JP2005132795A

JP2005132795A - 抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤

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Publication number: JP2005132795A
Application number: JP2003372659A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Inagawa; 裕之稲川; Chie Kawachi; 千恵河内; Genichiro Soma; 源一郎杣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-05-26
Also published as: US7485698B2; WO2005042008A1; EP1698346A1; EP1698346A4; US20070059279A1; CA2544372A1; CN1874783A

Abstract

【課題】新規な抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤を提供する。
【解決手段】抗悪性神経膠腫剤に、下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド又はこれらの混合物を含有する。
（ａ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、抗悪性神経膠腫作用を有するポリペプチド
【選択図】なし

Description

本発明は、抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤に関する。

腫瘍は、自律的な過剰増殖を示す細胞の集合であり、担腫瘍動物を死に至らしめる可能性がある悪性腫瘍（いわゆる癌）と、そうでない良性腫瘍とに区別されるが、例外も多く、厳格な区別は困難である（「岩波生物学辞典」第３版，４頁）。

現在における癌の治療方法の三本柱は、外科的治療法、薬物療法及び放射線療法であり、現実的には、更にこれらをレーザー療法等と組み合わせた集学的療法が広く行われている。治療に伴う苦痛や転移を考慮すると、薬物療法に対する期待が大きいのは当然であり、これに答えるべく数多くの抗癌剤が開発され、使用されているが、いずれも全種の癌に効くということはない。また、抗癌剤には、単独では充分な効果を発揮できないもの、強い副作用の故に長期使用ができないものが多く、多剤併用療法が一般的になっている。従って、新たな抗癌剤、特に、抗癌効果が高く、しかも簡便な方法で長期間使用可能な抗癌剤の開発に対する期待は大きい。

悪性腫瘍の中で、特に脳腫瘍に有効な抗癌剤は、現在に至っても見出されていない。脳腫瘍取扱い規約（平成１４年７月３１日発行，金原出版株式会社）によれば、脳腫瘍総症例数は１９６９年から１９９３年までに８万１千余例、粗罹患数は人口１０万人に対し、８〜１０くらいと考えられる。

原発脳腫瘍はその発生母地又は病理組織型により、神経膠腫（glioma）、髄膜腫（meningioma）など１０余に分類される。中でも発生頻度、悪性度ともに重大なのは神経膠腫であり、神経膠腫は、詳細な病理組織型により、膠芽腫（glioblastoma）、悪性星細胞腫（anaplastic astrocytoma）など７種類以上に分類される。原発脳腫瘍の悪性度については、病期（腫瘍の大きさ、遠隔転移の有無）に加えて、組織学的悪性度が用いられる。組織学的悪性度は、脳腫瘍取扱い規約（同上）によれば、Ｇ１からＧ４の４段階に分類され、それぞれＷＨＯ１からＷＨＯ４に対応する。数字が大きい程悪性度は高く、例えば、膠芽腫の悪性度はＧ４（ＷＨＯ４）、悪性星細胞腫の悪性度はＧ３（ＷＨＯ３）であり、Ｇ３、Ｇ４が悪性と分類される。従って、抗脳腫瘍剤が第一に標的とするべき原発脳腫瘍は、神経膠腫であり、中でも悪性度の高い膠芽腫又は悪性星細胞腫である。

神経膠腫は脳実質内に発生し浸潤性に増殖していく腫瘍であり、手術のみでは完治が困難である。中でも膠芽腫は、治療に最も抵抗性であり、５年生存率は８％前後ときわめて不良である。化学療法剤で明確に有効性が確認されたものは、アルキル化剤、テモゾロミドのみであるがこれも放射線療法との併用に留まっている。一方、術後の放射線照射が延命効果を示すことが認められている。

ＴＮＦ-αは特殊な使用法をとれば、脳腫瘍に対してある程度の抗腫瘍効果があることは、すでに報告されている。例えば、神経膠芽腫にＴＮＦ-αを局所注入した際に抗腫瘍効果が得られたこと（非特許文献１）、ＴＮＦ-αを動脈注入することである程度の抗腫瘍効果が得られること（非特許文献２）が報告されている。

