JP2005120002A - アミロイド前駆体特殊構造形成阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 2-pyrrolidin-1-yl-N-[4-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-acetylamino)-benzyl]
-phenyl]-acetamideおよびその誘導体を有効成分として含むプリオンタンパク質構造変換抑制剤。
【選択図】 なし
Description
-acetamideが、正常型プリオンの感染型プリオンへの構造変換を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
[1] 正常型プリオンタンパク質(PrPC)の結合ポケットに結合し、フィールディング中間体プリオンタンパク質(PrP*)の生成を抑制することにより、正常型プリオンが感染型プリオンに変換されるのを抑制する化合物、
[2] 結合ポケットが、正常型プリオンタンパク質(PrPC)のA-S2ループとヘリックスBのC端側との間に存在する、[1]の化合物、
[3] 一般式(I)
で表される[1]または[2]の化合物、
[4] 2-pyrrolidin-1-yl-N-[4-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-acetylamino)-benzyl]-phenyl]
-acetamideまたはその誘導体である[3]の化合物、
[5] [1]から[4]のいずれかの化合物を有効成分として含むプリオンタンパク質構造変換抑制剤、
[6] [1]から[4]のいずれかの化合物を有効成分として含むプリオン病の予防または治療剤、
[7] プリオン病が、羊のスクレイピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、GSS、FFI、クールーおよび変異型ヤコブ病からなる群から選択される[6]のプリオン病の予防または治療剤、
[8] [1]から[4]のいずれかの化合物を調製し、該化合物を正常型プリオンタンパク質に接触させることを含む、正常型プリオンが感染型プリオンに変換されるのを抑制する方法、
[9] ドッキングシミュレーション用ソフトウェアを動作可能に有するコンピューターであって、正常型プリオンの3次元立体構造を記憶媒体に格納したコンピューターに候補化合物の3次元立体構造を入力する工程、コンピューター上で正常型プリオンと前期候補化合物のドッキングシミュレーションを行う工程を含む、プリオンタンパク質の構造変換を抑制し得る化合物のスクリーニング方法、ならびに
[10] 候補化合物が、2-pyrrolidin-1-yl-N-[4-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-acetylamino)
-benzyl]-phenyl]-acetamideの誘導体である、[9]のプリオンタンパク質の構造変換を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
-acetylamino)-benzyl]-phenyl]-acetamide)は、正常型プリオンPrPCに結合し、異常型プリオンPrPScへの構造変換を抑制した。従って、GN8420またはその誘導体を含む組成物は、プリオン病の予防または治療剤として有用である。
本発明は、プリオンタンパク質の正常型プリオン(PrPC)から感染型プリオン(PrPSc)への構造変換を抑制する化合物である。本発明の化合物は、PrPCの結合ポケットに結合することによりPrPCの構造の揺らぎを抑制し、PrPCがPrPScに変換されるのを阻止する。すなわち、本発明は、正常型プリオンタンパク質(PrPC)の結合ポケットに結合し、フォールディング中間体プリオンタンパク質(PrP*)の生成を抑制することにより、正常型プリオンが感染型プリオンに変換されるのを抑制する化合物であり、正常型プリオンタンパク質(PrPC)のA-S2ループとヘリックスBのC端側との間に存在する結合ポケットに結合し得る化合物である。
バーチャルリガンドスクリーニング(VLS)により選択した化合物は、Aldrich Chemical Company, Inc.(Milwaukee, U.S.A)、G&J Research Chemicals, Ltd.(Devon, U.K.), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornwall, U.K.), AsInEx Ltd. (Moscow, U.S.S.R.)より入手した。これらの化合物は、in vivo でのスクリーニングのためにDMSO中に溶解し、またスペクトル分析のために、直接スペクトル分析用溶液として溶解させた。リコンビナントマウスプリオンタンパク質(23番目のアミノ酸から231番目のアミノ酸)は、PRIONICS AG (Schlieren, Switzerland)から入手し、H2Oに溶解させた。
〔バーチャルリガンドスクリーニング〕
ACDデータベース(MDLInformation Systems, Inc., San Leandro, CA)中のおおよそ320000の化合物について、マウスPrPC構造(F. Lopez Garcia, R. Zahn, R. Riek, K. Wuthrick, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8334-8339 (2000))との特異的結合を調べリガンドのin silico でのスクリーニングを行った。
