JP2005124478A - タンパク質cyc、その遺伝子、高度な温度耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】温度耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明するとともに、高度な温度耐性を有し、酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得し、さらに、当該微生物を用いて食酢を効率良く製造する方法を提供すること。
【解決手段】下記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYC、該タンパク質CYCをコードする遺伝子のDNA(A)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(B)特定のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質並びに微生物細胞内における前記DNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物;前記微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【選択図】 なし
【解決手段】下記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYC、該タンパク質CYCをコードする遺伝子のDNA(A)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(B)特定のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質並びに微生物細胞内における前記DNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物;前記微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【選択図】 なし
Description
本発明は、タンパク質CYC、その遺伝子、高度な温度耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法に関し、詳しくは温度耐性を増強する機能を有するタンパク質CYC、該タンパク質CYCをコードする遺伝子のDNA、該DNAを含むプラスミド、高度な温度耐性を有し、高濃度の酢酸を効率良く生産することが可能な微生物、及び該微生物を用いて高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法に関する。
工業的な食酢製造においては、微生物による酢酸発酵が利用されている。このような微生物はアルコール酸化能を有し、一般に酢酸菌と呼ばれる。酢酸菌の中でも特に、アセトバクター(Acetobacter)属及びグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属に属する酢酸菌は、工業的な酢酸発酵に広く利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、その際、多量の発酵熱が発生する。これを放置すると、発酵液の温度の上昇を招く。酢酸菌の発酵温度は通常30℃前後が適温であるので、食酢醸造においては、発酵液の温度を上昇させないよう、発酵液を冷却する必要があるが、その結果、冷却のためのエネルギーがかかることになる。そのため、酢酸発酵において、より高い温度でも増殖能力や発酵能力が低下しない酢酸菌、すなわち温度耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、温度耐性を持つ酢酸菌を自然界からスクリーニングする試みがなされていた(例えば、非特許文献1参照)。
しかし、酢酸菌の温度耐性に関与する遺伝子に関する知見は殆ど無く、酢酸菌の温度耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な温度耐性遺伝子を取得し、また取得した温度耐性遺伝子を用いて、より強い温度耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry)」、44巻、2901−2906、1980年
上記のように、酢酸菌の温度耐性を遺伝子レベルで解明し、高い温度耐性を有する実用性のある酢酸菌の開発に成功した例は、未だ報告されていない。
そこで、本発明の目的は、第一に酢酸菌の温度耐性の向上を図るため、温度耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明することである。さらに、本発明の別の目的は、当該タンパク質をコードする温度耐性増強遺伝子を取得するとともに、この遺伝子を用いて高度な温度耐性を有し、従来より高温度の条件下でも酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得すること、並びに当該微生物を用いて食酢を効率良く製造する方法を提供することである。
そこで、本発明の目的は、第一に酢酸菌の温度耐性の向上を図るため、温度耐性を増強するタンパク質を遺伝子レベルにおいて解明することである。さらに、本発明の別の目的は、当該タンパク質をコードする温度耐性増強遺伝子を取得するとともに、この遺伝子を用いて高度な温度耐性を有し、従来より高温度の条件下でも酢酸を効率良く生産することが可能な微生物を取得すること、並びに当該微生物を用いて食酢を効率良く製造する方法を提供することである。
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ね、従来より高温度の条件下においても増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な温度耐性遺伝子が存在するとの仮説を立てた。そして、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の温度耐性を向上させることができ、効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
従来の温度耐性酢酸菌の取得方法としては、温度非感受性の変異株をスクリーニングする方法が一般的であった(例えば、非特許文献1参照)。
従来の温度耐性酢酸菌の取得方法としては、温度非感受性の変異株をスクリーニングする方法が一般的であった(例えば、非特許文献1参照)。
しかし、本発明者は、この方法では産業上有用な温度耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、他の取得方法を検討した。その結果、酢酸菌の染色体DNAライブラリーを構築し、この染色体DNAライブラリーを酢酸菌に形質転換することにより、通常は寒天培地上において37℃程度の温度下でしか生育できない酢酸菌を、38℃の温度下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この取得方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター(Acetobacter)属やグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌から、温度耐性を実用レベルで増強させる機能を有する新規なタンパク質CYCの遺伝子(温度耐性増強遺伝子)をコードするDNAをクローニングすることにはじめて成功した。
