JP2005214832A - Screening method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アルツハイマー病の予防や処置に有用な物質のスクリーニング方法及びそのためのキットに関するものである。 The present invention relates to a method for screening a substance useful for the prevention and treatment of Alzheimer's disease and a kit therefor.
アルツハイマー病は進行性の神経変性疾患であり、重篤な痴呆症状を引き起こすために大きな社会問題となっており、その治療や予防のための薬剤の開発が待たれている。 Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease that has become a major social problem because it causes severe dementia, and the development of drugs for its treatment and prevention is awaited.
アルツハイマー病の病理的特徴としては、アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの細胞外沈殿と高リン酸化微小管結合タウの細胞内凝集とが挙げられる。 Pathological features of Alzheimer's disease include extracellular precipitation of amyloid beta (Aβ) peptide and intracellular aggregation of highly phosphorylated microtubule-bound tau.
アミロイドベータは、４０〜４２個のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が２箇所で切断されることによって生じる。ＡＰＰは、最初にベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）によって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片（ＣＴ９９）を生じ、続いてプレセニリン依存ガンマセクレターゼで切断される。 Amyloid beta is a peptide consisting of 40 to 42 amino acids, and is generated by cleaving amyloid precursor protein (APP) at two sites. APP is first catalyzed by beta-secretase (BACE) to produce a carboxy-terminal proteolytic fragment (CT99) bound to the membrane, followed by cleavage with presenilin-dependent gamma-secretase.
ガンマセクレターゼに関しては、神経分化に重要なＮｏｔｃｈや癌遺伝子であるＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４をも切断することが知られており、ベータセクレターゼに関しては、ＡＰＰを切断する以外の活性については現在のところまだ不明である。 Regarding gamma secretase, it is known to cleave Notch and oncogene HER4 / ERBB4, which are important for neuronal differentiation, and as for beta secretase, the activity other than cleaving APP is still unknown. is there.
近年、アルツハイマー病の予防又は処置のための薬物を開発するために、アミロイドベータの蓄積を低下させる方法を開発使用とする試みが行われている。その一つとして、ガンマセクレターゼやベータセクレターゼの活性を阻害することによりアミロイドベータの蓄積を低下させる方法がある。しかし、これらのセクレターゼは、ＡＰＰやＣＴ９９以外の別の重要な生理活性物質をも基質とすることから、これらのセレクターゼ阻害剤は、さまざまな副作用を生じる可能性があるという欠点がある。 In recent years, attempts have been made to develop and use methods for reducing amyloid beta accumulation in order to develop drugs for the prevention or treatment of Alzheimer's disease. One of them is a method for reducing the accumulation of amyloid beta by inhibiting the activity of gamma secretase or beta secretase. However, since these secretases also use other important physiologically active substances other than APP and CT99 as substrates, these selectorase inhibitors have a drawback that they may cause various side effects.
したがって、副作用のない、アルツハイマー病の予防又は処置のための薬物を開発するために、ＡＰＰからアミロイドベータが生成される過程の詳細な解明が待たれていた。 Therefore, in order to develop a drug for preventing or treating Alzheimer's disease without side effects, a detailed elucidation of the process by which amyloid beta is produced from APP has been awaited.
ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）でありリン酸化（セリン又はトレオニン）−プロリンモチーフに高い親和性を示すＰｉｎ１は、ヒトのタウの２３１位のホスホトレオニンと相互に作用し（非特許文献１）、また、Ｐｉｎ１ノックアウト（非特許文献２）は、ＡＤに見られるのと同様のマウスタウの高リン酸化をもたらす（非特許文献３）ことが知られている。 Pin1 which is peptidylprolyl cis / trans isomerase (PPlase) and shows high affinity for phosphorylated (serine or threonine) -proline motif interacts with phosphothreonine at position 231 of human tau (Non-patent Document 1). In addition, it is known that Pin1 knockout (Non-Patent Document 2) leads to the high phosphorylation of mouse tau similar to that seen in AD (Non-Patent Document 3).
しかし、アミロイドベータ生成過程へのＰｉｎ１の関与は、全く知られていなかった。 However, the involvement of Pin1 in the amyloid beta production process was not known at all.
本発明解決しようとする課題は、アルツハイマー病の予防や処置に有用な物質のスクリーニング方法及びそのためのキット提供することである。 The problem to be solved by the present invention is to provide a screening method for a substance useful for the prevention and treatment of Alzheimer's disease and a kit therefor.
本発明者は、アミロイドベータが合成される過程を解明することに成功した。すなわち、Ｐｉｎ１がβ切断部位で切断された後のＡＰＰと相互作用すること、そしてその結果、驚くべきことに、Ｐｉｎ１がＡＰＰのＣ末端断片のガンマ切断を調節することを解明し、本発明を完成させたものである。 The present inventor succeeded in elucidating the process by which amyloid beta is synthesized. That is, it was elucidated that Pin1 interacts with APP after being cleaved at the β-cleavage site, and as a result, surprisingly, Pin1 regulates gamma cleavage of the C-terminal fragment of APP. It has been completed.
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである。
１．下記工程：
（１）試験化合物をＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する工程
を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
２．下記工程：
（１）試験化合物を、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する工程
を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法。
３．Ｐｉｎ１を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
４．リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
５．２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、ベータアミラーゼに関連する疾患の処置のための医薬組成物。
That is, the present invention is as follows.
1. The following process:
A substance that inhibits Pin1's prolyl isomerase activity, comprising: (1) contacting a test compound with Pin1; and (2) determining whether the test compound inhibits Pin1's prolyl isomerase activity. How to screen.
2. The following process:
(1) contacting the test compound with phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1, and (2) determining whether the test compound inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1. A method for screening for a substance that inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1.
3. A kit for screening for a substance that inhibits the prolyl isomerase activity of Pin1, including Pin1.
4). A kit for screening for a substance that inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1, including phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1.
