JP2005221323A

JP2005221323A - Method for detecting osteomyelodysplasia syndrome

Info

Publication number: JP2005221323A
Application number: JP2004028266A
Authority: JP
Inventors: Kiyoyuki Ogata; 清行緒方
Original assignee: Nippon Medical School Foundation
Current assignee: Nippon Medical School Foundation
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2004-02-04
Publication date: 2005-08-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for differentiating acute myeloid leukemia (de novo AML) from a leukemic myelodysplastic syndrome (MDS) by certainly detecting the MDS or the leukemic MDS difficult to be certainly detected by various conventional inspection means. <P>SOLUTION: MDS or leucomic MDS a diagnosed by detecting the presence of CD45 negative blast cells being a cell group specific to MDS to be identified as de novo AML. The cell group specific to MDS is the CD45 negative blast cells negative in CD45 and characterized in that the positive ratio of CD13 and CD33 is clearly lowered as compared with the CD45 positive mycloblast group in the same specimen. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、骨髄異形成症候群（Myelodysplastic syndromes:ＭＤＳ）の診断方法に関し、詳しくはＭＤＳに特異的な細胞集団の検出方法、これらの細胞集団を検出することを特徴とするＭＤＳの検出方法、真正（de novo）の急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia；ＡＭＬ）と白血病化したＭＤＳとの鑑別法、及び前記方法に用いる鑑別用キットに関する。 The present invention relates to a method for diagnosing myelodysplastic syndromes (MDS), and more specifically, a method for detecting cell populations specific to MDS, a method for detecting MDS characterized by detecting these cell populations, authenticity The present invention relates to a method for differentiating (de novo) acute myeloid leukemia (AML) from leukemic MDS, and a differentiation kit used in the method.

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。 Myelodysplastic syndrome (MDS) is a syndrome characterized by myelodysplasia and cytopenias accompanied by bone marrow dysfunction due to clonal abnormalities of hematopoietic stem cells. If there is a case showing cytopenia (anemia, leukopenia, thrombocytopenia, etc.), morphological abnormalities (dysplasia) of each blood cell system can be confirmed and judged by the blast ratio in bone marrow or peripheral blood. However, often the blast ratio increases and a clinical test moves to leukemic MDS, which is indistinguishable from genuine acute myeloid leukemia (de novo AML).

de novo ＡＭＬ及び白血病化ＭＤＳは、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo ＡＭＬは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。 de novo AML and leukemic MDS are leukemias in which proliferation of undifferentiated clonal tumor cells from hematopoietic stem cells to progenitor cells of the bone marrow occurs. Leukemia cells may cease to differentiate as normal progenitor cells or exhibit abnormal differentiation. These have a high tumor growth rate, and clinical symptoms, test results, and the like change weekly. For this reason, it is not possible to distinguish between leukemic MDS and de novo AML from clinical findings, but unlike leukemia MDS, de novo AML is highly sensitive to drugs and prompt treatment is desired.

ＭＤＳは貧血等の症状をきっかけに発見（診断）される場合もあるが、症状に乏しい場合も多く、白血病化の後に初めて発見されることも多い。白血病化の後に初めて発見された場合、それがＭＤＳより移行した白血病化ＭＤＳなのか、そうでないde novo AMLなのかを鑑別することは困難であり、現状では患者の過去の医療記録等で原因不明の血球減少等があれば白血病化ＭＤＳであろうと推測しているに過ぎない（非特許文献１参照）。 MDS may be discovered (diagnosed) in the wake of symptoms such as anemia, but in many cases the symptoms are poor and often discovered only after leukaemia. When it is first discovered after leukemia, it is difficult to distinguish whether it is leukemic MDS transferred from MDS or de novo AML, and currently the cause is unknown in the patient's past medical records It is only speculated that leukemia MDS is present if there is a decrease in blood cell count (see Non-Patent Document 1).

最近の疫学調査の結果によれば、ＭＤＳの発症頻度は骨髄系腫瘍の中で最多である（非特許文献２参照）。しかしながら、多くの研究にもかかわらず、未だ有用な治療法は確立されておらず、白血病化ＭＤＳは治療に不応性のことが多い。一方de novo AMLでは治療に良く反応することが多い。したがって、白血病化ＭＤＳであるか、de novo AMLであるかを早期に鑑別することは、その患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。 According to the results of recent epidemiological studies, the incidence of MDS is the highest among myeloid tumors (see Non-Patent Document 2). However, despite many studies, no useful treatment has yet been established and leukemic MDS is often refractory to treatment. On the other hand, de novo AML often responds well to treatment. Therefore, early differentiation between leukemic MDS and de novo AML is important for estimating the prognosis of the patient, determining the treatment policy, and the like.

de novo AMLとＭＤＳの鑑別を行う方法として、ＭＤＳに特異的な遺伝子D1kの発現を検出することによる分子診断法（特許文献１参照）が開示されている。しかし、この方法は、遺伝子発現又は発現産物のレベルを指標とし、DNAマイクロアレイや二次元電気泳動を使用する複雑な方法であり、感度も低い。 As a method for distinguishing between de novo AML and MDS, a molecular diagnostic method (see Patent Document 1) by detecting expression of gene D1k specific to MDS is disclosed. However, this method is a complicated method that uses the level of gene expression or expression product as an index, uses DNA microarray or two-dimensional electrophoresis, and has low sensitivity.

近年、ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノクローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメトリー（flow cytometry: FCM）により、造血器腫瘍細胞の検出、特に白血病の診断が可能となった。 In recent years, it has become possible to detect hematopoietic tumor cells, particularly leukemia, by developing a large number of monoclonal antibodies against human cell surface antigens and using them for flow cytometry (FCM).

ＦＣＭとは、個々に遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管を通過させる際、レーザー光線を当ててその細胞から発生する蛍光の強弱及び散乱光等の情報により、細胞の大きさ、相対的なタンパク量、抗原量、ＤＮＡ量等を測定する方法である。コンピュータを組合わせることにより、細胞の数と蛍光の強弱等の２つのパラメータによるヒストグラム、スキャッターグラム、３つのパラメータによる三次元表示等も行われる。浮遊細胞を測定するため、一度に多数の細胞の解析が可能である。 FCM refers to the size of cells, relative to the intensity of the fluorescence generated from the cells when they are passed through a thin tube after being stained with a fluorescent dye and then scattered light. It is a method for measuring the amount of protein, antigen, DNA, etc. By combining computers, histograms based on two parameters such as the number of cells and the intensity of fluorescence, a scattergram, and three-dimensional display using three parameters are also performed. In order to measure floating cells, it is possible to analyze many cells at once.