この取得方法によって、実際に食酢製造に用いられているアセトバクター(Acetobacter)属やグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌から、温度耐性を実用レベルで増強させる機能を有する新規なタンパク質CYCの遺伝子(温度耐性増強遺伝子)をコードするDNAをクローニングすることにはじめて成功した。
得られた温度耐性増強遺伝子のコーディング領域は、微生物に見出されるシトクロムc−552と称されるタンパク質とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度が低いことから、酢酸菌に特異的なタンパク質遺伝子であって、酢酸菌のシトクロームc−552タンパク質とある程度似ている新規なタンパク質をコードする遺伝子であると推定された。
また、温度耐性増強遺伝子をコードするDNAのコピー数を増幅させてなる微生物は、温度耐性が顕著に増強するので、従来よりも高温度の条件下において、食酢を効率良く製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、温度耐性増強遺伝子をコードするDNAのコピー数を増幅させてなる微生物は、温度耐性が顕著に増強するので、従来よりも高温度の条件下において、食酢を効率良く製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、請求項1記載の本発明は、下記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYCを提供するものである。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
請求項2記載の本発明は、前記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYCをコードする遺伝子のDNAを提供するものである。
請求項3記載の本発明は、下記の(a)又は(b)に示すDNAである請求項2に記載の遺伝子のDNAを提供するものである。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
請求項3記載の本発明は、下記の(a)又は(b)に示すDNAである請求項2に記載の遺伝子のDNAを提供するものである。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
請求項4記載の本発明は、微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物を提供するものである。
請求項5記載の本発明は、微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項4に記載の微生物を提供するものである。
請求項6記載の本発明は、請求項4又は5に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法を提供するものである。
請求項5記載の本発明は、微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項4に記載の微生物を提供するものである。
請求項6記載の本発明は、請求項4又は5に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法を提供するものである。
本発明により、温度耐性を増強する機能を有する新規なタンパク質及びその遺伝子のDNAが提供され、該DNAを用いて、従来より高温度の条件下において、酢酸を効率良く生産可能な微生物を取得することができる。さらに、該微生物を使用することで、従来より高温度の条件下で、食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明のタンパク質CYC
本発明のタンパク質CYCは、請求項1に記載するように、下記の(A)又は(B)に示すタンパク質である。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
(1)本発明のタンパク質CYC
本発明のタンパク質CYCは、請求項1に記載するように、下記の(A)又は(B)に示すタンパク質である。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
ここで、(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、種々の微生物のシトクロムc−552タンパク質のアミノ酸配列とある程度の相同性を有するが、その相同性の程度は35%程度と低いことから、酢酸菌に特異的なシトクロムc−552タンパク質であると推定された。
すなわち、DDBJ/EMBL/Genbank及びSWISS−PROT/PIRにおいてアミノ酸配列レベルでホモロジー検索すると、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)のシトクロムc−552タンパク質をコードする遺伝子と35%の相同性を有する。
すなわち、DDBJ/EMBL/Genbank及びSWISS−PROT/PIRにおいてアミノ酸配列レベルでホモロジー検索すると、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)のシトクロムc−552タンパク質をコードする遺伝子と35%の相同性を有する。
本発明のタンパク質CYCは、上述のように、(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよいが、(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個、好ましくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質、(A)のタンパク質と実質的に同一のタンパク質であっても良い。
このような、タンパク質(B)は、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個、好ましくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含むアミノ酸配列となるように改変することによっても取得され得る。また、従来知られている突然変異処理によっても取得することができるし、酢酸菌全般、中でもアセトバクター(Acetobacter)属やグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。取得方法の詳細については、温度耐性を増強する機能を有することの確認のための手段を含めて、後述の(2)本発明のDNAについての説明において詳細に説明する。
