JP2005227154A

JP2005227154A - Specified gene detecting method, and base-modified nanoparticle and reagent for discriminating monobasic variation type gene used therefor

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Publication number: JP2005227154A
Application number: JP2004036688A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Tamiya; 栄一民谷; Kerman Kagan; ケルマン（ＫａｇａｎＫｅｒｍａｎ）カーン
Original assignee: Tamiya Eiichi
Current assignee: Tamiya Eiichi
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2005-08-25

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a specified gene detecting method capable of detecting quickly and easily a monobasic variation or the like in a gene, for example, and capable of identifying further a kind thereof. <P>SOLUTION: The specified gene is detected using a nanoparticle coupled with a base and having an electrochemical activity. In concrete saying, the monobasic-modified nanoparticle is made to act on the electrode immobilized with the gene of a discrimination object, and the presence of coupling of the nanoparticle to the electrode is detected as an electrochemical signal to discriminate the presence of the variation in the gene. Four kinds of nanoparticles of a cytosine-modified nanoparticle, a thymine-modified nanoparticle, a guanine-modified nanoparticle, and an adenine-modified nanoparticle are used as the monobasic-modified nanoparticles, and those are made to act sequentially to detect the electrochemical signals, so as to determine the kind of the variation in the gene. The each nanoparticle is a nanoparticle having the electrochemical activity, and is a gold nanoparticle, for example. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、例えば１塩基変異を有する遺伝子等、特定遺伝子を迅速、且つ簡易に把握し得る特定遺伝子検出方法に関するものであり、さらには、係る検出方法に使用される塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬に関する。 The present invention relates to a specific gene detection method capable of quickly and easily grasping a specific gene such as a gene having a single base mutation, and further, base-modified nanoparticles and 1 base used in such a detection method The present invention relates to a reagent for identifying a mutant gene.

ＤＮＡを基礎とする研究における現在の努力は、ヒトゲノムプロジェクトの膨大なライブラリーを利用することにフォーカスされている。そして、それは種々の生体現象の解明につながっている。これらの努力の最も大きな挑戦は、１塩基変異型遺伝子（ＳＮＰ）の検出に関するものである。体細胞における一塩基変異は、遺伝的あるいは、遺伝的でない病気にも関わると考えられている。遺伝情報の伝達は、全て特異的な塩基のペア、すなわちアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアに依存しており、これは５０年程前にワトソンとクリックによって初めて述べられたことである。ここで、塩基対のミスマッチのタイプは次のように分類される。 Current efforts in DNA-based research are focused on utilizing the vast library of human genome projects. And it has led to the elucidation of various biological phenomena. The greatest challenge of these efforts concerns the detection of single nucleotide variant genes (SNPs). Single nucleotide mutations in somatic cells are thought to be associated with genetic or non-genetic diseases. The transmission of genetic information depends on all specific base pairs, ie, adenine (A) -thymine (T), cytosine (C) -guanine (G) pairs, which was Watson about 50 years ago. And was first mentioned by clicking. Here, the types of base pair mismatch are classified as follows.

一つは、トランジションＳＮＰ、すなわちプリンと誤ったピリミジンとのペアであり、もう一つは、トランスバージョンＳＮＰ、すなわち２つのプリミジンのペア、ピリミジンのペアである。ＳＮＰの同定のプロトコールにおいては多くの組み合わせが考えられる。それは一塩基の変化によってなされる訳である。実際、８種類の可能なＳＮＰが予想されている。例えば、Ａ−Ｃ，Ａ−Ａ，Ａ−Ｇ，Ｃ−Ｃ，Ｃ−Ｔ，Ｔ−Ｔ，Ｔ−Ｇ，Ｇ−Ｇの組み合わせである。 One is a transition SNP, a pair of purines and a false pyrimidine, and the other is a transversion SNP, a pair of two primidines, a pyrimidine pair. Many combinations are possible in the SNP identification protocol. It is done by a single base change. In fact, eight possible SNPs are expected. For example, a combination of AC, AA, AG, CC, CT, TT, TG, and GG.

従来、ＳＮＰを計測するいくつかの重要な方法が知られている。しかしながら、従来の方法は、先に例示した全ての種類のＳＮＰを同時に計ることはできない。ＳＮＰを含むＤＮＡ部位を、例えばＳ−１ヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIのような一本鎖の特異的なデオキシリボヌクレアーゼによって***させることは、直接的なアプローチであった。しかしながら、酵素や反応の条件の数多くの異なる組み合わせがそれらの方法を困難なものにしている。さらに、Ａ−Ａ、あるいはＴ−ＴトランスバージョンＳＮＰは、それらミスマッチ鎖には***されない。 Conventionally, several important methods for measuring SNPs are known. However, the conventional method cannot simultaneously measure all types of SNPs exemplified above. Splitting DNA sites containing SNPs with single-stranded specific deoxyribonucleases such as S-1 nuclease, T4 endonuclease VII was a direct approach. However, many different combinations of enzymes and reaction conditions make these methods difficult. Furthermore, AA or TT transversion SNPs are not split into these mismatched strands.

ＳＮＰのタンパク質による認識は非常に魅力的な分野である。何故なら、酵素による切断は必要ないためである。ＳＮＰを認識し結合できるタンパク質は大腸菌から分離され、ｍｕｔＳと呼ばれている。ｍｕｔＳはＳＮＰに結合し、この複合体の検出は種々の分析法によって行われる。しかしながら、主な欠点は、あらゆるミスマッチに適応できないことである。例えば、Ｃ−ＣのミスマッチはｍｕｔＳによって認識されない。Ｂｉらは、最近遺伝子修飾ｍｕｔＳを基礎とするプロティンチップを報告した。一般的に修飾したｍｕｔＳは、ＳＮＰのＰＣＲで増幅されたカップルにおいてｍｕｔＳ検出を可能としている。 SNP protein recognition is a very attractive field. This is because enzymatic cleavage is not necessary. A protein that can recognize and bind to SNPs has been isolated from E. coli and is called mutS. mutS binds to SNP and detection of this complex can be done by various analytical methods. However, the main drawback is that it cannot adapt to any mismatch. For example, a CC mismatch is not recognized by mutS. Bi et al. Recently reported a protein chip based on genetically modified mutS. In general, modified mutS allows detection of mutS in a couple amplified by SNP PCR.

ミスマッチＤＮＡの完全な相補ＤＮＡとは異なる電気泳動挙動は、特別なゲルシステムによってモニタされる。例えば、グラジエントゲル電気泳動はＳＮＰ同定に用いられている。しかしながら、この方法は、完全なシーケンサとのミスマッチ配列との移動との変化が未だ完全に理解されていない。 The electrophoretic behavior of the mismatched DNA that is different from the fully complementary DNA is monitored by a special gel system. For example, gradient gel electrophoresis is used for SNP identification. However, in this method, the change between the complete sequencer and the movement with the mismatched sequence is not yet completely understood.

Ｇａｎｇｕｌｙらは、ラジオアイソトープラベルされた水溶性カルボジイミドをミスマッチのＴとＧに付加することによって、ＳＮＰがポリアクリルアミドゲル電気泳動でラジオアイソトープラベルをモニタすることにより検出できることを示した。このアプローチ方法の限界はＴやＧの塩基のみ依存することであり、また放射性物質を標識に用いることであり、それはルーチンな分析には望ましいことではない。 Showed that SNPs can be detected by monitoring radioisotope labels by polyacrylamide gel electrophoresis by adding radioisotope-labeled water-soluble carbodiimides to the mismatched T and G. The limitation of this approach is that it relies only on T and G bases and uses radioactive material for labeling, which is not desirable for routine analysis.

これまで、いくつかの電気化学的な方法や光学的なＤＮＡのバイオセンサーがＳＮＰを測定するために用いられてきた。測定のスキームはいつもターゲットＤＮＡシーケンスにおけるＳＮＰの存在を測定するものであった。これに対し、このレポートにおいては、一塩基修飾ナノ粒子によってＳＮＰ中の塩基の同定が可能であった。金のナノ粒子は、そのユニークな光学的、電気化学的な性質により、広くＤＮＡバイオセンサーに用いられている。 To date, several electrochemical methods and optical DNA biosensors have been used to measure SNPs. The measurement scheme always measured the presence of SNPs in the target DNA sequence. On the other hand, in this report, it was possible to identify the base in the SNP by the single base modified nanoparticles. Gold nanoparticles are widely used in DNA biosensors due to their unique optical and electrochemical properties.

Ｔａｔｏｎらは、金のナノ粒子でオリゴヌクレオチドのターゲットをラベル化し、それをハイブリットの融解プロフィルでモニタをした。銀の還元を触媒できる金のナノ粒子とと関連してＳＮＰが選択的に光のスキャノメトリックアレイによって検出された。 Taton et al. Labeled the oligonucleotide target with gold nanoparticles and monitored it with the hybrid melting profile. SNPs were selectively detected by light scanometric arrays in association with gold nanoparticles that could catalyze the reduction of silver.

