の血液成分の吸光波形に対して特徴的な波形を有していないため、観血型の血糖値測定器と同等の精度を有することは困難であるという問題がある。
本発明は以上の点に鑑みなされたものであり、長期にわたって連続測定可能であり、高精度な測定が可能であり、衛生面において優れた体液成分検出デバイス及び体液成分検出システムを提供することを目的とする。
（１）請求項１記載の体液成分検出デバイスは、有機体により、バイオセンサにて用いる物質（例えば酵素）を継続的に産生させることができる。そのため、バイオセンサによる測定に必要な物質が失活してしまうようなことがなく、長期間にわたって連続的に測定を行うことができる。また、本発明の体液成分検出デバイスは生体内に留置できるので、連続的な測定が可能である。
前記バイオセンサとしては、例えば、有機体が産生する酵素により、体液成分を電気化学的に反応させ、電気信号として体液成分を検出するものが挙げられる。また、バイオセンサとしては、体液成分の反応により生じる光を検出するものであってもよい。
前記有機体としては、微生物、人由来の細胞、その細胞からなる組織、前記細胞と組織の混合物等が挙げられる。微生物としては、嫌気性の微生物が好ましい。
体液成分検出デバイスを留置する生体内としては、体液が存在する場所であれば特に限定されることはなく、例えば、皮下、口の中、瞼の裏等が挙げられる。
（２）請求項２記載の体液成分検出デバイスでは、有機体として微生物を用いる。
（３）請求項３記載の体液成分検出デバイスは、微生物として遺伝子組み替え菌を用いているので、様々な疾患（例えば、生活習慣病、糖尿病、高脂血症、膵炎）の状態を測定するデバイスや、代謝モニタとすることができる。つまり、遺伝子組み替え菌は遺伝子操作によって様々な酵素等、バイオセンサの測定に用いる物質を産生させることができるので、遺伝子組み替え菌に特定の疾患に対応する測定項目を測定するために必要な物質を産生させることにより、その疾患に関する測定を行うデバイスとすることができる。
（４）請求項４記載の体液成分検出デバイスでは、有機体が、（Ａ）自己複製のための遺伝状を有する細胞、（Ｂ）前記細胞から成る組織、（Ｃ）前記細胞と前記組織との混合物のいずれかである。
体液成分検出デバイスを留置する生体内としては、体液が存在する場所であれば特に限定されることはなく、例えば、皮下、口の中、瞼の裏等が挙げられる。
（２）請求項２記載の体液成分検出デバイスでは、有機体として微生物を用いる。
（３）請求項３記載の体液成分検出デバイスは、微生物として遺伝子組み替え菌を用いているので、様々な疾患（例えば、生活習慣病、糖尿病、高脂血症、膵炎）の状態を測定するデバイスや、代謝モニタとすることができる。つまり、遺伝子組み替え菌は遺伝子操作によって様々な酵素等、バイオセンサの測定に用いる物質を産生させることができるので、遺伝子組み替え菌に特定の疾患に対応する測定項目を測定するために必要な物質を産生させることにより、その疾患に関する測定を行うデバイスとすることができる。
（４）請求項４記載の体液成分検出デバイスでは、有機体が、（Ａ）自己複製のための遺伝状を有する細胞、（Ｂ）前記細胞から成る組織、（Ｃ）前記細胞と前記組織との混合物のいずれかである。
本発明では、有機体として、バイオセンサにて用いる物質（例えばＧＯＤ等）を産生するようにウイルスを遺伝子導入した細胞、その細胞から成る組織、それら細胞と組織との混合物を用いることができる。
（５）請求項５記載の体液成分検出デバイスでは、有機体としての細胞が人由来のものである。そのため、万一、体液成分検出デバイスから細胞、組織、それらの混合物が漏れ出しても、被験者に害がない。また、細胞自体の欠損、生体への有毒物質の拡散の危険がないので、長期にわたって正確な測定を行うことができる。
（６）請求項６の体液成分検出デバイスでは、有機体の透過を許さない有機体拡散防止膜で有機体を覆うので、有機体が外部に漏れだしてしまうようなことがない。
（５）請求項５記載の体液成分検出デバイスでは、有機体としての細胞が人由来のものである。そのため、万一、体液成分検出デバイスから細胞、組織、それらの混合物が漏れ出しても、被験者に害がない。また、細胞自体の欠損、生体への有毒物質の拡散の危険がないので、長期にわたって正確な測定を行うことができる。
（６）請求項６の体液成分検出デバイスでは、有機体の透過を許さない有機体拡散防止膜で有機体を覆うので、有機体が外部に漏れだしてしまうようなことがない。
前記有機体拡散防止膜としては、例えば、有機体よりも小さい孔径または網目の大きさを有する膜が挙げられる。有機体拡散防止膜の材料としては、例えば、医療等の分野で使用されている高分子材料等を広く用いることができる。具体的には、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
（７）請求項７の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにおいて体液成分の検出を行う検出部を、検出に対する妨害物質（例えば体液中に存在する種々のたんぱく質等）の透過を制限する妨害物質防止膜で覆っているので、妨害物質が検出部に付着することがなく、常に正確な測定を行うことができる。また、妨害物質防止膜は、測定対象となる体液成分の透過は許すので、測定を妨害することがない。
（７）請求項７の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにおいて体液成分の検出を行う検出部を、検出に対する妨害物質（例えば体液中に存在する種々のたんぱく質等）の透過を制限する妨害物質防止膜で覆っているので、妨害物質が検出部に付着することがなく、常に正確な測定を行うことができる。また、妨害物質防止膜は、測定対象となる体液成分の透過は許すので、測定を妨害することがない。
前記妨害物質防止膜としては、例えば、妨害物質よりも小さく、且つ測定対象となる体液成分よりも大きい孔径または網目の大きさを有する膜が挙げられる。妨害物質防止膜の材料としては、例えば、医療等の分野で使用されている高分子材料等を広く用いることができる。具体的には、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
（８）請求項８の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにおいて体液成分の検出を行う検出部を、有機体の産生する物質の透過を制限する産生物質拡散防止膜で覆い、有機体はその産生物質拡散防止膜の中に収容している。そのため、有機体の産生する物質は、産生物質拡散防止膜の内部に留まり、産生物質拡散防止膜の内部にある検出部付近では有機体の産生する物質の濃度が十分に高くなる。その結果として、本発明の体液成分検出デバイスは正確に測定を行うことができる。また、産生物質拡散防止膜は、測定対象となる体液成分の透過を許すので、測定を妨げることがない。
（８）請求項８の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにおいて体液成分の検出を行う検出部を、有機体の産生する物質の透過を制限する産生物質拡散防止膜で覆い、有機体はその産生物質拡散防止膜の中に収容している。そのため、有機体の産生する物質は、産生物質拡散防止膜の内部に留まり、産生物質拡散防止膜の内部にある検出部付近では有機体の産生する物質の濃度が十分に高くなる。その結果として、本発明の体液成分検出デバイスは正確に測定を行うことができる。また、産生物質拡散防止膜は、測定対象となる体液成分の透過を許すので、測定を妨げることがない。
前記産生物質拡散防止膜としては、例えば、有機体が産生する物質よりも小さく、且つ測定対象となる体液成分よりも大きい孔径または網目の大きさを有する膜が挙げられる。産生物質拡散防止膜の材料としては、例えば、医療等の分野で使用されている高分子材料等を広く用いることができる。具体的には、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
（９）請求項９の体液成分検出デバイスは、外殻を備えているので、容易に皮下に埋め込むことができる。また、外殻は測定対象となる体液成分の透過を許すので、測定を妨げることがない。
（９）請求項９の体液成分検出デバイスは、外殻を備えているので、容易に皮下に埋め込むことができる。また、外殻は測定対象となる体液成分の透過を許すので、測定を妨げることがない。
前記外殻としては、例えば、測定対象となる体液成分より大きい孔径または網目の大きさを有する膜が挙げられる。外殻の材料としては、例えば、医療等の分野で使用されている高分子材料等を広く用いることができる。具体的には、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