このような本発明のタンパク質CYCは、微生物、例えばアセトバクター(Acetobacter)属又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属に属する酢酸菌、具体的には例えば、アセトバクター・アセチNo.1023株(Acetobacter aceti No.1023)(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムIFO3288(Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288)株、アセトバクター・アセチIFO3283(Acetobacter aceti IFO3283)株、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスDSM6160(Gluconacetobacter europaeus DSM6160)、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)に存在し、特にアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(特許生物寄託センターにFERM BP−491として寄託)に存在する。
(2)本発明のDNA
本発明のDNAは、請求項2に記載するように、上記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYCをコードする遺伝子のDNAである。具体的には、請求項3に記載するように、下記の(a)又は(b)に示すDNAである。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
なお、本発明のDNAが、塩基配列の調整要素及び該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
本発明のDNAは、請求項2に記載するように、上記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYCをコードする遺伝子のDNAである。具体的には、請求項3に記載するように、下記の(a)又は(b)に示すDNAである。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNA。
なお、本発明のDNAが、塩基配列の調整要素及び該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNAは、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)から次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(特許生物寄託センターにFERM BP−491として寄託)の染色体DNAを取得する。染色体DNAの取得は、例えば特開昭60−9489号公報に開示された方法により行なうことができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(特許生物寄託センターにFERM BP−491として寄託)の染色体DNAを取得する。染色体DNAの取得は、例えば特開昭60−9489号公報に開示された方法により行なうことができる。
次に、得られた染色体DNAから本発明の温度耐性を向上させる遺伝子を単離するために、染色体DNAライブラリーを作製する。
すなわち、まず、染色体DNAを適当な制限酵素で部分分解して種々の染色体DNA断片混合物を得る。制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Sau3AIを温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度1〜10ユニット/mlで様々な時間(1分〜2時間)、染色体DNAに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではSau3AIを用いた。
すなわち、まず、染色体DNAを適当な制限酵素で部分分解して種々の染色体DNA断片混合物を得る。制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Sau3AIを温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度1〜10ユニット/mlで様々な時間(1分〜2時間)、染色体DNAに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではSau3AIを用いた。
次いで、切断された染色体DNA断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターDNAに連結する。
ベクターDNAに染色体DNA断片を連結させるためには、制限酵素等を用いてベクターDNAを切断開裂させておく必要がある。制限酵素としては、上記DNA断片混合物を得る際に用いた制限酵素(例えば、Sau3AI)と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素(例えば、BamHI)を用いることができる。BamHIを用いた場合、温度30℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で、1時間以上ベクターDNAに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
切断開裂されたベクターDNAを、染色体DNA断片混合物と混合し、これにT4DNAリガーゼを作用させて、目的の組換えDNA(DNAライブラリー)を得ることができる。なお、T4DNAリガーゼの作用条件としては、例えば、温度4〜16℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時間以上、好ましくは6〜24時間とすることができる。
ベクターDNAに染色体DNA断片を連結させるためには、制限酵素等を用いてベクターDNAを切断開裂させておく必要がある。制限酵素としては、上記DNA断片混合物を得る際に用いた制限酵素(例えば、Sau3AI)と相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素(例えば、BamHI)を用いることができる。BamHIを用いた場合、温度30℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で、1時間以上ベクターDNAに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
切断開裂されたベクターDNAを、染色体DNA断片混合物と混合し、これにT4DNAリガーゼを作用させて、目的の組換えDNA(DNAライブラリー)を得ることができる。なお、T4DNAリガーゼの作用条件としては、例えば、温度4〜16℃、酵素濃度1〜100ユニット/mlの条件下で1時間以上、好ましくは6〜24時間とすることができる。
こうして得られた組換えDNA(DNAライブラリー)から、前記タンパク質(A)をコードする遺伝子、具体的には前記DNA(a)を選抜する。
選抜は、温度耐性の増強機能により行なうことができる。例えば、寒天培地上で37℃程度でしか通常増殖することができない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチNo.1023株(Acetobacter aceti No.1023)(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)を組換えDNAを用いて形質転換し、38℃で培養する。生じたコロニーを液体培地に接種し、得られる菌体からプラスミドを回収することで、目的のDNAを得ることができる。
