JP2005154402A

JP2005154402A - 金属錯体タンパク質複合体及び酸化触媒

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Publication number: JP2005154402A
Application number: JP2004080917A
Authority: JP
Inventors: Yoshito Watanabe; 芳人渡辺; Takashi Ueno; 隆史上野; Masataka Ohashi; 雅卓大橋; Tomomi Koshiyama; 友美越山; Norihiko Yokoi; 紀彦横井
Original assignee: Nagoya Industrial Science Research Institute
Current assignee: Nagoya Industrial Science Research Institute
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-06-16

Abstract

【課題】不斉配位子ではなく容易に入手可能な配位子を用いて合成することができ、酸化反応を良好に促進する。
【解決手段】キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに式（１）のサレン金属錯体を挿入した構造を有する、金属錯体タンパク質複合体。
【化１】

（式（１）中、Ｍは金属原子であり、Ｒ¹〜Ｒ¹⁰はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜５のアルコキシ基である）
【選択図】なし

Description

本発明は、新規な金属錯体タンパク質複合体及び酸化触媒に関する。

これまでに、本発明者は、酵素貯蔵タンパク質であるミオグロビン（Ｍｂ）からヘムを除いたアポミオグロビン（ａｐｏ−Ｍｂ）のキャビティーに、サロフェン金属錯体を非共有結合的に挿入した金属錯体タンパク質複合体を提案している。例えば、マンガンにＮ，Ｎ’−ビス（サリチリデン）−１，２−フェニレンジアミンを配位させた金属錯体をアポミオグロビンのキャビティーに保持した金属錯体タンパク質複合体を合成し、この種の複合体がチオアニソールの不斉酸化反応に有用であることを報告している（非特許文献１参照）。
第１６回生体機能関連シンポジウム講演要旨集、「１Ｓ１−１１アポミオグロビンキャビティーへの金属錯体挿入による人工酵素の構築」（２００１年９月発行）

しかしながら、上述したサロフェン錯体を用いた複合体では、酸化反応の反応性やエナンチオ選択性が十分とはいえないことから、より高活性な複合体の開発が望まれていた。

本発明は、新規な金属錯体タンパク質複合体を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、新規な酸化触媒を提供することを目的の一つとする。

本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、酸化触媒として有用な新規な金属錯体タンパク質複合体を見い出した。すなわち、本発明の金属錯体タンパク質複合体は、キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに、式（１）のサレン金属錯体を挿入した構造を有するものである。

（式（１）中、Ｍは金属原子であり、Ｒ¹〜Ｒ¹⁰はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、分岐があってもよい炭素数１〜５のアルキル基又は分岐があってもよい炭素数１〜５のアルコキシ基である）

本発明の金属錯体タンパク質複合体は、不斉配位子ではなく容易に入手可能な配位子を用いて合成することができるし、酸化反応を良好に促進することができる。例えば、スルフィド酸化における反応性やエナンチオ選択性を良好にすることができる。

式（１）中、Ｍは鉄、マンガン、クロム、コバルト又はニッケルが好ましく、マンガン又はクロムがより好ましく、マンガンが特に好ましい。また、Ｒ¹及びＲ⁵はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ²〜Ｒ⁴及びＲ⁶〜Ｒ¹⁰は水素原子であることが好ましく、このときＲ¹及びＲ⁵は同じ基であって炭素数１〜５のアルキル基であることがより好ましい。ここで、炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基又はｎ−プロピル基が好ましい。また、Ｒ¹及びＲ⁵の置換基の大きさは、サレン金属錯体がタンパク質のキャビティー内に固定される位置を決定する要因であり、反応基質の取り込みやすさに影響する要因であるため、金属種、タンパク質のキャビティーの大きさ、反応基質等に応じて適宜決定するのが好ましい。