5. 2,7-dimethylbenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-1,3,6,8 (2H, 7H) -tetron, diethyl-1,3,6,8-tetrahydro-1,3,6 , 8-tetraoxobenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-2,7-diacetate, diethyl-1,3,8,10-tetrahydro-1,3,8,10-tetraoxoanthra [2,1 , 9-def: 6,5,10-d′e′f ′] diisoquinoline-2,9-diacetate, bis (1-piperidylthiocarbonyl) sulfide, N-[(2-nitro-5-thienyl) Methylidene] -2-thiazolylamine, 4,5-dichloro-2-methyl-4-3 (2H) -isothiazolone, comprising one or more compounds selected from the group consisting of treatment of diseases related to beta amylase Pharmaceutical compositions.
本発明でＣＴ９９とは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）によって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片をいう。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の第５９７位〜第６９５位にわたるアミノ酸配列からなるポリペプチドをいう。なお、ＣＴ９９におけるアミノ酸位置は、便宜上、ＡＰＰにおけるアミノ酸位置を用いて表す。 In the present invention, CT99 refers to a carboxy-terminal proteolytic fragment in which amyloid precursor protein (APP) is catalyzed by beta-secretase (BACE) and bound to the membrane. More specifically, it refers to a polypeptide consisting of an amino acid sequence extending from position 597 to position 695 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In addition, the amino acid position in CT99 is represented using the amino acid position in APP for convenience.
本発明でリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とは、ＣＴ９９の細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフのトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９をいう。ＣＴ９９の膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の第６２５位〜第６４８位にわたる領域であることから、ＣＴ９９の細胞外ドメインとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６４９位〜第６９５位にわたる領域である。この細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６６８位のトレオニン及び第６６９位のプロリンからなるモチーフである。したがって、ＣＴ９９の細胞外ドメインに存在するトレオニン−プロリンモチーフのトレオニンとは、配列番号２のアミノ酸配列の第６６８位のトレオニンである。 In the present invention, phosphorylated threonine-containing CT99 refers to CT99 in which threonine of the threonine-proline motif present in the extracellular domain of CT99 is phosphorylated. Since the transmembrane domain of CT99 is a region extending from position 625 to position 648 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the extracellular domain of CT99 is position 649 to position 695 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is an area that spans. The threonine-proline motif present in this extracellular domain is a motif consisting of threonine at position 668 and proline at position 669 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Therefore, the threonine of the threonine-proline motif present in the extracellular domain of CT99 is the threonine at position 668 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
また、本発明でＡＰＰとは、配列番号１及び２に示した６９５個のアミノ酸からなるポリペプチドをいう（ＡＰＰ６９５、ｃＤＮＡはＮＣＢＩのアクセス番号Ａ３３２９２［ｇｉ：１５６７８５２］で示される）。このＡＰＰは、ヒト（H. sapiens）の脳で発現しているＡＰＰでは最も主要なスプライシングフォームである。なお、最長のＡＰＰは７７０アミノ酸からなるアミロイドベータＡ４である。 In the present invention, APP refers to a polypeptide consisting of 695 amino acids shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 (APP695, cDNA is represented by NCBI access number A33292 [gi: 1567852]). This APP is the most important splicing form of APP expressed in the human (H. sapiens) brain. The longest APP is amyloid beta A4 consisting of 770 amino acids.
試験化合物をリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及び／又はＰｉｎ１に接触させる条件は、特に制限されない。 Conditions for bringing the test compound into contact with phosphorylated threonine-containing CT99 and / or Pin1 are not particularly limited.
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされる試験化合物は、制限されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明のスクリーニングは、具体的には、これらの試験化合物又はこれらを含む試料をリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及び／又はＰｉｎ１と接触させることにより行われる。この試験材料は、特に制限されないが、試験化合物を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。 Test compounds to be screened by the screening method of the present invention are not limited, but include nucleic acids, peptides, proteins, organic compounds, inorganic compounds, and the screening of the present invention specifically includes these test compounds or these compounds. This is done by contacting the containing sample with phosphorylated threonine-containing CT99 and / or Pin1. The test material is not particularly limited, and examples thereof include cell extracts containing test compounds, gene library expression products, synthetic low-molecular compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.
試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する方法、試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する方法は、特に制限されることなく、タンパク質等の生体高分子の相互作用を分析するための当該技術分野において公知の方法であればいかなる方法をも用いることができる。 The method for determining whether a test compound inhibits the prolyl isomerase activity of Pin1 and the method for determining whether a test compound inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1 are particularly limited. Any method known in the art for analyzing the interaction of biopolymers such as proteins can be used.
本発明の一つの実施態様によれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させたＰｉｎ１を、適切な細胞内で発現させ、ＧＳＴ結合支持体を用いて複合物を回収する、いわゆるＧＳＴプルダウンアッセイを用いることができる。また、内在性のＰｉｎ１の影響を排除するためには、Ｐｉｎ１ノックアウトマウス（Fujimori F. et al., BBRC 265, 658-663(1999)）を用いることが好ましい。 According to one embodiment of the present invention, Pin1 fused with glutathione-S-transferase (GST) is expressed in appropriate cells and the so-called GST pulldown is used to recover the complex using a GST binding support. An assay can be used. In order to eliminate the influence of endogenous Pin1, it is preferable to use a Pin1 knockout mouse (Fujimori F. et al., BBRC 265, 658-663 (1999)).
また、本発明の別の実施態様によれば、ＤＮＡに転写因子が結合してタンパク質の合成が行われることを利用したいわゆる酵素ツーハイブリッド法を用いることもできる。例えば６６８位のトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９とＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質と、Ｐｉｎ１と転写活性化ドメインとの融合タンパク質を用いてレポーター遺伝子の発現を解析する。 In addition, according to another embodiment of the present invention, a so-called enzyme two-hybrid method can be used that utilizes the fact that a transcription factor binds to DNA to synthesize a protein. For example, the expression of the reporter gene is analyzed using a fusion protein of CT99 phosphorylated at 668 position and a DNA binding domain, and a fusion protein of Pin1 and a transcriptional activation domain.
