JP2005118050A - Screening method of g protein conjugating receptor ligand and expression cloning method of g protein conjugating receptor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、（１）所望の物質がＧ蛋白質共役型受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたは該アゴニストのアゴニスト作用の阻害する物質であるか否かを決定する方法、（２）Ｇ蛋白質共役型受容体のリガンドであるアゴニスト、アンタゴニスト及び／または該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する物質のスクリーニングする方法、（３）該いずれかの方法に用いられるＰＣ１２由来細胞、及び（４）ある物質と相互作用する受容体（例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体）をエクスプレッションクローニング法により同定する方法に関する。 The present invention includes (1) a method for determining whether a desired substance is an agonist of G protein-coupled receptor, an antagonist or a substance that inhibits the agonistic action of the agonist, and (2) a G protein-coupled receptor. A method of screening for an agonist, an antagonist, and / or a substance that inhibits the agonistic action of the agonist, (3) a PC12-derived cell used in any of the methods, and (4) a receptor that interacts with a substance The present invention relates to a method for identifying a body (eg, G protein-coupled receptor) by expression cloning.
Ｇ蛋白質共役型受容体は、細胞膜上の受容体であり、７ヶ所の細胞膜貫通部を有し、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）結合性の制御蛋白質（Ｇ蛋白質）を介して、リガンドの情報をエフェクター系に伝える役割を担っている。
Ｇ蛋白質は、α、β及びγの３つのサブユニットからなる３量体で、αサブユニットの種類によってＧｓ、Ｇｉ、Ｇｏ及びＧｑ等に大別され、各々受容体特異性（共役するＧ蛋白質受容体）及びエフェクター系（酵素やイオンチャンネル）の種類が異なっている。
The G protein-coupled receptor is a receptor on the cell membrane, has seven cell membrane penetrating parts, and is a ligand via a GTP (
G protein is a trimer composed of three subunits of α, β, and γ, and is roughly classified into Gs, Gi, Go, Gq, etc. depending on the type of α subunit, and each has receptor specificity (conjugate G protein). Receptors) and effector systems (enzymes and ion channels) are different.
例えば、グルカゴン様ペプチド１受容体やβ２アドレナリン受容体はＧｓと共役してエフェクター系であるアデニル酸シクラーゼ系を促進させ、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を増加さる。また、α２アドレナリン受容体はＧｉと共役してアデニル酸シクラーゼ系を抑制し、ｃＡＭＰを減少させる。Ｈ１ヒスタミン受容体はＧｑと共役してエフェクター系であるホスホリパーゼＣ系を促進して、ジアシルグリセロールとイノシトール３リン酸を増加させ、細胞内Ｃａ２＋を増加させる。エフェクター系の種類は、アデニル酸シクラーゼ系、ホスホリパーゼＣ系、及びｃＧＭＰホスホジエステラーゼ系などが主要なものである。 For example, glucagon-like peptide 1 receptor and β2 adrenergic receptor are coupled to Gs to promote the effector system adenylate cyclase system and increase cyclic AMP (cAMP). In addition, the α2 adrenergic receptor is coupled with Gi to suppress the adenylate cyclase system and reduce cAMP. The H1 histamine receptor couples with Gq to promote the effector system phospholipase C system to increase diacylglycerol and inositol triphosphate and increase intracellular Ca 2+ . The main types of effector systems are adenylate cyclase system, phospholipase C system, and cGMP phosphodiesterase system.
Ｇ蛋白質は、αサブユニットにＧＤＰ（グアノシン５’−二リン酸）が結合し、βサブユニット及びγサブユニットと会合している。α、β及びγが会合した状態は不活性型で、受容体にリガンドが結合すると、αに結合していたＧＤＰがＧＴＰに置換され、そしてαサブユニットにＧＴＰが結合したα-GTPと、β-γの結合体とに乖離する。α-GTP及びβ-γはエフェクター系に作用してシグナルを伝達する。この間にαサブユニットの持つGTPase活性によってＧＴＰが分解されＧＤＰになると、α−ＧＤＰはエフェクター系を離れてβ及びγと会合し、再び不活性型となる。この反応を繰り返すことにより、情報の増幅、伝達が行なわれる。
Ｇ蛋白質共役型受容体の生体内分布は特定の器官に局在しているものが多いが、Ｇ蛋白質は生体内に広く分布している。そして、前述したようにＧ蛋白質はＧ蛋白質共役型受容体を通じて、主に一連の細胞内リン酸化反応の引き金となって、遺伝子レベルでの転写調節から筋収縮まで幅広く細胞及び臓器機能の制御を行なっている。
In the G protein, GDP (
The distribution of G protein-coupled receptors in the living body is often localized in specific organs, but G protein is widely distributed in the living body. As described above, G protein is mainly triggered by a series of intracellular phosphorylation reactions through G protein-coupled receptors, and controls cell and organ functions widely from transcriptional regulation to muscle contraction at the gene level. Is doing.
例えば、β１アドレナリン受容体は、心臓、脂肪組織、大脳皮質などに局在し、Ｇｓによってアデニル酸シクラーゼ系が促進され、心拍増加、心収縮力増加、脂肪分解といった効果をもたらす。
このように、Ｇ共役型受容体／Ｇ蛋白質によって制御される情報伝達系は、生体の生理機能の制御に必須のメカニズムであり、換言すれば、該情報伝達系は種々の疾病の発症に広く関与するものである。従って、ある疾患の発症に関与するＧ蛋白質共役受容体が同定されれば、該受容体の生理機能を調節する薬剤（アゴニスト、アンタゴニスト、アゴニスト作用阻害物質など）を開発することにより、該薬剤によりその疾患を治療することが可能となる。
For example, the β1 adrenergic receptor is localized in the heart, adipose tissue, cerebral cortex, etc., and the adenylate cyclase system is promoted by Gs, resulting in effects such as increased heart rate, increased cardiac contractility, and lipolysis.
Thus, the information transmission system controlled by the G-coupled receptor / G protein is an essential mechanism for the control of physiological functions of the living body. In other words, the information transmission system is widely used for the development of various diseases. Is involved. Therefore, once a G protein-coupled receptor involved in the development of a disease is identified, by developing a drug (agonist, antagonist, agonist action inhibitor, etc.) that regulates the physiological function of the receptor, The disease can be treated.
一方、最近、多数の新規なＧ蛋白質共役型受容体（オーファンＧ蛋白質共役型受容体）が単離されてきている（例えば、特開平９−２６８号公報（特許文献１）、特開平９−５１７９５号（特許文献２）等。）。しかしながら、それらの中には該受容体と相互作用するリガンドが未知のもの、即ちオーファンＧ蛋白質受容体のものがほとんどである。
前述したとおり、Ｇ蛋白質共役型受容体は生体の生理機能の制御及び種々の疾患の発症に深く関与することから、該受容体の生理機能を明らかにすることは、種々の疾患の発症の原因を解明することにおいて極めて重要である。
Ｇ蛋白質共役型受容体の生理機能を明らかにするために最も重要なことは、該受容体のリガンド、即ち、該受容体のアゴニストを同定することであり、多くの科学者が精力的に研究を行っている。
On the other hand, many novel G protein-coupled receptors (orphan G protein-coupled receptors) have been isolated recently (for example, JP-A-9-268 (Patent Document 1) and JP-A-9 -51795 (patent document 2) etc.). However, most of them have unknown ligands that interact with the receptor, that is, orphan G protein receptors.
As described above, since the G protein-coupled receptor is deeply involved in the control of physiological functions of the living body and the onset of various diseases, the physiological function of the receptor is the cause of the onset of various diseases. Is very important in elucidating
In order to clarify the physiological function of G protein-coupled receptors, the most important thing is to identify ligands of the receptors, that is, agonists of the receptors. It is carried out.
リガンドが同定されていないＧ蛋白質共役型受容体（即ち、オーファンＧ蛋白質共役型受容体）のリガンド（即ち、該受容体と相互作用する物質であるアゴニストやアンタゴニストなど）を同定するためには、数万種以上の多数の候補物質を試験によりスクリーニングする必要があり、該スクリーニングを迅速を行うことが可能なアッセイ系が必要である。
また、該アッセイは、被験物質と該受容体との相互作用の有無を、該受容体が共役するＧ蛋白質を介して誘導される２次メッセンジャーの活性化若しくは抑制の増減を定量的に検出する必要があることから、該メッセージの増減を高感度で検出可能なアッセイ方法が必要である。
To identify a ligand of a G protein-coupled receptor (ie, orphan G protein-coupled receptor) whose ligand has not been identified (ie, an agonist or antagonist that is a substance that interacts with the receptor). Therefore, it is necessary to screen a large number of candidate substances of tens of thousands or more by a test, and an assay system that can perform the screening rapidly is required.
In addition, the assay quantitatively detects the presence or absence of the interaction between the test substance and the receptor, and the increase or decrease in activation or suppression of the second messenger induced through the G protein to which the receptor is coupled. Therefore, there is a need for an assay method that can detect increase and decrease of the message with high sensitivity.
従来のアッセイ方法としては次のような方法が知られている。
即ち、目的のＧ蛋白質共役型受容体を発現する細胞に試験試料（被験物質）あるいは既知アゴニスト及び試験試料を作用させ、エフェクター系の作用によって生ずるセカンドメッセンジャー、例えばGsあるいはGi共役型受容体の場合にはアデニル酸シクラーゼの活性変動に連携したcAMPの量、Gq共役型受容体の場合にはホスホリパーゼCの活性変動に連携したイノシトール3リン酸やCa2+濃度を測定する手法が汎用されている。
しかしながら、これらの測定方法は極めて煩雑な操作を必要とし大量の被験物質を迅速に評価することは極めて困難であった。また、これらの方法は、目的とする受容体が共役するＧ蛋白質の種類によって、測定されるべきセカンドメッセンジャーを選択する必要がある。従って、該受容体と共役するＧ蛋白質が不明の場合には、Gs、Gi、及びGqの各々を介するメッセージを測定可能な各々のアッセイ系で複数種類ののアッセイを行う必要があった。
さらに、Giと共役する受容体については、該受容体とGiとの共役により誘導される２次メッセージは、アデニル酸シクラーゼの抑制によるcAMPの減少であることから、この減少を定量的に捕らえるためには、Gsを活性化しcAMPを増加させる試薬（フォルスコリンなど）により予めcAMP量を増加させ、該cAMPの増加に対する被験物質によるcAMP量減少量として評価する必要があり、極めて煩雑な操作を必要とした。
The following methods are known as conventional assay methods.
That is, when a test sample (test substance) or a known agonist and test sample are allowed to act on cells expressing the target G protein-coupled receptor, and a second messenger produced by the effector system action, such as Gs or Gi-coupled receptor Is widely used to measure the amount of cAMP linked to fluctuations in adenylate cyclase activity, and in the case of Gq-coupled receptors, inositol triphosphate and Ca 2+ concentrations linked to fluctuations in phospholipase C activity. .
However, these measurement methods require extremely complicated operations, and it has been extremely difficult to quickly evaluate a large amount of test substances. In these methods, it is necessary to select a second messenger to be measured depending on the type of G protein to which the target receptor is coupled. Therefore, when the G protein conjugated to the receptor is unknown, it is necessary to perform a plurality of types of assays in each assay system capable of measuring messages via Gs, Gi, and Gq.
Furthermore, for the receptor coupled to Gi, the secondary message induced by coupling of the receptor to Gi is a decrease in cAMP due to the suppression of adenylate cyclase, so that this decrease can be captured quantitatively. It is necessary to increase the amount of cAMP in advance with a reagent that activates Gs and increases cAMP (such as forskolin), and evaluates it as the amount of cAMP decreased by the test substance against the increase in cAMP. It was.
最近になって、多数の被験物質を迅速に試験するための方法として、レポーター遺伝子を用いたアッセイ系（レポータージーンアッセイ）が開発された（国際特許出願公開WO92/02639号（特許文献３）、及び特表平6-502527（特許文献４）など）。それらの中で優れた方法としては、CRE（cAMPレスポンスエレメント）をプロモーターとして含むレポーター遺伝子を細胞内に導入し、該細胞に被験物質を接触させることにより変動するレポーター遺伝子産物の程度を定量することによりGsやGi系のシグナル伝達の有無として捕らえる方法や、SRE（シーラムレスポンスエレメント）をプロモーターとして含むレポーター遺伝子を用いて前記と同様にGq系からのシグナル伝達の有無を検出する方法がある。
本方法により比較的大量のサンプルを処理することは可能になったが、例えば従来のSREを用いたGq系のシグナル伝達評価系では、被験物質を細胞に接触させて誘導されるレポーター遺伝子産物の増加の程度は、被験物質を接触させない場合もそれの約５〜10倍程度であり、該被験物質が該受容体との相互作用すると判定するにはあまりに低い程度である。
Recently, as a method for rapidly testing a large number of test substances, an assay system using a reporter gene (reporter gene assay) has been developed (International Patent Application Publication No. WO92 / 02639 (Patent Document 3)), and JP 6-502527 (Patent Document 4)). Among them, an excellent method is to introduce a reporter gene containing CRE (cAMP response element) as a promoter into the cell, and to quantify the degree of the reporter gene product that fluctuates by contacting the test substance with the cell. There is a method for detecting the presence or absence of signal transmission of Gs or Gi system, and a method for detecting the presence or absence of signal transmission from the Gq system in the same manner as described above using a reporter gene containing SRE (Sealam Response Element) as a promoter.
With this method, it has become possible to process a relatively large amount of sample. For example, in the conventional Gq-based signal transduction evaluation system using SRE, the reporter gene product induced by contacting a test substance with a cell is used. The degree of increase is about 5 to 10 times that when the test substance is not contacted, and is too low to determine that the test substance interacts with the receptor.
また、セカンドメッセンジャーの１つである細胞内Ca2+濃度の増減を測定する方法に関しても、大量の被験物質を短時間で測定できる方法が最近開発されてきている。しかしながら、この方法も、被験物質による刺激の前後で検出されるシグナルの比（S/N比）は約５倍程度と低いものである。
被験物質の受容体に対する相互作用の有無を明確に決定でき、多数の被験物質を迅速にスクリーニングすることが可能なアッセイ系をミニチュア化するためには、細胞当たりでより大きなシグナルを誘導し、該シグナルの誘導を高いS/N比で得られるアッセイ系を開発する必要がある。
また、この細胞内Ca2+の増減を指標としたアッセイ系では、Gqを介するシグナル伝達の有無しか測定できないという問題を有したままである。
また、同様に、上述したレポータージーンアッセイ系においても、目的とする受容体が共役するG蛋白質の種類によってレポーターを選択する必要があるという問題点、ならびにGiと共役する受容体のリガンドの探索においては、被験物質と該受容体との相互作用の有無を、Gsを介するシグナル伝達により増加させたcAMPの増加に対するcAMPの増加の抑制の程度を指標として評価しなくてはいけない問題点は残されたままであった。
Further, as a method for measuring the increase or decrease in intracellular Ca 2+ concentration, which is one of the second messengers, a method capable of measuring a large amount of a test substance in a short time has recently been developed. However, this method also has a signal ratio (S / N ratio) detected before and after stimulation by the test substance, which is as low as about 5 times.
In order to miniaturize an assay system that can clearly determine whether a test substance interacts with a receptor and can rapidly screen a large number of test substances, it induces a larger signal per cell, There is a need to develop an assay system that can induce the signal with a high S / N ratio.
Further, the assay system using the increase / decrease in intracellular Ca 2+ as an index still has the problem that only the presence or absence of signal transduction via Gq can be measured.
Similarly, in the reporter gene assay system described above, it is necessary to select a reporter according to the type of G protein to which the target receptor is conjugated, and in the search for a ligand of a receptor that is conjugated to Gi. However, there remains a problem that the presence or absence of interaction between the test substance and the receptor must be evaluated using the degree of inhibition of cAMP increase relative to the increase in cAMP as a result of signal transduction via Gs as an index. It was up to.
従って、所望のＧ蛋白質共役型受容体のリガンド（該受容体と相互作用する物質）を同定するために、被験物質と該受容体の相互作用により伝達されるシグナルにより誘導される２次メッセージを大きな絶対値として及び高い感度（高いS/N比）で検出でき、且つ多数種類の被験物質を迅速にスクリーニングできるアッセイ方法の開発が熱望されている。さらにまた、１種類のアッセイ系で、Gs、Gi、及びGqの任意を介するシグナル伝達の有無を同時に捕えられるアッセイ系の樹立が求められている。 Therefore, in order to identify a ligand of a desired G protein-coupled receptor (a substance that interacts with the receptor), a secondary message induced by a signal transmitted by the interaction between the test substance and the receptor is used. Development of an assay method that can be detected as a large absolute value and with high sensitivity (high S / N ratio) and can rapidly screen a large number of kinds of test substances is eagerly desired. Furthermore, there is a need to establish an assay system that can simultaneously detect the presence or absence of signal transduction via any of Gs, Gi, and Gq in one type of assay system.