Ｐａｒｋらは、金がタグされたプローブとそのターゲットのオリゴヌクレオチド、それは２つのエレクトロードの間のナノギャップに固定化されているが、それをハイブリッドさせた。金のナノ粒子をベースとするプロテインアッセイもまた最近ミルキンによって報告された。ターゲットとなるプロティンは、磁気のマイクロ粒子とＤＮＡが付加された金のナノ粒子の間で捕らえられている。磁場によって分離されたあと、ＤＮＡは金のナノ粒子から放出され測定されている。金のナノ粒子のサイズに依存して非常に多くのＤＮＡの鎖が溶液中に放出され、タンパク質分子に補足される。 Park et al. Hybridized a gold-tagged probe and its target oligonucleotide, which is immobilized in the nanogap between the two electrodes. A protein assay based on gold nanoparticles was also recently reported by Milkin. The target protein is trapped between magnetic microparticles and gold nanoparticles with added DNA. After being separated by a magnetic field, the DNA is released from the gold nanoparticles and measured. Depending on the size of the gold nanoparticles, too many strands of DNA are released into the solution and captured by protein molecules.

Ｗａｎｇらは、磁気的に誘導された電気化学的検出法を開発している。すなわち、ストレプトアビジンでコートされたナノ粒子を、磁気ビーズ上に固定化されたビオチン化ハイブリットに結合させることで、ＤＮＡハイブリダイゼーションする方法である。Ｗａｎｇらは、ＰｂＳ、ＺｎＳ、ＣｄＳ等のクォンタムドットを用いて、同時に複数のＤＮＡターゲットの測定を水銀フィルム電極上において可能にしている。 Wang et al. Have developed a magnetically induced electrochemical detection method. That is, a DNA hybridization is performed by binding nanoparticles coated with streptavidin to a biotinylated hybrid immobilized on magnetic beads. Wang et al. Use a quantum dot such as PbS, ZnS, or CdS to simultaneously measure multiple DNA targets on a mercury film electrode.

Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙらは、最近ＳＮＰを測定する技術を開発した。それは蛍光ラベルされたもので、一塩基を用いるものである。それは、我々の仮説も支持している。すなわち、一塩基修飾ラベルがシングルモレキュレベルでのインフォメーションを与えることを可能にしている。ＤＮＡポリメラーゼ酵素がＣｙ−３，Ｃｙ−５と一塩基結合したＤＮＡポリメラーゼ酵素とＤＮＡテンプレート、それはＳＮＰの光学的な測定を可能にしている。ＤＮＡポリメラーゼとミスマッチされたラベル化一塩基は７５ベースのターゲットＤＮＡとに分解された。表面のイメージングのあとで蛍光分子の場所はＤＮＡ分子の位置と比較された。２番目の反応でその時には、蛍光されたベースと反応が行われ、イメージングが数倍にされた時、総合Ｃｙ−３のモデファイされたウラシル（Ｕ）が相補的に結合する。しかしながら、Ｃｙ−３がモデファイされたＡとは結合しない。 Braslavsky et al. Recently developed a technique for measuring SNPs. It is fluorescently labeled and uses a single base. It also supports our hypothesis. That is, a single base modification label can provide information at a single molecular level. A DNA polymerase enzyme and a DNA template in which the DNA polymerase enzyme is linked to Cy-3 and Cy-5 by a single base, which enables optical measurement of SNP. Labeled single base mismatched with DNA polymerase was degraded to 75 base target DNA. After surface imaging, the location of the fluorescent molecule was compared with the location of the DNA molecule. The second reaction then has a reaction with the fluorescent base, and when imaging is multiplied several times, the modified Cyura modified uracil (U) binds complementarily. However, Cy-3 does not bind to the modified A.

Ｗｉｌｌｎｅｒらの研究者は、チオール化されたオリゴヌクレオチドを、金電極または金クォーツのピエゾクリスタルの上にアセンブルした。前記オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰサイトの一塩基に限りターゲットＤＮＡと相補的である。通常、あるいは異常なターゲットＤＮＡを検出のためのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、ハイブリダイズしていないＳＮＰサイトのフリーな塩基を、ＤＮＡポリマラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）の存在下、ビオチン化されたヌクレオチドと反応させる。標識化されたヌクレオチドは、ＳＮＰサイトに含まれる２本鎖ハイブリッドとのみカップリングする。その後のＳＮＰサイト上のビオチン化されたヌクレオチドへのアビジン−アルカリホスファターゼの結合、及び変換器上での不溶性物質の生体触媒された沈殿により、ＳＮＰが増幅されて検出される。 The researchers at Willner et al. Assembled thiolated oligonucleotides on gold electrodes or gold quartz piezocrystals. The oligonucleotide is complementary to the target DNA only for one base of the SNP site. After normal or abnormal target DNA is hybridized with an oligonucleotide for detection, free bases of non-hybridized SNP sites are converted into biotinylated nucleotides in the presence of DNA polymerase I (Klenow fragment). React. Labeled nucleotides only couple with double-stranded hybrids contained at the SNP site. SNPs are amplified and detected by subsequent binding of avidin-alkaline phosphatase to biotinylated nucleotides on the SNP site and biocatalyzed precipitation of insoluble material on the transducer.

しかしながら、Ｗｉｌｌｎｅｒらの研究者は、変異サイトにおける未知のハイブリダイズしていないフリーな塩基の同定には、その検出システムを適用していない。 However, Willner et al. Researchers have not applied the detection system to the identification of unknown unhybridized free bases at mutation sites.

本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、１塩基変異型遺伝子等の特定遺伝子を迅速、且つ簡易に検出し、例えば変異の種類まで同定することが可能な特定遺伝子検出方法を提供することを目的とし、さらには、係る検出方法に用いる塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬を提供することを目的とする。 The present invention has been proposed in view of such a conventional situation, and a specific gene such as a single nucleotide mutation type gene can be detected quickly and easily, for example, a specification capable of identifying even the type of mutation. It is an object to provide a gene detection method, and further to provide a base-modified nanoparticle and a single-base mutation gene identification reagent used in such a detection method.

このような目的を達成するために、本発明の特定遺伝子検出方法は、塩基が結合し電気化学活性を有するナノ粒子と電極とを用いて特定遺伝子を検出することを特徴とする。例えば、特定遺伝子が１塩基変異型遺伝子の場合、識別対象となる遺伝子が固定された電極に対して１塩基修飾されたナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出し、前記遺伝子における変異の有無を識別する。 In order to achieve such an object, the specific gene detection method of the present invention is characterized in that a specific gene is detected using a nanoparticle having a base and electrochemical activity and an electrode. For example, when the specific gene is a single-base mutation gene, a single base-modified nanoparticle is allowed to act on the electrode to which the gene to be identified is fixed, and the presence or absence of binding of the nanoparticle to the electrode is electrically detected. Detected as a chemical signal to identify the presence or absence of mutations in the gene.

また、本発明の塩基修飾ナノ粒子は、対象となる遺伝子における変異の有無を識別するための塩基修飾ナノ粒子であって、電気化学的活性を有するナノ粒子表面がシトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる１種により修飾されていることを特徴とする。さらに、本発明の１塩基変異型遺伝子識別用試薬は、対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬であって、シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えることを特徴とする。 The base-modified nanoparticles of the present invention are base-modified nanoparticles for identifying the presence or absence of mutations in a target gene, and the surface of the nanoparticles having electrochemical activity is from cytosine, thymine, guanine, and adenine. It is modified by one selected. Furthermore, the single-base mutation gene identification reagent of the present invention is a single-base mutation gene identification reagent for identifying the type of mutation in the target gene, and includes cytosine-modified nanoparticles, thymine-modified nanoparticles, It comprises four types of single-base modified nanoparticles, guanine modified nanoparticles and adenine modified nanoparticles.

本発明の特定遺伝子検出方法は、例えば全ての可能な１塩基変異型遺伝子（ＳＮＰ）を区別できる方法である。すなわち、本発明では、ＳＮＰは特定の塩基が結合したナノ粒子（１塩基修飾ナノ粒子）の電気化学的信号の変化として区別される。１塩基修飾ナノ粒子は、はじめにキトサンポリマーがアルカンチオール自己組織化修飾されたナノ粒子の上に形成される。特定の一塩基は、その後でキトサンで被覆されたナノ粒子の上に形成される。それは、キトサンのアミノ基に結合したホスホルアミデート結合の形成を介してなされる。もし、ＤＮＡにＳＮＰがありそのミスマッチの塩基が相補的に結合するのなら、ナノ粒子は電極表面に蓄積し、その結果、電気化学的信号の大きな変化が起こる。 The specific gene detection method of the present invention is a method that can distinguish, for example, all possible single nucleotide mutation genes (SNPs). That is, in the present invention, the SNP is distinguished as a change in electrochemical signal of a nanoparticle to which a specific base is bound (one base-modified nanoparticle). A single base modified nanoparticle is first formed on a nanoparticle in which a chitosan polymer is alkanethiol self-assembled modified. A particular single base is then formed on the nanoparticles coated with chitosan. It is done through the formation of a phosphoramidate bond attached to the amino group of chitosan. If there is a SNP in the DNA and the mismatched bases bind complementary, the nanoparticles accumulate on the electrode surface, resulting in a large change in the electrochemical signal.

