JP2005170959A - Graft polymer for immobilizing biopolymer and base material immobilized with the same - Google Patents
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この発明は、生体高分子固定化可能なグラフト重合体ならびにそれを固定した基材に関するものである。この発明のグラフト重合体ならびにそれを固定化した基材は、生体高分子を固定化できると共に、走査型プローブ顕微鏡などによる生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性を有効に測定することに利用することができる。 The present invention relates to a graft polymer capable of immobilizing a biopolymer and a base material on which the graft polymer is immobilized. The graft polymer of the present invention and the substrate on which the graft polymer is immobilized can immobilize the biopolymer and effectively measure the mechanical properties of the biopolymer and the interaction force between the molecules using a scanning probe microscope or the like. It can be used for anything.
タンパク質や核酸、糖鎖などの生体高分子は合成高分子には付与の困難な、特有の生化学的、生理的機能を有するため、バイオテクノロジーの様々な領域で分子素材として応用が行われている。例えば、医用材料の分野では種々の酵素等タンパク質を材料の表面に固定することにより材料の機能化を図ったり、細胞工学分野・薬学分野等では細胞・組織の生理機能の調節・制御や創薬に用いられる。このような種々のバイオテクノロジーへの生体高分子の応用においては、生体高分子自体の構造・機能特性を詳細に理解することが要求される。このためは、生体高分子の力学特性、分子間相互作用特性、 材料と生体高分子の相互作用特性等の、ナノスケールレベルでの相互作用力情報の特性解析が強く望まれている。 Biopolymers such as proteins, nucleic acids, and sugar chains have unique biochemical and physiological functions that are difficult to impart to synthetic polymers, so they are used as molecular materials in various areas of biotechnology. Yes. For example, in the field of medical materials, various enzymes and other proteins are immobilized on the surface of the material to functionalize the material. In the field of cell engineering and pharmacy, regulation and control of physiological functions of cells and tissues and drug discovery Used for. In application of biopolymers to such various biotechnology, it is required to understand in detail the structure and functional characteristics of the biopolymer itself. For this purpose, it is strongly desired to analyze the characteristics of interaction force information at the nanoscale level, such as the mechanical properties of biopolymers, the interaction properties between molecules, and the interaction properties between materials and biopolymers.
近年、このようなナノスケールレベルでの相互作用の解析手段として、試料からの力を受けて試料表面を測定する原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope: ＡＦＭ）等の走査型プローブ顕微鏡（Scanning Probe Microscope: ＳＰＭ）を用いて生体試料の観察や材料表面の特性解析が活発に行われるようになってきている（特許文献１）。 Recently, as an analysis means of the interaction with such nanoscale level, atomic force microscopy to measure the sample surface under the force of the sample (A tomic F orce M icroscope: AFM) scanning type probe microscope or the like ( S canning P robe M icroscope: characterization of the biological sample observation and material surface using SPM) has come to be actively performed (Patent Document 1).
なかでも、測定に際して試料に特別な前処理を必要とせず、大気、真空、液体中という様々な環境で、試料表面を原子スケールで直接観察できるＡＦＭは、材料表面に原子・分子レベルで点在して機能を発現する局所領域の構造を明らかにし、その微小領域における物理的・化学的性質などを評価するための有力な手段として活用されている（非特許文献１）。ＡＦＭは、また、スタティックな表面観察に留まらず、表面局所領域において生じる吸着現象、分子間相互作用、生体高分子構造変移や生化学反応過程をダイナミックに測定する手段として利用されている。 In particular, AFM, which does not require any special pretreatment for the measurement, and can directly observe the sample surface at the atomic scale in various environments such as air, vacuum, and liquid, is scattered on the material surface at the atomic and molecular level. Thus, it is utilized as an effective means for clarifying the structure of a local region that expresses a function and evaluating physical and chemical properties in the micro region (Non-patent Document 1). AFM is used not only for static surface observation but also as a means for dynamically measuring adsorption phenomena, intermolecular interactions, biopolymer structural transitions and biochemical reaction processes occurring in the local surface region.
原子間力顕微鏡の主要部は、ＡＦＭ探針と、探針が受ける斥力または引力を変位に変換するカンチレバー、その撓みを検出する変位センサー、試料を３次元方向に高精度に移動させるための走査素子（ピエゾ）から構成されている。ＡＦＭ探針は、高分解能、高精度な観察または分子操作を実現するための重要な要素であり、カンチレバーと呼ばれる片持ちの板ばねの先端に微小突起（探針）として形成されている。本明細書では、ＡＦＭ探針を以下「ＡＦＭプローブ」ともいう。 The main part of the atomic force microscope is an AFM probe, a cantilever that converts the repulsive force or attractive force received by the probe into displacement, a displacement sensor that detects the deflection, and scanning for moving the sample in a three-dimensional direction with high accuracy. It is composed of elements (piezo). The AFM probe is an important element for realizing high-resolution and high-precision observation or molecular manipulation, and is formed as a minute protrusion (probe) at the tip of a cantilever leaf spring called a cantilever. In the present specification, the AFM probe is hereinafter also referred to as “AFM probe”.
ＡＦＭが発明された当初は、そのＡＦＭ探針は、金箔の先端にダイヤモンドの小片を接着したものや電解エッチングしたタングステン線の先端を折曲げたものなどが使用されていた（非特許文献２、３）。このような金属製のＡＦＭ探針では、その表面の硬度が高すぎたりして、生体高分子の表面特性を測定するのには適していない。
そこで現在では、フォトリソグラフィ技術により Si3N4、SiO2、Si などを加工した薄板カンチレバーが製作され、その先端部に探針が設けられている（非特許文献４，５，６）。ＡＦＭカンチレバーは、微視的な力である原子間力（10?9 N 程度）を検知するために、力に対する変位を大きくし感度を上げるためバネ定数が小さいことが求められる。また、床振動など低周波ノイズを抑制し、走査速度を向上させるために、共振周波数が高いことが望ましい。
微小変位検出法と測定モードには、小型で安定な半導体レーザーが用いられ、レーザー光の反射を利用する変位検出方式が実用化されている。とりわけ、光てこ方式が一般的であり、この方式では集光したレーザー光をカンチレバーの先端部に当て、カンチレバーのたわみによるレーザー光束の反射角度変化を、４分割フォトダイオード検出器や半導***置センサーに入射する光の相対強度の変化として検出する方式（ＤＣ検出方式）である（非特許文献７、８）。
At the time when AFM was invented, the AFM probe used was one in which a small piece of diamond was bonded to the tip of a gold foil, or one in which the tip of an electrolytically etched tungsten wire was bent (Non-Patent
Therefore, at present, a thin plate cantilever obtained by processing Si 3 N 4 , SiO 2 , Si, or the like by a photolithography technique is manufactured, and a probe is provided at the tip (
A small and stable semiconductor laser is used for the minute displacement detection method and measurement mode, and a displacement detection method using reflection of laser light has been put into practical use. In particular, the optical lever method is common. In this method, the focused laser beam is applied to the tip of the cantilever, and the change in the reflection angle of the laser beam due to the deflection of the cantilever is applied to a four-division photodiode detector or semiconductor position sensor. This is a method (DC detection method) for detecting the change in relative intensity of incident light (
ＡＦＭでは、探針・試料間の物理的相互作用力を検出することができる。ＡＦＭによる生体高分子間力測定を行なうためには、ＡＦＭ探針と基板表面を表面修飾し、生体高分子をＡＦＭ探針と基板表面とに固定することが必要になる。一方、タンパク質などの生体高分子は、その分子特有の立体構造を持っており、その構造によって様々な機能を発揮している。また、その機能はタンパク質の自由な分子運動の下で、より効果的に発現される。タンパク質は、固定される表面の特性によっては構造の変化（変性）や運動性の抑制などに起因して元の機能を失う場合があるので、ＡＦＭ探針と基板表面上へのタンパク質の固定法は非常に重要な課題になっている。したがって、タンパク質などの生体高分子をＡＦＭ探針と基板表面とに固定させる際には、その構造と機能・活性および運動自由度を如何に保持できるかが重要なポイントである。 In AFM, the physical interaction force between the probe and the sample can be detected. In order to perform biopolymer intermolecular force measurement by AFM, it is necessary to modify the surface of the AFM probe and the substrate surface and fix the biopolymer to the AFM probe and the substrate surface. On the other hand, biopolymers such as proteins have a three-dimensional structure unique to the molecule, and exhibit various functions depending on the structure. In addition, its function is expressed more effectively under the free molecular movement of proteins. Since proteins may lose their original functions due to structural changes (denaturation) or motility suppression depending on the characteristics of the surface to be immobilized, a method for immobilizing proteins on the AFM probe and the substrate surface Has become a very important issue. Therefore, when a biopolymer such as protein is fixed to the AFM probe and the substrate surface, it is an important point how to maintain the structure, function, activity and freedom of movement.
