JP2005151867A - Autoimmune disease model animal - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a model animal having an autoimmune disease by a new mechanism of developing glomerulonephritis caused by gradually degrading the internal structure of kidney(glomeruli) or splenomegaly where spleen size enlarges beyond the normal range, and to provide a method for screening prophylactic/therapeutic agents for autoimmune diseases including glomerulonephritis and splenomegaly using the model animal. <P>SOLUTION: The model animal is a mouse(MFG-E8<SP>-/-</SP>mouse) with a gene expressing a milk fat globule-coated glycoprotein( milk fat globule EGF factor-8; MFG-E8 ) identified as a factor promoting the phagocytosis of apoptosis cells is deleted. Using the model animal thus created and after administered with a test substance, the extent of ameliorating a symptom such as glomerulonephritis, splenomegaly or human systemic erythematodes and the phagocytosis of apoptosis cells in the spleen and tingible body macrophage of lymph node of the model animal in the presence of the test substance is assessed. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等を発症する自己免疫疾患病態モデル動物と、それを用いた糸球体腎炎や脾腫等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法などに関する。   The present invention relates to an animal model of an autoimmune disease pathology that develops glomerulonephritis caused by the gradual destruction of the internal structure of the kidney (glomera), splenomegaly in which the size of the spleen expands beyond the normal range, and the like. The present invention also relates to a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases such as glomerulonephritis and splenomegaly.

生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹起するようにプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスは、老化した細胞や病態細胞などの生体にとって好ましくない細胞を排除するために生体に備わった機構である。アポトーシスでは細胞のサイズは急速に縮小し、また細胞核も凝縮、断片化する。ついで、このアポトーシス細胞はアポトーシス小体となり、最終的にはマクロファージ等の食細胞により貪食される。すなわち、まず細胞が縮小して隣接細胞から離れ、核のＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチンが核膜周辺に凝縮し、核の濃縮が生じると共に細胞表面の微絨毛が消失して平滑化し、大小の突起が出現し、やがてそれらがくびれてちぎれ、膜に包まれた大小の球状のアポトーシス小体に断片化し、これらの小体がマクロファージや隣接する食細胞により貪食除去される。   Cell death, which is programmed to actively trigger cells under physiological conditions, that is, apoptosis is a mechanism that is built in the body to eliminate cells that are undesirable for the body, such as aging cells and pathological cells. is there. Apoptosis rapidly reduces cell size and condenses and fragments the cell nucleus. Subsequently, the apoptotic cells become apoptotic bodies, and finally phagocytosed by phagocytic cells such as macrophages. That is, the cells first shrink and move away from neighboring cells, and the chromatin, which is a complex of nuclear DNA and protein, is condensed around the nuclear membrane, resulting in the concentration of the nucleus and the microvilli on the cell surface disappearing and smoothing. Large and small protrusions appear, eventually they are constricted and broken, and fragmented into large and small spherical apoptotic bodies encased in membranes, which are phagocytically removed by macrophages and adjacent phagocytic cells.

このように、アポトーシスは有害又は無用な細胞を除去するプロセスであり、哺乳類のホメオスタシスを維持するのに欠かせない（例えば、非特許文献１参照）。アポトーシス細胞は食細胞によって速やかに取り込まれ、それが炎症や、瀕死の細胞から放出される細胞内の抗原に対する自己免疫反応を防ぐと考えられている（例えば、非特許文献２，３参照）。アポトーシス細胞の表面に露出しているホスファチジルセリン（ＰＳ；phosphatidylserine）は、マクロファージの有用な認識シグナルとして同定されている（例えば、非特許文献４参照）。アポトーシスは、その初期過程において、細胞を構成する細胞膜リン脂質の配列変化を伴い、結果として負電荷のリン脂質であるホスファチジルセリンが細胞表面へ露出されることが報告されている（例えば、非特許文献５，６参照）。この細胞表面の変化がマクロファージや隣接する細胞に認識され、貪食過程が進行すると考えられている。ホスファチジルセリンと選択的に結合するアネキシンＶにより前記貪食過程が阻害されることから、アポトーシス細胞の細胞表面にホスファチジルセリンが露出することが貪食機構に重要な役割を果たしているものと考えられていた（例えば、非特許文献７，８参照）。   Thus, apoptosis is a process of removing harmful or useless cells, and is indispensable for maintaining mammalian homeostasis (see, for example, Non-Patent Document 1). Apoptotic cells are taken up rapidly by phagocytic cells, which are thought to prevent inflammation and autoimmune responses to intracellular antigens released from dying cells (see, for example, Non-Patent Documents 2 and 3). Phosphatidylserine (PS) exposed on the surface of apoptotic cells has been identified as a useful recognition signal for macrophages (see, for example, Non-Patent Document 4). Apoptosis is accompanied by a change in the arrangement of cell membrane phospholipids in the initial process, and as a result, phosphatidylserine, a negatively charged phospholipid, is reported to be exposed to the cell surface (for example, non-patented). References 5 and 6). This cell surface change is recognized by macrophages and adjacent cells, and the phagocytic process is thought to proceed. Since the phagocytic process is inhibited by annexin V that selectively binds to phosphatidylserine, exposure of phosphatidylserine to the cell surface of apoptotic cells was thought to play an important role in the phagocytic mechanism ( For example, see Non-Patent Documents 7 and 8).

また、二次リンパ組織の胚中心（リンパ濾胞の中心）は、Ｂ細胞の増殖、選択、成熟及び死に対する固有の微小環境を提供する(例えば、非特許文献９，１０参照)。高親和性の表面免疫グロブリンを発現するB細胞は、成熟のために選択されるが、低親和性の免疫グロブリンをもつB細胞はアポトーシスによって死滅させられ、胚中心の可染体（tingible body）マクロファージと呼ばれる固有のマクロファージによって速やかに除去されることも知られている。   The germinal center of the secondary lymphoid tissue (the center of the lymphoid follicle) provides a unique microenvironment for B cell proliferation, selection, maturation and death (see, for example, Non-Patent Documents 9 and 10). B cells that express high-affinity surface immunoglobulin are selected for maturation, whereas B cells with low-affinity immunoglobulin are killed by apoptosis and a germinal center tingible body It is also known that it is rapidly removed by intrinsic macrophages called macrophages.

他方、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８；milk fat globule-EGF factor8）は、母乳中に多く含まれる乳腺上皮由来の分泌蛋白質としてクローニングされ（例えば、非特許文献１１参照）、その後、他の多くの正常組織やいくつかの腫瘍細胞で強く発現する分泌型糖タンパク質として知られている。ＭＦＧ−Ｅ８は、N末端側から２つのＥＧＦ（上皮増殖因子）ドメインと血液凝固因子Ｖ，VIIIのＣ１，Ｃ２ドメインとホモロジーのあるドメインで構成されている。ＭＦＧ−Ｅ８はヒト（ＢＡ４６，lactadherin）、マウス（ＭＦＧ−Ｅ８）、ラット（ｒＡＧＳ）、ブタ（Ｐ４７）、ウシ（ＰＡＳ−６，ＰＡＳ−７）を含め幾つかの哺乳類でそのホモログが報告されており、さらに、ＭＦＧ−Ｅ８とドメイン構造の類似性がある内皮細胞特異的細胞接着分子ＤＥＬ１がクローニングされており、ＭＦＧ−Ｅ８及びＤＥＬ１は２番目のＥＧＦドメイン内にはインテグリンと結合するＲＧＤ配列を含んでいる。一方、Ｃ末側のＣ１，Ｃ２ドメインは細胞膜のリン脂質に結合することが知られている。しかし、このＭＦＧ−Ｅ８は、酵素活性との関連やその生理機能について不明な点が多く、この点を明らかにするために、マウス脂肪球被膜糖蛋白質ＭＦＧ−Ｅ８のゲノム遺伝子と染色体マッピング、発生過程における遺伝子発現の動態、細胞内局在などについて検討されており、生殖原基がＭＦＧ−Ｅ８の発生初期の主要発現部位であり、発生の後期になると神経細胞や軟骨原基に特徴的な非常に強い発現があるとされている。   On the other hand, fat globule glycoprotein (MFG-E8; milk fat globule-EGF factor 8) has been cloned as a secretory protein derived from mammary epithelium that is abundant in breast milk (for example, see Non-Patent Document 11). It is known as a secreted glycoprotein that is strongly expressed in many normal tissues and some tumor cells. MFG-E8 is composed of two EGF (epidermal growth factor) domains and domains homologous to the C1, C2 domains of blood coagulation factors V and VIII from the N-terminal side. MFG-E8 has been reported in several mammals including human (BA46, lactadherin), mouse (MFG-E8), rat (rAGS), pig (P47), bovine (PAS-6, PAS-7). Furthermore, an endothelial cell-specific cell adhesion molecule DEL1 having a domain structure similarity with MFG-E8 has been cloned, and MFG-E8 and DEL1 are RGD sequences that bind to integrin in the second EGF domain. Is included. On the other hand, it is known that the C1, C2 domains on the C-terminal side bind to phospholipids in the cell membrane. However, this MFG-E8 has many unclear points regarding the relationship with enzyme activity and its physiological function. To clarify this point, the genomic gene and chromosome mapping and development of mouse fat globule glycoprotein MFG-E8 The dynamics of gene expression in the process, subcellular localization, etc. have been studied, and the germinal primordium is the main expression site in the early stages of MFG-E8 development. It is said that there is a very strong expression.