（１０）請求項１０の体液成分検出デバイスは、体液成分が電気化学反応するときの電気信号を検出可能な電極を検出部として備えている。そのため、体液成分を正確に測定することができる。
（１１）請求項１１の体液成分検出デバイスでは、電極が生体機能性高分子により化学修飾されている。そのため、体液中の妨害物質が電極に付着することを一層効果的に防止することができ、長期にわたって正確な測定を行うことができる。
（１０）請求項１０の体液成分検出デバイスは、体液成分が電気化学反応するときの電気信号を検出可能な電極を検出部として備えている。そのため、体液成分を正確に測定することができる。
（１１）請求項１１の体液成分検出デバイスでは、電極が生体機能性高分子により化学修飾されている。そのため、体液中の妨害物質が電極に付着することを一層効果的に防止することができ、長期にわたって正確な測定を行うことができる。
前記生体機能性高分子としては、医療等の分野で使用されている高分子材料等を広く用いることができる。具体的には、シリコーン、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン、セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
（１２）請求項１２の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにより検出したデータを、送信手段により外部へ送信することができる。
（１３）請求項１３の体液成分検出デバイスでは、送信手段により、データをリアルタイムで無線通信することができる。
（１４）請求項１４の体液成分検出システムでは、体液成分検出デバイスにより測定したデータを体外モニタ装置によりモニタすることができる。
（１５）請求項１５の体液成分検出システムは、データ記録手段により、受信したデータを時間データとともに記録することができる。そのため、体液成分の濃度が時間の経過とともにどのように変化したかを長期間にわたってモニタすることができる。
（１６）請求項１６の体液成分検出システムは、体外モニタ装置の有する判断手段により、受信したデータが異常であるか否かを判断することができ、データが異常であると判断した場合は、報知手段により報知することができる。このことにより、使用者は測定データの異常を迅速に知ることができる。
（１２）請求項１２の体液成分検出デバイスでは、バイオセンサにより検出したデータを、送信手段により外部へ送信することができる。
（１３）請求項１３の体液成分検出デバイスでは、送信手段により、データをリアルタイムで無線通信することができる。
（１４）請求項１４の体液成分検出システムでは、体液成分検出デバイスにより測定したデータを体外モニタ装置によりモニタすることができる。
（１５）請求項１５の体液成分検出システムは、データ記録手段により、受信したデータを時間データとともに記録することができる。そのため、体液成分の濃度が時間の経過とともにどのように変化したかを長期間にわたってモニタすることができる。
（１６）請求項１６の体液成分検出システムは、体外モニタ装置の有する判断手段により、受信したデータが異常であるか否かを判断することができ、データが異常であると判断した場合は、報知手段により報知することができる。このことにより、使用者は測定データの異常を迅速に知ることができる。
以下に本発明の体液成分検出デバイス及び体液成分検出システムの形態の例（実施例）を説明する。ここでは、体液成分である血糖（グルコース）を測定対象とする体液成分検出デバイス及び体液成分検出システムを例に挙げて説明する。
ａ）まず、本実施例１の体液成分検出システムにおける構成の概略を図１及び図２を用いて説明する。図１に示すように、液成分検出システム１は、生体内（皮下）に埋め込む体液成分検出デバイス３と、腕時計のように手首に装着することすることができる体外検出装置（体外モニタ装置）５とから構成される。
体液成分検出デバイス３は、図２に示すように、バイオセンサ６と、微生物収容部７と、外殻９とを備えている。バイオセンサ６は、白金から成る作用極１０、白金から成る対極１１、及び銀から成る参照極１３の３本の電極により構成されるセンシング部（検出部）１５を備えている。更に、バイオセンサ６は、センシング部１５に接続された電子デバイス１７を備えている。
また、微生物収容部７は、図２に示すように、作用極１０の先端部１０ａ、対極１１の先端部１１ａ、及び参照極１３の先端部１３ａがそれぞれ差し込まれた袋状のマイクロチューブ包括膜１９と、マイクロチューブ包括膜１９の内部に複数収容された小胞状のポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１と、ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１内に収容されたＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３とを有している。
ここで、マイクロチューブ包括膜１９は、０．１〜２ｎｍ径の孔又は網目の大きさを有するシリコーンから構成されており、有機体拡散防止膜、産生物質拡散防止膜、及び妨害物質防止膜に該当する。このマイクロチューブ包括膜１９は、上記の孔径又は網目の大きさを有することにより、測定対象であるグルコースの透過は許すが、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３が産生する酵素ＧＯＤ、及びセンシング部１５における検出を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）の透過は許さない。
また、ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１は、３ｎｍ程度の孔又は網目の大きさを有するシリコーンから構成されており、有機体拡散防止膜に該当する。このポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１は、上記の孔径又は網目の大きさを有することにより、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３が産生する酵素ＧＯＤの透過は許すが、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３の透過は許さない。
また、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３は、ＮＳＢＩ（National Center of Biotechnology Information）の識別番号においてＸ５６４４３対応する微生物である。このＸ５６４４３は、宿主である大腸菌に対して遺伝子の組み換えを行い、ＧＯＤを産生するようにしたものである。Ｘ５６４４３の遺伝子における塩基配列を後述する配列表に示す。
外殻９は、０．１〜２ｎｍ径の孔又は網目の大きさを有する多孔質シリコーンから構成されており、有機体拡散防止膜、産生物質拡散防止膜、妨害物質防止膜、及び外殻に該当する。この外殻９は、上記の孔径又は網目の大きさを有することにより、体液中のグルコースの透過は許すが、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３が産生する酵素ＧＯＤ、及びセンシング部１５における検出を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）の透過は許さない。
体外検出装置５は、図１に示すように、時計の文字盤を備えた円盤状の本体部２５と、手首に装着するためのベルト部２７とを有している。
ｂ）次に、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を得る方法を説明する。
ｂ）次に、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を得る方法を説明する。
(i)まず、A.nigerからAGPC法によりｍRNAを抽出した。具体的には以下のようにした。
GTC(グアニジンチオシアネート)を蒸留水に溶かした後、クエン酸ナトリウム、sarcosyl（sodium N-lauroyl sarcosine）を加えて、60〜65℃に加熱、攪拌し、2-ME（２−メルカプトエタノール）を入れたDenaturing solutionをマイクロチューブに入れ、細胞または組織を入れ、懸濁させた。次に、Denaturing solutionに、酢酸ナトリウム、平衡化酸性フェノール、CIA（クロロフォルム／イソアミルアルコール）を加え、混合させた。それを氷上に暫く静置すると、水層と有機層の２層に分離してくるので、それを20分間遠心分離した。分離した上層（水層）を別のチューブに回収し、残渣にイソプロアルコールを加え、室温で10分間放置した。その後、4℃で10分間遠心し、上清を捨て、RNAを沈殿させてペレット状にして獲得した。こうして得られたRNAペレットをDEPC処理水（Diethyl pyrocarbonate）に溶解させ、サンプルとして用いた。