選抜は、温度耐性の増強機能により行なうことができる。例えば、寒天培地上で37℃程度でしか通常増殖することができない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチNo.1023株(Acetobacter aceti No.1023)(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)を組換えDNAを用いて形質転換し、38℃で培養する。生じたコロニーを液体培地に接種し、得られる菌体からプラスミドを回収することで、目的のDNAを得ることができる。
こうして(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNAを得ることができる。ここで、配列表の配列番号1記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列は、コーディング領域であり、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列は、コーディング領域に対応したものである。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNAは、サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)のシトクロムc−552タンパク質をコードする遺伝子とアミノ酸レベルで35%の相同性を有することから、シトクロムc−552タンパク質とある程度似ている新規なタンパク質をコードする新規な遺伝子であると推定されたものである。この点については、前記(1)本発明のタンパク質CYCの項で既に説明した通りである。
なお、シトクロムc−552タンパク質をコードする遺伝子が、温度耐性と関係していることは従来全く知られていなかったことであり、本発明者が初めて見出したものである。
なお、シトクロムc−552タンパク質をコードする遺伝子が、温度耐性と関係していることは従来全く知られていなかったことであり、本発明者が初めて見出したものである。
このような、(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNAの製造は、上述の方法に限定されず、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)のゲノムDNAを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR反応)によって、又は該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
ここで、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のDNA合成機を用いて定法に従って合成できる。また、PCR反応は、アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems)製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 9700を用い、TaqDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)やKOD−Plus−(東洋紡績社製)などを使用して、定法に従って行なうことができる。
本発明のDNAは、(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、具体的には(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNAであってもよいが、(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個、好ましくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質、すなわち(A)のタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするものであっても良い。
このような、タンパク質(B)をコードするDNAは、例えば部位特異的変異法によって、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個、好ましくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするように、塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のようなタンパク質(B)をコードするDNAは、既知の突然変異処理によっても取得することができる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間で僅かに異なることが知られているので、タンパク質(B)をコードするDNAは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から上記のようなタンパク質(B)をコードするDNAを得ることが可能である。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするDNAの塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間で僅かに異なることが知られているので、タンパク質(B)をコードするDNAは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から上記のようなタンパク質(B)をコードするDNAを得ることが可能である。
このようなタンパク質(B)をコードするDNAは、(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は前記塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするDNAとして得ることができる。
例えば、酢酸菌全般、中でもアセトバクター(Acetobacter)属又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の種、株、変異体、変種、より具体的にはアセトバクター(Acetobacter)属やグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌、これらを自然に、若しくは人工的に変異処理して得られる変異体(変異株或いは変種)から、配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによって得ることができる。
例えば、酢酸菌全般、中でもアセトバクター(Acetobacter)属又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の種、株、変異体、変種、より具体的にはアセトバクター(Acetobacter)属やグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌、これらを自然に、若しくは人工的に変異処理して得られる変異体(変異株或いは変種)から、配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることによって得ることができる。
