JP2005189237A - 光学的測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料中に含まれる測定対象物質となるタンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類等の有機化合物等を高感度かつ高精度で測定することができる光学的測定方法を提供する。
【解決手段】 基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により、前記基板の表面に固定された蛍光物質を励起し、発生した蛍光の強度を直接測定する光学的測定方法であって、蛍光物質が半導体ナノ粒子からなる光学的測定方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、試料中に含まれる測定対象物質となるタンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類等の有機化合物等を高感度かつ高精度で測定することができる光学的測定方法に関する。

近年、生体内に含まれるタンパク質、核酸等の生体関連物質を高感度に測定する方法として、マーカー物質として蛍光物質を結合させ、該蛍光物質に励起光を照射することにより発せられる蛍光の強度を測定する方法が多用されている。

このような蛍光物質を利用した光学的測定方法としては、例えば、特許文献１に、光導波路に励起光を入射し、励起光を全反射させながら光導波路中を伝播させることにより生じるエバネッセント波を用いて、抗原抗体反応等により光導波路表面に固定された蛍光物質を励起し、生じた蛍光を光導波路中を伝播させて出射させ、出射した蛍光の強度を測定する方法が開示されている。この方法によれば、発生した微弱な蛍光を光導波路で増幅することにより比較的高感度な測定が可能となる。しかしながら、特許文献１では６５０ｎｍ近傍に吸収のピークがある蛍光物質を用い、６３５ｎｍ付近の励起光を用いているものの、励起光と蛍光との波長差（ストークスシフト）が充分とはいえず、充分な測定感度や測定精度を得ることはできなかった。また、測定毎に光導波路を洗浄する必要があり複数の物質を連続的に測定することができないという問題もあった。

これに対して特許文献２には、光導波路に励起光を入射し、励起光を全反射させながら光導波路中を伝播させることにより生じるエバネッセント波を用いて試料中の蛍光染料を励起し、生じた蛍光の強度を直接測定する方法が開示されている。即ち、この方法では、特許文献１に記載の方法のように蛍光を光導波路中を伝播させて出射させて測定するのではなく、光導波路の表面において生じた蛍光を直接測定する。この方法によれば、光導波路の表面を種々のサブセクションに分けて、それぞれのサブセクションにおいて蛍光染料を励起させることにより、複数の試料を連続的に測定することが可能となる。しかしながら、この方法では光導波路による増幅がないことから充分な蛍光強度が得られないことに加え、励起光と蛍光との波長差（ストークスシフト）の問題も解決されておらず、高い測定感度と測定精度とを得ることはできなかった。また、蛍光染料を用いることから、試料中の共存物質によっては蛍光強度が低くなったり、短時間で減衰したりするという問題もあった。

特許第３３６２２０６号公報 特許第３１８７３８６号公報

本発明は、上記現状に鑑み、試料中に含まれる測定対象物質となるタンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類等の有機化合物等を高感度かつ高精度で測定することができる光学的測定方法を提供することを目的とする。

本発明は、基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により、前記基板の表面に固定された蛍光物質を励起し、発生した蛍光の強度を直接測定する光学的測定方法であって、蛍光物質が半導体ナノ粒子からなる光学的測定方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、鋭意検討の結果、蛍光物質として半導体ナノ粒子を用いれば、極めて高い強度の蛍光が発せられ、かつ、励起光と蛍光との波長差（ストークスシフト）を充分にとることができることから、エバネッセント波により励起されて基板表面に発せられた蛍光の強度を直接測定する場合であっても、高い測定感度と測定精度とが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
なお、本明細書において蛍光の強度を直接測定するとは、蛍光を基板中を伝播させて出射させて測定するのではなく、生じた蛍光の強度自体をそのまま測定することを意味する。

本発明の光学的測定方法では、基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により基板の表面近傍に固定された蛍光物質を励起し、生じる蛍光の強度を直接測定する。このように基板の表面において生じた蛍光を直接測定する方法であれば、基板の表面を種々のサブセクションに分けて、それぞれのサブセクションにおいて蛍光物質を励起させることにより、複数の試料を連続的に測定することが可能となる。