本発明の第１の目的は、Ｇ蛋白質共役型受容体に対してアゴニスト、アンタゴニストあるいはアゴニスト作用阻害物質を作用させた場合のシグナルの変化を、大きな絶対値として、また高いS/N比で検出できるアッセイ系の樹立である。
第２の目的は、受容体に共役するG蛋白質の種類に関わらずGs、Gi、Gqのいずれかを介するシグナル伝達の有無を１種類の細胞で検出可能なアッセイ系の樹立である。
第３の目的は、GsまたはGqを介するエフェクター系に対して促進的に働くシグナルはもちろんのこと、Giを介するエフェクター系に対して抑制的に働くシグナル（cAMP産生を抑制させるシグナル）もシグナルの増強として検出できるアッセイ系の樹立である。
第４の目的は、上記のアッセイ方法を用いて、（１）所望の物質がＧ蛋白質共役型受容体のアゴニスト、アンタゴニストまたは該アゴニストのアゴニスト作用の阻害する物質であるか否かの決定、及び（２）Ｇ蛋白質共役型受容体のリガンドであるアゴニスト、アンタゴニスト及び／または該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する物質のスクリーニング、を迅速且つ簡便に実施することが可能な方法を提供することを目的とする。
第５の目的は、上記のアッセイ方法を用いて、ある物質と相互作用する受容体（例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体）を、エクスプレッションクローニング法を用いて簡便に同定する方法を提供する。
The first object of the present invention is to detect a change in signal when an agonist, an antagonist or an agonist action inhibitor is applied to a G protein-coupled receptor as a large absolute value and with a high S / N ratio. This is the establishment of a possible assay system.
The second purpose is to establish an assay system that can detect the presence or absence of signal transduction via any of Gs, Gi, and Gq regardless of the type of G protein coupled to the receptor.
The third purpose is not only the signal that acts on the effector system via Gs or Gq but also the signal that acts on the effector system via Gi (a signal that suppresses cAMP production). It is the establishment of an assay system that can be detected as an enhancement.
The fourth object is to use the above assay method, (1) determine whether the desired substance is an agonist of G protein-coupled receptor, an antagonist or a substance that inhibits the agonistic action of the agonist, and (2) An object of the present invention is to provide a method capable of quickly and easily carrying out screening for agonists, antagonists and / or substances that inhibit the agonistic action of the agonists, which are ligands for G protein-coupled receptors. To do.
A fifth object is to provide a method for easily identifying a receptor that interacts with a substance (for example, a G protein-coupled receptor) using the above-described assay method, using an expression cloning method.
本発明者らは、上記目的を達成するために、レポーター遺伝子を用いるアッセイ方法によりＧ蛋白質受容体のリガンドを同定する方法において用いる宿主細胞、プロモーター領域及びそれらの組み合わせについて鋭意検討した結果、所望のＧ蛋白質共役型受容体を発現する宿主細胞としてPC12h細胞を用いた場合に、アゴニスト添加によりレポーター遺伝子産物の発現が極めて顕著に見られることを発見した。
また、レポーター遺伝子を発現を制御するプロモーターとしてzif268プロモーター領域（以下、単にzif268ということもある。）を用いることにより、Gs及びGqの両者のシグナル伝達をレポーター遺伝子産物の発現増加として最も感度よく検出できることを発見した。
In order to achieve the above object, the present inventors have conducted extensive studies on host cells, promoter regions, and combinations thereof used in a method for identifying a ligand of a G protein receptor by an assay method using a reporter gene. When PC12h cells were used as host cells that express G protein-coupled receptors, it was found that the expression of reporter gene products can be seen remarkably when agonists are added.
In addition, by using the zif268 promoter region (hereinafter sometimes simply referred to as zif268) as a promoter that controls the expression of the reporter gene, both Gs and Gq signaling can be detected with the highest sensitivity as an increase in expression of the reporter gene product. I found something I could do.
さらに、宿主細胞としてPC12由来細胞（特に、PC12h細胞）を、またレポーター遺伝子発現の制御プロモーターとしてzif268プロモーター領域を用いた場合に、Gs及びGqの両者のシグナル伝達を極めて高い感度で検出できることを見出した。
加えて、該宿主細胞に、下記いずれかの遺伝子：
（ａ）ＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の一
部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする遺伝
子；
（ｂ）ＧαｓのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の一
部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする遺伝
子；または、
（ｃ）受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活性
化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子。
を導入しておくことにより、Giを介するシグナル伝達もレポーター遺伝子の発現の増加を指標として極めて高い感度で検出可能であることを見出した。
上記新規知見に基づき、Gs、Gi及びGqの任意のＧ蛋白質を介するシグナル伝達を高感度で検出でき、所望のＧ蛋白質共役型受容体と相互作用する物質（アゴニスト）、該物質のアンタゴニスト、または該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する活性を有する物質などを迅速且つ簡便に同定できるアッセイ方法を発明するに到った。
Furthermore, when PC12-derived cells (particularly PC12h cells) are used as host cells and the zif268 promoter region is used as a control promoter for reporter gene expression, both Gs and Gq signaling can be detected with extremely high sensitivity. It was.
In addition, the host cell may have any of the following genes:
(A) a gene encoding a chimeric G protein Gα subunit in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq is substituted with a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαi;
(B) a gene encoding a chimeric G protein Gα subunit in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs is substituted with a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαi; or
(C) A gene encoding a G protein that transmits a signal by activating phospholipase C, coupled to a receptor without receptor specificity.
It has been found that signal transduction via Gi can be detected with extremely high sensitivity using the increase in reporter gene expression as an index.
Based on the above-mentioned novel findings, signal transduction via any G protein of Gs, Gi and Gq can be detected with high sensitivity, a substance (agonist) that interacts with a desired G protein-coupled receptor, an antagonist of the substance, or It came to invent the assay method which can identify the substance etc. which have the activity which inhibits the agonist effect of this agonist rapidly and simply.
本発明のアッセイ方法を用いれば、（１）ある物質が所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストであるか否かの決定、（２）所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニスト、該受容体のアンタゴニスト及び／または該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する活性を有する物質を同定するための多数の被験物質の迅速且つ簡便なスクリーニング、（３）エクスプレッションクローニング法を用いて、ある物質と相互作用する受容体（例えば、Ｇ蛋白質型受容体）を同定（クローニング）するための多数の被験蛋白質（cDNAやcDNAライブラリー）の迅速且つ簡便なスクリーニング、を達成することができる。 Using the assay method of the present invention, (1) determination of whether a substance is an agonist of a desired G protein-coupled receptor, (2) agonist of a desired G protein-coupled receptor, the receptor Rapid and simple screening of a large number of test substances to identify a substance having an activity of inhibiting the agonistic action of the antagonist and / or the agonist, and (3) accepting that interacts with a substance using an expression cloning method A rapid and simple screening of a large number of test proteins (cDNA or cDNA library) for identifying (cloning) a body (for example, G protein type receptor) can be achieved.
即ち、本発明は下記<1>乃至<22>に記載されるとおりの方法または細胞である。
<1>ある物質が所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストであるか否かを決定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料に該物質を接触させる工程；
（ｂ）該物質に接触させた該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナル、及び該物質に接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。
<2>所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストを同定するために物質をスクリーニングする方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に異なる物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及びいずれの物質にも接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。
<3>ある物質が所望のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストであるか否か、または該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストのアゴニスト作用の阻害物質であるか否かを決定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料に該Ｇ蛋白質受容体のアゴニスト及び該物質を接触させる工程；
（ｂ）該物質に接触させた該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナル、及び該物質に接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。
<4>所望のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたは該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストのアゴニスト作用の阻害物質を同定するために物質をスクリーニングする方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー慮域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該該Ｇ蛋白質受容体のアゴニストと異なる物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及びいずれの物質にも接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。
<5>該プロモーター領域が、zif268（EGR-1）プロモーター領域、SREとCREとを含むプロモーター領域またはc-fosプロモーター領域のいずれかであることを特徴とする前記<1>乃至前記<2>のいずれかに記載の方法。
<6>該プロモーター領域が、zif268（EGR-1）プロモーター領域であることを特徴とする前記<1>乃至前記<4>のいずれかに記載の方法。
<7>該ＰＣ１２由来細胞が、さらに下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかの外来性遺伝子を有するものであることを特徴とする前記<1>乃至前記<6>のいずれかに記載の方法：
（ａ）ＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；
（ｂ）ＧαｓのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；または、
（ｃ）受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活
性化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子。
<8>前記（ｃ）に記載のＧ蛋白質が、G16またはG15であることを特徴とする前記<7>に記載の方法。
<9>少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子を有するＰＣ１２由来細胞：
（１）所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子。
<10>該プロモーター領域が、zif268プロモーター領域、SREとCREとを含むプロモーター領域またはc-fosプロモーター領域のいずれかであることを特徴とする前記<9>に記載の細胞。
<11>該プロモーター領域が、zif268プロモーター領域であることを特徴とする前記<9>に記載の細胞。
<12>該ＰＣ１２由来細胞が、さらに下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかの外来性遺伝子を有するものであることを特徴とする前記<9>乃至前記<11>のいずれかに記載の細胞：
（ａ）ＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；
（ｂ）ＧαｓのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；または、
（ｃ）受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活
性化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子。
<13>前記（ｃ）に記載のＧ蛋白質が、G16またはG15であることを特徴とする前記<12>に記載の細胞。
<14>ある物質と相互作用する受容体を同定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｄ）の工程を含むことを特徴とする方法（ここで、該物質は該受容体に対してアゴニストとして作用する。）：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｄ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。
<15>ある物質と相互作用する受容体を同定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｇ）の工程を含むことを特徴とする方法（ここで、該物質は該受容体に対してアゴニストとして作用する。）：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；
（ｄ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）工程（ｃ）で選択された該試料中の細胞が有する外来性遺伝子であ
って、工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする１または
複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｅ）工程（ｄ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ｄ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｇ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ｄ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。
<16>該方法が、所望に応じ前記工程（ｆ）と工程（ｇ）の間に、前記工程（ｄ）乃至（ｆ）からなる同様の操作の１乃至複数回を含むことを特徴とする前記<15>に記載の方法。
<17>該プロモーター領域が、zif268（EGR-1）プロモーター領域、SREとCREとを含むプロモーター領域またはc-fosプロモーター領域のいずれかであることを特徴とする前記<14>乃至前記<16>のいずれかに記載の方法。
<18>該プロモーター領域が、zif268プロモーター領域であることを特徴とする前記<14>乃至前記<16>のいずれかに記載の方法。
<19>該ＰＣ１２由来細胞が、さらに下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれかの外来性遺伝子を有するものであることを特徴とする前記<14>乃至前記<18>のいずれかに記載の方法：
（ａ）ＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；
（ｂ）ＧαｓのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の
一部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする
遺伝子；または、
（ｃ）受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活
性化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子。
<20>前記（ｃ）に記載のＧ蛋白質が、G15またはG16であることを特徴とする前記<19>に記載の方法。
<21>該蛋白質をコードする１または複数の遺伝子が、cDNAまたはcDNAライブラリーであることを特徴とする前記<14>乃至前記<20>のいずれかに記載の方法
<22>該受容体が、Ｇ蛋白質共役型受容体であることを特徴とする前記<14>乃至前記<21>のいずれかに記載の方法。
That is, the present invention is a method or cell as described in <1> to <22> below.
<1> A method for determining whether a substance is an agonist of a desired G protein-coupled receptor, comprising the following steps (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Contacting the substance with a sample comprising a constant number of PC12-derived cells having:
(B) a detectable signal produced by the reporter gene expressed in each cell in the sample contacted with the substance, and a detection produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample not contacted with the substance Quantitatively determining each of the possible signals; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b).
<2> A method for screening a substance for identifying an agonist of a desired G protein-coupled receptor, which comprises the following steps (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples consisting of a constant number of PC12-derived cells having: and contacting each of the samples with a different substance;
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), the detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and the substance not contacted with any substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b).
<3> A method for determining whether a substance is an antagonist of a desired G protein-coupled receptor or whether it is an inhibitor of an agonistic action of an agonist of the G protein-coupled receptor. A method comprising the following steps (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Bringing the G protein receptor agonist and the substance into contact with a sample comprising a constant of PC12-derived cells having:
(B) a detectable signal produced by the reporter gene expressed in each cell in the sample contacted with the substance, and a detection produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample not contacted with the substance Quantitatively determining each of the possible signals; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b).
<4> A method for screening a substance for identifying an antagonist of a desired G protein-coupled receptor antagonist or an agonistic action of an agonist of the G protein-coupled receptor, comprising the following (a) to (c): ) Comprising the steps of:
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
-A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples consisting of constants of PC12-derived cells having a contact with a substance different from the agonist of the G protein receptor to each of the samples;
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), the detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and the substance not contacted with any substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b).
<5> The above <1> to <2>, wherein the promoter region is any one of a zif268 (EGR-1) promoter region, a promoter region containing SRE and CRE, or a c-fos promoter region The method in any one of.
<6> The method according to any one of <1> to <4>, wherein the promoter region is a zif268 (EGR-1) promoter region.
<7> The <1> to <6> above, wherein the PC12-derived cell further has a foreign gene of any one of the following (a) to (c): Method:
(A) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
gene;
(B) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
Gene; or
(C) Conjugate with receptor without receptor specificity and activate phospholipase C
A gene encoding a G protein that transmits a signal by becoming sexual.
<8> The method according to <7>, wherein the G protein according to (c) is G16 or G15.
<9> PC12-derived cells having at least the exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding a desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to a region.
<10> The cell according to <9>, wherein the promoter region is any of a zif268 promoter region, a promoter region containing SRE and CRE, or a c-fos promoter region.
<11> The cell according to <9>, wherein the promoter region is a zif268 promoter region.
<12> The cells according to any one of <9> to <11> above, wherein the PC12-derived cells further have any of the following foreign genes (a) to (c): cell:
(A) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
gene;
(B) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
Gene; or
(C) Conjugate with receptor without receptor specificity, and activate phospholipase C
A gene encoding a G protein that transmits a signal by becoming sexual.
<13> The cell according to <12>, wherein the G protein according to (c) is G16 or G15.
<14> A method for identifying a receptor that interacts with a substance, comprising the following steps (a) to (d): Acts as an agonist.):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a); and (d) Determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (a) possessed by cells in the selected sample.
<15> A method for identifying a receptor that interacts with a substance, the method comprising the following steps (a) to (g): Acts as an agonist.):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each sample determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a);
(D) At least exogenous genes of (1) and (2) below:
(1) A foreign gene possessed by cells in the sample selected in step (c)
1 which encodes the protein according to (1) of step (a) or
A plurality of genes; and (2) promoters of genes whose expression is induced by stimulation via G protein
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(E) For each sample contacted with the substance in step (d), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(F) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (e) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (d); and (g) A step of determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (d) possessed by cells in the selected sample.
<16> The method may include one or more of the same operations including the steps (d) to (f) between the step (f) and the step (g) as desired. The method according to <15> above.
<17> The <14> to <16>, wherein the promoter region is any of a zif268 (EGR-1) promoter region, a promoter region containing SRE and CRE, or a c-fos promoter region The method in any one of.
<18> The method according to any one of <14> to <16>, wherein the promoter region is a zif268 promoter region.
<19> The <14> to <18> above, wherein the PC12-derived cell further comprises any of the following foreign genes (a) to (c): Method:
(A) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
gene;
(B) A part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs is the C-terminal amino acid sequence of Gαi.
Encodes a chimeric G protein Gα subunit partially substituted
Gene; or
(C) Conjugate with receptor without receptor specificity and activate phospholipase C
A gene encoding a G protein that transmits a signal by becoming sexual.
<20> The method according to <19>, wherein the G protein according to (c) is G15 or G16.
<21> The method according to any one of <14> to <20> above, wherein the one or more genes encoding the protein is cDNA or cDNA library
<22> The method according to any one of <14> to <21>, wherein the receptor is a G protein-coupled receptor.