タンパク質固定法については、図１で示されているように、当初は、短いクロスリンカー（cross-linker）またはシランカップリング剤等を用いてＡＦＭ探針と基板表面に直接固定される手法が使われた。このような「表面直接固定法」では、タンパク質など生体高分子は、表面との非特異的付着によって変性したり、立体方向性と運動自由度が制限されたり、ＡＦＭプローブと基板の表面間触圧によって機械的に変性してしまう恐れがある。また、ＡＦＭプローブと基板表面間の非特異的付着も分子間相互作用力測定の大きな障害になってきた。 As shown in FIG. 1, the protein immobilization method initially uses a method in which a short cross-linker or a silane coupling agent is used to immobilize directly on the AFM probe and the substrate surface. It was broken. In such a “direct surface immobilization method”, biopolymers such as proteins are denatured by non-specific adhesion to the surface, steric orientation and freedom of movement are limited, or the surface contact between the AFM probe and the substrate is limited. There is a risk of mechanical modification by pressure. In addition, nonspecific adhesion between the AFM probe and the substrate surface has also become a major obstacle to the measurement of intermolecular interaction force.
そこで、近年では、ポリエチレングリコール（PEG）などのスペーサー分子を使った固定法が検討されている。しかし、この方法においても、使用するスペーサーの分子量とそれによる表面の被覆状態が充分でなければ上記障害の完全な回避は難しく、この二条件を満足できるスペーサー分子の表面への固定法は確立されていないため、この方法も必ずしも理想的な方法とは言えない。 Therefore, in recent years, immobilization methods using spacer molecules such as polyethylene glycol (PEG) have been studied. However, even in this method, it is difficult to completely avoid the above obstacle unless the molecular weight of the spacer to be used and the coating state of the surface are sufficient, and a method for fixing the spacer molecule to the surface that satisfies these two conditions has been established. This method is not necessarily an ideal method.
かかる従来法を改善する手法として、高分子による表面修飾法の応用が考えられる。その方法は、高分子素材の表面に光照射によりラジカルを発生する光反応性化合物を塗布あるいは含浸させ、モノマー溶液中で光を照射することにより、光反応性化合物またはそれに由来して発生するラジカルを重合開始種として、高分子素材表面においてモノマーのラジカル重合を開始させてグラフト重合高分子を生成させ、そのグラフト重合高分子により高分子素材の表面を修飾することから構成されている（図２、非特許文献９，１０，１１、特許文献２）。
As a technique for improving such a conventional method, application of a surface modification method with a polymer can be considered. The method involves applying or impregnating a photoreactive compound that generates radicals upon irradiation with light onto the surface of the polymer material, and irradiating light in the monomer solution, thereby generating the photoreactive compound or radicals generated therefrom. Is used to initiate radical polymerization of monomers on the surface of the polymer material to form a graft polymer, and the surface of the polymer material is modified by the graft polymer (FIG. 2).
具体的には、光イニファターとしてＳ−ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートなどを使用した例が示されている（非特許文献１０、１１）。更に、このＳ−ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート基を固定化したポリマー表面に対して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メタクリル酸などのビニルモノマーの存在下において紫外線を照射すると、グラフト重合層を形成できることが記載されている（非特許文献１１、１２、１３、特許文献２）。
Specifically, examples in which S-benzyl N, N-diethyldithiocarbamate or the like is used as a photoiniferter are shown (Non-Patent
しかしながら、上記のようにして得られたグラフト重合層に対してタンパク質などの生体高分子を、その構造、活性、運動自由度を保持した状態で固定化することは通常は困難であるところから、ＡＦＭなどのＳＰＭによる生体高分子間力測定に応用することは困難である。したがって、タンパク質などの生体高分子を容易に固定化することが可能でかつＡＦＭなどのＳＰＭによる生体高分子間力測定にも応用することが可能な生体高分子固定化技術の開発が要請されている。
これらの問題点を解決するために、本発明者らは、ＡＦＭ探針と基板の表面修飾方法を鋭意研究した結果、ＡＦＭ探針と基板表面上に、生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファター分子を用いた重合反応により形成されるグラフト重合層を設けることによって、タンパク質などの生体高分子をグラフト重合層上に緩やかに固定し、その構造、活性、運動自由度を保持した状態で分子操作する技術（本明細書ではこの技術を「ソフトハンドリング」ともいう）が従来方法の問題点を解決することができることを見出して、この発明を完成するに到った。 In order to solve these problems, the present inventors have intensively studied the surface modification method of the AFM probe and the substrate, and as a result, have a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer on the AFM probe and the substrate surface. By providing a graft polymerization layer formed by a polymerization reaction using an iniferter molecule, a biopolymer such as a protein is gently fixed on the graft polymerization layer, and the molecule retains its structure, activity, and freedom of movement. The inventors have found that an operating technique (this technique is also referred to as “soft handling” in the present specification) can solve the problems of the conventional methods, and have completed the present invention.
なお、この発明において、「イニファター」という用語は、光または熱照射により解離してラジカルを発生し、一方のラジカルがモノマー分子の重合開始剤となり、他方のラジカルが重合停止剤として作用し、光または熱照射の間だけ一方のラジカルによる重合鎖が伸長すると共に、光または熱照射を停止すると他方のラジカルにより重合を停止させる化合物を意味する（非特許文献９）。この場合、イニファター分子はグラフト重合鎖の自由末端に常に配置される特徴を示す。 In the present invention, the term “iniferter” means that a radical is generated by dissociation by light or heat irradiation, one radical serves as a polymerization initiator for the monomer molecule, and the other radical acts as a polymerization terminator. Alternatively, it means a compound in which the polymerization chain by one radical is extended only during heat irradiation and the polymerization is stopped by the other radical when light or heat irradiation is stopped (Non-patent Document 9). In this case, the iniferter molecule exhibits the characteristic that it is always located at the free end of the graft polymer chain.
したがって、この発明は、その態様として、生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターが表面グラフト重合鎖の自由末端に配置されていることを特徴とする生体高分子固定可能なグラフト重合体、およびタンパク質などの生体高分子を固定した生体高分子固定化グラフト重合体を提供することを目的としている。
また、この発明は、その別の態様として、上記生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターを基材に固定化し、ビニルモノマーの存在下において光または熱照射により重合反応させて、生体高分子固定可能なグラフト重合体を得ることからなる生体高分子固定可能グラフト重合体の製造方法を提供することを目的とする。
Therefore, the present invention has, as an embodiment, a graft polymer capable of immobilizing a biopolymer, characterized in that an iniferter having a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer is disposed at the free end of the surface graft polymer chain, and It aims at providing the biopolymer fixed graft polymer which fixed biopolymers, such as protein.
In another aspect of the present invention, the iniferter having a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer is immobilized on a base material and polymerized by light or heat irradiation in the presence of a vinyl monomer to produce a biopolymer. An object of the present invention is to provide a method for producing a biopolymer-immobilizable graft polymer, which comprises obtaining an immobilizable graft polymer.
更に、この発明は、その別の態様として、上記方法によって得られた生体高分子固定可能なグラフト重合体にタンパク質などの生体高分子を固定化することからなる生体高分子固定化グラフト重合体の製造方法を提供することを目的としている。
この発明の更に別の目的は、上記生体高分子固定可能なグラフト重合体または生体高分子固定化グラフト重合体を固定した基材およびそれらの製造方法を提供することである。
Furthermore, as another aspect of the present invention, there is provided a biopolymer-immobilized graft polymer comprising a biopolymer such as a protein immobilized on a graft polymer capable of immobilizing a biopolymer obtained by the above method. The object is to provide a manufacturing method.
