JP2005185182A - METHOD FOR PRODUCING alpha-1,3-GLUCOOLIGOSACCHARIDE, THE RESULTING alpha-1,3-GLUCOOLIGOSACCHARIDE, AND PREPARATION COMPOSITION CONTAINING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫賦活物質やＱＯＬ向上剤として注目されている３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とするオリゴ糖の一種であるα−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖およびこれを含有する製剤組成物に関する。 The present invention is based only on an α-1,3-glucoside bond, which is a kind of oligosaccharide having 3-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose, which is attracting attention as an immunostimulatory substance or a QOL improver. The present invention relates to an efficient production method of α-1,3-glucooligosaccharide, α-1,3-glucooligosaccharide obtained by the production method, and a pharmaceutical composition containing the same.
近年、免疫賦活物質として３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類が注目されている。このような３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類としては、例えば、少なくとも１つ以上のα−１，３−グルコシド結合を含むグルコース重合度２程度以上のオリゴ糖が挙げられ、好ましくはグルコース重合度２〜１０程度のオリゴ糖、より好ましくは重合度２〜７程度のオリゴ糖であるニゲロオリゴ糖が挙げられている（下記特許文献１および２参照）。また、α−１，３−グルカン及びその誘導体には抗腫瘍活性があること（下記非特許文献１参照）が報告されている。さらに、α−１，３−グルコオリゴ糖にもまた、免疫賦活、抗腫瘍活性、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）向上などの生理活性があること（下記特許文献１および２参照）が報告されている。
以上のような免疫賦活などの生理活性を持つ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類の中で、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びニゲランテトラサッカライドの製造方法としては、α−１，３−結合をもたらす糖転移酵素を用いた方法が開示されている（下記特許文献３参照）。また、α−１，３−グルカンの製造方法（下記特許文献４）や修飾α−１，３−グルカンの製造方法は既に知られている。
In recent years, a saccharide containing 3-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose as a structural unit has attracted attention as an immunostimulatory substance. Examples of the saccharide containing 3-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose as a constituent unit include, for example, a degree of glucose polymerization of about 2 or more including at least one α-1,3-glucoside bond. Examples thereof include oligosaccharides, preferably oligosaccharides having a glucose polymerization degree of about 2 to 10, more preferably nigerooligosaccharides which are oligosaccharides having a polymerization degree of about 2 to 7 (see Patent Documents 1 and 2 below). In addition, it has been reported that α-1,3-glucan and derivatives thereof have antitumor activity (see Non-Patent Document 1 below). Furthermore, it has been reported that α-1,3-glucooligosaccharides also have physiological activities such as immunostimulation, antitumor activity, and QOL (Quality of Life) improvement (see Patent Documents 1 and 2 below).
Among the saccharides containing 3-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose having a physiological activity such as immunostimulation as a constituent unit, a method for producing nigerosyl glucose, nigerosyl maltose and nigeran tetrasaccharide For example, a method using a glycosyltransferase that produces an α-1,3-linkage is disclosed (see Patent Document 3 below). In addition, a production method of α-1,3-glucan (the following Patent Document 4) and a production method of modified α-1,3-glucan are already known.
しかしながら、免疫賦活作用が期待されるα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖であるα−１，３−グルコオリゴ糖については未だその効率的な製造方法が知られていない。 However, an efficient production method for α-1,3-glucooligosaccharide, which is an oligosaccharide consisting only of α-1,3-glucoside bonds expected to have an immunostimulatory action, is not yet known.
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、α−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖およびこれを含有する製剤組成物を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above, and is an efficient production method of α-1,3-glucooligosaccharide consisting only of α-1,3-glucoside bonds, and α-1 obtained by the production method. , 3-Glucooligosaccharide and a pharmaceutical composition containing the same.