ＦＣＭで白血病細胞を分析する場合、白血病細胞が他の細胞とはっきり区別が出来る場合は問題が無いが、他の細胞のサイトグラムとオーバーラップして何処をゲーティングしてよいかわからない場合や、白血病細胞の数が減少している場合等は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣパラメーターdot-plotを用いたゲート設定法（ＣＤ４５blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる（非特許文献３参照）が、このときCD４５抗原に注目したのは、あくまでも白血病細胞を特定するために過ぎなかった。 When analyzing leukemia cells with FCM, there is no problem if leukemia cells can be clearly distinguished from other cells, but if you do not know where to gate by overlapping with the cytogram of other cells, When the number of leukemia cells has decreased, the gate setting method (CD45 blast gating method) using the CD45-SSC parameter dot-plot, which makes use of the characteristic that the expression of CD45 antigen, which is a leukocyte common antigen, is weak is popular. Have been doing. Since the CD45 blast gating method can clearly separate an immature acute leukemia cell of a differentiation level in which the CD45 antigen is weakly expressed from a normal mature cell in which the CD45 antigen is strongly expressed, a highly accurate leukemia cell surface antigen Although analysis can be performed (see Non-Patent Document 3), the focus on the CD45 antigen at this time was only to identify leukemia cells.

さらに、ＣＤ４５以外の細胞表面抗原の発現パターンによって白血病細胞を検出する方法（特許文献２参照）も報告されている。
特開２００１−２６９１７４号公報特開２０００−２４１４２７号 Smith MT, Linet MS, Morgan GJ. Causative agents in the etiology of myelodysplastic syndromes and the acute myeloid leukemias. In "The Myelodysplastic Syndromes: Pathobiology and Clinical Management" edited by Bennett JM. Publisher: Marcel Dekker, Inc., 2002 pp29-63 Aul C, Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics. Int J Hematol. 2001; 73(4): 405-10 Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993 Furthermore, a method for detecting leukemia cells based on the expression pattern of cell surface antigens other than CD45 (see Patent Document 2) has also been reported.
JP 2001-269174 A JP 2000-241427 A Smith MT, Linet MS, Morgan GJ. Causative agents in the etiology of myelodysplastic syndromes and the acute myeloid leukemias.In "The Myelodysplastic Syndromes: Pathobiology and Clinical Management" edited by Bennett JM. Publisher: Marcel Dekker, Inc., 2002 pp29- 63 Aul C, Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics.Int J Hematol. 2001; 73 (4): 405-10 Borowitz et al., Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993

本発明の課題は、これまでの種々の検査手段では検出することができなかったか、確実な検出が困難であったＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳを確実に検出し、de novo AMLと白血病化ＭＤＳとの鑑別法を提供することである。更に、前記鑑別方法に使用するキットを提供することにある。 An object of the present invention is to reliably detect MDS or leukemic MDS, which could not be detected by various conventional examination means, or which was difficult to reliably detect, so that de novo AML and leukemic MDS It is to provide a discrimination method. Furthermore, it is providing the kit used for the said discrimination method.

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の存在を見出し、この細胞集団を検出することで、de novo AMLと白血病化ＭＤＳを鑑別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors found the presence of a CD45-negative blast, which is a cell population specific to MDS, and detected this cell population, whereby de novo AML and leukemia were detected. The present inventors have found that a modified MDS can be identified, and have completed the present invention.

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）検体中のＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳの検出方法。
（２）検体が、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄細胞である、（１）に記載の方法。
（３）免疫学的方法を用いて、ＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、（１）乃至（２）のいずれかに記載の方法。
（４）ＣＤ４５陰性芽球が以下のものである、（３）に記載の方法：
ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更に
ＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下しているＣＤ４５陰性芽球。
（５）ＣＤ４５陰性芽球が、さらにＧＰＡ陰性かつＣＤ３８陰性であるＣＤ４５陰性芽球である、（４）に記載の方法。
（６）フローサイトメトリーを用いることを特徴とする、（３）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）以下の（ア）から（エ）の工程を含む、急性骨髄性白血病（de novo AML）と白血病化ＭＤＳとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５陰性を検出する工程
（イ）赤芽球、血小板、形質細胞の混入を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較したＣＤ１３陽性率の低下を検出する工程
（エ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較したＣＤ３３陽性率の低下を検出する工程。
（８）ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。 That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A method for detecting myelodysplastic syndrome (MDS) or leukemic MDS, comprising detecting the presence of CD45 negative blasts in a specimen.
(2) The method according to (1), wherein the specimen is peripheral blood or bone marrow cells of a patient suspected of having MDS.
(3) The method according to any one of (1) to (2), wherein the presence of CD45 negative blasts is detected using an immunological method.
(4) The method according to (3), wherein the CD45 negative blast is as follows:
The CD13 positive rate is lower than the CD13 positive rate in the CD45 positive myeloblast population found in the same sample, and the CD33 positive rate is further reduced in the CD45 positive myeloblast population found in the same sample. CD45 negative blasts that are reduced compared to the CD33 positive rate.
(5) The method according to (4), wherein the CD45 negative blast is a CD45 negative blast that is further GPA negative and CD38 negative.
(6) The method according to any one of (3) to (5), wherein flow cytometry is used.
(7) A method for differentiating acute myeloid leukemia (de novo AML) from leukemic MDS, including the following steps (a) to (d):
(A) a step of detecting CD45 negative (a) a step of determining contamination of erythroblasts, platelets and plasma cells (c) a decrease in the CD13 positive rate compared to the CD13 positive rate in the CD45 positive myeloblast population Detecting step (d) detecting a decrease in the CD33 positive rate compared to the CD33 positive rate in the CD45 positive myeloblast population.
(8) A kit for differentiating MDS or leukemic MDS and de novo AML containing an antibody specific for CD45 negative blasts.

本発明を用いれば、白血病化MDSとde novo AMLの鑑別を速やかに行うことができる。白血病化MDSとde novo AMLとでは治療方針が異なるため、両者の鑑別が速やかに行えれば、患者の予後推定、治療方針の決定等に非常に重要である。 By using the present invention, it is possible to quickly differentiate between leukemic MDS and de novo AML. Since the treatment policy differs between leukemic MDS and de novo AML, if they can be differentiated promptly, it is very important for estimating the prognosis of the patient and determining the treatment policy.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

発明の実施の形態BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

本発明においてＭＤＳとは、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。 In the present invention, MDS is a syndrome characterized by bone marrow dysplasia and cytopenias accompanied by bone marrow dysfunction due to clonal abnormality of hematopoietic stem cells. If there is a case showing cytopenia (anemia, leukopenia, thrombocytopenia, etc.), morphological abnormalities (dysplasia) of each blood cell system can be confirmed and judged by the blast ratio in bone marrow or peripheral blood. However, often the blast ratio increases and a clinical test moves to leukemic MDS, which is indistinguishable from genuine acute myeloid leukemia (de novo AML).

一方、de novo ＡＭＬ及び白血病化ＭＤＳは、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo ＡＭＬは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。 On the other hand, de novo AML and leukemic MDS are leukemias in which proliferation of undifferentiated clonal tumor cells from hematopoietic stem cells of bone marrow to progenitor cells occurs. Leukemia cells may cease to differentiate as normal progenitor cells or exhibit abnormal differentiation. These have a high tumor growth rate, and clinical symptoms, test results, and the like change weekly. For this reason, it is not possible to distinguish between leukemic MDS and de novo AML from clinical findings, but unlike leukemia MDS, de novo AML is highly sensitive to drugs and prompt treatment is desired.

本発明において、ＭＤＳに罹患していることが疑われるとは、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかに罹患しているが、そのいずれに罹患しているのかは不明の状態であることをいう。 In the present invention, suspected of being affected by MDS is affected by either MDS (including leukemic MDS) or de novo AML, but it is unclear whether it is affected. It means being in a state.

ＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なものは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体であって芽球に富むものであり、例えば、末梢血もしくは骨髄細胞等が挙げられる。 A suitable sample used for detecting MDS is a sample collected from a patient suspected of suffering from MDS and rich in blasts, for example, peripheral blood or bone marrow cells. Can be mentioned.

骨髄細胞、または末梢血の採取方法としては、患者への侵襲度の低い方法であればいかなる方法でも良い。例えば骨髄細胞の場合、局所麻酔の後、背中側の腸骨（骨盤骨）から骨盤穿刺針を用いて注射器で吸引する等、一般的な方法が用いられる。 As a method for collecting bone marrow cells or peripheral blood, any method may be used as long as the method is less invasive to the patient. For example, in the case of bone marrow cells, after local anesthesia, a general method is used such as suctioning with a syringe from the iliac bone (pelvic bone) on the back side using a pelvic puncture needle.

検体採取時にはヘパリン等の抗凝固剤を加え、採取後速やかに用いることが好ましい。しかし、末梢血はそのまま、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ、４℃以下にて２４時間まで保存しておくことができる。また、４〜−８０℃、好ましくは−２０℃から−７０℃の低温条件下で２４時間以上保存しておくこともできる。保存に際しては、変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を必要に応じて添加しても良い。 It is preferable to add an anticoagulant such as heparin at the time of sample collection and use it immediately after collection. However, the peripheral blood remains as it is, and the bone marrow puncture solution can be suspended in 10% FCS-added RPMI-1640 and stored at 4 ° C. or lower for up to 24 hours. Further, it can be stored for 24 hours or more under a low temperature condition of 4 to -80 ° C, preferably -20 ° C to -70 ° C. In storage, a preservative that suppresses denaturation or the like, a preservative for preventing spoilage, or the like may be added as necessary.

採取した検体はそのまま用いることもできるが、検体中の芽球比率が低い場合には、適切な試薬を用いて芽球比率を高めてから、解析に用いることができる。芽球比率を高めるための適当な試薬としては、例えば、本願発明者らが開発した芽球精製法に基づき商品化されたBlastretriever（登録商標）試薬（日本抗体研究所、高崎）等が挙げられる。検体中の芽球比率はサイトスピン標本を顕微鏡下に観察する等の方法によって測定することができる。芽球比率が低いとは、検体中の芽球の比率が一定以下、例えば全血球に対して芽球が３０％以下であることをいう。芽球比率が一定以上ある検体について、定法により、混入赤血球の溶血作業をおこなう。 The collected specimen can be used as it is, but when the blast ratio in the specimen is low, it can be used for analysis after increasing the blast ratio using an appropriate reagent. Suitable reagents for increasing the blast ratio include, for example, the Blastretriever (registered trademark) reagent (Nippon Antibody Laboratories, Takasaki) commercialized based on the blast purification method developed by the present inventors. . The blast ratio in the specimen can be measured by a method such as observing a cytospin specimen under a microscope. A low blast ratio means that the ratio of blasts in a specimen is below a certain value, for example, 30% or less of blasts relative to whole blood cells. For specimens with a certain ratio of blasts or more, hemolysis of mixed red blood cells is performed by a conventional method.

上記検体を用いてＭＤＳに特異的な細胞集団を検出する。ＭＤＳに特異的な細胞集団は、検体に含まれる特定の芽球の集団であり、ＭＤＳとしての特異性はその芽球集団の抗原発現により特徴付けられる。具体的には、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ４５陰性の芽球（本明細書中でＣＤ４５陰性芽球と称する）である。 A cell population specific for MDS is detected using the specimen. A cell population specific to MDS is a specific blast population contained in a specimen, and the specificity as MDS is characterized by antigen expression of the blast population. Specifically, the cell population specific for MDS is CD45 negative blasts (referred to herein as CD45 negative blasts).

さらに、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更にＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下している。本発明において、ＣＤ１３陽性率とは、解析対象の芽球集団中でＣＤ１３陽性芽球の占める比率をいう。ＣＤ３３陽性率についても同様である。すなわち、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の集団では、同一検体中のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して、ＣＤ１３陽性芽球及びＣＤ４５陽性芽球の占める比率がそれぞれ低下している。この比率がＣＤ４５陰性芽球の集団においてＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団よりも低い数値となっていれば低下していると判断されるが、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上低下していればより確実である。 Furthermore, the cell population specific for MDS has a reduced CD13 positive rate compared to the CD13 positive rate in the CD45 positive myeloblast population found in the same sample, and further the CD33 positive rate in the same sample. Compared to the CD33 positive rate in the CD45 positive myeloblast population seen in In the present invention, the CD13 positive rate refers to the ratio of CD13 positive blasts in the blast population to be analyzed. The same applies to the CD33 positive rate. That is, in the population of CD45-negative blasts, which is a cell population specific to MDS, the proportion of CD13-positive blasts and CD45-positive blasts decreases compared to the CD45-positive myeloblast population in the same specimen, respectively. doing. If this ratio is lower in the CD45 negative blast population than in the CD45 positive myeloblast population, it is judged that the ratio is decreased, but preferably 30% or more, more preferably 50% or more, Preferably, it is more reliable if it is reduced by 70% or more.

赤芽球、血小板、形質細胞等の混入がない検体の場合においては、このようにＣＤ４５が陰性であり、さらにＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団におけるものと比較して低下しているということが、ＭＤＳに特異的な細胞集団として必要にして十分な特徴である。 In the case of specimens free from contamination with erythroblasts, platelets, plasma cells, etc., CD45 is negative in this way, and the CD13 positive rate and the CD33 positive rate are compared with those in the myeloblast population with CD45 positive. The reduction is a necessary and sufficient feature for a cell population specific for MDS.

ＣＤ４５陰性の細胞集団には、赤芽球、血小板、形質細胞が混入していることがあるため、確実な検出のためにはこれらの混入細胞の存在を確認しなければならない。そのためには、末梢血等赤芽球や形質細胞のほとんど含まれない検体を解析するか、以下の方法により、ＭＤＳに特異的な細胞をこれらの混入細胞と区別して解析するのがよい。 Since the CD45 negative cell population may be contaminated with erythroblasts, platelets and plasma cells, the presence of these contaminated cells must be confirmed for reliable detection. For this purpose, it is preferable to analyze a specimen containing almost no erythroblasts or plasma cells such as peripheral blood, or to distinguish MDS-specific cells from these mixed cells by the following method.

赤芽球や血小板はいずれもＣＤ４５陰性または弱陽性であるが、細胞の大きさや特徴的な抗原の相違を利用してＭＤＳに特異的な細胞と区別することができる。例えば、血小板は通常の細胞よりも小さいこと、特徴的な抗原として赤芽球に発現するＧＰＡ（Glycophorin A）や形質細胞に発現するＣＤ３８に着目することにより、ＭＤＳに特異的な細胞とこれらの混入細胞を区別することができる。具体的には、例えば、上述の、ＣＤ４５陰性かつＣＤ１３陽性率及びＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して低下しているという特徴に加えてさらにＧＰＡとＣＤ３８が陰性であることをもって、ＭＤＳに特異的な細胞集団の特徴とすることができる。 Both erythroblasts and platelets are CD45 negative or weakly positive, but can be distinguished from cells specific for MDS by utilizing the difference in cell size and characteristic antigen. For example, by focusing on platelets smaller than normal cells, GPA (Glycophorin A) expressed in erythroblasts as characteristic antigens, and CD38 expressed in plasma cells, these cells specific to MDS and these Contaminating cells can be distinguished. Specifically, for example, in addition to the above-described characteristics that the CD45 negative and CD13 positive rate and the CD33 positive rate are reduced as compared with the CD45 positive myeloblast population, GPA and CD38 are also negative. Can be characterized as a cell population specific for MDS.