Still another object of the present invention is to provide a base material on which the biopolymer-immobilizable graft polymer or biopolymer-immobilized graft polymer is immobilized, and a method for producing them.
この発明は更に上記生体高分子固定化グラフト重合体またはグラフト重合体固定基板を使用して生体高分子の力学特性および分子間の相互作用力特性の精密測定方法を提供することを目的としている。また、別の態様としては、かかる測定を原子間力顕微鏡によって行う方法を提供することも目的としている。 Another object of the present invention is to provide a method for precisely measuring the mechanical properties of biopolymers and the interaction force properties between molecules using the above-mentioned graft polymer-immobilized graft polymer or graft polymer-immobilized substrate. Another object of the present invention is to provide a method for performing such measurement using an atomic force microscope.
上記目的を達成するために、この発明は、その１つの態様として、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ2基もしくは−ＳＨ基、−ＯＨ基またはこれらの１つを含む生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターが表面グラフト重合鎖の自由末端に配置されていることを特徴とする生体高分子固定可能なグラフト重合体、およびタンパク質などの生体高分子を固定した生体高分子固定化グラフト重合体を提供する。また、この発明は、その好ましい態様として、イニファターが光イニファターまたは熱イニファターであり、また下記一般式[I]で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]で表されるチウラムジスルフィドである生体高分子固定可能なグラフト重合体および生体高分子固定化グラフト重合体を提供することを目的としている。 To achieve the above object, this invention provides, as one aspect thereof, -COOH group, -NH 2 group or -SH group, an -OH group or a biopolymer immobilizable chemical functional group containing one of these A graft polymer capable of immobilizing a biopolymer, characterized in that the iniferter possessed is disposed at the free end of the surface graft polymer chain, and a biopolymer-immobilized graft polymer immobilizing a biopolymer such as a protein To do. Further, according to a preferred embodiment of the present invention, the iniferter is a photoiniferter or a thermal iniferter, and is a dithiocarbamate represented by the following general formula [I] or a thiuram disulfide represented by the general formula [II]. An object of the present invention is to provide a graft polymer capable of immobilizing a molecule and a graft polymer immobilized with a biopolymer.
この発明はまた、上記生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターを基材に固定化し、ビニルモノマーの存在下において光または熱照射により重合反応させて、生体高分子固定可能なグラフト重合体を得ることからなる生体高分子固定可能グラフト重合体の製造方法を提供する。 The present invention also provides a graft polymer capable of immobilizing a biopolymer by immobilizing an iniferter having a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer on a base material and polymerizing by light or heat irradiation in the presence of a vinyl monomer. There is provided a method for producing a biopolymer-immobilizable graft polymer.
更に、この発明は、その別の態様として、上記方法によって得られた生体高分子固定可能なグラフト重合体にタンパク質などの生体高分子を固定化することからなる生体高分子固定化グラフト重合体の製造方法を提供する。
この発明はまた上記生体高分子固定可能なグラフト重合体または生体高分子固定化グラフト重合体を固定した基材およびそれらの製造方法を提供する。この発明は、これらの好ましい態様として、かかる基材として、例えば、プローブ顕微鏡のプローブや測定検体を固定する基板などを提供する。
Furthermore, as another aspect of the present invention, there is provided a biopolymer-immobilized graft polymer comprising a biopolymer such as a protein immobilized on a graft polymer capable of immobilizing a biopolymer obtained by the above method. A manufacturing method is provided.
The present invention also provides a base material on which the biopolymer-immobilizable graft polymer or biopolymer-immobilized graft polymer is immobilized, and a method for producing the same. The present invention provides, as these preferred embodiments, as the base material, for example, a probe microscope probe or a substrate on which a measurement specimen is fixed.
この発明は更に生体高分子固定化グラフト重合体またはグラフト重合体固定基板を使用して生体高分子の表面特性を測定する測定方法とともに、また別の態様としては、かかる測定を原子間力顕微鏡で測定する測定方法を提供する。 The present invention further includes a measurement method for measuring the surface characteristics of a biopolymer using a biopolymer-immobilized graft polymer or a graft polymer-immobilized substrate. In another embodiment, the measurement is performed using an atomic force microscope. A measurement method for measuring is provided.
この発明に係る生体高分子固定可能なグラフト重合体は、特にＡＦＭ探針と試料間に作用する力を検出することによって生体高分子間力測定を行なうために、ＡＦＭ探針と基板表面との表面修飾をして、生体高分子をＡＦＭ探針と基板表面に固定させるために有用である。 The graft polymer capable of immobilizing a biopolymer according to the present invention is particularly suitable for measuring the force between the AFM probe and the sample by detecting the force acting between the AFM probe and the sample. It is useful for surface modification to fix the biopolymer to the AFM probe and the substrate surface.
前述したように、ＡＦＭの主要部は、ＡＦＭ探針と、ＡＦＭ探針が受ける斥力または引力を変位に変換するカンチレバー、その撓みを検出する変位センサー、試料を３次元方向に高精度に移動させるための走査素子（ピエゾ）から構成されている。このＡＦＭ探針は、装置性能を決める重要な要素であり、この探針によって高分解能、高精度な観察または分子操作を実現することができる。 As described above, the main part of the AFM is the AFM probe, the cantilever that converts the repulsive force or attractive force received by the AFM probe into displacement, the displacement sensor that detects the deflection, and the sample is moved with high accuracy in the three-dimensional direction. Scanning element (piezo). The AFM probe is an important factor that determines the performance of the apparatus, and high-resolution and high-precision observation or molecular manipulation can be realized by the probe.
ＡＦＭでは、探針・試料間の物理的相互作用として、ＡＦＭ探針と試料間に作用する力を検出することができる。ＡＦＭ探針と試料間に力が作用すると、カンチレバーが上下方向に撓む。レーザー光の反射を利用して検出されるカンチレバーのたわみ変位から、カンチレバーのバネ定数を考慮して相互作用力が算出される。 In the AFM, a force acting between the AFM probe and the sample can be detected as a physical interaction between the probe and the sample. When a force acts between the AFM probe and the sample, the cantilever bends in the vertical direction. The interaction force is calculated from the deflection displacement of the cantilever detected using the reflection of the laser light in consideration of the spring constant of the cantilever.
現在よく使用されているカンチレバーのバネ定数 ( k ) は、0.01〜100 N/m が一般的であり、一方、カンチレバーの変位検出の分解能は、約 0.1 nm である。したがって、フックの法則 （Hooke's law: F = kz） から分かるように、ＡＦＭ探針と試料表面との間に働く力は 10?12 〜 10?8 N の分解能で検出可能である。原子の共有結合力は、10?9 N 程度と考えられているので、バネ定数の小さいカンチレバーを用いれば、試料表面の形状の観察、分子操作や、分子間力測定などを行うことができる。 The spring constant (k) of a cantilever currently in common use is generally 0.01 to 100 N / m, while the resolution for detecting the displacement of the cantilever is about 0.1 nm. Therefore, as can be seen from Hooke's law (F = kz), the force acting between the AFM probe and the sample surface can be detected with a resolution of 10 12 to 10 8 N. Since the covalent bond force of atoms is thought to be about 10 9 N, using a cantilever with a small spring constant enables observation of the shape of the sample surface, molecular manipulation, intermolecular force measurement, and the like.
ＡＦＭによる力測定では、そのピエゾスキャナーをZ軸方向に移動させながら、探針を試料表面に降下・接触・上昇させ、試料からの力により生じるカンチレバーのたわみ変位 (Deflection) を時間またはピエゾスキャナーの移動距離に対して連続的にプロットしていく。ここで、カンチレバーの変位にそのバネ定数をかけることによってカンチレバーに負荷された力が計算でき、そのプロットカーブはフォースカーブと呼ばれる。 In force measurement by AFM, while moving the piezo scanner in the Z-axis direction, the probe is lowered / contacted / raised to the sample surface, and the deflection displacement of the cantilever caused by the force from the sample is measured in time or by the piezo scanner. Plot continuously against the distance traveled. Here, the force applied to the cantilever can be calculated by applying the spring constant to the displacement of the cantilever, and the plot curve is called a force curve.
