JP2005137293A - Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion - Google Patents
Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005137293A JP2005137293A JP2003378439A JP2003378439A JP2005137293A JP 2005137293 A JP2005137293 A JP 2005137293A JP 2003378439 A JP2003378439 A JP 2003378439A JP 2003378439 A JP2003378439 A JP 2003378439A JP 2005137293 A JP2005137293 A JP 2005137293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phytase
- plant
- codon
- phytase gene
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、植物におけるフィターゼの生産方法に関するものである。 The present invention relates to a method for producing phytase in a plant.
近年、穀物、種子等リン酸塩を多く含む飼料を用いて飼育される家畜（単胃動物）の排せつ物中のリン酸が河川等を汚染し、環境の富栄養化を引き起こすことが問題化している。フィターゼは、飼料添加剤として家畜飼料中に混入されることにより、飼料中のフィチン酸塩が脱リン酸化され、それにより生じたリン酸が動物に吸収されるようになるため、排せつ物中のリン酸源濃度を低減させる効果がある。また、フィターゼの添加により動物におけるリン酸の吸収効率が改善されるため、通常ではリン酸の補給の目的で飼料に加えられるリン鉱石を添加する必要がなくなるため、リン資源としてのリン鉱石の節減につながる。さらにフィターゼは、フィチン酸によりキレートされているミネラルを遊離するので、動物におけるミネラル吸収を促進する効果がある。同様に、フィターゼは、タンパク質、デンプン、脂質等と複合体を形成するフィチン酸を分解するので、タンパク質、デンプン、脂質の消化性向上に役立つ効果がある。一方、フィターゼは、飼料添加剤としての利用の他に、フィチン酸塩の加水分解の生成物であるミオイノシトールの生産にも利用される。なお、ミオイノシトールは鳥類や哺乳類にとっての必須栄養源である。 In recent years, it has become a problem that phosphoric acid in the excrement of livestock (monogastric animals) bred using diets rich in phosphate, such as cereals and seeds, contaminates rivers and the like, causing eutrophication of the environment. Yes. When phytase is mixed in livestock feed as a feed additive, phytate in the feed is dephosphorylated, and the resulting phosphate is absorbed by the animal. There is an effect of reducing the acid source concentration. In addition, since the absorption efficiency of phosphate in animals is improved by the addition of phytase, it is no longer necessary to add phosphate ore that is normally added to feed for the purpose of supplementing phosphate. Leads to. Furthermore, since phytase releases minerals chelated by phytic acid, it has the effect of promoting mineral absorption in animals. Similarly, phytase degrades phytic acid that forms a complex with proteins, starches, lipids, and the like, and thus has an effect of helping to improve digestibility of proteins, starches, and lipids. On the other hand, phytase is used not only as a feed additive but also for production of myo-inositol which is a product of phytate hydrolysis. Myo-inositol is an essential nutrient source for birds and mammals.
フィターゼの生産は、フィターゼを生産する微生物自身の培養系、あるいは異種タンパク質生産がすでに開発されている大腸菌、枯早菌、酵母、糸状菌を宿主とする宿主ベクター系を用いた培養系により一般的に行われている。一方、形質転換植物を用いたフィターゼの生産は、上記の微生物培養法に比べ、特殊な装置や大量のエネルギーを必要としないため、生産コストの点で利点がある。また、フィターゼを生産する植物は、直接飼料として動物に与えることができる他、労力やエネルギーをほとんど使わずにフィターゼを生産する植物からフィターゼを粗抽出又は粗精製して飼料添加剤として用いることができるという利点がある。 Phytase production is generally carried out by the culture system of the microorganism that produces phytase, or the culture system using a host vector system with Escherichia coli, Bacteria, yeast, and filamentous fungi, which have already been developed for heterologous protein production. Has been done. On the other hand, the production of phytase using a transformed plant is advantageous in terms of production cost because it does not require a special device or a large amount of energy as compared with the above-described microorganism culture method. Plants that produce phytase can be fed directly to animals as feed, and can be used as feed additives by roughly extracting or roughly purifying phytase from plants that produce phytase with little effort and energy. There is an advantage that you can.
植物における外来フィターゼの生産については、アスペルギルス・ニガー(Aspeugillus niger)由来のフィターゼを、タバコの種子（非特許文献１）、タバコの葉（非特許文献２）、コムギの種子（非特許文献３）で生産させた例やダイズの懸濁培養から分泌させた例（非特許文献４）やシロイヌナズナの根から分泌させた例（非特許文献５）、アスペルギルス・フミガトゥス(Aspeugillus fumigatus)由来のフィターゼをイネの種子で生産させた例（非特許文献６）、アスペルギルス・フィクウム(Aspeugillus ficuum) 由来のフィターゼをタバコの葉（非特許文献７）やアルファルファの葉（非特許文献８）やジャガイモの塊茎（非特許文献９）で生産させた例が知られているが、アスペルギルス属以外の生物種由来のフィターゼを植物で生産させた例はほとんどない。その原因の一つとして、植物において外来フィターゼ遺伝子の発現効率が低い、あるいは発現したとしても産業上価値のあるレベルでフィターゼを生産することができないことが挙げられる。 For the production of exogenous phytase in plants, phytase derived from Asperugillus niger is used as tobacco seed (Non-patent document 1), tobacco leaf (Non-patent document 2), and wheat seed (Non-patent document 3). Examples produced in soybean, secreted from suspension culture of soybean (Non-patent document 4), secreted from Arabidopsis roots (Non-patent document 5), phytase derived from Asperugillus fumigatus (Aspeugillus fumigatus) Example of non-patent document 6 produced from Aspergillus ficus, Asperugillus ficuum phytase derived from tobacco leaves (non-patent document 7), alfalfa leaves (non-patent document 8) and potato tubers (non-patent document 6) Although the example produced by patent document 9) is known, the example which produced the phytase derived from biological species other than Aspergillus genus with a plant is almost. There. One of the causes is that the expression efficiency of the foreign phytase gene in plants is low, or even if expressed, it cannot be produced at an industrially valuable level.
フィターゼは、高等植物、動物および微生物に存在するが、由来となる生物種ごとに至適温度、至適ｐＨ、温度安定性、反応可能なｐＨのレンジなどの生化学的な性質はそれぞれ異なっている（非特許文献１０、１１）。一般的に産業上は、温度安定性が高く、反応可能なｐＨレンジが広いフィターゼが望まれるが、家畜、魚を含めた動物種およびそれらの生育ステージ毎に理想的なフィターゼの性質が異なる（１０）。以上のことから、固有の性質を有する様々なフィターゼを植物で生産する系を確立することは産業上重要である。
Phytase exists in higher plants, animals, and microorganisms, but the biochemical properties such as optimum temperature, optimum pH, temperature stability, and reactable pH range differ depending on the species of origin. (
解決しようとする問題点は、ある生物種由来のフィターゼ遺伝子は宿主とする植物において高い効率で遺伝子発現しない、又は高い効率でその遺伝子発現産物であるフィターゼを生産しない点である。 The problem to be solved is that the phytase gene derived from a certain species does not express the gene with high efficiency in the host plant, or does not produce the phytase that is the gene expression product with high efficiency.