しかしながら、ＴＮＦ-αを投与する場合、たとえ抗腫瘍効果が得られても、延命効果に結びつかないという問題点があり、事実、ＴＮＦ-αを投与した脳腫瘍患者に延命効果が得られた報告はない。また、ＴＮＦ-αを投与した神経膠芽腫ラットに延命効果は観察されていない。

一方、Ｘ−Ｘ'−(ＴＮＦの第４エクソン部分のアミノ酸配列)（但し、Ｘは１個の水素原子か、任意に種類、数を決定できるペプチドであり、Ｘ’はアミノ酸残基数が１〜３９個のペプチドであり、Ｘ及びＸ’を構成しているアミノ酸残基数に対する正味塩基性アミノ酸残基数の割合が１４．５％を超える）で表されるポリペプチドが抗腫瘍作用を有すること（特許文献１)、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが抗腫瘍作用を有すること（特許文献２)が知られているが、これらのポリペプチドが抗悪性神経膠腫作用を有することは知られていない。
ハヤシ（Hayashi S）等，「Clinical significance of the expression of nuclearfactor-kappa B, tumor necrosis factor receptor type I (TNFR 1), and c-myc in human malignant astrocytomas」，Neurol. Med. Chir.，２００１年，第４１巻，第１８７頁〜第１９５頁ハラダ（Harada K）等、「Antitumor effect of intra-arterial tumor necrosis factor-alpha in rats with transplanted intracerebral glioma and its evaluation by MRI」，脳神経外科，１９９５年，第２３巻，１０６９〜１０７４頁特許第２５４４１１４号公報特公平８−１７７１６号公報

本発明は、新規な抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、以下の抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤を提供する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド又はこれらの混合物を含有する抗悪性神経膠腫剤。
（ａ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、抗悪性神経膠腫作用を有するポリペプチド
（２）前記（ｂ）に示すポリペプチドが、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列のうち、１番目のアミノ酸から１８番目のアミノ酸までの部分において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである前記（１）記載の抗悪性神経膠腫剤。
（３）動物用抗悪性神経膠腫剤である前記（１）又は（２）記載の抗悪性神経膠腫剤。

本発明の抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤は、抗悪性神経膠腫作用を有するとともに、正常細胞への毒性がＴＮＦ-αと比較して低いので、悪性神経膠腫患者及び悪性神経膠腫動物に対する延命効果が高い。

本発明の抗悪性神経膠腫剤は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド又はこれらの混合物を含有する。
（ａ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下「ポリペプチド（ａ）」という場合がある。）
（ｂ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、抗悪性神経膠腫作用を有するポリペプチド（以下「ポリペプチド（ｂ）」という場合がある。）

配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において、１９番目のアミノ酸（Ａｌａ）からＣ末端のアミノ酸（Ｌｅｕ）までは、ヒト由来ＴＮＦ-αの第４エクソン部分のアミノ酸配列に相当する。すなわち、ヒト由来ＴＮＦ-αの第４エクソン部分をコードするＤＮＡ（配列番号３参照）の５’末端にグアニンを付加した場合に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。

配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、抗悪性神経膠腫作用が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個であり、欠失又は置換に関する具体的な範囲は、通常１〜１４個、好ましくは１〜２個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１〜４５個、好ましくは１〜３９個、さらに好ましくは１〜６個である。

配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加される位置は、抗悪性神経膠腫作用が保持される限り特に限定されるものではないが、１番目のアミノ酸残基（Ｍｅｔ）から１８番目のアミノ酸残基（Ｖａｌ）までの部分において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加され、１９番目のアミノ酸（Ａｌａ）からＣ末端のアミノ酸（Ｌｅｕ）までの部分においては１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されないことが好ましい。配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｎ末端は立体構造に寄与しないと考えられる一方、Ｃ末端は立体構造に寄与すると考えられるからである。