この方法によって、図３に示すようにグラフト鎖一本の引伸時の力変移の測定、グラフト重合層の厚さ、弾性等の測定が可能である。また、カンチレバーの Deflection ピークの高さにバネ定数をかけると、ポリマー鎖を伸ばし切る力（Rupture force） が推算できる （90 nm ×20 pN/nm = 1800 pN）。なお、ポリマーの長さも 200 nm 前後であるなどことが判る。 By this method, as shown in FIG. 3, it is possible to measure the force shift during stretching of one graft chain, and measure the thickness, elasticity, etc. of the graft polymerization layer. Also, if the spring constant is applied to the height of the cantilever's Deflection peak, the Rupture force can be estimated (90 nm × 20 pN / nm = 1800 pN). It can be seen that the length of the polymer is around 200 nm.
ここで、この発明に係る生体高分子固定可能なグラフト重合体について説明する。
この発明に係る生体高分子固定可能なグラフト重合体は、生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターが表面グラフト重合鎖の自由末端に配置されていることを特徴とする。このグラフト重合体においては、グラフト重合鎖の固定端はシランカップリング結合等を介して基材に固定化されている。
Here, the biopolymer immobilizable graft polymer according to the present invention will be described.
The graft polymer capable of immobilizing a biopolymer according to the present invention is characterized in that an iniferter having a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer is arranged at the free end of the surface graft polymer chain. In this graft polymer, the fixed end of the graft polymer chain is fixed to the substrate via a silane coupling bond or the like.
この発明において使用することができるイニファターとしては、例えば、一般式[I]：
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]：
As an iniferter that can be used in the present invention, for example, the general formula [I]:
Dithiocarbamate represented by the general formula [II]:
で表されるチウラムジスルフィドが挙げられる。
Thiuram disulfide represented by
上記イニファターにおいて、生体高分子固定可能化学官能基としては、タンパク質などの生体高分子を結合することができる化学官能基であれば、特に限定されるものではなく、例えば、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ2基、−ＳＨ基、もしくは−ＯＨ基またはこれらの１つを含む化学官能基を挙げることができる。また、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ2基、−ＳＨ基、もしくは−ＯＨ基を含む生体高分子固定可能化学官能基としては、例えば、−ＣＨ2ＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＮＨ2、−ＣＨ2ＳＨ、−ＣＨ2ＯＨなどの−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ2基、−ＳＨ基、もしくは−ＯＨ基置換アルキレン基などが挙げられる。ここで、アルキレン基とは、炭素数１ないし４個の２価脂肪族炭化水素残基を意味する。 In the above iniferter, the biopolymer immobilizable chemical functional group is not particularly limited as long as it is a chemical functional group capable of binding a biopolymer such as a protein. For example, a —COOH group, —NH Mention may be made of two , -SH, or -OH groups or chemical functional groups containing one of these. Examples of the chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer containing —COOH group, —NH 2 group, —SH group, or —OH group include —CH 2 COOH, — (CH 2 ) 2 COOH, —CH 2. Examples include —COOH groups such as NH 2 , —CH 2 SH, and —CH 2 OH, —NH 2 groups, —SH groups, and —OH group-substituted alkylene groups. Here, the alkylene group means a divalent aliphatic hydrocarbon residue having 1 to 4 carbon atoms.
上記一般式[II]で表されるチウラムジスルフィドは、ジチオカルバメート２分子が結合した形状であって、特に熱によりジチオカルバメートにそれぞれ分離され、上記ジチオカルバメートと実質的に同様に作用する。 The thiuram disulfide represented by the above general formula [II] has a shape in which two molecules of dithiocarbamate are bonded to each other, and is separated into dithiocarbamates by heat in particular, and acts in substantially the same manner as the above dithiocarbamates.
上記一般式において、Ｒ1で表されるラジカル発生基としては、特に限定されるものではなく、光または熱照射によってＲ1−Ｓ結合が、Ｒ1とＳとに解離し、それぞれラジカルを発生する者であればいずれでもよいが、例えば、低級アルキル基、低級シクロアルキル基、アラルキル基などを挙げることができる。 In the above formula, the radical generating group represented by R 1, is not particularly limited, R 1 -S bond by light or heat irradiation, dissociated into R 1 and S, respectively generate radicals Any one may be used, and examples thereof include a lower alkyl group, a lower cycloalkyl group, and an aralkyl group.
更に詳細には、低級アルキル基としては、炭素数が１ないし６の飽和鎖状炭化水素残基を意味し、例えば、メチル、エチル、メチルエチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを挙げることができる。低級シクロアルキル基としては、素数が３ないし６の環状炭化水素残基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを挙げることができる。アラルキル基としては、炭素数が７ないし１１の環状―鎖状炭化水素残基を意味し、ベンジル、メチルベンジル、ナフチルメチルなどを挙げることができる。 More specifically, the lower alkyl group means a saturated chain hydrocarbon residue having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include methyl, ethyl, methylethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and the like. it can. The lower cycloalkyl group means a cyclic hydrocarbon residue having a prime number of 3 to 6, and examples thereof include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and the like. The aralkyl group means a cyclic-chain hydrocarbon residue having 7 to 11 carbon atoms and includes benzyl, methylbenzyl, naphthylmethyl and the like.
この発明において、グラフト重合鎖は、基材にシランカップリング結合を介して固定した上記イニファターに対して、ビニルモノマーの存在下に光または熱照射による重合反応の結果、該基材上のシランカップリング剤とイニファター分子との間に挿入・伸長させて得ることができる。 In this invention, the graft polymer chain is a silane cup on the substrate as a result of a polymerization reaction by light or heat irradiation in the presence of a vinyl monomer with respect to the above-described iniferter fixed to the substrate via a silane coupling bond. It can be obtained by inserting and extending between a ring agent and an iniferter molecule.
また、この発明において使用できる基材としては、この発明のグラフト重合体が、特にＡＦＭなどのＳＰＭ探針・試料間の物理的相互作用力測定に基づく生体高分子間力測定に有用であるので、ＡＦＭ探針や、試料用基板などを使用するのが好ましいが、この発明の目的に適うものであれば、特に限定されるものではなく、マイクロスケールのプローブの他に、ナノチューブへの修飾、または作成したナノスケールのプローブなども包含される。 In addition, as the base material that can be used in the present invention, the graft polymer of the present invention is particularly useful for measuring the force between biopolymers based on the measurement of the physical interaction force between the SPM probe and sample such as AFM. It is preferable to use an AFM probe or a sample substrate, but it is not particularly limited as long as it meets the purpose of the present invention. In addition to a microscale probe, modification to a nanotube, Or the produced nanoscale probe etc. are also included.
次に、この発明に係る生体高分子固定可能なグラフト重合体の製造方法について説明する。
上記の構成からなるこの発明の生体高分子固定可能なグラフト重合体は、まず、シランカップリング剤等で処理して基材にイニファターを固定可能な化学官能基を導入した後、上記イニファターをそのシランカップリング剤分子との結合を介して基材に固定化する。なお、基材への固定化方法やシランカップリング法はいずれも当業者に公知の文献記載の方法に従って行なうことができる。
続いて、この基材に固定化したイニファターに対して、ビニルモノマーの存在下に光照射もしくは加熱することにより重合反応を起こして、該基材上のシランカップリング剤とイニファター分子との間にグラフト重合鎖を挿入・伸長させることができる。なお、この重合反応は非特許文献１１、１２、１３に記載の方法に従って行なうことができる。
Next, the manufacturing method of the graft polymer which can fix | immobilize the biopolymer based on this invention is demonstrated.
The graft polymer capable of fixing a biopolymer of the present invention having the above structure is first treated with a silane coupling agent or the like to introduce a chemical functional group capable of fixing an iniferter on a base material, and then the iniferter is added to the graft polymer. Immobilization to a substrate through bonding with silane coupling agent molecules. In addition, both the immobilization method to the base material and the silane coupling method can be performed according to methods described in literature known to those skilled in the art.
Subsequently, the iniferter immobilized on the base material is irradiated with light or heated in the presence of a vinyl monomer to cause a polymerization reaction, and between the silane coupling agent and the iniferter molecule on the base material. A graft polymer chain can be inserted and extended. This polymerization reaction can be carried out according to the methods described in
この発明に使用することができるビニルモノマーとしては、ビニル基を有するモノマーであれば、この発明の目的に適うものである限り、特に限定されるものではないが、例えば、アクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリル酸、スチレン、酢酸ビニル、ビニルアルコール、塩化ビニルなどが挙げられる。 The vinyl monomer that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a monomer having a vinyl group, as long as it is suitable for the purpose of the present invention. Examples thereof include acrylic acid, acrylamide, and acrylonitrile. Methacrylic acid, styrene, vinyl acetate, vinyl alcohol, vinyl chloride and the like.