このような抗原発現の特徴により、ＭＤＳに特異的な細胞集団を検出することができる。検出の方法としては、抗原の発現および細胞の大きさを判別することのできる方法である必要があるため、上述したＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８等のヒト造血系抗原に特異的な抗体を用いた免疫学的方法を用いるのがよい。 Due to such characteristics of antigen expression, a cell population specific to MDS can be detected. Since the detection method needs to be a method capable of discriminating the expression of the antigen and the cell size, an antibody specific for the above-mentioned human hematopoietic antigens such as CD45, CD13, CD33, GPA, CD38, etc. It is preferable to use an immunological method using

免疫学的方法としては、細胞を用いて抗原の存在を検出することのできる方法であれば特に限定はされないが、実際の臨床現場において、簡便にかつ迅速に多量の試料を同時に測定できるという利点から、好適にはＦＣＭを用いて複数の蛍光標識抗体を組合わせて検査を行うのが好ましい。 The immunological method is not particularly limited as long as it can detect the presence of an antigen using cells, but it is advantageous in that a large amount of samples can be simultaneously and easily measured in an actual clinical site. Therefore, it is preferable to perform an inspection by combining a plurality of fluorescently labeled antibodies using FCM.

ＦＣＭの操作方法は公知の方法（例えば、野村和弘ら編「フローサイトメトリー〜手技と実際〜」1984年，蟹書房、河本圭司ら編「フローサイトメトリー入門」1989年，医学書院、河本圭司ら編「応用サイトメトリー」2000年，医学書院）に準じて行うことができる。 The operation method of FCM is a publicly known method (for example, Kazuhiro Nomura et al. “Flow Cytometry-Techniques and Practices” 1984, Tsuji Shobo, Shinji Kawamoto et al. “Introduction to Flow Cytometry” 1989, Medical School, Shinji Kawamoto et al. (Applied cytometry, 2000, Medical School).

また、ＦＣＭで用いる蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、ＰｅｒＣＰ（peridin chlorophyll）、ＥＣＤ（phycoerythrin-Texas Red）、ＰＣ５（phycoerythrin-cyanin5.1）、ＰＣ７（phycoerythrin-cyanin7）等一般的に市販されている蛍光標識を用いることが出来、これらの組み合わせは自由に行うことができる。 Fluorescent labels used in FCM include FITC (Fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), APC (Allophycocyanin), PerCP (peridin chlorophyll), ECD (phycoerythrin-Texas Red), PC5 (phycoerythrin-cyanin5.1), PC7. A commercially available fluorescent label such as (phycoerythrin-cyanin7) can be used, and these combinations can be freely performed.

また、ＦＣＭは３カラー又は４カラー解析法によって行うことができるが、４カラー解析法によればより効率よく解析を行うことができる。
ＦＣＭを用いた場合、本発明において、ＣＤ４５陰性芽球とは以下のように同定した細胞をさす。すなわち、まず側方散乱（side scatter:ＳＳＣ）と前方散乱（forward scatter:ＦＳＣ）で展開したプロットにおいて、血小板や破砕細胞等を除外した所謂生細胞にゲートをかける(図１−１で言えばＲ１にあたる)。 Further, FCM can be performed by a three-color or four-color analysis method, but according to the four-color analysis method, analysis can be performed more efficiently.
When FCM is used, in the present invention, CD45 negative blast refers to a cell identified as follows. That is, first, in a plot developed by side scatter (SSC) and forward scatter (FSC), a so-called live cell excluding platelets and crushed cells is gated (in the case of FIG. 1-1). R1).

これと平行して、ＣＤ４５に対する陰性コントロール抗体（Mouse IgG）でのみ染色した細胞検体を、ＣＤ４５とＳＳＣで展開した際に、少なくとも９５％以上、より好ましくは９７%以上の細胞がおさまるＣＤ４５の蛍光強度の範囲をＣＤ４５陰性と判定し、基準線を設定する。本発明においてＣＤ４５陰性（ＣＤ４５^-）とはこの基準線より左側に位置することを意味し、ＣＤ４５陽性（ＣＤ４５⁺）とは右側に位置することを意味する。またＣＤ４５弱陽性（ＣＤ４５±）とはこの基準線上にまたがることを意味する。 In parallel with this, when a cell specimen stained only with a negative control antibody (Mouse IgG) against CD45 is developed with CD45 and SSC, the fluorescence of CD45 contains at least 95% or more preferably 97% or more cells. The intensity range is determined to be CD45 negative, and a reference line is set. In the present invention, CD45 negative (CD45 ⁻ ) means located on the left side of the reference line, and CD45 positive (CD45 ⁺ ) means located on the right side. Further, CD45 weakly positive (CD45 ±) means crossing over this reference line.

次にＲ１ゲート内の細胞をＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体（ＣＤ４５-ＰｅｒＣＰ）とＳＳＣで展開した際に検出される、ＳＳＣが低くかつＣＤ４５陰性（ＣＤ４５^-）の細胞集団が、ＣＤ４５陰性芽球である。 Next, a cell population having a low SSC and a CD45 negative (CD45 ⁻ ) detected when the cells in the R1 gate are developed with PerCP-labeled CD45 antibody (CD45-PerCP) and SSC is a CD45 negative blast.

ＭＤＳ患者から採取した検体におけるＣＤ４５陰性芽球のゲーティング例を図４−１に示す。ＳＳＣとＦＳＣで展開したプロットにおいてゲーティングされた解析対象の細胞集団がＲ１と表示されたクラスターである。Ｒ１に含まれる細胞を展開して同定されたＲ３と表示されたクラスターを、ＣＤ４５^-またはＣＤ４５^-/±の細胞集団として、さらに分離する。ＦＣＭで得た情報からＲ１およびＲ３を満たす情報をコンピューター上で抽出し解析することにより、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の集団を同定できる。なお、Ｒ１およびＲ２を満たす情報がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団の情報である。 An example of gating of CD45 negative blasts in a sample collected from an MDS patient is shown in FIG. The cell population of the analysis target gated in the plot developed by SSC and FSC is a cluster indicated as R1. The cluster indicated as R3 identified by expanding the cells contained in R1 is further separated as a CD45 ⁻ or CD45 ^{− /} ± cell population. By extracting and analyzing information satisfying R1 and R3 from information obtained by FCM on a computer, a population of CD45 negative blasts, which is a cell population specific to MDS, can be identified. Information satisfying R1 and R2 is information on a CD45-positive myeloblast population.