上記基板としては、レーザ光を全反射できるものであれば特に限定されないが、例えば、樹脂プレート又はガラスプレート等が好適である。なかでも、光導波路は、レーザ光の反射に極めて優れ、レーザ光が光導波路中を伝播することから、１つの光導波路上で種々の測定をすることができ好ましい。
上記ガラスプレートを構成するガラスとしては特に限定されないが、例えば、石英ガラス等が好適である。
上記樹脂プレートを構成する樹脂としては特に限定されないが、例えば、アクリル樹脂、ポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等が好適である。なかでも、励起光の吸収がないものを選択することが好ましい。

上記基板の厚さとしては特に限定されないが、好ましい下限は５μｍ、好ましい上限は１０００μｍであり、より好ましい下限は１０μｍ、より好ましい上限は１５０μｍである。

上記励起光の光源としては、例えば、単色のレーザや発光ダイオード等を用いることができる。
このような励起光を上記基板の端部から一定の角度で入射すれば、入射した励起光は全反射し、上記基板が光導波路である場合には光導波路中を伝播する。この基板中で励起光が全反射する際に、反射部においてエバネッセント波が生じ、基板の表面に染み出す。そして、基板の表面に蛍光物質が固定されている場合には、該蛍光物質がエバネッセント波により励起され、蛍光を発する。

本発明の光学的測定方法においては、蛍光物質として半導体ナノ粒子を用いる。
本明細書において半導体ナノ粒子とは、ＣｄＳ、ＺｎＳ、ＣｄＳｃ等の半導体材料を粒子径がナノメートルオーダーの微粒子にしたものを意味する。
半導体ナノ粒子は、粒子径が約１０ｎｍ以下になると、光励起によって蛍光を発する性質を有する。半導体ナノ粒子を励起するために必要な波長は紫外側にブロードに存在し、その粒子径が大きいほど、励起スペクトルの長波長端は長波長側にシフトする。また、蛍光波長も半導体ナノ粒子の粒子径が大きくなるに従って長波長側にシフトする。このように、半導体ナノ粒子は、粒子径により蛍光波長や励起光波長が変わるという特徴を有する。従って、粒子径の異なる半導体ナノ粒子に異なる反応物を結合することにより、同時に複数の対象物を測定することが可能になる。

上記半導体ナノ粒子は、励起光を照射することによって極めて高輝度の蛍光を発することから、微量成分の高感度測定に好適に用いることができる。また、粒子径により励起光波長と蛍光波長とを調整できることから、励起光と蛍光との波長差（ストークスシフト）を充分にとることも可能である。

本発明において用いる半導体ナノ粒子としては、例えば、ＣｕＣｌ等のＩ−ＶＩＩ 族化合物半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ等のＩＩ−ＶＩ族、ＩｎＡｓ等のＩＩＩ−Ｖ族化合物半導体、ＩＶ族半導体等の半導体結晶、ＴｉＯ_２等の金属酸化物、フタロシアニン、アゾ化合物等の有機化合物からなるもの、またはそれらの複合材料等が挙げられる。このような複合材料としては、例えば、ＣｄＳをコア−ＣｄＳｅをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＣｄＳをシェル、ＣｄＳをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅをコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳをシェル、ＣｄＳｅのナノ結晶をコア−ＺｎＳｅをシェル、Ｓｉをコア−ＳｉＯ_２をシェルとするコア−シェル構造を有するもの等が挙げられる。

また、上記半導体ナノ粒子を水溶液中に分散安定化させるために、半導体ナノ粒子の表面をコートする種々の分散剤を使用することができる。
このような分散剤としては、例えば、半導体ナノ粒子への結合基として、チオール、アミン、ホスフィン又はホスフィンオキシド等を有し、水溶液中への分散と抗体又は抗原等の標識のため、最外層にカルボキシレート類、アミン類、水酸化物、ポリエチレングリコール及び他のポリオール類、スルホネート、ホスフェート及びホスホネート等を形成するもの等が挙げられる。