最近、いくつかのレセプターがホスファチジルセリンと結合することが報告されている（例えば、非特許文献２，１２参照）。本発明者らは、ＭＦＧ−Ｅ８が、活性化されたマクロファージから分泌され、ＰＳを認識してアポトーシス細胞に特異的に結合し、貪食する食細胞に誘導することを、既に報告している（例えば、非特許文献１３参照）。すなわち、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）が、細胞がアポトーシスへ向かいはじめると細胞表面に露出するホスファチジルセリンなどのアミノリン脂質を認識することで、アポトーシス細胞に特異的に結合し、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を促進することや、ＭＦＧ−Ｅ８の点変異誘導体であるＤ８９Ｅ変異体がマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を阻害することを報告している（例えば、特許文献１参照）。
特開２００３−１５５２５１号公報 Cell, 88, 347-354, 1997 Nature, 407, 784-788, 2000 Nat. Rev. Immunol., 2, 965-975, 2002 J. Immunol., 148, 2207-2216, 1992 Immunol. Today, 14: 131-136, 1993 Cirk. Res., 77: 1136-1142, 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun., 205, 1488-1493, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1624-1629, 1996 Immunology, 107, 167-175, 2002 Annu. Rev. Immunol. 12, 117-139, 1994 Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 522-528, 1999 Cell, 104, 325-328, 2001 Nature, 417, 182-187, 2002 Recently, it has been reported that some receptors bind to phosphatidylserine (see, for example, Non-Patent Documents 2 and 12). We have already reported that MFG-E8 is secreted from activated macrophages, recognizes PS, specifically binds to apoptotic cells, and induces to phagocytic phagocytes ( For example, refer nonpatent literature 13). That is, fat globule glycoprotein (MFG-E8) specifically binds to apoptotic cells by recognizing aminophospholipids such as phosphatidylserine exposed on the cell surface when cells begin to undergo apoptosis, and apoptosis by macrophages It has been reported that the phagocytosis of cells is promoted and that the D89E mutant, which is a point mutation derivative of MFG-E8, inhibits the phagocytosis of apoptotic cells by macrophages (see, for example, Patent Document 1).
JP 2003-155251 A Cell, 88, 347-354, 1997 Nature, 407, 784-788, 2000 Nat. Rev. Immunol., 2, 965-975, 2002 J. Immunol., 148, 2207-2216, 1992 Immunol. Today, 14: 131-136, 1993 Cirk. Res., 77: 1136-1142, 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun., 205, 1488-1493, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1624-1629, 1996 Immunology, 107, 167-175, 2002 Annu. Rev. Immunol. 12, 117-139, 1994 Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 522-528, 1999 Cell, 104, 325-328, 2001 Nature, 417, 182-187, 2002

本発明の課題は、腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等を発症する新規メカニズムによる自己免疫疾患病態モデル動物と、それを用いた糸球体腎炎や脾腫等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide autoimmunity by a novel mechanism for developing glomerulonephritis caused by gradually destroying the internal structure (glomera) of the kidney, splenomegaly in which the size of the spleen expands beyond the normal range, and the like. It is intended to provide a disease disease state model animal and a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases such as glomerulonephritis and splenomegaly using the disease state model animal.

本発明者らは、アポトーシス細胞の食作用を促進する因子として、脂肪球皮膜糖タンパク質（Milk Fat Globule EGF factor-8、；ＭＦＧ−Ｅ８）を既に同定している。そこで、ＭＦＧ−E８遺伝子を欠損させたマウス（ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス）を作製し、かかるＭＦＧ−E８ノックアウトマウスの脾臓及びリンパ節の胚中心の可染体マクロファージについて調べたところ、多くのアポトーシスリンパ球が、効果的に貧食されていなかった。そして、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、肥大した白色髄に複数のリンパ小節を保有して脾腫を発症し、自己抗体を産生し、糸球体腎炎を発症していることを見い出した。これらの結果は、ＭＦＧ−Ｅ８が胚中心のアポトーシスＢ細胞を除去するのに重要な役割を果たし、その貪食機能の欠失が自己免疫疾患を誘導することを示唆している。本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。 The present inventors have already identified a fat globule membrane glycoprotein (Milk Fat Globule EGF factor-8; MFG-E8) as a factor that promotes phagocytosis of apoptotic cells. Thus, a mouse deficient in the MFG-E8 gene (MFG-E8 − / − mouse) was prepared, and the spleen and lymph node germinal center macrophages of such MFG-E8 knockout mice were examined. Apoptotic lymphocytes were not effectively phagocytosed. The MFG-E8 − / − mouse was found to have a plurality of lymph nodes in the enlarged white marrow, develop splenomegaly, produce autoantibodies, and develop glomerulonephritis. These results suggest that MFG-E8 plays an important role in removing germinal center apoptotic B cells and that its loss of phagocytic function induces autoimmune diseases. The present invention has been completed based on these findings.

すなわち本発明は、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生することを特徴とする自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項１）や、糸球体腎炎を発症することを特徴とする請求項１記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項２）や、脾腫を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項３）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項４）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項５）に関する。   That is, the present invention lacks part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome, loses the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type, and produces autoantibodies. An autoimmune disease model non-human animal (claim 1) characterized by the above, or an autoimmune disease model non-human animal (claim 2) or splenomegaly characterized by developing glomerulonephritis The autoimmune disease model non-human animal (claim 3) or the non-human animal according to claim 1 or 2, wherein the non-human animal is a rodent. The autoimmune disease model non-human animal according to any one of claims 1 to 4 (Claim 4) or the rodent animal is a mouse (Claim 5). About.

また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来することを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項６）や、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項７）や、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項８）に関する。   Further, the present invention is an MFG-E8-deficient macrophage (claim 6) or a chromosomal macrophage derived from the autoimmune disease model non-human animal according to any one of claims 1 to 5. The present invention relates to the MFG-E8-deficient macrophage according to claim 6 (claim 7) and the MFG-E8-deficient macrophage according to claim 6 (claim 8), which are peritoneal macrophages.

本発明はまた、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項９）や、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１０）や、請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１１）や、ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１２）や、ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１３）や、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と、野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１４）や、野生型非ヒト動物が、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項１４記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１５）や、自己免疫疾患が糸球体腎炎であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１６）や、自己免疫疾患が脾腫であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１７）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１８）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１９）に関する。   The present invention also lacks part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome, loses the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type, and produces autoantibodies. A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases, comprising administering a test substance to a non-human animal and evaluating the degree of the autoimmune disease in the non-human animal, and chromosomal fat A test substance is administered to a non-human animal that produces autoantibodies that lacks the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type due to loss of part or all of the sphere coat glycoprotein (MFG-E8) gene And screening for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease, characterized by evaluating the degree of phagocytosis of apoptotic cells of MFG-E8-deficient macrophages of said non-human animal (Claim 10) or an MFG-E8-deficient macrophage derived from an autoimmune disease model non-human animal according to any one of claims 1 to 5 is contacted with apoptotic cells in the presence of a test substance, and the non-human animal A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases characterized by evaluating the degree of phagocytosis of apoptotic cells by MFG-E8-deficient macrophages, and MFG-E8-deficient macrophages are chromosomal 12. The method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to claim 10 or 11, wherein the macrophage is a macrophage, or the MFG-E8-deficient macrophage is a peritoneal macrophage. Item 10. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to Item 10 or 11, (Claim 13), A non-human animal that produces an autoantibody, in which part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromophore is deleted, the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type is lost, and A method for screening a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the method is compared and evaluated with a wild-type non-human animal. Human animals lack part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome, lose the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type, and produce autoantibodies 15. The method for screening a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to claim 14, wherein the autoimmune disease is glomerulonephritis, wherein the autoimmune disease is a wild-type non-human animal that is the same as a human animal. The The method for screening for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to any one of claims 9 to 15 (claim 16), or the autoimmune disease is splenomegaly, The autoimmune disease according to any one of claims 9 to 17, wherein the method for screening a preventive / therapeutic agent for autoimmune disease according to claim 17 or the non-human animal is a rodent animal. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent (Claim 18), or a method for screening a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to Claim 18, wherein the rodent is a mouse (Claim 19). About.

さらに本発明は、請求項９〜１９のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤（請求項２０）や、検体から脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法（請求項２１）に関する。   Furthermore, the present invention provides a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases (Claim 20), a sample obtained by the method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases according to any one of Claims 9-19. The present invention relates to a method for diagnosing an autoimmune disease caused by an abnormality in MFG-E8, characterized in that a fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene is extracted from the gene and the presence or absence of the gene abnormality is examined.

本発明によると、新規作用メカニズムによる新しいタイプの抗自己免疫疾患薬、例えば腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等の予防・治療剤を開発することができるばかりでなく、可染体マクロファージやチオグリコレート刺激腹腔マクロファージ等のマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用の機構解明が可能となる。   According to the present invention, a new type of anti-autoimmune disease drug with a novel mechanism of action, for example, glomerulonephritis caused by the gradual destruction of the internal structure of the kidney (glomerus) or the size of the spleen exceeds the normal range. In addition to the development of preventive and therapeutic agents for splenomegaly and the like, it becomes possible to elucidate the mechanism of phagocytosis of apoptotic cells by macrophages such as chromosomal macrophages and thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages.

本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物としては、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生するモデル動物（以下、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損したモデル動物ということがある）であれば特に制限されるものではないが、糸球体腎炎及び／又は脾腫（巨脾症）の症状を呈するモデル動物を好適に例示することができる。また、上記非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができ、中でもマウスを好適に挙げることができる。   The autoimmune disease model non-human animal of the present invention is a model animal that lacks part or all of the MFG-E8 gene, loses the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type, and produces autoantibodies. (Hereinafter, it may be referred to as a model animal in which the function of the MFG-E8 gene is deficient on the chromosome), but it is not particularly limited, but exhibits symptoms of glomerulonephritis and / or splenomegaly (splenic splenomegaly). A model animal can be preferably exemplified. Further, the non-human animal is not particularly limited as long as it is a non-human animal, but specific examples include rodents such as mice and rats, and mice can be preferably mentioned.

本発明において「自己抗体を産生する」とは、少なくとも、血清内の抗二重鎖ＤＮＡ抗体及び／又は抗核抗体濃度が、野生型の非ヒト動物に比して、２倍以上高いことをいう。また、自己免疫疾患としては、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等を例示することができ、糸球体腎炎の症状を呈するとは、少なくとも、糸球体内に多量のＩｇＧが認められ、糸球体が肥大した症状を呈することをいい、脾腫（巨脾症）の症状を呈するとは、少なくとも、白色髄が非常に肥大し、複数のリンパ小節を有する症状を呈することをいう。本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物は、抗自己免疫疾患薬、例えば糸球体腎炎や脾腫等の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。   In the present invention, “producing autoantibodies” means that at least the concentration of anti-double-stranded DNA antibody and / or antinuclear antibody in serum is twice or more higher than that of wild-type non-human animals. Say. In addition, examples of autoimmune diseases include glomerulonephritis, splenomegaly, human systemic lupus erythematosus, and the like. Symptoms of glomerulonephritis include at least a large amount of IgG in the glomeruli, The expression of the sphere is enlarged, and the expression of splenomegaly (splenic splenomegaly) means that at least the white medulla is extremely enlarged and has a plurality of lymph nodes. The autoimmune disease model non-human animal of the present invention can be advantageously used for screening an anti-autoimmune disease drug, for example, a prophylactic / therapeutic agent for glomerulonephritis, splenomegaly and the like.