このように、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した末梢血又は骨髄細胞を処理し、ＦＣＭを用いて適当な蛍光標識抗体を組合わせた検査を行い、同一症例の骨髄芽球の造血系抗原の発現と比較して判定することにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。 In this way, peripheral blood or bone marrow cells collected from a patient suspected of having MDS are processed, and an examination using a combination of appropriate fluorescently labeled antibodies using FCM is performed. MDS and de novo AML can be differentiated by making a determination in comparison with the expression of the hematopoietic antigen.

この判定は、以下のフローチャートに従って行うことができる。 This determination can be made according to the following flowchart.

Ｒ１のＣＤ４５とＳＳＣで展開した図において、ＣＤ４５^-またはＣＤ４５^-/±の細胞集団を認めた場合、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとして、次に赤芽球、血小板、形質細胞の混入をＧＰＡ、ＣＤ３８の発現や細胞の大きさ等により調べる。赤血球、血小板、形質細胞の混入が無いか軽度な検体であれば、そのままＣＤ１３とＣＤ３３のそれぞれの陽性率低下を同一症例のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団のＣＤ１３とＣＤ３３の発現と比較し、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性があると判定することができる。ＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率の低下は、通常ＣＤ３８陽性率の低下を伴う。ＣＤ１３陽性率低下とＣＤ３３陽性率低下が見られた場合は、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとする。赤芽球、血小板、形質細胞の混入のある場合は、赤芽球、血小板、形質細胞以外の細胞集団について、ＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率低下を調べる。例えば、ＣＤ４５抗体としてＣＤ４５-ＰｅｒＣＰを用いた場合では、さらに細胞にＧＰＡ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ＦＩＴＣ、ＣＤ１３−ＰＥの３抗体を加え、ＦＩＴＣ陰性細胞のＣＤ１３の発現を評価する。同様にＣＤ１３−ＰＥの代わりにＣＤ３３−ＰＥを使用し、ＣＤ３３の発現を評価する。 If the CD45 ⁻ or CD45 ^{− /} ± cell population is observed in the R1 CD45 and SSC diagrams, there is a possibility of MDS or leukemic MDS, followed by contamination with erythroblasts, platelets, and plasma cells. Investigate by GPA, CD38 expression, cell size, etc. If the sample is free of erythrocytes, platelets or plasma cells or is mild, the decrease in the positive rate of CD13 and CD33 is directly compared with the expression of CD13 and CD33 in the CD45-positive myeloblast population of the same case. Or it can determine with the possibility of leukemic MDS. A decrease in the CD13 positive rate and the CD33 positive rate is usually accompanied by a decrease in the CD38 positive rate. If a decrease in CD13 positive rate and a decrease in CD33 positive rate are observed, there is a possibility of MDS or leukemic MDS. When erythroblasts, platelets, and plasma cells are mixed, a decrease in the positive rate of CD13 and CD33 is examined for cell populations other than erythroblasts, platelets, and plasma cells. For example, when CD45-PerCP is used as the CD45 antibody, GPA-FITC, CD38-FITC, and CD13-PE 3 antibodies are further added to the cells to evaluate the expression of CD13 in FITC-negative cells. Similarly, CD33-PE is used instead of CD13-PE, and the expression of CD33 is evaluated.

上述のように、本発明の方法によりＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なのは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体である。しかしながら、実際の臨床現場においてはＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかであろうと判断される以前の検体を扱う必要も生ずることがある。また、検体の採取状態によって、ＦＣＭ解析の邪魔をする物質が混入することもある。このような検体を用いた場合であっても、ＭＤＳに特異的な細胞集団を確実に検出するために、上記の抗体に加えて、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ７、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ等の一般的なマーカーを用いて解析を行ってもよい。これらの抗体を使用することにより、検出の精度を高め、より確実な診断をすることが可能となる。 As described above, a sample used for detecting MDS by the method of the present invention is preferably a sample collected from a patient suspected of having MDS. However, in actual clinical settings, it may be necessary to handle previous specimens that are determined to be either MDS (including leukemic MDS) or de novo AML. In addition, depending on the sample collection state, a substance that interferes with the FCM analysis may be mixed. Even when such a specimen is used, in order to reliably detect a cell population specific for MDS, in addition to the above-mentioned antibodies, CD34, CD11b, CD15, CD2, CD3, CD10, CD19, CD20 , CD44, CD7, CD56, CD117, CD133, CD41a, CD123, HLA-DR and other general markers may be used for analysis. By using these antibodies, detection accuracy can be improved and more reliable diagnosis can be performed.

例えば、誤って急性リンパ性白血病の検体を検査した場合、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ２０等が陽性となり、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者ではないことが判明する。また、骨髄芽球のゲーティングが困難な試料においてもＣＤ３４を使用することで骨髄芽球を明確にゲーティングができる。また、血小板は色々な細胞に対して付着しやすい性質があるため、ＭＤＳに特異的な細胞に血小板が付着し、見かけ上血小板抗原（ＣＤ４１ａ等）陽性を示すことがある。この場合、さらに細胞の大きさ、ＣＤ４４の発現（血小板は陰性または弱陽性、ＭＤＳ特異的細胞は陽性を示す場合がある）等で、ＭＤＳ特異的細胞の存在を確認してもよい。 For example, if a sample of acute lymphoblastic leukemia is mistakenly tested, CD2, CD3, CD10, CD20, etc. are positive, and it is found that the patient is not suspected of having MDS. In addition, it is possible to clearly gate myeloblasts by using CD34 even in samples in which myeloblast gating is difficult. In addition, since platelets tend to adhere to various cells, platelets may adhere to cells specific to MDS, and may appear to be positive for platelet antigens (CD41a, etc.). In this case, the presence of MDS-specific cells may be further confirmed by cell size, CD44 expression (platelets may be negative or weakly positive, and MDS-specific cells may be positive).

本発明はさらに、ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キットを提供する。ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体としては、上述のように、ＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４４等のヒト抗原に対するモノクローナル抗体を用いることができる。 The present invention further provides a kit for differentiating MDS or leukemic MDS and de novo AML comprising an antibody specific for CD45 negative blasts. As described above, monoclonal antibodies against human antigens such as CD45, CD13, CD33, GPA, CD38, and CD44 can be used as antibodies specific for CD45 negative blasts.

検出法において標識剤として酵素を用いる場合には、本発明のキットは下記の構成試薬を含むことができる。
（１）酵素標識化モノクローナル抗体
（２）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。 When an enzyme is used as a labeling agent in the detection method, the kit of the present invention can contain the following constituent reagents.
(1) Enzyme-labeled monoclonal antibody (2) Substrate solution When the sandwich ELISA method is used as a modification of the kit, the kit of the present invention can contain the following reagents.

（１）モノクローナル抗体
（２）酵素標識化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。 (1) Monoclonal antibody (2) Enzyme-labeled monoclonal antibody or polyclonal antibody (3) Substrate solution When the biotin-avidin method is used as a modification of the above kit, the kit of the present invention may contain the following reagents: it can.