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意研究を重ねた結果、α−１，３−グルカンであるムタンのムタナーゼによる加水分解反応を制御することにより、免疫賦活活性を有する重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることができることを知見し、本発明をなすに至った。 As a result of intensive studies aimed at solving the above problems, the present inventor has controlled the hydrolysis reaction of mutanase, which is α-1,3-glucan, by mutanase, and thereby has a degree of polymerization having immunostimulatory activity of 2 It was found that α-1,3-glucooligosaccharides of ˜4 could be obtained, and the present invention was made.
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、基質であるムタンに対して、該ムタンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることを特徴とする。
この製造方法においては、前記ムタナーゼとして、プロテアーゼ産生が陰性であるバシラス属細菌により産生され、かつ（１）ムタンを基質としてｐＨ４〜６の範囲で高い加水分解活性を示し、（２）ムタンを基質としてｐＨ５で反応させる場合、温度５０〜６５℃において高い加水分解活性を示すタナーゼを用いることが好ましい。
また、前記ムタナーゼとして、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子が翻訳されることにより得られるムタナーゼ、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いることが好ましい。
In the method for producing α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention, mutanase having an endo-type hydrolyzing action on mutan is allowed to act on mutan as a substrate to hydrolyze the mutan. It is characterized in that an α-1,3-glucooligosaccharide consisting only of α-1,3-glucoside bonds having a degree of polymerization of 2 to 4 is obtained.
In this production method, the mutanase is produced by a bacterium belonging to the genus Bacillus that is negative for protease production, and (1) exhibits high hydrolysis activity in the pH range of 4 to 6 using mutan as a substrate, and (2) mutan as a substrate. In the case of reaction at pH 5, it is preferable to use a tannase that exhibits high hydrolysis activity at a temperature of 50 to 65 ° C.
Further, as the mutanase, it is preferable to use a mutanase obtained by translating a gene encoded by the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
また、以上の製造方法により製造されるα−１，３−グルコオリゴ糖も本発明の対象である。 Further, α-1,3-glucooligosaccharide produced by the above production method is also an object of the present invention.
さらに、以上のα−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物も同様に本発明の対象である。 Furthermore, the pharmaceutical composition containing the above α-1,3-glucooligosaccharide is also an object of the present invention.
本発明によれば、α−１，３−グルカンのムタナーゼによる加水分解反応を制御することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造することが可能となり、免疫賦活活性を有するα−１，３−グルコオリゴ糖および該α−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物を提供できる。 According to the present invention, by controlling the hydrolysis reaction of α-1,3-glucan by mutanase, it becomes possible to produce α-1,3-glucooligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 4, and immune activation. An α-1,3-glucooligosaccharide having activity and a pharmaceutical composition containing the α-1,3-glucooligosaccharide can be provided.
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、基質であるムタンに対して、該ムタンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得ることを特徴とする。この製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖は、重合度が２から４のα−１，３−グルコシド結合のみからなることを特徴とし、免疫賦活活性を有するため有用である。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
In the method for producing α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention, mutanase having an endo-type hydrolyzing action on mutan is allowed to act on mutan as a substrate to hydrolyze the mutan. An oligosaccharide having only an α-1,3-glucoside bond having a degree of polymerization of 2 to 4 is obtained. The α-1,3-glucooligosaccharide obtained by this production method is characterized by being composed only of α-1,3-glucoside bonds having a polymerization degree of 2 to 4, and is useful because it has immunostimulatory activity.
前記製造方法で用いられる基質のムタンとは、グルコースがα−１，３−結合のみでつながった水不溶性の高分子多糖すなわちα−１，３−グルカンのことをいう。本発明に用いる高純度のムタンは、組換え体由来のムタン合成酵素をショ糖に作用させることにより得ることができる（特開２０００−３１６５７１号公報）。 The substrate mutan used in the above production method refers to a water-insoluble polymeric polysaccharide in which glucose is connected only by α-1,3-bonds, that is, α-1,3-glucan. High-purity mutan used in the present invention can be obtained by allowing a recombinant mutan synthase to act on sucrose (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-316571).