本発明は、宿主とする植物種のコドンの使用頻度に近づくよう塩基配列を改変したフィターゼ遺伝子に細胞外への分泌シグナルに対応する塩基配列を連結して宿主植物へ導入することを最も主要な特徴とする。 The most important aspect of the present invention is that a phytase gene whose base sequence is modified so as to approach the frequency of codon usage of the plant species used as a host is linked to a base sequence corresponding to an extracellular secretion signal and introduced into a host plant. Features.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] フィターゼ遺伝子の塩基配列を変えることで使用コドンを改変し、かつ、当該フィターゼを細胞外に局在させることを特徴とする、形質転換植物で外来フィターゼ遺伝子を発現し、フィターゼを生産する方法。
[２] フィターゼ遺伝子が植物以外の生物種由来であることを特徴とする[１]に記載の方法。
[３] 植物以外の生物種が微生物であることを特徴とする[２]に記載の方法。
[４] 微生物が酵母であることを特徴とする[３]に記載の方法。
[５] 酵母がシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)であることを特徴とする[４]に記載の方法。
[６] フィターゼを細胞外に局在させるために細胞外分泌シグナルを用いることを特徴とする[１]に記載の方法。
[７] 細胞外分泌シグナルに対応するＤＮＡ領域がイネのキチナーゼ遺伝子由来であることを特徴とする[６]に記載の方法。
[８] フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンの集団のうち、一個以上のコドンについて当該使用頻度を低下させることを特徴とする[１]に記載の方法。
[９] フィターゼ遺伝子のコドンを改変により、アミノ酸配列の改変を伴わないことを特徴とする[８]に記載の方法。
[１０] 使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結することを特徴とするフィターゼ遺伝子発現用構成物。
[１１] [１０]に記載のフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する形質転換された植物。
[１２] 形質転換された植物がルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ルーピン、ダイズ、綿花、セイヨウアブラナ、カリフラワー、ナタネ、ダイコン、ヒマワリ、ニンジン、アカクローバ、シロクローバ、タバコ、ゴマ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバもしくはビートから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、エンバク、アワ、ヒエ、ソルガム、サトウキビ、トウモロコシ、イタリアンライグラス、オーチャードグラス、チモシー、寒地型牧草もしくは暖地型牧草から選ばれる単子葉植物種である、[１１]に記載の植物。
[１３] [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞。
[１４] [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする飼料構成物。
[１５] [１４]に記載の飼料構成物を動物に与えることを特徴とする動物の飼育方法。
[１６] [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物細胞からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする食品。
That is, the present invention is as follows.
[1] A foreign phytase gene is expressed in a transformed plant, and the phytase is produced by transforming the codon used by changing the base sequence of the phytase gene and localizing the phytase outside the cell. Method.
[2] The method according to [1], wherein the phytase gene is derived from a biological species other than plants.
[3] The method according to [2], wherein the biological species other than the plant is a microorganism.
[4] The method according to [3], wherein the microorganism is yeast.
[5] The method according to [4], wherein the yeast is Schwanniomyces occidentalis.
[6] The method according to [1], wherein an extracellular secretion signal is used to localize phytase outside the cell.
[7] The method according to [6], wherein the DNA region corresponding to the extracellular secretion signal is derived from a rice chitinase gene.
[8] According to [1], the frequency of use of one or more codons in the codon population in which the frequency of use of codons in the phytase gene is higher than the frequency of use in the plant species serving as the host is reduced. The method described.
[9] The method according to [8], wherein the amino acid sequence is not altered by modifying the codon of the phytase gene.
[10] A composition for phytase gene expression, characterized in that a base sequence of an extracellular secretion signal is linked to a phytase gene whose codon used is modified.
[11] A transformed plant having the phytase gene expression composition according to [10].
[12] The transformed plants are lupine, pea, broad bean, kidney bean, alfalfa, lupine, soybean, cotton, rape, cauliflower, rapeseed, radish, sunflower, carrot, red clover, white clover, tobacco, sesame, sugar beet, potato , Sweet potato, cassava or beet dicotyledonous species, or wheat, barley, rye, rice, oat, millet, millet, sorghum, sugarcane, corn, Italian ryegrass, orchardgrass, timothy, coldland pasture or warmland type The plant according to [11], which is a monocotyledonous plant species selected from pasture.
[13] A plant, a part of a plant, or a plant cell in which a foreign phytase gene is expressed by the method according to any one of [1] to [9].
[14] A plant, a part of the plant, or a plant cell in which the foreign phytase gene is expressed by the method according to any one of [1] to [9], or a secretion or extract from the plant Feed composition characterized by containing.
[15] A method for raising animals, comprising feeding the animal with the feed composition according to [14].
[16] A plant, a part of a plant, or a plant cell in which a foreign phytase gene is expressed by the method according to any one of [1] to [9], or a secretion or extract from the plant cell A food characterized by containing.
本発明のコドン改変と細胞外分泌により外来フィターゼを植物で生産させる方法は、コドン改変により翻訳レベルの遺伝子発現効率を向上させる効果、および分泌シグナルの利用により細胞内で合成されたフィターゼを細胞外に効率良く分泌させる効果を組み合わせることにより、これまで不可能、又は低効率であった外来フィターゼ遺伝子の植物における発現又は当該フィターゼ酵素の生産を飛躍的に向上できるという利点がある。 The method of producing exogenous phytase in plants by codon modification and extracellular secretion according to the present invention has the effect of improving gene expression efficiency at the translation level by codon modification, and phytase synthesized intracellularly by using a secretion signal. By combining the effect of efficiently secreting, there is an advantage that the expression or production of the phytase enzyme of a foreign phytase gene, which has been impossible or low efficiency so far, can be dramatically improved.
外来フィターゼ遺伝子の導入対象とする宿主植物において塩基配列が解析されている2つ以上の遺伝子群又は特定の遺伝子から求められるコドンの使用頻度に近づくように、外来フィターゼ遺伝子の塩基配列を改変し、それに細胞外分泌シグナルに対応する塩基配列を連結したフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築する。当該フィターゼ遺伝子発現用構成物は、宿主植物での転写レベルでの遺伝子発現誘導に関与するプロモーター領域と遺伝子発現終結に関与するターミネーター領域を含む形で構成される。当該フィターゼ遺伝子発現用構成物を、一般的な広く知られている方法により植物細胞に導入することにより、外来フィターゼを高生産する形質転換植物の取得を実現した。 Modifying the base sequence of the foreign phytase gene so that it approaches the frequency of codon usage determined from two or more gene groups or specific genes whose base sequences have been analyzed in the host plant to which the foreign phytase gene is introduced, A phytase gene expression construct is constructed in which a base sequence corresponding to an extracellular secretion signal is linked thereto. The phytase gene expression component comprises a promoter region involved in gene expression induction at the transcription level in the host plant and a terminator region involved in gene expression termination. By introducing the phytase gene expression component into a plant cell by a general and widely known method, it was possible to obtain a transformed plant that highly produces a foreign phytase.
本発明においてフィターゼとは、フィチン酸を脱リン酸させるホスファターゼである。フィターゼは、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistryにより、フィチン酸の６位を最初に加水分解する６−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．２６．）とフィチン酸の３位を最初に加水分解する３−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．８．）の２つに分類されている。これらはいずれも本発明におけるフィターゼの定義に含まれる。本発明においてフィターゼ遺伝子とは、フィターゼおよびフィターゼを構成するサブユニットをコードするDNA領域全体およびその一部を含むDNA構成物を指し、生物由来のフィターゼ遺伝子のみではなく、人為的に塩基配列を改変した遺伝子も含まれる。 In the present invention, phytase is a phosphatase that dephosphorylates phytic acid. The phytase is hydrolyzed by 6-phytase (EC 3.1.3.26.) Which hydrolyzes the 6th position of phytic acid first and 3rd position of the phytic acid by the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. It is classified into two types of 3-phytase (EC 3.1.1.3.8). These are all included in the definition of phytase in the present invention. In the present invention, the phytase gene refers to a DNA construct comprising the entire DNA region coding for phytase and the subunit constituting phytase and a part thereof, and not only an organism-derived phytase gene but also artificially altering the base sequence Genes are also included.