本発明の検出方法においては、塩基で修飾されたナノ粒子がＳＮＰの存在を示すだけでなく、どの塩基がその塩基対の中に存在しているかを明らかにできる。特にトラスバージョンＳＮＰの同定、それはすなわち同じピリミジンあるいはプリンのカップルを有する場合であるが、その場合は特に単純な応答として区別される。ここではモデルとして構成された２１塩基のＤＮＡプローブを用いて行われた。そのプローブはすべての可能な変異の組み合わせを有するＴＮＦ−αに関するものである。このナノ粒子を基礎とする電気化学的な方法は、あらゆる変異のＤＮＡを測定する有効な方法である。 In the detection method of the present invention, not only the nanoparticles modified with a base indicate the presence of SNPs, but also it is possible to clarify which base is present in the base pair. In particular, the identification of the truss version SNP, ie when it has the same pyrimidine or purine couple, is distinguished as a particularly simple response. Here, a 21-base DNA probe constructed as a model was used. The probe is for TNF-α with all possible mutation combinations. This electrochemical method based on nanoparticles is an effective method for measuring DNA of any mutation.

本発明によれば、例えば１塩基変異を有する特定遺伝子の存在を、電気化学的信号の変化として、迅速、且つ簡易に検出することができる。また、本発明によれば、１塩基変異の種類まで同定することが可能であり、あらゆる変異のＤＮＡを測定する全く新規で有効な方法を提供することが可能である。 According to the present invention, for example, the presence of a specific gene having a single base mutation can be detected quickly and easily as a change in an electrochemical signal. Further, according to the present invention, it is possible to identify even the types of single-base mutations, and it is possible to provide a completely new and effective method for measuring DNA of any mutation.

以下、本発明を適用した特定遺伝子検出方法、塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬について、詳細に説明する。なお、以下においては、特定遺伝子として、１塩基変異型遺伝子を例にして、その識別方法について説明する。 Hereinafter, the specific gene detection method to which the present invention is applied, the base-modified nanoparticles, and the single-base mutation gene identification reagent are described in detail. In the following, the identification method will be described using a single-base mutation gene as an example of the specific gene.

本発明の１塩基変異型遺伝子の識別方法（特定遺伝子検出方法）は、基本的には、識別対象となる遺伝子が固定された電極に対して塩基修飾された電気化学的活性ナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出し、前記遺伝子における変異の有無を識別するというものである。 The identification method (specific gene detection method) of a single nucleotide mutation type gene of the present invention basically operates by applying base-modified electrochemically active nanoparticles to an electrode on which a gene to be identified is fixed. The presence or absence of a mutation in the gene is identified by detecting the presence or absence of binding of the nanoparticle to the electrode as an electrochemical signal.

先にも述べたように、遺伝子配列中において、各塩基は、特異的に特定の塩基とのみ結合する。具体的には、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアのみである。これらが正常に結合していれば、他の塩基を作用させても結合しない。ところが、１塩基変異が存在する場合、この変異部位には前記組み合わせではない組み合わせが存在し、互いに結合しない塩基が存在する。 As described above, each base specifically binds only to a specific base in the gene sequence. Specifically, there are only adenine (A) -thymine (T) and cytosine (C) -guanine (G) pairs. If these are normally bound, they will not bind even if other bases are allowed to act. However, when there is a single base mutation, there is a combination other than the above combination at this mutation site, and there are bases that do not bind to each other.

したがって、前記変異部位に何らかの塩基を作用させれば、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアを構成する場合、前記結合していない塩基と作用させた塩基が結合する。塩基として１塩基修飾されたナノ粒子を作用させれば、前記塩基の結合によりナノ粒子が結合し、電気化学的信号の変化として確認できる。これを検出すれば、遺伝子に１塩基変異が存在するか否かを識別することができる。さらに、前記１塩基修飾されたナノ粒子としてシトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類のナノ粒子を用い、これらを順次作用させて前記電気化学的信号を検出することで、遺伝子における変異の種類を判別することも可能である。 Therefore, if any base was allowed to act on the mutation site, when a pair of adenine (A) -thymine (T) and cytosine (C) -guanine (G) was constructed, it was allowed to act with the unbound base. The base binds. When nanoparticles modified by one base are allowed to act as a base, the nanoparticles are bound by the binding of the base, and can be confirmed as a change in electrochemical signal. By detecting this, it is possible to identify whether or not a single base mutation exists in the gene. Furthermore, four types of nanoparticles, cytosine-modified nanoparticles, thymine-modified nanoparticles, guanine-modified nanoparticles, and adenine-modified nanoparticles, are used as the one-base-modified nanoparticles, and these are sequentially acted on to make the electrochemical reaction. By detecting the signal, it is also possible to determine the type of mutation in the gene.

図１は、本発明による１塩基変異の識別の原理を模式的に示すものである。例えば、１塩基変異として、Ａ−Ｇの組み合わせが遺伝子中に存在するとする。この場合、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）は、互いに結合することなく遺伝子中に存在する。 FIG. 1 schematically shows the principle of identification of single nucleotide mutations according to the present invention. For example, it is assumed that a combination of AG exists in a gene as a single base mutation. In this case, adenine (A) and guanine (G) are present in the gene without binding to each other.

ここで、図１（ａ）に示すように、シトシン（Ｃ）修飾ナノ粒子を作用させると、前述の特異的組み合わせによりグアニン（Ｇ）と結合する。この状態で電気化学的信号を測定すると、電極上にナノ粒子が存在するため、電気化学的酸化信号としてピークが発現する。次に、図１（ｂ）に示すように、チミン（Ｔ）修飾ナノ粒子を作用させると、アデニン（Ａ）と結合する。したがって、この場合にも電気化学的酸化信号としてピークが発現する。 Here, as shown in FIG. 1A, when cytosine (C) -modified nanoparticles are allowed to act, they bind to guanine (G) by the specific combination described above. When an electrochemical signal is measured in this state, a peak appears as an electrochemical oxidation signal because nanoparticles exist on the electrode. Next, as shown in FIG. 1B, when thymine (T) -modified nanoparticles are allowed to act, they bind to adenine (A). Therefore, in this case, a peak appears as an electrochemical oxidation signal.

一方、図１（ｃ）に示すように、グアニン（Ｇ）修飾ナノ粒子を作用させた場合には、ペアとなる相手の塩基（シトシン）が存在しないため結合せず、電気化学的信号を測定してもピークは発現しない。同様に、図１（ｄ）に示すように、アデニン（Ａ）修飾ナノ粒子を作用させた場合にも、ペアとなる相手の塩基（チミン）が存在しないため結合せず、電気化学的信号を測定しても、やはりピークは発現しない On the other hand, as shown in FIG. 1 (c), when a guanine (G) modified nanoparticle is allowed to act, since there is no paired base (cytosine), it does not bind and the electrochemical signal is measured. Even if a peak does not appear. Similarly, as shown in FIG. 1 (d), when an adenine (A) modified nanoparticle is allowed to act, since there is no base (thymine) as a partner, there is no binding and an electrochemical signal is generated. Even after measurement, no peak appears

したがって、いすれの１塩基修飾金ナノ粒子を作用させたときにピークが発現するかを調べれば、その１塩基変異がどのような塩基の組み合わせか判別することができる。例えば、前記のようにシトシン修飾ナノ粒子とチミン修飾ナノ粒子を作用させたときにピークが発現すれば、１塩基変異がＡ−Ｇであることがわかる。他の組み合わせにおいても同様であり、例えば１塩基変異がＡ−Ｃであれば、グアニン修飾ナノ粒子とチミン修飾ナノ粒子を作用させた時に電気化学的信号のピークが発現する。例えば１塩基変異がＡ−Ａである場合には、チミン修飾ナノ粒子を作用させた時にのみ電気化学的信号のピークが発現する。 Therefore, by investigating whether a peak appears when any one base-modified gold nanoparticle is allowed to act, it is possible to determine what kind of base combination the single base mutation is. For example, if a peak appears when cytosine-modified nanoparticles and thymine-modified nanoparticles are allowed to act as described above, it is understood that the single base mutation is AG. The same applies to other combinations. For example, if the single base mutation is AC, a peak of an electrochemical signal appears when guanine-modified nanoparticles and thymine-modified nanoparticles are allowed to act. For example, when the single base mutation is AA, the peak of the electrochemical signal appears only when the thymine modified nanoparticles are allowed to act.