本発明の金属錯体タンパク質複合体の合成方法としては、幾つかの方法が考えられるが、代表的には以下の２通りの方法がある。一つは、キャビティーを持つタンパク質類のキャビティーに金属錯体を挿入する方法であり、もう一つは、キャビティーを持つタンパク質類が存在する系内に、キャビティーに挿入しようとする金属錯体の製造原料（反応することにより金属錯体となるもの）を入れてその系内で金属錯体を合成すると同時にキャビティーに金属錯体を挿入する方法である。前者の方法としては、例えば、キャビティーを持つタンパク質類と金属錯体とをタンパク質類と金属との当量比が１：０．５〜１００、好ましくは１：１．１〜２となるように混合することが挙げられる。このときの溶媒としては、水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒、水−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合溶媒、水−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）混合溶媒、水のみなどが好ましく、そのうち水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒が特に好ましい。また、混合時の温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜４℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜３０分が好ましい。また、後者の方法としては、例えば、タンパク質類と金属との当量比が１：０．５〜１００、好ましくは１：１．１〜２となるように混合することが挙げられる。このときの溶媒としては、水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒、水−ＤＭＦ混合溶媒、水−ＤＭＳＯ混合溶媒、水のみなどが好ましく、そのうち水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒が特に好ましい。また、混合時の温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜４℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜１時間が好ましい。これら以外の方法として、担体に担持されたタンパク質類のキャビティーに前記２通りの方法のいずれかを用いて金属錯体を挿入する方法や、一旦金属錯体タンパク質複合体を調製したあと金属錯体の配位子を別の配位子に交換する方法を採用してもよい。なお、タンパク質類のキャビティーに入れる金属錯体のカウンターアニオンとしては、特に限定されるものではなく、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオンなどのハロゲンアニオンのほか、テトラフルオロボレートアニオンやパークロレートアニオンなどが挙げられる。

本発明に用いられるタンパク質類としては、例えば、金属錯体の金属が配位可能なアミノ酸残基又は金属錯体の配位子と非共有結合可能なアミノ酸残基をキャビティーに有するタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体であってもよいし、ヘムを含むタンパク質からヘムを除くことによりヘムの存在していた部位をキャビティーにしたものであってもよい。具体的には、アポミオグロビン、アポヘモグロビン、アポヘムオキシゲナーゼ、アポカタラーゼ、アポシトクロム、アポフェリチン又はそれらの変異体などが挙げられる。なお、「アポ」とは、補因子又は補欠分子族などが欠損しているタンパク質を表す接頭語であり、アポミオグロビン、アポヘモグロビン等はヘムが欠損しており、アポフェリチンは鉄イオンが欠損している。また、タンパク質類の変異体としては、タンパク質類のキャビティーに挿入された金属錯体の化学反応場に影響を与える位置のアミノ酸残基を化学反応に適したアミノ酸残基に変異させたものが好ましい。例えばアポミオグロビンの変異体としては、アポミオグロビン（１５３個のアミノ酸よりなるポリペプチド鎖）の６４番目、７１番目、９３番目、１０７番目などのアミノ酸残基を変異させたものが挙げられ、このうち６４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ６４）と７１番目のアラニン（Ａｌａ７１）を変異させたものが好ましく、Ｈｉｓ６４をアスパラギン酸にＡｌａ７１をグリシンに変異させたものが特に好ましい。また、タンパク質類としてアポミオグロビン又はその変異体を用いる場合、９３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ９３）のイミダゾール骨格中の窒素原子Ｎ
とサレン金属錯体の金属原子との距離が０．２０５〜０．２４５ｎｍ（２．０５〜２．４５Å）であることが好ましい。金属種によって活性最適化の位置は異なっていると考えられるため、各金属ごとに最適な距離を決めることが好ましい。この距離は、分子動力学計算から求めることができる。

本発明の酸化触媒は、上述した金属錯体タンパク質複合体からなるものであり、酸化反応を促進するものである。本発明の酸化触媒を利用すれば、酸化反応速度が向上したり、反応生成物のエナンチオ選択性が向上したりする。本発明の酸化触媒の使用量は、反応容器や経済性によって異なるが、反応基質とのモル比Ｓ／Ｃ（Ｓは基質、Ｃは触媒）が１０〜１００００、特に５０〜５０００の範囲で用いることが好ましい。反応基質は、酸化される部位を有する化合物であれば特に限定されないが、例えばメチルフェニルスルフィド（チオアニソール）、エチルフェニルスルフィドなどに代表されるアルキルフェニルスルフィドや、メチルベンジルスルフィド、エチルベンジルスルフィドなどに代表されるアルキルベンジルスルフィドなどのスルフィド類が挙げられる。酸化反応の溶媒としては、例えば、水、水と低級アルコール（メタノール、エタノールなど）の混合溶媒、水と低級ケトン（アセトン、メチルエチルケトンなど）の混合溶媒、水とＤＭＦの混合溶媒、水とＤＭＳＯの混合溶媒などが挙げられる。反応温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜５０℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜１０時間が好ましい。この酸化反応は、反応形式がバッチ式においても連続式においても実施することができる。