(ii)次に、前記(i)で抽出したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用いてＤＮＡの合成反応（逆転写反応）を行い、そのＤＮＡをあらためて鋳型としてＰＣＲを行った（ＲＴ−ＰＣＲ法）。具体的には、以下の手順により行った。
（GODgeneのRT-PCR増幅を用いたｃDNAの増幅）
前記(i)で得られたRNA、oligo(dT)12−18、DEPC処理水の混合液（RNAサンプル／プライマー）を70℃で10分間インキュベートした。その後、氷上に移し、1分以上置いて、PCRバッファー、MgCl2、dNTPミックス、DTTを順に加え、42℃で5分間インキュベートした。それに、逆転酵素（例えばSUPERSCRIPT II、BRL社）を加え、混合し、42℃で50分間インキュベートした後、さらに70℃で15分間インキュベートさせ、反応を止める。それを氷上で冷やした後、遠心をかけ、反応液をチューブの底に集めたものに、Rnase Hを加え、37℃で20分間インキュベートしたものを、PCRの試料（PCR産物）として用いた。
（ベクターＤＮＡの精製）
次に，PCR産物からDNA断片の精製をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて行った。本キットはGFXを用いてDNA断片を精製することが出来る。GFXcolumnにColection Tubeをセットし，カラムにCapture Bufferを500μL滴下し，PCR産物を40μL滴下した後ピペッティングを行い，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離し，DNAをGFXに吸着させ，その他の不純物を排除した。次に，GFX Columnを新たなCollection Tubeにセットし，Wash Bufferを500μL滴下した後，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離した。
GTC(グアニジンチオシアネート)を蒸留水に溶かした後、クエン酸ナトリウム、sarcosyl（sodium N-lauroyl sarcosine）を加えて、60〜65℃に加熱、攪拌し、2-ME（２−メルカプトエタノール）を入れたDenaturing solutionをマイクロチューブに入れ、細胞または組織を入れ、懸濁させた。次に、Denaturing solutionに、酢酸ナトリウム、平衡化酸性フェノール、CIA（クロロフォルム／イソアミルアルコール）を加え、混合させた。それを氷上に暫く静置すると、水層と有機層の２層に分離してくるので、それを20分間遠心分離した。分離した上層（水層）を別のチューブに回収し、残渣にイソプロアルコールを加え、室温で10分間放置した。その後、4℃で10分間遠心し、上清を捨て、RNAを沈殿させてペレット状にして獲得した。こうして得られたRNAペレットをDEPC処理水（Diethyl pyrocarbonate）に溶解させ、サンプルとして用いた。
(ii)次に、前記(i)で抽出したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用いてＤＮＡの合成反応（逆転写反応）を行い、そのＤＮＡをあらためて鋳型としてＰＣＲを行った（ＲＴ−ＰＣＲ法）。具体的には、以下の手順により行った。
（GODgeneのRT-PCR増幅を用いたｃDNAの増幅）
前記(i)で得られたRNA、oligo(dT)12−18、DEPC処理水の混合液（RNAサンプル／プライマー）を70℃で10分間インキュベートした。その後、氷上に移し、1分以上置いて、PCRバッファー、MgCl2、dNTPミックス、DTTを順に加え、42℃で5分間インキュベートした。それに、逆転酵素（例えばSUPERSCRIPT II、BRL社）を加え、混合し、42℃で50分間インキュベートした後、さらに70℃で15分間インキュベートさせ、反応を止める。それを氷上で冷やした後、遠心をかけ、反応液をチューブの底に集めたものに、Rnase Hを加え、37℃で20分間インキュベートしたものを、PCRの試料（PCR産物）として用いた。
（ベクターＤＮＡの精製）
次に，PCR産物からDNA断片の精製をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて行った。本キットはGFXを用いてDNA断片を精製することが出来る。GFXcolumnにColection Tubeをセットし，カラムにCapture Bufferを500μL滴下し，PCR産物を40μL滴下した後ピペッティングを行い，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離し，DNAをGFXに吸着させ，その他の不純物を排除した。次に，GFX Columnを新たなCollection Tubeにセットし，Wash Bufferを500μL滴下した後，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離した。
次に，GFXからの染色体DNAの溶離として，GFX Columnをマイクロチューブにセットし，滅菌水を50μL滴下し1分間インキュベートした後，4℃，15,000rpmで1分間遠心分離してDNA溶液を獲得した。次に，DNA断片をBamHIとHindIIIで切断した。マイクロチューブにDNA断片10μL，10×K Buffer 5μL，BamHIとHindIIIをそれぞれ1μL，滅菌水33μLを滴下し，37℃で1時間インキュベートした。そしてフェノール処理を行った後，これをインサートDNAとした。ベクターの調整は，pQEベクターをBamHIとHindIIIで制限酵素処理をした。マイクロチューブに，pQEベクターを1μg，10×K Bufferを5μL，BamHIとHindIIIをそれぞれ1μL，滅菌水を41μL滴下し，37℃で1時間インキュベートした。そしてフェノール処理を行った後，これをベクターDNAとした。
（ライゲーション反応）
pQEベクター 0.5μg，インサートDNA 1.5μgを500μLマイクロチューブに添加し，さらに10倍濃度のLigation buffer 2μL，20mg/mL BSA Solution 2.5μL，T4 DNA Ligase 1μL(300units)を添加し，最後に合計量が20μLとなるように滅菌水を添加した。これを，16℃で1.5時間反応させた。
（トランスフォーメーション）
マイクロチューブにpGAPZαA,B,C（Invitrogen社、酵母）50μL，ライゲーション産物5μLを添加し，氷中で15分間インキュベートした後に，42℃で5分間ヒートショックを行った。氷中に2分間インキュベートした後，SOC培地で1時間振盪培養した。
（遺伝子導入の確認）
Tryptone Peptone 2.0％，Yeast Extract 0.5％，NaCl 0.5％，Agar 1.5％を添加した培地を調整し，121℃で15分間オートクレーブした。この培地が約50℃に冷めてから，アンピシリン 0.1mg/mL，IPTG(Isopropyl-β-thiogalactoside) 1mM(0.286mg/mL)， X-gal 4mg/mLを添加し，これを滅菌シャーレに10mLずつ分注してBlue/White selection培地を作製した。IPTGを培地に添加すると，通常リプレッサーにより抑制を受けているβ-galの発現系が開放されて酵素の誘導が起こりやすくなり，目的の生産物を多量に獲得可能となる。
（ライゲーション反応）
pQEベクター 0.5μg，インサートDNA 1.5μgを500μLマイクロチューブに添加し，さらに10倍濃度のLigation buffer 2μL，20mg/mL BSA Solution 2.5μL，T4 DNA Ligase 1μL(300units)を添加し，最後に合計量が20μLとなるように滅菌水を添加した。これを，16℃で1.5時間反応させた。
（トランスフォーメーション）
マイクロチューブにpGAPZαA,B,C（Invitrogen社、酵母）50μL，ライゲーション産物5μLを添加し，氷中で15分間インキュベートした後に，42℃で5分間ヒートショックを行った。氷中に2分間インキュベートした後，SOC培地で1時間振盪培養した。
（遺伝子導入の確認）