前記製造方法で用いられるムタナーゼとは、ムタンの加水分解酵素であり、本発明においては、エンド型の加水分解作用をもつムタンの加水分解酵素をいう。本発明のムタナーゼは、ムタンの末端からムタンを加水分解するエキソ型の加水分解作用をもつムタナーゼとは異なり、ムタンをランダムに加水分解するため、α−１，３−グルコオリゴ糖の製造に適している。 The mutanase used in the production method is a mutan hydrolase. In the present invention, it means a mutan hydrolase having an endo-type hydrolyzing action. The mutanase of the present invention is suitable for the production of α-1,3-gluco-oligosaccharides, because the mutanase hydrolyzes mutan randomly, unlike the mutanase having an exo-type hydrolyzing action that hydrolyzes mutan from the end of mutan. Yes.
前記製造方法においては、前記エンド型の加水分解反応の反応条件であるｐＨ、温度、時間などの諸条件を適宜調整し、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得ることができるように、ムタンの加水分解を制御することが重要である。 In the said manufacturing method, various conditions, such as pH, temperature, time, etc. which are reaction conditions of the said endo-type hydrolysis reaction, are adjusted suitably, and it consists only of (alpha) -1,3-glucosidic bonds whose polymerization degree is 2-4. It is important to control the hydrolysis of mutan so that oligosaccharides can be obtained.
前記製造方法において、「重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得る」とは、ムタンの加水分解反応後の反応溶液を、例えば、薄層クロマトグラフィーで分析した場合に、重合度が２〜４以外のα−１，３−グルコオリゴ糖がほぼ観察されないことである。 In the above production method, “obtaining an oligosaccharide having only an α-1,3-glucoside bond having a degree of polymerization of 2 to 4” means that the reaction solution after the hydrolysis reaction of mutan is obtained by, for example, thin layer chromatography. When analyzed, α-1,3-glucooligosaccharides having a polymerization degree other than 2 to 4 are hardly observed.
前記α−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法としては、具体的には、例えば、５％のα−１，３−グルカン懸濁液と最終濃度４０００Ｕ／ｍＬのムタナーゼを混合し、攪拌しながら反応させる方法を挙げることができる。
反応温度は３５℃〜５０℃で、好ましくは４０℃がよい。反応時間は１時間以上３時間以内、好ましくは２時間反応させることがよい。これにより、グルコースの重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることができる。
As a method for producing the α-1,3-glucooligosaccharide, specifically, for example, a 5% α-1,3-glucan suspension and a final concentration of 4000 U / mL mutanase are mixed and stirred. The method of making it react can be mentioned.
The reaction temperature is 35 ° C to 50 ° C, preferably 40 ° C. The reaction time is 1 hour to 3 hours, preferably 2 hours. Thereby, α-1,3-glucooligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 2 to 4 can be obtained.
本発明にもちいるムタナーゼとしては、前述のように、基質であるムタンに対してエンド型の作用性をもつものが良く、好ましくはプロテアーゼ産生が陰性であるバシラス属によって産生され、以下の理化学的性質を有するムタナーゼであることが好ましい（バチルス・エスピーＲＭ１株生命研菌寄第１４８３６号：特開平第８−３０８５５８号公報）。
（１）基質特異性：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を良く分解する。
（２）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０分間反応させる場合、ｐＨ４において作用が至適であり、ｐＨ４〜６の範囲で高い加水分解活性を示す。
（３）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。
（４）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させる場合、温度６０℃において作用が至適である。
（５）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、６０℃以下で加水分解活性は安定であり、７５℃で失活する。
（６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約１５万である。
（７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水銀、銀、または３価の鉄によって作用が阻害される。
（８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害される。
As described above, the mutanase used in the present invention is preferably one having endo-type activity on the substrate mutan, preferably produced by the genus Bacillus which is negative for protease production, and has the following physicochemical properties: Preferably, it is a mutanase having properties (Bacillus sp. RM1 strain, Life Research Bacteria No. 14836: JP-A-8-308558).