上記半導体ナノ粒子の粒子径の好ましい下限は３ｎｍ、上限は１０ｎｍである。
上記半導体ナノ粒子の形状としては特に限定されず、例えば、球状、棒状、板状、薄膜状、繊維状、チューブ状等が挙げられる。なかでも、球状が好ましい。

本発明の光学的測定方法では、上記半導体ナノ粒子からなる蛍光物質を励起し、生じる蛍光の強度を直接測定する。
蛍光強度を測定する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。なかでも、１分子蛍光画像アナライザー法は、上記半導体ナノ粒子の粒子径がナノメートルオーダーであり発光強度も高いことから、１分子レベルで高感度に測定することが可能となり特に好適である。

本発明の光学的測定方法では、２種類以上の測定対象物質を同時に測定することが可能である。２種類以上の試料の同時測定としては、試料中に２種以上の測定対象物質が混合している試料を測定する場合や、基板上の複数箇所に分けられたそれぞれ単独で存在する測定対象物質を１回の測定で実施する場合等が挙げられる。上記２種以上の測定対象物を検出する方法としては特に限定されず、例えば、上述したように、本発明の光学的測定方法では、基板として用いる光導波路の表面を種々のサブセクションに分けたり、粒子径の異なる複数の半導体ナノ粒子を併用したりすることにより、複数の試料を連続的に測定することが可能となる。
また、上記測定において検出光から各試料中に含まれる測定対象物質の濃度を測定する方法としては特に限定されず、例えば、プリズム分光等を利用して検出光を単一光に分光することにより測定可能となる。

次に、本発明の光学的測定方法を用いて、試料中に含まれる有機化合物等を測定する具体的な方法の一実施態様を詳しく説明する。本実施態様では、分子認識物質として抗体を用い、抗原抗体反応を利用して試料中に含まれる特定のタンパク質の濃度を測定する。

本実施態様では、まず、測定対象とするタンパク質に対応する抗体を調製し、これを分子認識物質として用いる。上記抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、又は、モノクローナル抗体が挙げられ、これらはいずれも好適に用いることができる。
上記抗体は、例えば、測定対象とするタンパク質で免役した免疫マウスの脾臓から得られた脾細胞を抗体産生細胞と細胞融合し、この融合細胞を培養することにより調製することができる。

このようにして調製した抗体を、基板の表面に被覆する。被覆の方法としては特に限定されないが、例えば、基板の表面に抗体溶液を滴下し、所定時間一定の温度で静置し、緩衝液で洗浄後、血清アルブミン（ＢＳＡ）等を加えて固定する方法等が挙げられる。

一方、別に分子認識物質である抗体と蛍光物質である半導体ナノ粒子とを結合させて、分子認識蛍光物質を作製する。なお、基板上に被覆する抗体と分子認識物質として用いる抗体とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
抗体と半導体ナノ粒子とを結合させる方法としては特に限定されないが、例えば、半導体ナノ粒子の表面をコートした分散剤の官能基を介し、アビジンを更にコートすることで半導体ナノ粒子−アビジンの複合体を調製し、一方、抗体とビオチンとを結合した抗体−ビオチン複合体を調製する。得られた半導体ナノ粒子−アビジン複合体と抗体−ビオチン複合体とは、アルブミンを介して容易に結合することができる。
このようにアビジン−アルブミン−ビオチンを介して半導体ナノ粒子と分子認識物質とを複合化する方法は、抗体等のタンパク質のみならずＤＮＡ等の核酸をはじめ多くの有機化合物と半導体ナノ粒子との複合化に用いることができる。