また、本発明の別の実施態様によれば、バクテリオファージゲノムにＤＮＡを挿入し、ファージのキャプシドタンパク質に融合した目的のペプチド又はタンパク質をファージ分子の表面に呈示させ、標的タンパク質と他のタンパク質との相互作用を解析する、いわゆるファージディスプレイ法を用いることができる。例えば、組換えにより６６８位のトレオニンがリン酸化されたＣＴ９９を表面に表示させたファージを作製し、ＣＴ９９を表面に固定したプレートを用いてパニングさせることにより、両者の相互作用を解析することができる。 According to another embodiment of the present invention, the target peptide or protein fused with the capsid protein of the phage is inserted on the bacteriophage genome and displayed on the surface of the phage molecule. The so-called phage display method can be used to analyze the interaction of these. For example, the interaction between the two can be analyzed by preparing a phage displaying CT99 phosphorylated on threonine at position 668 on the surface and panning using a plate having CT99 immobilized on the surface. it can.
また、本発明の別の実施態様によれば、水晶発振子が基板上に吸着した質量に比例して共鳴振動数が減少することを利用した水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）を利用することもできる。ＱＣＭは、振動数変化から生体分子間相互作用を検出するものであり、ＡｆｆｉｎｉｘＱとして市販されている。例えば、ＣＴ９９またはＡＰＰのリン酸化（ｐ）６６８Ｔｈｒ−６６９Ｐｒｏの前後のアミノ酸を含む短いペプチド配列、例えばＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳをチップに固定化しておき、そこにＰｉｎ１またはＰｉｎ１のＷＷモチーフを含むリコンビナントタンパク質の結合を観察することができる。この結合反応を行うときに、あらかじめ化合物を入れておき、反応を阻害する化合物を探索することができる。 According to another embodiment of the present invention, it is also possible to use a crystal oscillator microbalance (QCM) that utilizes the fact that the resonance frequency decreases in proportion to the mass of the crystal oscillator adsorbed on the substrate. it can. QCM detects biomolecular interactions from frequency changes and is commercially available as AffinixQ. For example, a short peptide sequence containing amino acids before and after CT99 or APP phosphorylated (p) 668Thr-669Pro, for example, EVDAAVpTPEEHLLS, is immobilized on a chip, and binding of a recombinant protein containing Pin1 or Pin1 WW motif is observed there can do. When this binding reaction is performed, a compound can be put in advance and a compound that inhibits the reaction can be searched.
また、本発明には、光学現象である表面プラズモン共鳴を応用したアフィニティバイオセンサーであるビアコア（ビアコア）、蛍光ランタニドキレートによる時間分解蛍光技術(ワラック)と蛍光共鳴エネルギー転移技術を応用したＬＡＮＣＥ ＴＲ−ＦＲＥＴ（パーキンエルマー）、生体発光ドナー分子から蛍光アクセプター分子へのエネルギートランスファーに基づくＢＲＥＴ２（バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移アッセイ、パーキンエルマー）、シンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ）なども用いることができる。 The present invention also includes Biacore, which is an affinity biosensor applying surface plasmon resonance that is an optical phenomenon, time-resolved fluorescence technology (Wallac) using fluorescent lanthanide chelate, and LANCE TR-, which applies fluorescence resonance energy transfer technology. FRET (Perkin Elmer), BRET 2 (bioluminescence resonance energy transfer assay, Perkin Elmer) based on energy transfer from a bioluminescent donor molecule to a fluorescent acceptor molecule, scintillation proximity assay (SPA), and the like can also be used.
Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否か、又はリン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かの判断基準は、当該技術分野において慣用されている方法、例えば、５０％阻害（ＩＣ５０）の濃度が１０μＭ以下である化合物を選択する方法を用いることができる。この選択の過程では、ｐ値有意差検定等の統計学的検定方法を用いることができる。 Whether to inhibit the prolyl isomerase activity of Pin1 or whether to inhibit the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1 is determined by a method commonly used in the art, for example, 50% inhibition. A method of selecting a compound having a (IC50) concentration of 10 μM or less can be used. In this selection process, a statistical test method such as a p-value significant difference test can be used.
また、例えば、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳ結合チップへのＰｉｎ１の結合は、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドを添加することによって阻害されることから、このペプチド濃度の１０倍のモル数の化合物を添加して、このペプチドと同様の、Ｐｉｎ１のチップへの阻害が見られたら、その化合物を阻害活性がある化合物とみなすこともできる。 In addition, for example, since the binding of Pin1 to the EVDAAVpTPEELERS binding chip is inhibited by adding the EVDAAVpTPEEHLLS peptide, a compound having a molar number of 10 times the peptide concentration is added, and the same Pin1 as that of this peptide is added. Can be regarded as a compound having an inhibitory activity.
本発明のキットには、さらに、マイクロプレート、細胞培養用試薬、血清、ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドやリン酸化されたＣＴ９９およびその一部に対する抗体、ペプチド、アビジン、ビオチンなどを固定化したチップ、または表面に蛋白質や化合物を固定化できるようにしたチップ、プラスチック表面を被覆するために用いるスキンミルクやアルブミンなどの物質などを含むこともできる。 The kit of the present invention further comprises a microplate, a cell culture reagent, serum, a chip on which an antibody against EVDAAVpTPEEHLLS peptide or phosphorylated CT99 and a part thereof, a peptide, avidin, biotin or the like is immobilized, or a protein on the surface Or a chip that can immobilize a compound, or a substance such as skin milk or albumin used to coat a plastic surface.
また、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得られた、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質を含む医薬組成物にも関する。Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質としては、例えば、２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンが挙げられる。 The present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a substance that inhibits the prolyl isomerase activity of Pin1 obtained by the screening method of the present invention. Examples of substances that inhibit the prolyl isomerase activity of Pin1 include 2,7-dimethylbenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-1,3,6,8 (2H, 7H) -tetron, diethyl-1, 3,6,8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-2,7-diacetate, diethyl-1,3,8,10-tetrahydro-1, 3,8,10-tetraoxoanthra [2,1,9-def: 6,5,10-d'e'f '] diisoquinoline-2,9-diacetate, bis (1-piperidylthiocarbonyl) sulfide N-[(2-nitro-5-thienyl) methylidene] -2-thiazolylamine, 4,5-dichloro-2-methyl-4-3 (2H) -isothiazolone.
Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質は、ベータアミロイドの生成を阻害することから、ベータアミロイドに関連する疾患、例えば、アルツハイマー病の処置、例えば、予防や治療に有用である。 Since the substance that inhibits the prolyl isomerase activity of Pin1 inhibits the production of beta amyloid, it is useful for the treatment of diseases related to beta amyloid, such as Alzheimer's disease, such as prevention and treatment.
Ａβペプチドは、連続したタンパク質分解によってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から得られる。ＡＰＰは、最初にβセクレターゼであるＢＡＣＥによって触媒され膜に結合したカルボキシ末端のタンパク質分解断片（ＣＴ９９）を生じ、続いてプレセニリン依存ガンマ−セクレターゼで切断される。 Aβ peptides are obtained from amyloid precursor protein (APP) by sequential proteolysis. APP first produces a carboxy-terminal proteolytic fragment (CT99) catalyzed by BACE, a β-secretase, and is subsequently cleaved with presenilin-dependent gamma-secretase.
ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）でありホスホ（セリン又はトレオニン）−プロリンモチーフに高い親和性を示すＰｉｎ１は、ヒトのタウの２３１位のホスホトレオニンと相互に作用し、また、Ｐｉｎ１ノックアウトは、ＡＤに見られるのと同様のマウスタウの高リン酸化をもたらす。 Pin1 which is a peptidylprolyl cis / trans isomerase (PPlase) and shows high affinity for the phospho (serine or threonine) -proline motif interacts with phosphothreonine at position 231 in human tau, and the Pin1 knockout is , Resulting in hyperphosphorylation of mouse tau similar to that seen in AD.
また、ＡＰＰは、細胞質ドメインの６６８位のトレオニンに特有の（セリン／トレオニン）−プロリンモチーフを有する。そこで、リン酸化ｐ５３に対するＰｉｎ１の結合性試験について記載されたとおりに（Zheng, H., et al. Nature 419, 849-853(2002)、Zacchi, P., et al. Nature 419, 853-857(2002)）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｐｉｎ１プルダウンアッセイによってＰｉｎ１がＡＰＰと結合するかどうかを試験した。 APP also has a (serine / threonine) -proline motif characteristic of threonine at position 668 of the cytoplasmic domain. Therefore, as described for the binding test of Pin1 to phosphorylated p53 (Zheng, H., et al. Nature 419, 849-853 (2002), Zacchi, P., et al. Nature 419, 853-857 (2002)), glutathione S-transferase (GST) -Pin1 pull-down assay tested whether Pin1 binds to APP.
ＧＳＴ−Ｐｉｎ１を含むグルタチオンビーズをＣＯＳ７細胞で発現されたＡＰＰとインキュベーションした。 Glutathione beads containing GST-Pin1 were incubated with APP expressed in COS7 cells.
Ｐｉｎ１は、β切断カルボキシ末端断片であるＣＴ９９と結合したが、全長ＡＰＰとは結合しなかった。また、６６８位のトレオニンのバリンへの置換及びフォスファターゼによるＣＴ９９の処理によって、Ｐｉｎ１のＣＴ９９に対する結合性は、消滅した（図１）。 Pin1 bound to the β-cleaved carboxy terminal fragment CT99 but not to full-length APP. Moreover, the binding of Pin1 to CT99 disappeared by substitution of threonine at position 668 with valine and treatment of CT99 with phosphatase (FIG. 1).
Ｐｉｎ１は、タイプＩＶのＷＷドメイン及びＰＰｌａｓｅドメインからなる。３４位のトリプトファンのアラニンへの突然変異（Ｗ３４Ａ突然変異）によるＷＷ領域の破壊によって、Ｐｉｎ１がＣＴ９９と結合することができなくなったのに対し、ＰＰｌａｓｅドメインの活性中心でのＲ６８／６９Ａ突然変異は、Ｐｉｎ１結合性を変化させなかった（図１）。 Pin1 consists of a type IV WW domain and a PPlase domain. The destruction of the WW region by tryptophan at position 34 to alanine (W34A mutation) resulted in the inability of Pin1 to bind to CT99, whereas the R68 / 69A mutation in the active center of the PPlase domain Pin1 binding was not changed (FIG. 1).
ＡＰＰへのＰｉｎ１の結合は、ＡＰＰのタンパク質分解プロセスにＰｉｎ１が関与することを示唆する。 Binding of Pin1 to APP suggests that Pin1 is involved in the proteolytic process of APP.
Ｐｉｎ１及びＣＴ９９、又はＰｉｎ１及び全長ＡＰＰでトランスフェクションしたＰｉｎ１−／−マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培地中に分泌されるＡβ１−４０及びＡβ１−４２ペプチドを記載されているようにＥＩＡによって測定した（Suzuki N. et al., Science 264, 1336-1340 (1994)）。この測定にはアイ・ビー・エル社のキットなど市販のものを使用することも可能である。 Aβ1-40 and Aβ1-42 peptides secreted into the medium of Pin1 and CT99 or Pin1 and / or mouse embryonic fibroblasts (MEF) transfected with full length APP as measured by EIA as described (Suzuki N. et al., Science 264, 1336-1340 (1994)). For this measurement, a commercially available kit such as an IB kit can be used.
ＣＴ９９に加えてＰｉｎ１でトランスフェンクションされたＰｉｎ１−／−ＭＥＦは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の両者を産生し、そして両Ａβ種の量は、Ｐｉｎ１−／−ＭＥＦをＣＴ９９のみでトランスフェクションした場合と比べて多かった（図２）。 Pin1 − / − MEFs transfected with Pin1 in addition to CT99 produce both Aβ1-40 and Aβ1-42, and the amount of both Aβ species is transfected with Pin1 − / − MEF with CT99 alone. There were many compared with the case (FIG. 2).