（１）ビオチン化モノクローナル抗体
（２）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法及びビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）モノクローナル抗体
（２）ビオチン化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（４）基質溶液
本発明に使用するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の詳しい作製方法については公知の方法（例えば、富山朔二ら編「単クローン抗体実験マニュアル」1987年，講談社、右田俊介ら翻訳「免疫化学実験法」1992年，西村書店）に準じて行うことができる。 (1) Biotinylated monoclonal antibody (2) Enzyme labeled avidin or streptavidin (3) Substrate solution When the sandwich ELISA method and the biotin-avidin method are used as a modification of the above kit, the kit of the present invention is as follows. Reagents can be included.
(1) Monoclonal antibody (2) Biotinylated monoclonal antibody or polyclonal antibody (3) Enzyme-labeled avidin or streptavidin (4) Substrate solution For detailed production methods of the monoclonal antibody and polyclonal antibody used in the present invention ( For example, it can be carried out in accordance with the “Monoclonal Antibody Experiment Manual” edited by Toyama Shinji et al., 1987, Kodansha, Shunsuke Ueda et al., “Immunochemical Experiment Method, 1992, Nishimura Shoten).

以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, the scope of the present invention is not limited to these Examples.

１．検体の採取
検体としては、ヒトの骨髄液または末梢血を用いた。これらの検体は、ＭＤＳまたはde novo AMLが疑われる患者に採取及び研究目的の使用について充分に説明を行い、同意を得られたあとに用いた。検体採取の際には抗凝固剤としてヘパリンを添加した。 1. As a sample to be collected, human bone marrow fluid or peripheral blood was used. These specimens were used after a thorough explanation of their collection and use for research purposes in patients suspected of having MDS or de novo AML and consent. At the time of sample collection, heparin was added as an anticoagulant.

２．検体の調製
末梢血はそのまま使用し、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０で２〜３倍に希釈する。このとき、検体中の芽球比率が低い場合は、Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高めた。 2. Preparation of specimen Peripheral blood is used as it is, and bone marrow puncture solution is diluted 2-3 times with RPMI-1640 supplemented with 10% FCS. At this time, when the blast ratio in the specimen was low, the blast ratio was increased using Blastretriever (registered trademark) reagent.

Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高める方法は、試薬の使用説明書に準じて行う。すなわち、ガラス試験管にBlastretriever（登録商標）試薬を入れ、ヘパリン加末梢血あるいは３−５倍に希釈したヘパリン加骨髄穿刺液を重層し、これを１０分間（550ｘｇ、室温）遠心分離し、中間層に残った細胞を回収した。 The method for increasing the blast ratio using the Blastretriever (registered trademark) reagent is performed according to the instruction manual of the reagent. That is, Blastretriever (registered trademark) reagent is put in a glass test tube, and heparin-added peripheral blood or heparin-added bone marrow puncture diluted 3 to 5 times is overlaid, and this is centrifuged for 10 minutes (550 × g, room temperature), Cells remaining in the layer were collected.

３．染色及び測定
検体を溶血剤（NH₄Cl 8.26g、KHCO₃ 1.00g、EDTA−4NA／LWD 0.04g）を用いて室温にて5分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：0.1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）にて細胞濃度を１×１０⁶／ｍｌに調製した。調製した検体を１００μｌずつＦＣＭ用チューブに分注し、以下の蛍光標識抗体の組合わせに準じ染色後、ＦＣＭでデータを収集した。 3. Stained and measured samples were incubated with a hemolytic agent (NH ₄ Cl 8.26 g, KHCO ₃ 1.00 g, EDTA-4NA / LWD 0.04 g) at room temperature for 5 minutes to perform hemolysis of contaminating erythrocytes. The cell concentration was adjusted to 1 × 10 ⁶ / ml with acid buffered saline (PBS: 0.1% BSA, 0.1% sodium azide). 100 μl of the prepared specimen was dispensed into FCM tubes, stained according to the following combination of fluorescently labeled antibodies, and data collected by FCM.

抗ＣＤ４５抗体に２種の抗体を組合わせ３カラー解析法で解析する場合、分注した検体をそれぞれ異なる標識で染色を行う。今回は、peridin chlorophyll (PerCP)で標識した抗ＣＤ４５抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いたため、その他の抗体をfluorescein isothiocyanate (FITC)標識抗体とphycoerythrin (PE)標識抗体で染色した。用いるFITC標識抗体とPE標識抗体は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ１０、ＣＤ１１７、ＧＰＡ等３種の抗体を、例えばＣＤ４５／ＣＤ３４／ＣＤ３８、ＣＤ４５／ＧＰＡ／ＣＤ１３、ＣＤ４５／ＣＤ１５／ＣＤ３３、ＣＤ４５／ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ／ＣＤ４１ａ、ＣＤ４５／ＣＤ４４／ＣＤ４１ａ等適宜組み合わせて測定を行った。 When two types of antibodies are combined with the anti-CD45 antibody and analyzed by the three-color analysis method, the dispensed specimens are stained with different labels. Since an anti-CD45 antibody (Becton Dickinson, San Jose, Calif.) Labeled with peridin chlorophyll (PerCP) was used this time, other antibodies were stained with a fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled antibody and a phycoerythrin (PE) labeled antibody. The FITC-labeled antibody and PE-labeled antibody used are CD3, CD5, CD8, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, HLA-DR, CD4, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD2, CD7, CD20, CD33, CD56, Three types of antibodies such as CD10, CD117, GPA are appropriately used, for example, CD45 / CD34 / CD38, CD45 / GPA / CD13, CD45 / CD15 / CD33, CD45 / HLA-A, B, C / CD41a, CD45 / CD44 / CD41a, etc. Measurements were made in combination.

抗ＣＤ４５抗体に他の３種の抗体を組合わせ４カラーＦＣＭで解析する場合、抗ＣＤ４５抗体および検体の使用量をそれぞれ節約しつつ、同時に診断を行うことができる。
ＦＣＭによる測定は、FACScan（Becton Dickinson）を用いて定法に従って３カラー解析法で施行した。 When the anti-CD45 antibody is combined with the other three types of antibodies and analyzed by the 4-color FCM, the diagnosis can be performed simultaneously while saving the usage amounts of the anti-CD45 antibody and the specimen.
The measurement by FCM was carried out by a three-color analysis method according to a conventional method using FACScan (Becton Dickinson).