本発明において使用コドンを改変するとは、アミノ酸配列を規定する情報を有する核酸塩基の配列上において、各アミノ酸に対応する３塩基連鎖であるコドン（codon、又は遺伝暗号、又はgenetic code、又は単にcodeとも言う）を改変することを意味する。基本的には、元来のアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを改変することを意味するが、本発明においては、目的とするタンパク質の基本的な特性が変わらない限り、アミノ酸配列の改変を伴う場合も含まれる。 The modification of the codon used in the present invention refers to a codon (codon, or genetic code, or genetic code, or simply code corresponding to each amino acid on a nucleobase sequence having information defining the amino acid sequence. (Also called). Basically, this means that only the base sequence is modified without changing the original amino acid sequence, but in the present invention, unless the basic characteristics of the target protein are changed, the amino acid sequence is modified. This includes cases that accompany it.
本発明において細胞とは具体的には、膜構造により外界と隔離され、内部に遺伝情報とその発現機構を有する生命の最小単位であり、単細胞では個体と同じだが、多細胞生物では組織の構成単位を意味する。細胞膜に包まれた細胞質には、遺伝情報を含む核（原核生物の場合には明瞭な構造はない）の他に、ATPを供給するミトコンドリア、分泌顆粒を形成するゴルジ体、分泌タンパク質の輸送を担う小胞体、光合成を担う葉緑体（植物細胞のみ）、液胞などの細胞内小器官の他、タンパク質合成を担うリボソーム、分泌顆粒、色素顆粒などが混在する。原核細胞および植物細胞では細胞膜の外側に細胞壁や細胞間隙があるが、本発明においては、細胞壁や細胞間隙を細胞の一部と定義する。 In the present invention, specifically, a cell is a minimum unit of life that is isolated from the outside world by a membrane structure and has genetic information and its expression mechanism inside, and is the same as an individual in a single cell, but a tissue structure in a multicellular organism Means a unit. In addition to the nucleus containing genetic information (there is no clear structure in the case of prokaryotes), the cytoplasm wrapped in the cell membrane contains mitochondria that supply ATP, the Golgi apparatus that forms secretory granules, and the transport of secreted proteins. In addition to vesicles responsible for photosynthesis, chloroplasts responsible for photosynthesis (plant cells only), and organelles such as vacuoles, ribosomes responsible for protein synthesis, secretory granules, pigment granules, and the like are mixed. In prokaryotic cells and plant cells, there are cell walls and cell gaps outside the cell membrane. In the present invention, cell walls and cell gaps are defined as part of the cells.
本発明において局在させるとは、目的とするタンパク質を細胞膜、細胞質、特定の細胞内小器官あるいは細胞膜外に特異的に輸送して蓄積させることを意味する。 Localizing in the present invention means that the target protein is specifically transported and accumulated outside the cell membrane, cytoplasm, specific intracellular organelle, or outside the cell membrane.
本発明において外来フィターゼ遺伝子とは、宿主細胞が本来有していないフィターゼ遺伝子を指しており、そのような遺伝子は蛋白質をコードする領域とその上流に当該領域の発現を制御するプロモーター領域（遺伝子プロモーター）を少なくとも有し、更に所望によりその上流にトランジットペプチド配列や下流にターミネーター領域を有していてもよい。この場合、これらタンパク質をコードする領域以外のプロモーター領域およびターミネーター領域等は必ずしもその由来が蛋白質をコードする領域と同一である必要はなく、必要に応じて適宜選択可能である。このような外来性フィターゼ遺伝子の例としては実施例１に記載のイネのキチナーゼの細胞外分泌シグナルにシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼのｃＤＮＡを含むものがあげられる。 In the present invention, the exogenous phytase gene refers to a phytase gene that the host cell does not originally have, and such a gene includes a protein-coding region and a promoter region (gene promoter) that controls the expression of the region upstream of the region. ) And, if desired, a transit peptide sequence upstream and a terminator region downstream. In this case, the promoter region and terminator region other than the region encoding these proteins do not necessarily have the same origin as the region encoding the protein, and can be appropriately selected as necessary. Include those containing Schwanniomyces-oxy Den Tallis (Schwanniomyces occidentalis) of phytase from cDNA extracellular secretion signal chitinases of rice according to Example 1 Examples of such exogenous phytase gene.
本発明において植物以外の生物とは、クロロフィルによる同化作用、いわゆる光合成を行わない生物を意味し、具体的には、動物および菌類の一群を意味する。 In the present invention, organisms other than plants mean organisms that do not undergo anabolic action by chlorophyll, so-called photosynthesis, and specifically mean a group of animals and fungi.
本発明において微生物とは、微小で肉眼では観察できないような生物のことであり、具体的には、細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類、原生動物を意味する。 In the present invention, a microorganism is a living organism that is minute and cannot be observed with the naked eye, and specifically means bacteria, filamentous fungi, yeast, deformed fungi, unicellular algae, and protozoa.
本発明において酵母とは具体的に、、大部分の生活環を単細胞で経過する菌類を意味し、コウボ菌類の他に大部分の原生子嚢菌類と、不完全世代（無胞子型、偽酵母）を有するPhodosporidium、LeucosporidiumおよびSporobolomycesなどの原生担子菌類を含む。 In the present invention, yeast specifically refers to fungi that pass through most life cycles in a single cell, and in addition to yeast, most protozoan fungi and imperfect generations (a spore type, pseudoyeast) ) With protozoan basidiomycetes such as Phodosporidium, Leucosporidium and Sporobolomyces.
本発明においてシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼ遺伝子はどのように入手するのかといえば、該遺伝子が真核生物由来のため、イントロンが存在する可能性があることを考慮すれば、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリスIFO 1840のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターに組み込み作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから該サブユニットと特異的に反応する抗体をプローブとしてクローンを得ることができる。シュワニオミセスオキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、具体的には例えば特開平８−２８９７８２の配列表の配列番号：５に記載の塩基配列であり、少なくとも特開平８−２８９７８２の配列表の配列番号：３、配列番号：４のＤＮＡ塩基配列を含んでいる。 Speaking phytase gene from Schwanniomyces-oxy Den Tallis (Schwanniomyces occidentalis) in the present invention and how to obtain, because the gene is from a eukaryotic organism, considering that there is a possibility that introns are present For example, clones can be obtained from a cDNA expression library prepared by incorporating cDNA synthesized from mRNA of Schwanniomyces oxydentalis IFO 1840 into an expression vector of Escherichia coli using an antibody that specifically reacts with the subunit as a probe. it can. The gene encoding the phytase subunit derived from Schwanniomyces oxydentalis is specifically the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing of JP-A-8-289788, for example, and at least JP-A-8-289788. The DNA base sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing of FIG.
シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼはどのように入手するのかといえば、シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子を、宿主細胞中で複製可能なベクターに連結することにより組換えプラスミドを作製し、これを適当な微生物に形質転換することにより異種生物中で発現させることで入手できる。例えば、特開平１１−２０６３６８に記載の通り、キャンディダ・ボディニイ（Candida boidinii）のAOD1遺伝子のプロモーターの下流にフィターゼ遺伝子が結合したＤＮＡを有する組換えプラスミドをキャンディダ・ボディニイに形質転換し、０．３〜３．０ｇ／Ｌのリン酸またはリン酸化合物を含む液体培地中で、１０日以上培養することで当該キャンディダ・ボディニイの菌体外に当該フィターゼを分泌生産することができる。 The phytase from Schwanniomyces occidentalis is obtained by linking the phytase gene from Schwanniomyces occidentalis to a vector that can replicate in the host cell. It can be obtained by preparing a recombinant plasmid and expressing it in a heterologous organism by transforming it into an appropriate microorganism. For example, as described in JP-A-11-206368, a recombinant plasmid having a DNA having a phytase gene linked downstream of the promoter of the Candida boidinii AOD1 gene is transformed into Candida bodny. The phytase can be secreted and produced outside the cells of the Candida bodny by culturing for 10 days or more in a liquid medium containing 3 to 3.0 g / L of phosphoric acid or a phosphoric acid compound.