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば1xSSCで0.1%SDSに相当する塩濃度にて60℃で洗浄が行なわれる条件などが挙げられる。
温度耐性を増強する機能を有することの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、通常は寒天培地上で37℃程度でしか増殖することができないアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)に目的のDNAを形質転換し、38℃で増殖可能かどうかを調べることにより行なうことができる。
(3)本発明の微生物
本発明の微生物は、請求項4に記載するように、微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物である。
本発明の微生物は、請求項4に記載するように、微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物である。
このような微生物として、アルコール酸化能を有する酢酸菌が挙げられ、中でも、請求項5に記載のアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、酢酸の生産量及び生産効率を増大させることができる点で好ましい。
係る高度な温度耐性を有する微生物の取得に用いる酢酸菌は、アセトバクター(Acetobacter)属又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌であり、アセトバクター(Acetobacter)属の酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチNo.1023株(Acetobacter aceti No.1023)(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムIFO3288(Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288)株、アセトバクター・アセチIFO3283(Acetobacter aceti IFO3283)株を用いることができる。
係る高度な温度耐性を有する微生物の取得に用いる酢酸菌は、アセトバクター(Acetobacter)属又はグルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌であり、アセトバクター(Acetobacter)属の酢酸菌としては、例えば、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチNo.1023株(Acetobacter aceti No.1023)(特許生物寄託センターにFERM BP−2287として寄託)、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムIFO3288(Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO3288)株、アセトバクター・アセチIFO3283(Acetobacter aceti IFO3283)株を用いることができる。
また、グルコンアセトバクター(Gluconacetobacter)属の酢酸菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスDSM6160(Gluconacetobacter europaeus DSM6160)、グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(現在特許生物寄託センターにFERM BP−491として寄託)を用いることができる。
本発明の高度な温度耐性を有する微生物は、微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数が、好ましくは2回以上、より好ましくは3〜20回増幅されてなる微生物である。
微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数を増幅する方法としては、例えば、該遺伝子の構造遺伝子(配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、204〜737番目)を含むDNA断片を、対象である微生物中で効率よく機能するプロモーター配列、例えば、酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、175巻、p.6857−6866、1993年」参照)、大腸菌のプラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドpACYC177のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドpACYC184のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど対象微生物以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えて得られる組換えDNAを用いて、微生物を形質転換する方法によっても良い。
微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数を増幅する方法としては、例えば、該遺伝子の構造遺伝子(配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、204〜737番目)を含むDNA断片を、対象である微生物中で効率よく機能するプロモーター配列、例えば、酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journal of Bacteriology)、175巻、p.6857−6866、1993年」参照)、大腸菌のプラスミドpBR322のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドpACYC177のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドpACYC184のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど対象微生物以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えて得られる組換えDNAを用いて、微生物を形質転換する方法によっても良い。
その他、請求項2又は3に記載のDNAを含むマルチコピーベクターを微生物の細胞に導入することによっても良い。
ここで、マルチコピーベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン等が挙げられる。
プラスミドとしては、pGI18(例えば、特願2003−350265明細書参照)、pUF106(例えば、「セルロース(Cellulose)、p.153−158、1989年」参照)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例えば、特開昭60−9488号公報参照)などが挙げられ、中でも、酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、且つ細胞内での安定性に優れる点で、pGI18が好ましい。