Tryptone Peptone 2.0％，Yeast Extract 0.5％，NaCl 0.5％，Agar 1.5％を添加した培地を調整し，121℃で15分間オートクレーブした。この培地が約50℃に冷めてから，アンピシリン 0.1mg/mL，IPTG(Isopropyl-β-thiogalactoside) 1mM(0.286mg/mL)， X-gal 4mg/mLを添加し，これを滅菌シャーレに10mLずつ分注してBlue/White selection培地を作製した。IPTGを培地に添加すると，通常リプレッサーにより抑制を受けているβ-galの発現系が開放されて酵素の誘導が起こりやすくなり，目的の生産物を多量に獲得可能となる。
尚、宿主としてpGAPZαA,B,C（Invitrogen社、酵母）を用いたが、それには限定されず、人体に対し、病原性が無く、25から37℃のｐH中性下で生息可能なかびや酵母（例えば、Saccaromyces cerevisiae、repens、oryzae等）を広く用いることができる。
ｃ）次に、体液成分検出デバイス３及び体外検出装置５の電気的な構成を図３を用いて説明する。
体液成分検出デバイス３の電子デバイス１７は、定電圧印可部２９と、制御部３１と、送受信部３３とを備えている。定電圧印可部２９は、センシング部１５の電極に定電圧を印可する。制御部３１は、定電圧が印可されたセンシング部１５の電極に流れる電流値を一定期間（１０分程度）計測し、そのデータを送受信部３３に送る。送受信部（送信手段）３３はアンテナ３３ａを介してデータをリアルタイムに人体外部に送信する。
体液成分検出デバイス３の電子デバイス１７は、定電圧印可部２９と、制御部３１と、送受信部３３とを備えている。定電圧印可部２９は、センシング部１５の電極に定電圧を印可する。制御部３１は、定電圧が印可されたセンシング部１５の電極に流れる電流値を一定期間（１０分程度）計測し、そのデータを送受信部３３に送る。送受信部（送信手段）３３はアンテナ３３ａを介してデータをリアルタイムに人体外部に送信する。
また、体液成分検出デバイス３の電子デバイス１７は、定電圧印可部２９、制御部３１、及び送受信部３３の電源として機能する電力供給部３５を備えている。この電力供給部３５は２次コイル３７、整流回路３９、充電回路４１、及び二次電池４３から構成される。電力供給部３５は、被験者の就寝中等の間に、図３に示す充電装置４５を用いて充電することができる。つまり、充電装置４５の側では、ＡＣ電源４７、発信回路４９、及び発信制御回路５１を用いて一次コイル５３に交流電圧を発生させる。この一次コイル５３を体液成分検出デバイス３側の二次コイル３７に近づけておくと、２次コイル３７には電磁結合方式により起電力が生じる。その起電力に基づき、整流回路３９及び充電回路４１により二次電池４３を充電する。
体外検出装置５は、送受信部（受信手段）５５と、演算制御部５７と、表示部５９と、ＲＡＭ６１と、スピーカ６３と、外部コントロールボタン６５とを備えている。送受信部５５は体液成分検出デバイス３から送信されたデータをアンテナ５５ａで受信し、演算制御部５７に伝える。演算制御部５７はデータに対し演算処理を実施し、表示部５９に表示するとともに、ＲＡＭ（データ記録手段）６１に記憶する。尚、表示部５９における表示形式は、外部コントロールボタン６５の操作により変更することができる。具体的には、ＲＡＭ６１に記憶しておいた過去のデータを読み出し、測定データを時系列に沿って表示することができる。
また、演算制御部（判断手段）５７は、データがあらかじめ設定しておいた基準値よりも低値または高値である場合は、表示部（報知手段）５９にその旨を表示するとともに、スピーカ（報知手段）６３により異常を報知し、被計測者に注意を促す。
体外検出装置５は、上述した充電装置４５の制御も行うことができる。つまり、充電装置４５を体外検出装置５にはめ込んだ状態で、体外検出装置５の演算制御部５７が充電装置４５の発信制御回路５１を制御する。
ｄ）次に、本実施例１の体液成分検出デバイス３及び体液成分検出システム１の測定時における作用について図２を用いて説明する。
体液成分検出デバイス３は、図２に示すように、周知のシリンジ６７を用いて皮下（生体内）に埋め込まれ、留置される。尚、体液成分検出デバイス３を留置する場所は、口の中、まぶたの裏等であってもよい。
体液成分検出デバイス３は、図２に示すように、周知のシリンジ６７を用いて皮下（生体内）に埋め込まれ、留置される。尚、体液成分検出デバイス３を留置する場所は、口の中、まぶたの裏等であってもよい。
測定対象となる体液成分であるグルコースは、外殻９、及びマイクロチューブ包括膜１９を透過して、マイクロチューブ包括膜１９の内部に入る。尚、外殻９、及びマイクロチューブ包括膜１９の孔径又は網目の大きさはグルコースより大きいので、グルコースはそれらを透過できる。
一方、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３は、酵素ＧＯＤを産生する。上述したように、酵素ＧＯＤはポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１の孔径又は網目の大きさよりも小さいので、酵素ＧＯＤはポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１の外側に拡散する。しかし、酵素ＧＯＤの大きさはマイクロチューブ包括膜１９の孔径又は網目の大きさより大きいので、酵素ＧＯＤはマイクロチューブ包括膜１９の内側に留まる。
従って、マイクロチューブ包括膜１９の内側には、グルコースと、酵素ＧＯＤが共存することになる。そして、マイクロチューブ包括膜１９の内部では、式（１）に示すように、酵素ＧＯＤの存在下、グルコースが化学反応する。
式（１） Ｃ6Ｈ12Ｏ6＋Ｏ2→Ｃ6Ｈ10Ｏ6＋Ｈ2Ｏ2
この式（１）で生じたＨ2Ｏ2は、（作用極）（アノード）において、式（２）のように化学反応する。
式（２）Ｈ2Ｏ2→２Ｈ+＋Ｏ2＋２ｅ-
更に、この反応で生じたＨ+は、（対極）（カソード）において、式（３）に示すように化学反応する。
式（３）２Ｈ+＋１／２Ｏ2＋２ｅ-→Ｈ2Ｏ
上記の式（２）及び式（３）の化学反応が生じることにより、アノードとカソードとの間には電流が流れる。アノードとカソードとの間には上述したように定電圧印可部２９（図３参照）により定電圧が印可されているので、電流値はグルコースの量に依存する。従って、この電流値を測定することにより、グルコースの量を測定することができる。
式（１） Ｃ6Ｈ12Ｏ6＋Ｏ2→Ｃ6Ｈ10Ｏ6＋Ｈ2Ｏ2
この式（１）で生じたＨ2Ｏ2は、（作用極）（アノード）において、式（２）のように化学反応する。
式（２）Ｈ2Ｏ2→２Ｈ+＋Ｏ2＋２ｅ-
更に、この反応で生じたＨ+は、（対極）（カソード）において、式（３）に示すように化学反応する。
式（３）２Ｈ+＋１／２Ｏ2＋２ｅ-→Ｈ2Ｏ
上記の式（２）及び式（３）の化学反応が生じることにより、アノードとカソードとの間には電流が流れる。アノードとカソードとの間には上述したように定電圧印可部２９（図３参照）により定電圧が印可されているので、電流値はグルコースの量に依存する。従って、この電流値を測定することにより、グルコースの量を測定することができる。
電子デバイス１７は、この電流値を測定データとして記録する。また、測定データを無線信号に変換しリアルタイムに送信する。体外検出装置５は、体液成分検出デバイス３が送信する無線信号を受信し、測定データとして記憶する。
ｅ）次に、本実施例１の体液成分検出デバイス３及び体液成分検出システム１の奏する効果について説明する。
(i)本実施例１の体液成分検出デバイス３は、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を有することにより、酵素ＧＯＤを継続的に産生させることができる。そのため、バイオセンサ６による測定に必要な酵素ＧＯＤが失活してしまうことがなく、長期間にわたって連続的に測定を行うことができる。
(ii)本実施例１の体液成分検出デバイス３は、バイオセンサ６を用いて電気化学反応に基づきグルコースを測定するので、反射スペクトルを用いる方法に比べて高精度な測定を行うことができる。
(iii) 本実施例１の体液成分検出デバイス３を用いれば、従来の測定方法のように穿刺針を体内留置させる必要がないので、衛生面で優れている。
(iv) 本実施例１の体液成分検出デバイス３は、酵素を産生する微生物として遺伝子組み替え菌２３を用いているので、糖尿病以外の疾患に関する測定も行うことができる。つまり、遺伝子組み替え菌は遺伝子操作によってＧＯＤ以外にも様々な酵素等、バイオセンサ６の測定に用いる物質を産生させることができるので、遺伝子組み替え菌に、他の疾患に対応する測定項目を測定するために必要な物質を産生させることにより、他の疾患に関する測定を行うことができる。