本発明において細胞外分泌シグナルとは、タンパク質が細胞外に分泌される際に機能するペプチド鎖である。具体的には、リボソームにより細胞質で合成されたばかりの分泌タンパク質の前駆体に含まれるペプチド鎖であり、当該ペプチド鎖により当該前駆体タンパク質は小胞体内に導入され、グリコシル化などの修飾を受け、最終的には分泌小胞により成熟タンパク質となって細胞外に分泌される。本発明において細胞外分泌シグナルは、タンパク質を細胞外に分泌する際に機能するペプチド鎖ばかりではなく、当該ペプチド鎖に対応するアミノ酸配列およびＤＮＡの塩基配列をも意味する。 In the present invention, an extracellular secretion signal is a peptide chain that functions when a protein is secreted outside the cell. Specifically, it is a peptide chain contained in a precursor of a secreted protein that has just been synthesized in the cytoplasm by ribosome, and the precursor protein is introduced into the endoplasmic reticulum by the peptide chain, and is subjected to modifications such as glycosylation, Ultimately, it becomes a mature protein by secretory vesicles and is secreted outside the cell. In the present invention, an extracellular secretion signal means not only a peptide chain that functions when a protein is secreted outside the cell, but also an amino acid sequence and a DNA base sequence corresponding to the peptide chain.
本発明においてイネのキチナーゼは公知であり、その遺伝子配列も既に知られている（Y. NishizawaらMol.Gen.Genet, vol.241, pp.1-10, 1993）。Y. Nishizawaらが単離・解析した３種のイネキチナーゼ遺伝子のうち、Cht-3が細胞外分泌シグナルを含むことが知られている（A.Sharmaら、FEBS Letters, vol.484, pp.7-11, 2000）。 In the present invention, rice chitinase is known, and its gene sequence is already known (Y. Nishizawa et al., Mol. Gen. Genet, vol. 241, pp. 1-10, 1993). Of the three rice chitinase genes isolated and analyzed by Y. Nishizawa et al., Cht-3 is known to contain an extracellular secretion signal (A. Sharma et al., FEBS Letters, vol. 484, pp. 7 -11, 2000).
フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンの集団のうち、一個以上のコドンについて当該使用頻度を低下させるとは具体的には以下のような方法が例示される。シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子をイネで発現させる場合には、まず、シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子のコドン使用頻度（codon usageとも言う）とイネの塩基配列が決定された遺伝子群から求められるコドン使用頻度を比較する。なお、イネのコドン使用頻度は、例えば、GeneBankのCodon Usage Database（http://kazusa.or.jp/codon/）から調べることができる。特定のアミノ酸に対する各コドンの使用頻度を上記の２者間で比較し、イネよりも当該フィターゼ遺伝子において使用頻度が高いコドンについては、イネでの使用頻度が高いコドンに改変する。例えば、ロイシン（Leu）に対応する６つのコドンの使用頻度の合計を１００％とした場合、TTAのコドン（TTA-Leu）の使用頻度は当該フィターゼ遺伝子において約５４％であるが、イネでは約６％で約９倍の差がある。そこで、当該フィターゼ遺伝子のTTAのコドンの使用頻度を下げ、イネでの使用頻度が高いCTC-LeuやCTG-Leuなどを使用するようにデザインする。このようにすべてのアミノ酸に対するコドンについて同様にデザインすることにより、イネよりも当該フィターゼ遺伝子において使用頻度が高いコドン全般について、コドン使用頻度を低下させることができる。
特にコドン改変の対象となるのは、目的とするフィターゼにおける使用頻度の方が宿主とする植物種における使用頻度よりも顕著に高い場合であって、宿主とする植物種と同等の場合又は低い場合には改変の対象とする必要はない。また、あるコドンの改変の結果として、別のコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における使用頻度よりも高く場合があっても、特定のアミノ酸における各コドンの使用頻度が宿主とする植物種における使用頻度に全般的に近づいていれば問題にはならない。例えば前記のシュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子をイネで発現させる場合において、TTA-Leuの使用頻度を下げることにより、CTC-LeuやCTG-Leuの使用頻度がイネにおける使用頻度よりも高くなる場合でも、その割合が大きくなければ、例えば２倍以下であれば、約９倍のTTA-Leuの使用頻度を同等レベル（約１倍）に改変する効果を打ち消すものではない。
Among the codon population in which the frequency of use of codons in the phytase gene is higher than the frequency of use in the plant species serving as the host, specifically reducing the frequency of use of one or more codons includes the following method: Illustrated. When expressing the phytase gene derived from Schwanniomyces oxydentalis in rice, first determine the codon usage (also referred to as codon usage) of the phytase gene derived from Schwanniomyces oxydentalis and the base sequence of rice The codon usage frequency obtained from the obtained gene group is compared. In addition, the codon usage frequency of rice can be investigated from, for example, Codon Usage Database (http://kazusa.or.jp/codon/) of GeneBank. The frequency of use of each codon for a specific amino acid is compared between the above two, and a codon that is used more frequently in the phytase gene than rice is modified to a codon that is used more frequently in rice. For example, when the total frequency of use of six codons corresponding to leucine (Leu) is 100%, the frequency of use of the TTA codon (TTA-Leu) is about 54% in the phytase gene, but in rice about There is a difference of about 9 times at 6%. Therefore, the frequency of use of the TTA codon of the phytase gene is lowered, and CTC-Leu, CTG-Leu, etc. that are frequently used in rice are used. Thus, by designing similarly about the codon with respect to all the amino acids, the codon usage frequency can be lowered | hung about the whole codon which is frequently used in the said phytase gene rather than rice.
In particular, the target of codon modification is when the frequency of use in the target phytase is significantly higher than the frequency of use in the plant species used as the host, and when the frequency is equivalent to or lower than the plant species used as the host Does not need to be modified. In addition, as a result of modification of a certain codon, even if the frequency of use of another codon may be higher than the frequency of use in a plant species as a host, the frequency of use of each codon in a specific amino acid as a host plant species If it is generally close to the frequency of use, there is no problem. For example, when the phytase gene derived from Schwaniomyces oxydentalis is expressed in rice, the usage frequency of CTC-Leu or CTG-Leu is less than the usage frequency in rice by lowering the usage frequency of TTA-Leu. Even if it becomes high, if the ratio is not large, for example, if it is 2 times or less, the effect of modifying the usage frequency of TTA-Leu of about 9 times to the same level (about 1 time) is not negated.
デザインした塩基配列を有するDNAは人為的に合成することができるが、長いＤＮＡの場合には、いくつかの断片に分けてあらかじめ合成し、最終的にそれらを結合して合成することができる。 A DNA having a designed base sequence can be artificially synthesized, but in the case of a long DNA, it can be synthesized in advance by dividing it into several fragments, and finally they can be combined.