(1) Substrate specificity: The α-1,3-glucoside bond of mutan is well degraded.
(2) Optimal action pH: When reacting at 35 ° C. for 10 minutes with mutan as a substrate, the action is optimum at pH 4, and high hydrolysis activity is exhibited in the range of pH 4-6.
(3) Stable pH range: When kept at 25 ° C. for 24 hours, the pH is stable in the range of 4 to 10.
(4) Optimal temperature: When reacting at pH 5 using mutan as a substrate, the effect is optimal at a temperature of 60 ° C.
(5) Temperature stability: When heat-treated at pH 5 for 10 minutes, the hydrolysis activity is stable at 60 ° C. or less and deactivated at 75 ° C.
(6) Molecular weight: The molecular weight determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is about 150,000.
(7) Effect of metal ions: When mutan is used as a substrate, the action is inhibited by mercury, silver, or trivalent iron.
(8) Effect of inhibitor: When mutan is used as a substrate, it is inhibited by p-chloromercury benzoic acid (PCMB).
さらに、後述の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子が翻訳されることにより得られるムタナーゼ（特開平第１０−２０１４８３号公報）がより好ましい。 Furthermore, a mutanase (Japanese Patent Laid-Open No. 10-201483) obtained by translating a gene encoded by a DNA sequence described in SEQ ID NO: 1 described below is more preferable.
ここで、前記配列番号１の遺伝子がコードするムタナーゼのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。当業者であれば、本明細書において開示された配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに変異を導入し、これを基に配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する改変酵素の調製を容易に行うことができる。本発明のＤＮＡには、このように配列番号：２に記載のムタナーゼの改変体であってムタンのα−１，３−グルコシド結合を分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡも含まれる。 Here, the amino acid sequence of the mutanase encoded by the gene of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. A person skilled in the art will introduce a mutation into DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 disclosed in the present specification, and based on this, a modification having a function equivalent to that of the mutanase described in SEQ ID NO: 2. The enzyme can be easily prepared. The DNA of the present invention also includes a DNA that encodes an enzyme having the activity of degrading the α-1,3-glucoside bond of mutan, which is a variant of the mutanase described in SEQ ID NO: 2.
前記のムタナーゼを改変する方法としては、例えば、亜硫酸（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４５７（１９８３））、亜硝酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４２５８（１９８２））などを用いた化学処理による変異体の作製や、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９９５））やＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｕａｌ Ａｍｂｅｒ法（Ｇｅｎｅ，１５２，２７１（１９９５））、ＰＣＲ法を応用した部位特異的変異による変異体の作製などの方法が当業者によく知られている。 As a method for modifying the above mutanase, for example, sulfite (Methods in Enzymol. 100, 457 (1983)), nitrous acid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4258 (1982)) and the like were used. Preparation of mutants by chemical treatment, Kunkel method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1995)), Oligonucleotide-directed Dual Amber method (Gene, 152, 271 (1995)), PCR method Methods of producing mutants by applied site-specific mutation are well known to those skilled in the art.
なお、ＤＮＡの変異は自然界においても生じ、これにより天然型のムタナーゼとアミノ酸配列の異なる酵素が生じうる。このような酵素をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。 It should be noted that DNA mutations also occur in nature, which may result in enzymes that differ in amino acid sequence from natural mutanases. DNA encoding such an enzyme is also included in the DNA of the present invention.
また、当業者にとってはハイブリダイゼーション技術（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５））などを用いて、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列（またはその一部）を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する酵素を得ることも常套手段であるといえる。 Further, for those skilled in the art, using a hybridization technique (J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) or the like, based on the DNA sequence (or a part thereof) described in SEQ ID NO: 1, It can also be said that it is a conventional means to isolate a DNA having high homology and obtain an enzyme having a function equivalent to that of the mutanase described in SEQ ID NO: 2 from the DNA.