ＣＴ９９の代わりに全長ＡＰＰでトランスフェクションしたＰｉｎ１−／−ＭＥＦにおいては、Ｐｉｎ１の共トランスフェクションの有無にかかわらずＡβ１−４０及びＡβ１−４２の量に有意差は認められなかった（図２）。特徴的なのは、Ａβ１−４０に対するＡβ１−４２の割合が著しく増加したことである（図２）。 In Pin1 − / − MEFs transfected with full-length APP instead of CT99, no significant difference was observed in the amounts of Aβ1-40 and Aβ1-42 regardless of the presence or absence of Pin1 cotransfection (FIG. 2). Characteristically, the ratio of Aβ1-42 to Aβ1-40 was significantly increased (FIG. 2).
このように、Ｐｉｎ１は、Ａβの全量のみならず、アミロイド原性であるＡβ１−４２の相対割合も増加させた。 Thus, Pin1 increased not only the total amount of Aβ, but also the relative proportion of Aβ1-42, which is amyloidogenic.
本研究は、Ｐｉｎ１が、β切断部位で切断された後のＡＰＰと相互作用すること、そして結果として生じるＡＰＰのＣ末端断片のガンマ切断を調節することを示した。これは、ＣＴ９９に対するＰｉｎ１の結合性がトレオニン６６８−プロリン結合の異性化によって立体配座的変化を誘導したためと推測される。 This study showed that Pin1 interacts with APP after being cleaved at the β-cleavage site and regulates the resulting gamma cleavage of the C-terminal fragment of APP. This is presumably because Pin1 binding to CT99 induced a conformational change by isomerization of the threonine 668-proline bond.
したがって、Ｐｉｎ１によるガンマ切断の調節は、変化したガンマセクレターゼ活性のためよりはむしろガンマセクレターゼに対するＡＰＰの変化した感受性が原因と考えられる。 Thus, regulation of gamma cleavage by Pin1 is thought to be due to the altered sensitivity of APP to gamma secretase rather than due to altered gamma secretase activity.
このように、アルツハイマー病におけるＰｉｎ１の関与は、タウの神経原線維変化に対する予防とＡβによる老人班の形成という対照的な２つの面によって比類なきほど複雑である。アルツハイマー病におけるＰｉｎ１関与についてのさらなる研究は、Ａβ病理とタウ病理との機能的なつながりのためのメカニズムへの見識を与えると思われる。 Thus, the involvement of Pin1 in Alzheimer's disease is incomparably complicated by two contrasting aspects: prevention of tau neurofibrillary tangles and formation of senile plaques by Aβ. Further research on Pin1 involvement in Alzheimer's disease appears to provide insights into the mechanism for the functional link between Aβ pathology and tau pathology.
Ｐｉｎ１、３４位のトリプトファンのアラニンへの突然変異（Ｗ３４Ａ突然変異）によるＷＷ領域の破壊をしたPin1、ＰＰｌａｓｅドメインの活性中心でのＲ６８／６９Ａ突然変異によるPPIase活性を失ったPin1と3種類のＧＳＴと融合したPin1タンパク質の調製法（図１で用いられたＰｉｎ１） Pin1, Pin1 in which tryptophan at position 34 is mutated to alanine (W34A mutation), Pin1 in which WW region is disrupted, Pin1 which has lost PPIase activity due to R68 / 69A mutation in the active center of PPase domain, and three types of GST For the preparation of Pin1 protein fused with the protein (Pin1 used in Fig. 1)
リコンビナントＰｉｎ１をZacchi, P. et al (2002) Nature, 419: 853-857及びZheng, H et al (2002) Nature, 419: 849-853に記載されたとおりに調製した。ｐＧＥＸ４Ｔ−Ｐｉｎ１を導入した大腸菌株を一晩培養し、１／１０量の培養液を新たな培地に加え、２時間培養した。１００mM ＩＰＴＧを添加して３７℃で３時間培養し、ＧＳＴ−Ｐｉｎ１融合タンパクの発現を誘導した。遠心（４℃、３，０００rpm、１０分間）して菌体を回収し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、菌体をソニケーションバッファー（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理（出力３、サイクル５０％、６分間）して菌体を破砕し、遠心（４℃、１５，０００rpm、１０分間）によって上清を回収した（粗抽出液）。得られた粗抽出液にソニケーションバッファーで平衡化したグルタチオンセファロースビーズ（Glutathion-Sepharose 4B［Pharmacia Biotech］）を加え、攪拌（４℃、２時間）した。ソニケーションバッファーでグルタチオンセファロースビーズを３回洗浄し、溶出緩衝液（１６mM還元型グルタチオン、５０mMＮａＣｌ、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ〔pH ８．０〕）で溶出した。得られた溶出液を１×ＰＢＳ（−）で透析し、ＧＳＴ−Ｐｉｎ１タンパク質を得た。 Recombinant Pin1 was prepared as described in Zacchi, P. et al (2002) Nature, 419: 853-857 and Zheng, H et al (2002) Nature, 419: 849-853. The Escherichia coli strain into which pGEX4T-Pin1 was introduced was cultured overnight, and 1/10 amount of the culture solution was added to a new medium, followed by culturing for 2 hours. 100 mM IPTG was added and cultured at 37 ° C. for 3 hours to induce expression of GST-Pin1 fusion protein. The cells are collected by centrifugation (4 ° C., 3,000 rpm, 10 minutes), washed with PBS (−), and then washed with sonication buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). 1 mM DTT). This suspension was sonicated (output 3, cycle 50%, 6 minutes) to disrupt the cells, and the supernatant was recovered by centrifugation (4 ° C., 15,000 rpm, 10 minutes) (crude extract) . Glutathione Sepharose beads (Glutathion-Sepharose 4B [Pharmacia Biotech]) equilibrated with sonication buffer were added to the resulting crude extract and stirred (4 ° C., 2 hours). The glutathione sepharose beads were washed 3 times with sonication buffer and eluted with elution buffer (16 mM reduced glutathione, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]). The obtained eluate was dialyzed against 1 × PBS (−) to obtain GST-Pin1 protein.