(i)本実施例１の体液成分検出デバイス３は、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を有することにより、酵素ＧＯＤを継続的に産生させることができる。そのため、バイオセンサ６による測定に必要な酵素ＧＯＤが失活してしまうことがなく、長期間にわたって連続的に測定を行うことができる。
(ii)本実施例１の体液成分検出デバイス３は、バイオセンサ６を用いて電気化学反応に基づきグルコースを測定するので、反射スペクトルを用いる方法に比べて高精度な測定を行うことができる。
(iii) 本実施例１の体液成分検出デバイス３を用いれば、従来の測定方法のように穿刺針を体内留置させる必要がないので、衛生面で優れている。
(iv) 本実施例１の体液成分検出デバイス３は、酵素を産生する微生物として遺伝子組み替え菌２３を用いているので、糖尿病以外の疾患に関する測定も行うことができる。つまり、遺伝子組み替え菌は遺伝子操作によってＧＯＤ以外にも様々な酵素等、バイオセンサ６の測定に用いる物質を産生させることができるので、遺伝子組み替え菌に、他の疾患に対応する測定項目を測定するために必要な物質を産生させることにより、他の疾患に関する測定を行うことができる。
(v)本実施例１の体液成分検出デバイス３ではＧＯＤ遺伝子組み替え菌２３をマイクロチューブ包括膜１９及びポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１により覆っている。マイクロチューブ包括膜１９及びポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１の孔径または網目の大きさはＧＯＤ遺伝子組み替え菌２３よりも小さいので、ＧＯＤ遺伝子組み替え菌２３がそれらの外部に漏れだしてしまうことがない。
(vi) 本実施例１の体液成分検出デバイス３では、作用極１０の先端部１０ａ、対極１１の先端部１１ａ、及び参照極１３の先端部１３ａをマイクロチューブ包括膜１９により覆っている。このマイクロチューブ包括膜１９の孔径または網目の大きさは、センシング部１５における検出を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）よりも小さいので、妨害物質がマイクロチューブ包括膜１９の内部に侵入することを防止できる。そのため、本実施例１の体液成分検出デバイス３では、妨害物質がセンシング部１５の電極に付着することがなく、常に正確な測定を行うことができる。
(vi) 本実施例１の体液成分検出デバイス３では、作用極１０の先端部１０ａ、対極１１の先端部１１ａ、及び参照極１３の先端部１３ａをマイクロチューブ包括膜１９により覆っている。このマイクロチューブ包括膜１９の孔径または網目の大きさは、センシング部１５における検出を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）よりも小さいので、妨害物質がマイクロチューブ包括膜１９の内部に侵入することを防止できる。そのため、本実施例１の体液成分検出デバイス３では、妨害物質がセンシング部１５の電極に付着することがなく、常に正確な測定を行うことができる。
また、マイクロチューブ包括膜１９の孔径または網目の大きさは酵素ＧＯＤよりも小さいので、ＧＯＤ遺伝子組み替え菌２３が産生した酵素ＧＯＤはマイクロチューブ包括膜１９の内部に留まる。そのため、マイクロチューブ包括膜１９の内部にある作用極１０の先端部１０ａ、対極１１の先端部１１ａ、及び参照極１３の先端部１３ａの付近では酵素ＧＯＤの濃度が十分に高くなり、正確に測定を行うことができる。
(vii) 本実施例１の体液成分検出デバイス３は円柱形の外殻９を備えており、その中にバイオセンサ６及び微生物収容部７を収容している。そのため、体液成分検出デバイス３はシリンジ６７を用いてスムーズに皮下に埋め込むことができる。
(xiii) 本実施例１の体液成分検出システム１では、体液成分検出デバイス３に送受信部３３を備え、体外検出装置５に送受信部５５を備えることにより、測定データをリアルタイムで無線通信することができる。
(ix) 本実施例１の体液成分検出システム１では、体外検出装置５の演算制御部３７により、受信した測定データが異常であるか否かを判断することができる。また、測定データが異常であると判断した場合には、表示部５９及びスピーカ６３により報知することができる。このことにより、使用者は測定データの異常を迅速に知ることができる。
(vii) 本実施例１の体液成分検出デバイス３は円柱形の外殻９を備えており、その中にバイオセンサ６及び微生物収容部７を収容している。そのため、体液成分検出デバイス３はシリンジ６７を用いてスムーズに皮下に埋め込むことができる。
(xiii) 本実施例１の体液成分検出システム１では、体液成分検出デバイス３に送受信部３３を備え、体外検出装置５に送受信部５５を備えることにより、測定データをリアルタイムで無線通信することができる。
(ix) 本実施例１の体液成分検出システム１では、体外検出装置５の演算制御部３７により、受信した測定データが異常であるか否かを判断することができる。また、測定データが異常であると判断した場合には、表示部５９及びスピーカ６３により報知することができる。このことにより、使用者は測定データの異常を迅速に知ることができる。
本実施例２の体液成分検出システム１の構成及び作用は基本的には前記実施例１と同様であるが、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を得る方法において相違する。以下、この相違点を中心に具体的に説明する。
本実施例２では、以下のようにしてＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３を得る。
(i)E.coliからの染色体DNAの抽出
E.coli JM105を37℃で吸光度OD600＝1となるまで液体振盪培養し、その培養液の吸光度をOD600＝5.0に調整した。この培地をマイクロチューブに，1mLずつ分注し，25℃，15,000rpmで30秒間遠心分離した後，上清を完全に除去した。これに，protein K buffer 40μLを添加し，直ちにボルテックスミキサーで完全に懸濁して混合し，これにproteinase Kを10μL滴下し,55℃で15分間インキュベートして細胞壁の破壊を行った。さらに，RNase 5μLを添加し，25℃で10分間インキュベートしてRNAを分解した。次にExtraction Solution 500μLを添加し，25度で10分間インキュベートして菌体を完全に破壊した。次に，Collection TubeにセットしたGFX Columnに菌体抽出液を移し，25℃，7,500rpmで15分間遠心分離してDNAをGFXに吸着させ，その他の不純物を排除した。
(i)E.coliからの染色体DNAの抽出
E.coli JM105を37℃で吸光度OD600＝1となるまで液体振盪培養し、その培養液の吸光度をOD600＝5.0に調整した。この培地をマイクロチューブに，1mLずつ分注し，25℃，15,000rpmで30秒間遠心分離した後，上清を完全に除去した。これに，protein K buffer 40μLを添加し，直ちにボルテックスミキサーで完全に懸濁して混合し，これにproteinase Kを10μL滴下し,55℃で15分間インキュベートして細胞壁の破壊を行った。さらに，RNase 5μLを添加し，25℃で10分間インキュベートしてRNAを分解した。次にExtraction Solution 500μLを添加し，25度で10分間インキュベートして菌体を完全に破壊した。次に，Collection TubeにセットしたGFX Columnに菌体抽出液を移し，25℃，7,500rpmで15分間遠心分離してDNAをGFXに吸着させ，その他の不純物を排除した。
次に，GFX Columnを新たなCollection Tubeにセットし，再びExtraction Solution 500μLを添加して完全に不純物を溶解し，25℃，7,500rpmで1分間遠心分離し，Collection Tubeに溜まった廃液を完全に除去した。そしてこのGFX ColumnにWash Solution 500μLを添加し，25℃，15,000rpmで3分間遠心分離して，GFXに吸着している染色体DNAを洗浄した。これを25℃，15,000rpmで1分間遠心分離してGFXを完全に乾燥させ，Wash Solutionの除去を行った。
次に，GFXからの染色体DNAの溶離として，GFX Columnをマイクロチューブにセットし，TE buffer100μLを添加し，25℃で1分間インキュベートした後，25℃，7,500rpmで1分間遠心分離してDNA溶液を獲得した。