なお、この重合反応においては、該イニファターは、前述したように、光または熱照射によりＲ1−Ｓ結合が解離して互いにラジカルを発生し、一方のラジカル（Ｓ側）はモノマー分子の重合開始剤となり、他方のラジカル（Ｒ1側）は重合停止剤として作用し、光または熱照射の間だけ一方のラジカルによる重合鎖が伸長すると共に、光または熱照射を停止すると他方のラジカルにより重合が停止する化合物を意味する。したがって、光または熱照射の時間を調節することによって、グラフト重合鎖の長さを自由に調節することができる。 In this polymerization reaction, as described above, the iniferter dissociates R 1 —S bonds by light or heat irradiation to generate radicals, and one radical (S side) is the start of polymerization of monomer molecules. The other radical (R 1 side) acts as a polymerization terminator, and the polymer chain by one radical is extended only during light or heat irradiation. When light or heat irradiation is stopped, polymerization by the other radical occurs. Means a compound that stops. Therefore, the length of the graft polymer chain can be freely adjusted by adjusting the time of light or heat irradiation.
この発明に係る生体高分子固定化グラフト重合体は、上記のようにして得られた生体高分子固定可能なグラフト重合体に対して、水溶性カルボジイミド、マレイミド、スクシンイミド等の架橋剤を用いる常法に従ってタンパク質などの生体高分子を結合させることによって得ることができる。 The biopolymer-immobilized graft polymer according to the present invention is a conventional method using a water-soluble carbodiimide, maleimide, succinimide, or other crosslinking agent for the biopolymer-immobilizable graft polymer obtained as described above. According to the above, it can be obtained by binding a biopolymer such as a protein.
次に、上述の生体高分子固定可能化学官能基を有するイニファターを用いるグラフト重合体を基材表面上に形成する方法をＡＦＭプローブおよびガラス基材上への修飾を例にして説明する。
（ＡＦＭプローブおよびガラス基材の修飾方法）
Next, a method for forming a graft polymer on the substrate surface using the above-described iniferter having a chemical functional group capable of immobilizing a biopolymer will be described by taking AFM probe and modification on a glass substrate as examples.
(Modification method of AFM probe and glass substrate)
−COOH基を持つイニファター（N-(dithiocarboxy)sarcosine, ＤＴＣＳ）を用いたＡＦＭプローブおよびガラス基材へのグラフト重合層修飾方法について、図４を参照して説明する。この方法では、まず、ＡＦＭ探針およびカバーガラスの両表面側にシラン化剤にて処理をした後、ＤＴＣＳを化学固定させ、ビニルモノマーなどの重合反応基質を共存させた状態でUV照射する。 An AFM probe using an iniferter having a —COOH group (N- (dithiocarboxy) sarcosine, DTCS) and a method for modifying a graft polymerization layer on a glass substrate will be described with reference to FIG. In this method, first, both surfaces of the AFM probe and the cover glass are treated with a silanizing agent, and then DTCS is chemically fixed, and UV irradiation is performed in a state where a polymerization reaction substrate such as a vinyl monomer coexists.
UV照射によりラジカル化された反応開始剤がモノマーを次々と重合し、光照射時間の制御によって一定の鎖長を持つグラフト重合高分子を作ることができる。光照射時間のコントロールによってグラフト重合鎖の鎖長をよく制御できることも、この方法の重要な特徴である。なお、光照射停止によって重合反応が止まった際には、イニファター分子がグラフト重合鎖の末端に留まった状態で残るので、イニファターの種類を選ぶことによって様々な自由末端特性を持つグラフト重合層を作成することができるという利点もある。 The reaction initiators radicalized by UV irradiation polymerize monomers one after another, and a graft polymerized polymer having a certain chain length can be made by controlling the light irradiation time. It is also an important feature of this method that the length of the graft polymer chain can be well controlled by controlling the light irradiation time. In addition, when the polymerization reaction stops due to light irradiation termination, the iniferter molecule remains in the state of staying at the end of the graft polymerization chain, so creating a graft polymerization layer with various free end characteristics by selecting the type of iniferter There is also an advantage that it can be done.
グラフト重合層修飾化されたＡＦＭプローブ上にタンパク質を固定して、同様の方法で基材表面に固定されたタンパク質との間の相互作用測定を行う際には、グラフト重合層間の付着が起こらないように親水性のモノマー基質を選ぶ必要性があるため、N、N-dimethylacrylamide（DMAAm）などのビニルモノマーを重合反応基質として選ぶのが好ましい。 When the protein is immobilized on the AFM probe modified with the graft polymerization layer and the interaction between the protein immobilized on the substrate surface is measured by the same method, adhesion between the graft polymerization layers does not occur. Therefore, it is preferable to select a vinyl monomer such as N, N-dimethylacrylamide (DMAAm) as a polymerization reaction substrate.
（作成されたグラフト重合層の特定）
ガラス基材とＡＦＭプローブ表面にグラフト重合層の状態の確認は次のようにして行なうことができる。グラフト重合層の状態としては、例えば、グラフト重合層の厚さ、鎖長、末端特性、鎖間または層間相互作用などを特定する必要がある。
UV強度を上げるまたは照射時間を長くすることによって、グラフト重合層の鎖長が伸長し、厚さは増加する。グラフト重合層の末端特性と鎖間または層間相互作用は、上述したように反応開始剤とモノマー基質の種類によって決めることができる。
(Identification of created graft polymerization layer)
The state of the graft polymerized layer on the glass substrate and the surface of the AFM probe can be confirmed as follows. As the state of the graft polymerization layer, it is necessary to specify, for example, the thickness of the graft polymerization layer, chain length, terminal characteristics, interchain or interlayer interaction, and the like.
By increasing the UV intensity or increasing the irradiation time, the chain length of the graft polymerization layer is extended and the thickness is increased. As described above, the terminal properties of the graft polymerization layer and the chain-to-chain or interlayer interaction can be determined by the types of the reaction initiator and the monomer substrate.
ガラス基材表面上に作成されたグラフト重合層の特性は、水接触角測定およびＡＦＭフォースカーブ測定方法によって特定する研究結果が既に発表されている（非特許文献１２、図５）。この研究結果により、親水性モノマーを重合基質とした場合には、一定のUV強度下では、グラフト重合層は30秒間の短時間内に“mushroom state”から“mushroom monolayer state”を経て “brush state”に変移し、表面が疎水性から親水性に変わるので、この変移過程を水接触角を測定することによって解析するができることが知られている。また、グラフト重合の厚さ変化は、ＡＦＭプローブで押しながら取ったForce-Distanceカーブによって予測できることも知られている（非特許文献１３）。
本発明におけるＡＦＭプローブ表面のグラフト化については、ＡＦＭプローブ表面が非常に小さいので、水接触角度測定による解析は不可能であるが、ＡＦＭフォースカーブ測定方法によってプローブ表面にグラフト重合層ができているかどうかは確認できることが判明した。
The research result which specifies the characteristic of the graft polymerization layer created on the glass substrate surface by the water contact angle measurement and the AFM force curve measurement method has already been published (Non-patent Document 12, FIG. 5). As a result of this study, when hydrophilic monomers are used as the polymerization substrate, the graft polymerized layer passes through the “mushroom monolayer state” through the “bush state” within a short period of 30 seconds under a certain UV intensity. It is known that this transition process can be analyzed by measuring the water contact angle since the surface changes from hydrophobic to hydrophilic. It is also known that the thickness change of graft polymerization can be predicted by a Force-Distance curve taken while pushing with an AFM probe (Non-patent Document 13).
Regarding the grafting of the AFM probe surface in the present invention, since the AFM probe surface is very small, analysis by water contact angle measurement is impossible, but is a graft polymerization layer formed on the probe surface by the AFM force curve measurement method? It turned out that it can be confirmed.