本発明の１塩基変異型遺伝子の識別方法では、前記ナノ粒子として、電気化学的に活性を持つ粒子であれば任意であるが、例えば金、銀、銅、白金等の金属のナノ粒子や、ＣｄＳ、ＣｕＳ、ＣｄＳｅ等の半導体のナノ粒子や、ポリマー粒子が好ましい。これらの中で、粒子サイズや特異的電気化学的性質等の点から、金ナノ粒子、特に金コロイドナノ粒子が好適である。 In the method for identifying a single-base mutation gene of the present invention, the nanoparticle is arbitrary as long as it is an electrochemically active particle, for example, a metal nanoparticle such as gold, silver, copper, platinum, Semiconductor nanoparticles such as CdS, CuS, CdSe, and polymer particles are preferred. Among these, gold nanoparticles, particularly gold colloidal nanoparticles are preferable from the viewpoint of particle size, specific electrochemical properties, and the like.

遺伝子を固定する電極は、任意であるが、例えばビオチンを含むカーボンペースト電極が好ましく、これに対象となる遺伝子を結合したプローブ標識ビーズを固定化して用いればよい。また、前記電気化学的信号は、例えば矩形波ボルタメトリーにより測定すればよい。 The electrode for immobilizing the gene is optional, but for example, a carbon paste electrode containing biotin is preferable, and probe-labeled beads to which the gene of interest is bound may be immobilized and used. The electrochemical signal may be measured by, for example, rectangular wave voltammetry.

対象となる遺伝子における変異の有無を識別するための塩基修飾ナノ粒子としては、シトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる１種により修飾されたナノ粒子を用いる。これを模式的に示したものが図２である。金ナノ粒子（Ａｕ）の表面が塩基（Ｂ）で修飾されている。 As the base-modified nanoparticles for identifying the presence or absence of mutation in the target gene, nanoparticles modified with one selected from cytosine, thymine, guanine, and adenine are used. This is schematically shown in FIG. The surface of the gold nanoparticle (Au) is modified with a base (B).

ただし、金ナノ粒子の表面を直接塩基で修飾することは難しく、例えば図３に示すように、キトサンを介してナノ粒子表面に塩基Ｂを結合させる。前記塩基は、ホスホルアミデート結合により前記キトサンと結合する。また、キトサンは、アルカンチオールを介してナノ粒子表面に結合する。アルカンチオールは、例えばナノ粒子の表面に自己組織化単分子膜として形成されるが、表面には前記キトサンと結合する官能基、例えばカルボキシル基を有することが好ましい。 However, it is difficult to directly modify the surface of the gold nanoparticle with a base. For example, as shown in FIG. 3, base B is bonded to the nanoparticle surface via chitosan. The base binds to the chitosan through a phosphoramidate bond. Chitosan binds to the nanoparticle surface via alkanethiol. The alkanethiol is formed as a self-assembled monolayer on the surface of the nanoparticle, for example, and preferably has a functional group that binds to the chitosan, such as a carboxyl group, on the surface.

対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬としては、前記シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えていればよい。 The single-base mutation type gene identification reagent for identifying the type of mutation in the target gene is one of four types of the cytosine-modified nanoparticles, thymine-modified nanoparticles, guanine-modified nanoparticles, and adenine-modified nanoparticles. It suffices to have base-modified nanoparticles.

＜測定装置＞
矩形波ボルタメトリー（ＳＷＶ）には、６６０Ａ電気化学測定ワークステーション（CH instruments Inc., Austin, TX）を用いた。UV測定にはSolutionsソフトウエア付きの日立U-3010分光光度計を用い、１ｍＬ用、光路長１０ｍｍの水晶キュベットを用いた。検出は２．０ｍＬセルを用い、カーボンペースト電極（ＣＰＥ，直径３ｍｍ）、参照極（ＢＡＳ）、対極にＰｔワイヤーを用いて行った。 <Measurement device>
A 660A electrochemical measurement workstation (CH instruments Inc., Austin, TX) was used for square wave voltammetry (SWV). For UV measurement, a Hitachi U-3010 spectrophotometer equipped with Solutions software was used, and a quartz cuvette with an optical path length of 10 mm was used for 1 mL. The detection was performed using a 2.0 mL cell, using a carbon paste electrode (CPE, 3 mm in diameter), a reference electrode (BAS), and a Pt wire as a counter electrode.

原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は大気中で、市販のキット (SPA400-SPI3800, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan)を用いて行い、以下の条件でキャリブレーションした（20 mm xy-scan and 10 mm z-scan range PZT-scanner）。窒化シリコンチップ（SI-DF40, spring constant = 42 N/m, Seiko Instruments Inc.）を用い、画像はダイナミックフォースモード（ＤＦＭ）でとった。ＡＦＭ測定用のマイカ基板はふるうち化学社（東京、日本）より購入した。 Atomic force microscope (AFM) was performed in air using a commercially available kit (SPA400-SPI3800, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan) and calibrated under the following conditions (20 mm xy-scan and 10 mm). z-scan range PZT-scanner). A silicon nitride chip (SI-DF40, spring constant = 42 N / m, Seiko Instruments Inc.) was used and images were taken in dynamic force mode (DFM). A mica substrate for AFM measurement was purchased from Furuuchi Chemical Co. (Tokyo, Japan).

＜試薬＞
金コロイドナノ粒子（3.5-6.5 nm, 0.75 A₅₂₀ units/mL）と、ストレプトアビジンをコートした超常磁性酸化鉄粒子（〜１μｍ）はシグマから購入した。ウシ胸腺由来の２重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と１重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）はシグマから購入した。合成オリゴヌクレオチドはファスマックから購入した。構造はそれぞれ下記のとおり。
プローブ：5'-Biotin- CAA GAC CAC CAC TTC GAA ACC -3'
相補体：5' -GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG -3'
グアニンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GGG GTG GTC TTG -3'
シトシンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GCG GTG GTC TTG -3'
アデニンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GAG GTG GTC TTG -3'
非相補体：5'- GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGC GTGCCCC-3' <Reagent>
Colloidal gold nanoparticles (3.5-6.5 nm, 0.75 A ₅₂₀ units / mL) and streptavidin-coated superparamagnetic iron oxide particles (˜1 μm) were purchased from Sigma. Bovine thymus-derived double-stranded DNA (dsDNA) and single-stranded DNA (ssDNA) were purchased from Sigma. Synthetic oligonucleotides were purchased from Fasmac. The structure is as follows.
Probe: 5'-Biotin-CAA GAC CAC CAC TTC GAA ACC-3 '
Complement: 5'-GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG-3 '
Guanine mismatch: 5 '-GGT TTC GAA GGG GTG GTC TTG -3'
Cytosine mismatch: 5 '-GGT TTC GAA GCG GTG GTC TTG -3'
Adenine mismatch: 5 '-GGT TTC GAA GAG GTG GTC TTG -3'
Non-complement: 5'- GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGC GTGCCCC-3 '

オリゴヌクレオチド保存溶液（１００ｍｇ／Ｌ）は１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０，ＴＥ）にて調製し、凍結して保存した。プローブの希釈には２０ｍＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ４．８，ＡＢＳ）を用いた。ターゲットの稀希釈には２０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０，ＴＢＳ）を用いた。全ての保存液とバッファーはMillipore Milli-Q system (Bedford, MA)で作成した超純水を用いて調製した。全ての核酸の濃度は分光光度法により決定した。ビオチンとキトサンは和光純薬から購入した。アデノシン５′−モノフォスフェート（Adenosine 5'-monophosphate）, シチジン５′−モノフォスフェート（cytidine 5'-monophosphate）,グアノシン５′−モノフォスフェート（guanosine 5'-monophosphate）, チミジン５′−モノフォスフェート（thymidine 5'-monophosphate）はＩＣＮバイオメディカル社（ICN Biomedicals Inc.）より、また３−メルカプトプロピオン酸（3-mercaptopropionic acid：MPA）,３メルカプトプロパノール（3-mercaptopropanol：MP）, Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミドハイドロクロライド［N-(3-dimethylamino)propyl］-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride：EDC］, 及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide：(NHS)はアルドリッチ社（Aldrich）より購入した。他の試薬は分析試薬グレードのものを用いた。全ての実験は室温で行った。 An oligonucleotide stock solution (100 mg / L) was prepared with 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0, TE), and was stored frozen. For the dilution of the probe, 0.5 M acetate buffer (pH 4.8, ABS) containing 20 mM NaCl was used. For diluting the target, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, TBS) containing 20 mM NaCl was used. All stock solutions and buffers were prepared using ultrapure water made with the Millipore Milli-Q system (Bedford, Mass.). All nucleic acid concentrations were determined spectrophotometrically. Biotin and chitosan were purchased from Wako Pure Chemical. Adenosine 5'-monophosphate, cytidine 5'-monophosphate, guanosine 5'-monophosphate, thymidine 5'-mono Phosphate (thymidine 5'-monophosphate) was obtained from ICN Biomedicals Inc., and 3-mercaptopropionic acid (MPA), 3-mercaptopropanol (MP), N- (3-dimethylamino) propyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride [N- (3-dimethylamino) propyl] -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), and N-hydroxysuccinimide (NHS) Purchased from Aldrich, other reagents were analytical reagent grade, and all experiments were performed at room temperature.