(ii)GODgeneのPCR増幅を用いたインサートDNAとベクターDNAの獲得
マイクロチューブに，染色体DNAを1μg，10×Ex TaqTMbufferを5μL，dNTP Mixtureを4μL，5'プライマーと3'プライマーをそれぞれ0.5μL，TaKaRa Ex Taqを0.5μL添加した。温度条件は，まず98℃で5分間インキュベートした後，98℃で10ｓ，65℃で30秒，72℃で90秒を30回繰り返した。
(ii)GODgeneのPCR増幅を用いたインサートDNAとベクターDNAの獲得
マイクロチューブに，染色体DNAを1μg，10×Ex TaqTMbufferを5μL，dNTP Mixtureを4μL，5'プライマーと3'プライマーをそれぞれ0.5μL，TaKaRa Ex Taqを0.5μL添加した。温度条件は，まず98℃で5分間インキュベートした後，98℃で10ｓ，65℃で30秒，72℃で90秒を30回繰り返した。
次に，PCR産物からDNA断片の精製をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて行った。本キットはGFXを用いてDNA断片を精製することが出来る。GFXcolumnにColection Tubeをセットし，カラムにCapture Bufferを500μL滴下し，PCR産物を40μL滴下した後ピペッティングを行い，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離し，DNAをGFXに吸着させ，その他の不純物を排除した。次に，GFX Columnを新たなCollection Tubeにセットし，Wash Bufferを500μL滴下した後，4℃，15,000rpmで30秒間遠心分離した。
次に，GFXからの染色体DNAの溶離として，GFX Columnをマイクロチューブにセットし，滅菌水を50μL滴下し1分間インキュベートした後，4℃，15,000rpmで1分間遠心分離してDNA溶液を獲得した。次に，DNA断片をBamHIとHindIIIで切断した。マイクロチューブにDNA断片10μL，10×K Buffer 5μL，BamHIとHindIIIをそれぞれ1μL，滅菌水33μLを滴下し，37℃で1時間インキュベートした。そしてフェノール処理を行った後，これをインサートDNAとした。ベクターの調整は，pQEベクターをBamHIとHindIIIで制限酵素処理をした。マイクロチューブに，pQEベクターを1μg，10×K Bufferを5μL，BamHIとHindIIIをそれぞれ1μL，滅菌水を41μL滴下し，37℃で1時間インキュベートした。そしてフェノール処理を行った後，これをベクターDNAとした。
(iii)ライゲーション反応
pQEベクター 0.5μg，インサートDNA 1.5μgを500μLマイクロチューブに添加し，さらに10倍濃度のLigation buffer 2μL，20mg/mL BSA Solution 2.5μL，T4 DNA Ligase 1μL(300units)を添加し，最後に合計量が20μLとなるように滅菌水を添加した。これを，16℃で1.5時間反応させた。
(iv)トランスフォーメーション
マイクロチューブにコンピテントセル50μL，ライゲーション産物5μLを添加し，氷中で15分間インキュベートした後に，42℃で5分間ヒートショックを行った。氷中に2分間インキュベートした後，SOC培地で1時間振盪培養した。
(v)遺伝子導入の確認
Tryptone Peptone 2.0％，Yeast Extract 0.5％，NaCl 0.5％，Agar 1.5％を添加した培地を調整し，121℃で15分間オートクレーブした。この培地が約50℃に冷めてから，アンピシリン 0.1mg/mL，IPTG(Isopropyl-β-thiogalactoside) 1mM(0.286mg/mL)， X-gal 4mg/mLを添加し，これを滅菌シャーレに10mLずつ分注してBlue/White selection培地を作製した。IPTGを培地に添加すると，通常リプレッサーにより抑制を受けているβ-galの発現系が開放されて酵素の誘導が起こりやすくなり，目的の生産物を多量に獲得可能となる。この培地に，遺伝子導入したE.coli JM109を100μL植菌し，37℃で一晩培養し、目的の菌を得る。
(iii)ライゲーション反応
pQEベクター 0.5μg，インサートDNA 1.5μgを500μLマイクロチューブに添加し，さらに10倍濃度のLigation buffer 2μL，20mg/mL BSA Solution 2.5μL，T4 DNA Ligase 1μL(300units)を添加し，最後に合計量が20μLとなるように滅菌水を添加した。これを，16℃で1.5時間反応させた。
(iv)トランスフォーメーション
マイクロチューブにコンピテントセル50μL，ライゲーション産物5μLを添加し，氷中で15分間インキュベートした後に，42℃で5分間ヒートショックを行った。氷中に2分間インキュベートした後，SOC培地で1時間振盪培養した。
(v)遺伝子導入の確認
Tryptone Peptone 2.0％，Yeast Extract 0.5％，NaCl 0.5％，Agar 1.5％を添加した培地を調整し，121℃で15分間オートクレーブした。この培地が約50℃に冷めてから，アンピシリン 0.1mg/mL，IPTG(Isopropyl-β-thiogalactoside) 1mM(0.286mg/mL)， X-gal 4mg/mLを添加し，これを滅菌シャーレに10mLずつ分注してBlue/White selection培地を作製した。IPTGを培地に添加すると，通常リプレッサーにより抑制を受けているβ-galの発現系が開放されて酵素の誘導が起こりやすくなり，目的の生産物を多量に獲得可能となる。この培地に，遺伝子導入したE.coli JM109を100μL植菌し，37℃で一晩培養し、目的の菌を得る。
本実施例３の体液成分検出システム１の構成及び作用は基本的には前記実施例１と同様である。但し、体液成分検出デバイス３の構成において一部相違する。以下、この相違点を中心に具体的に説明する。
本実施例３における体液成分検出デバイス３では、図４に示すように、微生物収容部７は、センシング部５における３本の電極１０、１１、及び１３の間に位置している。従って、本実施例３では、電極１０、１１、及び１３は微生物収容部７の外側に位置している。
尚、微生物収容部７は、前記実施例１と同様に、袋状のマイクロチューブ包括膜１９と、マイクロチューブ包括膜の内部に複数収容された小胞状のポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１と、ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１内に収容されたＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３とを有している。
本実施例３では、マイクロチューブ包括膜１９の孔径または網目の大きさは、０．１〜１μｍとなっており、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３の透過は許さないが、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３が産生した酵素ＧＯＤは外側に透過させることができる。センシング部１５の電極１０、１１、及び１３では、マイクロチューブ包括膜１９を透過してきた酵素ＧＯＤの存在下、グルコースに関して前記実施例１と同様の電気化学反応が生じる。従って、センシング部１５はグルコースの量に応じた電流値を検出することができる。
本実施例３の体液成分検出デバイス３及び体液成分検出システム１は、前記実施１と同様の効果を奏する。但し、本実施例３では、センシング部１５の電極に測定を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）が付着することを防止するのは、マイクロチューブ包括膜１９ではなく、外殻９である。また、本実施例３では、酵素ＧＯＤの拡散を防止し、センシング部１５における酵素ＧＯＤの濃度を一定以上に保つ役割を果たすのは、マイクロチューブ包括膜１９ではなく、外殻９である。
本実施例４の体液成分検出システム１の構成及び作用は基本的には前記実施例１と同様である。但し、本実施例４では、体液成分検出デバイス３におけるセンシング部１５の電極１０、１１、及び１３の表面が生体機能性高分子であるシリコーンにより化学修飾されている。このことにより、本実施例４では、体液中の妨害物質が電極に付着することを一層効果的に防止することができ、長期にわたって正確な測定を行うことができる。