細胞を用いるレポータージーンアッセイ（cell-based reporter gene assay）を用いて、Ｇ蛋白質共役型受容体とリガンドの相互作用により誘導されるＧ蛋白質を介する情報伝達系の活性化の程度を解析する方法において、該レポーター遺伝子の発現を制御するプロモーターとしてＧ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域）を使用すること、また宿主細胞としてPC12細胞またはそれからサブクローニングされる細胞（例えば、PC12h細胞及び該PC12h細胞からサブクローニングされる細胞）を用いることにより、該Ｇ蛋白質を介する情報伝達系の活性化（レポーター遺伝子の発現の増大を指標に検出されるシグナル）の程度を極めて高感度で検出することが可能となった。
具体的には、本発明のアッセイで用いられる上記のG蛋白質共役型受容体発現PC12由来細胞）に該受容体に対するリガンドを接触させることにより検出される該シグナルの値の絶対値が極めて大きくなり、該リガンドと接触させない場合に検出される該シグナルとの比（即ち、S/N比）は、少なくとも約20乃至30倍以上と高いものである。
また、上記レポータージーンアッセイに用いられる宿主細胞中に、(1)GqまたはGsの各々のαサブユニットとGiのαサブユニットとからなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする遺伝子、または(2)G15やG16などのように受容体特異性を有さずに受容体と共役しフォスフォリパーゼＣを活性化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子、のいずれかを導入することにより、Giを介するシグナル伝達もレポーター遺伝子の発現の増加を指標として極めて高い感度で検出可能となった。
即ち、この方法を用いることにより、共役するＧ蛋白質に拘束されることなく、任意のＧ蛋白質（例えば、Gq、Gs及びGi）を介するシグナル伝達の有無を１種類の細胞を用いる１つのアッセイ系で極めて高感度で検出可能である。
In a method for analyzing the degree of activation of a signal transduction system via a G protein induced by an interaction between a G protein-coupled receptor and a ligand using a cell-based reporter gene assay, Use of a promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region) as a promoter for controlling the expression of the reporter gene, and PC12 cells or Then, by using a cell that is subcloned (for example, a PC12h cell and a cell that is subcloned from the PC12h cell), activation of the signal transduction system via the G protein (signal detected by using increased reporter gene expression as an indicator) ) Can be detected with extremely high sensitivity.
Specifically, the absolute value of the signal value detected by bringing the G protein-coupled receptor-expressing PC12-derived cell used in the assay of the present invention into contact with a ligand for the receptor becomes extremely large. The ratio of the signal detected when not contacted with the ligand (ie, S / N ratio) is as high as at least about 20 to 30 times or more.
In the host cell used for the reporter gene assay, (1) a gene encoding a chimeric G protein Gα subunit comprising each α subunit of Gq or Gs and an α subunit of Gi, or (2) G15 By introducing any of the genes encoding G protein that transmits a signal by activating phospholipase C by coupling with the receptor without receptor specificity, such as G16 and G16, Gi-mediated signal transduction can also be detected with extremely high sensitivity using the increase in reporter gene expression as an indicator.
That is, by using this method, one assay system using one kind of cell for the presence or absence of signal transduction via any G protein (for example, Gq, Gs and Gi) without being restricted by the conjugated G protein. It can be detected with extremely high sensitivity.
従って、本発明のアッセイ方法及び該アッセイに用いられる上記のような特徴を有する細胞を用いることにより、下記(1)乃至(4)を極めて簡便且つ迅速に実施することが可能となった。
（１）所望の物質がＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストであるか否かの決定。
（２）所望の物質がＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたは該受容体のアゴニストのアゴニスト作用を阻害する活性を有する物質であるか否かの決定。
（３）所望のＧ蛋白質共役型受容体のリガンド（例えば、アゴニスト）を同定するための多数の物質のスクリーニング。
（４）所望のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたは該受容体の既知アゴニストのアゴニスト作用を阻害する物質を同定するための多数の物質のスクリーニング。
例えば、ヒスタミン受容体、アドレナリン受容体、セロトニン受容体などのようにＧ蛋白質共役型受容体の多くは種々の疾患と密接に関連しており、またそのようなＧ蛋白質共役型受容体を医薬品のターゲットし該受容体の機能を制御する薬剤が多く開発販売されている。
従って、上記(1)乃至(4)の実施は、即ち、任意のＧ蛋白質共役型受容体をターゲットとする医薬品の同定及びスクリーニング方法であり、医薬品開発において不可欠なステップである。即ち、本発明の方法及び細胞は、医薬品開発において必須且つ極めて有用な方法及び細胞である。
Therefore, the following (1) to (4) can be carried out very simply and rapidly by using the assay method of the present invention and the cells having the above-described characteristics used in the assay.
(1) Determination of whether a desired substance is an agonist of a G protein-coupled receptor.
(2) Determination of whether or not the desired substance has an activity of inhibiting the agonistic action of an antagonist of the G protein-coupled receptor or an agonist of the receptor.
(3) Screening of a large number of substances to identify a ligand (eg, agonist) of a desired G protein-coupled receptor.
(4) Screening of a large number of substances for identifying a substance that inhibits the agonistic action of a desired G protein-coupled receptor antagonist or a known agonist of the receptor.
For example, many G protein-coupled receptors such as histamine receptor, adrenergic receptor, serotonin receptor and the like are closely related to various diseases, and such G protein-coupled receptors are used in pharmaceuticals. Many drugs that target and control the function of the receptor have been developed and sold.
Therefore, the implementation of the above (1) to (4) is a method for identifying and screening a drug targeting any G protein-coupled receptor, and is an indispensable step in drug development. That is, the method and cell of the present invention are essential and extremely useful methods and cells in drug development.
また、本発明のアッセイ方法及び該アッセイに用いられる上記のような特徴を有する細胞を用いることにより、下記(5)を極めて簡便且つ迅速に実施することが可能となった。 In addition, by using the assay method of the present invention and the cells having the above-described characteristics used in the assay, the following (5) can be carried out very simply and rapidly.
(5)ある物質と相互作用する受容体（例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体）の、エクスプレッションクローニング法を用いた同定。
前述したとおり、G蛋白質共役型受容体は種々の疾患の発症と密接に関連していることから、上記(5)が可能になることで、種々の疾患の治療のための医薬品開発のターゲットとしての受容体を容易に同定することが可能となる。
(5) Identification of a receptor that interacts with a substance (for example, G protein-coupled receptor) using an expression cloning method.
As mentioned above, G protein-coupled receptors are closely related to the onset of various diseases. It becomes possible to easily identify the receptors.
以下、本発明で用いる語句の意味及び本発明の具体的態様を明らかにすることにより本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by clarifying the meanings of the terms used in the present invention and specific embodiments of the present invention.
１．「ＰＣ１２由来細胞」
本発明における「ＰＣ１２由来細胞」とは、ラット副腎褐色細胞腫由来のPC12細胞株（ATCC CRL-1721（非特許文献１）; Proc. Natl. Acad.
Sci.USA., Vol.73, p.2424-2426, 1976（非特許文献２）; Science,
Vol.229, p.393-395, 1985（非特許文献３）; EMBO J., Vol.2,
p.643-648, 1983（非特許文献４））または該PC12細胞株からからサブクローニングされた任意の細胞株を意味する。
好ましくは、該サブクローニングされた細胞であって、且つ下記の性質を有するものである。
即ち、該細胞に、（１）所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子、並びに（２）後述する「Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子」を外来的に導入して得た組換え細胞に、該Ｇ蛋白質共役型受容体のリガンドを接触させた場合に、発現が誘導される該レポーター遺伝子産物の量が、宿主細胞として該PC12細胞株を用いて検出されるレポーターの量よりも高い値が得られる細胞である。
該サブクローニングされた細胞としては、例えば、PC12h細胞株（Brain Research, Vol.222, p.225-233, 1981(非特許文献５)）並びに該PC12h細胞株からサブクローニングされた種々細胞を好ましい態様として例示することができる。
1. “PC12-derived cells”
In the present invention, “PC12-derived cell” refers to a rat adrenal pheochromocytoma-derived PC12 cell line (ATCC CRL-1721 (Non-patent Document 1); Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., Vol. 73, p.2424-2426, 1976 (Non-Patent Document 2); Science,
Vol.229, p.393-395, 1985 (non-patent document 3); EMBO J., Vol.2,
p.643-648, 1983 (Non-patent Document 4)) or any cell line subcloned from the PC12 cell line.
Preferably, the subcloned cells have the following properties.
That is, the cells are operably linked to (1) a gene encoding a desired G protein-coupled receptor, and (2) “a promoter region of a gene whose expression is induced by stimulation through G protein” described later. When the G protein-coupled receptor ligand is contacted with a recombinant cell obtained by exogenously introducing the reporter gene ", the amount of the reporter gene product whose expression is induced is determined as a host cell. A cell in which a value higher than the amount of reporter detected using the PC12 cell line is obtained.
Preferred examples of the subcloned cells include PC12h cell line (Brain Research, Vol. 222, p.225-233, 1981 (Non-patent Document 5)) and various cells subcloned from the PC12h cell line. It can be illustrated.
２．「Ｇ蛋白質共役型受容体」及び「Ｇ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子」
本発明における「Ｇ蛋白質共役型受容体」は、細胞膜上に存在する受容体であって、ＧＴＰ（グアノシン５'−三リン酸）結合性の制御蛋白質（Ｇ蛋白質）を介して、該受容体と相互作用するリガンドの情報をエフェクター系に伝える機能を有する蛋白質を意味する。これまでに同定されているほとんどのＧ蛋白質共役型受容体は細胞膜を７回貫通する構造を有している。
本発明におけるＧ蛋白質共役型受容体は、細胞が生来発現する内在性の受容体、または所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子を該細胞に導入することにより該細胞に発現させた受容体のいずれかを意味する。
2. “G protein-coupled receptor” and “gene encoding G protein-coupled receptor”
The “G protein-coupled receptor” in the present invention is a receptor present on a cell membrane, and the receptor is coupled via a GTP (
The G protein-coupled receptor in the present invention is an endogenous receptor that is naturally expressed by a cell, or a receptor that is expressed in the cell by introducing a gene encoding a desired G protein-coupled receptor into the cell. Mean any body.
本発明における「Ｇ蛋白質共役型受容体」には、既知の該受容体及び未だ同定されていない該受容体のいずれもが包含される。
既知のＧ蛋白質共役型受容体の一例としては、既に構造及び機能が解明されている受容体（例えば、α-アドレナリン受容体、β-アドレナリン受容体、ドパミン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、タキキニン受容体、グルタミン酸受容体、エンドセリン受容体、血小板活性化因子（ＰＡＦ）受容体、トロンビン受容体、ＦＳＨ受容体等）、及び構造は知られているがそのリガンド及び／または生理機能が不明の受容体（例えば、種々のオーファンＧ蛋白質共役型受容体）を挙げることができる。
The “G protein-coupled receptor” in the present invention includes both known and unidentified receptors.
Examples of known G protein-coupled receptors include receptors whose structures and functions have already been elucidated (for example, α-adrenergic receptor, β-adrenergic receptor, dopamine receptor, muscarinic acetylcholine receptor, serotonin) Receptors, histamine receptors, tachykinin receptors, glutamate receptors, endothelin receptors, platelet activating factor (PAF) receptors, thrombin receptors, FSH receptors, etc.) and their structures but their ligands and Examples thereof include receptors with unknown physiological functions (for example, various orphan G protein-coupled receptors).
３．「Ｇ蛋白質共役型受容体リガンド」
本明細書中で用いる「Ｇ蛋白質共役型受容体リガンド」とは、Ｇ蛋白質共役型受容体と相互作用する任意のアゴニストまたは該受容体の任意のアンタゴニストを意味する。
3. "G protein-coupled receptor ligand"
As used herein, “G protein-coupled receptor ligand” means any agonist that interacts with a G protein-coupled receptor or any antagonist of the receptor.
４．「キメラＧ蛋白質Ｇαサブユニット」
本発明における「キメラＧ蛋白質Ｇαサブユニット」とは、ある種のＧ蛋白質のαサブユニット（例えば、ＧαｑあるいはＧαｓ）の一部のアミノ酸配列を、異なる種類のＧ蛋白質のαサブユニット（例えば、Ｇαｉ）の一部のアミノ酸配列に置き換えた構造を有するＧ蛋白質αサブユニットを意味する。
本発明における「キメラＧ蛋白質Ｇｑｉ」とは、Ｇαｑ（Ｇｑ蛋白質のαサブユニット）のＣ末端アミノ酸配列の一部が、ＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の一部に置換えられた構造を有するキメラＧ蛋白質αサブユニットを意味する。また、「キメラＧ蛋白質Ｇｓｉ」とは、同様にＧαｓ（Ｇｓ蛋白質のαサブユニット）のＣ末端アミノ酸配列の一部が、ＧαｉのＣ末端アミノ酸配列と置換えられた構造を有するキメラＧ蛋白質αサブユニットを意味する。
4). “Chimeric G protein Gα subunit”
In the present invention, the term “chimeric G protein Gα subunit” refers to a partial amino acid sequence of an α subunit of a certain G protein (eg, Gαq or Gαs), and an α subunit of a different type of G protein (eg, G protein α subunit having a structure in which a part of the amino acid sequence of Gαi) is replaced.
The “chimeric G protein Gqi” in the present invention is a chimeric G protein having a structure in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq (the α subunit of Gq protein) is replaced with a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαi. means α subunit. Similarly, “chimeric G protein Gsi” is a chimeric G protein αsub having a structure in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs (α subunit of Gs protein) is replaced with the C-terminal amino acid sequence of Gαi. Means a unit.
Ｇ蛋白質ＧαｑのＣ末端のアミノ酸を対応するＧ蛋白質Ｇαｉ2のＣ末端のアミノ酸に置換したαｑ／αｉ2キメラＧ蛋白質は、Ｇｉ共役型受容体と共役してＧｑ情報伝達系を活性化すること、並びにαｉ2サブユニットのＣ末端アミノ酸配列中の第３位のグリシンが受容体特異性を変換することに寄与していると考えられることが知られている（Nature, Vol.363, p.274-276, 1993(非特許文献６)）。
従って、置換されるべきＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部は、この３位のグリシンを含む範囲であることが特に望ましい。置換されるべきアミノ酸の数としては、少なくと約３乃至約23個のアミノ酸、好ましくは約３乃至約11個のアミノ酸、さらに好ましくは約４乃至約９個のアミノ酸である。
The αq / αi 2 chimeric G protein in which the C-terminal amino acid of the G protein Gαq is substituted with the corresponding C-terminal amino acid of the G protein Gαi 2 is coupled to a Gi-coupled receptor and activates the Gq signal transduction system. Glycine at the 3rd position in the C-terminal amino acid sequence of the αi 2 subunit is known to contribute to the conversion of receptor specificity (Nature, Vol. 363, p. 274-276, 1993 (Non-Patent Document 6)).
Therefore, it is particularly desirable that a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq to be substituted is within a range including glycine at the 3-position. The number of amino acids to be substituted is at least about 3 to about 23 amino acids, preferably about 3 to about 11 amino acids, more preferably about 4 to about 9 amino acids.
Ｇαｑ及びＧαｉは各々一群のファミリーを構成している。これらのファミリーは、その種類によって、組織分布が異なっている。
例えば、Ｇｉファミリーであるαｉ2及びαｉ3は広く組織に分布するが、αｏ1及びαｏ2は各々主に脳及び神経組織に発現している。一方、Ｇαｑファミリーのαｑ、α11は広く分布するが、α14は主に肺、腎臓、肝臓組織に発現している。
上述の「キメラＧ蛋白質Ｇαサブユニット」を構成するＧαｑ及びＧαｉとしては、各々のファミリーに属するいずれのＧαｑ及びＧαｉを用いてもよく、受容体の発現する組織に応じて選択することができる。好ましくは、広く組織に分布するものである。本発明におけるキメラＧαｑ／Ｇαiサブユニットとしては、ＧαｑとＧαｉ2とからなるキメラＧ蛋白質αサブユニットが好ましい。
Gαq and Gαi each constitute a group of families. These families have different tissue distributions depending on their types.
For example, the Gi family αi 2 and αi 3 are widely distributed in tissues, while αo 1 and αo 2 are mainly expressed in brain and nerve tissues, respectively. On the other hand, αq and α11 of the Gαq family are widely distributed, while α14 is mainly expressed in lung, kidney and liver tissues.
As Gαq and Gαi constituting the above-mentioned “chimeric G protein Gα subunit”, any Gαq and Gαi belonging to each family may be used, and can be selected according to the tissue in which the receptor is expressed. Preferably, it is widely distributed in the tissue. The chimeric Gαq / Gαi subunit in the present invention is preferably a chimeric G protein α subunit consisting of Gαq and Gαi 2 .
上述したＧαqと同様に、Ｇαｓについても、置換されるべきＣ末端アミノ酸配列としては、少なくと約３乃至約23個、好ましくは約３個乃至約11個、さらに好ましくは約４個乃至約９個のアミノ酸を対応するＧ蛋白質ＧαｉのＣ末端のアミノ酸配列に置換すればよい。
なお、キメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットの構成は上記に限定されるものではない。
Similar to Gαq described above, Cα-terminal amino acid sequence to be substituted for Gαs is at least about 3 to about 23, preferably about 3 to about 11, more preferably about 4 to about 9. One amino acid may be substituted with the amino acid sequence at the C-terminal of the corresponding G protein Gαi.
The configuration of the chimeric G protein Gα subunit is not limited to the above.