ＡＦＭプローブ表面とガラス基材表面にグラフト重合層を以下のようにして作成した。
ガラス基材をアセトン、脱イオン蒸留水（ＤＤＷ）、続いてエタノールで各２０分づつ超音波洗浄した。次に、ガラス基材は、ピラニア液（c-H2SO4 : 30%H2O2 = 7 : 3）で８０℃のオイルバスで１時間処理し、基材の表面をシラノール化するとともに、汚れを除去した。続いて、基材をＤＤＷで３回洗浄し、ピラニア液を完全に洗い流した後、脱水アセトンで５回洗浄し、水を完全に洗い流した。更に、脱水アセトン・トルエン（１：１）で洗浄した後、脱水トルエンで５回洗浄して、アセトンを完全に洗い流した。
更に、ガラス基材を、クロロメチルフェニルトリクロロシラン（蒸留トルエン中にシラン５％）中で、ＡｒまたはＮ2ガス置換状態で１８時間震盪し、シランカップリングした。その後、ガラス基材をトルエン、次にアセトンでそれぞれ２０分間超音波洗浄し、上記と同様にして、クロロメチルフェニルトリクロロシランによりシランカップリングを行い、更にトルエン、次にアセトンでそれぞれ２０分間超音波をかけながら再度洗浄した。再洗浄後、ガラス基材を１１５℃で１０分間乾燥処理し、トルエンとアセトンの吸着残留物を揮発除去させた。
A graft polymerization layer was prepared on the AFM probe surface and the glass substrate surface as follows.
The glass substrate was ultrasonically washed with acetone, deionized distilled water (DDW), followed by ethanol for 20 minutes each. Next, the glass substrate is treated with a piranha solution (cH 2 SO 4 : 30% H 2 O 2 = 7: 3) in an oil bath at 80 ° C. for 1 hour to make the surface of the substrate silanol and stain it. Was removed. Subsequently, the substrate was washed 3 times with DDW, and the piranha solution was completely washed away, and then washed 5 times with dehydrated acetone, and the water was washed away completely. Further, after washing with dehydrated acetone / toluene (1: 1), it was washed 5 times with dehydrated toluene to completely wash away acetone.
In addition, the glass substrate was shaken in chloromethylphenyltrichlorosilane (5% silane in distilled toluene) for 18 hours under Ar or N 2 gas substitution and silane coupled. Thereafter, the glass substrate was ultrasonically washed with toluene and then with acetone for 20 minutes, respectively, and silane coupling was carried out with chloromethylphenyltrichlorosilane in the same manner as described above. Washed again while applying. After rewashing, the glass substrate was dried at 115 ° C. for 10 minutes to volatilize and remove the adsorption residue of toluene and acetone.
続いて、反応開始剤としてＤＴＣＳの５％メタノール液中で４８時間震盪し、ガラス基材に反応開始剤を固定した。その後、ガラス基材をメタノールで５回洗浄した後、乾燥、密封、暗所状態で保存するかまたは下記の光イニファター重合反応を行った。
次に、蒸留DMAAmの1Mエタノール液300 ・Ｌを直径３５ mm
ガラスディッシュの真中においてある直径１５ mm カバーガラス基材上に載せ、直径３０ mm ガラスでカバーし、Ｎ2ガスを当てながらＵＶ照射をして光イニファター重合反応を行った。ＡＦＭプローブは、テフロン（登録商標）特製の小さいチャンバーの中に上向きで入れ、同じ方法で重合反応を行った。
Subsequently, the reaction initiator was shaken in a 5% methanol solution of DTCS for 48 hours as a reaction initiator to fix the reaction initiator to the glass substrate. Then, after wash | cleaning a
Next, 300mL of 1M ethanol solution of distilled DMAAm was 35 mm in diameter.
It was placed on a cover glass substrate having a diameter of 15 mm in the middle of the glass dish, covered with a glass having a diameter of 30 mm, and irradiated with UV while applying N 2 gas to carry out a photo-iniferter polymerization reaction. The AFM probe was placed upward in a small chamber made of Teflon (registered trademark) and the polymerization reaction was performed in the same manner.
図６に、ＵＶ照射時間制御によってガラス基材およびＡＦＭプローブ表面に作成された ？COOH自由端グラフト重合層のフォースカーブ測定結果を示す。図の左側のカーブは Deflection-Displacement プロットを示し、右はその Force-Extension (Force-Distance) プロットである。Force-Extension カーブの縦軸はカンチレバーにかかった力 (Deflection) を、横軸はＡＦＭプローブ先端のZ方向での移動距離 (Distance) を表している。グラフト重合反応の際のＵＶ強度は700 mW/cm2、UV照射時間は３分間とした。無修飾のガラス基材またはＡＦＭプローブ表面をグラフト化されていない際の対照表面とした。その結果から、ＡＦＭプローブ表面上に約30 nm厚さでグラフト重合層ができていることが確認できた。DTCS は親水性であり、付着現象は完全に解消されたことも確認された。 FIG. 6 shows that the glass substrate and the AFM probe surface were created by UV irradiation time control. The force curve measurement result of a COOH free end graft polymerization layer is shown. The left curve in the figure shows the Deflection-Displacement plot, and the right is the Force-Extension (Force-Distance) plot. The vertical axis of the Force-Extension curve represents the force applied to the cantilever (Deflection), and the horizontal axis represents the movement distance (Distance) of the tip of the AFM probe in the Z direction. The UV intensity during the graft polymerization reaction was 700 mW / cm 2 and the UV irradiation time was 3 minutes. An unmodified glass substrate or AFM probe surface served as a control surface when not grafted. From the results, it was confirmed that a graft polymerization layer was formed on the surface of the AFM probe with a thickness of about 30 nm. It was also confirmed that DTCS was hydrophilic and the adhesion phenomenon was completely eliminated.
以上の実験によって、ＡＦＭプローブとガラス基材表面上に−COOH自由端グラフト重合層が作成できていることを確認した後、グラフト重合層が共有結合で表面に固定されているかどうか、またグラフト重合層の鎖長分布について調べた。
ＵＶ強度800 mW/cm2、UV照射時間３分間の条件でガラス基材表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層にEDC処理を施し、アミノシラン化されたＡＦＭプローブを使って自由末端から引っ張った。EDCは、−COOH 基および−NH2 基の架橋剤で、[1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimide Hydrochloride]である。図７に、測定された鎖長延伸フォースカーブを示す。
図中、左のカーブは観察された幾つかの典型的な Deflection-Displacement プロットを示し、右はそのExtension (Force-Distance) プロットである。その結果、ガラス基材表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層のポリマー鎖長は50〜300 nmの範囲内であり、ポリマー鎖を切り離すRupture forceは1〜2 nNであることが判った。
Based on the above experiments, after confirming that the -COOH free-end graft polymerization layer was formed on the surface of the AFM probe and the glass substrate, whether the graft polymerization layer was covalently bonded to the surface, and whether graft polymerization was performed. The chain length distribution of the layer was investigated.
A -COOH free-end graft polymerization layer prepared on the surface of a glass substrate under the conditions of UV intensity of 800 mW / cm 2 and UV irradiation time of 3 minutes is subjected to EDC treatment, and from the free end using an aminosilanized AFM probe. I pulled. EDC is a crosslinking agent of —COOH group and —NH 2 group, and is [1-Ethyl-3- (3-Dimethylaminopropyl) -carbodiimide Hydrochloride]. FIG. 7 shows the measured chain length extension force curve.
In the figure, the left curve shows some typical Deflection-Displacement plots observed, and the right is its Extension (Force-Distance) plot. As a result, it was found that the polymer chain length of the -COOH free-end graft polymerization layer prepared on the surface of the glass substrate was in the range of 50 to 300 nm, and the Rupture force for breaking the polymer chain was 1 to 2 nN. It was.
さらに、同じ方法で、ＡＦＭプローブ表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層のポリマー鎖を自由末端から引き伸ばし、グラフト重合層が共有結合でプローブ表面に固定されているかどうかを調べた。その結果を図８に示す。その結果からは、ＡＦＭプローブ表面上に作成された−COOH自由端グラフト重合層のポリマー鎖長は200〜1000 nm範囲内であり、ポリマー鎖を切り離すRupture forceは2〜3 nNであることが判った。普通、共有結合を切り離す力も1〜3 nN範囲内であるため、今回の結果によってＡＦＭプローブとガラス基材表面上にできたグラフト重合層は共有結合によって表面上に固定されていることが確認できる。 Further, in the same manner, the polymer chain of the —COOH free-end graft polymerization layer prepared on the AFM probe surface was extended from the free end to examine whether the graft polymerization layer was covalently fixed to the probe surface. The result is shown in FIG. From the results, it can be seen that the polymer chain length of the -COOH free-end graft polymerization layer prepared on the surface of the AFM probe is in the range of 200 to 1000 nm, and the Rupture force for breaking the polymer chain is 2 to 3 nN. It was. Usually, since the force for breaking the covalent bond is also within the range of 1 to 3 nN, it can be confirmed from this result that the graft polymerization layer formed on the surface of the AFM probe and the glass substrate is fixed on the surface by the covalent bond. .