また、染色体組み込み型ベクターであるpMVL1(例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry)、52巻、p.3125−3129、1988年」参照)も用いることができる。
トランスポゾンとしては、MuやIS1452などが挙げられる。
ここで、マルチコピーベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン等が挙げられる。
プラスミドとしては、pGI18(例えば、特願2003−350265明細書参照)、pUF106(例えば、「セルロース(Cellulose)、p.153−158、1989年」参照)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例えば、特開昭60−9488号公報参照)などが挙げられ、中でも、酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、且つ細胞内での安定性に優れる点で、pGI18が好ましい。
また、染色体組み込み型ベクターであるpMVL1(例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry)、52巻、p.3125−3129、1988年」参照)も用いることができる。
トランスポゾンとしては、MuやIS1452などが挙げられる。
マルチコピーベクターの微生物細胞への導入は、塩化カルシウム法(例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological Chemistry)、49巻、p.2091−2097、1985年」参照)、エレクトロポレーション法(例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Bioscience,Biotechnology and Biochemistry)、58巻、p.974−975、1994年」参照)等によって行なうことができる。
(4)本発明の食酢の製造方法
本発明の食酢の製造方法は、請求項6に記載するように、請求項4又は5に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
本発明の食酢の製造方法は、請求項6に記載するように、請求項4又は5に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
この方法は、従来の酢酸菌による発酵方法と同様に行なえば良い。アルコールを含有する培地とは、エタノール等のアルコールと、炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であり、いわゆる酢酸発酵の際に用いられる培地と同様の組成のものを使用することができる。必要に応じて、使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸等を用いることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸等を用いることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の常法に従って、好気的条件下で行なうことができる。培養温度は20〜45℃、好ましくは30〜40℃、通常は38℃とすることができる。
培地のpHは通常2.5〜7.0の範囲であり、2.7〜6.5の範囲が好ましく、各種の酸、塩基、緩衝液等によって適宜調整することができる。
培地のpHは通常2.5〜7.0の範囲であり、2.7〜6.5の範囲が好ましく、各種の酸、塩基、緩衝液等によって適宜調整することができる。
このように、本発明においては、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることができ、通常1〜21日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を生成蓄積せしめることができる。
以上、本発明のタンパク質CYC又は温度耐性増強遺伝子は、それらの遺伝子源であるアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株がFERM BP−491として特許生物寄託センターに寄託されているので、本発明に係る遺伝子のDNAは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、本発明のタンパク質CYC又は温度耐性増強遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターに乗せ換え、これを酢酸菌に導入し、該酢酸菌を培養することにより、高温度の条件下において、食酢を容易に製造することができる。
さらに、上記したように本発明のタンパク質CYC又は温度耐性増強遺伝子のクローン化やPCRの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託、その他が開示若しくは実施されており、いずれも入手ないし操作、処理が容易に行なえるので、実施例を参考にして各操作、処理を行なえば、目的とする温度耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより、高温度条件下においても、酢酸を製造することができる。
さらに、上記したように本発明のタンパク質CYC又は温度耐性増強遺伝子のクローン化やPCRの態様、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託、その他が開示若しくは実施されており、いずれも入手ないし操作、処理が容易に行なえるので、実施例を参考にして各操作、処理を行なえば、目的とする温度耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより、高温度条件下においても、酢酸を製造することができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例1(温度耐性増強遺伝子のクローニング)
(1)染色体DNAライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(FERM BP−491)を、6%酢酸と4%エタノールを添加したYPG培地(3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%ポリペプトン含有)中で、30℃にて240〜336時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離(7,500xg、10分)し、菌体を得た。
実施例1(温度耐性増強遺伝子のクローニング)
(1)染色体DNAライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ(Gluconacetobacter entanii)の1株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(FERM BP−491)を、6%酢酸と4%エタノールを添加したYPG培地(3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.2%ポリペプトン含有)中で、30℃にて240〜336時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離(7,500xg、10分)し、菌体を得た。