＜手順＞
ストレプトアビジンコートビーズ上へのビオチン化プローブ修飾
プローブ標識ビーズはWang らの報告した方法を改変して調製した。改変部：遠心分離（３分、１２０００ｒｐｍ）後、ビーズの洗浄を０．２％Ｔｗｅｅｎと０．１％ＳＤＳを含むバッファーで行った。 <Procedure>
Modification of biotinylated probe onto streptavidin-coated beads Probe-labeled beads were prepared by modifying the method reported by Wang et al. Modified part: After centrifugation (3 minutes, 12000 rpm), the beads were washed with a buffer containing 0.2% Tween and 0.1% SDS.

溶液中でのハイブリダイゼーション
プローブ修飾ビーズを１００μＬのハイブリダイゼーション溶液（０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．０））に懸濁させた後、ターゲットが含まれるハイブリダイゼーション溶液（１５μｇ／ｍＬ）に添加した。ハイブリダイゼーションは２０分間、室温で静かに撹拌して行った。ハイブリダイゼーション後、ガラス瓶の下に磁石を置くことによって磁場をかけてハイブリ化したビーズを溶液から分離した。分離されたビーズは再びハイブリダイゼーション溶液に懸濁させ、その操作を３回繰り返した。ビーズの磁石による分離及び洗浄のいずれも、非特異的結合の影響を大きく抑制した。 Hybridization in solution After the probe-modified beads are suspended in 100 μL of a hybridization solution (10 mM phosphate buffer (PBS, pH 7.0) containing 0.1 M NaCl), a hybridization solution containing the target ( 15 μg / mL). Hybridization was carried out with gentle agitation at room temperature for 20 minutes. After hybridization, the hybridized beads were separated from the solution by applying a magnetic field by placing a magnet under the glass bottle. The separated beads were suspended again in the hybridization solution, and the operation was repeated three times. Both separation and washing of the beads with a magnet greatly suppressed the influence of non-specific binding.

ビオチン修飾ＣＰＥの調製
必要量のグラファイト粉末とミネラルオイル（Acheson 38, Fisher）（３０／７０％（ｗ／ｗ）graphite/oil)をよく混ぜた。その後、カーボンペーストの一部をビオチンと混ぜ、最終的に５％（Ｗ／Ｗ）となるようにした。その混合物をテフロン（登録商標）の電極ホルダーにきつく詰め、なめらかに磨いた。このビオチン修飾ＣＰＥは、その後ハイブリッドストレプトアビジンコートビーズを含むハイブリダイゼーション溶液に浸した。そのビーズを１時間ゆっくりかき混ぜてＣＰＥ上へ固定化した。 Preparation of biotin-modified CPE The required amount of graphite powder and mineral oil (Acheson 38, Fisher) (30/70% (w / w) graphite / oil) were mixed well. Thereafter, a part of the carbon paste was mixed with biotin, so that the final amount was 5% (W / W). The mixture was tightly packed in a Teflon (registered trademark) electrode holder and polished smoothly. The biotin modified CPE was then immersed in a hybridization solution containing hybrid streptavidin coated beads. The beads were agitated slowly for 1 hour and immobilized on CPE.

１塩基修飾金ナノ粒子の調製
金ナノ粒子上の１塩基による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）は、既報とほぼ同じようにして調製し、ＭＰＡでコートされた金ナノ粒子を１時間インキュベーションする部分は改変した。キトサン（分子量は不均一）は５ｍＭＡＢＳ（ｐＨ４．５０）に溶解した。その溶液は最終濃度が０．０５％となるようにＡＢＳで定容した。１００μＬの金ナノ粒子溶液に１００μＬのキトサン溶液を加え、１時間保持した。キトサンの第１アミンを、ＳＡＭのカルボキシル末端へ固定化させるためである（ＳＡＭは、２ｍＭＥＤＣと５ｍＭＮＨＳｉｎ５０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．４０）で、共有結合を活性化しておく）。１塩基溶液は２００μｇ monobase／ｍＬを含むＴＢＳ溶液とした。１００μＬを１塩基溶液に１００μＬの金／キトサン溶液に加え、１時間放置した。１塩基はキトサンがコートされた金ナノ粒子に５′リン酸基を通じて付着した（固定されたキトサンのフリーのアミノ基とホスホルアミデート結合を形成することによって）。この金/キトサン/１塩基修飾ナノ粒子溶液をハイブリダイゼーションに用いた。 Preparation of 1-base modified gold nanoparticles Self-assembled monolayer (SAM) with 1 base on gold nanoparticles was prepared in the same manner as previously reported, and gold nanoparticles coated with MPA were incubated for 1 hour. The part was modified. Chitosan (molecular weight is heterogeneous) was dissolved in 5 mM ABS (pH 4.50). The solution was made up with ABS to a final concentration of 0.05%. 100 μL of the chitosan solution was added to 100 μL of the gold nanoparticle solution and held for 1 hour. This is because the primary amine of chitosan is immobilized on the carboxyl terminus of SAM (SAM is activated with 2 mM EDC and 5 mM NHS in 50 mM phosphate buffer (PBS, pH 7.40) to activate the covalent bond) . The 1 base solution was a TBS solution containing 200 μg monobase / mL. 100 μL was added to 100 μL of gold / chitosan solution in 1 base solution and left for 1 hour. One base was attached to the gold nanoparticles coated with chitosan through 5 'phosphate groups (by forming a phosphoramidate bond with the free amino group of immobilized chitosan). This gold / chitosan / 1 base modified nanoparticle solution was used for hybridization.

キトサン修飾金ナノ粒子における１塩基装着量の決定
手順は、Patolsky らが報告したものと同様に行った。一時的に、既知の濃度のキトサン修飾金ナノ粒子の吸収スペクトル(0.30 O.D. 520 nm) を１塩基の固定化の前に記録した。１塩基修飾金ナノ粒子の吸収スペクトルは裸の金ナノ粒子の５２０ｎｍでの同じＯ．Ｄ．値で標準化した。ＤＮＡは５２０ｎｍに吸収を持たないので、裸の金ナノ粒子のスペクトルから１塩基修飾金ナノ粒子のスペクトルの値を引くと、関係するＤＮＡの吸収が計算できる。２６０ｎｍにおける吸光度差はＤＮＡ量を表した。既知の金ナノ粒子濃度により、金ナノ粒子上の１塩基の被覆の程度が計算出来る。 The procedure for determining the amount of one base attached to chitosan-modified gold nanoparticles was the same as that reported by Patolsky et al. Temporarily, the absorption spectrum (0.30 OD 520 nm) of known concentrations of chitosan modified gold nanoparticles was recorded prior to 1 base immobilization. The absorption spectrum of the 1 base modified gold nanoparticles is the same O.D. D. Standardized by value. Since DNA has no absorption at 520 nm, subtracting the value of the spectrum of single base modified gold nanoparticles from the spectrum of bare gold nanoparticles can calculate the absorption of the relevant DNA. The difference in absorbance at 260 nm represented the amount of DNA. With a known gold nanoparticle concentration, the degree of coverage of one base on the gold nanoparticle can be calculated.

１塩基修飾金ナノ粒子のＡＦＭ画像
キトサンと負に荷電したマイカの表面との間の静電的結合を確認するために、無修飾のマイカ基質を用いた。金ナノ粒子溶液（０．３０Ｏ．Ｄ．）をマイカの上に滴下した。２分後、マイカ基板を１００μＬの超純水で２回洗浄し、窒素ガスで静かに乾燥した。全てのＡＦＭ操作はＤＦＭモード、室温、湿度３０〜４０％で行った。 AFM image of single base modified gold nanoparticles To confirm electrostatic binding between chitosan and negatively charged mica surface, an unmodified mica substrate was used. A gold nanoparticle solution (0.30 OD) was dropped onto the mica. After 2 minutes, the mica substrate was washed twice with 100 μL of ultrapure water and gently dried with nitrogen gas. All AFM operations were performed in DFM mode, room temperature, and 30-40% humidity.

変異サイトと１塩基修飾金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション
ハイブリッド化−固定化ＣＰＥを、希望する量の金ナノ粒子標識１塩基溶液２．０ｍＬに３７⁰Ｃで６０分間浸した。その溶液は６０ｍＭＫＣｌと１０ｍＭＭｇＣｌ₂含む２０ｍＭＴＢＳ（ｐＨ７．８溶液で、２０Ｕ／μＬＤＮＡポリメラーゼＩ(Klenow fragment) を含んでいる。金ナノ粒子への非特異的結合は、Leeらの報告にあるように０．３０ＭＮａＮＯ₃液で電極を洗浄することにより取り除いた。 Hybridization Hybridization of the mutation site and one base-modified gold nanoparticle - immobilized CPE, soaked 60 min at 37 ⁰ C in the gold nanoparticle labels 1 base solution 2.0mL desired amount of. The solution is 20 mM TBS (pH 7.8 solution containing 60 mM KCl and 10 mM MgCl ₂ ) and contains 20 U / μL DNA polymerase I (Klenow fragment). Nonspecific binding to gold nanoparticles is reported in Lee et al. The electrode was removed by washing with 0.30M NaNO ₃ solution as in some cases.