本発明のＤＮＡには、配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードする酵素であって、ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡも含まれる。 The DNA of the present invention includes an enzyme encoded by a DNA that hybridizes with the DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having an activity of degrading the α-1,3-glucoside bond of mutan. Encoding DNA is also included.
配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する酵素をコードするＤＮＡは、通常、配列番号：１に記載のＤＮＡと高い相同性を有する。ここでいう高い相同性とは、配列番号：１に記載のＤＮＡと、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を指す。
なお、単離される酵素によっては、機能的に重要な領域（例えば、活性中心や基質結合部位）で高い相同性を有し、他の領域では比較的相同性が低いため、全体としては配列番号：２に記載のＤＮＡと１０％程度の配列の同一性でありうるが、このような酵素をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
DNA encoding an enzyme having a function equivalent to that of the mutanase described in SEQ ID NO: 2 usually has high homology with the DNA described in SEQ ID NO: 1. High homology here refers to the identity of the sequence of SEQ ID NO: 1 with at least 30% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more. .
Depending on the enzyme to be isolated, it has high homology in a functionally important region (for example, active center or substrate binding site) and relatively low homology in other regions. : It may be about 10% of sequence identity with the DNA described in 2. However, DNA encoding such an enzyme is also included in the DNA of the present invention.
このような機能的に同等な酵素をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の一例を示せば、温度条件としては、Ｔｍ値より２０〜２５℃低い温度、好ましくは１０〜２０℃低い温度、さらに好ましくは５〜１０℃低い温度である。 An example of hybridization conditions for isolating DNA encoding such a functionally equivalent enzyme is as follows. The temperature condition is 20 to 25 ° C. lower than the Tm value, preferably 10 to 20 ° C. The temperature is low, more preferably 5 to 10 ° C.
ここで、本発明において利用できるα−１，３−グルカンとしてはとしては、α−１，３−グルコシド結合のみからなるグルカンであれば特に限定されるものではないが、特開２０００−０８３６６５号及び特開２０００−３１６５７１号公報記載の方法、即ち組換え体由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉを用いて製造したムタン、即ちα―１，３−グルカンを用いることが望ましい。 Here, the α-1,3-glucan that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a glucan consisting of only an α-1,3-glucoside bond, but JP-A-2000-083665. It is desirable to use mutan produced by the method described in JP-A-2000-316571, that is, glucosyltransferase-I derived from a recombinant, that is, α-1,3-glucan.
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、１，３−グルコシド結合のみからなる重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖であり、以上のようなα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法により取得することができる。α−１，３−グルコオリゴ糖は、免疫賦活活性を有する化合物として有用である。 The α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention is an α-1,3-glucooligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 4 consisting only of 1,3-glucoside bonds. It can be obtained by a sugar production method. α-1,3-glucooligosaccharide is useful as a compound having immunostimulatory activity.
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖をヒト由来の繊維芽細胞に添加すると、免疫細胞であるＴ−細胞を活性化する因子として知られているＬｉｇｈｔ（Ｉｍｕｎｉｔｙ．８(1)２１−３０ １９９８）の発現を、該オリゴ糖無添加の細胞に比べ約１１倍増加させることができる。この試験結果より、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は免疫賦活活性を有することがわかる。 When the α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention is added to human-derived fibroblasts, Light (Immunity. 8 (1) 21-30, which is known as a factor that activates T-cells that are immune cells, is known. 1998) can be increased about 11-fold compared to cells without the oligosaccharide. This test result shows that the α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention has immunostimulatory activity.