１番目のアミノ酸残基（Ｍｅｔ）から１８番目のアミノ酸残基（Ｖａｌ）までの部分において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、抗悪性神経膠腫作用が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個であり、欠失又は置換に関する具体的な範囲は、通常１〜１４個、好ましくは１〜２個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１〜４５個、好ましくは１〜３９個、さらに好ましくは１〜６個である。この場合、欠失、置換又は付加後の当該部分のアミノ酸配列は特に限定されるものではないが、当該部分における総アミノ酸残基数に対する正味塩基性アミノ酸残基数の割合が１４．５％を超えることが好ましい。当該部分における総アミノ酸残基数に対する正味塩基性アミノ酸残基数の割合が１４．５％を超えると、ＴＮＦが感受性を示す細胞（例えばＬ−９２９細胞）に対して抗腫瘍作用を示すことはもちろんのこと、ＴＮＦが全く感受性を示さない細胞（例えばＴ−２４細胞（Science, vol.230, p.943-945 (1985)））に対しても抗腫瘍作用を示すからである（特許第２５４４１１４号公報）。

ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）には、糖鎖が付加されたポリペプチド及び糖鎖が付加されていないポリペプチドのいずれもが含まれる。ポリペプチドに付加される糖鎖の種類、位置等は、ポリペプチドの製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたポリペプチドには、いずれの宿主細胞を用いて得られるポリペプチドも含まれる。また、ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）には、その医薬的に許容される塩も含まれ、その具体例としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。また、上記塩には、ポリペプチド又はアミノ酸と適当な有機酸又は無機酸との反応による無毒性酸付加塩も含まれる。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。

ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）は、それぞれのポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて常法に従って製造することができる。ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成することにより得ることができる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。また、ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡは、ＴＮＦ-αの第４エクソン部分をコードするＤＮＡに、部位特異的変異誘発法等によって人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TaKaRa社製）、Mutant-G（TaKaRa社製）、TaKaRa社のLA-PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。

ポリペプチド（ａ）及び（ｂ）は、以下の工程に従い、それぞれのポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させることにより製造することができる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするポリペプチドのコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするポリペプチドのコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。

このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするポリペプチドを生産し得る形質転換体を得ることができる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有することができる。

発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。

宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。

細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、Ｐ_Lプロモーター、Ｐ_Rプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用することができる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを使用することもできる。

細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。

酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用することができる。

酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。

動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用することができる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用することができる。

動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。

昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用することができる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。

昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。

〔形質転換体の培養〕
目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用することができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用することができる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。

形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２８〜３７℃、培養時間は通常０．５〜４日であり、培養期間中はｐＨを６．８〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、α-MEM培地、DMEM培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２〜２０日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、TC-100 培地 (Gibco BRL社製)、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用することができる。形質転換体の培養は、通常２２〜２８℃で３〜２０日行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

〔ポリペプチドの単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするポリペプチドを採取することにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするポリペプチドが形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするポリペプチドを抽出する。目的とするポリペプチドが形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。

こうして得られるポリペプチド（ａ）又は（ｂ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。

ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。

本発明の抗悪性神経膠腫剤は、ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）のみから構成されていてもよいが、通常は、医薬上許容される１種以上の担体及び／又は添加剤とともに常法に従って製剤化される。製剤化する場合、ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）の配合量は適宜調節し得るが、通常１０^４〜１０^９Ｕ／ｍｇであり、好ましくは使用前例がある範囲である。使用前例としては、例えば、インターフェロンα製剤ロフェロンＡ６００（中外製薬）（ロフェロンＡ：６００万国際単位、ヒト血清アルブミン：５ｍｇ、塩化ナトリウム：９ｍｇ）、エリスロポエチン製剤エポジン９０（中外製薬）（遺伝子組換えエポエチンベータ：９０００国際単位、Ｌ−塩酸ヒスチジン：０．６７５ｍｇ、ポリソルベート８０：０．０２５ｍｇ）（医薬品添加物事典２０００、日本医薬品添加剤協会編集）が挙げられる。

医薬上許容される担体としては、例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。

製剤化に際して使用される添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、滑沢剤、安定化剤、抗菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択される。

投与経路としては、例えば、経口投与、脳内、腹腔内、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口投与が挙げられる。また、投与剤形としては、例えば、錠剤、散剤、注射剤、顆粒剤、噴霧剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、座剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。