ＣＰＥ上でのハイブリッド化固定化ビーズの被覆率の計量
ハイブリッド化固定化ビーズの表面被覆率の計量は、Wangらの報告したＤＮＡ中のグアニンのボルタメトリーでの酸化シグナルを測定することで、次のように行った。２重鎖オリゴヌクレオチドの表面密度はグアニンの酸化シグナルを０．５０ＭＡＢＳ中で（〜１．０Ｖ）ビオチン修飾ＣＰＥを用いて、矩形波ボルタメトリー（パラメーター：amplitude of 25 mV and a step potential of 4 mV at 15 Hz）によって測定し計算した。 Measure the coverage of hybridized immobilized beads on CPE The surface coverage of hybridized immobilized beads can be measured by measuring the voltammetric oxidation signal of guanine in DNA as reported by Wang et al. Went like that. The surface density of the double-stranded oligonucleotide was determined by square wave voltammetry (parameter: amplitude of 25 mV and a step potential of 4) using biotin-modified CPE in guanine oxidation signal (˜1.0 V) in 0.50 M ABS. mV at 15 Hz).

ボルタメトリーの変換
金の酸化シグナルは、ＴＢＳをブランクとし、＋０．５０〜＋１．４０Ｖまでをスキャンし、上述のパラメーターで、矩形波ボルタメトリー（ＳＷＶ）を用いて測定した。生のボルタモグラムは電気化学測定ワークステーションのソフトウエアを用いて、スムージングとベースライン修正を行った。 Voltammetry Conversion Gold oxidation signals were measured using square wave voltammetry (SWV) with TBS as blank, scanning from +0.50 to +1.40 V, with the parameters described above. Raw voltammograms were smoothed and baseline corrected using the electrochemical measurement workstation software.

＜結果と考察＞
理想的なＳＮＰ分析では、８つの可能なＳＮＰをすべて識別し、コード化する必要がある。本実験結果より、１塩基修飾金ナノ粒子を用いてこのゴールに到達したものと考えられる（すなわち、金ナノ粒子はミスマッチ塩基とハイブリすることができ、どのＳＮＰがサンプルの中にあるか正確に明らかにすることができた）。 <Results and discussion>
In an ideal SNP analysis, all eight possible SNPs need to be identified and coded. From this experimental result, it is considered that this goal was reached using single base-modified gold nanoparticles (ie, gold nanoparticles can hybridize with mismatched bases and exactly which SNPs are in the sample) I was able to clarify).

本実験結果は、未知のＳＮＰｓが、１塩基修飾金ナノ粒子を用いることによって、電気化学的にコードできることを示している。最初のステップでは、ビオチン化したプローブがストレプトアビジンをコートした磁性ビーズに付着する。その後、そのビーズはターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液に移される。ハイブリダイゼーション後、磁場によって、そのビーズを混合物から分離する。ビーズを洗浄を繰り返した後、ビオチン修飾ＣＰＥを溶液に浸し、ビーズをＣＰＥ表面に固定化する。強いストレプトアビジン／ビオチン親和性を利用して溶液からビーズを集めることにより、電極表面での不要の非特異性結合をさらに抑制できる。その後、１つのバッチ実験では、４つのハイブリ化修飾ＣＰＥ（それらは同じ方法の中で準備されている）を、４つの異なる金ナノ粒子溶液中に浸す。そして、４つの１塩基のボルタモグラムをそれぞれ測定して、ミスマッチ塩基を検出した。 This experimental result shows that unknown SNPs can be electrochemically encoded by using single base modified gold nanoparticles. In the first step, biotinylated probes are attached to magnetic beads coated with streptavidin. Thereafter, the beads are transferred to a hybridization solution containing the target DNA. After hybridization, the beads are separated from the mixture by a magnetic field. After repeated washing of the beads, biotin-modified CPE is immersed in the solution, and the beads are immobilized on the CPE surface. By collecting beads from a solution using strong streptavidin / biotin affinity, unnecessary non-specific binding on the electrode surface can be further suppressed. Thereafter, in one batch experiment, four hybridized modified CPEs (which are prepared in the same method) are immersed in four different gold nanoparticle solutions. Then, four 1-base voltammograms were measured to detect mismatched bases.

キトサン及び１塩基層による金ナノ粒子の修飾は図２及び図３に示した。キトサンは、アルカンチオールＳＡＭの上に共有結合する。１塩基もまた、ホスホルアミデート結合によりキトサン表面へ付着する。金ナノ粒子のキトサン修飾に対する特性評価をAFMで行い、図４及び図５に示した。修飾無しの裸の金ナノ粒子の場合は、負に荷電したマイカ表面に結合することは出来ない。したがって、マイカ表面(図４)上で５±２nanoparticles/mm²程度観察出来たのみである。これに対し、正に荷電したキトサン修飾では、７３±３nanoparticles/mm²(図５)が静電気的に付着出来た。キトサン修飾により、金ナノ粒子のマイカへの付着は約１５倍に上昇した。裸の金ナノ粒子は、キトサン修飾により５ｎｍから８．４６±１．５３ｎｍまでその大きさを増加させた。この観察では、ナノ粒子の高さについても考慮した。 Modification of gold nanoparticles with chitosan and one base layer is shown in FIGS. Chitosan is covalently bonded onto the alkanethiol SAM. One base is also attached to the chitosan surface by a phosphoramidate bond. The characteristics of gold nanoparticles for chitosan modification were evaluated by AFM and are shown in FIGS. In the case of unmodified bare gold nanoparticles, they cannot bind to the negatively charged mica surface. Therefore, only about 5 ± ² nanoparticles / mm ^{2 was} observed on the mica surface (FIG. 4). In contrast, with positively charged chitosan modification, 73 ± 3 nanoparticles / mm ² (FIG. 5) could adhere electrostatically. Chitosan modification increased the adhesion of gold nanoparticles to mica by about 15 times. Bare gold nanoparticles were increased in size from 5 nm to 8.46 ± 1.53 nm by chitosan modification. In this observation, the height of the nanoparticles was also considered.

仮に、変異サイトが、導入された金ナノ粒子に対し相補的な塩基を持っている場合、これらの塩基はＤＮＡポリメラーゼＩの助けを得てハイブリダイゼーションし、電極表面に金ナノ粒子を蓄積させ、金の酸化シグナルを増強させた。金ナノ粒子の１塩基と非ハイブリ化塩基の結合定数は低くなくてはいけないが、１つの粒子が多くの変異サイトへ結合出来ると仮定される。それゆえ、相互依存的な結合が認められた。これらの１．２５Ｖ前後（Gonzales-Garcia らとOzsozらにより報告）での電気化学的シグナルの変化を計測することで、ミスマッチ塩基をコード化することが出来た。 If the mutation site has bases complementary to the introduced gold nanoparticles, these bases will hybridize with the help of DNA polymerase I and accumulate gold nanoparticles on the electrode surface, Increased gold oxidation signal. The binding constant between one base of gold nanoparticles and a non-hybridized base must be low, but it is assumed that one particle can bind to many mutation sites. Therefore, interdependent binding was observed. By measuring the change in electrochemical signal around 1.25V (reported by Gonzales-Garcia et al. And Ozsoz et al.), It was possible to encode mismatched bases.

図６にはＡ−Ｃミスマッチによる塩基対置換のハイブリッドから得られた電気化学シグナルを示した。Ａ−Ｃミスマッチを含んだハイブリッドは、１重鎖プローブとＣ−ミスマッチをもつターゲットＤＮＡから作られた。電極をＴを修飾した金ナノ粒子に浸すことにより高いシグナルを示した。なぜなら、ＴはミスマッチしたＡ塩基とハイブリすることが出来るからである。予想どおり、Ｇ修飾金ナノ粒子もミスマッチＣ塩基とのハイブリ後、高いシグナルを示す。これに対し、ＣとＡを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーションでは、いずれも低いシグナルを示した。これらの低いシグナルは金ナノ粒子との非特異的な結合の結果である。それは洗浄の過程で、完全に除去することはできない。４つの異なる１塩基修飾金ナノ粒子を用いてＡ−Ｃミスマッチがコードしたデータは図７に示した。それぞれのバーは平均と平均値と標準偏差（ｎ＝５）を示している。 FIG. 6 shows the electrochemical signal obtained from the hybrid of base pair substitution due to AC mismatch. Hybrids containing A-C mismatches were made from single-stranded probes and target DNA with C-mismatches. High signal was shown by immersing the electrode in gold nanoparticles modified with T. This is because T can hybridize with a mismatched A base. As expected, G-modified gold nanoparticles also show a high signal after hybridization with mismatched C bases. In contrast, hybridization with C and A-modified gold nanoparticles all showed low signals. These low signals are the result of non-specific binding with gold nanoparticles. It cannot be completely removed during the cleaning process. The data encoded by the AC mismatch using four different single base modified gold nanoparticles is shown in FIG. Each bar shows the average, average value, and standard deviation (n = 5).