本発明においてフィターゼのコドンの改変がアミノ酸の改変を伴わないとは、特定のアミノ酸に対応するコドンがいくつかある場合に、あるコドンから同じアミノ酸に対応する別のコドンに変えることを意味する。例えば、ロイシンに対応するコドンTTAを同じロイシンに対応するコドンであるTTG又はCTT又はCTC又はCTA又はCTGに改変することを意味する。こうしてフィターゼのアミノ酸配列に含まれるすべてのアミノ酸について同様のコドンの改変を行うことより、フィターゼのコドンの改変はアミノ酸の改変を伴わないことになる。 In the present invention, the modification of a phytase codon does not involve an amino acid modification means that when there are several codons corresponding to a specific amino acid, the codon is changed from one codon to another corresponding to the same amino acid. For example, it means that the codon TTA corresponding to leucine is changed to TTG or CTT or CTC or CTA or CTG which are codons corresponding to the same leucine. Thus, by performing the same codon modification for all amino acids contained in the amino acid sequence of phytase, the modification of the phytase codon does not involve any amino acid modification.
本発明において使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結する方法としては以下のような方法が例示できる。使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子のＮ末側のＤＮＡ領域を含み、その上流に特定の制限酵素（仮に制限酵素Ｂとする）の認識部位を付加した正方向のオリゴヌクレオチドを合成する。また、当該フィターゼ遺伝子のＣ末側のＤＮＡ領域を含み、その下流にＢとは異なる制限酵素（仮に制限酵素Ｃとする）の認識部位を付加した逆方向のオリゴヌクレオチドを合成する。上記2種のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、当該フィターゼ遺伝子の５´上流および３´下流側にそれぞれＢおよびＣという制限酵素認識部位を有するＤＮＡ断片を合成する。細胞外分泌シグナルについても同様に行い、当該分泌シグナルの５´上流および３´下流側にようにそれぞれＡおよびＢという制限酵素認識部位を有するＤＮＡ断片を合成する。上記の２つのＤＮＡ断片を一般的なクローニング技術により、汎用的なプラスミド上に、（Ａ）-（細胞外分泌シグナル）-（Ｂ）-（使用コドンを改変した遺伝子）-（Ｃ）（括弧内は制限酵素認識部位を示す）の順に連結することができる。 In the present invention, examples of the method for linking the base sequence of the extracellular secretion signal to the phytase gene with a modified codon used include the following methods. A forward oligonucleotide containing a DNA region on the N-terminal side of the phytase gene with a modified codon used and having a recognition site for a specific restriction enzyme (assumed to be restriction enzyme B) added upstream is synthesized. In addition, a reverse oligonucleotide is synthesized which contains a DNA region on the C-terminal side of the phytase gene and has a recognition site for a restriction enzyme different from B (restricted to be restriction enzyme C) downstream thereof. PCR using the above two types of oligonucleotides as PCR primers and a phytase gene with a modified codon used as a template, and having restriction enzyme recognition sites B and C on the 5 ′ upstream side and 3 ′ downstream side of the phytase gene, respectively Synthesize the fragments. The same procedure is performed for the extracellular secretion signal, and DNA fragments having restriction enzyme recognition sites A and B are synthesized on the 5 ′ upstream side and 3 ′ downstream side of the secretion signal, respectively. Using the general cloning technique, the above two DNA fragments are placed on a general-purpose plasmid by (A)-(extracellular secretion signal)-(B)-(gene with modified codon used)-(C) (in parentheses) Represents a restriction enzyme recognition site).
上記に代わる連結方法として、まず、（Ａ）-（細胞外分泌シグナルの全ＤＮＡ領域）-（使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子のＮ末側のＤＮＡ領域）を含むの正方向の長鎖のオリゴヌクレオチドと、（当該フィターゼ遺伝子のＣ末側の塩基配列）-（Ｂ）を含む逆方向のオリゴヌクレオチドを合成する。これらをＰＣＲプライマーとし、使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、（Ａ）-（細胞外分泌シグナル）-（使用コドンを改変した遺伝子）-（Ｂ）（括弧内は制限酵素認識部位を示す）の順に連結したＤＮＡ断片が合成できる。このＤＮＡ断片は汎用的なプラスミド上に容易にクローニングすることができる。 As a ligation method alternative to the above, first, a long-chain oligonucleotide in the forward direction containing (A)-(total DNA region of extracellular secretion signal)-(DNA region on the N-terminal side of the phytase gene with a modified codon used) Then, a reverse oligonucleotide containing (base sequence on the C-terminal side of the phytase gene)-(B) is synthesized. PCR was performed using these as PCR primers and a phytase gene with a modified codon used as a template, and (A)-(extracellular secretion signal)-(gene with modified codon used)-(B) (restricted enzyme recognition site in parentheses) DNA fragments linked in this order) can be synthesized. This DNA fragment can be easily cloned on a general-purpose plasmid.
さらに本発明は、本発明による使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結することを特徴とするフィターゼ遺伝子発現用構成物を形質転換して得られる植物を提供する。加えて本発明は、本明細書の方法の結果としてフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する細胞も提供する。 Furthermore, the present invention provides a plant obtained by transforming a phytase gene expression composition characterized in that the base sequence of an extracellular secretion signal is linked to a phytase gene having a modified codon used according to the present invention. In addition, the present invention also provides cells having a phytase gene expression construct as a result of the methods herein.
本発明においてフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する形質転換された植物としては具体的には双子葉植物種、例えばルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ルーピン、ダイズ、綿花、セイヨウアブラナ、カリフラワー、ナタネ、ダイコン、ヒマワリ、ニンジン、アカクローバ、シロクローバ、タバコ、ゴマ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバもしくはビート、又は単子葉植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、エンバク、アワ、ヒエ、ソルガム、サトウキビ、トウモロコシ、イタリアンライグラス、オーチャードグラス、チモシー、寒地型牧草もしくは暖地型牧草でありうる。特に関心があるのは、潜在的な食物又は飼料成分になりうる植物、又は物質生産性の高い植物である。植物の状態としては、生のもの、サイレージ化したもの、乾燥したもの、粉砕したもの、加工処理したもの、飼料調製したものが本発明の請求の範囲に含まれる。 In the present invention, the transformed plant having a phytase gene expression component is specifically a dicotyledonous plant species such as lupine, pea, broad bean, kidney bean, alfalfa, lupine, soybean, cotton, rape, cauliflower, Rapeseed, radish, sunflower, carrot, red clover, white clover, tobacco, sesame, sugar beet, potato, sweet potato, cassava or beet, or monocotyledonous species such as wheat, barley, rye, rice, oat, millet, millet, sorghum, sugar cane Corn, Italian ryegrass, orchardgrass, timothy, cold grass or warm grass. Of particular interest are plants that can be potential food or feed ingredients, or plants that are highly productive. The state of the plant includes raw, silaged, dried, pulverized, processed, and prepared feed within the scope of the claims of the present invention.
植物を形質転換する方法としては、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換法、プロトプラストへの直接導入法（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれるが、熟練した読者には公知であり、ここでは詳細な説明は省略する。一旦、植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性の発現系で測定され得て、あるいは植物ゲノム内への安定に組み込まれるため、選別ののち、決定されうる。技術としては、植物組織のインビトロ培養、そして多くの場合に、植物体への再分化が知られている。導入された遺伝子を、もともと形質転換された植物から商業的に有用な培養物に転移する技術は、当業者には知られている。 As a method for transforming a plant, a plant cell transformation method using T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transforming factor, protoplast transformation The direct introduction method (injection method, electroporation method, etc.), particle gun method, and other possibilities are included, but they are known to skilled readers and will not be described in detail here. Once introduced into plant tissue, the expression of structural genes can be measured in a transient expression system or can be determined after selection because it is stably integrated into the plant genome. As techniques, in vitro culture of plant tissue and in many cases, regeneration into a plant body is known. Techniques for transferring an introduced gene from an originally transformed plant to a commercially useful culture are known to those skilled in the art.