投与量及び投与回数は、担当医師又は獣医師の厳重な管理の下、投与対象者又は動物の年齢、症状、体重、投与効果等を勘案して個別に決定されるが、ヒト成人（体重６０ｋｇ）の場合、静脈投与では１００万単位、動脈投与では２００万単位、経皮投与では１００万単位が日用量の目安となり、この日用量を１日１回又は数回に分けて投与できる。なお、ヒト以外の動物、例えば、ウシ、ウマ等の大型動物の場合、上記日用量の６０分の１を体重１ｋｇ当たりの投与量の目安とし、ニワトリ等の鳥類の場合、さらにその２倍量を体重１ｋｇ当たりの投与量の目安として投与できる。

上記単位は、ＷＨＯが標準化したＴＮＦ-αの比活性を指標とし、各ポリペプチドのＬ−９２９細胞（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1975年，第72巻，p.3666-3670）に対する細胞毒性を基にして、次のようにして求められる。

Ｌ−９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下「ＭＥＭ培地」という。）で育成し、８×１０^４個の細胞が１００μＬ及び同培地に含まれるようにし、９６穴の平底プレートで育種する。育種条件は、３７℃、２時間、５％ＣＯ_２、１００％Ｈ_２Ｏであり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ／ｍＬとなるように加え、培養液の液量を１５０μＬとする（アクチノマイシンＤは、細胞感受性を高めるために繁用されている薬剤であり、それ自体にＬ−９２９細胞毒性は持たないとされている）。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μＬ加える（この際、稀釈率を適宜調節してＥＤ_５０を求めることができる）。更に、最終液量２００μＬとなったＬ−９２９細胞を上記条件で１８時間培養する。

細胞壊死活性を測定するには、まず全培地を除去し、ついで０．２％クリスタルバイオレットを含む２％メチルアルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死を生じた結果プレート底面より遊離した細胞は染色しないので、細胞壊死活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ_{５９０ｎｍ}での吸収で測定し、対照群に対する染色度と比較することで細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次のように行う。

Ｌ−９２９細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳを使用し、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍＬ）を２．４×１０^６単位／ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ-αを用いて決定する。このウサギＴＮＳのＥＤ_５０を与える稀釈率（Ｃ）を求める。
検体の活性（単位／ｍＬ）はＮ／Ｃ×ｎに基づいて計算する。

配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのマウスに対するＬＤ_５０は９．５×１０^７単位／ｋｇ(ＢＡＬＢ／Ｃ系統)、２．７×１０^７単位／ｋｇ（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統）、５．８×１０^７単位／ｋｇ（Ｃ５７ＢＬ／６系統）であり、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのマウスに対するＬＤ_５０は２．９×１０^７単位／ｋｇ(ＢＡＬＢ／Ｃ系統)、２．７×１０^７単位／ｋｇ（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統）、２．７×１０^７単位／ｋｇ（Ｃ５７ＢＬ／６系統）であり、共にＴＮＦ-αの値である１．０×１０^７単位／ｋｇ(ＢＡＬＢ／Ｃ系統)、７．８×１０^６単位／ｋｇ（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統）、５×１０^７単位／ｋｇ（Ｃ５７ＢＬ／６系統）に比べて非常に小さい。このように、ポリペプチド（ａ）又は（ｂ）の正常細胞への毒性がＴＮＦ-αより極めて低いことも、本発明の抗悪性神経膠腫剤及び動物用抗悪性神経膠腫剤の臨床での有用性を高めるものである。

本発明の抗悪性神経膠腫剤をヒト又は動物に投与することにより、ヒト又は動物における悪性神経膠腫を予防又は治療できる。悪性神経膠腫には、悪性星細胞腫／退形成性星細胞腫（anaplastic astrocytoma）、膠芽腫（glioblastoma）、巨細胞膠芽腫（giant cell glioblastoma）、膠肉腫（gliosarcoma）、退形成性乏（稀）突起膠腫（anaplastic oligodendroglioma）、退形成性上衣腫（anaplastic ependymoma）、脈絡叢癌（choroid plexus carcinoma）、退形成性神経節膠腫（anaplastic ganglioglioma）、松果体芽腫（pineoblastoma）、髄上皮腫（medulloepithelioma）、上衣芽腫（ependymoblastoma）、髄芽腫（medulloblastoma）、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（supratentorial primitive neuroectodermal tumor）、非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍（atypical teratoid / rhabdoid tumor）等が含まれる。動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳類；ニワトリ等の鳥類が挙げられる。