試料中の測定対象物質であるタンパク質を測定するには、まず、試料と上記分子認識蛍光物質とを混合する。これにより、抗原抗体反応によって試料中のタンパク質が特異的に分子認識蛍光物質中の抗体と結合する。
次いで、抗体で被覆した基板の表面に上記混合液を滴下すれば、抗原抗体反応によりタンパク質と基板表面の抗体とが結合する。このようにして、基板の表面に試料中のタンパク質の量に応じた半導体ナノ粒子が固定される。あるいは、基板の表面に抗原を固定した後、抗体を標識した半導体ナノ粒子を滴下することで、基板の表面に固定した抗原量に応じて半導体ナノ粒子が固定される。
この状態で基板の端部から全反射する角度で励起光を入射し、エバネッセント波を生じさせれば、このエバネッセント波により基板の表面の半導体ナノ粒子から蛍光が発せられる。
予め既知のタンパク質濃度の試料を測定して検量線を作製しておけば、未知の試料中に含まれるタンパク質の量を測定することができる。
なお、試料を抗体で被覆した基板の表面に滴下して抗原抗体反応により試料中のタンパク質と基板表面の抗体とを結合しておき、この基板表面に上記分子認識蛍光物質を滴下することで、抗原抗体反応によって基板表面に結合した試料中のタンパク質と特異的に分子認識蛍光物質中の抗体とを結合させ、基板表面に試料中のタンパク質の量に応じた半導体ナノ粒子を固定してもよい。

本実施態様において、上記基板表面及び／又は半導体ナノ粒子に固定する抗体は、Ｆｃ部分を切除した抗体フラグメントであることが好ましい。エバネッセント波による基板表面の半導体ナノ粒子から発せられる蛍光の強度は、基板表面と半導体ナノ粒子との距離が大きくなると減衰するため、上記基板表面及び／又は半導体ナノ粒子に固定する抗体を上記抗体フラグメントとすることで、基板表面と半導体ナノ粒子との距離が縮まり、エバネッセント波による半導体ナノ粒子から発せられる蛍光がより高強度となる。
このような抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦａｂであることが好適である。

上記Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントを作製する方法としては、例えば、試料がヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）である場合、試料を溶解させた溶液とペプシン固定化ゲル溶液とを混合し、インキュベートした後、プロテインＡ固定化ゲル等を用いてＦ（ａｂ’）_２を分離する方法等が挙げられる。
また、上記ＡＦＰのＦａｂ抗体フラグメントを作製する方法としては、例えば、試料を溶解させた溶液とシステイン・ＨＣｌ溶液とを混合して調製した混合液に、システイン・ＨＣｌ溶液中にパパイン固定化ゲル（架橋アガロース）を平衡化したパパイン固定化ゲル溶液を加えてインキュベートした後、プロテインＡ固定化ゲル等を用いてＦａｂを分離する方法等が挙げられる。

本実施態様においては、基板の表面に半導体ナノ粒子を固定する方法として抗原抗体反応を利用したが、その他にも核酸間のハイブリッド形成反応等、特異的な結合反応であれば利用することができる。本発明の光学的測定方法により、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその凝滞体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類及びその他の有機化合物等を分析することができる。

本実施態様により試料中に含まれるタンパク質等を測定する場合、基板は測定対象物質であるタンパク質等により被覆されており、そのタンパク質に分子認識蛍光物質が結合することによって、基板の表面に蛍光物質が固定される。従って、基板と蛍光物質の間には測定対象であるタンパク質からなる被覆層が存在し、場合によってはその被覆層の厚さが数十ｎｍ程度になることもある。得られる蛍光強度は、基板と蛍光物質との間の距離に影響されることから、被覆層によりその距離が数十ｎｍ程度になる場合には、充分な蛍光強度が得られないことがある。
このような場合には、基板の表面に固定された蛍光物質上に、蛍光物質に接するように別の基板を置き、該別の基板内に励起光を入射し内部反射させる。該別の基板と蛍光物質とは極めて距離が近いことから、該別の基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により蛍光物質が励起して高強度の蛍光が発生し、これを直接測定することにより極めて感度の高い測定が可能になる。
第１の基板の表面に固定された蛍光物質上に第２の基板を置き、上記第２の基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により、上記第１の基板の表面に固定された蛍光物質を励起し、発生した蛍光の強度を直接測定する光学的測定方法であって、蛍光物質が半導体ナノ粒子からなる光学的測定方法もまた、本発明の１つである。