本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。また上記ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、ＭＦＧ−Ｅ８欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして上記のように、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物の好適例としては、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウスを、野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。   The wild-type non-human animal in the present invention means an animal of the same kind as the above-mentioned non-human animal deficient in the function of the MFG-E8 gene. In addition, as a non-human animal deficient in the function of the MFG-E8 gene, those born according to Mendel's law can obtain wild-types that are the same as the MFG-E8-deficient type, and can be used to accurately This is preferable because a comparative experiment can be performed. As described above, as a preferable example of an autoimmune disease model non-human animal deficient in the function of the MFG-E8 gene, an MFG-E8 knockout mouse is used, and a wild-type mouse that is the same as the knockout mouse is used as a wild-type mouse. , Can be mentioned specifically. Hereinafter, the case where the non-human animal is a mouse will be described as an example.

ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウスの作製法としては、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質を発現する機能を失ったマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよいが、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定し、このクローンのＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の全部又は一部を含むフラグメントをネオマイシン耐性遺伝子カセット等で置換することによって、ターゲットベクターを作製する方法を挙げることができる。   Any method can be used for producing an MFG-E8 knockout mouse as long as it can produce a mouse that has lost the function of expressing the MFG-E8 protein. For example, PCR can be performed from a mouse gene library. The MFG-E8 gene is screened using the gene fragment obtained by the above method, and the screened MFG-E8 gene is subcloned using a plasmid vector or the like and identified by DNA sequencing. A method for preparing a target vector can be mentioned by replacing a fragment containing all or part of the MFG-E8 gene with a neomycin resistance gene cassette or the like.

この線状化されたベクターをエレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、Ｇ−４１８などの薬剤に抵抗性の細胞の中から相同的組換えを行ったＥＳ細胞を選択し、その細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウス（ＭＦＧ−Ｅ８+/-）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスの雌雄を交配させることによって、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス（ＭＦＧ−Ｅ８-/-）を得ることができる。 This linearized vector is introduced into ES cells by electroporation (electroporation) or the like, and ES cells that have undergone homologous recombination are selected from cells resistant to drugs such as G-418. Then, the clone of the cell is microinjected into a blastocyst of a mouse, and the blastocyst is returned to a temporary parent mouse to produce a chimeric mouse. When this chimeric mouse is crossed with a wild-type mouse, a heterozygous mouse (MFG-E8 +/− ) can be obtained, and by mating the male and female of this heterozygous mouse, an MFG-E8 knockout can be obtained. Mice (MFG-E8 − / − ) can be obtained.

本発明のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとしては、上記本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ、すなわち、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子が染色体上で欠損したモデル動物から得られる、アポトーシス細胞の貪食作用が喪失又は減衰したマクロファージであれば特に制限されず、かかるマクロファージとして、可染体マクロファージ、腹腔マクロファージ、メタロフィリック（metalophilic）マクロファージ、骨髄由来マクロファージ、樹状細胞を挙げることができる。例えば、胚中心（リンパ濾胞の中心）に存在するＣＤ６８を特異的に発現する可染体マクロファージは、、抗ＣＤ６８抗体を用いて常法により同定することができ、また、腹腔マクロファージは、３％（ｗ/ｖ）のチオグリコレートの腹腔内注射を受けたマウスから常法により調製することができる。かかる本発明のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージは、アポトーシス細胞の貪食作用の機構を解明する上で、また、抗自己免疫疾患薬、例えば糸球体腎炎や脾腫等の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。   The MFG-E8-deficient macrophage of the present invention is obtained from a macrophage derived from the above-mentioned autoimmune disease model non-human animal of the present invention, that is, a model animal in which the MFG-E8 gene such as MFG-E8 knockout mouse is deficient on the chromosome. Any macrophage in which the phagocytosis of apoptotic cells has been lost or attenuated is not particularly limited, and examples of such macrophages include chromosomal macrophages, peritoneal macrophages, metalophilic macrophages, bone marrow-derived macrophages, and dendritic cells. Can do. For example, a chromosomal macrophage that specifically expresses CD68 present in the germinal center (the center of the lymphoid follicle) can be identified by a conventional method using an anti-CD68 antibody, and peritoneal macrophages are 3% It can be prepared by a conventional method from a mouse that has received an intraperitoneal injection of (w / v) thioglycolate. Such MFG-E8-deficient macrophages of the present invention are advantageously used for elucidating the mechanism of phagocytosis of apoptotic cells and for screening for preventive / therapeutic agents for anti-autoimmune diseases such as glomerulonephritis and splenomegaly. be able to.

本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価する方法や、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法や、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明のスクリーニング方法によると、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の自己免疫疾患の予防・治療剤を開発することが可能となる。   As a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease of the present invention, a test substance is administered to an autoimmune disease model non-human animal in which the function of the MFG-E8 gene of the present invention is deficient on the chromosome, and the non-human animal A test substance is administered to a non-human animal model of autoimmune disease in which the function of the MFG-E8 gene of the present invention is deficient on the chromosome, and the non-human animal has MFG-E8 deficiency A method for evaluating the degree of phagocytosis of macrophages on apoptotic cells, or an MFG-E8-deficient macrophage derived from an autoimmune disease model non-human animal in which the function of the MFG-E8 gene of the present invention is deficient on the chromosome, Phagocytosis of apoptotic cells of MFG-E8-deficient macrophages of the non-human animal in contact with apoptotic cells in the presence of The method for evaluating the degree of use is not particularly limited. According to the screening method of the present invention, a preventive / therapeutic agent for autoimmune diseases such as glomerulonephritis, splenomegaly, and human systemic lupus erythematosus is developed. Is possible.

上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、局所への直接投与などの方法を挙げることができる。また、自己免疫疾患の程度を評価する方法としては、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の症状の改善程度を評価する方法を挙げることができる。自己免疫疾患の程度を評価するに際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。   A test substance is administered to an autoimmune disease model non-human animal in which the function of the MFG-E8 gene such as the above-described MFG-E8 knockout mouse of the present invention is deficient on the chromosome, and the degree of autoimmune disease in the non-human animal is evaluated. Examples of the administration method of the test substance in the screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases include oral administration, intravenous administration, and direct local administration. Examples of a method for evaluating the degree of autoimmune disease include a method for evaluating the degree of improvement of symptoms such as glomerulonephritis, splenomegaly, and human systemic lupus erythematosus. When evaluating the degree of autoimmune disease, it is preferable to compare and evaluate wild-type non-human animals of the same type as autoimmune disease model non-human animals, especially wild-type non-human animals of the same type as autoimmune disease model non-human animals. .

上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、局所への直接投与などの方法を挙げることができる。また、非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとしては、可染体マクロファージや腹腔マクロファージなどを好適に例示することができる。アポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法としては、例えば、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを用いる場合、デキサメサゾンでアポトーシスを誘導したＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞を貪食する程度を、ＴＵＮＥＬ反応により、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより評価する方法を挙げることができる。かかる評価に際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。 A test substance is administered to an autoimmune disease model non-human animal deficient on the chromosome of the MFG-E8 gene function, such as the above-described MFG-E8 knockout mouse of the present invention, and apoptotic cells of the MFG-E8-deficient macrophage of the non-human animal Examples of the administration method of the test substance in the screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease that evaluates the degree of phagocytosis effect on humans include oral administration, intravenous administration, and local direct administration. Moreover, as a non-human animal MFG-E8 deficient macrophage, a chromosomal macrophage, a peritoneal macrophage, etc. can be illustrated suitably. As a method for evaluating the degree of phagocytosis on apoptotic cells, for example, when using thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages, the degree of phagocytosis of thymocytes of CAD − / − mice induced with dexamethasone is determined by the TUNEL reaction. The method of evaluating by quantifying the number of TUNEL positive apoptotic cells per macrophage can be mentioned. In such an evaluation, it is preferable to compare and evaluate a wild-type non-human animal of the same type as the autoimmune disease model non-human animal, particularly an autoimmune disease model non-human animal and a wild-type non-human animal of the same litter.

上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にインビトロでアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の存在下でのＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとアポトーシス細胞との接触は、マクロファージの培養に用いられる培地中で、被検物質の存在下に共培養することにより行うことができる。アポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法としては、例えば、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを用いる場合、デキサメサゾンでアポトーシスを誘導したＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞を貪食する程度を、ＴＵＮＥＬ反応により、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより評価する方法を挙げることができる。かかる評価に際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。 MFG-E8-deficient macrophage derived from a non-human animal model of autoimmune disease in which the function of MFG-E8 gene such as MFG-E8 knockout mouse of the present invention is deficient on the chromosome is apoptotic in vitro in the presence of the test substance. MFG-E8-deficient macrophage in the presence of a test substance in a screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease, which is contacted with a cell and evaluates the degree of phagocytosis of apoptotic cells of MFG-E8-deficient macrophage And apoptotic cells can be contacted by co-culturing in the presence of a test substance in a medium used for culturing macrophages. As a method for evaluating the degree of phagocytosis on apoptotic cells, for example, when using thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages, the degree of phagocytosis of thymocytes of CAD − / − mice induced with dexamethasone is determined by the TUNEL reaction. The method of evaluating by quantifying the number of TUNEL positive apoptotic cells per macrophage can be mentioned. In such an evaluation, it is preferable to compare and evaluate a wild-type non-human animal of the same type as the autoimmune disease model non-human animal, particularly an autoimmune disease model non-human animal and a wild-type non-human animal of the same litter.

上記本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質としては、天然若しくは人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、低分子有機化合物を例示することができる。かかる被検物質の中から、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の症状を改善する物質やアポトーシス細胞に対する貪食作用を増強する物質は自己免疫疾患の予防・治療剤の候補物質であり、かかる候補物質としては、ＭＦＧ−Ｅ８の他、ＭＦＧ−Ｅ８中のＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２ドメイン、高プロリン／スレオニン含有ドメイン、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有する組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体、かかる変異体に対する抗体、Ｄｅｌ−１等のＭＦＧ−Ｅ８の相同体などを具体的に挙げることができる。これら候補物質の中から薬効が確認できた物質を医薬用の治療剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液、リポソームに封入又は包埋体等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。   Examples of the test substance in the method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention include various peptides, proteins, polynucleotides, and low molecular organic compounds synthesized naturally or artificially. Among such test substances, substances that improve symptoms such as glomerulonephritis, splenomegaly, human systemic lupus erythematosus, and substances that enhance phagocytosis against apoptotic cells are candidates for autoimmune disease prevention and treatment agents, Such candidate substances include, in addition to MFG-E8, an EGF-2 domain having an RGD motif in MFG-E8, a high proline / threonine-containing domain, and a recombinant MFG- having two factor VIII homology domains (C1 and C2). Specific examples include E8 mutants, antibodies against such mutants, and homologues of MFG-E8 such as Del-1. Among these candidate substances, substances that have been confirmed to have a medicinal effect are used as pharmaceutical therapeutic agents, and pharmaceutically acceptable ordinary carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffering agents. In addition, various preparation ingredients such as a disintegrant, a solubilizer, a solubilizer, and an isotonic agent can be added. These therapeutic agents can be administered orally or parenterally, for example, orally in dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, syrups, suspensions, liposomes, or embedded bodies. Alternatively, for example, in the form of a solution, emulsion, suspension or the like, it can be administered parenterally in the form of an injection, or it can be administered intranasally in the form of a spray.