本発明の範囲には外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞が包含される。植物の一部とは、たとえば葉、茎、根、花器、種子、さやの一部であり、これらの未発達又は未熟な組織、器官ばかりでなく、老化又は乾燥又は枯死した組織や器官の一部が含まれる。また、飼料用に調製処理された上記の組織や器官も含まれる。植物細胞とは、植物の個々の細胞であるが、プロトプラストや細胞膜の外側にある細胞壁や細胞間隙も本発明の定義に含まれる。また、各種培養細胞、未分化細胞やその集合体やカルス等も含まれる。 The scope of the present invention includes plants, plant parts, or plant cells in which a foreign phytase gene is expressed. Plant parts include, for example, leaves, stems, roots, flower organs, seeds, and parts of pods, and not only these undeveloped or immature tissues and organs, but also aging or dried or withered tissues and organs. Part is included. In addition, the above tissues and organs prepared for feed are also included. Plant cells are individual cells of a plant, but cell walls and cell gaps outside the protoplast and cell membrane are also included in the definition of the present invention. Also included are various cultured cells, undifferentiated cells, aggregates thereof, and callus.
本発明において飼料とは、天然物又は人工物に関わらず、動物が食べ、摂取し、消化することを意図した食料、食事である。飼料構成物とは、例えば飼料に混入された原材料、加工された物質、又は添加物等であって、飼料を構成する成分を意味する。 In the present invention, a feed is a food or a meal that an animal intends to eat, ingest, or digest regardless of whether it is a natural product or an artificial product. The feed composition means, for example, a raw material mixed in the feed, a processed substance, an additive, or the like, which constitutes the feed.
本発明において飼料構成物を動物に与えるとは、動物の飼育、健康の維持又は増進、又は動物から得られる製品の栄養価の向上や物性の改変、又は動物由来の***物の量や質の制御等を意図して動物に飼料構成物を食べさせること、又は摂取させることを意味する。動物とは、すべての動物であり、例えば豚、トリ、ヒト、魚である。特に好ましいのは単胃動物の豚および鶏（ブロイラー）である。飼育方法とは、動物の肉、卵、生乳、それらの乳製品、加工品、発酵品等の食品を得ること、又は動物の骨、肉、脂、臓器、体毛、角質、皮等から得られる製品を得ることを主な目的として、管理された環境条件下および食餌・食事制御下において動物を飼う方法を意味する。 In the present invention, feeding a feed composition to an animal means raising the animal, maintaining or promoting health, improving the nutritional value of a product obtained from the animal, modifying physical properties, or the amount or quality of animal-derived excreta. It means feeding or ingesting the feed composition to animals for the purpose of control or the like. Animals are all animals, such as pigs, birds, humans, and fish. Particularly preferred are monogastric pigs and chickens (broilers). The breeding method is to obtain food such as animal meat, eggs, raw milk, dairy products, processed products, fermented products, etc., or obtained from animal bones, meat, fat, organs, body hair, keratin, skin, etc. It means a method of keeping animals under controlled environmental conditions and diet / meal control, with the main purpose of obtaining products.
本発明において外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物細胞からの分泌物又は抽出物を含む食品とは、成分として含まれるフィターゼがフィチン酸をミオイノシトールとリン酸に分解する作用を見込んで作られる食品であり、具体的には、抗栄養剤として働くフィチン酸の量の低下、又は動物におけるリン酸吸収効率の改善、又は動物の***物に含まれるリン酸量の低下、又は鳥類や哺乳類にとっての必須栄養源であるミオイノシトール量の増加等の効果を意図して作られる食品であって、外来フィターゼを生産する生食用の植物、又は成分としてフィターゼを含む外来フィターゼ遺伝子が発現する植物からの分泌物又は抽出物が添加された加工食品、医薬品、医薬部外品、健康食品を意味する。 In the present invention, a food containing a plant, a part of a plant, or a plant cell in which an exogenous phytase gene is expressed, or containing a secretion or extract from the plant cell means that phytase contained as a component converts phytic acid to myo-inositol. It is a food made in anticipation of the action of breaking down into phosphoric acid. Specifically, it is included in the reduction of the amount of phytic acid acting as an antinutritional agent, the improvement of phosphate absorption efficiency in animals, or the excrement of animals As a raw food plant or ingredient that produces exogenous phytase, it is intended to reduce the amount of phosphate produced or increase the amount of myo-inositol, which is an essential nutrient source for birds and mammals. Means processed foods, pharmaceuticals, quasi-drugs, and health foods to which plant secretions or extracts expressing foreign phytase genes including phytase are added .
以下本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、ＤＮＡの切断、連結、クローニング、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付された説明者や、実験書（例えば、「Molecular Cloning (Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)」に従った。また、イネに関する形質転換法、栽培法、分子生物学的な解析法等については、特に記載のない限り、実験書（例えば、「モデル植物の実験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ編」細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、1996）に基本的に従った。 The present invention will be described in more detail below, but the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise stated, methods necessary for gene recombination, such as DNA cleavage, ligation, cloning, E. coli transformation, and gene sequencing, can be applied to commercially available reagents and machinery used in each operation. Followed the attached explainers and experiments (for example, “Molecular Cloning (Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)”. Also, transformation method, cultivation method, molecular biological analysis of rice Unless otherwise specified, methods (such as “Experimental protocol for model plants, edited by rice Arabidopsis thaliana”, separate volume of cell engineering, plant cell engineering series 4, supervised by Isao Shimamoto, Kiyotaka Okada, Shujunsha, 1996) ) Basically followed.
コード領域としてシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡ又はコドン改変型ｃＤＮＡに、イネキチナーゼの細胞外分泌シグナルを連結した、又は連結しないフィターゼ遺伝子発現用構成物をイネで発現させた例
（１）フィターゼ遺伝子発現用構成物の構築
シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡは以前に望月らにより単離され、ヌクレオチド配列が決定されたもの（特開平８-２８９７８２、以下、Oriと略す）を用いた。また、アミノ酸配列は変えずに、当該フィターゼにおける使用コドンを宿主とするイネにおけるコドンの使用頻度よりも顕著に高いコドンがないようにデザインしたＤＮＡ（配列番号：１）を全合成した（以下、Modと略す）。図１は、特定のアミノ酸に対応する各コドンの使用頻度の合計を１００％とした場合のコドン毎の使用頻度をOri、Mod及びイネについて算出し、Ori又はModの各コドンの使用頻度を対応するイネの各コドンの使用頻度で除した値を示す。Oriでは、イネではあまり使われないコドンを使用する傾向がみられ、コドン：TTA-Leu（ロイシン）においてはイネの使用頻度の約９倍である。一方、コドン改変後のModにおいては、すべてのコドンにおいてその比率は２倍以下となっており、イネにおけるコドン使用頻度に近づいていることがわかる。
A phytase gene expression construct in which an extracellular secretion signal of rice chitinase is linked or not linked to rice phytase cDNA or codon-modified cDNA of Schwanniomyces occidentalis as a coding region is expressed in rice. Example (1) Construction of phytase gene expression construct The Schwanniomyces occidentalis phytase cDNA was previously isolated by Mochizuki et al. And its nucleotide sequence was determined (Japanese Patent Laid-Open No. 8-289787). Hereafter referred to as Ori). In addition, the DNA (SEQ ID NO: 1) designed so that there was no codon significantly higher than the codon usage frequency in rice using the codon used in the phytase as a host without changing the amino acid sequence was synthesized in total (hereinafter, Abbreviated Mod). Figure 1 shows the frequency of use of each codon corresponding to a specific amino acid as 100%, and calculates the frequency of use of each codon for Ori, Mod, and rice, and corresponds the frequency of use of each codon of Ori or Mod. It shows the value divided by the usage frequency of each codon in rice. In Ori, there is a tendency to use codons that are rarely used in rice, and the codon: TTA-Leu (leucine) is about nine times the frequency of rice use. On the other hand, in the Mod after codon modification, the ratio is less than twice for all codons, indicating that the frequency of codon usage in rice is approaching.