５．「受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活性化
することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質」
本発明における標記のＧ蛋白質は、任意のＧ蛋白質共役型受容体と共役する能力を有し、該共役により受容体がら受けたシグナルを、Ｇｑを介するシグナル伝達経路、即ちフォスフォリパーゼＣのの活性化という形でさらに下流に伝達する能力を有するＧ蛋白質である。
好ましい態様としては、例えば、Ｇ１５やＧ１６（J. Biol. Chem., Vol.270,
p.16175-16180, 1995（非特許文献７））を挙げることができるが、この限りではない。
5). "G protein that transmits a signal by activating phospholipase C by coupling to the receptor without receptor specificity"
The title G protein in the present invention has the ability to couple with an arbitrary G protein-coupled receptor, and the signal received by the receptor by the coupling is converted into a signal transduction pathway via Gq, ie, phospholipase C. It is a G protein having the ability to transmit further downstream in the form of activation.
Preferred embodiments include, for example, G15 and G16 (J. Biol. Chem., Vol. 270,
p. 16175-16180, 1995 (Non-patent Document 7)), but is not limited thereto.
６．「Ｇ蛋白質を介した刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域」
本発明における標記プロモーター領域としては、最初期遺伝子（immediate-early gene）のプロモーター領域が挙げられる。
本発明で用いられる最初期遺伝子のプロモーターとしては、例えば、c-fosプロモーター領域やzif268プロモーター領域（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
Vol.86, p.377-381, 1989（非特許文献８）；「EGR-1」、「NGF1-A」、「Krox24」、「Tis8」または「cef5」とも称される。）が挙げられる。特に好ましい態様としては、zif268(EGR-1）プロモーター領域が挙げられる。また、本発明で使用されるプロモータとしてには、前記プロモーターの任意の動物種の対応物も包含される。
ここで「プロモーター領域」とは、プロモーター活性を発現するために必須な最小の塩基配列を含む任意の領域を意味しする。例えば、該遺伝子の転写部位に対して上流約500bp乃至約２kbの領域の一部または全部を用いることが可能である。
さらに本発明における標記プロモーター領域としては、ミニマルプロモーターの上流に転写因子結合配列であるSRE（serum response element）及び／またはCRE（cAMP response element）を有するプロモーター領域が挙げられる。
6). "Promoter region of gene whose expression is induced by stimulation through G protein"
The title promoter region in the present invention includes a promoter region of an immediate-early gene.
Examples of the early gene promoter used in the present invention include c-fos promoter region and zif268 promoter region (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
Vol.86, p.377-381, 1989 (Non-Patent Document 8); also called “EGR-1,” “NGF1-A,” “Krox24,” “Tis8,” or “cef5”. ). A particularly preferred embodiment is the zif268 (EGR-1) promoter region. The promoter used in the present invention also includes the counterpart of any animal species of the promoter.
Here, the “promoter region” means an arbitrary region containing the minimum base sequence essential for expressing promoter activity. For example, a part or all of the region of about 500 bp to about 2 kb upstream from the transcription site of the gene can be used.
Further, the title promoter region in the present invention includes a promoter region having a transcription factor binding sequence SRE (serum response element) and / or CRE (cAMP response element) upstream of the minimal promoter.
７．「レポーター遺伝子」
本発明における「レポーター遺伝子」は、検出可能な蛍光を発するレポーター蛋白質をコードする遺伝子を意味する。具体的には、例えば、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、またはクラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）などを挙げることができる。さらには、例えば、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及びβラクタマーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
7). "Reporter gene"
The “reporter gene” in the present invention means a gene encoding a reporter protein that emits detectable fluorescence. Specific examples include luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, and the like. Further examples include a gene encoding β-galactosidase, a gene encoding chloramphenicol acetyltransferase, and a gene encoding β-lactamase.
８．「アゴニスト作用阻害物質」／「アゴニストのアゴニスト作用を阻害する物質」
本発明における標記物質は、アゴニストに直接作用してアゴニストの活性を阻害あるいは喪失させる物質を意味し、例えばアゴニストに対する抗体等を意味する。
8). “Agonist action inhibiting substance” / “substance inhibiting the agonist action of an agonist”
The title substance in the present invention means a substance that acts directly on an agonist to inhibit or lose the activity of the agonist, for example, an antibody against the agonist.
９．「レポータージーンアッセイ」
本発明で言う「レポータージェーンアッセイ（reporter gene assay）」とは、下記のような方法を意味する。
本発明の一部である前記<9>乃至<13>に記載の細胞に、被験物質を接触させ、該化合物の作用に依存して発現されるレポーター蛋白質の量を、該蛋白質が発する蛍光の量を測定することにより間接的に測定することにより、該被験物質のＧ蛋白質共役型受容体との相互作用の有無を分析する方法である（例えば、米国特許第5,436,128号（特許文献５）及び米国特許第5,401,629号（特許文献６）を参照できる）。
また、該レポータージーンアッセイは、マニュアル作業でも可能であるが、機械（ロボット）を用いて自動で行う所謂ハイスループットスクリーニング（High Throughput Screening）（組織培養工学, Vol.23,
No.13, p.521-524（非特許文献９）；米国特許第5,670,113号（特許文献７））を用いることによりより迅速、簡便に行うことができる。
9. "Reporter Gene Assay"
The “reporter gene assay” as used in the present invention means the following method.
A test substance is brought into contact with the cells according to <9> to <13>, which are a part of the present invention, and the amount of reporter protein expressed depending on the action of the compound is determined by the fluorescence emitted by the protein. A method of analyzing the presence or absence of interaction of the test substance with a G protein-coupled receptor by indirectly measuring the amount (for example, US Pat. No. 5,436,128 (Patent Document 5) and U.S. Pat. No. 5,401,629 can be referred to).
In addition, the reporter gene assay can be performed manually, but the so-called High Throughput Screening (Tissue Culture Engineering, Vol. 23,
No. 13, p. 521-524 (Non-patent Document 9); US Pat. No. 5,670,113 (Patent Document 7)) can be performed more quickly and easily.
１０．「物質」
本発明の方法により同定またはスクリーニングされる「物質」とは、自然界に存在する天然の物質（蛋白質、抗体、ペプチド、天然化合物など）あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。
具体的には、例えば、化学的に合成された任意の「化合物」を挙げることができる。該化合物の種類及び分子量などについては特に限定されないが、分子量について言えば、医薬品として用いられる可能性のある化合物の分子量は、分子量約50乃至約3000以下であり、さらに一般的には分子量約100乃至約2000であり、さらに一般的には分子量約100乃至約1000である。
該物質が、蛋白質、抗体またはペプチドである場合には、生体組織や細胞から単離されるもの、及び遺伝子組換えや化学的合成により調製されるものも包含する。さらにまた、それらの化学修飾体も包含する。
ペプチドとしては、例えば、約３乃至約500個のアミノ酸、好ましくは約３乃至約300個のアミノ酸、さらに好ましくは約３乃至約200個のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。
10. "material"
The “substance” identified or screened by the method of the present invention means a natural substance existing in nature (protein, antibody, peptide, natural compound, etc.) or any artificially prepared substance.
Specifically, for example, any “synthesized” chemically synthesized can be mentioned. The type and molecular weight of the compound are not particularly limited, but as far as the molecular weight is concerned, the molecular weight of a compound that may be used as a pharmaceutical is about 50 to about 3000, more generally about 100 molecular weight. To about 2000, more typically about 100 to about 1000 molecular weight.
When the substance is a protein, antibody or peptide, it includes those isolated from biological tissues and cells, and those prepared by genetic recombination or chemical synthesis. Furthermore, those chemical modifications are also included.
Examples of the peptide include peptides consisting of about 3 to about 500 amino acids, preferably about 3 to about 300 amino acids, and more preferably about 3 to about 200 amino acids.
以下に本発明で用いられる各種実験ツールの意味及び／またはその調製のための一般的な方法を例示する。しかしながら、本発明で用いられる該ツールは、下記に例示される方法で調製されるものに限定されるものではないことは言うまでもない。
（１）各種遺伝子のクローニング及び単離
本発明で用いられる各種遺伝子（例えば、所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子、所望の蛋白質をコードする遺伝子、レポーター遺伝子、プロモーター領域など）は、いかなる方法で得られるものであってもよい。また、その取得においては、既知の塩基配列情報を用いることもできるし、また全く新たにクローニングすることもできる。
例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡ及びこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
本発明で用いられるある蛋白質をコードするＤＮＡは、常法に従って該蛋白質をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
The meaning of various experimental tools used in the present invention and / or general methods for their preparation will be exemplified below. However, it goes without saying that the tools used in the present invention are not limited to those prepared by the method exemplified below.
(1) Cloning and isolation of various genes Various genes used in the present invention (for example, a gene encoding a desired G protein-coupled receptor, a gene encoding a desired protein, a reporter gene, a promoter region, etc.) It may be obtained by any method. Moreover, in the acquisition, known base sequence information can be used, or a completely new cloning can be performed.
For example, complementary DNA (cDNA) prepared from mRNA, DNA prepared from genomic DNA, DNA obtained by chemical synthesis, DNA obtained by amplifying by PCR using RNA or DNA as a template, and appropriate combinations of these methods All DNAs constructed in this way are also included.
DNA encoding a protein used in the present invention can be obtained by a method of cloning cDNA from mRNA encoding the protein according to a conventional method, a method of isolating genomic DNA and splicing, a method of chemical synthesis, etc. Can do.
例えば、該蛋白質をコードするｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、所望の蛋白質を発現・産生する前述のような組織あるいは細胞から該蛋白質をコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（Chirgwinら、Biochemistry,Vol.18, p.5294, 1979（非特許文献１０））、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
For example, the following method is exemplified as a method for cloning cDNA from mRNA encoding the protein.
First, mRNA encoding the protein is prepared from the tissues or cells as described above that express and produce the desired protein. The mRNA is prepared using, for example, a guanidine thiocyanate method (Chirgwin et al., Biochemistry, Vol. 18, p. 5294, 1979 (Non-patent Document 10)), a total RNA prepared using a known method such as the hot phenol method or the AGPC method. Can be performed by affinity chromatography using oligo (dT) cellulose, poly U-sepharose or the like.
次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（Mol.Cell.Biol.,
Vol.2, p.161, 1982（非特許文献１１）; Mol.Cell. Biol., Vol.3,
p.280, 1983（（非特許文献１２））やHoffmanらの方法（Gene, Vol.25, p.263, 1983（非特許文献１３））等によりｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
Then, using the obtained mRNA as a template, for example, a known method such as using reverse transcriptase, for example, the method of Okayama et al. (Mol. Cell. Biol.,
Vol.2, p.161, 1982 (Non-patent Document 11); Mol. Cell. Biol., Vol.3,
p.280, 1983 (Non-patent Document 12) and the method of Hoffman et al. (Gene, Vol. 25, p.263, 1983 (Non-patent Document 13)) etc. Convert to cDNA. This cDNA is incorporated into a plasmid vector, phage vector or cosmid vector, and transformed into E. coli, or after in vitro packaging, a cDNA library is prepared by transfecting E. coli.
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてpUC19、λgt10、λgt11等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で該蛋白質をコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。 The plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and retained in the host, and any phage vector that can be propagated in the host may be used. Examples of commonly used cloning vectors include pUC19, λgt10, λgt11, and the like. However, when subjected to immunological screening described later, a vector having a promoter capable of expressing a gene encoding the protein in a host is preferable.
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えばManiatisらの方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring
Harbor Laboratory, p.1.53, 1989（非特許文献１４））に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunhらの方法（DNA Cloning, a practical approach,
Vol.1, p.49, 1985（非特許文献１５））などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、E.coli: HB101, DH5αまたはMC1061/P3等）等の適当な宿主に導入する。
As a method for incorporating cDNA into a plasmid, for example, the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring
And the like described in Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989 (Non-Patent Document 14). As a method of incorporating cDNA into a phage vector, the method of Hyunh et al. (DNA Cloning, a practical approach,
Vol.1, p.49, 1985 (Non-patent Document 15)). For convenience, a commercially available cloning kit (for example, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) can also be used. The recombinant plasmid and phage vector thus obtained are introduced into an appropriate host such as a prokaryotic cell (for example, E. coli: HB101, DH5α, MC1061 / P3, etc.).
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol.1.74, 1989（非特許文献１６））に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン製、アマシャム製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
As a method for introducing a plasmid into a host, (Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 1.74, 1989 (Non-patent Document 16)), and the calcium chloride method, calcium chloride / rubidium chloride method, lipofection method, electroporation method and the like. Examples of a method for introducing a phage vector into a host include a method of introducing phage DNA into an expanded host after in vitro packaging. In vitro packaging can be easily performed by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, manufactured by Stratagene, Amersham, etc.).
一方、例えば、ある種の刺激（例えば、サイトカインなどによる刺激）に依存して発現が増強される蛋白質をコードする遺伝子（cDNA）を取得する場合には、該刺激を与えた細胞由来のmRNAを基に作製したcDNAライブラリー（tester cDNA library）と未刺激の細胞由来のmRNAを基に作製したcDNAライブラリー（driver cDNA library）の２つのcDNAライブラリーを用い、例えば、抑制PCR効果（Nucleic Acids Res., Vol.23,
p.1087-1088, 1995（非特許文献１７））を利用したサプレッションサブトラクトハイブリダイゼーション法（supression subtract hybridization (SSH)）（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.6025-6030, 1996（非特許文献１８）; Anal. Biochem., Vol.240, p.90-97, 1996（非特許文献１９））により同定することができる。
On the other hand, for example, when obtaining a gene (cDNA) encoding a protein whose expression is enhanced depending on a certain kind of stimulus (for example, stimulation by cytokines, etc.), mRNA derived from the cell to which the stimulus is applied is obtained. Using two cDNA libraries, a cDNA library prepared based on tester cDNA library and a cDNA library generated based on mRNA from unstimulated cells (driver cDNA library), for example, suppressive PCR effect (Nucleic Acids Res., Vol.23,
p.1087-1088, 1995 (Non-patent Document 17)), suppression subtract hybridization (SSH) (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.6025-6030, 1996 (Non-patent Document 18); Anal. Biochem., Vol.240, p.90-97, 1996 (Non-patent Document 19)) Can be identified.
サブトラクションクローニングに必要なcDNAライブラリーの調製は、市販のキット、例えば、PCR-Select Subtraction Kit（CLONTECH製、カタログ番号：K1804-1）を用いることができる。実験操作は、該キットに添付の実験操作手順書に従って行うことができる。 A cDNA library required for subtraction cloning can be prepared using a commercially available kit, for example, PCR-Select Subtraction Kit (manufactured by CLONTECH, catalog number: K1804-1). The experimental operation can be performed according to the experimental operation procedure attached to the kit.
具体的実験操作の一例を以下に概略する。
適切な刺激物質で刺激した細胞、及び未刺激の細胞の各々から、既報（Nucleic Acids Res.,
Vol.26, No.4, p.911-918, 1998（非特許文献２０））と同様にしてpolyA+RNAをする。次いで、各々のpolyA+RNA試料を基に逆転写酵素を用い常法に従ってcDNAを調製する。刺激した細胞から調製したcDNAをテスターcDNA（tester
cDNA）として、また未刺激の細胞由来のcDNAをドライバーcDNA（driver cDNA）として用いる。
前記既報及び該市販のキットに添付の実験操作マニュアルに従って、テスターcDNAにドライバーcDNAを加えサブトラクションを行う。なお、サブトラクションの効率は、テスターcDNAに、コントロールとして適当な外来性DNAを少量加えることによりモニターする。サブトラクションの後、該外来性DNAを濃縮する。
サブトラクションされたcDNA（subtracted
cDNA）を、常法に従って適当なプラスミド発現ベクター中にクローニングしプラスミドライブラリーを作製する。
An example of a specific experimental operation is outlined below.
From each of cells stimulated with an appropriate stimulating substance and unstimulated cells, a report (Nucleic Acids Res.,
Vol.26, No.4, p.911-918, the polyA + RNA in the same manner as in 1998 (Non-patent Document 20)). Subsequently, cDNA is prepared according to a conventional method using reverse transcriptase based on each polyA + RNA sample. CDNA prepared from stimulated cells is converted to tester cDNA (tester
cDNA) and unstimulated cell-derived cDNA are used as driver cDNA.
Subtraction is performed by adding the driver cDNA to the tester cDNA according to the aforementioned report and the experimental operation manual attached to the commercially available kit. The efficiency of subtraction is monitored by adding a small amount of exogenous DNA suitable as a control to the tester cDNA. After subtraction, the exogenous DNA is concentrated.
Subtracted cDNA (subtracted
cDNA) is cloned into an appropriate plasmid expression vector according to a conventional method to prepare a plasmid library.