経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。また、自己免疫疾患の予防・治療剤の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができる。   In the case of preparations for oral administration, various conventional organic or inorganic carrier substances are used as pharmacologically acceptable carriers. For example, tablets include excipients such as lactose and starch, talc, and magnesium stearate. Lubricants such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone, disintegrants such as carboxymethylcellulose, etc. can be blended. Solvents such as physiological saline alcohol, polyethylene glycol, propylene Solubilizing agents such as glycol, suspending agents such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, lecithin, isotonic agents such as glycerin and D-mannitol, buffering agents such as phosphate, acetate and citrate Etc. can be blended. If necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be blended. For preparations for parenteral administration, water-soluble solvents such as distilled water and physiological saline, solubilizing agents such as sodium salicylate, isotonic agents such as sodium chloride, glycerin and D-mannitol, human serum albumin, etc. Stabilizers, preservatives such as methylparaben, and narcotics such as benzyl alcohol can be blended. In addition, the dose of the prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases can be appropriately selected depending on the type of disease, the weight and age of the patient, the dosage form, symptoms, and the like.

本発明のＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法としては、検体のマクロファージからＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を抽出し、その塩基配列を調べて、正常なＭＦＧ−Ｅ８遺伝子と比較して異常の有無を調べる方法を例示することができる。   As a method for diagnosing an autoimmune disease caused by MFG-E8 abnormality of the present invention, the MFG-E8 gene is extracted from a macrophage of a specimen, the base sequence thereof is examined, and the abnormality is compared with a normal MFG-E8 gene. A method for examining the presence or absence can be exemplified.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

（ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊）
ＭＦＧ−Ｅ８染色体遺伝子を１２９／ｓｖマウスλ遺伝子ライブラリーから単離した。エクソン４〜６をｎｅｏ遺伝子で置換し、ジフテリア毒素Ａ断片をコードするＤＮＡ断片を、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の下流に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した。Ｒ１ ＥＳ細胞を、文献（Science, 292, 1546-1549, 2001）記載の通りターゲッティングベクターでトランスフェクトし、Ｇ−４１８耐性クローンを、ＰＣＲにより、相同的組み換え用にスクリーニングし、ＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスを作製した。ＭＦＧ−Ｅ８欠損対立遺伝子を保有するＥＳクローンを、宿主の胎芽に導入し、キメラマウスを作製した。ＥＳ細胞に起因するキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Nippon SLC社製）と交配し、ＭＦＧ−Ｅ８+/-マウスを作製した。ＭＦＧ−Ｅ８+/-を親として交配して、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスを作製し、ＭＦＧ−Ｅ８+/+及びＭＦＧ−Ｅ８-/-の同腹仔の表現型を分析した。全てのマウスを、特定病原体未感染施設に収容し、全ての動物実験は大阪大学医学部動物実験委員会に承認された細則に従って行われた。 (Disruption targeting the MFG-E8 gene)
The MFG-E8 chromosomal gene was isolated from a 129 / sv mouse λ gene library. Exons 4 to 6 were replaced with the neo gene, and a DNA fragment encoding the diphtheria toxin A fragment was inserted downstream of the MFG-E8 gene to prepare a targeting vector. R1 ES cells were transfected with a targeting vector as described in the literature (Science, 292, 1546-1549, 2001), G-418 resistant clones were screened for homologous recombination by PCR, and MFG-E8 null mice were Produced. An ES clone carrying the MFG-E8 deficient allele was introduced into the embryo of the host to produce a chimeric mouse. Chimeric mice derived from ES cells were crossed with C57BL / 6 mice (Nippon SLC) to produce MFG-E8 +/− mice. MFG-E8 +/− were bred as parents to generate MFG-E8 − / − mice, and the phenotypes of MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − littermates were analyzed. All mice were housed in specific pathogen-free facilities, and all animal experiments were conducted according to the rules approved by the Animal Experiment Committee of Osaka University School of Medicine.

（ＰＣＲ、サザンブロット及びノーザンブロット分析）
ゲノムＤＮＡを文献（Nucleic Acids Res. 19, 4293, 1991）記載の通り調製し、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の遺伝子型をＰＣＲにより定量した。野生型に特異なセンスプライマー（５'‐ＧＴＧＡＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴ；配列番号１）又は突然変異対立遺伝子（５'‐ＣＧＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴ ；配列番号２）を、共通のアンチセンスプライマー（５'‐ＧＧＧＣＡＴＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣ ；配列番号３）と共に使用した。サザンハイブリダイゼーション用に、ゲノムＤＮＡをEcoRV及びKpnIで処理し、０．８％アガロースゲルで電気泳動して単離し、Hybond Ｎ+膜（Amercham Bioscience 社製）に移した。ハイブリダイゼーションを、ターゲッティングベクターのすぐ外側に局在する５４０ｂｐのＤＮＡ断片を使用して行った。ノーザンハイブリダイゼーション用に、全ＲＮＡを２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルで単離し、Hybond Ｎ+膜に移し、マウスＭＦＧ−Ｅ８ ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。 (PCR, Southern blot and Northern blot analysis)
Genomic DNA was prepared as described in the literature (Nucleic Acids Res. 19, 4293, 1991), and the genotype of the MFG-E8 gene was quantified by PCR. A wild type specific sense primer (5'-GTGAACCCTCTGCCGGAAGAT; SEQ ID NO: 1) or a mutant allele (5'-CGTGGGATCATGTTTTTCT; SEQ ID NO: 2) together with a common antisense primer (5'-GGGGCATAAACTCCAGCTCAC; SEQ ID NO: 3) used. For Southern hybridization, genomic DNA was treated with EcoRV and KpnI, isolated by electrophoresis on a 0.8% agarose gel, and transferred to a Hybond N + membrane (Amercham Bioscience). Hybridization was performed using a 540 bp DNA fragment located just outside the targeting vector. For Northern hybridization, total RNA was isolated on a 1.5% agarose gel containing 2.2M formaldehyde, transferred to Hybond N + membrane, and hybridized using mouse MFG-E8 cDNA as a probe.

（免疫沈降及びウェスタンブロッティング）
プロテインＡ−セファロースと抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体２４２２との複合体を、文献（Nature, 417, 182-187, 2002）記載の通り、調製した。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、３％（ｗ/ｖ）のチオグリコレート（Sigma社製）の腹腔内注射を受けた１２週齢のマウスから調製した。細胞（１×１０7）をＡＩＭＶ培地（Invitrogen社製）で４８時間培養した。上澄液を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭの［ｐ-アミジノフェニル］メタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液［ｐＨ７．６］）に細胞を溶解した。培養上澄液及び細胞可溶化液を、２４２２−プロテインＡ−セファロース複合体とインキュベーションした。０．５ＭのＮａＣｌを含むＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した後、ビーズに結合したタンパク質を、０．１％のトリトンＸ−１００を含む１００ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）で溶出した。溶出物の一定分量を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ゲル）で分離し、その後、ビオチン標識化ハムスター抗マウスＭＦＧ−Ｅ８モノクローナル抗体（クローン１８Ａ２、Ｋ．Ａ．、Ｒ．Ｈ．、Ｍ．Ｔ．、及びＳ．Ｎ．未発表）とペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Roche社製）でウエスタンブロッティングした。抗体が認識したタンパク質を、化学ルミネッセンス反応（Renaissance社製）により視覚化した。 (Immunoprecipitation and Western blotting)
A complex of protein A-Sepharose and anti-MFG-E8 antibody 2422 was prepared as described in the literature (Nature, 417, 182-187, 2002). Thioglycolate stimulated peritoneal macrophages were prepared from 12 week old mice that received an intraperitoneal injection of 3% (w / v) thioglycolate (Sigma). Cells (1 × 10 7 ) were cultured in AIMV medium (Invitrogen) for 48 hours. The supernatant was collected, RIPA buffer (1% Triton X-100, 0.1 percent SDS, 0.5 percent sodium deoxycholate, 150 mM of NaCl, 1.5 mM of MgCl 2, 1 mM EGTA, Cells in 10 mM glycerol, 1 mM [p-amidinophenyl] methanesulfonyl fluoride hydrochloride, 50 mM HEPES-NaOH buffer [pH 7.6] containing 1 μg / ml leupeptin and 1 μg / ml pepstatin). Dissolved. Culture supernatant and cell lysate were incubated with 2422-protein A-Sepharose complex. After washing with RIPA buffer containing 0.5 M NaCl, the protein bound to the beads was eluted with 100 mM triethylamine (pH 11.5) containing 0.1% Triton X-100. An aliquot of the eluate was separated by SDS-PAGE (10% gel) under non-reducing conditions, followed by biotin-labeled hamster anti-mouse MFG-E8 monoclonal antibody (clone 18A2, KA, RH , MT, and SN (unpublished) and peroxidase-conjugated streptavidin (Roche). The protein recognized by the antibody was visualized by chemiluminescence reaction (manufactured by Renaissance).