不死化したマウス神経細胞株であるGT1-7は、4.5g/mlのグルコース、10%ウシ胎児血清(ICN, UK)および1%のストレプトマイシン-ペニシリン(GIBCO/BRL)を含むDMEM培地で培養した。3から4日ごとに、細胞をトリプシン処理し、1:5に希釈して継代した。安定にFukuoka-1または22L株に感染したGT1-7細胞については、O.Milhavet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13937-13942 (2000)に記載されている。化合物のストック溶液(選択された59の化合物のうち19個)は、100mMのDMSO中に調製し4℃で保存した。使用前に、化合物を培地で希釈した。対照細胞を溶媒のみを含む(0.1%)培地で処理した。約2×105の細胞を6ウェルプレートの各ウェルに入れ化合物を添加15時間後に薬剤処理を開始した。72時間のインキュベーションの後に、細胞を1×Triton/DOC溶解バッファー(0.5% tritonX-100, 0.5% deoxycholic acid, 150mM NaCl, 25mM Tris HCl pH7.5, 2mM EDTA およびペプスタチン、ロイペプシン)150μl中で溶解させた。タンパク質濃度をBCSアッセイ(Pierce)で測定し、各サンプルを2mgタンパク質に標準化した。PrPsc産生を分析するために、タンパク質を10μg/mgの濃度でプロテイナーゼKで30分間37℃で消化した。消化はPMSF(2mM)で阻害し、サンプルについて15% SDS/PAGEゲルを用いてSDS/PAGEを行った。次いで、タンパク質をPVDF膜(Immobilon-P, Amasham, USA)に転写した。PrPresのために、抗マウスPrP抗体(SS28)を用いた。またPrPCの検出のために、SAF32抗体(SPI bio, France)を一次抗体として用いた。シグナルはECL-plus(Amasham)で可視化し、X線フィルム(Konica)に曝露した。シグナルの定量は、膜をFluorochem(Alpha Innotech, US)でスキャンすることにより行った。
全ての円二色性測定は、Aviv202ストップドフロー円二色性スペクトルメーターで行った。遠紫外線スペクトルは、25℃で熱安定化させた1nmのスリット幅および0.1cmのパス長を有するセルを用いて、80から250nmの間で記録した。マウスPrPの変性は5.0μM PrPを含み、10.0μMの候補化合物を含むかまたは含まないサンプルを222nmでのCDシグナルを、1℃/分の加熱速度で25から85℃の温度幅で測定することによりモニターした。全ての測定は、100mM リン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中で行った。Tm値が加熱速度に依存しないことを確認するため、サンプルを加熱速度2、1、0.5℃/分で加熱し熱的に変性させた。熱変性プロファイルは以下の2相モデル(F. Lopez Garcia, R. Zahn, R. Riek, K. Wuthrick, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 8334-8339 (2000))でフィッティングさせた。
PrPCに存在する5箇所の結合ポケットのうち、我々は特に、図1Aに示すA-S2ループとヘリックスBのC端側との間にある緑色の結合ポケットに焦点を当てた。まず、計算機によるドッキングミュレーションにより、ACDデータベースの320000個の化合物の中から検索した。プログラムはマウスプリオンの受容部位ポテンシャル場にたいして可動性リガンド構造を最適化する。結合エネルギーが−32 kcal/mol以下の化合物が624個選ばれた。このあと、受容部位の側鎖を動かすことにより、結合構造をさらに最適化した(M. Schapira, B. M. Raake, H. H. Samuels, and R. Abagyan, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 1008-1013 (2000))。その後、さらに注意深く検討することにより、59種類の候補が選ばれた。これらは、次のインビトロ・テストにかけられた。(そのうちの6個をテーブルに示す)
Claims (10)
- 正常型プリオンタンパク質(PrPC)の結合ポケットに結合し、フォールディング中間体プリオンタンパク質(PrP*)の生成を抑制することにより、正常型プリオンが感染型プリオンに変換されるのを抑制する化合物。
- 結合ポケットが、正常型プリオンタンパク質(PrPC)のA-S2ループとヘリックスBのC端側との間に存在する、請求項1記載の化合物。
- 2-pyrrolidin-1-yl-N-[4-[4-(2-pyrrolidin-1-yl-acetylamino)
-benzyl]-phenyl]-acetamideまたはその誘導体である請求項3記載の化合物。 - 請求項1から4のいずれか1項に記載の化合物を有効成分として含むプリオンタンパク質構造変換抑制剤。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載の化合物を有効成分として含むプリオン病の予防または治療剤。
- プリオン病が、羊のスクレイピー、ウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、GSS、FFI、クールーおよび変異型ヤコブ病からなる群から選択される請求項6記載のプリオン病の予防または治療剤。
- 請求項1から4のいずれか1項に記載の化合物を調製し、該化合物を正常型プリオンタンパク質に接触させることを含む、正常型プリオンが感染型プリオンに変換されるのを抑制する方法。
- ドッキングシミュレーション用ソフトウェアを動作可能に有するコンピューターであって、正常型プリオンの3次元立体構造を記憶媒体に格納したコンピューターに候補化合物の3次元立体構造を入力する工程、およびコンピューター上で正常型プリオンと前期候補化合物のドッキングシミュレーションを行う工程を含む、プリオンタンパク質の構造変換を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
- 候補化合物が、2-pyrrolidin-1-yl-N-[4-[4-(2-pyrrolidin-1-yl
-acetylamino)-benzyl]-phenyl]-acetamideの誘導体である、請求項9記載のプリオンタンパク質の構造変換を抑制し得る化合物のスクリーニング方法。
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