本発明によれば、試料中に含まれる測定対象物質となるタンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類等の有機化合物等を高感度かつ高精度で測定することができる光学的測定方法を提供できる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（１）ヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）に対するモノクローナル抗体の作製
ＡＦＰをフロイントコンプリートアジュバントに充分に分散した分散液を調製し、この分散液１００μＬを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに４回免疫した。
得られた免疫マウスの脾臓を摘出し、消化して１０^６個の脾細胞を得た。得られた脾細胞をマウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールの存在下で融合させた融合細胞を作製し、培養した。増殖した各融合細胞の上清を採取しＥＬＩＳＡ法により抗ＡＦＰ抗体の有無を調べた。ＡＦＰ陽性の細胞を限界稀釈法により試験し、抗ＡＦＰ抗体を産生している細胞を確認した。抗ＡＦＰ抗体産生細胞を大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後より３日おきに腹水を採取し、ＡＦＰの認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）である、抗ＡＦＰ−１抗体と抗ＡＦＰ−２抗体とを得た。

（２）ビオチン化抗ＡＦＰ抗体−１の調製
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）に抗ＡＦＰ抗体−１を溶解して０．３ｍｇ／ｍＬの溶液を５００μＬ調製した。
得られた抗ＡＦＰ抗体−１溶液にビオチン化試薬（２０ｍＭ Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏｃａｐａｔｅ−ＮＨＳ、ナカライテクタスク社製）を１０μＬ添加して混合後、２５℃にて２時間インキュベーションした。次いで、これをリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムファルマシア社製）を用いて、未反応のビオチン化試薬を除去し、精製して、ビオチン化抗ＡＦＰ抗体−１を得た。

（３）抗ＡＦＰ抗体−１固定半導体ナノ粒子の調製
半導体ナノ粒子（Ｑｄｂｔ６０５ストレプトアビジンコンジュゲート、コア部：ＣｄＳｃ、シェル部：ＺｎＳ、粒子径１０〜１５ｎｍ、Ｑｄｏｔ社製）を、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）で１０倍に稀釈した。
得られた半導体ナノ粒子分散液５００μＬと、ビオチン化抗ＡＦＰ抗体−１溶液１ｍＬとを混合し、室温で３時間静置した。次に、この混合液を２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムファルマシア社製）を用いて、未固定のビオチン化抗ＡＦＰ抗体−１を除去し、精製して抗ＡＦＰ抗体−１固定半導体ナノ粒子分散液を得た。

（４）基板の被覆
基板として厚さ１００μｍのアクリル樹脂からなる光導波路を用いた。光導波路を３０％エタノールに３分間浸漬後、蒸留水で洗浄した。
抗ＡＦＰ−２抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し抗ＡＦＰ−２抗体溶液を調製した。得られた抗ＡＦＰ−２抗体溶液中に光導波路を浸漬し、３０℃、１時間攪拌した。光導波路を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に浸して洗浄した後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）中に浸漬し、３０℃、１時間静置した後、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で表面を洗浄して、抗ＡＦＰ−２抗体被覆光導波路を作製した。
得られた抗ＡＦＰ−２抗体被覆光導波路は、使用するまで、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）中に４℃で保存した。

（５）検量線の作製
ＡＦＰをリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解して、０．５、２、５及び１０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製した。
各々の濃度のＡＦＰ溶液１０μＬと、抗ＡＦＰ抗体−１固定半導体ナノ粒子分散液１００μＬを混合した後、この混合液を抗ＡＦＰ−１抗体被覆光導波路の表面に滴下した。
この抗ＡＦＰ−１抗体被覆光導波路に、波長５３０ｎｍのレーザ光を全反射する角度で側面からレンズを介して入射し、混合液を滴下した部分にエバネッセンス波を発生させた。この結果発生した波長６１０ｎｍ近傍の蛍光をＣＣＤカメラで検出し、その蛍光強度を測定した。
結果を表１に示した。
また、表１に示した結果をもとに検量線を作製した。これを図１に示した。