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の混合物として用いることもでき、さらにこの混合物をカラムクロマトグラフィーなどの分離手段により分離精製して、それぞれ重合度２〜４の重合度をもつ単一のα−１，３−グルコオリゴ糖としても用いることができる。分子量分画する方法は一般に行われている方法で問題はなく、ゲル濾過やフィルター濾過などの手法を用いることができる。分画後の液は、凍結乾燥等の乾燥工程による手法によりパウダー化して保存することが好ましい。 The α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention can also be used as a mixture of α-1,3-glucooligosaccharide having a polymerization degree of 2 to 4, and the mixture is further separated and purified by a separation means such as column chromatography. Thus, it can also be used as a single α-1,3-glucooligosaccharide having a polymerization degree of 2 to 4 respectively. The method for molecular weight fractionation is a commonly performed method and there is no problem, and techniques such as gel filtration and filter filtration can be used. The liquid after fractionation is preferably stored in a powder form by a drying process such as freeze drying.
また、以上のα−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物も同様に本発明の対象である。このような製剤組成物としては、ＱＯＬ向上組成物、抗腫瘍剤組成物などの諸種の免疫賦活活性を有する製剤組成物を挙げることができる。ここで、ＱＯＬ向上組成物とは、いわゆる生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）を向上させる製剤組成物のことをいい、そのような組成物として免疫賦活活性成分を配合した諸種の剤型を設計することが可能である。 Further, a pharmaceutical composition containing the above α-1,3-glucooligosaccharide is also an object of the present invention. Examples of such a pharmaceutical composition include pharmaceutical compositions having various immunostimulatory activities such as a QOL improving composition and an antitumor agent composition. Here, the QOL improving composition refers to a pharmaceutical composition that improves so-called quality of life, and various dosage forms in which an immunostimulatory active ingredient is blended are designed as such a composition. It is possible.
以下、製造例と実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕α−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法の検討
α−１，３−グルカン５ｇをリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）１００ｍＬに採り、５％α−１，３−グルカン懸濁液を用意した。この懸濁液にムタナーゼ（最終濃度４０００Ｕ／ｍＬ）を入れ反応液とした。
上記反応液を攪拌しながら４０℃でインキュベートした。インキュベート開始から１，２，３，４，６，１２時間後にサンプルを採取し、下記の薄層クロマトグラフィー条件で採取サンプルを分析し、表１に各反応時間後に生成したα−１，３−グルコオリゴ糖の重合度の分布を示した。
EXAMPLES Hereinafter, although a manufacture example and an Example demonstrate this invention concretely, this invention is not limited by the following Example.
[Example 1] Examination of production method of α-1,3-glucooligosaccharide 5 g of α-1,3-glucan was taken up in 100 mL of sodium phosphate buffer (pH 6.0), and 5% α-1,3-glucan suspension was obtained. A suspension was prepared. Mutanase (final concentration 4000 U / mL) was added to this suspension to prepare a reaction solution.
The reaction was incubated at 40 ° C. with stirring. Samples were collected 1, 2, 3, 4, 6, and 12 hours after the start of incubation, and the collected samples were analyzed under the following thin-layer chromatography conditions. Table 1 shows α-1,3- produced after each reaction time. The distribution of the degree of polymerization of glucooligosaccharide was shown.
薄層クロマトグラフィー条件
溶媒：メタノール／クロロホルム／水＝５０：５０：１２
薄層クロマト：シリカゲル６０（メルク社製）
展開後、濃硫酸を噴霧し、１００℃で焼き付けた。
Thin layer chromatography conditions Solvent: methanol / chloroform / water = 50: 50: 12
Thin layer chromatography: Silica gel 60 (Merck)
After the development, concentrated sulfuric acid was sprayed and baked at 100 ° C.
反応液の分画精製
得られた反応液１００ｍＬをビバスピン（ザルトリウス社製）により分子量分画し、分子量５０００以下の分画８０ｍＬを採取した。この分画液を凍結乾燥し、α−１，３−グルコオリゴ糖の粉末２．５ｇを得た。
Fractionation and purification of reaction solution 100 mL of the obtained reaction solution was subjected to molecular weight fractionation using Vivaspin (manufactured by Sartorius), and 80 mL fractions having a molecular weight of 5000 or less were collected. This fraction solution was freeze-dried to obtain 2.5 g of α-1,3-glucooligosaccharide powder.