ウェスタンブロット（結合性試験）
２×１０６個のＣＯＳ７細胞またはを直径１０cmの組織培養ディッシュに播種し、２４時間培養した。
リポフェクトアミン（登録商標）（ギブコ）＋プラス試薬を用いて、ｐＣＴ９９（１０μg）をトランスフェクションした（ＤＮＡ比；ＡＰＰ：ＧＳＫ＝８：２）。ｐＣＴ９９は、ＰＣＲでクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）にＣＤ５シグナル配列を導入して作製した（参考；Farzan, S et al, (2000) PNAS, 17: 9712-9717）。またリン酸化を促進するために、ＧＳＫ３ｂキナーゼのｃＤＮＡをＰＣＲでクローニングしてｐｃＤＮＡ３．１に導入したものを同様にトランスフェクションした。この細胞をさらに４８時間培養した。
Western blot (binding test)
2 × 10 6 COS7 cells or 10 cm diameter tissue culture dishes were seeded and cultured for 24 hours.
PCT99 (10 μg) was transfected with Lipofectamine® (Gibco) + plus reagent (DNA ratio; APP: GSK = 8: 2). pCT99 was prepared by cloning by PCR and introducing a CD5 signal sequence into a pcDNA3.1 vector (Invitrogen) (reference; Farzan, S et al, (2000) PNAS, 17: 9712-9717). In order to promote phosphorylation, GSK3b kinase cDNA cloned by PCR and introduced into pcDNA3.1 was similarly transfected. The cells were further cultured for 48 hours.
細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、５００μlのＮＰ４０溶解バッファー（５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mMＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、５mMＥＤＴＡ、１mMＰＭＳＦ、２μg/mlアプロチニン、５０mMＮａＦ、２５mMβ−グリセロフォスフェート、１mMＮａ３ＶＯ４）を加え、氷浴上で３０分静置した。（ＣＩＰ処理するサンプルにはフォスファターゼインヒビターを加えなかった）。細胞を収集し、超音波処理（出力２．５、サイクル３０％、１０秒間）し、遠心（４℃、１５，０００rpm、３０分）し、得られた上清をサンプルとした（インプット用に一部回収した）。ＣＩＰ処理（ＤＮＡ末端の脱リン酸化）するサンプルには、３０ＵのＣＩＰ（仔牛小腸アルカリホスファターゼ、ニッポンジーン）を加え、インキュベーション（３７℃、１時間）した。 The cells were washed twice with PBS (−) and 500 μl of NP40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinin, 50 mM NaF, 25 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 ) was added, and the mixture was allowed to stand on an ice bath for 30 minutes. (No phosphatase inhibitor was added to samples treated with CIP). Cells were collected, sonicated (output 2.5, cycle 30%, 10 seconds), centrifuged (4 ° C., 15,000 rpm, 30 minutes), and the resulting supernatant was used as a sample (for input) Part of it was recovered). 30 U of CIP (calf intestine alkaline phosphatase, Nippon Gene) was added to the sample to be CIP treated (dephosphorylation of DNA ends) and incubated (37 ° C., 1 hour).
ＮＰ４０溶解バッファーで平衡化した（１サンプルあたり）１０μlのグルタチオンセファロースビーズと１０μgのＧＳＴ融合タンパク質をＮＰ４０溶解バッファーで５００μlにメスアップし、攪拌（４℃、１時間）した。
ＧＳＴ融合Ｐｉｎ１またはＰｉｎ１のＷＷまたはＰＰＩａｓｅドメインに変異を導入した変異Ｐｉｎ１を結合させたグルタチオンセファロースビーズを、１mlのＮＰ４０溶解バッファーで１回洗浄後（全ての遠心条件：４℃，２０００rpm，５分）、回収した細胞溶解物と混ぜて、４℃で１時間撹拌して反応させた。その後、１mlのＮＰ４０溶解バッファーで５回洗浄し、グルタチオンセファロースビーズに１０μlの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、一晩放置した。
10 μl of glutathione sepharose beads and 10 μg of GST fusion protein equilibrated with NP40 lysis buffer (per sample) were diluted to 500 μl with NP40 lysis buffer and stirred (4 ° C., 1 hour).
GST-fused Pin1 or glutathione sepharose beads to which mutant Pin1 having a mutation introduced into the WW or PPIase domain of Pin1 was bound were washed once with 1 ml of NP40 lysis buffer (all centrifugation conditions: 4 ° C., 2000 rpm, 5 minutes) The collected cell lysate was mixed and stirred at 4 ° C. for 1 hour to react. Thereafter, the plate was washed 5 times with 1 ml of NP40 lysis buffer, 10 μl of 2 × SDS sample buffer was added to glutathione sepharose beads, and left overnight.
サンプルを５分ボイルした後、ＳＤＳ電気泳動し、メンブランにトランスファー後（セミドライ：ＢｉｏＲａｄ）、ブロッキング液（３％スキムミルク−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ）で１時間以上ブロッキングした。所定のブロッキング液で希釈した１次抗体を加えて４℃で一晩反応させた。 The sample was boiled for 5 minutes, then subjected to SDS electrophoresis, transferred to a membrane (semi-dry: BioRad), and then blocked with a blocking solution (3% skim milk-0.1% Tween 20-TBS) for 1 hour or longer. A primary antibody diluted with a predetermined blocking solution was added and reacted overnight at 4 ° C.
ブロッキング液で３回洗浄後、ブロッキング液で希釈した２次抗体で、室温で１時間反応させた。ブロッキング液で３回、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ）で３回洗浄後、ＥＣＬで発色させ、ＬＡＳ３０００（富士フィルム）で解析した。試験結果を図１に示した。 After washing with the blocking solution three times, the reaction was performed at room temperature for 1 hour with the secondary antibody diluted with the blocking solution. After washing 3 times with blocking solution and 3 times with TBS-T (0.1% Tween20-TBS), the color was developed with ECL and analyzed with LAS3000 (Fuji Film). The test results are shown in FIG.