この発明において作成したグラフト重合層化表面上では、タンパク質など生体高分子が表面付着で変性されたり、立体方向性と自由度が制限されたり、ＡＦＭプローブと基板の表面接触で押しつぶれたりする他のタンパク質固定方法で見られる諸問題が解決できると同時に、ＡＦＭプローブと基板の表面の接触によって発生する非特異的な表面間付着現象も解消される。
以上の特徴から見ても、この発明に係るグラフト重合層を仲介したタンパク質のソフトハンドリング方法は全く新しい発想であり、ＡＦＭによる１分子の観察、操作または力測定分野での応用性が期待される。
そこで、この発明に係るグラフト重合層化ＡＦＭプローブをタンパク質のソフトハンドリングによる相互作用力の測定に応用した例について説明する。
On the graft polymerization layered surface created in the present invention, biopolymers such as proteins are modified by surface adhesion, steric directionality and freedom are limited, or they are crushed by surface contact between the AFM probe and the substrate. In addition to solving the problems seen in the protein immobilization method, non-specific surface-to-surface adhesion phenomenon caused by contact between the AFM probe and the surface of the substrate is also eliminated.
Even in view of the above characteristics, the protein soft handling method mediated by the graft polymerization layer according to the present invention is a completely new idea, and is expected to be applicable to the field of single molecule observation, manipulation or force measurement by AFM. .
Therefore, an example in which the graft polymerization layered AFM probe according to the present invention is applied to the measurement of the interaction force by soft handling of proteins will be described.
ここで、この発明のＡＦＭプローブの−COOH自由端グラフト重合層化技術を使って、ＡＦＭを使用して、グラフト重合層化ＡＦＭプローブを用いたタンパク質のソフトハンドリングによる微弱相互作用力の測定の検証実験を行った。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とそのモノクローナル抗体 (IgG1) を対象にして、グラフト重合層上での抗体・抗原相互作用力の測定実験を行った。また、その比較実験として、抗体・抗原をシラン化処理表面およびPEG3400修飾表面に固定した際の相互作用力の測定実験も同時に行い、この発明方法の特徴と実用性について比較、評価を行った。 Here, verification of weak interaction force measurement by soft handling of protein using graft polymerization layered AFM probe using AFM using -COOH free end graft polymerization layering technology of AFM probe of the present invention The experiment was conducted. Experiments were conducted on the antibody / antigen interaction force on the graft polymerization layer of human serum albumin (HSA) and its monoclonal antibody (IgG 1 ). As a comparative experiment, an experiment for measuring the interaction force when the antibody / antigen was immobilized on a silanized surface and a PEG3400-modified surface was performed at the same time, and the characteristics and practicality of the method of the present invention were compared and evaluated.
（実験目的）
ＨＳＡ抗体・抗原に対し、シラン化表面、PEG3400修飾表面およびPDMAAmグラフト重合層表面上での相互作用力測定を行い、それぞれの固定条件で観察されるフォースカーブの形態、力と延伸距離の測定値分布、特異的なフォースカーブの出現確率、非特異的なフォースカーブの割合などについて比較と評価を行う。それによって、この発明によるグラフト重合層化ＡＦＭプローブを用いたタンパク質のソフトハンドリングによる微弱相互作用力の測定方法の特徴と実用性を検証する。
(Experimental purpose)
Measures the interaction force on the silanized surface, PEG3400 modified surface and PDMAAm graft polymerized layer surface for HSA antibody / antigen, and measured force curve morphology, force and stretch distance observed under each fixing condition Comparison and evaluation of distribution, probability of appearance of specific force curve, ratio of non-specific force curve, etc. Thereby, the characteristics and practicality of the method for measuring the weak interaction force by the soft handling of the protein using the graft polymerization layered AFM probe according to the present invention are verified.
（実験原理）
抗体・抗原の相互作用力は、一般的に他のリガンドーレセプタ対に比べて強いとされているので、今回の実験試料にはアルブミン抗体・抗原を使用した。新しい固定条件で観察されるフォースカーブの形態、力と延伸距離の測定値分布、特異的なフォースカーブの出現確率、非特異的なフォースカーブの割合など諸状況については、他の方法を使った場合の結果を比べながら評価を行い、この発明方法の応用性を試験した。なお、三種類の固定方法の問題点については既に説明したので、ここでは実験方法と結果を中心に説明する。
(Experimental principle)
Since the interaction force between the antibody and the antigen is generally considered to be stronger than that of other ligand-receptor pairs, the albumin antibody / antigen was used for this experimental sample. Other methods were used for various situations, such as force curve morphology, force and stretch distance distribution, specific force curve appearance probability, and non-specific force curve ratio observed under new fixed conditions. Evaluation was made while comparing the results of the cases, and the applicability of the method of the present invention was tested. Since the problems of the three types of fixing methods have already been described, the experimental method and results will be mainly described here.
（実験方法）
ＨＳＡ抗体・抗原の３種類のタンパク質固定方法および相互作用力測定の基本原理をそれぞれ図９、図１０および図１１に示す。
図９に示すシラン化表面の場合には、一晩SH−シラン化剤でカップリングされた基材とプローブ表面上に抗体・抗原を固定する。図１０に示すPEG3400修飾表面の場合には、一晩SH−シラン化剤でカップリングされた基材とプローブ表面を20 mMのNHS-PEG3400-MALで1時間修飾した後、タンパク質固定を行う。
これに対して、図１１に示すグラフト重合層表面上での場合には、UV強度が840 mW/cm2で、 重合時間が3 minの条件で作成されたPDMMAm-DTCSグラフト重合層を0.1MのEDC（pH4.8）で一晩修飾した後、タンパク質固定を行う。
また、３種類のタンパク質固定条件と同様にして、非固定のタンパク質を1M Tris bufferで洗い流してから、PBS(-) buffer中で力測定を行った。
なお、これらのタンパク質固定は、ＨＳＡ抗原として 2 mg/ml のものを、抗体として 1 mg/mlのものを使い、タンパク質固定時間を約３時間にして行った。ＡＦＭによる力測定は、スキャン速度を500 nm/sec (スキャン距離は 500 nm で、 頻度は 0.5 Hz) に設定した状態で行った。マイクロカンチレバーはオリンパス製の OMCL TR400PSA の長いカンチレバー（バネ定数20 pN/nm）を使用した。
(experimental method)
FIG. 9, FIG. 10, and FIG. 11 show the basic principle of the three types of HSA antibody / antigen immobilization methods and the interaction force measurement, respectively.
In the case of the silanized surface shown in FIG. 9, the antibody / antigen is immobilized on the probe surface and the base material coupled with the SH-silanating agent overnight. In the case of the PEG3400 modified surface shown in FIG. 10, the base material coupled with the SH-silanating agent and the probe surface are modified with 20 mM NHS-PEG3400-MAL for 1 hour, and then the protein is immobilized.
On the other hand, in the case of the surface of the graft polymerization layer shown in FIG. 11, a PDMMAm-DTCS graft polymerization layer prepared under the conditions of a UV intensity of 840 mW / cm 2 and a polymerization time of 3 min is 0.1M. After overnight modification with EDC (pH 4.8), protein fixation is performed.
In the same manner as in the three types of protein immobilization conditions, non-immobilized protein was washed away with 1M Tris buffer, and then force measurement was performed in PBS (−) buffer.
These protein immobilizations were performed using 2 mg / ml HSA antigen and 1 mg / ml antibody, and the protein immobilization time was about 3 hours. The force measurement by AFM was performed with the scanning speed set to 500 nm / sec (scanning distance was 500 nm and frequency was 0.5 Hz). The micro cantilever used was a long cantilever (spring constant 20 pN / nm) of OMCL TR400PSA manufactured by Olympus.