４．フローサイトメトリーによるＣＤ４５陰性芽球の同定に基づくde novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別
次に、収集したＦＣＭデータをＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、以下の手順に従って、骨髄芽球の細胞集団の他にＭＤＳに特異的な細胞集団があるかどうかを判定した。
（１）ＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいて、骨髄芽球の細胞集団とは別に、よりＣＤ４５発現の弱い（通常ＣＤ４５陰性であるが、一部ごくわずかに陽性の場合もある）細胞集団（以降この細胞をＣＤ４５^-/±細胞と称する）を確認する。
（２）ＣＤ４５^-/±細胞集団は同一症例の骨髄芽球に比べ、必ずＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率が低下している。また、通常ＣＤ３８の陽性率も低下している。
（３）ＣＤ４５^-/±細胞集団はＴ細胞マーカー(ＣＤ２、ＣＤ３等)陰性、Ｂ細胞マーカー(ＣＤ１０、ＣＤ１９等)陰性である。
（４）ＣＤ４５^-/±細胞集団には赤芽球、血小板、形質細胞が混入していることがあるため、ＣＤ４５^-/±細胞集団にこれら以外に造血系抗原陰性芽球が存在することを確認する必要がある。そのためには、(A) 末梢血等赤芽球、形質細胞のほとんど含まれない検体を解析する、(B) ＧＰＡ（赤芽球に発現）、ＣＤ３８（形質細胞に発現）等に対する抗体に対する反応や細胞の大きさ（血小板は通常の細胞より小さい）をフローサイトメトリーで評価する、等が必要である。 4). Differentiation of de novo AML and leukemic MDS based on identification of CD45 negative blasts by flow cytometry Next, the collected FCM data were developed with CD45 expression and SSC, and the myeloblast cell population was analyzed according to the following procedure. It was determined whether there was a cell population specific for MDS.
(1) In plots developed with CD45 and SSC, apart from myeloblast cell population, cell population with weaker CD45 expression (usually negative for CD45 but may be slightly positive in some cases) This cell is called CD45 ^{− /} ± cell).
(2) The CD45 ^{− /} ± cell population always has a lower positive rate of CD13 and CD33 than the myeloblasts of the same case. Moreover, the positive rate of normal CD38 is also decreasing.
(3) The CD45 ^{− /} ± cell population is negative for T cell markers (CD2, CD3, etc.) and negative for B cell markers (CD10, CD19, etc.).
(4) Since the CD45 ^{− /} ± cell population may be contaminated with erythroblasts, platelets, and plasma cells, the CD45 ^{− /} ± cell population should contain other hematopoietic antigen-negative blasts. It is necessary to confirm. To that end, (A) Analyzing erythroblasts such as peripheral blood and specimens almost free of plasma cells, (B) Response to antibodies against GPA (expressed in erythroblasts), CD38 (expressed in plasma cells), etc. And cell size (platelets are smaller than normal cells) should be evaluated by flow cytometry.

De novo AMLではこの特異的細胞集団は存在しないか、あっても１％以下であることから、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
５．フローサイトメトリーにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別した結果
実際の症例において解析した例を図１〜図６に示す。 In De novo AML, this specific cell population does not exist, or even if it is 1% or less, it is possible to differentiate between de novo AML and leukemic MDS.
5). Examples of analysis in actual cases as a result of differentiating MDS and de novo AML by flow cytometry are shown in FIGS.

図１はde novo AMLの症例番号１のＦＣＭパターンである。図１−１がサイトグラムであり、図１−２がＣＤ４５陰性コントロールの図である。図１−３は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、図１−２の陰性コントロールによってＣＤ４５基準線を設定した。この基準線より右に位置するのがＣＤ４５陽性細胞となる。de novo AMLにおいては、ＣＤ４５陰性細胞集団は殆ど認められないが、ＭＤＳと比較するためにあえてＲ３としてターゲティングを行った。図２はde novo AMLにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析であり、図２−１が陰性コントロールの図である。この陰性コントロールによって、各抗原解析図の基準線を決定した。ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８のそれぞれの陽性率を図の下に表わした。また、図３は同様にde novo AMLにおけるＣＤ４５陰性領域細胞の抗原解析である。 FIG. 1 is an FCM pattern of case number 1 of de novo AML. 1-1 is a cytogram, and FIG. 1-2 is a diagram of a CD45 negative control. FIG. 1-3 is a diagram in which R1 is developed with CD45 and SSC, and a CD45 reference line is set by the negative control of FIG. 1-2. CD45 positive cells are located to the right of this reference line. In de novo AML, almost no CD45-negative cell population was observed, but targeting was performed as R3 for comparison with MDS. FIG. 2 is an antigen analysis of CD45 positive myeloblasts in de novo AML, and FIG. 2-1 is a diagram of a negative control. With this negative control, the baseline of each antigen analysis chart was determined. The positive rates of CD13, CD33, GPA, and CD38 are shown at the bottom of the figure. FIG. 3 is also an antigen analysis of CD45 negative region cells in de novo AML.

図４はＭＤＳの症例番号７のＦＣＭパターンである。図１と同様に、図４−1がサイトグラムであり、図４−２がＣＤ４５陰性コントロールの図である。図４−３は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、図４−２の陰性コントロールによってＣＤ４５基準線を上記と同様に設定した。ＭＤＳにおいては、de novo AMLとは異なり、ＣＤ４５陰性細胞集団が認められる。図５はＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析であり、図５−１が陰性コントロールの図である。図２と同様にこの陰性コントロールによって、各抗原解析図の基準線を決定した。ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８のそれぞれの陽性率を図の下に表わした。また、図６は同様にＭＤＳにおけるＣＤ４５陰性芽球の抗原解析である。 FIG. 4 is an FCM pattern of case number 7 of MDS. Similar to FIG. 1, FIG. 4-1 is a cytogram, and FIG. 4-2 is a diagram of a CD45 negative control. FIG. 4-3 is a diagram in which R1 is developed with CD45 and SSC, and the CD45 reference line is set in the same manner as described above by the negative control in FIG. 4-2. In MDS, unlike de novo AML, a CD45 negative cell population is observed. FIG. 5 is an antigen analysis of CD45-positive myeloblasts in MDS, and FIG. 5-1 is a negative control diagram. The reference line of each antigen analysis chart was determined by this negative control as in FIG. The positive rates of CD13, CD33, GPA, and CD38 are shown at the bottom of the figure. Similarly, FIG. 6 is an antigen analysis of CD45 negative blasts in MDS.

同じように臨床症状によってde novo AMLと診断された症例を５件、ＭＤＳと診断された症例６件においても同様にＦＣＭパターンを展開し、ＣＤ４５陰性芽球の検出を行った。これらの症例においては、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ７、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ等のヒト抗原に対する抗体による解析も行い、de novo AMLあるいは骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳとしての特徴的な形質の存在を確認した。 Similarly, FCM patterns were similarly developed in 5 cases diagnosed with de novo AML due to clinical symptoms and 6 cases diagnosed with MDS, and CD45 negative blasts were detected. In these cases, analysis with antibodies against human antigens such as CD34, CD11b, CD15, CD2, CD3, CD10, CD19, CD7, CD56, CD117, CD133, CD41a, CD123, HLA-DR, etc. was performed, and de novo AML or The presence of characteristic traits as myelodysplastic syndrome (MDS) or leukemic MDS was confirmed.

各症例におけるＣＤ４５とＳＳＣプロットでのＣＤ４５陰性細胞集団の有無とそれぞれの抗体に対する判定結果及びそれらのデータより導かれるＣＤ４５陰性芽球の有無の判定結果を表１に示した。 Table 1 shows the presence / absence of the CD45 negative cell population in each case and the determination result for each antibody in the CD45 and SSC plots, and the determination result of the presence / absence of CD45 negative blasts derived from these data.

表１はde novo AMLと臨床症状から診断された症例６例と、ＭＤＳまたは白血病化ＭＤＳと臨床症状から診断された症例７例を示す。ＣＤ４５とＳＳＣプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団の存在を確認したときは○を、存在しなかったときは×を記載した。 Table 1 shows 6 cases diagnosed from de novo AML and clinical symptoms and 7 cases diagnosed from MDS or leukemic MDS and clinical symptoms. When the presence of a CD45 negative cell population was confirmed in the CD45 and SSC plots, a circle was indicated, and when there was no CD45 negative cell, a cross was written.