改変型のフィターゼ遺伝子上記のコドン改変前、又は改変後のフィターゼＤＮＡに、イネキチナーゼの細胞外分泌シグナルのDNA領域を連結したＤＮＡ構成物（以下、それぞれTp-Ori、Tp-Modと略す）を構築するためにするために以下のＰＣＲプライマーを設計した。上流側のプライマーとして、すでに報告されているCht-3の分泌シグナルに対応するＤＮＡ配列（Y. Nishizawaら、Mol. Gen. Genet., vol. 241, pp. 1-10, 1993）とその５’側にXbaI認識部位を含むＤＮＡ配列、その３’側にTp-Ori又はTp-Modの開始コドンを含むＮ末側のＤＮＡ配列を付加した正方向のオリゴヌクレオチド（Tp-Ori用の配列番号：２、Tp-Mod用の配列番号：３）を合成した。下流側のプライマーとして、当該フィターゼの終始コドンを含むＣ末側のＤＮＡ配列及びその３’側にSacI認識部位を含むＤＮＡ配列を付加した逆方向のオリゴヌクレオチド（配列番号：４）を合成した。配列番号：２と配列番号：４のＰＣＲプライマーを用い、シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡクローンであるｐＨＹ３６を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ増幅断片をXbaIとSacIで同時に切断してプラスミドベクターであるpBluescript SK-にクローニングした。こうして得られたクローンをさらにSmaIとSacIで同時に切断して得られたＤＮＡ断片、およびイネのクロロフィルa/b結合タンパク質（以下、Cabと略す）のプロモーター領域（Y. Tadaら、EMBO J, vol.10, pp.1803-1808, 1991）を含むHindIII-SmaI断片を、あらかじめHindIIIとSacIで同時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクターpBI-HIにクローニングして、Tp-Oriのフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築した。一方、上記の配列番号：３と配列番号：４のＰＣＲプライマーを用い、配列番号：１のＤＮＡクローンを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ増幅断片をXbaIとSacIで同時に切断してプラスミドベクターであるpBluescript SK-にクローニングした。こうして得られたクローンをさらにSmaIとSacIで同時に切断して得られたＤＮＡ断片、およびイネのCabプロモーターを含むHindIII-SmaI断片を、あらかじめHindIIIとSacIで同時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクターpBI-HIにクローニングして、Tp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築した。図２にTp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。 Modified phytase gene Construction of DNA constructs (hereinafter abbreviated as Tp-Ori and Tp-Mod, respectively) in which the DNA region of the extracellular secretion signal of rice chitinase is linked to the phytase DNA before or after the above codon modification In order to do so, the following PCR primers were designed. As an upstream primer, a DNA sequence corresponding to the previously reported secretion signal of Cht-3 (Y. Nishizawa et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 241, pp. 1-10, 1993) and 5 A DNA sequence containing the XbaI recognition site on the 'side, and a forward oligonucleotide with an N-terminal DNA sequence containing the start codon of Tp-Ori or Tp-Mod on the 3' side (SEQ ID NO for Tp-Ori) : 2, SEQ ID NO: 3) for Tp-Mod was synthesized. As a downstream primer, a C-terminal DNA sequence containing the phytase stop codon and a reverse oligonucleotide (SEQ ID NO: 4) added with a DNA sequence containing a SacI recognition site on the 3 'side thereof were synthesized. PCR was performed using the PCR primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 using pHY36, which is a cDNA clone of Schwanniomyces occidentalis phytase, as a template. It was simultaneously cut with SacI and cloned into the plasmid vector pBluescript SK-. A DNA fragment obtained by simultaneously cleaving the thus obtained clone with SmaI and SacI, and a promoter region of rice chlorophyll a / b binding protein (hereinafter abbreviated as Cab) (Y. Tada et al., EMBO J, vol. .10, pp.1803-1808, 1991) was cloned into the binary vector pBI-HI from which the GUS gene was removed by cutting with HindIII and SacI at the same time to express the phytase gene of Tp-Ori. Constructs for use. On the other hand, using the PCR primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 above, PCR was performed using the DNA clone of SEQ ID NO: 1 as a template, and the resulting DNA amplified fragment was simultaneously cleaved with XbaI and SacI to obtain a plasmid vector. And cloned into pBluescript SK-. A binary vector obtained by further simultaneously cleaving the clone obtained in this way with SmaI and SacI and a HindIII-SmaI fragment containing the rice Cab promoter simultaneously with HindIII and SacI to remove the GUS gene. A construct for expression of the phytase gene of Tp-Mod was constructed by cloning into pBI-HI. FIG. 2 shows a phytase gene expression component of Tp-Mod.
（２）形質転換イネの取得
上記（１）で得られたフィターゼ遺伝子発現用構成物はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介した方法により、ジャポニカ品種であるキヌヒカリの種子由来カルスに用いて形質転換を行った。形質転換イネは閉鎖系のグロースチャンバーを用いて、２４℃、湿度６０％、１４時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ2／ｓｅｃ）の条件で育成した。
(2) Acquisition of transformed rice The phytase gene expression composition obtained in (1) above is used for callus derived from seeds of the japonica cultivar Kinuhikari by a method using Agrobacterium tumefaciens. Transformation was performed. The transformed rice was grown in a closed growth chamber under the conditions of 24 ° C., humidity 60%, and 14-hour day length (700 μmol / m 2 / sec).
（３） 形質転換イネの粗酵素液抽出
作出された形質転換イネ当代について、フィターゼ活性を測定するための粗酵素液の抽出を行った。粗酵素液はいずれも緑葉を液体窒素で凍結させ、乳鉢内で破砕、融解した後適量の抽出バッファー（０．１M 酢酸ナトリウム pH５、10mM CaCl2、 1mM DTT）に懸濁し、１２０００rpmで２０分遠心分離した上清を回収することで調製した。
(3) Extraction of Crude Enzyme Solution from Transformed Rice About the produced transformed rice generation, a crude enzyme solution was extracted for measuring phytase activity. In each crude enzyme solution, green leaves were frozen in liquid nitrogen, crushed and thawed in a mortar, then suspended in an appropriate amount of extraction buffer (0.1 M
（４） 形質転換イネのフィターゼ活性
フィターゼ活性の測定はフィチン酸ナトリウムを基質としてフィターゼの反応によって生じる遊離リン酸を定量することにより行った。０．１ｍｌの反応バッファー（４０ mM酢酸ナトリウム溶液（pH５．５）、１mMフィチン酸ナトリウム）中で、３７℃で６０分反応させた後、０．２ｍｌの５mM硫酸を添加することにより反応を停止した。０．１６mlの反応停止後の溶液に、１．５８５mMマラカイトグリーン／２０％(v/v)硫酸、７．５％(w/v)モリブデン酸アンモニウム、１１％(v/v)Tween20をそれぞれ１００：２５：２(v/v)の割合で混合することにより調整したリン酸検出液を４０μｌ加え、混合して３０分静置した後、６５５nmの吸光度測定によりリン酸量を定量した。標準曲線としては、０、５、１０、２０、４０μMのリン酸カリウム溶液を使用した。なお、植物抽出した粗酵素液には内生の遊離リン酸が含まれているので、６０分反応後の反応液に含まれるリン酸量から反応０分の反応液に含まれるリン酸量を差し引いた値をフィターゼの反応による遊離リン酸量とした。（１）で述べたフィターゼ遺伝子発現用構成物を導入したイネ以外に非形質転換イネについても酵素活性を測定した。なお、フィターゼ活性の１単位（１ユニット）は、３７℃、ｐＨ５．５において、フィチン酸から一分間あたりに１マイクロモル（μmol）のリン酸を生産する能力と定義した。
(4) Phytase activity of transformed rice The phytase activity was measured by quantifying the free phosphate produced by the phytase reaction using sodium phytate as a substrate. After reacting in 0.1 ml of reaction buffer (40 mM sodium acetate solution (pH 5.5), 1 mM sodium phytate) at 37 ° C. for 60 minutes, the reaction was stopped by adding 0.2 ml of 5 mM sulfuric acid. did. To 0.16 ml of the solution after stopping the reaction, 100% each of 1.585 mM malachite green / 20% (v / v) sulfuric acid, 7.5% (w / v) ammonium molybdate, and 11% (v / v)
フィターゼ遺伝子発現用構成物を含まない非形質転換体の平均のフィターゼ活性を１とした場合の、形質転換イネの各系統の相対活性をそれぞれ図１にまとめた。その結果、コドン改変せずに細胞外分泌シグナルを付加したTp-Oriやコドンを改変して細胞外分泌シグナルを付加しなかったModを導入したイネでは、非形質転換イネと同等の低い活性レベルしか示さなかったが、コドンを改変し、かつ、細胞外分泌シグナルを付加したTp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を導入した系統においては顕著な活性上昇が認められ、その最大相対活性は１１０倍であった。実施例１の結果から、コドン改変と細胞外分泌シグナルを組合せて利用することにより、植物における外来フィターゼの高生産が可能になることが示された。 The relative activities of each line of transformed rice when the average phytase activity of non-transformants not containing the phytase gene expression component is 1 are summarized in FIG. As a result, rice with Tp-Ori with an extracellular secretion signal added without codon modification and Mod with a modified codon with no extracellular secretion signal showed only a low activity level equivalent to that of non-transformed rice. However, a marked increase in activity was observed in the strains into which the codon-modified and extracellular secretion signal added Tp-Mod phytase gene expression construct was introduced, and the maximum relative activity was 110-fold. It was. From the results of Example 1, it was shown that high production of exogenous phytase in plants becomes possible by using a combination of codon modification and extracellular secretion signal.