（実施例２）
ヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のサンプルＩｇＧ溶液を、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に透析し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整してサンプル溶液を調製した。
０．５ｍＬの緩衝液（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）中に０．１２５ｍＬのペプシン固定化ゲル（架橋アガロース）を平衡化してペプシン固定化ゲル溶液を調製した。
調製したサンプル溶液１ｍＬをペプシン固定化ゲル溶液中に入れ、３７℃、４時間、振倒機でインキュベートした。
その後、遠心分離により、ペプシン固定化ゲルとＩｇＧ及びその分解物（Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２）を分離し、更に、プロテインＡ固定化ゲルを用いてＡＦＰに対するＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントのみを分離した。

抗ＡＦＰ抗体−１及び抗ＡＦＰ抗体−２に代えて、得られたＡＦＰに対するＦ（ａｂ’）_２抗体フラグメントを用いた以外は、実施例１と同様にしてビオチン化抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体、抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体固定半導体ナノ粒子を調製し、更に、抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）素抗体被覆光導波路を作製した。
得られた抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体被覆光導波路は、使用するまで、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）中に４℃で保存した。

（蛍光強度の測定）
ＡＦＰをリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解して、０．５、２、５及び１０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製した。
各々の濃度のＡＦＰ溶液１０μＬと、抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体固定半導体ナノ粒子分散液１００μＬを混合した後、この混合液を抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体被覆光導波路の表面に滴下した。
この抗ＡＦＰ（Ｆ（ａｂ’）_２）抗体被覆光導波路に、波長５３０ｎｍのレーザ光を全反射する角度で側面からレンズを介して入射し、混合液を滴下した部分にエバネッセンス波を発生させた。この結果発生した波長６１０ｎｍ近傍の蛍光をＣＣＤカメラで検出し、その蛍光強度を測定した。
その結果、蛍光強度は、実施例１に比べて約５０％増加した。

（実施例３）
ヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のサンプルＩｇＧ溶液を、１０ｍＭＥＤＴＡ含有２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）に透析し、ＩｇＧ濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整し、更に、システイン・ＨＣｌ溶液を２０ｍＭとなるように添加してサンプル溶液を調製した。
２０ｍＭのシステイン・ＨＣｌ溶液中にパパイン固定化ゲル（架橋アガロース）を平衡化してパパイン固定化ゲル溶液を調製した。
調製したパパイン固定化ゲル溶液にサンプル溶液を加え、３７℃、５時間から一晩振倒機でインキュベートした。
その後、遠心分離により、パパイン固定化ゲルとＩｇＧ及びその分解物（Ｆｃ、Ｆａｂ）を分離し、上澄みに１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を添加し、更に、プロテインＡ固定化ゲルを用いてＡＦＰに対するＦａｂ抗体フラグメントのみを分離した。

抗ＡＦＰ抗体−１及び抗ＡＦＰ抗体−２に代えて、得られたＡＦＰに対するＦａｂ抗体フラグメントを用いた以外は、実施例１と同様にしてビオチン化抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体、抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）固定半導体ナノ粒子を調製し、更に、抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体被覆光導波路を作製した。
得られた抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体被覆光導波路は、使用するまで、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）中に４℃で保存した。

（蛍光強度の測定）
ＡＦＰをリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解して、０．５、２、５及び１０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製した。
各々の濃度のＡＦＰ溶液１０μＬと、抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体固定半導体ナノ粒子分散液１００μＬを混合した後、この混合液を抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体被覆光導波路の表面に滴下した。
この抗ＡＦＰ（Ｆａｂ）抗体被覆光導波路に、波長５３０ｎｍのレーザ光を全反射する角度で側面からレンズを介して入射し、混合液を滴下した部分にエバネッセンス波を発生させた。この結果発生した波長６１０ｎｍ近傍の蛍光をＣＣＤカメラで検出し、その蛍光強度を測定した。
その結果、蛍光強度は、実施例１に比べて約５０％増加した。