以下、製造例及び試験例により本発明を詳細に説明する。なお、以下、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ＴＮＦ−ＳＡＭ１」といい、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを「ＴＮＦ−ＳＡＭ２」という。
〔製造例１〕注射剤
１×１０^６単位（約２５０μｇ）のＴＮＦ−ＳＡＭ１、ＴＮＦ−ＳＡＭ２又はこれらの混合物を１ｍＬの生理的食塩水に溶解して、注射液を調製した。

〔製造例２〕除放剤
１×１０^６単位（約２５０μｇ）のＴＮＦ−ＳＡＭ１、ＴＮＦ−ＳＡＭ２又はこれらの混合物をリポソームに分類封入して、除放剤を調製した。

〔試験例１〕
ＴＮＦ−ＳＡＭ２の抗悪性神経膠腫作用を、ラット脳室内に膠芽腫細胞であるＣ６グリオーマ細胞を移植した神経膠腫病態動物の延命効果により調べた。
ラット（５週齢の雄ウィスターラット，体重１５０ｇ〜２５０ｇ）を麻酔し、脳定位挿入装置を用いて頭蓋切除術を行った後、１．６×１０^４個のＣ６グリオブラストーマ細胞（脳腫瘍細胞）を５μＬの生理食塩水に懸濁した溶液を、４ｍｍの脳内の深さに注入した。脳腫瘍細胞移植後３日目のラットを脳腫瘍モデルラットとして用いた。各投与群（Ａ群は正常ラット血清、Ｂ群はＴＮＦ-α、Ｃ群はＴＮＦ−ＳＡＭ２）に５匹ずつの脳腫瘍移植ラットを用いた。各投与群において、検体を３％の正常ラット血清を含むように調製し、頚動脈から１回投与した。
結果を表１に示す。

表１に示すように、ＴＮＦ-αは抗脳腫瘍効果が全くないばかりか、７×１０^６及び２０×１０^６単位の投与では、薬物無投与群（Ａ群）よりも早期に死亡した。また、ＴＮＦ−ＳＡＭ２の７×１０^６単位の投与では、薬物無投与群（Ａ群）及びＴＮＦ-α投与群（Ｂ群）に比べ、有意に延命効果を示した。
なお、ＴＮＦ−ＳＡＭ２がアルキル化剤との併用で相乗的に抗腫瘍効果を示すことが報告されていることから（Cancer Biotherapy，vol.9，p.359-367（1994年））、テモゾロミドとＴＮＦ−ＳＡＭ２との併用療法が悪性神経膠腫に対して効果的であると考えられる

〔試験例２〕
（１）症例１
２００１年に悪性星細胞腫（Grade III）が発見された４７歳の女性について、手術を行ったが、部分切除にとどまった。ラニムスチン（Ranimustin）（（メチル−６）−３−（２−クロロエチル）−３−ニトロソウレア−６−デオキシ−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド）；(methyl-6)-3-(2-chloroethyl)-3-nitrosoureido)-6-deoxy-alpha-D-glucopyranoside；ＭＣＮＵ）１００ｍｇを第１日目に投与し、放射線照射を行った後３日目からＴＮＦ−ＳＡＭ２、１００万単位を週５回投与した。この治療を１５回行ったところ、腫瘍量がＭＲＩで５０％以上縮小していることが示された。

（２）症例２
１９９７年に膠芽腫（Grade IV）が発見された５０歳の女性について、手術で亜全摘を行ったが、腫瘍は残存した。上記症例と同様の治療を５週間行った。残存腫瘍はその間増殖しなかった。

Claims

下記（ａ）又は（ｂ）に示すポリペプチド又はこれらの混合物を含有する抗悪性神経膠腫剤。
（ａ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１又は２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、抗悪性神経膠腫作用を有するポリペプチド
前記（ｂ）に示すポリペプチドが、配列番号１又は２記載のアミノ酸配列のうち、１番目のアミノ酸から１８番目のアミノ酸までの部分において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１記載の抗悪性神経膠腫剤。
動物用抗悪性神経膠腫剤である請求項１又は２記載の抗悪性神経膠腫剤。