（インビトロ貪食作用分析）
インビトロ貪食作用分析を、本質的に文献（Nature, 417, 182-187, 2002）記載の通りに行った。６週齢のＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞（Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003）の１×１０6細胞を、１０μＭのデキサメサゾンで、３７℃でインキュベーションし、アポトーシスを誘導し、８ウェルのLab‐Tek IIチャンバースライド（Nalge Nunc 社製）中で培養したチオグリコレート刺激腹腔マクロファージ（１×１０5細胞）に添加した。１．５時間の共培養の後、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ反応させ、光学顕微鏡で観察した。ＴＵＮＥＬ陽性胸腺細胞の数を数え、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより、貪食作用の指標とした。少なくとも１５０のマクロファージを検査した。 (In vitro phagocytosis analysis)
In vitro phagocytosis analysis was performed essentially as described in the literature (Nature, 417, 182-187, 2002). Incubating 1 × 10 6 cells of thymocytes of 6 weeks old CAD − / − mice (Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003) with 10 μM dexamethasone at 37 ° C. to induce apoptosis, They were added to thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages (1 × 10 5 cells) cultured in 8-well Lab-Tek II chamber slides (Nalge Nunc). After 1.5 hours of co-culture, the cells were fixed, reacted with TUNEL, and observed with a light microscope. The number of TUNEL positive thymocytes was counted, and the number of TUNEL positive apoptotic cells per macrophage was quantified to serve as an indicator of phagocytosis. At least 150 macrophages were examined.

（組織化学及び電子顕微鏡分析及び自己抗体アッセイ）
ヘマトキシリン及びエオシン染色を行うために、マウス脾臓及びリンパ節を、０．１％のリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースに固定し、パラフィンに包埋し、４μｍの切片にした。免疫組織化学分析を行うために、凍結した組織の切片（４μｍ）を冷却アセトンで固定し、非特異的部位を、５％のヤギ血清（Invitrogen社製）及び１％のウシ血清アルブミン（Sigma 社製）でブロックした。使用したモノクローナル抗体は、Alexa‐Fluro 488 スプレプトアビジン（Molecular probes社製）、Ｃｙ−３結合抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体（クローン１８Ａ２）と共にビオチン化した抗ＣＤ６８抗体（Serotec社製）又は抗Ｆ４／８０抗体（クローン６−１６Ａ、Ｍ．Ｔ．）、及びＣｙ３結合抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson社製）と共にラット抗ＭＯＭＡ−１抗体（BMA Biomedical社製）であった。ＴＵＮＥＬ染色をApoptag kit（Intergen社製）を用いて行った。染色した切片を、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Dojindo Laboratories 社製）を含むFluorSave mounting 試薬（Calbiochem社製）でマウントし、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。電子顕微鏡での観察には、１０週齢のマウスにKLHを投与した後、脾臓を２％のグルトアルデヒド及び２％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）内に固定した。７．５％のスクロースを含む同緩衝液で洗浄した後、サンプルを１％のＯｓＯ４で固定(post-fix)し、Epon ８１２に包埋した。切片（８０μm）をウルトラミクロトーム（Nissei社製）で調製し、クエン酸鉛及び酢酸ウラニルで染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ‐７１００電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー 社製）で観察した。 (Histochemistry and electron microscopic analysis and autoantibody assay)
To perform hematoxylin and eosin staining, mouse spleen and lymph nodes were fixed in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose in 0.1% phosphate buffer (pH 7.2), embedded in paraffin, 4 μm sections were made. To perform immunohistochemical analysis, frozen tissue sections (4 μm) were fixed with cold acetone, and non-specific sites were treated with 5% goat serum (Invitrogen) and 1% bovine serum albumin (Sigma). Block). The monoclonal antibodies used were Alexa-Fluro 488 Sreptoavidin (Molecular probes), Cy-3-conjugated anti-MFG-E8 antibody (clone 18A2) and biotinylated anti-CD68 antibody (Serotec) or anti-F4 / 80. It was a rat anti-MOMA-1 antibody (manufactured by BMA Biomedical) together with an antibody (clone 6-16A, MT) and a Cy3 binding anti-rat IgG antibody (manufactured by Jackson). TUNEL staining was performed using Apoptag kit (Intergen). The stained section was mounted with a FluorSave mounting reagent (Calbiochem) containing 1 μg / ml DAPI (Dojindo Laboratories) and observed with a fluorescence microscope (Olympus). For observation with an electron microscope, KLH was administered to a 10-week-old mouse, and then the spleen was placed in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 2% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde. Fixed. After washing with the same buffer containing 7.5% sucrose, the sample was post-fixed with 1% OsO4 and embedded in Epon812. Sections (80 μm) were prepared with an ultramicrotome (Nissei), stained with lead citrate and uranyl acetate, and observed with a Hitachi H-7100 electron microscope (Hitachi High Technology).

抗二本鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡを、ＭＢＬからのMesacup EIAを用いて、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）抗体（Cappel社製）で定量化した。４５０ｎｍの吸光度を自動Micro-ELISA readerを用いて測定した。   Anti-double-stranded DNA antibody and ANA were quantified with anti-mouse Ig (G + M + A) antibody (Cappel) using Mesacup EIA from MBL. Absorbance at 450 nm was measured using an automatic Micro-ELISA reader.

（免疫化）
リンパ節の胚中心を発達させるために、文献14記載の通りに、マウスをヒトアルブミンで免疫化した。要約すると、１０週齢のマウスの腹腔内に０．５ｍｌのウサギ抗ヒトアルブミン抗体（２ｍｇ／ｍｌ）(Sigma社製)を注入し、２４時間後に、フッドパッドに２５μｇのヒト血清アルブミンを注入した。膝窩及び笨窩リンパ節を、抗原注入後６日目に調製した。ＫＬＨで免疫化するためには、マウスの腹腔内に１５μｇのＫＬＨ（Wako社製）及びフロイントの完全アジュバンドを注入した。免疫を２回繰返し、脾臓を２回目の注入の４日後に単離した。 (Immunization)
To develop the germinal center of the lymph node, mice were immunized with human albumin as described in reference 14 . In summary, 0.5 ml of rabbit anti-human albumin antibody (2 mg / ml) (Sigma) was injected intraperitoneally into a 10-week-old mouse, and 25 μg of human serum albumin was injected into the hood pad 24 hours later. . Popliteal and axillary lymph nodes were prepared on day 6 after antigen injection. To immunize with KLH, 15 μg of KLH (manufactured by Wako) and Freund's complete adjuvant were injected into the abdominal cavity of mice. Immunization was repeated twice and the spleen was isolated 4 days after the second injection.

（可染体マクロファージにおけるＭＦＧ−Ｅ８の発現）
ＭＦＧ−Ｅ８のインビボでの生理学的な役割を調べるために、その発現を先ずノーザンブロットハイブリダイゼーションによって調べた（図１ａ）。文献（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 8417-8421, 1990、Biochem. Biophys. Res. Commun., 254, 522-528, 1999）記載の通り、ＭＦＧ−Ｅ８は乳腺で強く発現した。脾臓、リンパ節及び脳等の他のいくつかの組織もＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡを発現した。抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体との脾臓切片の免疫組織分析は、ＭＦＧ−Ｅ８が、胚中心に局在する制限された細胞で発現することを示した（図１ｂ）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片は、抗体で染色されず、ＭＦＧ−Ｅ８抗体の特異性を確認した。胚中心（リンパ濾胞の中心）には、特異的にＣＤ６８を発現するがＦ４／８０は発現しない可染体マクロファージと呼ばれるマクロファージが存在している（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。ＭＦＧ−Ｅ８を発現する細胞は、ＣＤ６８を発現するがＦ４／８０を発現せず、ＣＤ６８又はＦ４／８０による二重染色は、可染体マクロファージがＭＦＧ−Ｅ８を発現することを示唆した。ＣＤ６８+可染体マクロファージは、脾臓だけでなく、リンパ節及び胸腺にも存在する（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体での染色は、リンパ節のＣＤ６８+マクロファージがＭＦＧ−Ｅ８を発現することを示唆した（図１ｂ）が、胸腺の切片においては、ＭＦＧ−Ｅ８のシグナルは検出されなかった。 (Expression of MFG-E8 in chromosomal macrophages)
To investigate the physiological role of MFG-E8 in vivo, its expression was first examined by Northern blot hybridization (FIG. 1a). As described in the literature (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 8417-8421, 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun., 254, 522-528, 1999), MFG-E8 was strongly expressed in the mammary gland. . Several other tissues such as spleen, lymph nodes and brain also expressed MFG-E8 mRNA. Immunohistochemical analysis of spleen sections with anti-MFG-E8 antibody showed that MFG-E8 is expressed in restricted cells located in the germinal center (FIG. 1b). The spleen sections of MFG-E8 − / − mice were not stained with the antibody, confirming the specificity of the MFG-E8 antibody. In the germinal center (the center of the lymphoid follicle), there exists a macrophage called a chromosomal macrophage that specifically expresses CD68 but does not express F4 / 80 (J. Exp. Med., 174, 827-836). , 1991). Cells expressing MFG-E8 express CD68 but not F4 / 80, and double staining with CD68 or F4 / 80 suggested that chromosomal macrophages expressed MFG-E8. CD68 + chromosomal macrophages are present not only in the spleen but also in the lymph nodes and thymus (J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991). Staining with anti-MFG-E8 antibody suggested that lymph node CD68 + macrophages expressed MFG-E8 (FIG. 1b), but no MFG-E8 signal was detected in thymic sections.

（ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊）
本発明者らは、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスをジーンターゲティング法により作製した。マウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子は、第７染色体に局在し、ゲノムＤＮＡ１５．３ｋｂ内に１０個のエクソンによりコードされている。エクソン４〜６をｎｅｏ耐性遺伝子と置換したターゲッティングベクターを構築し（図２ａ）、マウス胚幹細胞（ＥＳ）に注入した。突然変異を有するＥＳクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により同定した。２つのＥＳクローン由来のマウスは、同一の表現型を有した。ヘテロ接合の動物をインタークロスし、その結果生じた同腹仔の尾部ＤＮＡを、ターゲッティングベクター外の配列を含むプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。図２ｂに示すように、EcoRV及びKpnIで二重処理したＤＮＡは、ＭＦＧ−Ｅ８+/+には、７．２ｋｂのバンドが現れ、ＭＦＧ−Ｅ８-/-には、５．６ｋｂのバンドが現れ、ＭＦＧ−Ｅ８+/-ではその両方が現れた。そのサイズは、ターゲッティングベクターとＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の相同的組換で想定された通りであった。neo 遺伝子プローブを用いたKpnIで処理したＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションでは、ＭＦＧ−Ｅ８+/-又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおいては単一のバンドが現れ（データは示されていない）、ターゲットベクターが他の部位に挿入されていないことを確認した。 (Disruption targeting the MFG-E8 gene)
The present inventors produced MFG-E8 − / − mice by the gene targeting method. The mouse MFG-E8 gene is located on chromosome 7 and is encoded by 10 exons in the genomic DNA 15.3 kb. A targeting vector in which exons 4 to 6 were replaced with a neo resistance gene was constructed (Fig. 2a) and injected into mouse embryonic stem cells (ES). ES clones with mutations were identified by polymerase chain reaction (PCR). Mice from two ES clones had the same phenotype. Heterozygous animals were intercrossed and the resulting littermate tail DNA was analyzed by Southern blot hybridization using a probe containing sequences outside the targeting vector. As shown in FIG. 2b, in the DNA double-treated with EcoRV and KpnI, a 7.2 kb band appears in MFG-E8 + / + , and a 5.6 kb band appears in MFG-E8 − / −. Both appeared in MFG-E8 +/− . Its size was as expected by homologous recombination of the targeting vector and the MFG-E8 gene. Southern blot hybridization of DNA treated with KpnI using the neo gene probe revealed a single band in MFG-E8 +/− or MFG-E8 − / − mice (data not shown) It was confirmed that the vector was not inserted at other sites.