（実施例４）
（１）抗体固定半導体ナノ粒子分散溶液の調製
ＣｄＳをコア、ＺｎＳをシェルとした粒径の異なる２種類の半導体ナノ粒子を、粒子分散剤としてメルカプトウンデカン酸を用いてリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に分散させ、１−エチル−３（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド架橋試薬（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＥＤＣ，Ｐｉｅｒｃｅ））用いてシステインを結合させた。更に、スクシイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレイト（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）用いて、５２０ｎｍに発光波長のピークを有する半導体ナノ粒子（ＱＤ５２０）には、人由来の抗ジフテリア毒素抗体、６４０ｎｍに発光波長のピークを有する半導体ナノ粒子（ＱＤ６４０）には、ウサギ由来の抗破傷風毒素抗体をそれぞれの抗体量がリン酸緩衝液に対し１μｇ／１００μＬとなるように結合させた。

（２）１分子蛍光画像アナライザーによる蛍光強度の２項目同時測定
カバーグラス上に所定濃度のジフテリア毒素と破傷風毒素との混合溶液を１００μＬ滴下し、その上に調製した抗体固定半導体ナノ粒子溶液１００μＬを滴下した。
これをコンデンサ型全反射蛍光顕微鏡システムＢＸ２Ｗ１−ＴＩＲＦＭ（オリンパス社製）を用いてジフテリア毒素と破傷風毒素との２項目同時測定を行った。
なお、カバーガラス上に滴下するジフテリア毒素と破傷風毒素との混合溶液の濃度比（ジフテリア毒素（ｎｇ／ｍＬ）：破傷風毒素（ｎｇ／ｍＬ））は、それぞれ（１００：１００）、（１００：１０）、（１０：１００）、（１０：１０）、（１：１０）、（１０：１）、（１：１）、（０：０）となるように調整し、それぞれについて、５μｍ×５μｍの視野で蛍光数をカウントし、蛍光強度の平均値と標準偏差とを測定した。
その結果を図２及び表２に示した。なお、図２中、上段の写真は、ジフテリア毒素の１分子蛍光同時検出の様子を示し、下段の写真は、破傷風毒素の１分子蛍光同時検出の様子を示し、各写真の下の数値は、蛍光強度の平均値と標準偏差とを示す。

本発明によれば、試料中に含まれる測定対象物質となるタンパク質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類等の有機化合物等を高感度かつ高精度で測定することができる光学的測定方法を提供できる。

実施例１で作製したＡＦＰ濃度の検量線である。 実施例４で測定した１分子蛍光画像アナライザーによる蛍光強度の測定結果である。 実施例４で測定した１分子蛍光画像アナライザーによる蛍光強度の測定結果である。

Claims (8)

1. 基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により、前記基板の表面に固定された蛍光物質を励起し、発生した蛍光の強度を直接測定する光学的測定方法であって、蛍光物質が半導体ナノ粒子からなることを特徴とする光学的測定方法。
2. 第１の基板の表面に固定された蛍光物質上に第２の基板を置き、前記第２の基板内に励起光を入射し内部反射させることにより生じるエバネッセント波により、前記第１の基板の表面に固定された蛍光物質を励起し、発生した蛍光の強度を直接測定する光学的測定方法であって、蛍光物質が半導体ナノ粒子からなることを特徴とする光学的測定方法。
3. ２種類以上の測定対象物質を同時に測定することを特徴とする請求項１又は２記載の光学的測定方法。
4. 基板は、光導波路であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の光学的測定方法。
5. 半導体ナノ粒子の粒子径は、３〜１０ｎｍであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の光学的測定方法。
6. １分子蛍光画像アナライザー法により蛍光の強度を測定することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の光学的測定方法。
7. 基板表面及び／又は半導体ナノ粒子にＦｃ部分を切断した抗体フラグメントを固定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の光学的測定方法。
8. 抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦａｂであることを特徴とする請求項７記載の光学的測定方法。