既報と同様にして、該ライブラリーの多数のコロニーを、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法によりスクリーニングする（Nucleic Acids Res., Vol.26, No.4, p.911-918, 1998（非特許文献２１）; 臨床免疫, Vol.29, No.Suppl.17, p.451-459, 1997（非特許文献２２））。ここで、ハイブリダイゼーションプローブとしては、前記テスターcDNA及びドライバーcDNAの各々を放射性標識したものを用いることができる。なお、目的のDNAを含むクローンと前記外来性DNAを含むクローンの区別は、レプリカントフルターに該外来性DNAをハイブリダイズさせることにより行うことができる。
放射性標識ドライバーcDNAプローブよりも放射性標識テスターcDNAプローブに対してより強いシグナルを発するクローンを同定し、目的のcDNAまたはcDNA断片を得ることができる。
In the same manner as previously reported, a large number of colonies in the library are screened by differential hybridization (Nucleic Acids Res., Vol. 26, No. 4, p. 911-918, 1998 (Non-patent Document 21); Clinical Immunity, Vol. 29, No. Suppl. 17, p. 451-459, 1997 (Non-patent Document 22)). Here, as the hybridization probe, those obtained by radioactively labeling each of the tester cDNA and the driver cDNA can be used. The clone containing the target DNA and the clone containing the exogenous DNA can be distinguished by hybridizing the exogenous DNA to a replicant filter.
A clone that emits a stronger signal to the radiolabeled tester cDNA probe than the radiolabeled driver cDNA probe can be identified, and the target cDNA or cDNA fragment can be obtained.
また、本発明における任意の蛋白質をコードするcDNAの単離は、他の一般的なｃDNAのスクリーニング法を用いることによっても行うことができる。
例えば、市販または既知のアミノ酸配列や塩基配列も基に独自に単離した該蛋白質をコードするcDNA若しくはcDNA断片、あるいは別個に化学合成した該蛋白質のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（Crunsteinら, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vol.72, p.3961, 1975（非特許文献２３））またはプラークハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spring
Harbor Laboratory, p.2.108, 1989（非特許文献２４））により、市販または所望に応じ独自に調製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。
さらに、該蛋白質をコードするcDNA若しくはcDNA断片の塩基配列を基に一対のPCRプライマーを作製し、全長cDNAライブラリーを鋳型として該プライマーを用いたPCRにより該蛋白質をコードするcDNAを含むDNAを増幅する方法を挙げることができる。
In addition, isolation of cDNA encoding any protein in the present invention can also be performed by using other general cDNA screening methods.
For example, a commercially available or known cDNA or cDNA fragment encoding the protein isolated based on a known amino acid sequence or base sequence, or an oligonucleotide corresponding to the amino acid sequence of the protein chemically synthesized separately is labeled with 32 P. And a known colony hybridization method (Crunstein et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, Vol. 72, p.3961, 1975 (non-patent document 23)) or plaque hybridization method (Molecular Cloning). , A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring
According to Harbor Laboratory, p.2.108, 1989 (Non-patent Document 24)), it can be obtained by screening a commercially available or independently prepared cDNA library as desired.
In addition, a pair of PCR primers is prepared based on the nucleotide sequence of the cDNA or cDNA fragment encoding the protein, and DNA containing the cDNA encoding the protein is amplified by PCR using the primer with a full-length cDNA library as a template. The method of doing can be mentioned.
cDNAを発現しうる発現ベクターを用いて作製したcDNAライブラリーを用いる場合には、該蛋白質に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することもできる。大量にクローンを処理する場合には、PCR法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Maxamら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.560, 1977（非特許文献２５））あるいはファージM13を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.5463-5467, 1977（非特許文献２６））によって決定することができる。市販のDNAシークエンサーを用いると簡便に塩基配列を決定することが可能である。 本発明における任意の蛋白質をコードする遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
When a cDNA library prepared using an expression vector capable of expressing cDNA is used, a target clone can be selected by utilizing an antigen-antibody reaction using an antibody reactive with the protein. When a large amount of clones are processed, it is preferable to use a screening method utilizing PCR.
The base sequence of the DNA thus obtained is the Maxam-Gilbert method (Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 74, p. 560, 1977 (Non-patent Document 25)) or It can be determined by the method of chain termination of dideoxynucleotide synthesis using phage M13 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 74, p. 5463-5467, 1977 (Non-patent Document 26)). The base sequence can be easily determined by using a commercially available DNA sequencer The gene encoding any protein in the present invention is restricted in whole or in part from the clone obtained as described above. It can be obtained by cutting with an enzyme or the like.
また、所望の蛋白質をコードする遺伝子を、該蛋白質を発現する細胞に由来するゲノムＤＮＡから単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
該細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから該蛋白質をコードする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
例えば、ヒト由来タンパクをコードするｃＤＮＡを取得する場合には、さらにヒトゲノムＤＮＡ（染色体ＤＮＡ）が導入されたコスミドライスラリーを作製（「ラボマニュアルヒトゲノムマッピング」、堀雅明及び中村祐輔 編、丸善 出版）し、該コスミドライブラリーをスクリーニングすることにより、該目的とする蛋白質のコーディング領域のＤＮＡを含む陽性クローンを得、該陽性クローンから切り出したコーディングＤＮＡをプローブとして用い、前述のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより調製することもできる。
Moreover, as a preparation method by isolating the gene which codes a desired protein from the genomic DNA derived from the cell which expresses this protein, the following method is illustrated, for example.
The cells are preferably lysed using SDS or proteinase K or the like, and extraction with phenol is repeated to deproteinize DNA. RNA is preferably digested with ribonuclease. The obtained DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme, and the resulting DNA fragment is amplified with an appropriate phage or cosmid to prepare a library. Then, a clone having the target sequence is detected by, for example, a method using a radiolabeled DNA probe, and all or a part of the gene encoding the protein is cut out from the clone with a restriction enzyme or the like.
For example, to obtain cDNA encoding a human-derived protein, a cosmi dry slurry with human genomic DNA (chromosomal DNA) introduced is prepared ("Lab Manual Human Genome Mapping", edited by Masaaki Hori and Yusuke Nakamura, published by Maruzen) Then, by screening the cosmid library, a positive clone containing DNA of the coding region of the target protein is obtained, and the aforementioned cDNA library is screened using the coding DNA cut out from the positive clone as a probe. Can also be prepared.
（２）発現ベクターの調製及び該ベクターによる細胞の形質転換
上述した任意の蛋白質をコードする遺伝子のクローニングにおいて用いられるベクター、及び／または該蛋白質をコードする遺伝子を発現させるための発現ベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクター及びファージベクターが包含される。但し、前述した本発明の<1>乃至<22>の実施においては、該蛋白質をコードする遺伝子が、前記で定義した「PC12由来細胞」中で発現可能なベクターに限られる。
(2) Preparation of expression vector and transformation of cell with said vector As a vector used in cloning of a gene encoding any of the above-mentioned proteins and / or an expression vector for expressing a gene encoding the protein, There is no particular limitation as long as it can be replicated and maintained in various prokaryotic and / or eukaryotic hosts, and plasmid vectors and phage vectors are included. However, in the implementation of <1> to <22> of the present invention described above, the gene encoding the protein is limited to a vector that can be expressed in the “PC12-derived cell” defined above.
当該組換えベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡ及びバクテリアファージＤＮＡ）に該蛋白質コードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。
用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194 などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例示される。
The recombinant vector can be conveniently prepared by ligating DNA encoding the protein by a conventional method to a recombination vector (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art.
Specific examples of the recombination vector used include plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 and pUC19, yeast derived plasmids such as pSH19 and pSH15, and Bacillus subtilis derived plasmids such as pUB110, pTP5 and pC194. Etc. are exemplified. Examples of the phage include bacteriophages such as λ phage, and animal and insect viruses (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retrovirus, vaccinia virus, and nuclear polyhedrosis virus.
該蛋白質をコードするＤＮＡを前記で定義した「PC12由来細胞」中で発現させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、該細胞中で該遺伝子を発現する機能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、pMAL C2 、pEF-BOS（ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Research）、第１８巻、第５３２２頁、１９９０年（非特許文献２７）等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができる。 An expression vector is useful for the purpose of expressing the DNA encoding the protein in the “PC12-derived cells” defined above. The expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing the gene in the cell. For example, pMAL C2, pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, Vol. 5322, 1990 (Non-patent Document 27), etc.) or pME18S (Experimental Medicine separate volume “Gene Engineering Handbook”, 1992 etc.).
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、目的の該蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、該蛋白質をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
When animal cells are used as the host, the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, DNA encoding the protein of interest, and a stop codon. It also contains DNA encoding signal peptides, enhancer sequences, 5 'and 3' untranslated regions of the gene encoding the protein, splicing junctions, polyadenylation sites, selectable marker regions or replicable units, etc. May be. Moreover, the gene amplification gene (marker) normally used according to the objective may be included.
A suitable initiation codon is exemplified by methionine codon (ATG).
Examples of stop codons include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA).
As the terminator region, a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）及び合成プラスミド等が含まれる。例えば、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC
37149等があげられる。
A replicable unit refers to a DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a DNA fragment prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included. For example, in E. coli, plasmid pBR322, or an artificial modification thereof (DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), and in mammalian cells, plasmid pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV -MMTneo ATCC 37224, plasmid pSV2neo ATCC
37149 etc.
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位及びスプライシング接合部位については、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えば、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、ハイグロマイシン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
As the enhancer sequence, polyadenylation site and splicing junction site, those commonly used by those skilled in the art can be used.
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples thereof include antibiotic resistance genes such as neomycin, tetracycline, ampicillin, hygromycin, and kanamycin.
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。 The gene amplification gene includes dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase gene, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, hygromycin-B-phosphotransferase gene, aspartate transcarbamylase gene Etc. can be illustrated.
本発明で用いられる発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドン及びターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。 The expression vector used in the present invention is prepared by linking at least the above promoter, start codon, DNA encoding the desired protein, stop codon, and terminator region continuously and circularly to appropriate replicable units. Can do. At this time, if desired, an appropriate DNA fragment (for example, a linker, other restriction enzyme cleavage sites, etc.) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
本発明において調製される形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞（即ち、前記で定義した「PC12由来細胞」）に導入することにより調製することができる。
本発明において使用される細胞（野生型細胞、株化細胞、非形質転換細胞、形質転換細胞を含む）は、栄養培地で培養することによって生存、維持及び／または増殖させることができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は適宜選択される。
宿主が動物細胞の場合には、培地として例えば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM培地（Science, Vol.122, p.501, 1952（非特許文献２８））、 DMEM培地（Virology, Vol.8, p.396, 1959（非特許文献２９））、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.199,
p.519, 1967（非特許文献３０））、199培地（proc.
Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950（非特許文献３１））等を用いることができる。培地のpHは約６〜８に設定することができ、培養は通常約30〜40℃でなわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
The transformed cell prepared in the present invention can be prepared by introducing the expression vector described above into a host cell (ie, “PC12-derived cell” as defined above).
Cells (including wild-type cells, established cells, non-transformed cells, and transformed cells) used in the present invention can be survived, maintained and / or grown by culturing in a nutrient medium.
The nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant). Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose. Examples of the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, large extract, and the like. Examples include soybean cake and potato extract. Further, other nutrients (for example, inorganic salts (for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (for example, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.)) may be included as desired. .
Culturing is performed by methods known in the art. Culture conditions such as temperature, medium pH and culture time are appropriately selected.
When the host is an animal cell, for example, a MEM medium (Science, Vol. 122, p. 501, 1952 (Non-patent Document 28)) containing about 5 to 20% fetal bovine serum, a DMEM medium (Virology, Vol.8, p.396, 1959 (Non-patent Document 29)), RPMI1640 medium (J. Am. Med. Assoc., Vol.199,
p.519, 1967 (Non-patent Document 30)), 199 medium (proc.
Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1, 1950 (Non-patent Document 31)) and the like can be used. The pH of the medium can be set to about 6 to 8, and the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C., and aeration and agitation can be performed as necessary.
（３）キメラ遺伝子の構築と発現ベクターの構築
本発明で用いられるキメラＧ蛋白質αサブユニット、例えば、ＧαiとＧαqからなるＧαqiをコードする遺伝子あるいはＧαiとＧαsからなるＧαsiをコードする遺伝子は、Ｇαq及びＧαsの各々をコードするmRNAの塩基配列を鋳型として下記一対のプライマーを用いたPCRにより調製することができる。
フォーワードプライマー： Gq及びGsの各々のＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー。
リバースプライマー： Gq及びGsの各々のＣ末端側のアミノ酸の一部をコードする塩基配列に相補的な塩基配列の下流にGiのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマー。
(3) Construction of Chimeric Gene and Construction of Expression Vector Chimeric G protein α subunit used in the present invention, for example, a gene encoding Gαqi consisting of Gαi and Gαq or a gene encoding Gαsi consisting of Gαi and Gαs is Gαq And the base sequence of mRNA encoding each of Gαs can be prepared by PCR using the following pair of primers as a template.
Forward primer: A primer having a base sequence complementary to the base sequence encoding the N-terminal amino acid sequence of each of Gq and Gs.
Reverse primer: has a base sequence complementary to the base sequence encoding the C-terminal amino acid sequence of Gi downstream of the base sequence complementary to the base sequence encoding a part of the C-terminal side amino acids of Gq and Gs Primer.
（４）レポーター遺伝子発現ベクター
前記で定義した本発明で用いられる各種のレポーター遺伝子は、上述したような既存の遺伝子クローニング法を用いてクローニングすることもできるが、該遺伝子が挿入された市販の発現ベクターを用いるのが簡便である。
(4) Reporter gene expression vector Various reporter genes used in the present invention as defined above can be cloned using the existing gene cloning method as described above, but commercially available expression in which the gene is inserted. It is convenient to use a vector.
（５）細胞の形質転換
本発明における宿主細胞（例えば、前記で定義した「PC12由来細胞」）の種々遺伝子発現ベクターによる形質転換は、上述した一般的な方法（例えばリポフェクション法あるいはエレクトロポレーション法など）により行うことができる。
本発明で使用される形質転換体には、一過性形質転換体（transient transformant）あるいは安定形質転換体（stable transformant）のいずれもが包含される。
安定形質転換体は、前述したとおり、宿主細胞を種々のマーカー遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）で形質転換し、次いで、該細胞を、該薬剤存在下で培養して該薬剤に耐性のクローンを選択することにより取得できる。
(5) Transformation of cells In the present invention, transformation of host cells (for example, “PC12-derived cells” defined above) with various gene expression vectors is performed by the general methods described above (for example, lipofection method or electroporation method). Etc.).
The transformant used in the present invention includes both a transient transformant and a stable transformant.
As described above, the stable transformant transforms a host cell with various marker genes (for example, a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene), and then the cell is cultured in the presence of the drug to form the drug. It can be obtained by selecting resistant clones.
（６）Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストを同定する方法
本発明の１つである下記発明（前記<1>）の態様の一例を挙げる。
前記<1>の発明は即ち下記のとおりである。
「ある物質が所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストであるか否かを決定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料に該物質を接触させる工程；
（ｂ）該物質に接触させた該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナル、及び該物質に接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。」
(6) Method for Identifying G Protein Coupled Receptor Agonist An example of an embodiment of the following invention (<1> above) which is one of the present invention will be given.
The invention <1> is as follows.
“A method for determining whether a substance is an agonist of a desired G protein-coupled receptor, comprising the following steps (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Contacting the substance with a sample comprising a constant number of PC12-derived cells having:
(B) a detectable signal produced by the reporter gene expressed in each cell in the sample contacted with the substance, and a detection produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample not contacted with the substance Quantitatively determining each of the possible signals; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b). "
本発明は例えば、下記のように実施することができる。
〈I〉PC12由来細胞（例えば、PC12h細胞株）を下記(i)及び(ii)または(i)乃至(iii)の遺伝子が宿主細胞内で発現可能なように挿入された１または複数の発現ベクターで形質転換し、該全ての遺伝子が導入された形質転換細胞（好ましくは安定形形質転換細胞）を取得する。
i)ある所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子（好ましくはcDNA）。
ii)Ｇ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域、c-fosプロモーター領域、またはSRE及び／またはCREを含むプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）、βーラクタマーゼをコードするcDNA）。
iii)GqのαサブユニットのＣ末端側のアミノ酸配列であって3位のグリシンを含む約３乃至約23個（好ましくは9個）の連続するアミノ酸配列を、GiのαサブユニットのＣ末端側の対応するアミノ酸配列で置換して得られるキメラＧ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子（好ましくは、cDNA）。
The present invention can be implemented as follows, for example.