本発明者らは、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージが、ＭＦＧ−Ｅ８を高分泌していることを先に報告した（Nature, 417, 182-187, 2002）。実際、抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体を用いた免疫沈降及びウェスタンブロットによって、野生型マウスのチオグリコレート刺激腹腔マクロファージの培養上澄液における７４ｋＤａのタンパク質が明らかになった（図２ｃ）。このタンパク質は、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージの上澄液では検出されず、ＭＦＧ−Ｅ８-/-対立遺伝子が、ＭＦＧ−Ｅ８に対するヌル対立遺伝子であることを確認した。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力を、アポトーシスを起こしたＣＡＤ-/-胸腺細胞を用いて調べた。ＣＡＤ-/-胸腺細胞はアポトーシス刺激によるＤＮＡ分解をおこさない（Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003）。しかし、ＭＦＧ−Ｅ８+/+マクロファージと共培用すると、細胞はアポトーシスの指標であるＴＵＮＥＬ陽性となり、食細胞指標は１．２０であり（図２ｄ及び２ｅ）、ＭＦＧ−Ｅ８+/+マクロファージが効果的にアポトーシス細胞を貪食し、そのＤＮＡを切断することを示した。他方、ＭＦＧ−Ｅ-/-マウスのマクロファージは、アポトーシス細胞を全く又は少数しか貪食せず、食細胞指標は０．３１であった。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力は、組み替えＭＦＧ−Ｅ８を添加することによって、用量依存的に回復した。すなわち、これらのマクロファージに０．１μｇ／ｍｌの組換ＭＦＧ−Ｅ８を添加すると、食細胞指標は０．９２まで増加した。 The present inventors previously reported that thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages highly secreted MFG-E8 (Nature, 417, 182-187, 2002). Indeed, immunoprecipitation and Western blot using anti-MFG-E8 antibody revealed a 74 kDa protein in the culture supernatant of thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages from wild type mice (FIG. 2c). This protein was not detected in the supernatant of MFG-E8 − / − macrophages, confirming that the MFG-E8 − / − allele is a null allele for MFG-E8. The ability of thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages to phagocytose apoptotic cells was examined using apoptotic CAD − / − thymocytes. CAD − / − thymocytes do not undergo DNA degradation by apoptosis stimulation (Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003). However, when co-cultured with MFG-E8 + / + macrophages, the cells became TUNEL positive, an index of apoptosis, and the phagocytic index was 1.20 (FIGS. 2d and 2e), and MFG-E8 + / + macrophages were It has been shown to effectively phagocytose apoptotic cells and cleave their DNA. On the other hand, macrophages of MFG-E − / − mice phagocytosed no or few apoptotic cells with a phagocytic index of 0.31. The ability of MFG-E8 − / − macrophages to phagocytose apoptotic cells was restored in a dose-dependent manner by the addition of recombinant MFG-E8. That is, when 0.1 μg / ml recombinant MFG-E8 was added to these macrophages, the phagocytic index increased to 0.92.

（ＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスの脾腫）
３つの遺伝子型（ＭＦＧ−Ｅ８+/+、ＭＦＧ−Ｅ８+/-及びＭＦＧ−Ｅ８-/-）は通常のメンデル遺伝の法則通りに現れた。ＭＦＧ-/-マウスは、通常の繁殖力で繁殖し、その乳腺は少なくとも非妊娠時は普通であるように見えた（データは示されていない）。しかし、図３ａに示されるように、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは年齢依存的に脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫（巨脾症）を発症した。４０週齢では、ＭＦＧ−Ｅ８-/-の脾臓は、野生型より約３倍重かった（図３ｂ）。脾臓の組織化学分析で、白色髄がＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスで非常に肥大し、複数のリンパ小節を保有していることが示された（図３ｃ）。マーカーＭＯＭＡ−１によって定義されるメタロフィリックマクロファージは、白色髄の周辺帯と濾胞帯の境界に局在している（Immunology, 58, 665-669, 1986）。抗ＭＯＭＡ−１抗体による脾臓切片の染色により、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓の濾胞帯の肥大を確認した（図３ｄ）。脾臓内のＢ細胞とＴ細胞の比率は、ＭＦＧ−Ｅ８+/+とＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスとで同じであったが、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓のリンパ球の数は、野生型の脾臓より２〜３倍多かった。 (Splenoma of MFG-E8 null mouse)
Three genotypes (MFG-E8 + / + , MFG-E8 +/− and MFG-E8 − / − ) appeared in accordance with normal Mendelian inheritance rules. MFG − / − mice bred at normal fertility and their mammary glands appeared normal at least during non-pregnancy (data not shown). However, as shown in FIG. 3a, MFG-E8 − / − mice developed splenomegaly (splenomegaly) in which the size of the spleen expanded beyond the normal range in an age-dependent manner. At 40 weeks of age, the spleen of MFG-E8 − / − was about 3 times heavier than the wild type (FIG. 3b). Histochemical analysis of the spleen showed that the white marrow was very enlarged in MFG-E8 − / − mice and possessed multiple lymph nodes (FIG. 3c). The metallophilic macrophages defined by the marker MOMA-1 are localized at the border between the white and the marginal zone of the white pulp (Immunology, 58, 665-669, 1986). Staining of spleen sections with anti-MOMA-1 antibody confirmed enlargement of the follicular zone of the spleen of MFG-E8 − / − mice (FIG. 3d). The ratio of B cells to T cells in the spleen was the same in MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mice, but the number of lymphocytes in MFG-E8 − / − spleen was wild type 2 to 3 times more than the spleen.

（胚中心のＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食障害）
可染体マクロファージが、胚中心で発生したアポトーシスＢ細胞を貪食することは知られている（Anat. Rec., 229, 511-520, 1991）。４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウスの脾臓では、胚中心のＣＤ６８陽性マクロファージと結合しているアポトーシスをおこしたＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は少なかった（図４ａ）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスのＣＤ６８陽性細胞は、明らかに野生型マウスのＣＤ６８陽性細胞より大きく、より多くのＴＵＮＥＬ陽性細胞と結合していた。ＣＤ６８陽性マクロファージの肥大と、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓のＴＵＮＥＬ陽性細胞との強い結合は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）でマウスを免疫し、B細胞を活性化すると明瞭であった（図４ａ）。ＣＤ６８は、主に後期エンドソーム又はリソソーム内に局在している（Adv. Immunol., 68, 271-314, 1998）。したがって、ＫＬＨで処理したＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓内のＴＵＮＥＬ陽性細胞を保有するマクロファージを共焦点顕微鏡で分析したところ（図４ｂ）、ＣＤ６８を細胞内に見い出した。ＴＵＮＥＬ陽性物質であるアポトーシス細胞の核はＣＤ６８と共在していなかったが、マクロファージの表面の細胞外に存在していたようである。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージ内のアポトーシス物質が細胞外に局在していることを確認するために、脾臓切片を電子透過型顕微鏡で分析した。図４ｃに示すように、野生型マウスの可染体マクロファージは、アポトーシス細胞の凝縮核を細胞内に保有しており、いくつかのアポトーシス物質は分解されていた。ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓では、アポトーシス細胞は一見、可染体マクロファージに局在していたが、これはインタクトな原形質膜を保有してた。このことは、これらのアポトーシス細胞がマクロファージの外側に局在することを示唆している。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓から調製したリンパ球は、Ｆａｓリガンド又はＵＶの処理により野生型細胞と同じ効率でアポトーシスを起こし、ＰＳを表面に露出した。これらの結果から、可染体マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力は、ＭＦＧ−Ｅ８の欠如によって障害されていると結論した。 (A phagocytosis of apoptotic cells by MFG-E8-deficient chromosomal macrophages in the germinal center)
It is known that chromosomal macrophages phagocytose apoptotic B cells generated at germinal centers (Anat. Rec., 229, 511-520, 1991). In the spleen of 40-week-old MFG-E8 + / + mice, the number of TUNEL-positive cells undergoing apoptosis bound to CD68-positive macrophages at the germinal center was small (FIG. 4a). The CD68 positive cells of MFG-E8 − / − mice were clearly larger than the CD68 positive cells of wild type mice and bound to more TUNEL positive cells. The strong association of CD68 positive macrophages with MFG-E8 − / − splenic TUNEL positive cells was evident when immunizing mice with keyhole limpet hemocyanin (KLH) and activating B cells (FIG. 4a). CD68 is mainly localized in late endosomes or lysosomes (Adv. Immunol., 68, 271-314, 1998). Therefore, when macrophages carrying TUNEL positive cells in the spleen of MFG-E8 − / − mice treated with KLH were analyzed with a confocal microscope (FIG. 4b), CD68 was found in the cells. The nuclei of apoptotic cells, which are TUNEL positive substances, did not co-exist with CD68, but seemed to exist extracellularly on the surface of macrophages. In order to confirm that apoptotic substances in MFG-E8 − / − macrophages were localized extracellularly, spleen sections were analyzed with an electron transmission microscope. As shown in FIG. 4c, chromosomal macrophages of wild-type mice possessed condensed nuclei of apoptotic cells, and some apoptotic substances were degraded. In MFG-E8 − / − spleen, apoptotic cells seemed to be localized to chromosomal macrophages, which retained an intact plasma membrane. This suggests that these apoptotic cells are located outside the macrophages. Lymphocytes prepared from the spleen of MFG-E8 − / − mice caused apoptosis with the same efficiency as wild type cells by treatment with Fas ligand or UV, and exposed PS on the surface. From these results, it was concluded that the ability of chromosomal macrophages to phagocytose apoptotic cells was impaired by the lack of MFG-E8.

（ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおける糸球体腎炎の発症）
アポトーシス細胞を全身へ連続的に注入すると、自己抗体が産生されることが知られている（J. Exp. Med., 188, 387-392, 1998）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、自発的に自己抗体を年齢依存的に産生した。図５ａに示すように、１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-の血清内の抗二重鎖ＤＮＡ抗体又は抗核抗体（ＡＮＡ）の濃度は、野生型マウスと同じであった。しかし、４０週齢では、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス、特にメスのマウスは、血清内に、抗二重鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡを高い濃度で保有していた。すなわち、オスのＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの抗二重鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡの濃度は、野生型マウスよりそれぞれ２．３倍及び５．４倍高かった。メスのマウスでは、これらの値は野生型マウスより６．３倍及び８．０倍高かった。４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの全ＩｇＧレベルも、同齢の野生型マウスより２倍高かった（データは示されていない）。循環している自己抗体は、腎臓に免疫複合体として堆積し、糸球体腎炎を誘発することが知られている（Semin. Nephrol., 12, 379-394, 1992）。腎臓の凍結切片を、蛍光抗体法により調べたところ、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの糸球体内に多量のＩｇＧの堆積が明らかになった（図５ｂ）。ＩｇＧの堆積と一致して、細胞過多及び糸球体の肥大が、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの糸球体で見られ、これらのマウスが糸球体腎炎を発症したことを示している（図５ｃ）。 (Development of glomerulonephritis in MFG-E8 − / − mice)
It is known that autoantibodies are produced when apoptotic cells are continuously injected throughout the body (J. Exp. Med., 188, 387-392, 1998). MFG-E8 − / − mice spontaneously produced autoantibodies in an age-dependent manner. As shown in FIG. 5a, the concentration of anti-double-stranded DNA antibody or antinuclear antibody (ANA) in the serum of 10-week-old MFG-E8 − / − was the same as that in the wild-type mouse. However, at 40 weeks of age, MFG-E8 − / − mice, particularly female mice, possessed high concentrations of anti-double-stranded DNA antibody and ANA in the serum. That is, the concentrations of anti-double-stranded DNA antibody and ANA in male MFG-E8 − / − mice were 2.3 times and 5.4 times higher than in wild type mice, respectively. In female mice, these values were 6.3 and 8.0 times higher than in wild type mice. Total IgG levels in 40-week-old MFG-E8 − / − mice were also 2 times higher than in wild-type mice of the same age (data not shown). Circulating autoantibodies are known to accumulate in the kidney as immune complexes and induce glomerulonephritis (Semin. Nephrol., 12, 379-394, 1992). Examination of the frozen section of the kidney by a fluorescent antibody method revealed that a large amount of IgG was deposited in the glomeruli of MFG-E8 − / − mice (FIG. 5b). Consistent with IgG deposition, cell hypertrophy and glomerular hypertrophy were seen in the glomeruli of MFG-E8 − / − mice, indicating that these mice developed glomerulonephritis (FIG. 5c). .

（まとめ）
アポトーシス細胞の除去は通常非常に効率的であり、アポトーシスの割合が非常に高い組織でもほとんどアポトーシス細胞を見い出すことができない（Nature, 372, 100-103, 1994）。マクロファージ内のいくつかの分子が、アポトーシス細胞のレセプター又はアポトーシス細胞とマクロファージとの間の架橋分子（bridging molecules）として提案された（Nature, 407, 784-788, 2000）が、各分子の生理学的役割は明確にはなっていなかった。上記実施例は、ＭＦＧ−Ｅ８が、脾臓及びリンパ節の胚中心の可染体マクロファージ並びにチオグリコレート刺激腹腔マクロファージで特異的に発現することを示した。胚中心では、抗原に対して減衰した親和性を有するＢ細胞が、アポトーシスを起こす（Immunity, 4, 107-111, 1996）。可染体マクロファージは、これらのアポトーシス細胞の排除に寄与し、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスで得られた結果は、ＭＦＧ−Ｅ８がこの過程に重要な役割を果たしていることを示している。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、多量の自己抗体を発生させた。この結果は貪食されなかったアポトーシスＢ細胞は二次的ネクローシスを起し、遊離した物質は濾胞性の樹状細胞と結合し、自己反応性Ｂ細胞に生存シグナルを与える可能性を示唆している（Immunol., 74, 61-88, 2000）。さらにこのシグナルは、リンパ球の成長を刺激するサイトカインを産生するＴ細胞を活性化し、脾腫を誘発してのであろう。 (Summary)
Apoptotic cell removal is usually very efficient and few apoptotic cells can be found even in tissues with a very high percentage of apoptosis (Nature, 372, 100-103, 1994). Several molecules within macrophages have been proposed as receptors for apoptotic cells or bridging molecules between apoptotic cells and macrophages (Nature, 407, 784-788, 2000) The role was not clear. The above examples showed that MFG-E8 is specifically expressed in spleen and lymph node germinal center chromosomal macrophages and thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages. At the germinal center, B cells with attenuated affinity for antigen undergo apoptosis (Immunity, 4, 107-111, 1996). The chromosomal macrophages contribute to the elimination of these apoptotic cells, and the results obtained in MFG-E8 − / − mice indicate that MFG-E8 plays an important role in this process. MFG-E8 − / − mice developed large amounts of autoantibodies. This result suggests that apoptotic B cells that were not phagocytosed could undergo secondary necrosis, and the released material could bind to follicular dendritic cells and provide a survival signal to autoreactive B cells. (Immunol., 74, 61-88, 2000). Furthermore, this signal will activate T cells producing cytokines that stimulate lymphocyte growth and induce splenomegaly.

ＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージは、アポトーシス細胞と結合していた。このことは、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージがアポトーシス細胞をまだ認識できることを示している。Hoffmann et al.は以前に、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食に関して２段階モデルを提案した（J. Cell Biol., 155, 649-659, 2001）。このモデルにおいては、アポトーシス細胞は、先ずマクロファージによって繋ぎとめられ、次にＰＳ依存方式で、マクロピノサイトーシスに貪食される。このシナリオでは、ＭＦＧ−Ｅ８は、マクロピノサイトーシス段階で機能しているように思われる。ＣＤ−６８陽性可染体マクロファージは、二次リンパ組織の胚中心だけでなく、胸腺にも存在する（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。胸腺マクロファージにＭＦＧ−Ｅ８が発現しないことは、異なる組織のマクロファージが、アポトーシス細胞の貪食に異なる分子を用いることを示している。このことに関して、本発明者らは、近年ＭＦＧ−Ｅ８の相同体（Ｄｅｌ−１）を見い出し、その発現がＭＦＧ−Ｅ８の発現と完全に異なることを確認した。 MFG-E8-deficient chromosomal macrophages were associated with apoptotic cells. This indicates that MFG-E8 − / − macrophages can still recognize apoptotic cells. Hoffmann et al. Previously proposed a two-stage model for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages (J. Cell Biol., 155, 649-659, 2001). In this model, apoptotic cells are first anchored by macrophages and then engulfed by macropinocytosis in a PS-dependent manner. In this scenario, MFG-E8 appears to function at the macropinocytosis stage. CD-68 positive chromosomal macrophages are present not only in the germinal center of secondary lymphoid tissues but also in the thymus (J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991). The lack of MFG-E8 expression in thymic macrophages indicates that macrophages from different tissues use different molecules for phagocytosis of apoptotic cells. In this regard, the present inventors recently found a homologue of MFG-E8 (Del-1) and confirmed that its expression is completely different from that of MFG-E8.

他方、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージは、ＭＦＧ−Ｅ８を発現し、その貪食作用はＭＦＧ−Ｅ８に強く依存する。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージは、炎症部位の好中球及びリンパ球の速やかな排除に関与する専門のマクロファージを代表する（J. Leukoc. Biol., 61, 375-380, 1997）。バクテリア又はウイルス感染に対するＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの反応を観察することは興味深いかもしれない。最後に、全身性エリマトーデスのヒトの患者は、胚中心の可染体マクロファージのアポトーシス細胞の貪食にしばしば欠陥がある（Arthritis Rheum., 46, 191-201, 2002）ことから、本発明の自己免疫マウスは、ヒト全身性エリマトーデスのモデル動物として有用であろう。 On the other hand, thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages express MFG-E8, whose phagocytosis is strongly dependent on MFG-E8. Thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages represent specialized macrophages involved in the rapid elimination of neutrophils and lymphocytes at sites of inflammation (J. Leukoc. Biol., 61, 375-380, 1997). It may be interesting to observe the response of MFG-E8 − / − mice to bacterial or viral infection. Finally, human patients with systemic lupus erythematosus are often deficient in phagocytosis of apoptotic cells of germinal center chromosomal macrophages (Arthritis Rheum., 46, 191-201, 2002). The mouse will be useful as a model animal for human systemic lupus erythematosus.