次に、本発明を実施するための最良の形態を実施例を用いて説明する。

［実施例１］
３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ配位子（図１参照）を以下のようにして合成した。エタノール１０ｍｌに３−メチルサリチルアルデヒド０．２７ｇ（２ｍｍｏｌ，アルドリッチ社）を溶かし、その溶液にエチレンジアミン０．０６ｇ（１ｍｍｏｌ）を滴下し、９０℃で２時間還流した。エバポレータにより溶媒を除去すると、３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ配位子が黄色の生成物として得られた。

続いて、［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-（図２参照）を以下のようにして合成した。まず、エタノール８ｍｌに、３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ配位子５０ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を溶かし、その溶液にＭｎＣｌ₂・Ｈ₂Ｏ３３ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）を加え、８５℃で４時間還流した。室温で一晩撹拌し、濃縮すると茶色の沈殿（［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺Ｃｌ^-）が得られた。［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］］⁺Ｃｌ^- １５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに溶かし、ＡｇＢＦ₄７．７ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を加え７５℃で６時間還流した。室温で一晩撹拌した後濃縮し、エーテルを加えていくと、［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-が茶色の生成物として得られた。

続いて、サレン金属錯体アポミオグロビン複合体（図３参照）を以下のようにして合成した。なお、以下の作業はすべて４℃で行った。まず、公知文献(T.Matsui et al. J.Am.Chem.Soc., 1999, vol121, p9952-9957)に従って、ミオグロビンの６４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンをアスパラギン酸に変異させ、７１番目のアミノ酸残基であるアラニンをグリシンに変異させた。次に、このように変異させたミオグロビンを、公知文献(F.Ascole et al. Method Enzymol. 1981, vol76, p72-87)に記載された酸−ブタノン法に従ってアポ化し、１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファーｐＨ７．０，６Ｌで６時間透析することにより、アポミオグロビンを得た。このアポミオグロビンをａｐｏ−Ｈ６４Ｄ／Ａ７１ＧＭｂと称する。このアポミオグロビン溶液に１−１．５等量の［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-のメタノール溶液を滴下し、１０分間放置した後、１０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファーｐＨ６．０，１Ｌで６時間透析した。再構成した複合体は、ゲルろ過クロマトグラフィーであるＧ２５とＧ５０（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファｐＨ７．０）により単離生成を行った。複合体の同定は、ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ（電子スプレー式イオン化法を用いた飛行時間型質量分析）、ＵＶ−ｖｉｓ、原子吸光法によって行った。このときのＭＳ分析値は１７６４３．２であり、計算値１７６４３．０とよく一致していた。また、ＵＶ−ｖｉｓ分析では２８１ｎｍ（３．７×１０⁵）、３１７ｎｍ（３．３×１０⁴）であった。なお、Ｇ２５はSephadex G25 Medium（アマシャムバイオサイエンス社製）で、Ｇ５０はSephadex G50 Superfine（アマシャムバイオサイエンス社製）である。また、上述した例では、金属錯体のカウンターアニオンとして、複合体の生成し易さを考慮してテトラフルオロボレートアニオンを採用したが、塩素イオンを採用してもよい。