<I> One or a plurality of expressions in which a PC12-derived cell (for example, a PC12h cell line) is inserted so that the following genes (i) and (ii) or (i) to (iii) can be expressed in a host cell By transforming with a vector, a transformed cell into which all the genes have been introduced (preferably a stable transformed cell) is obtained.
i) A gene (preferably cDNA) encoding a desired G protein-coupled receptor.
ii) It can be expressed in the promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region, c-fos promoter region, or promoter region containing SRE and / or CRE) A reporter gene linked to (preferably, luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, cDNA encoding β-lactamase).
iii) The amino acid sequence on the C-terminal side of the α subunit of Gq, which is about 3 to about 23 (preferably 9) consecutive amino acids containing glycine at
〈II〉得られた該形質転換細胞の定数（例えば、１〜1×1010個、以下好ましい順に、1×101〜1×109個、1×102〜1×108個、1×103〜1×107個、1×104〜1×107個、1×104〜1×106個、1×104〜5×105個）を所望の細胞培養が可能な器具（例えば、シャーレ、多数のウェルを有するマイクロプレート、マイクロチューブなど）を用いて所望の試薬（例えば、血清、抗生物質など）を含む所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。この定数の細胞からなる試料を、少なくとも2セット以上準備する。
〈III〉前記の試料の少なくとも１つに試験しようとする物質（例えば、化合物）の所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）を加え約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
<II> Constants of the obtained transformed cells (for example, 1 to 1 × 10 10 cells, 1 × 10 1 to 1 × 10 9 cells, 1 × 10 2 to 1 × 10 8 cells, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 cells, 1 × 10 4 to 1 × 10 7 cells, 1 × 10 4 to 1 × 10 6 cells, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 cells) In a desired nutrient medium (eg, D-MEM medium) containing desired reagents (eg, serum, antibiotics, etc.) using a suitable instrument (eg, petri dish, microplate with many wells, microtube, etc.) Incubate with Prepare at least two sets of samples consisting of this constant number of cells.
<III> A desired concentration (for example, about 1.0 pM to about 1.0 M) of a substance (eg, a compound) to be tested in at least one of the above samples, for example, about 10.0 pM to about 100 mM, about 100 pM To about 10 mM, about 1.0 nM to about 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM), and cultured at about 37 ° C. for a desired time (for example, about 1 to 24 hours).
〈IV〉前記で該物質の存在下で培養した細胞試料に含まれる細胞を、所望の細胞溶解試薬で細胞溶解し、該試料の細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、測定値[A]を得る。
また、該物質を加えないで培養した前記〈II〉の細胞試料中に含まれる細胞についても、同様にして細胞溶解し、細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、測定値[B]を得る。
〈V〉測定値[A]と測定値[B]を比較し、その差違の程度に基づいて、該物質が該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストであるか否か（該受容体との相互作用の有無）を決定する。
<IV> The cells contained in the cell sample cultured in the presence of the above-mentioned substance are lysed with a desired cell lysis reagent, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate of the sample is reduced to a commercially available amount. Quantitative determination is performed using a luciferase activity measuring device to obtain a measured value [A].
In addition, the cells contained in the cell sample of <II> cultured without adding the substance were also lysed in the same manner, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate was determined based on the commercially available luciferase activity. Quantitatively determined using a measuring device to obtain a measured value [B].
<V> The measured value [A] is compared with the measured value [B], and based on the degree of the difference, whether or not the substance is an agonist of the G protein-coupled receptor (reciprocal with the receptor) Determine the presence or absence of action).
（７）Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストを同定するために物質をスクリーニングする方法
本発明の１つである下記発明（前記<2>）の態様の一例を挙げる。
前記<2>の発明は即ち下記のとおりである。
「所望のＧ蛋白質共役型受容体のアゴニストを同定するために物質をスクリーニングする方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に異なる物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及びいずれの物質にも接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。」
(7) Method for screening a substance to identify an agonist of a G protein-coupled receptor An example of the embodiment of the following invention (<2>), which is one of the present invention, is given.
That is, the invention <2> is as follows.
“A method for screening a substance to identify an agonist of a desired G protein-coupled receptor, comprising the following steps (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples consisting of a constant number of PC12-derived cells having: and contacting each of the samples with a different substance;
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), the detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and the substance not contacted with any substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b). "
本発明は例えば、下記のように実施することができる。
〈I〉PC12由来細胞（例えば、PC12h細胞株）を下記(i)及び(ii)または(i)乃至(iii)の遺伝子が宿主細胞内で発現可能なように挿入された１または複数の発現ベクターで形質転換し、該全ての遺伝子が導入された形質転換細胞（好ましくは安定形形質転換細胞）を取得する。
i)ある所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子（好ましくはcDNA）。
ii)Ｇ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域、c-fosプロモーター領域、またはSRE及び／またはCREを含むプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）、βーラクタマーゼをコードするcDNA）。
iii)GqのαサブユニットのＣ末端側のアミノ酸配列であって3位のグリシンを含む約３乃至約23個（好ましくは9個）の連続するアミノ酸配列を、GiのαサブユニットのＣ末端側の対応するアミノ酸配列で置換して得られるキメラＧ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子（好ましくは、cDNA）。
The present invention can be implemented as follows, for example.
<I> One or a plurality of expressions in which a PC12-derived cell (for example, a PC12h cell line) is inserted so that the following genes (i) and (ii) or (i) to (iii) can be expressed in a host cell By transforming with a vector, a transformed cell into which all the genes have been introduced (preferably a stable transformed cell) is obtained.
i) A gene (preferably cDNA) encoding a desired G protein-coupled receptor.
ii) It can be expressed in the promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region, c-fos promoter region, or promoter region containing SRE and / or CRE) A reporter gene linked to (preferably, luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, cDNA encoding β-lactamase).
iii) The amino acid sequence on the C-terminal side of the α subunit of Gq, which is about 3 to about 23 (preferably 9) consecutive amino acids containing glycine at
〈II〉得られた該形質転換細胞の定数（例えば、１〜1×1010個、以下好ましい順に、1×101〜1×109個、1×102〜1×108個、1×103〜1×107個、1×104〜1×107個、1×104〜1×106個、1×104〜5×105個）を、多数のウェル（例えば、24穴、48穴、96穴、364穴など）を有するマイクロプレートの各々のウェルに蒔き、該細胞を所望の試薬（例えば、血清、抗生物質など）を含む所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。（以下、各ウェルにセットされた定数の細胞群を、試料と称する。）
〈III〉マイクロプレートの各ウェルにセットされた複数の試料の各々に、各々異なる試験しようとする物質（例えば、化合物）の所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）を加え、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
<II> Constants of the obtained transformed cells (for example, 1 to 1 × 10 10 cells, 1 × 10 1 to 1 × 10 9 cells, 1 × 10 2 to 1 × 10 8 cells, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 6 pieces, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 pieces) , 24-well, 48-well, 96-well, 364-well, etc.) and place the cells in a desired nutrient medium (eg, D) containing the desired reagents (eg, serum, antibiotics, etc.) -In MEM medium). (Hereinafter, a constant group of cells set in each well is referred to as a sample.)
<III> Each of a plurality of samples set in each well of the microplate is provided with a desired concentration (for example, about 1.0 pM to about 1.0 M in a preferable order) of a different substance (for example, a compound) to be tested. About 10.0 pM to about 100 mM, about 100 pM to about 10 mM, about 1.0 nM to about 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM), and about 37 ° C. for a desired time (eg, about 1 Incubate for ~ 24 hours).
〈IV〉次いで、各々異なる試験物質の存在下で培養した各試料に、所望の細胞溶解試薬を加えて細胞を溶解し、該各々の試料の細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、各々の試料について複数の測定値[A]、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]を得る。
また、該物質を加えないで培養した前記〈II〉の細胞試料中に含まれる細胞についても、同様にして細胞溶解し、細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、１または複数の測定値[Control]を得る。
〈V〉複数の測定値[A] 、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]の各々を、測定値[Control]と比較し、その差違の程度に基づいて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストである（該受容体と相互作用する）物質を選別、同定する。
<IV> Next, a desired cell lysis reagent is added to each sample cultured in the presence of different test substances to lyse cells, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate of each sample Is quantitatively determined using a commercially available luciferase activity measuring device, and a plurality of measured values [A], [B], [C], [D], [E],... [X] for each sample. Get.
In addition, the cells contained in the cell sample of <II> cultured without adding the substance were also lysed in the same manner, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate was determined based on the commercially available luciferase activity. Quantitative determination is performed using a measuring device, and one or more measured values [Control] are obtained.
<V> Each measured value [A], [B], [C], [D], [E] ... [X] is compared with the measured value [Control], and the degree of difference Based on the above, a substance that is an agonist (interacts with the receptor) of the G protein-coupled receptor is selected and identified.
（８）Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはアゴニスト作用阻害物質を同定する方法
本発明の１つである下記発明（前記<3>）の態様の一例を挙げる。
前記<3>の発明は即ち下記のとおりである。
「ある物質が所望のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストであるか否か、または該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストのアゴニスト作用の阻害物質であるか否かを決定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料に該Ｇ蛋白質受容体のアゴニスト及び該物質を接触させる工程；
（ｂ）該物質に接触させた該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナル、及び該物質に接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。」
(8) Method for Identifying G Protein-Coupled Receptor Antagonist or Agonist Action Inhibitor An example of the embodiment of the following invention (<3> above) which is one of the present invention is given.
The invention <3> is as follows.
“A method for determining whether a substance is an antagonist of a desired G protein-coupled receptor or whether it is an inhibitor of the agonistic action of an agonist of the G protein-coupled receptor, comprising: A method comprising the steps of (a) to (c):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Bringing the G protein receptor agonist and the substance into contact with a sample comprising a constant of PC12-derived cells having:
(B) a detectable signal produced by the reporter gene expressed in each cell in the sample contacted with the substance, and a detection produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample not contacted with the substance Quantitatively determining each of the possible signals; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b). "
本発明は例えば、下記のように実施することができる。
〈I〉PC12由来細胞（例えば、PC12h細胞株）を下記(i)及び(ii)または(i)乃至(iii)の遺伝子が宿主細胞内で発現可能なように挿入された１または複数の発現ベクターで形質転換し、該全ての遺伝子が導入された形質転換細胞（好ましくは安定形形質転換細胞）を取得する。
i)ある所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子（好ましくはcDNA）。
ii)Ｇ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域、c-fosプロモーター領域、またはSRE及び／またはCREを含むプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）、βーラクタマーゼをコードするcDNA）。
iii)GqのαサブユニットのＣ末端側のアミノ酸配列であって3位のグリシンを含む約３乃至約23個（好ましくは9個）の連続するアミノ酸配列を、GiのαサブユニットのＣ末端側の対応するアミノ酸配列で置換して得られるキメラＧ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子（好ましくは、cDNA）。
The present invention can be implemented as follows, for example.
<I> One or a plurality of expressions in which a PC12-derived cell (for example, a PC12h cell line) is inserted so that the following genes (i) and (ii) or (i) to (iii) can be expressed in a host cell By transforming with a vector, a transformed cell into which all the genes have been introduced (preferably a stable transformed cell) is obtained.
i) A gene (preferably cDNA) encoding a desired G protein-coupled receptor.
ii) It can be expressed in the promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region, c-fos promoter region, or promoter region containing SRE and / or CRE) A reporter gene linked to (preferably, luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, cDNA encoding β-lactamase).
iii) The amino acid sequence on the C-terminal side of the α subunit of Gq, which is about 3 to about 23 (preferably 9) consecutive amino acids containing glycine at
〈II〉得られた該形質転換細胞の定数（例えば、１〜1×1010個、以下好ましい順に、1×101〜1×109個、1×102〜1×108個、1×103〜1×107個、1×104〜1×107個、1×104〜1×106個、1×104〜5×105個）を所望の細胞培養が可能な器具（例えば、シャーレ、多数のウェルを有するマイクロプレート、マイクロチューブなど）を用いて所望の試薬（例えば、血清、抗生物質など）を含む所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。この定数の細胞からなる試料を、少なくとも2セット以上準備する。 <II> Constants of the obtained transformed cells (for example, 1 to 1 × 10 10 cells, 1 × 10 1 to 1 × 10 9 cells, 1 × 10 2 to 1 × 10 8 cells, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 cells, 1 × 10 4 to 1 × 10 7 cells, 1 × 10 4 to 1 × 10 6 cells, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 cells) In a desired nutrient medium (eg, D-MEM medium) containing desired reagents (eg, serum, antibiotics, etc.) using a suitable instrument (eg, petri dish, microplate with many wells, microtube, etc.) Incubate with Prepare at least two sets of samples consisting of this constant number of cells.
〈III〉前記〈II〉の試料の少なくとも１つ下記(i)及び(ii)を加え、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
i)該G蛋白質共役型受容体の既知のアゴニストの所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
ii)試験しようとする物質（例えば、化合物）の所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
<III> At least one of the samples of <II> above (i) and (ii) is added and cultured at about 37 ° C. for a desired time (for example, about 1 to 24 hours).
i) a desired concentration of a known agonist of the G protein coupled receptor (e.g., about 1.0 pM to about 1.0 M, in a preferred order, from about 10.0 pM to about 100 mM, from about 100 pM to about 10 mM, from about 1.0 nM to About 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
ii) the desired concentration of the substance (eg, compound) to be tested (eg, from about 1.0 pM to about 1.0 M, in the following preferred order, from about 10.0 pM to about 100 mM, from about 100 pM to about 10 mM, from about 1.0 nM to about 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
〈IV〉前記〈II〉の試料の少なくとも１つ下記(i)を加え、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
i)該G蛋白質共役型受容体の既知のアゴニストの所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
〈V〉前記〈III〉及び〈IV〉で培養した各々の試料に、所望の細胞溶解試薬で細胞溶解し、該各々の試料の細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定する。前記〈III〉の試料について測定値[A]を得、また前記〈IV〉の試料について測定値[B]を得る。
また、該アゴニスト及び該試験物質のいずれをもを加えないで培養した前記〈II〉の細胞試料中に含まれる細胞についても、同様にして細胞溶解し、細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、測定値[C]を得る。
〈VI〉測定値[A]、[B]及び[C]を比較し、その差違の程度に基づいて、該物質が該Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストであるか否か、または該物質が該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する活性を有する物質であるか否かを決定する。
<IV> At least one of the samples of <II> above (i) is added and cultured at about 37 ° C. for a desired time (for example, about 1 to 24 hours).
i) a desired concentration of a known agonist of the G protein coupled receptor (e.g., about 1.0 pM to about 1.0 M, in a preferred order, from about 10.0 pM to about 100 mM, from about 100 pM to about 10 mM, from about 1.0 nM to About 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
<V> Each sample cultured in the above <III> and <IV> is lysed with a desired cell lysis reagent, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate of each sample is measured with a commercially available product. It is determined quantitatively using a luciferase activity measuring device. The measured value [A] is obtained for the sample <III>, and the measured value [B] is obtained for the sample <IV>.
In addition, the cells contained in the cell sample of <II> cultured without adding any of the agonist and the test substance are similarly lysed and contained in a fixed amount of the cell lysate. The amount of luciferase is quantitatively determined using a commercially available luciferase activity measuring device to obtain a measured value [C].
<VI> The measured values [A], [B] and [C] are compared, and based on the degree of the difference, whether or not the substance is an antagonist of the G protein-coupled receptor, It is determined whether or not the substance has an activity that inhibits the agonistic action of the agonist.
（９）Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたはアゴニスト作用阻害物質を同定するために物質をスクリーニングする方法
本発明の１つである下記発明（前記<4>）の態様の一例を挙げる。
前記<4>の発明は即ち下記のとおりである。
「所望のＧ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストまたは該Ｇ蛋白質共役型受容体のアゴニストのアゴニスト作用の阻害物質を同定するために物質をスクリーニングする方法であって、下記（ａ）乃至（ｃ）の工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）該所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー慮域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞の定数からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該該Ｇ蛋白質受容体のアゴニストと異なる物質を接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及びいずれの物質にも接触させていない該試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々のシグナルの量を比較する工程。」
(9) Method for screening a substance to identify an antagonist or agonist action inhibitor of G protein-coupled receptor An example of the embodiment of the following invention (<4>), which is one of the present invention, is given.
The invention <4> is as follows.
“A method for screening a substance for identifying an antagonist of a desired G protein-coupled receptor antagonist or an agonistic action of an agonist of the G protein-coupled receptor, comprising the following (a) to (c): A method comprising the steps:
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) a gene encoding the desired G protein-coupled receptor; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation via the G protein.