本実施例５の体液成分検出システム１の構成及び作用は基本的には前記実施例１と同様である。但し、体液成分検出デバイス３の構成において一部相違する。以下、この相違点を中心に具体的に説明する。
図６に示すように、体液成分検出デバイス３は、多孔質系シリコーンから成り、円柱形状を有する本体部６９と、その内部に埋め込まれた、前記実施例１と同様のバイオセンサ６とを備えている。
本体部６９は、その内部に有る円柱形状の空隙部７１以外は多孔質系シリコーンにより充填されている。バイオセンサ６のうち、３本の電極である作用極１０、対極１１、及び参照極１３の先端は空隙部７１内にあり、バイオセンサ６のその他の部分は、本体部６９の多孔質性シリコーン内に埋め込まれている。
空隙部７１内には、生理食塩水とともに、自己複製のための遺伝情報を有する組み替え細胞７３と、複数の組み替え細胞７３から成る組織７５との混合物が収容されている。これら組み替え細胞７３及び組織７５は酵素ＧＯＤを産生する。バイオセンサ６は、その酵素ＧＯＤを用いて、前記実施例１と同様に、グルコースの量を測定する。
本実施例５において、本体部６９は、０．１〜２ｎｍ径の孔又は網目の大きさを有する多孔質性シリコーンから構成されており、有機体拡散防止膜、産生物質拡散防止膜、及び妨害物質防止膜に該当する。つまり、本体部６９は、上記の孔径又は網目の大きさを有することにより、測定対象であるグルコースの透過は許すが、組み替え細胞７３、組織７５、及び組み替え細胞７３や複組織７５が産生する酵素ＧＯＤの本体部６９外への拡散は許さない。また、本体部６９は、バイオセンサ６による検出を妨害する物質（体液中に存在する種々のたんぱく質等）の、空隙部７１への透過は許さない。
次に、下記（１）〜（１３）の手順に従って、組み替え細胞７３を製造した。この製造方法を図７を用いて説明する。尚、ここでは、Clontech社のAdeno−ＸExpression System（登録商標）のキットを用いて標的細胞へ感染させる手法を用いている。また、pShuttle VectorはＩ−Ｃeu及びPl−Sce−Ｉ制限酵素部が両端に位置する哺乳動物の遺伝子特異的な発現カセットを構築するために使用している。
（１）プラスミドの調整
標準的な分子生物学的手法で、遺伝子特異的な組み替えpShuttleベクターを構築する。
（２）目的の遺伝子のクローニング
目的遺伝子をpShuttleに組み込んでクローニングする。
（３）大腸菌のトランスフォーメーション
制限酵素で消化したベクターと遺伝子断片をライゲーションし、その産物を大腸菌トランスフォームする。
（４）プラスミドＤＮＡの精製
制限酵素部位を解析して、目的の組み替えプラスミドを同定する。シーケンシングによって挿入した断片の方向と結合部位を確認し、同定されれば、大量に調製を行い、トランスフェクションの為の全てのプラスミドを単離する。
（５）発現カセットのpShuttleからの切り出し
制限酵素Pl−Scel及びＩ―Ceulを使用して発現カセットをpShuttleプラスミドＤＮＡから切り出す。
（６）発現カセットのAdeno−Ｘ ViraＤＮＡへのライゲーション
切り出された発現カセットを、in vitroライゲーション反応によってAdeno−Ｘ ViraＤＮＡに組み込む。
（７）ライゲーション産物の切断
ライゲーション産物をSwalで切断する。
（８）大腸菌のトランスフォーメーション
ＤＨ５αなどの一般用の組み替え欠損宿主株を使用し、標準の分子生物学的手法を用いて、化学または電気的にコンピテントした大腸菌をトランスフォーメーションさせる。
（９）目的遺伝子を含む組み替えアデノウイルスＤＮＡのSwal消化の精製
制限酵素部位の解析により、組み替え体を同定する。
（１０）Paclで組み替えアデノウイルスＤＮＡを消化
制限酵素Pcalで組み替えアデノウイルスを消化する。
（１１）Pacl消化した組み替えアデノウイルスＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション
アデノウイルスによるベクターをパッケージングして増殖するためにＨＥＫ２９３細胞を用い、前述のアデノウイルスＤＮＡのSwal消化をトランスフェクションする。
（１）プラスミドの調整
標準的な分子生物学的手法で、遺伝子特異的な組み替えpShuttleベクターを構築する。
（２）目的の遺伝子のクローニング
目的遺伝子をpShuttleに組み込んでクローニングする。
（３）大腸菌のトランスフォーメーション
制限酵素で消化したベクターと遺伝子断片をライゲーションし、その産物を大腸菌トランスフォームする。
（４）プラスミドＤＮＡの精製
制限酵素部位を解析して、目的の組み替えプラスミドを同定する。シーケンシングによって挿入した断片の方向と結合部位を確認し、同定されれば、大量に調製を行い、トランスフェクションの為の全てのプラスミドを単離する。
（５）発現カセットのpShuttleからの切り出し
制限酵素Pl−Scel及びＩ―Ceulを使用して発現カセットをpShuttleプラスミドＤＮＡから切り出す。
（６）発現カセットのAdeno−Ｘ ViraＤＮＡへのライゲーション
切り出された発現カセットを、in vitroライゲーション反応によってAdeno−Ｘ ViraＤＮＡに組み込む。
（７）ライゲーション産物の切断
ライゲーション産物をSwalで切断する。
（８）大腸菌のトランスフォーメーション
ＤＨ５αなどの一般用の組み替え欠損宿主株を使用し、標準の分子生物学的手法を用いて、化学または電気的にコンピテントした大腸菌をトランスフォーメーションさせる。
（９）目的遺伝子を含む組み替えアデノウイルスＤＮＡのSwal消化の精製
制限酵素部位の解析により、組み替え体を同定する。
（１０）Paclで組み替えアデノウイルスＤＮＡを消化
制限酵素Pcalで組み替えアデノウイルスを消化する。
（１１）Pacl消化した組み替えアデノウイルスＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション
アデノウイルスによるベクターをパッケージングして増殖するためにＨＥＫ２９３細胞を用い、前述のアデノウイルスＤＮＡのSwal消化をトランスフェクションする。
尚、ＨＥＫ２９３細胞は予め培養し、ストックを維持しておく。長期保存するときには、細胞凍結させる。
（１２）組み替えアデノウイルスの採取
アデノウイルスを採取し、ウイルスタイター測定を実施し、ウイルス活性を計測する。
（１３）標的細胞に感染
アデノウイルスを標的細胞に感染させ、組み替え細胞７３を製造する。
（１２）組み替えアデノウイルスの採取
アデノウイルスを採取し、ウイルスタイター測定を実施し、ウイルス活性を計測する。
（１３）標的細胞に感染
アデノウイルスを標的細胞に感染させ、組み替え細胞７３を製造する。
次に、組み替え細胞７３から、下記（１）〜（６）の手順に従って組織７５を得た。尚、下記の方法は、インキュベータ手法であり、器具としてバイオクリスタル社製のOptiCell（登録商標）を用いた。
（１） Opticellのアクセスポートをアルコール綿でよく拭く。
（２）培地ボトルキャップをアルコール綿で消毒し、シリンジ培地を吸引する。
（３）Opticellのアクセスポートにチップを挿入し、培地、組み替え細胞７３を注入する。
（４）Opticellの上下を反転させ、１０ｍｌの空気を吸引させる。
（５）アルコール綿でOpticellのアクセスポートを拭き、インキュベータで培養する。
（６）Opticellに空気を注入してから培地を吸引し、鉗子等を用いて片方の正着面からフレームに沿って切り離し、培養された細胞７５を得る。
（１） Opticellのアクセスポートをアルコール綿でよく拭く。
（２）培地ボトルキャップをアルコール綿で消毒し、シリンジ培地を吸引する。
（３）Opticellのアクセスポートにチップを挿入し、培地、組み替え細胞７３を注入する。
（４）Opticellの上下を反転させ、１０ｍｌの空気を吸引させる。
（５）アルコール綿でOpticellのアクセスポートを拭き、インキュベータで培養する。
（６）Opticellに空気を注入してから培地を吸引し、鉗子等を用いて片方の正着面からフレームに沿って切り離し、培養された細胞７５を得る。
本実施例５の体液成分検出デバイス３及び体液成分検出システム１は、前記実施例１と同様の効果を奏する。
尚、本発明は前記実施例になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
尚、本発明は前記実施例になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