得られた菌体より、特開昭60−9489号公報に開示された方法により、染色体DNAを調製した。すなわち、該菌体をTE緩衝液で洗浄後、TE緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、EDTA液を加えて37℃で20分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、37℃で20分間静置した後、65℃5分間加熱した。その後3倍量の滅菌水を加え、それと等量のフェノールを加えて激しく攪拌し、7,000×g、30分間の遠心を行ってフェノールを分離した。分取した水溶液の2倍量のエタノールを加えて−80℃で2時間放置後、7,000xg、30分間の遠心を行って、得られた沈殿を真空乾燥した後、沈殿物をUC緩衝液に溶解させ、エチジウムブロマイドを加え、さらに塩化セシウムを加えて密度を1.57に合わせ、密度勾配遠心分離を行なった。その後、遠心チューブに365nmの紫外線を照射し、現れた染色体バンドを分取した。分画液をイソプロパノールで処理し、エチジウムブロマイドを除き、TE緩衝液に対して透析した。これを染色体DNA溶液とした。
上記のようにして得られた染色体DNAを、制限酵素Sau3AI(タカラバイオ社製)で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターpGI18を制限酵素BamHIで消化して、切断した。これらのDNAを適量ずつ混合し、ライゲーションキット(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製)を用いて連結してアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株の染色体DNAライブラリーを構築した。
(2)温度耐性増強遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株の染色体DNAライブラリーを、通常は寒天培地上で生育温度37℃程度までしか増殖できないアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株(FERM BP−2287)に形質転換した。
その後、該形質転換株を、100μg/mlのアンピシリンを加えたYPG寒天培地で、38℃にて4日間培養した。
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株の染色体DNAライブラリーを、通常は寒天培地上で生育温度37℃程度までしか増殖できないアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株(FERM BP−2287)に形質転換した。
その後、該形質転換株を、100μg/mlのアンピシリンを加えたYPG寒天培地で、38℃にて4日間培養した。
次に、生じたコロニーを100μg/mlのアンピシリンを含むYPG培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。その結果、図1の上段に示すように、約5.0kbpのSau3AI断片がクローン化されたプラスミドを回収できた。
さらに、YPG寒天培地において、アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株を38℃でも生育可能にするDNA断片は、クローン化された約5.0kbpのSau3AI断片中の約0.9kbpのFbaI断片であることが確認できた。
このようにして、通常は寒天培地上で37℃程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株を、38℃でも増殖可能にする温度耐性増強遺伝子断片を取得した。
さらに、YPG寒天培地において、アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株を38℃でも生育可能にするDNA断片は、クローン化された約5.0kbpのSau3AI断片中の約0.9kbpのFbaI断片であることが確認できた。
このようにして、通常は寒天培地上で37℃程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株を、38℃でも増殖可能にする温度耐性増強遺伝子断片を取得した。
(3)温度耐性増強遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
上記のクローン化されたSau3AI断片中のFbaI断片を、pUC19のBamHI切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。なお、塩基配列の決定は、DNA2本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号1記載の塩基配列が決定された。配列表の配列番号1記載の塩基配列中には、塩基番号204〜737にかけて、配列表の配列番号2記載のアミノ酸178個からなるアミノ酸配列をコードするオープンリーディング・フレーム(ORF)の存在が確認された。図1の上段に、Sau3AI断片の制限酵素地図を、温度耐性増強遺伝子の位置と共に示す。
上記のクローン化されたSau3AI断片中のFbaI断片を、pUC19のBamHI切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。なお、塩基配列の決定は、DNA2本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号1記載の塩基配列が決定された。配列表の配列番号1記載の塩基配列中には、塩基番号204〜737にかけて、配列表の配列番号2記載のアミノ酸178個からなるアミノ酸配列をコードするオープンリーディング・フレーム(ORF)の存在が確認された。図1の上段に、Sau3AI断片の制限酵素地図を、温度耐性増強遺伝子の位置と共に示す。
実施例2(温度耐性増強遺伝子による形質転換)
(1)アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例1のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(FERM BP−491)由来の温度耐性増強遺伝子を、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用いてPCR法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターpGI18(特願2003−350265参照)を制限酵素SmaIで切断後、アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社製)で脱リン酸化処理を行い、その部位に、PCR法によって増幅したDNA断片を挿入して、pCYC1を作製した。図1下段にpCYC1に挿入された増幅断片の概略を示した。