他の塩基対置換ミスマッチであるＡ−Ｇ対の測定結果もまた、金ナノ粒子の電気化学的酸化シグナル変化として図８のように示された。高いシグナルはＴとＣを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション後に認められ、一方相補的ではないＡとＧを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション後には低いシグナルが得られた。 The measurement result of the AG pair, which is another base pair substitution mismatch, was also shown in FIG. 8 as the electrochemical oxidation signal change of the gold nanoparticles. A high signal was observed after hybridization with gold nanoparticles modified with T and C, while a low signal was obtained after hybridization with non-complementary A and G modified gold nanoparticles.

塩基対置換ミスマッチの検出はこのプロトコールを用いれば非常に簡単である。いくつかの塩基により構成されるミスマッチ対は、それと相補的な塩基を修飾した金ナノ粒子が付着することで、そのシグナルを増強させる。例えば、Ａ−Ａ対では、図９に示したように電極をＴ修飾金ナノ粒子に浸した場合に有意にシグナルは増強し、他では低い。これらシグナル間での大きな違いが、塩基対置換のミスマッチの検出を非常に簡単、迅速なものにしている。 Detection of base pair substitution mismatches is very simple using this protocol. A mismatch pair composed of several bases enhances the signal by attaching gold nanoparticles modified with a complementary base thereto. For example, in the AA pair, the signal is significantly enhanced when the electrode is immersed in T-modified gold nanoparticles as shown in FIG. The large difference between these signals makes the detection of base pair substitution mismatches very easy and fast.

対照実験はプローブ修飾ビーズを１５μｇ／ｍＬの非相補的ターゲットＤＮＡ、１０ μｇ／ｍＬの２重鎖ＤＮＡおよび１重鎖ＤＮＡに浸して行った。いずれの場合も、これらのＤＮＡのプローブへの非特異的結合は、実験の項で述べたような磁石による分離で抑制された。磁気分離後、非特異的結合をしたＤＮＡはプローブから離れ、ビーズは溶液から集められた。この結果は、非特異的結合の影響を非常に抑制することが出来ることを示しており、それは未知のＳＮＰの検出には非常に重要なことである。 Control experiments were performed by immersing the probe-modified beads in 15 μg / mL non-complementary target DNA, 10 μg / mL double-stranded DNA and single-stranded DNA. In all cases, nonspecific binding of these DNAs to the probe was suppressed by separation with a magnet as described in the experimental section. After magnetic separation, non-specifically bound DNA left the probe and the beads were collected from the solution. This result shows that the influence of non-specific binding can be greatly suppressed, which is very important for the detection of unknown SNPs.

完全に相補的なハイブリッドについても、同様に４つの１塩基修飾金ナノ粒子溶液を用いて検討した（データは示していない）。完全に相補的にハイブリする１塩基修飾金ナノ粒子溶液に浸した場合に低いシグナルが得られた。これらの所見は、金ナノ粒子が２重らせんの中にそれ自身が非特異的に補足されることを示したが、ＳＮＰのコード化には影響を及ぼさなかった。 A fully complementary hybrid was similarly examined using four 1-base modified gold nanoparticle solutions (data not shown). A low signal was obtained when immersed in a solution of a single base modified gold nanoparticle that hybridizes completely and complementarily. These findings indicated that the gold nanoparticles were themselves nonspecifically trapped in the double helix, but did not affect the SNP encoding.

キトサン修飾金ナノ粒子の1塩基の表面被覆量は次のような分光光度法により決定した。金ナノ粒子上の1塩基の表面被覆量は、5回の計測の結果、平均33(1.42 pmol/cm²であった。サンプル中のナノ粒子の直径のばらつきは少ないにもかかわらず、表面被覆量は、金ナノ粒子上の４つの１塩基において類似していた。 The surface coverage of one base of chitosan modified gold nanoparticles was determined by spectrophotometry as follows. The surface coverage of one base on the gold nanoparticles was an average of 33 (1.42 pmol / cm ^{2) as} a result of five measurements. Despite the small variation in the diameter of the nanoparticles in the sample, the surface coverage The amount was similar in the four 1 bases on the gold nanoparticles.

ハイブリッドＤＮＡ固定化ビーズが、ビオチン修飾ＣＰＥ上へ強く吸着され、蓄積されることは、さらに有用であった。ＣＰＥ上への固定化過程は、ＤＮＡのグアニンの酸化によるマイナスシグナルを用いて調べた。全表面に付着する条件（ＤＮＡ溶液の濃度、吸着時間）はグアニンの電流値を測定することで調べた。ＡＢＳ中で、ビーズ濃度９０μｇ／ｍＬ、プローブ６μｇ／ｍＬとターゲット１５μｇ／ｍＬの条件下で、吸着時間６分以上において表面が飽和した。固定化ＤＮＡ層の安定性は、撹拌中のＡＢＳ溶液に浸し、そのシグナルをモニタリングすることで確認した。グアニンの応答は３０分以上たっても減少せず、ＤＮＡ層は安定であることが示された。いろいろな濃度でのＡ−ＣＳＮＰの場合の電流値の高さをまとめた結果、全表面を被覆した時の値は２９．７５(２．３４ｐｍｏｌ／ｃｍ²であった。ハイブリッド分子のこのような高い密度は金ナノ粒子により多くの結合部位があることを示しており、その結果、この相互依存的な結合が電気化学応答を強めていた。 It was further useful that the hybrid DNA immobilized beads were strongly adsorbed and accumulated on biotin modified CPE. The immobilization process on CPE was examined using a minus signal due to oxidation of guanine of DNA. Conditions (DNA solution concentration, adsorption time) adhering to the entire surface were examined by measuring the current value of guanine. In ABS, the surface was saturated at an adsorption time of 6 minutes or more under the conditions of a bead concentration of 90 μg / mL, a probe of 6 μg / mL and a target of 15 μg / mL. The stability of the immobilized DNA layer was confirmed by immersing it in the stirring ABS solution and monitoring the signal. The guanine response did not decrease over 30 minutes, indicating that the DNA layer was stable. As a result of summarizing the height of the current value in the case of the AC SNP at various concentrations, the value when the entire surface was coated was 29.75 (2.34 pmol / cm ² ). The high density indicated that there were more binding sites in the gold nanoparticles, and as a result, this interdependent bond enhanced the electrochemical response.

金ナノ粒子濃度に関連するシグナル増幅について、図１０に示した。金ナノ粒子濃度はハイブリダイゼーション前後（１塩基修飾ナノ粒子と電極表面の高密度の変異部位との）の５２０ｎｍにおける吸光度変化で測定した。このような効果的なハイブリダイゼーション過程は、微量の金の測定に便利であった。Ｓ／Ｎ＝３の場合、これらの検出限界は０．０２Ｏ．Ｄ．であった。析出時間を長くすることで、さらにシグナルを増加させ、検出限界を下げることが期待できる。金濃度が０．０５Ｏ．Ｄ．から０．３０Ｏ．Ｄ．へ増加した場合、金シグナルは直線的に上昇し、０．３０Ｏ．Ｄ．以上では飽和に達した。それゆえ、０．３０Ｏ．Ｄ．のキトサン修飾金ナノ粒子溶液は、表面は飽和状態であると結論づけられた。 The signal amplification related to gold nanoparticle concentration is shown in FIG. The gold nanoparticle concentration was measured by a change in absorbance at 520 nm before and after hybridization (one base-modified nanoparticle and a high-density mutation site on the electrode surface). Such an effective hybridization process was convenient for the measurement of trace amounts of gold. For S / N = 3, these detection limits are 0.02 O.D. D. Met. Increasing the precipitation time can be expected to further increase the signal and lower the detection limit. Gold concentration is 0.05 O.D. D. To 0.30 O.D. D. The gold signal rises linearly and increases to 0.30 O.D. D. This reached saturation. Therefore, 0.30 O.D. D. It was concluded that the chitosan modified gold nanoparticle solution of the surface is saturated.