任意のフィターゼについて、当該遺伝子のコドン改変と細胞外分泌シグナルの使用を組み合わせて宿主とする植物に導入することにより、当該植物における当該フィターゼの高生産が可能となる。フィターゼを高生産する植物はそれ自身、あるいは当該植物の抽出液又は分泌液を飼料に添加することにより、動物における栄養性向上ばかりではなく、環境富栄養化の原因となる未分解リン酸の動物からの排出軽減等に適用できる。 By introducing any phytase into a host plant in combination with codon modification of the gene and use of an extracellular secretion signal, high production of the phytase in the plant becomes possible. Plants that produce high phytase, or by adding the extract or secretion of the plant to the feed, not only improve nutrition in animals, but also animals with undegraded phosphate that cause environmental eutrophication It can be applied to reduce emissions from the city.
P-Cab：イネのCabプロモーターの領域を示す。 P-Cab: Rice Cab promoter region.
Cht3-Tp：イネのキチナーゼの細胞外分泌シグナルの領域を示す。 Cht3-Tp: The region of extracellular secretion signal of rice chitinase.
Phytase：Ori又はModのフィターゼ遺伝子のコード領域を示す。 Phytase: indicates the coding region of Ori or Mod phytase gene.
T-nos：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノバリンシンターゼのターミネーター領域を示す。 T-nos: A terminator region of Novaline synthase of Agrobacterium tumefaciens.
Tp-Ori： Schwanniomyces occidentalis由来フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼ遺伝子の細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加して構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。 Tp-Ori: A composition for expressing a phytase gene constructed by adding a DNA region of an extracellular secretion signal of a rice-derived chitinase gene to a Schwanniomyces occidentalis-derived phytase gene.
Tp-Mod： 配列表１に示すコドン改変型フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加して構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
Tp-Mod: A phytase gene expression construct constructed by adding a DNA region of an extracellular secretion signal of rice-derived chitinase to the codon-modified phytase gene shown in
Ori： Schwanniomyces occidentalis由来フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加せずに構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。 Ori: A phytase gene expression construct constructed without adding the DNA region of the extracellular secretion signal of rice-derived chitinase to the Schwanniomyces occidentalis phytase gene.
Mod： 配列表１に示すコドン改変型フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加せずに構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
Mod: A phytase gene expression component constructed without adding the DNA region of the extracellular secretion signal of rice-derived chitinase to the codon-modified phytase gene shown in
Claims (16)
A plant, a part of a plant, or a plant cell in which a foreign phytase gene is expressed by the method according to any one of claims 1 to 9, or a secretion or extract from the plant cell. And food.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003378439A JP2005137293A (en) | 2003-11-07 | 2003-11-07 | Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003378439A JP2005137293A (en) | 2003-11-07 | 2003-11-07 | Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005137293A true JP2005137293A (en) | 2005-06-02 |
Family
ID=34688829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003378439A Pending JP2005137293A (en) | 2003-11-07 | 2003-11-07 | Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2005137293A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009532043A (en) * | 2006-04-04 | 2009-09-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | Phytase mutant |
-
2003
- 2003-11-07 JP JP2003378439A patent/JP2005137293A/en active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009532043A (en) * | 2006-04-04 | 2009-09-10 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | Phytase mutant |
| US8460656B2 (en) | 2006-04-04 | 2013-06-11 | Novozymes A/S | Phytase variants |
| US8877471B2 (en) | 2006-04-04 | 2014-11-04 | Novozymes A/S | Phytase variants |
| US9451783B2 (en) | 2006-04-04 | 2016-09-27 | Novozymes A/S | Phytase variants |
| US10041052B2 (en) | 2006-04-04 | 2018-08-07 | Novozymes A/S | Phytase variants |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100225087B1 (en) | The expression of phytase in plants | |
| ES2387203T3 (en) | Phytase variants | |
| AU765477B2 (en) | Phytase variants | |
| JPH06502296A (en) | Production of enzymes in seeds and their use | |
| EP1961293A2 (en) | Phytate polynucleotides and methods of use | |
| MXPA04006389A (en) | Thermotolerant phytase for animal feed. | |
| Hamada et al. | High‐level production of yeast (Schwanniomyces occidentalis) phytase in transgenic rice plants by a combination of signal sequence and codon modification of the phytase gene | |
| EP1604008B1 (en) | Using mutations to improve aspergillus phytases | |
| US6689358B2 (en) | Phytase variants | |
| CN107531766B (en) | Production of glucanases and methods of using the same | |
| CN101460612B (en) | Phytase variants | |
| Hood et al. | Industrial proteins produced from transgenic plants | |
| CN105671074B (en) | A kind of carrier improving plant methionine contents and its construction method and purposes | |
| JP2005137293A (en) | Method for producing extraneous phytase in plant through combination of codon modification with extracellular secretion | |
| Jube et al. | Recent advances in food biotechnology research | |
| CN101250551B (en) | Expression vector for improving soy protein content and quality as well as preparation and use thereof | |
| EP1164194A2 (en) | Protein production in transgenic plant seeds | |
| WO2002054885A1 (en) | Germinated seeds or sprouts in aquafeed compositions | |
| GRABAU | Phytase expression in transgenic plants | |
| MXPA05006761A (en) | Generation of plants with altered oil content. | |
| VERWOERD et al. | 6-3 Phytase Produced in Transgenic Plants for Use as a Novel Feed Additive | |
| JP3600614B6 (en) | Expression of phytase in plants | |
| US8114443B2 (en) | Phytase-expressing transgenic plants | |
| CA2309342A1 (en) | Protein production in transgenic plant seeds | |
| Hood et al. | College Station. TX 77845 USA |