このようにして得られたサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いてチオアニソールのスルフォキシドへの不斉酸化反応を以下のようにして行った。１０μＭのサレン金属錯体アポミオグロビン複合体溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．０）に、１ｍＭチオアニソール、１ｍＭ過酸化水素、内部標準物質であるアセトフェノンを加え、３５℃で１０分間反応させた後、反応生成物を０．５ｍｌのジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタンをエアーで除去し、１０％イソプロピルヘキサン溶液に溶解させ、ダイセルキラルセルＯＤカラム（Daicel chiralcel OD column）を用い、ＨＰＬＣ（島津ＬＣ−１０ＡＤポンプシステム（Shimadzu LC-10AD pump system））、島津ＳＰＤ−１０Ａスペクトロメーター（Shimadzu SPD-10A spectrphotometer））、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０）により分析した。その結果、反応速度（１分あたりのターンオーバー数）及びエナンチオ選択性は、図５のとおりであった。なお、生成物の濃度は、ＨＰＬＣにおける内部標準物質と生成物とのピーク面積強度比に基づいて決定した。

また、チオアニソールの不斉酸化反応に準じて、エチルフェニルスルフィドやベンジルメチルスルフィドの不斉酸化反応を行ったところ、前者は２７ｅｅ％（Ｓ）、５９３×１０^-3ターンオーバー数／分、後者は３９ｅｅ％（Ｒ）、５０３×１０^-3ターンオーバー数／分であった。

［実施例２］
実施例１に準じて、３，３’−Ｅｔ₂−ｓａｌｅｎ配位子（図１の３，３’位がＥｔのもの）、［Ｍｎ^III（３，３’−Ｅｔ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-（図２の３，３’位がＥｔのもの）、これを用いたサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を合成した。この複合体のＭＳ分析値は１７６６９．６であり、計算値１７６７１．１とよく一致していた。得られたサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いたチオアニソールの酸化反応を行った。その結果を図５に示す。

［実施例３］
実施例１に準じて３，３’−Ｐｒ₂−ｓａｌｅｎ配位子（図１の３，３’位がｎ−Ｐｒのもの）、［Ｍｎ^III（３，３’−Ｐｒ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-（図２の３，３’位がｎ−Ｐｒのもの）、これを用いたサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を合成した。この複合体のＭＳ分析値は１７６９８．５であり、計算値１７６９９．１とよく一致していた。得られたサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いたチオアニソールの酸化反応を行った。その結果を図５に示す。

［比較例１］
実施例１で得た［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-をアポミオグロビンと複合化せずそのまま用いてチオアニソールの酸化反応を実施例１に準じて行った。その結果を図５に示す。

［比較例２］
実施例１に準じて、３，３’−［Ｍｎ^III（３，３’−Ｍｅ₂−ｓａｌｏｐｈｅｎ）］⁺ＢＦ₄ ^-を作成し、これとアポミオグロビンａｐｏ−Ｈ６４Ｄ／Ａ７１ＧＭｂとを複合化してサロフェン金属錯体アポミオグロビン錯体（図５参照）を合成し、得られたサロフェン金属錯体アポミオグロビン錯体を用いてチオアニソールの酸化反応を行った。その結果を図５に示す。

［結果］
図５に示すように、サレン金属錯体をアポミオグロビンと複合化せずに用いた場合（比較例１）には、反応活性が６２と低くエナンチオ選択性も全く見られなかったが、サレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いた場合（実施例１〜３）には、反応活性が１３５〜４６４と高くなりエナンチオ選択性も見られるようになった。また、サロフェン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いた場合（比較例２）とサレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いた場合（実施例１）とを比較すると、反応活性は前者が１５８に対して後者が４６４と大きく向上し、エナンチオ選択性は前者が２３ｅｅ％（Ｓ体）に対して後者が３２ｅｅ％（Ｓ体）と向上した。また、サレン金属錯体アポミオグロビン複合体を用いた場合、３，３’位の置換基がメチル基では３２ｅｅ％（Ｓ体）だが、エチル基では６ｅｅ％まで下がり、ｎ−プロピル基では１３ｅｅ％（Ｒ体）と逆のエナンチオマーが過剰となった。