-A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples consisting of constants of PC12-derived cells having a contact with a substance different from the agonist of the G protein receptor to each of the samples;
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), the detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and the substance not contacted with any substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the sample; and
(C) A step of comparing the amounts of the respective signals determined in step (b). "
本発明は例えば、下記のように実施することができる。
〈I〉PC12由来細胞（例えば、PC12h細胞株）を下記(i)及び(ii)または(i)乃至(iii)の遺伝子が宿主細胞内で発現可能なように挿入された１または複数の発現ベクターで形質転換し、該全ての遺伝子が導入された形質転換細胞（好ましくは安定形形質転換細胞）を取得する。
i)ある所望のＧ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子（好ましくはcDNA）。
ii)Ｇ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域、c-fosプロモーター領域、またはSRE及び／またはCREを含むプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）、βーラクタマーゼをコードするcDNA）。
iii)GqのαサブユニットのＣ末端側のアミノ酸配列であって3位のグリシンを含む約３乃至約23個（好ましくは9個）の連続するアミノ酸配列を、GiのαサブユニットのＣ末端側の対応するアミノ酸配列で置換して得られるキメラＧ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子（好ましくは、cDNA）。
The present invention can be implemented as follows, for example.
<I> One or a plurality of expressions in which a PC12-derived cell (for example, a PC12h cell line) is inserted so that the following genes (i) and (ii) or (i) to (iii) can be expressed in a host cell By transforming with a vector, a transformed cell into which all the genes have been introduced (preferably a stable transformed cell) is obtained.
i) A gene (preferably cDNA) encoding a desired G protein-coupled receptor.
ii) It can be expressed in the promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region, c-fos promoter region, or promoter region containing SRE and / or CRE) A reporter gene linked to (preferably, luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, cDNA encoding β-lactamase).
iii) The amino acid sequence on the C-terminal side of the α subunit of Gq, which is about 3 to about 23 (preferably 9) consecutive amino acids containing glycine at
〈II〉得られた該形質転換細胞の定数（例えば、１〜1×1010個、以下好ましい順に、1×101〜1×109個、1×102〜1×108個、1×103〜1×107個、1×104〜1×107個、1×104〜1×106個、1×104〜5×105個）を、多数のウェル（例えば、24穴、48穴、96穴、364穴など）を有する１または複数（好ましくは複数）のマイクロプレートの各々のウェルに蒔き、該細胞を所望の試薬（例えば、血清、抗生物質など）を含む所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。（以下、各ウェルにセットされた定数の細胞群を、試料と称する。）
〈III〉マイクロプレートの各ウェルにセットされた複数の試料の一部または全部の各々に、下記(i)及び(ii)を加えて、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
i)該G蛋白質共役型受容体の既知のアゴニストの所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
ii)各試料に対して各々異なる試験しようとする物質（例えば、化合物）の所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
<II> Constants of the obtained transformed cells (for example, 1 to 1 × 10 10 cells, 1 × 10 1 to 1 × 10 9 cells, 1 × 10 2 to 1 × 10 8 cells, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 6 pieces, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 pieces) , 24-well, 48-well, 96-well, 364-well, etc.) to each well of one or more (preferably multiple) microplates, and the cells are loaded with the desired reagents (eg, serum, antibiotics, etc.) Culture in a desired nutrient medium (eg, D-MEM medium). (Hereinafter, a constant group of cells set in each well is referred to as a sample.)
<III> The following (i) and (ii) are added to each or all of a plurality of samples set in each well of the microplate, and a desired time (for example, about 1 to about 1) is added at about 37 ° C. Incubate for 24 hours.
i) a desired concentration of a known agonist of the G protein coupled receptor (e.g., about 1.0 pM to about 1.0 M, in a preferred order, from about 10.0 pM to about 100 mM, from about 100 pM to about 10 mM, from about 1.0 nM to About 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
ii) the desired concentration (eg, about 1.0 pM to about 1.0 M, in the following preferred order, about 10.0 pM to about 100 mM, about 100 pM to about 10 mM, about 1.0 nM to about 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
〈IV〉前記〈III〉の試験に用いたマイクロプレートとは別の前記〈II〉のマイクロプレートの各ウェルにセットされた各々の試料、または前記〈III〉のマイクロプレートにセットされた試料であって前記〈III〉の試験に使用しなかった残りのウェルにセットさいれた試料の各々前記にセットされた複数の試料の各々に、下記(i)を加えて、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
i)該G蛋白質共役型受容体の既知のアゴニストの所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）。
<IV> Each sample set in each well of the microplate of <II> different from the microplate used in the test of <III>, or a sample set on the microplate of <III> Each of the samples set in the remaining wells that were not used in the test of <III> was added to each of the plurality of samples set in the above by adding the following (i), and at about 37 ° C. (For example, about 1 to 24 hours).
i) a desired concentration of a known agonist of the G protein coupled receptor (e.g., about 1.0 pM to about 1.0 M, in a preferred order, from about 10.0 pM to about 100 mM, from about 100 pM to about 10 mM, from about 1.0 nM to About 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM).
〈V〉前記〈III〉及び〈IV〉で培養した各々の試料に、所望の細胞溶解試薬で細胞溶解し、該各々の試料の細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定する。前記〈III〉の試料について測定値[A]、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]を得、また前記〈IV〉の試料について測定値[A']、[B']、[C']、[D']、[E']・・・・[X']を得る。
また、該アゴニスト及び該試験物質のいずれをもを加えないで培養した前記〈II〉の細胞試料中に含まれる細胞についても、同様にして細胞溶解し、細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、１または複数の測定値[Control]を得る。
〈VI〉複数の測定値[A] 、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]の各々を、測定値[A']、[B']、[C']、[D']、[E']・・・・[X']、及び測定値[Control]と比較し、その差違の程度に基づいて、該Ｇ蛋白質共役型受容体のアンタゴニストである物質、または該アゴニストのアゴニスト作用を阻害する活性を有する物質を選別、同定する。
<V> Each sample cultured in the above <III> and <IV> is lysed with a desired cell lysis reagent, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate of each sample is measured with a commercially available product. It is determined quantitatively using a luciferase activity measuring device. The measured values [A], [B], [C], [D], [E]... [X] are obtained for the sample <III>, and the measured values [A] are obtained for the sample <IV>. '], [B'], [C '], [D'], [E ']... [X'] are obtained.
In addition, the cells contained in the cell sample of <II> cultured without adding any of the agonist and the test substance are similarly lysed and contained in a fixed amount of the cell lysate. The amount of luciferase is quantitatively determined using a commercially available luciferase activity measuring device, and one or more measured values [Control] are obtained.
<VI> Each of a plurality of measured values [A], [B], [C], [D], [E]... [X] is measured with measured values [A '], [B'], [ C ′], [D ′], [E ′]... [X ′] and the measured value [Control], and based on the degree of the difference, an antagonist of the G protein-coupled receptor. A substance or a substance having an activity of inhibiting the agonistic action of the agonist is selected and identified.
（10）ある物質と相互作用する受容体（例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体）を同定する方法
本発明の１つである下記発明（前記<14>乃至<16>）の態様の一例を挙げる。
(10) Method for identifying a receptor that interacts with a certain substance (for example, a G protein-coupled receptor) An example of the embodiment of the following invention (above <14> to <16>) that is one of the present invention is given .
前記<14>の発明は即ち下記のとおりである。
「ある物質と相互作用する受容体を同定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｄ）の工程を含むことを特徴とする方法（ここで、該物質は該受容体に対してアゴニストとして作用する。）：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｄ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。」
The invention <14> is as follows.
“A method for identifying a receptor that interacts with a substance, comprising the following steps (a) to (d): wherein the substance is an agonist for the receptor Works):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a); and (d) Determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (a) possessed by cells in the selected sample. "
前記<15>の発明は即ち下記のとおりである。
「ある物質と相互作用する受容体を同定する方法であって、下記（ａ）乃至（ｆ）の工程を含むことを特徴とする方法（ここで、該物質は該受容体に対してアゴニストとして作用する。）：
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；
（ｄ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）工程（ｃ）で選択された該試料中の細胞が有する外来性遺伝子であ
って、工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする１または
複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｅ）工程（ｄ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ｄ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｇ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ｄ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。」
The invention <15> is as follows.
“A method for identifying a receptor that interacts with a substance, comprising the following steps (a) to (f): wherein the substance is an agonist for the receptor Works):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each sample determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a);
(D) At least exogenous genes of (1) and (2) below:
(1) A foreign gene possessed by cells in the sample selected in step (c)
1 which encodes the protein according to (1) of step (a) or
A plurality of genes; and (2) promoters of genes whose expression is induced by stimulation via G protein
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(E) For each sample contacted with the substance in step (d), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(F) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (e) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (d); and (g) A step of determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (d) possessed by cells in the selected sample. "
前記<16>の発明は即ち下記のとおりである。
「該方法が、所望に応じ前記工程（ｆ）と工程（ｇ）の間に、前記工程（ｄ）乃至（ｆ）からなる同様の操作の１乃至複数回を含むことを特徴とする前記<15>に記載の方法。」
The invention <16> is as follows.
“The method includes one or more of the same operations including the steps (d) to (f) between the step (f) and the step (g) as desired. The method described in 15>. "
本発明は例えば、下記のように実施することができる。
〈I〉PC12由来細胞（例えば、PC12h細胞株）を下記(i)及び(ii)または(i)乃至(iii)の遺伝子が宿主細胞内で発現可能なように挿入された１または複数の発現ベクターで形質転換し、該全ての遺伝子が導入された形質転換細胞（好ましくは安定形形質転換細胞）であって、該形質転換細胞は、細胞毎に各々異なる下記(i)の遺伝子を有する複数種類の形質転換細胞を調製する。
i)任意の蛋白質をコードする１または複数の遺伝子（好ましくはcDNA）。具体的には、例えば、ヒト由来の種々の蛋白質の全長アミノ酸配列をコードする多種のcDNAからなるcDNAライブラリー中の１または複数種類からなるcDNAまたはcDNA群。
ii)Ｇ蛋白質を介するシグナルにより発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域（好ましくは、zif268(EGR-1）プロモーター領域、c-fosプロモーター領域、またはSRE及び／またはCREを含むプロモーター領域）に発現可能に連結されたレポーター遺伝子（好ましくは、蛍若しくはウミシイタケなどに由来するルシフェラーゼ、クラゲ由来のＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）、βーラクタマーゼをコードするcDNA）。
iii)GqのαサブユニットのＣ末端側のアミノ酸配列であって3位のグリシンを含む約３乃至約23個（好ましくは9個）の連続するアミノ酸配列を、GiのαサブユニットのＣ末端側の対応するアミノ酸配列で置換して得られるキメラＧ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子（好ましくは、cDNA）。
The present invention can be implemented as follows, for example.
<I> Expression of one or a plurality of PC12-derived cells (for example, PC12h cell line) inserted so that the following genes (i) and (ii) or (i) to (iii) can be expressed in host cells A transformed cell (preferably a stable transformed cell) transformed with a vector and introduced with all of the genes, wherein the transformed cell has a plurality of genes (i) that are different for each cell. Prepare a variety of transformed cells.
i) One or more genes (preferably cDNA) encoding any protein. Specifically, for example, one or a plurality of cDNAs or cDNA groups in a cDNA library consisting of various cDNAs encoding full-length amino acid sequences of various human-derived proteins.
ii) It can be expressed in the promoter region of a gene whose expression is induced by a signal via G protein (preferably, zif268 (EGR-1) promoter region, c-fos promoter region, or promoter region containing SRE and / or CRE) A reporter gene linked to (preferably, luciferase derived from firefly or Renilla, GFP (Green Fluorescence Protein) derived from jellyfish, cDNA encoding β-lactamase).
iii) The amino acid sequence on the C-terminal side of the α subunit of Gq, which is about 3 to about 23 (preferably 9) consecutive amino acids containing glycine at
〈II〉得られた複数種類の該形質転換細胞の各々の定数（例えば、１〜1×1010個、以下好ましい順に、1×101〜1×109個、1×102〜1×108個、1×103〜1×107個、1×104〜1×107個、1×104〜1×106個、1×104〜5×105個）を、多数のウェル（例えば、24穴、48穴、96穴、364穴など）を有するマイクロプレートの各々のウェルに蒔き、該細胞を所望の試薬（例えば、血清、抗生物質など）を含む所望の栄養培地（例えば、D-MEM培地など）中で培養する。即ち、各ウェルには、各々異なる前記(i)の遺伝子を有する細胞がセットされる。（以下、各ウェルにセットされた定数の細胞群を、試料と称する。）
〈III〉マイクロプレートの各ウェルにセットされた複数の試料の各々に、所望の試験しようとする物質（例えば、化合物）の所望の濃度（例えば、約1.0pM〜約1.0M、以下好ましい順で、約10.0pM〜約100mM、約100pM〜約10mM、約1.0nM〜約1.0mM、約10nM〜約500μM、約100nM〜約500μM）を加え、約37℃前後で所望の時間（例えば、約１〜24時間）培養する。
<II> Constants of the obtained plural types of the transformed cells (for example, 1 to 1 × 10 10 cells, 1 × 10 1 to 1 × 10 9 cells, 1 × 10 2 to 1 × in the following preferable order) 10 8 pieces, 1 × 10 3 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 7 pieces, 1 × 10 4 to 1 × 10 6 pieces, 1 × 10 4 to 5 × 10 5 pieces) Seed each well of a microplate with multiple wells (eg, 24, 48, 96, 364, etc.) and place the cells in the desired nutrient containing the desired reagent (eg, serum, antibiotics, etc.) Incubate in a medium (eg, D-MEM medium). That is, cells having the different gene (i) are set in each well. (Hereinafter, a constant group of cells set in each well is referred to as a sample.)
<III> In each of a plurality of samples set in each well of the microplate, a desired concentration (for example, about 1.0 pM to about 1.0 M) of a desired substance to be tested (for example, a compound) is applied in the following preferable order. , About 10.0 pM to about 100 mM, about 100 pM to about 10 mM, about 1.0 nM to about 1.0 mM, about 10 nM to about 500 μM, about 100 nM to about 500 μM), and about 37 ° C. for a desired time (eg, about 1 Incubate for ~ 24 hours).
〈IV〉次いで、該試験物質の存在下で培養した各々の試料に、所望の細胞溶解試薬を加えて細胞を溶解し、該各々の試料の細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、各々の試料について複数の測定値[A]、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]を得る。
また、所望に応じて、該物質を加えないで培養した前記〈II〉の各々の細胞試料中に含まれる細胞についても、同様にして細胞溶解し、細胞溶解液の一定量中に含まれるルシフェラーゼの量を市販のルシフェラーゼ活性測定装置を用いて定量的に決定し、１または複数の測定値[Control]を得る。
〈V〉複数の測定値[A] 、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]の各々を互いに比較し、その差違の程度に基づいて、該物質と相互作用すると認められる試料を選別、同定する。また、この選別、同定においては、所望に応じて、該複数の測定値[A] 、[B]、[C]、[D]、[E]・・・・[X]の各々を測定値[Control]と比較して得られる知見も参考にすることができる。
<IV> Next, a desired cell lysis reagent is added to each sample cultured in the presence of the test substance to lyse cells, and the amount of luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate of each sample Is quantitatively determined using a commercially available luciferase activity measuring device, and a plurality of measured values [A], [B], [C], [D], [E],... [X] for each sample. Get.
In addition, if desired, the cells contained in each cell sample of <II> cultured without adding the substance were also lysed in the same manner, and luciferase contained in a fixed amount of the cell lysate. Is quantitatively determined using a commercially available luciferase activity measuring device to obtain one or more measured values [Control].
<V> Each of a plurality of measured values [A], [B], [C], [D], [E]... [X] is compared with each other, and the substance is determined based on the degree of the difference. Select and identify samples that are found to interact with. In this selection and identification, if desired, each of the plurality of measured values [A], [B], [C], [D], [E]. The knowledge obtained in comparison with [Control] can also be used as a reference.
〈VI〉前記〈V〉で選別された試料が１乃至数種類である場合には、各々の試料中について、該各々の試料中に含まれる細胞中に導入されている前記〈I〉の(i)の遺伝子の塩基配列を決定し、該塩基配列に基づいて、該物質と相互作用した該(i)の遺伝子を特定することができる。
〈VII〉前記〈V〉で選別された試料が、多数の種類ある場合には、当該選別された各々の試料について、該試料中の細胞に対して導入された前記〈I〉の(i)の遺伝子の種類の情報を基に、前記〈I〉乃至〈V〉と同様の操作を繰り返した後に前記〈VI〉操作を行うことにより該物質と相互作用した該(i)の遺伝子を特定することができる。
即ち、例えば、前記〈V〉で下記10種類の試料が同定された場合を例に挙げると下記のような操作を行うことができる。
(1)選別された試料１：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,B,C
(2)選別された試料２：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,D,E
(3)選別された試料３：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,F,G
(4)選別された試料４：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,H,I
(5)選別された試料５：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,J,K
(6)選別された試料６：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,L,M
(7)選別された試料７：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,N,O
(8)選別された試料８：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,P,Q
(9)選別された試料９：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,R.S
(10)選別された試料10：前記〈I〉の(i)で細胞に導入された遺伝子： 遺伝子A,T,U
<VI> When there are one or several types of samples selected in <V>, (i) of (I) introduced into the cells contained in each sample. The base sequence of the gene (i) can be determined, and the gene (i) interacting with the substance can be identified based on the base sequence.