Millan と Mikkelsenの報告によると、ハイブリッド固定化および裸のＣＰＥから得られたキャリブレーションデータ（データは提示していない）は、１塩基修飾金ナノ粒子の（電極表面の微小環境での）分配係数を推定するのに用いられ、次のような等式で示される。 According to Millan and Mikkelsen, the calibration data obtained from hybrid immobilization and bare CPE (data not shown) shows the partition coefficient (in the microenvironment of the electrode surface) of single base modified gold nanoparticles. Is given by the following equation:

Au_boundとAu_freeは遊離および結合した金ナノ粒子複合体の濃度
i_bound はハイブリッド修飾のピーク電流値、i_free は裸のＣＰＥのピーク電流値

Au _bound and Au _free are free and bound gold nanoparticle complex concentrations
i _bound is the peak current value of hybrid modification, i _free is the peak current value of bare CPE

この等式の正当性は、Millan と Mikkelsenによれば、次のような仮説に基づいている。（ａ）遊離および結合型の金ナノ粒子の平衡は、ボルタメトリックな時間のスケールでは瞬時に起こる、（ｂ）金ナノ粒子の拡散係数は、ハイブリッドＤＮＡ中とバルク溶液中で同じである、（ｃ）ハイブリッドＤＮＡ中での電極表面の金ナノ粒子の前濃度は、至適金ナノ粒子複合体濃度と有意差は無い。金ナノ粒子の分配係数は、いろいろな金ナノ粒子濃度での、両電極の電流値を用いて、０．９４と推定された。このように高い分配係数は、１塩基修飾金ナノ粒子が（ＤＮＡポリメラーゼの助けを借りて）効果的に固定化変異部位に結合できることを示している。 The validity of this equation is based on the following hypothesis, according to Millan and Mikkelsen: (A) The equilibrium of free and bound gold nanoparticles occurs instantaneously on a voltammetric time scale, (b) the diffusion coefficient of gold nanoparticles is the same in hybrid DNA and bulk solution, ( c) The pre-concentration of gold nanoparticles on the electrode surface in the hybrid DNA is not significantly different from the optimal gold nanoparticle complex concentration. The distribution coefficient of gold nanoparticles was estimated to be 0.94 using the current values of both electrodes at various gold nanoparticle concentrations. This high partition coefficient indicates that single base modified gold nanoparticles can effectively bind to the immobilized mutation site (with the aid of DNA polymerase).

以上のように、本発明の電気化学的なＳＮＰｓの検出は、マイクロアレイにも適用できる応用範囲の広い方法である。ここでは、塩基対置換とＳＮＰｓが２１塩基のプローブで簡単に識別できることについて述べたが、さらに、この方法をマイクロアレイに適用することにより、いくつものＰＣＲサンプルのミスマッチ塩基を同時に検出することが可能である。 As described above, the detection of electrochemical SNPs of the present invention is a method with a wide range of applications that can be applied to microarrays. Here, we have described that base pair substitution and SNPs can be easily identified with a 21-base probe. Furthermore, by applying this method to a microarray, it is possible to simultaneously detect mismatched bases in a number of PCR samples. is there.

本発明の基本原理を説明する模式図である。It is a schematic diagram explaining the basic principle of this invention. １塩基修飾金ナノ粒子を模式的に示す図である。It is a figure which shows 1 base modification gold | metal | money nanoparticle typically. キトサンを介して塩基が金ナノ粒子に結合する様子を示す図である。It is a figure which shows a mode that a base couple | bonds with a gold nanoparticle via chitosan. 裸の金ナノ粒子を示すものであり、（ａ）は平面像、（ｂ）はＡＦＭによる高さの測定結果である。The figure shows naked gold nanoparticles, (a) is a planar image, and (b) is a height measurement result by AFM. １塩基修飾金ナノ粒子を示すものであり、（ａ）は平面像、（ｂ）はＡＦＭによる高さの測定結果である。1 shows a single base-modified gold nanoparticle, (a) is a planar image, and (b) is a height measurement result by AFM. Ａ−Ｃミスマッチによる塩基対置換のハイブリッドから得られた電気化学シグナルを示す特性図である。It is a characteristic view which shows the electrochemical signal obtained from the hybrid of the base pair substitution by A-C mismatch. Ａ−Ｃミスマッチにおける測定データである。It is the measurement data in AC mismatch. Ａ−Ｇミスマッチにおける測定データである。It is the measurement data in an A-G mismatch. Ａ−Ａミスマッチにおける測定データである。It is the measurement data in AA mismatch. 金ナノ粒子濃度によるシグナル増幅を示す特性図である。It is a characteristic view which shows signal amplification by gold nanoparticle density | concentration.

Claims

塩基が結合し電気化学活性を有するナノ粒子と電極とを用いて特定遺伝子を検出することを特徴とする特定遺伝子検出方法。 A method for detecting a specific gene, comprising detecting a specific gene using a nanoparticle having a base and electrochemical activity and an electrode.

検出対象となる遺伝子が固定された電極に対して前記ナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出することを特徴とする請求項１記載の特定遺伝子検出方法。 The identification according to claim 1, wherein the nanoparticle is allowed to act on an electrode to which a gene to be detected is fixed, and the presence or absence of binding of the nanoparticle to the electrode is detected as an electrochemical signal. Gene detection method.

前記特定遺伝子が１塩基変異型遺伝子であり、遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする請求項１又は２記載の特定遺伝子検出方法。 The method for detecting a specific gene according to claim 1 or 2, wherein the specific gene is a single nucleotide mutated gene, and the presence or absence of a mutation in the gene is detected.

前記塩基が結合したナノ粒子として、シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾されたナノ粒子を用い、これらを順次作用させて前記電気化学的信号を検出し、前記遺伝子における変異の種類を判別することを特徴とする請求項３記載の特定遺伝子検出方法。 As the nanoparticles to which the base is bonded, four types of single-base-modified nanoparticles of cytosine-modified nanoparticles, thymine-modified nanoparticles, guanine-modified nanoparticles, and adenine-modified nanoparticles are used. The method for detecting a specific gene according to claim 3, wherein an electrochemical signal is detected to determine the type of mutation in the gene.

前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子またはポリマー粒子であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の特定遺伝子検出方法。 The specific gene detection method according to any one of claims 1 to 4, wherein the nanoparticles having electrochemical activity are metal nanoparticles, semiconductor nanoparticles, or polymer particles.

前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金ナノ粒子であることを特徴とする請求項５記載の特定遺伝子検出方法。 The specific gene detection method according to claim 5, wherein the nanoparticle having electrochemical activity is a gold nanoparticle.

前記電気化学的信号は、ボルタメトリーにより測定することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の特定遺伝子検出方法。 The specific gene detection method according to claim 1, wherein the electrochemical signal is measured by voltammetry.

特定遺伝子を検出するための塩基修飾ナノ粒子であって、電気化学的活性を有するナノ粒子表面がシトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる少なくとも１種により修飾されていることを特徴とする塩基修飾ナノ粒子。 A base-modified nanoparticle for detecting a specific gene, wherein the surface of the nanoparticle having electrochemical activity is modified with at least one selected from cytosine, thymine, guanine, and adenine Nanoparticles.

前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子またはポリマー粒子であることを特徴とする請求項８記載の塩基修飾ナノ粒子。 9. The base-modified nanoparticles according to claim 8, wherein the nanoparticles having electrochemical activity are metal nanoparticles, semiconductor nanoparticles, or polymer particles.

前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金ナノ粒子であることを特徴とする請求項９記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 9, wherein the nanoparticles having electrochemical activity are gold nanoparticles.

塩基は、キトサンを介してナノ粒子表面に結合していることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticle according to any one of claims 8 to 10, wherein the base is bonded to the surface of the nanoparticle via chitosan.

塩基は、ホスホルアミデート結合により前記キトサンと結合していることを特徴とする請求項１１記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 11, wherein the base is bound to the chitosan through a phosphoramidate bond.

前記キトサンは、アルカンチオールを介してナノ粒子表面に結合していることを特徴とする請求項１１又は１２記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 11 or 12, wherein the chitosan is bonded to the surface of the nanoparticles through alkanethiol.

前記アルカンチオールは、ナノ粒子の表面に自己組織化単分子膜として形成されていることを特徴とする請求項１３記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 13, wherein the alkanethiol is formed as a self-assembled monolayer on the surface of the nanoparticles.

前記アルカンチオールは、前記キトサンと結合するカルボキシル基を有することを特徴とする請求項１３記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 13, wherein the alkanethiol has a carboxyl group that binds to the chitosan.

前記アルカンチオールとして、メルカプトプロピオン酸及びメルカプトプロパノールを用いたことを特徴とする請求項１４記載の塩基修飾ナノ粒子。 The base-modified nanoparticles according to claim 14, wherein mercaptopropionic acid and mercaptopropanol are used as the alkanethiol.

対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬であって、
シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えることを特徴とする１塩基変異型遺伝子識別用試薬。 A single-base mutation type gene identification reagent for identifying the type of mutation in a target gene,
A reagent for identifying a single-base mutation gene comprising four types of single-base modified nanoparticles, cytosine-modified nanoparticles, thymine-modified nanoparticles, guanine-modified nanoparticles, and adenine-modified nanoparticles.