また、表中のＣＤ１３及びＣＤ３３欄はＣＤ４５陽性骨髄芽球に比べてＣＤ４５陰性骨髄芽球のそれぞれの抗体に対する陽性率が高かったとき＋を、あまり変わらなかったときは±を、明らかに低かったときは−を記載した。 Also, in the columns of CD13 and CD33 in the table, + was positive when the positive rate for each antibody of CD45 negative myeloblast was higher than that of CD45 positive myeloblast, and ± was clearly lower when it did not change much. When-is described.

ＧＰＡ及びＣＤ３８はそれぞれ陽性であったときは＋を、境界上にあったときは±を、陰性であったときは−を記載した。
これらの測定結果から、ＣＤ４５陰性芽球の存在を確認できたときは○を、確認できなかったときは×を記載した。 When GPA and CD38 were positive, + was described, ± when they were on the boundary, and-when negative.
From these measurement results, when the presence of CD45 negative blasts could be confirmed, ○ was indicated, and when it was not confirmed, × was indicated.

de novo AMLではＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団が確認できなかったのに加え、あえて解析したＣＤ４５陰性領域の細胞はＣＤ４５陽性骨髄芽球に比べてＣＤ１３およびＣＤ３３の発現低下を示さなかった。 In de novo AML, a CD45 negative cell population could not be confirmed in the plot developed with CD45 and SSC, and the cells in the CD45 negative region that were intentionally analyzed showed decreased expression of CD13 and CD33 compared to CD45 positive myeloblasts. There wasn't.

ＭＤＳではＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団が確認でき、ＣＤ１３及びＣＤ３８の陽性率がＣＤ４５陽性骨髄芽球集団の陽性率と比較して低下していた。症例６において±と記載しているのは、ＣＤ３３の陽性率がＣＤ４５陽性骨髄芽球及びＣＤ４５陰性芽球の双方とも５以下ととても低く比較が難しかったためであり、細胞の表面形質は明らかに陰性であった。 In MDS, the CD45 negative cell population was confirmed in the plot developed by CD45 and SSC, and the positive rate of CD13 and CD38 was lower than the positive rate of the CD45 positive myeloblast population. The case 6 is described as ± because the CD33 positive rate of both CD45-positive myeloblasts and CD45-negative blasts was very low at 5 or less, making it difficult to compare, and the cell surface traits were clearly negative Met.

以上の結果から、臨床症状等から明らかにde novo AMLと診断された症例においてはＣＤ４５陰性芽球は検出されず、ＭＤＳまたは白血病化ＭＤＳと診断された症例からはＣＤ４５陰性芽球を検出することが出来た。 Based on the above results, CD45 negative blasts are not detected in cases diagnosed with de novo AML clearly from clinical symptoms, and CD45 negative blasts are detected from cases diagnosed with MDS or leukemic MDS. Was made.

本発明の細胞集団はＭＤＳに特異的に現れることから、これを検出することで白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。白血病化ＭＤＳは治療に不応性であるが、de novo AMLでは治療に良く反応するため、この両者を鑑別することは患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。本発明の鑑別方法を用いることにより、診断の初期に白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別し、適切な治療戦略の構築が可能となる。本発明の鑑別方法をその他の診断方法と組み合わせて用いると鑑別をさらに確実なものとすることができる。 Since the cell population of the present invention appears specifically in MDS, leukemic MDS and de novo AML can be differentiated by detecting this. Although leukemic MDS is refractory to treatment, de novo AML responds well to treatment, so distinguishing both is important for estimating the prognosis of patients, determining treatment strategies, and the like. By using the differentiation method of the present invention, it becomes possible to differentiate leukemic MDS and de novo AML at the early stage of diagnosis and to construct an appropriate therapeutic strategy. When the discrimination method of the present invention is used in combination with other diagnostic methods, the discrimination can be further ensured.

フローサイトメトリ−により、de novo AMLを展開した図を示す。(症例番号：de novo AML 1)The figure which expanded de novo AML by flow cytometry is shown. (Case number: de novo AML 1) de novo AMLにおけるＣＤ４５陽性の骨髄芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：de novo AML 1)The antigen analysis figure of the CD45 positive myeloblast in de novo AML is shown. (Case number: de novo AML 1) de novo AMLにおけるＣＤ４５陰性領域細胞集団の抗原解析図を示す。(症例番号：de novo AML 1)The antigen analysis figure of the CD45 negative area cell population in de novo AML is shown. (Case number: de novo AML 1) フローサイトメトリーにより、ＭＤＳを展開した図を示す（症例番号：ＭＤＳ７）。The figure which developed MDS by flow cytometry is shown (case number: MDS7). ＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性の骨髄芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：ＭＤＳ７)The antigen analysis figure of the CD45 positive myeloblast in MDS is shown. (Case number: MDS7) ＭＤＳにおけるＣＤ４５陰性芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：ＭＤＳ７)The antigen analysis figure of the CD45 negative blast in MDS is shown. (Case number: MDS7)

Claims

検体中のＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳの検出方法。 A method for detecting myelodysplastic syndrome (MDS) or leukemic MDS, which comprises detecting the presence of CD45 negative blasts in a specimen.

検体が、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the specimen is peripheral blood or bone marrow cells of a patient suspected of having MDS.

免疫学的方法を用いて、ＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、請求項１乃至２のいずれかに記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the presence of CD45 negative blasts is detected by using an immunological method.

ＣＤ４５陰性芽球が以下のものである、請求項３に記載の方法：
ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更に
ＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下しているＣＤ４５陰性芽球。 4. The method of claim 3, wherein the CD45 negative blast is:
The CD13 positive rate is lower than the CD13 positive rate in the CD45 positive myeloblast population found in the same sample, and the CD33 positive rate is further reduced in the CD45 positive myeloblast population found in the same sample. CD45 negative blasts that are reduced compared to the CD33 positive rate.

ＣＤ４５陰性芽球が、さらにＧＰＡ陰性かつＣＤ３８陰性であるＣＤ４５陰性芽球である、請求項４に記載の方法。 The method according to claim 4, wherein the CD45 negative blast is a CD45 negative blast that is further GPA negative and CD38 negative.

フローサイトメトリーを用いることを特徴とする、請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。 6. The method according to claim 3, wherein flow cytometry is used.

以下の（ア）から（エ）の工程を含む、急性骨髄性白血病（de novo AML）と白血病化ＭＤＳとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５陰性を検出する工程
（イ）赤芽球、血小板、形質細胞の混入を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較したＣＤ１３陽性率の低下を検出する工程
（エ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較したＣＤ３３陽性率の低下を検出する工程。 A method for differentiating acute myeloid leukemia (de novo AML) from leukemic MDS, including the following steps (a) to (d):
(A) a step of detecting CD45 negative (a) a step of determining contamination of erythroblasts, platelets and plasma cells (c) a decrease in the CD13 positive rate compared to the CD13 positive rate in the CD45 positive myeloblast population Detecting step (d) detecting a decrease in the CD33 positive rate compared to the CD33 positive rate in the CD45 positive myeloblast population.

ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。 A kit for differentiating MDS or leukemic MDS and de novo AML containing an antibody specific for CD45 negative blasts.