結合阻害剤のスクリーニング
Ｐｉｎ１−ＧＳＴ−ビーズと細胞溶解液を反応させるときに化合物を混入して、それが結合阻害をＰｉｎ１が結合していないＧＳＴ−ビースと同程度低下さえる化合物を選択した。
Screening for Binding Inhibitors Compounds were mixed when Pin1-GST-beads were allowed to react with cell lysates, which selected compounds that reduced binding inhibition to the same extent as GST-beads without Pin1 binding.
Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質のスクリーニング
基質としてＳｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡを用いて、ＭＣＡ蛍光の測定を行った。下記の反応は、コールドルーム中で９６穴マルチプレート内で行った。化合物（自家製化学物質ライブラリー）のＤＭＳＯ溶液１μl、アッセイバッファー（５０mMＨＥＰＥＳ、１００mMＮａＣｌ、pH７．０）６５μl、Ｐｉｎ１溶液１０μl（１１μg）及び６０mg/mlキモトリプシン０．００１ＮＨＣｌ溶液１０μlを用事に混合し、１００μg/ml基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ：日本ペプチド研究所）４８０mMＬｉＣｌを含むトリフルオロエタノール溶液５μlを加えた。この混合物を２０秒間反応させ、酢酸（１００％）／メタノール（１：１）１００μlを用いて反応を停止させ、次いで、蛍光マイクロプレートリーダー（マルチラベルカウンター１４２０；Ｗａｌｌａｃ）を用いてＭＣＡ蛍光（励起波長／発光波長＝３６５nm／４６０nm）を測定した。
Screening for Pin1 PPIase Activity Inhibitor MCA fluorescence was measured using Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-MCA as a substrate. The following reaction was performed in a 96-well multiplate in a cold room. 1 μl of compound (homemade chemical library) in DMSO, 65 μl of assay buffer (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0), 10 μl of Pin1 solution (11 μg) and 10 μl of 60 mg / ml chymotrypsin 0.001 NHCl solution were mixed thoroughly. 5 μl of trifluoroethanol solution containing 480 mM LiCl was added to ml substrate (Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-MCA: Japan Peptide Institute). The mixture is allowed to react for 20 seconds, quenched with 100 μl acetic acid (100%) / methanol (1: 1), and then MCA fluorescence (excitation) using a fluorescence microplate reader (Multilabel Counter 1420; Wallac). Wavelength / emission wavelength = 365 nm / 460 nm).
その結果、ＰｉＡ：２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ＰｉＢ：ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、及び、ＰｉＪ：ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテートが、Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質として検出され、ＩＣ５０は、それぞれ２．０、１．０、１．０μＭであった。 As a result, PiA: 2,7-dimethylbenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-1,3,6,8 (2H, 7H) -tetron, PiB: diethyl-1,3,6,8-tetrahydro- 1,3,6,8-tetraoxobenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-2,7-diacetate and PiJ: diethyl-1,3,8,10-tetrahydro-1,3,8, 10-tetraoxoanthra [2,1,9-def: 6,5,10-d'e'f '] diisoquinoline-2,9-diacetate was detected as a PPIase activity inhibitor of Pin1 and IC50 was , 2.0, 1.0 and 1.0 μM, respectively.
１．ＤＡＡＶｐＴＰＥペプチド−センサーセルの作成；ＡｆｆｉｎｉｘＱのセンサーセルを用いて相互作用実験をおこなった。まず、アビジンをＮ−エチル−Ｎ’−［（ジメチルアミノ）プロリル］カルボジイミドでセンサーセル表面に固定した。このセンサーセルに１２個の炭素鎖スペーサーとビオチンを末端に付加したＡＰＰ由来ペプチド、ビオチン−ＥＶＤＡＡＶｐＴＰＥＥＲＨＬＳペプチドをビオチン−アビジン結合で固定化した。 1. Creation of a DAAVpTPE peptide-sensor cell; Interaction experiments were performed using AffinixQ sensor cells. First, avidin was fixed to the sensor cell surface with N-ethyl-N ′-[(dimethylamino) prolyl] carbodiimide. In this sensor cell, 12 carbon chain spacers and biotin-EVDAAVpTPEEHLLS peptide, in which biotin is added at the end and biotin-EVDAAVpTPERHLS peptide, were immobilized with a biotin-avidin bond.
２．１で作製したＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドセンサーセルをＡｆｆｉｎｉｘＱ４にセットし、結合測定用緩衝液（１０mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、pH７．４、１５０mMＮａＣｌ、３mMＥＤＴＡ）と１／４０容量の４×ＡｆｆｉｎｉｘＱ用ブロッキングバッファーで満たした（全量４５０μl）。ここに、Ｐｉｎ１、Ｐｉｎ１（Ｗ３４Ａ突然変異）、Ｐｉｎ１（Ｒ６８，６９Ａ変異）−ＧＳＴ融合タンパク質（０．１μg/μl）を、１μl， ５μl， １０μlずつ順次添加した。また、同時にあらかじめＰｉｎ１をＶｐＴＰＥペプチド（１００ｕＭ）と１０分間混合しておいたものも同時に添加した。ＱＣＭの測定値がほぼ安定した１５分後に低下したＨｚを測定し、添加前後で低下した振動Ｈｚを計測した。結果を表１に示した。 The DAAVpTPE peptide sensor cell prepared in 2.1 was set in AffinixQ4 and filled with binding measurement buffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA) and 1/40 volume of 4 × AffinixQ blocking buffer ( Total volume 450 μl). Here, Pin1, Pin1 (W34A mutation), Pin1 (R68, 69A mutation) -GST fusion protein (0.1 μg / μl) were sequentially added in an amount of 1 μl, 5 μl, and 10 μl. At the same time, Pin1 previously mixed with VpTPE peptide (100 uM) for 10 minutes was also added. The Hz decreased after 15 minutes when the measured value of QCM was almost stabilized, and the vibration Hz decreased before and after the addition was measured. The results are shown in Table 1.