本製造方法により得られたオリゴ糖は、グルコースの重合度が２〜４のオリゴ糖であることを薄層クロマトグラフィーにより確認した。
また、表１の各反応時間後に生成したα−１，３−グルコオリゴ糖の重合度の分布の結果より、グルコースの重合度が２〜４のオリゴ糖を得るためには、反応時間を１時間以上３時間以内とすることが好適で、さらには２時間とすることがさらに好適である事が分かった。
It was confirmed by thin layer chromatography that the oligosaccharide obtained by this production method was an oligosaccharide having a glucose polymerization degree of 2 to 4.
In addition, from the result of the distribution of the polymerization degree of α-1,3-glucooligosaccharide produced after each reaction time in Table 1, in order to obtain an oligosaccharide having a polymerization degree of glucose of 2 to 4, the reaction time is 1 hour. It has been found that the time is preferably within 3 hours, and more preferably 2 hours.
〔実施例２〕本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の免疫賦活作用の検討
繊維芽細胞として、正常ヒト新生児***皮膚繊維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を、培養液として、ＬＳＧ（クラボウ社製：Ｓ−００３−１０）添加Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（倉敷紡績株式会社製：Ｍ−１０６−５００Ｓ）を用いて、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の免疫賦活作用を検討した。
３７℃、５％ＣＯ2環境下で前記繊維芽細胞が飽和するまで培養した。その後、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖を生理食塩水に溶解し、最終濃度０．１％になる様に添加した。対照となる細胞培養液には生理食塩水のみを添加した（オリゴ糖無添加細胞）。１６時間後に前記繊維芽細胞を回収し、ＤＮＡアレイ解析（ジェネティックラボ社製）に供した。ＤＮＡアレイ解析の結果、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、免疫細胞であるＴ−細胞を活性化する因子として知られているＬｉｇｈｔ（Ｉｍｕｎｉｔｙ．８(1)２１−３０ １９９８）の発現を、該オリゴ糖無添加の細胞に比べ約１１倍増加させることを確認した。
[Example 2] Examination of immunostimulatory action of α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention As fibroblasts, normal human newborn foreskin skin fibroblasts (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.) were used as a culture solution, and LSG ( The immunostimulatory action of the α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention was examined using Medium 106S (Kurashiki Boseki Co., Ltd .: M-106-500S) added by Kurabo Industries Co., Ltd .: S-003-10).
The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment until the fibroblasts were saturated. Thereafter, the α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention was dissolved in physiological saline and added to a final concentration of 0.1%. Only physiological saline was added to the cell culture medium as a control (cells without oligosaccharide added). After 16 hours, the fibroblasts were collected and subjected to DNA array analysis (Genetic Labs). As a result of DNA array analysis, the α-1,3-glucooligosaccharide of the present invention was obtained from Light (Immunity. 8 (1) 21-30 1998), which is known as a factor that activates T-cells that are immune cells. It was confirmed that the expression was increased about 11 times compared to the cells without the oligosaccharide.
以上のように、本発明にかかるα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、α−１，３−グルコシド結合のみからなる重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法として有用であり、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖は免疫賦活作用を有し、これを含有する製剤組成物は免疫賦活製剤組成物として、特に適している。 As described above, the method for producing α-1,3-glucooligosaccharide according to the present invention is efficient for α-1,3-glucooligosaccharide having a polymerization degree of 2 to 4 consisting only of α-1,3-glucoside bonds. The α-1,3-glucooligosaccharide obtained by the production method has an immunostimulatory action, and a pharmaceutical composition containing this is particularly suitable as an immunostimulatory pharmaceutical composition.
配列番号：１ バチルス・エスピーＲＭ１株由来のムターゼ遺伝子
配列番号：２ バチルス・エスピーＲＭ１株由来のムターゼ
SEQ ID NO: 1 Mutase gene derived from Bacillus sp. RM1 strain SEQ ID NO: 2 Mutase derived from Bacillus sp. RM1 strain
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