例えば、前記実施例１〜実施例５において、体液成分検出デバイス３は、送受信部３３を用いて、測定データとともに電力供給部３５の電源状態も送信することができる。この場合、体外検出装置５は、測定データとともに電源状態を受信し、電力供給部３５の充電完了、２次電池４３の容量低下をモニタすることができる。
前記実施例１〜実施例４において、ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル２１はなくとも良い。この場合、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３はマイクロチューブ包括膜１９の中に分散して存在する。尚、マイクロチューブ包括膜１９の孔径または網目の大きさはＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３よりも小さいので、ＧＯＤ遺伝子組み換え菌２３がマイクロチューブ包括膜１９の外側に漏れ出すことはない。
前記実施例１〜４において、ＧＯＤを産生する微生物はＸ５６４４３には限定されず、他の菌であってもよい。例えば、ＮＳＢＩの識別番号においてＣＢ３６００５３、ＮＴ_０３９５５３、ＢＣ０１２２７９、ＮＭ_０１３９２９、ＡＫ０１７５７０、ＡＫ０１０５６２、ＡＢ０９５５４２、ＸＭ_１２２４７０、ＡＦ４８３５９４、ＡＦ４８３５８２、ＢＢ００１２７５、ＡＦ２２０５５７、ＡＦ２２０５５６、ＡＦ２２０５５５、ＡＦ２１４７０４等に該当するものが挙げられる。
前記実施例１〜実施例５の体液成分検出システムは、糖尿病の状態を検出するシステムとする以外にも、生活習慣病、高脂症、膵炎の状態を検出するシステムや、代謝モニタとすることができる。
高脂血症の状態を検出するシステムとする場合には、測定対象となる体液成分はコレステロールとなる。この場合、実施例１〜４では、微生物収容部７に、酵素であるコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを産生する遺伝子組み替え菌を収容し、実施例４では、空隙７１に酵素であるコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを産生する組み替え細胞７３及び組織７５を収容する。このとき、体液成分検出システム１は、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼの存在下、コレステロールの電気化学反応に伴う電流を検出することができる。尚、この反応におけるトランスデューサはＨ2Ｏ2となる。
膵炎の状態を検出するシステムとする場合には、測定対象となる体液成分はα−アミラーゼとなる。この場合、実施例１〜４では、微生物収容部７には、酵素であるα−アミラーゼ、α−グルコシターゼ、及びグルコースオキシターゼを産生する遺伝子組み替え菌を収容し、実施例５では、空隙７１に酵素であるα−アミラーゼ、α−グルコシターゼ、及びグルコースオキシターゼを産生する組み替え細胞７３及び組織７５を収容する。このとき、体液成分検出デバイス３のセンシング部１５では、α−アミラーゼ、α−グルコシターゼ、及びグルコースオキシターゼの存在下、図５に示す電気化学反応が生じる。この電気化学反応の速さ、すなわち検出する電流値はα−アミラーゼの量に依存するので、電流値を測定することにより、α−アミラーゼの量を測定することができる。尚、図５の反応におけるトランスデューサはＨ2Ｏ2となる。
代謝モニタとする場合には、測定対象となる体液成分は乳酸となる。この場合、実施例１〜４では、微生物収容部７に、酵素であるラクテートオキシターゼを産生する遺伝子組み替え菌を収容し、実施例５では、空隙７１に酵素であるラクテートオキシターゼを産生する組み替え細胞７３及び組織７５を収容する。このとき、体液成分検出システム１は、ラクテートオキシターゼの存在下、乳酸の電気化学反応に伴う電流を検出することができる。尚、この反応におけるトランスデューサはＨ2Ｏ2となる。
１・・・体液成分検出システム
３・・・体液成分検出デバイス
５・・・体外検出装置
６・・・バイオセンサ
７・・・微生物収容部
９・・・外殻
１０・・・作用極
１１・・・対極
１３・・・参照極
１５・・・センシング部
１７・・・電子デバイス
１９・・・マイクロチューブ包括膜
２１・・・ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル
２３・・・ＧＯＤ遺伝子組み換え菌
３１・・・制御部
３３、５５・・・送受信部
３５・・・電力供給部
５７・・・演算制御部
５９・・・表示部
６１・・・ＲＡＭ
６３・・・スピーカ
６９・・・本体部
７１・・・空隙部
７３・・・組み替え細胞
７５・・・組織
３・・・体液成分検出デバイス
５・・・体外検出装置
６・・・バイオセンサ
７・・・微生物収容部
９・・・外殻
１０・・・作用極
１１・・・対極
１３・・・参照極
１５・・・センシング部
１７・・・電子デバイス
１９・・・マイクロチューブ包括膜
２１・・・ポリマー皮膜多孔性マイクロカプセル
２３・・・ＧＯＤ遺伝子組み換え菌
３１・・・制御部
３３、５５・・・送受信部
３５・・・電力供給部
５７・・・演算制御部
５９・・・表示部
６１・・・ＲＡＭ
６３・・・スピーカ
６９・・・本体部
７１・・・空隙部
７３・・・組み替え細胞
７５・・・組織
Claims (16)
- 体液成分を測定できるバイオセンサと、
前記バイオセンサにて用いる物質を産生する有機体と、を備え、
生体内に留置することを特徴とする体液成分検出デバイス。 - 前記有機体は微生物であることを特徴とする請求項１記載の体液検出デバイス。
- 前記微生物が遺伝子組み換え菌であることを特徴とする請求項２記載の体液成分検出デバイス。
- 前記有機体が、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の体液成分検出デバイス。
（Ａ）自己複製のための遺伝情報を有する細胞、
（Ｂ）前記細胞から成る組織、
（Ｃ）前記細胞と前記組織との混合物 - 前記細胞が人由来のものであることを特徴とする請求項４記載の体液成分検出デバイス。
- 前記有機体を、前記有機体の透過を許さない有機体拡散防止膜で覆うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。
- 前記バイオセンサにおいて前記体液成分の検出を行う検出部を、前記検出に対する妨害物質の透過を制限するとともに、前記体液成分は透過可能な妨害物質防止膜で覆うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。
- 前記バイオセンサにおいて前記体液成分の検出を行う検出部を、前記有機体の産生する物質の透過を制限するとともに、前記体液成分は透過可能な産生物質拡散防止膜で覆い、
前記有機体は、前記産生物質拡散防止膜の中に収容することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。 - 前記バイオセンサ及び前記有機体を収容するとともに、前記体液成分の透過を許す外殻を備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。
- 前記バイオセンサは、前記体液成分を検出する検出部として、前記体液成分が電気化学反応するときの電気信号を検出可能な電極を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。
- 前記電極は生体機能性高分子により化学修飾されていることを特徴とする請求項１０に記載の体液成分検出デバイス。
- 前記バイオセンサにより検出したデータを外部へ送信する送信手段を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の体液成分検出デバイス。
- 前記送信手段は、前記データをリアルタイムで無線通信することを特徴とする請求項１２に記載の体液成分検出デバイス。
- 請求項１２又は１３に記載の体液成分検出デバイスと、
前記送信手段により送信されたデータを受信可能な受信手段を備えた体外モニタ装置と、を備えた体液成分検出システム。 - 前記体外モニタ装置は、受信した前記データを時間データとともに記録するデータ記録手段を有することを特徴とする請求項１４に記載の体液成分検出システム。
- 前記体外モニタ装置は、受信した前記データが異常であるか否かを判断する判断手段と、
前記データが異常であると判断した場合に報知する報知手段と、を備えることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の体液成分検出システム。
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