その結果、表１に見られるように野生型Ｐｉｎ１がＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドに結合することがＡｆｆｉｎｉｘＱによる実験で明らかになった。またこの結合がＰｉｎ１のＰＰＩａｓｅでなくてＷＷドメインで起こることもしめされた。この結果はウェスタンブロットの結果と整合した。また、このＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドとＰｉｎ１の結合は、より短いペプチド鎖である、ＶｐＴＰＥペプチドによって阻害された。この結果はＶｐＴＰＥがＣＴ９９とＰｉｎ１の結合を阻害することを示している。 As a result, as shown in Table 1, it was revealed by an experiment using AffinixQ that wild-type Pin1 binds to the DAAVpTPE peptide. It has also been shown that this binding occurs in the WW domain rather than in the Pin1 PPIase. This result was consistent with the Western blot results. In addition, the binding between the DAAVpTPE peptide and Pin1 was inhibited by the shorter peptide chain, VpTPE peptide. This result indicates that VpTPE inhibits the binding between CT99 and Pin1.
表１ ＤＡＡＶｐＴＰＥペプチドセンサーセル
減少した共鳴振動数（Ｈｚ）
タンパク質 Pin1 Pin1W34A Pin1R68,69A Pin1+VpTPEペプチド
１ １２０ ３０ １０３ ４０
５ ２５０ ３４ ２４３ ５３
１０ ６５０ ６０ ６６３ １００
１５ １３００ １００ １１１３ ２５０
Table 1. DAAVpTPE peptide sensor cell reduced resonance frequency (Hz)
Protein Pin1 Pin1W34A Pin1R68,69A Pin1 + VpTPE peptide 1 120 30 103 40
5 250 34 243 53
10 650 60 663 100
15 1300 100 1113 250
Ｐｉｎ１のＰＰＩａｓｅ活性阻害物質、ＰｉＡ：２，７−ジメチルベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−１，３，６，８（２Ｈ，７Ｈ）−テトロン、ＰｉＢ：ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］［３，８］フェナントロリン−２，７−ジアセテート、ＰｉＪ：ジエチル−１，３，８，１０−テトラヒドロ−１，３，８，１０−テトラオキソアントラ［２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’］ジイソキノリン−２，９−ジアセテート、ＰｉＴ：ビス（１−ピペリジルチオカルボニル）スルフィド、ＰｉＵ：Ｎ−［（２−ニトロ−５−チエニル）メチリデン］−２−チアゾリルアミン、ＰｉＺ：４，５−ジクロロ−２−メチル−４−３（２Ｈ）−イソチアゾロンをＤＭＳＯに溶解して、各化合物を各最終濃度 １．０ ｍｉｃｒｏＭになるように培地に混入して、Ａβ４０およびＡβ４２を００３５−３７に記載したＥＩＡ法で定量し、低下率を調べた（表２）。表２に示したようにこれらのＰｉｎ１ＰＰＩａｓｅ阻害剤は、Ａβ４０およびＡβ４２の産生を低下させた。 Pin1 PPIase activity inhibitor, PiA: 2,7-dimethylbenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-1,3,6,8 (2H, 7H) -tetron, PiB: diethyl-1,3,6 8-tetrahydro-1,3,6,8-tetraoxobenzo [lmn] [3,8] phenanthroline-2,7-diacetate, PiJ: diethyl-1,3,8,10-tetrahydro-1,3 8,10-tetraoxoanthra [2,1,9-def: 6,5,10-d'e'f '] diisoquinoline-2,9-diacetate, PiT: bis (1-piperidylthiocarbonyl) sulfide PiU: N-[(2-nitro-5-thienyl) methylidene] -2-thiazolylamine, PiZ: 4,5-dichloro-2-methyl-4-3 (2H) -isothiazolone. Dissolved in MSO, each compound was mixed in the medium to a final concentration of 1.0 microM, and Aβ40 and Aβ42 were quantified by the EIA method described in 0035-37, and the reduction rate was examined (Table 2). ). As shown in Table 2, these Pin1 PPIase inhibitors reduced the production of Aβ40 and Aβ42.
表２ Ｐｉｎ１ＰＰＩａｓｅ阻害剤によるＡβ４０およびＡβ４２の産生低下
阻害剤 コントロール PiA PiB PiJ PiT PiU PiZ
Ａβ４０ １００ ９０ ７５ ８７ ９７ ８０ ８０
Ａβ４２ １００ ８７ ７０ ８０ ９０ ７４ ７７
Table 2 Inhibitors of Aβ40 and Aβ42 production reduction by Pin1 PPIase inhibitors Control PiA PiB PiJ PiT PiU PiZ
Aβ40 100 90 75 87 87 97 80 80
Aβ42 100 87 70 80 90 74 77
本発明は、アルツハイマー病の予防又は処置に有用な物質をスクリーニングするために有用である。 The present invention is useful for screening substances useful for the prevention or treatment of Alzheimer's disease.
Claims (5)
（１）試験化合物をＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害するか否かを決定する工程
を含む、Ｐｉｎ１のプロリルイソメラーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。 The following process:
A substance that inhibits Pin1's prolyl isomerase activity, comprising: (1) contacting a test compound with Pin1; and (2) determining whether the test compound inhibits Pin1's prolyl isomerase activity. How to screen.
（１）試験化合物を、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９及びＰｉｎ１に接触させる工程、及び
（２）試験化合物が、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害するか否かを決定する工程
を含む、リン酸化トレオニン含有ＣＴ９９とＰｉｎ１との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法。 The following process:
(1) contacting the test compound with phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1, and (2) determining whether the test compound inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1. A method for screening for a substance that inhibits the binding between phosphorylated threonine-containing CT99 and Pin1.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008540571A (en) * | 2005-05-12 | 2008-11-20 | ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション | Pin1 blockade prevents cytokine production by activated immune cells |
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