（実験結果と考察）
ＨＳＡ抗体・抗原に対し、シラン化表面、PEG3400修飾表面およびグラフト重合層表面上での相互作用力測定を行って、フォースカーブの形態特性を調べた後、それぞれの場合に観察された典型的なフォースカーブを非吸着型、付着型、シングルピーク型、ダブルピーク型、マルチピーク型に分けて、それらの形態特性を図１２にまとめた。
まず、シラン化表面上では、８割のフォースカーブに付着現象が見られたのに対して、PEG3400修飾表面では付着力の出現は１割程度に留まり、グラフト重合層表面上ではほとんど付着力は確認されなかった。
また、シラン化表面上では、ほとんどの場合にマルチフォースピーク現象が観察され、特異的なフォースピークと非特異的なフォースピークの区別が難しい場合がほとんどだった。他方、マルチフォースピークの場合には、最後に現れるピークを力測定値データとして使っているが、それが必ずしも特異的なものであるとは言えないため、この方法で測定されたタンパク質間相互作用力の測定値には誤差が予想される。
(Experimental results and discussion)
For the HSA antibody / antigen, the interaction force was measured on the silanized surface, the PEG3400 modified surface and the surface of the graft polymerization layer to examine the morphological characteristics of the force curve. The force curve is divided into a non-adsorption type, an adhesion type, a single peak type, a double peak type, and a multi peak type, and their morphological characteristics are summarized in FIG.
First, on the silanized surface, an adhesion phenomenon was observed in an 80% force curve, whereas on the surface modified with PEG3400, the adhesive force appeared only about 10%, and on the surface of the graft polymerization layer almost no adhesion force was observed. It was not confirmed.
On the silanized surface, the multi-force peak phenomenon was observed in most cases, and it was almost difficult to distinguish between a specific force peak and a non-specific force peak. On the other hand, in the case of multiforce peaks, the last peak appears as force measurement data, but it is not necessarily specific, so the protein-protein interaction measured by this method Errors are expected in force measurements.
表１は、ＨＳＡ抗体・抗原の三種類の違うタンパク質固定条件で示したフォースカーブの統計比較を示す。
３種類の固定条件で得られた力測定データを統計し、図１３で示したように力と延伸距離の分布図を作成した。これを上述の吸着割合結果と一緒にまとめてみると、表１で示したような結果が得られた。この統計結果からは、シラン化表面上での力測定値は、他の２つの方法の場合よりは少し高めになっていることが判る。ところが、吸着現象の影響が少ないPEG3400修飾表面とグラフト重合層表面では、力測定値はそれぞれ64 ± 34 pNと73 ± 35pNであり、お互いに僅か11 pNの差があったに過ぎない。この結果から、グラフト重合層表面上でのタンパク質固定では、非特異的なフォースカーブの割合が減少し、付着現象を抑えることが確認された。 The force measurement data obtained under the three types of fixed conditions were statistically analyzed, and a distribution diagram of force and stretching distance was created as shown in FIG. When this was put together with the above-mentioned adsorption ratio results, the results shown in Table 1 were obtained. From this statistical result, it can be seen that the force measurement on the silanized surface is slightly higher than in the other two methods. However, on the PEG3400 modified surface and the graft polymerized layer surface, where the effect of the adsorption phenomenon is small, the measured force values are 64 ± 34 pN and 73 ± 35 pN, respectively, and there is only a difference of 11 pN from each other. From this result, it was confirmed that the protein immobilization on the surface of the graft polymerization layer reduces the non-specific force curve ratio and suppresses the adhesion phenomenon.
また、付着現象の確率については、PEG3400修飾表面またはグラフト重合層上では非特異的な吸着現象は少なかったが、プローブを基材表面により強い力で押し付けた場合だけは、時々付着現象が観察された（図１４）。この現象は、グラフト重合層よりもPEG3400修飾表面上での場合にはよく見られた。その原因は図１５に模式的に示すように、固体表面上でのグラフト重合層作成に使われる二種類の方法である"Grafting from"および"Grafting to"基本的な特徴によるものだと考えられる。"Grafting from"法では、モノマーが表面から重合し高密度でポリマーが成長してくるため、UV照射時間が長くなるのにつれて「ブラシ状」の重合層が形成されることに起因して、ＡＦＭプローブで押し付けた際の「クッション」機能が強くなる。一方、"Grafting to"法では、ランダムコイル状態のポリマーが溶液中から表面に吸着してくるため、最高の密度で吸着した場合でも「マッシュルーム」の単分子層状態での被覆が限界であり、形成されるポリマーグラフト層は「ブラシ状」には至らないことが知られている。このため、ＡＦＭプローブで押し付けた際の「クッション」機能が弱くなるものと考えられる。
したがって、本実験においても、PEG3400修飾表面上では、グラフト重合層のようにポリマー鎖がブラシ状にはなっておらず、ポリマー鎖の固定密度が比較的に低く、強い力でプローブを基材に押し付けた場合には、固体表面間に直接的な接触が起こりやすくなっていることが予測される。グラフト重合層上では、その現象は解消される。
In addition, regarding the probability of the adhesion phenomenon, there was little non-specific adsorption phenomenon on the PEG3400 modified surface or graft polymerization layer, but the adhesion phenomenon was sometimes observed only when the probe was pressed against the substrate surface with a stronger force. (FIG. 14). This phenomenon was more common on the PEG3400 modified surface than the graft polymerized layer. The cause is considered to be due to the basic characteristics of “Grafting from” and “Grafting to” which are two kinds of methods used for making a graft polymerization layer on a solid surface, as schematically shown in FIG. . In the “Grafting from” method, the monomer is polymerized from the surface and the polymer grows at a high density, so that a “brush-like” polymerized layer is formed as the UV irradiation time becomes longer. The “cushion” function when pressed with a probe is strengthened. On the other hand, in the “Grafting to” method, the polymer in a random coil state is adsorbed from the solution to the surface, so even when adsorbed at the highest density, the coating in the monolayer state of “mushroom” is the limit, It is known that the polymer graft layer formed does not reach a “brush shape”. For this reason, it is considered that the “cushion” function when pressed by the AFM probe is weakened.
Therefore, even in this experiment, on the PEG3400 modified surface, the polymer chain is not brushed like the graft polymerized layer, the fixing density of the polymer chain is relatively low, and the probe is used as a substrate with a strong force. When pressed, direct contact between the solid surfaces is likely to occur. The phenomenon is eliminated on the graft polymerization layer.
ＨＳＡ抗体・抗原に対し、シラン化表面、PEG3400修飾表面およびPDMAAmグラフト重合層表面上で行った相互作用力測定結果から、今回我々が開発した「グラフト重合層修飾ＡＦＭプローブを用いたタンパク質のソフトハンドリングによる微弱相互作用力の測定」法は、他の方法に比べて種々の面で優れており、ＡＦＭによる生体高分子の精密一分子観察、操作、力測定などに実用化できることがわかった。 From the results of interaction force measurements performed on silanized surfaces, PEG3400-modified surfaces, and PDMAAm graft-polymerized layer surfaces for HSA antibodies / antigens, we developed “Soft handling of proteins using graft-polymerized layer-modified AFM probes” It was found that the “measurement of weak interaction force by” is superior to other methods in various aspects, and can be put to practical use for precise single-molecule observation, manipulation, force measurement of biopolymers by AFM.
Claims (29)
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]：
で表されるチウラムジスルフィドであることを特徴とする生体高分子固定可能なグラフト重合体。 The graft polymer capable of immobilizing a biopolymer according to claim 1 or 2, wherein the iniferter is represented by the general formula [I]:
Dithiocarbamate represented by the general formula [II]:
A graft polymer capable of immobilizing a biopolymer, characterized by being a thiuram disulfide represented by the formula:
で表されるジチオカルバメートまたは一般式[II]：
で表されるチウラムジスルフィドであることを特徴とする生体高分子固定可能グラフト重合体の製造方法。 The method for producing a biopolymer-fixable graft polymer according to claim 8 or 9, wherein the iniferter has the general formula [I]:
Dithiocarbamate represented by the general formula [II]:
A biopolymer-immobilizable graft polymer, characterized in that it is thiuram disulfide represented by the formula:
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