可染体マクロファージにおけるＭＦＧ−Ｅ８の発現に関する図である。ａ．１０週齢のマウスの示された組織から調製した全ＲＮＡ（１０μｇ）を、32Ｐ標識マウスＭＦＧ−Ｅ８ ｃＤＮＡをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った（上パネル）。下のパネル；フィルターをメチレンブルーで染色した。ｂ．１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+（ＷＴ）マウス又はＭＦＧ−Ｅ８-/-（ＫＯ）マウスの脾臓切片を抗Ｆ４／８０抗体又は抗ＣＤ６８抗体（緑）及び抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体（赤）で染色した。切片をヘモキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した。マウスをヒトアルブミンで免疫化してリンパ節を発達させ、切片を上記の通り染色した。ＨＥで染色した切片の、付点の四角は、免疫染色パネルで示す区域に対応する。スケールバー、１００μｍ。It is a figure regarding the expression of MFG-E8 in a chromosomal macrophage. a. Total RNA (10 μg) prepared from the indicated tissues of 10-week-old mice was subjected to Northern hybridization using 32 P-labeled mouse MFG-E8 cDNA as a probe (upper panel). Lower panel; filters were stained with methylene blue. b. Spleen sections of 10-week-old MFG-E8 + / + (WT) or MFG-E8 − / − (KO) mice were treated with anti-F4 / 80 antibody or anti-CD68 antibody (green) and anti-MFG-E8 antibody (red) Stained with Sections were stained with hemoxylin-eosin (HE). Mice were immunized with human albumin to develop lymph nodes and sections were stained as described above. The dotted squares of the sections stained with HE correspond to the areas shown in the immunostaining panel. Scale bar, 100 μm. 本発明の自己免疫疾患モデルマウスを作製するための、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊に関する図である。ａ．内在性のＭＦＧ−Ｅ８部位（ＷＴ）、ターゲットベクター及びターゲット部位（ＫＯ）を示した。エクソンを黒の四角で示し、番号を付した。ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）及びジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする遺伝子を示した。ｂのサザンハイブリダイゼーションに使用したプローブをバーで示した。プローブにより検出されたEcoRV‐KpnIで処理した断片を示した。ｂ．ＭＦＧ−Ｅ８+/-の親から生じた仔の尾部DＮＡ（５μｇ）を、サザンハイブリダイゼーションにより分析した。ｃ．１２週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスから調製したチオグリコレート刺激腹腔マクロファージを４８時間培養した。細胞抽出液及び培養上澄液を、抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体２４２２で免疫沈降し、１８Ａ２モノクローナル抗体でウェスタンブロットした。ｄ．チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、組換えＭＦＧ−Ｅ８（０．１μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下でＣＡＤ欠損マウスから調製したアポトーシス胸腺細胞と共培養し、ＴＵＮＥＬ（茶）で染色した後、光学顕微鏡で観察した。倍率は４００倍。ｅ．マクロファージ当たりの貪食された（ＴＵＮＥＬ陽性）アポトーシス細胞数で示された貪食作用指標。実験は３回行い、平均値が標準偏差と共に示されている。It is a figure regarding the destruction which made the MFG-E8 gene a target for producing the autoimmune disease model mouse of this invention. a. The endogenous MFG-E8 site (WT), target vector and target site (KO) are shown. Exons are indicated by black squares and numbered. The genes encoding neomycin resistance gene (Neo) and diphtheria toxin A (DTA) are shown. The probe used for Southern hybridization of b is indicated by a bar. The fragments treated with EcoRV-KpnI detected by the probe are shown. b. Offspring tail DNA (5 μg) generated from MFG-E8 +/− parents was analyzed by Southern hybridization. c. Thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages prepared from 12-week-old MFG-E8 + / + or MFG-E8 − / − mice were cultured for 48 hours. Cell extracts and culture supernatants were immunoprecipitated with anti-MFG-E8 antibody 2422 and Western blotted with 18A2 monoclonal antibody. d. Thioglycolate-stimulated peritoneal macrophages were co-cultured with apoptotic thymocytes prepared from CAD-deficient mice in the presence or absence of recombinant MFG-E8 (0.1 μg / ml) and stained with TUNEL (brown). Observed with an optical microscope. The magnification is 400 times. e. Phagocytosis index indicated by the number of apoptotic cells phagocytosed per macrophage (TUNEL positive). The experiment was performed in triplicate and the average value is shown with the standard deviation. 本発明のＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスの脾腫発症に関する図である。ａ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓を撮影した。スケールバー、１センチ。ｂ．１０週齢又は４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス（白いバー）及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス（黒いバー）の脾臓を秤量し、１０匹のマウスの平均値を標準偏差と共に示した。ｃ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。スケールバー、０．１ｍｍ。ｄ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片を抗ＭＯＭＡ−１抗体（赤）で染色した。スケールバー、０．１ｍｍ。It is a figure regarding the splenomegaly development of the MFG-E8 null mouse of this invention. a. The spleens of 40-week-old MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mice were photographed. Scale bar, 1 cm. b. The spleens of 10 or 40-week-old MFG-E8 + / + mice (white bars) and MFG-E8 − / − mice (black bars) were weighed, and the average values of 10 mice were shown with standard deviations . c. Spleen sections of 40-week-old MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mice were stained with hematoxylin and eosin. Scale bar, 0.1 mm. d. Spleen sections of 40-week-old MFG-E8 + / + mice and MFG-E8 − / − mice were stained with anti-MOMA-1 antibody (red). Scale bar, 0.1 mm. 本発明の胚中心のＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食障害に関する図である。ａ．脾臓切片は、４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス、又はＫＬＨで免疫化した１０週齢のマウスから調製し、抗ＣＤ６８抗体（赤）及びＴＵＮＥＬ（緑）で染色した。スケールバー、１００μｍ。付点の区域の拡大図を右のパネルに示す。スケールバー、２５μｍ。ｂ．ＫＬＨで免疫化した１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓に局在するＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）と結合したＣＤ６８陽性（赤）可染体マクロファージを、共焦点顕微鏡（Zeiss社製）で観察し、３Ｄ投影システムを使用して３次元の像を作成した。ｃ．ＫＬＨで免疫化した１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片を、電子顕微鏡により分析した。ＭＦＧ−Ｅ８+/+脾臓の可染体マクロファージ（ＴＢＭ）は、アポトーシス細胞の残遺物しか保有しない（矢印）が、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓でＴＢＭと結合したアポトーシス細胞はまだインタクトである。It is a figure regarding the phagocytic disorder of the apoptotic cell by the MFG-E8 deficient chromosomal macrophage of the germinal center of this invention. a. Spleen sections were prepared from 40 week old MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mice or 10 week old mice immunized with KLH, anti-CD68 antibody (red) and TUNEL (green). Stained with Scale bar, 100 μm. An enlarged view of the dotted area is shown in the right panel. Scale bar, 25 μm. b. CD68 positive (red) dyeable macrophages bound to TUNEL positive cells (green) localized in the spleen of 10-week-old MFG-E8 − / − mice immunized with KLH were confocal microscope (Zeiss) And a 3D image was created using a 3D projection system. c. Spleen sections of 10-week old MFG-E8 + / + or MFG-E8 − / − mice immunized with KLH were analyzed by electron microscopy. MFG-E8 + / + splenic chromosomal macrophages (TBM) carry only the remnants of apoptotic cells (arrows), but apoptotic cells associated with TBM in MFG-E8 − / − spleen are still intact. 本発明のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおいて糸球体腎炎の発症を示す図である。ａ．１０又は４０週齢のオス（Ｍ）及びメス（Ｆ）のマウス（各グループに８匹のマウス）の抗二重鎖ＤＮＡ抗体及び抗核抗体（ＡＮＡ）の血清濃度は、平均でプロットした（バー）。ｂ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの腎臓の凍結切片をＣｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson社製）で染色した。スケールバー、１００μｍ。ｃ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの腎臓切片をパラホルムアルデヒドで固定し、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。It is a figure which shows the onset of glomerulonephritis in the MFG-E8 − / − mouse of the present invention. a. Serum concentrations of anti-double-stranded DNA antibodies and antinuclear antibodies (ANA) in 10 or 40 week old male (M) and female (F) mice (8 mice in each group) were plotted on average ( bar). b. Cryosections of 40-week-old MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mouse kidneys were stained with Cy3-conjugated anti-mouse IgG antibody (Jackson). Scale bar, 100 μm. c. Kidney sections of 40-week-old MFG-E8 + / + and MFG-E8 − / − mice were fixed with paraformaldehyde and stained with periodate Schiff (PAS).

Claims (21)

染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生することを特徴とする自己免疫疾患モデル非ヒト動物。 It is characterized in that a part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome is deleted, the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type is lost, and autoantibodies are produced. Autoimmune disease model non-human animal. 糸球体腎炎を発症することを特徴とする請求項１記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。 The autoimmune disease model non-human animal according to claim 1, which develops glomerulonephritis. 脾腫を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。 The autoimmune disease model non-human animal according to claim 1 or 2, which develops splenomegaly. 非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。 The autoimmune disease model non-human animal according to any one of claims 1 to 3, wherein the non-human animal is a rodent. 齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。 5. The autoimmune disease model non-human animal according to claim 4, wherein the rodent is a mouse. 請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来することを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。 An MFG-E8-deficient macrophage derived from the non-human animal model of autoimmune disease according to any one of claims 1 to 5. 可染体マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。 The MFG-E8-deficient macrophage according to claim 6, which is a chromosomal macrophage. 腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。 The MFG-E8-deficient macrophage according to claim 6, which is an abdominal cavity macrophage. 染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 A part or all of the fat globule coat glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome is deleted, the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type is lost, and nonhuman animals producing autoantibodies are covered. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease, comprising administering a test substance and evaluating the degree of the autoimmune disease in the non-human animal. 染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 A part or all of the fat globule coat glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome is deleted, the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type is lost, and nonhuman animals producing autoantibodies are covered. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases, comprising administering a test substance and evaluating the degree of phagocytosis of apoptotic cells of MFG-E8-deficient macrophages of the non-human animal. 請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 The MFG-E8-deficient macrophage derived from the autoimmune disease model non-human animal according to any one of claims 1 to 5 is contacted with apoptotic cells in the presence of a test substance, and the non-human animal MFG-E8-deficient macrophage is contacted. A screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases, characterized by evaluating the degree of phagocytosis on apoptotic cells. ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 12. The screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to claim 10 or 11, wherein the MFG-E8-deficient macrophage is a chromosomal macrophage. ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 The method for screening a preventive / therapeutic agent for autoimmune diseases according to claim 10 or 11, wherein the MFG-E8-deficient macrophages are peritoneal macrophages. 染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と、野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 A non-human animal that produces an autoantibody, in which a part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome is deleted, the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type is lost, 14. The screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to any one of claims 9 to 13, wherein the method is compared / evaluated with a wild type non-human animal. 野生型非ヒト動物が、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項１４記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 Wild-type non-human animals lack part or all of the fat globule glycoprotein (MFG-E8) gene on the chromosome, lose the function of expressing MFG-E8 expressed in the wild type, 15. The screening method for a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to claim 14, which is a wild-type non-human animal that is the same as the non-human animal to be produced. 自己免疫疾患が糸球体腎炎であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 The method for screening for a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to any one of claims 9 to 15, wherein the autoimmune disease is glomerulonephritis. 自己免疫疾患が脾腫であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 The method for screening for a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to any one of claims 9 to 15, wherein the autoimmune disease is splenomegaly. 非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 The method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune disease according to any one of claims 9 to 17, wherein the non-human animal is a rodent. 齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。 19. The screening method for a prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease according to claim 18, wherein the rodent is a mouse. 請求項９〜１９のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤。 A prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases obtained by the method for screening a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases according to any one of claims 9 to 19. 検体から脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法。
A method for diagnosing an autoimmune disease caused by MFG-E8 abnormality, comprising extracting a fat globule coat glycoprotein (MFG-E8) gene from a specimen and examining the presence or absence of the gene abnormality.
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