なお、３，３’位が水素原子のサレン錯体アポミオグロビン複合体やサロフェン錯体アポミオグロビン複合体も合成したが、実施例１〜３の複合体と比べて不安定であった。

［結晶構造］
ミオグロビンは、１５３個のアミノ酸より成るポリペプチド鎖と、鉄−ポリフィリン（ヘム）補欠分子族を含んでいるが、そのときに鉄と配位しているのはポリペプチド鎖の９３番目のヒスチジンのイミダゾール骨格にある窒素原子（Ｈｉｓ９３Ｎ）である。このため、今回のサレン金属錯体アポミオグロビン複合体についても、このＨｉｓ９３Ｎと金属との距離が酸化反応の反応性やエナンチオ選択性を決定するパラメータになり得る。そこで、実施例１のサレン金属錯体アポミオグロビン複合体につき、この距離を以下のようにして算出した。

実施例１のサレン金属錯体アポミオグロビン複合体自身は結晶化に成功していないが、比較例２のサロフェン金属錯体アポミオグロビン複合体のアポミオグロビンをａｐｏ−Ａ７１ＧＭｂ（７１番目のアミノ酸残基であるアラニンをグリシンに変異させたアポミオグロビン）としたものを別途合成したところ結晶化に成功した。このため、その結晶構造データを元にした分子動力学計算の結果から、実施例１の複合体についてマンガンとＨｉｓ９３Ｎ
との距離を求めたところ、０．２２８ｎｍ（２．２８Å）であった。なお、結晶構造解析には、リガク社製のＸ線発生装置（RigakuFR-E）, 検出器（Rigaku R-AXIS VII）を用いた。また、ソフトウェアはAFMB-CNRS社のTURBO-FRODO、ハードウェアは日本SGI社製のワークステーションUNIX Octaneを用いた。分子動力学計算は、アクセルリス社のソフトウェアinsightII/Discover3.0、ワークステーションUNIX Octaneを用いて行った。パラメータはＥＳＦＦ force fieldを用いた。

サレン配位子の説明図である。サレン金属錯体の説明図である。サレン金属錯体アポミオグロビン複合体の説明図である。サロフェン金属錯体アポミオグロビン複合体の説明図である。チオアニソールの不斉酸化反応の結果を表すテーブルである。

Claims

キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに式（１）のサレン金属錯体を挿入した構造を有する、金属錯体タンパク質複合体。

（式（１）中、Ｍは金属原子であり、Ｒ¹〜Ｒ¹⁰はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜５のアルコキシ基である）
前記式（１）中、Ｍは鉄、マンガン、クロム、コバルト又はニッケルであり、Ｒ¹及びＲ⁵はそれぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ²〜Ｒ⁴及びＲ⁶〜Ｒ¹⁰は水素原子である、請求項１に記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記式（１）中、Ｒ¹及びＲ⁵は同じ基であってメチル基、エチル基又はｎ−プロピル基であり、Ｒ²〜Ｒ⁴及びＲ⁶〜Ｒ¹⁰は水素原子である、請求項１又は２に記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、前記サレン金属錯体の金属が配位可能なアミノ酸残基又は前記サレン金属錯体の配位子と非共有結合可能なアミノ酸残基を前記キャビティーに有するタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、ヘムを含むタンパク質からヘムを除くことによりヘムの存在していた部位をキャビティーにしたタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体である、請求項１〜４のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、アポミオグロビン、アポヘモグロビン、アポヘムオキシゲナーゼ、アポカタラーゼ、アポシトクロム、アポフェリチン又はそれらの変異体である、請求項１〜５のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、アポミオグロビン又はそれらの変異体であって９３番目のアミノ酸残基であるヒスチジンのイミダゾール骨格中の窒素原子Ｎ
と前記サレン金属錯体の金属原子との距離が０．２０５〜０．２４５ｎｍである、請求項１〜６のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、アポミオグロビンの６４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンと７１番目のアミノ酸残基であるアラニンとを変異させたアポミオグロビン変異体である、請求項１〜７のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
前記タンパク質類は、アポミオグロビンの６４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンをアスパラギン酸に変異させ７１番目のアミノ酸残基であるアラニンをグリシンに変異させたアポミオグロビン変異体である、請求項８に記載の金属錯体タンパク質複合体。
請求項１〜９のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体であって、酸化反応を促進する機能を有する酸化触媒。
スルフィド類の不斉酸化反応を促進する機能を有する請求項１０に記載の酸化触媒。