(1)アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例1のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスMH−24(Acetobacter altoacetigenes MH-24)株(FERM BP−491)由来の温度耐性増強遺伝子を、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用いてPCR法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターpGI18(特願2003−350265参照)を制限酵素SmaIで切断後、アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社製)で脱リン酸化処理を行い、その部位に、PCR法によって増幅したDNA断片を挿入して、pCYC1を作製した。図1下段にpCYC1に挿入された増幅断片の概略を示した。
PCR法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムDNAを用い、プライマーとしてプライマー1(primer #1)及びプライマー2(primer #2)を用い、下記する条件にて、PCR法を実施した。プライマー1及び2の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号3及び4に示すとおりである。
PCR法のサイクルは、94℃15秒、57℃30秒、68℃90秒を1サイクルとして、30サイクルとした。
PCR法のサイクルは、94℃15秒、57℃30秒、68℃90秒を1サイクルとして、30サイクルとした。
このpCYC1を、アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株(FERM BP−2287)にエレクトロポレーション法(「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー(Bioscience, Biotechnology and Biochemistry)、58巻、p.974−975、1994年」参照)によって形質転換した。形質転換株は100μg/mlのアンピシリンを添加したYPG寒天培地で、培養温度を38℃に設定して選択した。
38℃において培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、温度耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
38℃において培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、温度耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
(2)形質転換株の温度耐性
上記のようにして得られたプラスミドpCYC1を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、YPG培地で通気培養した場合の生育状態を、培養温度を変えて、シャトルベクターpGI18のみを導入した元株アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株の生育と比較した。
具体的には、アンピシリン100μg/mlを含む10mlのYPG培地にpCYCを有する形質転換株とシャトルベクターpGI18を有する元株をそれぞれ接種し、30℃及び38℃で振とう培養(150rpm)を行ない、形質転換株と元株の生育を660nmにおける吸光度を測定することにより比較した。38℃で培養した場合における、元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を濁度(optical density:OD)で測定した結果を図2に示す。
上記のようにして得られたプラスミドpCYC1を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、YPG培地で通気培養した場合の生育状態を、培養温度を変えて、シャトルベクターpGI18のみを導入した元株アセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株の生育と比較した。
具体的には、アンピシリン100μg/mlを含む10mlのYPG培地にpCYCを有する形質転換株とシャトルベクターpGI18を有する元株をそれぞれ接種し、30℃及び38℃で振とう培養(150rpm)を行ない、形質転換株と元株の生育を660nmにおける吸光度を測定することにより比較した。38℃で培養した場合における、元株及び形質転換株の増殖量の経時的変化を濁度(optical density:OD)で測定した結果を図2に示す。
その結果、30℃で培養した場合では、形質転換株及び元株はほぼ同様の増殖が可能であった。しかし、図2から明らかな通り、38℃で培養した場合では、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株であるアセトバクター・アセチNo.1023(Acetobacter aceti No.1023)株は増殖できないことが確認でき、該温度耐性増強遺伝子の温度耐性増強機能が確認できた。
本発明により、温度耐性を増強する機能を有する新規なタンパク質及びその遺伝子のDNAが提供され、該DNAを用いて、従来より高温度の条件下において、酢酸を効率良く生産可能な微生物を取得することができる。さらに、該微生物を使用することで、従来より高温度の条件下で、食酢を高効率で製造する方法の提供が可能となった。
Claims (6)
- 下記の(A)、又は(B)に示すタンパク質CYC。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 下記の(A)又は(B)に示すタンパク質CYCをコードする遺伝子のDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。 - 下記の(a)又は(b)に示すDNAである請求項2に記載の遺伝子のDNA。
(a)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列を含むDNA。
(b)配列表の配列番号1に記載の塩基配列のうち、塩基番号204〜737からなる塩基配列又は該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質CYCをコードするDNA。 - 微生物細胞内における請求項2又は3に記載のDNAのコピー数が増幅されてなる、高度な温度耐性を有する微生物。
- 微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項4に記載の微生物。
- 請求項4又は5に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
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JP2003363540A JP2005124478A (ja) | 2003-10-23 | 2003-10-23 | タンパク質cyc、その遺伝子、高度な温度耐性を有する微生物、及び該微生物を用いた食酢の製造方法 |
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