<VII> When there are many types of samples selected in <V>, for each of the selected samples, (i) of <I> introduced into the cells in the sample Based on the information on the gene type of <i> to <v>, the <i> operation is repeated, and then <vi> operation is performed to identify the gene (i) that interacted with the substance. be able to.
That is, for example, when the following 10 types of samples are identified by <V>, the following operation can be performed.
(1) Selected sample 1: genes introduced into cells in (i) of <I> above: genes A, B, C
(2) Selected sample 2: Gene introduced into cells in (i) of <I> above: Genes A, D, E
(3) Selected sample 3: Gene introduced into cells in (i) of <I> above: Genes A, F, G
(4) Selected sample 4: Gene introduced into cell in (i) of <I> above: Genes A, H, I
(5) Selected sample 5: genes introduced into cells in (i) of <I> above: genes A, J, K
(6) Selected sample 6: Genes introduced into cells in (i) of <I> above: Genes A, L, M
(7) Selected sample 7: gene introduced into cell in (i) of <I> above: gene A, N, O
(8) Selected sample 8: genes introduced into cells in (i) of <I> above: genes A, P, Q
(9) Selected sample 9: Gene introduced into cell in (i) of <I> above: Gene A, RS
(10) Selected sample 10: Gene introduced into cells in (i) of <I> above: Genes A, T, U
上記のような場合には、前記〈I〉の(i)の遺伝子を、遺伝子A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T,及びUに限定する。次いで、これらの遺伝子から選ばれる１または複数を前記〈I〉と同様にしてPC12由来細胞に導入する。以下、前記〈I〉乃至〈V〉と同様の操作を繰り返し行う。 In the above case, the gene (i) in <I> is replaced with the genes A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O , P, Q, R, S, T, and U. Next, one or more selected from these genes are introduced into PC12-derived cells in the same manner as in the above <I>. Thereafter, the same operations as in <I> to <V> are repeated.
以下、実施例を以って本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to only the modes described in the examples.
実施例１
Ｈ１ヒスタミン受容体発現ベクターの構築
Ｈ１ヒスタミン受容体（pME-H1R）の発現ベクターを以下のようにして構築した。なお、以下「受容体」をレセプターと称することもある。
ウシ脳由来cDNA（Bovine QUICK-Clone
cDNA; CLONTECH製）を鋳型としてプライマーＦ３（5'-GCGAATTCCAATGACCTGTCCCAACTCC-3'）及びプライマーＲ３（5'-GCGCGGCCGCAGGCTTCCTCCTTCACTTCC-3'）を用いてＰＣＲを行い、Ｈ１ヒスタミン受容体のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI及びNotIにて消化した。発現ベクターpME18S（Mol. Cell. Biol., Vol.8, p.466, 1988（非特許文献３２）)を制限酵素EcoRi及びNotIにて消化し、上記のＤＮＡ断片をpME18Sにクローン化した。
本実験及び以後の全ての実験においてベクターへＰＣＲ断片をクローン化した後シークエンスを確認した。
Example 1
Construction of H1 Histamine Receptor Expression Vector An H1 histamine receptor (pME-H1R) expression vector was constructed as follows. Hereinafter, the “receptor” may be referred to as a receptor.
Bovine brain cDNA (Bovine QUICK-Clone
PCR using cDNA; CLONTECH) as a template with primer F3 (5'-GCGAATTCCAATGACCTGTCCCAACTCC-3 ') and primer R3 (5'-GCGCGGCCGCAGGCTTCCTCCTTCACTTCC-3'). The amplified DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and NotI. The expression vector pME18S (Mol. Cell. Biol., Vol. 8, p.466, 1988 (Non-patent Document 32)) was digested with restriction enzymes EcoRi and NotI, and the above DNA fragment was cloned into pME18S.
In this experiment and all subsequent experiments, the sequence was confirmed after cloning the PCR fragment into the vector.
実施例２
グルカゴン様ペプチド受容体発現ベクターの構築
グルカゴン様ペプチド（GLP1）受容体（pEF-GLPR）発現ベクターを以下のようにして構築した。
ヒト膵臓由来cDNA（Human Pancreas
QUICK-Clone cDNA; CLONTECH製）を鋳型として、プライマーＦ４（5'-GCGAATTCCCAGTCCTGAACTCC-3'）及びプライマーＲ４（5'-CGCTCGAGTCTCAGCTGCAGGAGG-3'）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI及びXhoIにて消化し、GLP1受容体のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、pCRII（TA Cloning Kit; Invitrogen製）のEcoRI-XhoIサイトにクローン化（pIT101）した。ついで、pIT101をSpeI及びXbaIで消化し（両制限酵素サイトはpCRII由来）、得られたＤＮＡ断片を、pEF-BOS（特開平2-242687号（特許文献８））のXbaI-XbaIサイトにクローン化した。
Example 2
Construction of glucagon-like peptide receptor expression vector A glucagon-like peptide (GLP1) receptor (pEF-GLPR) expression vector was constructed as follows.
Human pancreas cDNA (Human Pancreas
Using QUICK-Clone cDNA (manufactured by CLONTECH) as a template, PCR was performed using primer F4 (5'-GCGAATTCCCAGTCCTGAACTCC-3 ') and primer R4 (5'-CGCTCGAGTCTCAGCTGCAGGAGG-3'), and the amplified DNA fragment was subjected to restriction enzyme EcoRI And digested with XhoI to obtain a DNA fragment containing the coding region of GLP1 receptor. The obtained DNA fragment was cloned (pIT101) into the EcoRI-XhoI site of pCRII (TA Cloning Kit; manufactured by Invitrogen). Next, pIT101 is digested with SpeI and XbaI (both restriction enzyme sites are derived from pCRII), and the resulting DNA fragment is cloned into the XbaI-XbaI site of pEF-BOS (Japanese Patent Application Laid-Open No. H2-242687 (Patent Document 8)). Turned into.
実施例３
アドレナリンα２Ａ受容体発現ベクターの構築
アドレナリンα２Ａ受容体（pME-α2AR）の発現ベクターを以下のように構築した。
アドレナリンα２Ａ受容体遺伝子を、ATCC(American Type Culture Collection）から入手し、以下の手順でそのコーディング領域をｐME18S発現ベクターに組み込んだ。
すなわち、α２Ａのコーディング領域の上流（5'）側を制限酵素PvuII及びSacIで消化し、このＤＮＡ断片をpBluescript IIのSmaI-SacIサイトにクローン化した（pBlue-α2A5'）。
また、α２Ａのコーディング領域の下流（3'）側を制限酵素AccIで消化し、上記の上流側と一部オーバーラップするＤＮＡ断片を得、これをpBluescript IIのAccIサイトにクローン化した（pBlue-α2A3'）。
ついで、pBlue-α2A5'を制限酵素EcoRI（ベクター上の制限酵素サイト）及びFspI（α２Ａコーディング上の制限酵素サイト）で消化し、α２Ａのコーディング領域の上流（5'）側のＤＮＡ断片を得た。一方、pBlue-α2A3'を制限酵素FspI（pBlue-α2A5'のα２Ａコーディング上と同一位置の制限酵素サイト）及びNotI（ベクター上の制限酵素サイト）で消化し、α２Ａのコーディング領域の下流（3'）側のＤＮＡ断片を得た。このようにして得られたα２Ａのコーディング領域の上流及び下流のＤＮＡ断片をFspIサイトで連結し、pMe18SのEcoRI-NotIサイトにクローン化した。
Example 3
Construction of Adrenaline α2A Receptor Expression Vector An adrenaline α2A receptor (pME-α2AR) expression vector was constructed as follows.
The adrenaline α2A receptor gene was obtained from ATCC (American Type Culture Collection), and the coding region was incorporated into the pME18S expression vector by the following procedure.
That is, the upstream (5 ′) side of the coding region of α2A was digested with restriction enzymes PvuII and SacI, and this DNA fragment was cloned into the SmaI-SacI site of pBluescript II (pBlue-α2A5 ′).
Further, the downstream (3 ′) side of the coding region of α2A was digested with the restriction enzyme AccI to obtain a DNA fragment partially overlapping with the upstream side, and this was cloned into the AccI site of pBluescript II (pBlue− α2A3 ').
Subsequently, pBlue-α2A5 ′ was digested with restriction enzymes EcoRI (restriction enzyme site on the vector) and FspI (restriction enzyme site on α2A coding) to obtain a DNA fragment upstream (5 ′) of the coding region of α2A. . On the other hand, pBlue-α2A3 ′ is digested with restriction enzymes FspI (restriction enzyme site at the same position as the α2A coding of pBlue-α2A5 ′) and NotI (restriction enzyme site on the vector), and downstream of the coding region of α2A (3 ′ ) Side DNA fragment was obtained. The DNA fragments upstream and downstream of the coding region of α2A thus obtained were ligated at the FspI site and cloned into the EcoRI-NotI site of pMe18S.
実施例４
zif268プロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築。
zif268(EGR-1)プロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミド（pGL2-zif、以下zif-ルシフェラーゼと称することもある）を以下の手順により作成した。
ラットゲノミック ＤＮＡを鋳型として、プライマーＦ１（5'AGAGAGGGTACCAGCCTCAGCTCTACGCGCCT-3'）及びプライマーＲ１（5'-AGAGAGAAGCTTGAAGCTACTGAGGGCACACT-3'）を用いてＰＣＲを行い、zif268遺伝子のプロモーター領域［転写開始部位に対して-526〜+227（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.86,
p.377-381, 1989（非特許文献３３））］を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素SacIIにて消化後平滑末端処理を行い、その後に、さらに制限酵素KpnIにて消化し、-526〜+97の断片を得た。
真核細胞のプローモーター配列とエンハンサー配列を持たない発現ベクターpGL2-ベーシックベクター（PROMEGA社）を制限酵素HindIIIで消化後平滑末端処理を行い、その後に、制限酵素KpnIにて消化し、上記のzif268プロモーター断片（-526〜+97）をpGL2-ベーシックベクターのルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローン化した。
Example 4
Construction of zif268 promoter-luciferase reporter plasmid.
A zif268 (EGR-1) promoter-luciferase reporter plasmid (pGL2-zif, hereinafter sometimes referred to as zif-luciferase) was prepared by the following procedure.
Using rat genomic DNA as a template, PCR was performed using primer F1 (5'AGAGAGGGTACCAGCCTCAGCTCTACGCGCCT-3 ') and primer R1 (5'-AGAGAGAAGCTTGAAGCTACTGAGGGCACACT-3'), and the promoter region of zif268 gene [-526 to the transcription start site]. ~ + 227 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.86,
p.377-381, 1989 (non-patent document 33))]. The amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme SacII, subjected to blunt end treatment, and further digested with the restriction enzyme KpnI to obtain a fragment of -526 to +97.
The expression vector pGL2-basic vector (PROMEGA) without eukaryotic promoter sequence and enhancer sequence is digested with restriction enzyme HindIII, followed by blunt end treatment, followed by digestion with restriction enzyme KpnI, and the above zif268 The promoter fragment (-526 to +97) was cloned upstream of the luciferase gene of the pGL2-basic vector.
実施例５
c-fosプロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築
c-fosプロモーター−ルシフェラーゼレポータープラスミド（pGL2-fos、以下fosプロモーター−ルシフェラーゼレポーターと記載することもある）を以下のようにして構築した。
ヒトゲノミックＤＮＡを鋳型として、プライマーＦ２（5'-TCTCTCGGTACCGCAGGAACAGTGCTAGTATT-3'）及びプライマーＲ２（5'-TCTCTCAGATCTTGAAGCAGAGCTGGGTAGGA-3'）を用いてＰＣＲを行い、c-fos遺伝子のプロモーター領域［転写開始部位に対して-733〜+98（Endocrinology, Vol.136, p.4505-4516,
1995（非特許文献３４））； GenBank Accession No.M16287）］を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素BglII及びKpnIにて消化した。
発現ベクターpGL2-ベーシックベクター（PROMEGA社）を制限酵素BglII及びKpnIにて消化し、上記のＤＮＡ断片をpGL2-ベーシックベクターにクローン化した。
Example 5
Construction of c-fos promoter-luciferase reporter plasmid
A c-fos promoter-luciferase reporter plasmid (pGL2-fos, hereinafter sometimes referred to as fos promoter-luciferase reporter) was constructed as follows.
Using human genomic DNA as a template, PCR was performed using primer F2 (5'-TCTCTCGGTACCGCAGGAACAGTGCTAGTATT-3 ') and primer R2 (5'-TCTCTCAGATCTTGAAGCAGAGCTGGGTAGGA-3'), and the promoter region of the c-fos gene [to the transcription start site] -733 to +98 (Endocrinology, Vol.136, p.4505-4516,
1995 (Non-Patent Document 34)); GenBank Accession No. M16287)] was amplified. The amplified DNA fragment was digested with restriction enzymes BglII and KpnI.
The expression vector pGL2-basic vector (PROMEGA) was digested with restriction enzymes BglII and KpnI, and the above DNA fragment was cloned into the pGL2-basic vector.
実施例６
薬剤耐性ベクターの構築
以下の実施例において使用されるピューロマイシン耐性ベクター（pCMV-Pur）は以下のようにして調製した。
pPURプラスミド（CLONTECH製）を制限酵素HindIII、XbaIにて消化し、ピューロマイシン耐性構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、発現ベクターpIRESIhyg（CLONTECH製）のHindIII-XbaIサイトにクローン化した。
Example 6
Construction of drug resistance vector The puromycin resistance vector (pCMV-Pur) used in the following examples was prepared as follows.
The pPUR plasmid (manufactured by CLONTECH) was digested with restriction enzymes HindIII and XbaI to obtain a DNA fragment containing the puromycin resistance structural gene. This DNA fragment was cloned into the HindIII-XbaI site of the expression vector pIRESIhyg (manufactured by CLONTECH).
実施例７
Ｇq情報伝達系を活性化するリガンド／受容体によるレポーター遺伝子の活性化（ヒスタミンによるＨ１ヒスタミン受容体(Ｈ１Ｒ)を介したzif-ルシフェラーゼの活性化）。
Ｇq情報伝達系を活性化するヒスタミン／Ｈ１ヒスタミン受容体の、本発明アッセイ系におけるレポーター遺伝子の活性化の例を以下に示す。
PC12h細胞をコラーゲンコート処理済み24穴プレート（IWAKI製）に１ｘ105細胞／ウェルになるように播いた。培地にはD-MEM(10％ 馬血清, ５％牛胎児血清 , ペニシリン５０単位/ml, ストレプトマイシン５０μg/ml)を用いた。該細胞を37℃で１日培養後に、製造業者の説明書に従いリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL製）を用いて、受容体発現ベクター（pME-H1R; 200ng／ウェル）及びレポータープラスミド（pGL2-zif; 20ng/ウェル）で共形質転換（co-transfection）した。
約６時間後にトランスフェクション液を捨て、低血清D-MEM培地（0.5％馬血清, 0.25％牛胎児血清,
ペニシリン50単位／ml, ストレプトマイシン50μg/ml)をウェル当たり１ml加えた。２日間37℃で培養後に、ヒスタミンを最終濃度10nM〜1mMになる様に加えた。６時間37℃で培養後に培地を捨て、細胞をリン酸緩衝生理食塩溶液で２回洗浄後、細胞溶解バッファー（レポーターリシスバッファー；PROMEGA製）をウェル当たり100μl加え細胞を溶解させ、溶解液の一部（10μl）をルシフェラーゼ活性測定に供した。ルシフェラーゼ活性は、基質にルシフェラーゼアッセイシステム（PROMEGA製）を用いて、測定器にLUMINOUS CT-9000D（DIA-IATRON製）を用いて行った。
図１に示す様に、レポーター遺伝子産物であるルシフェラーゼの活性はリガンドであるヒスタミンの濃度に依存して増加し、例えばヒスタミン0.1μMではヒスタミン非添加の32倍、100μMでは123倍の増加が認められ、本アッセイ系が従来技術に比較してはるかに高い応答性を示すことが示された。
なお、PC12h細胞を、該ヒスタミン受容体発現ベクターの代わりに、pME18Sベクタープラスミドで形質転換した場合には、ヒスタミンによるレポーター遺伝子の活性化は見られず、この反応が強制発現したＨ１受容体特異的であることも確認している。
Example 7
Activation of a reporter gene by a ligand / receptor that activates the Gq signal transduction system (activation of zif-luciferase by Histamine through H1 histamine receptor (H1R)).
An example of activation of a reporter gene in the assay system of the present invention of the histamine / H1 histamine receptor that activates the Gq signal transduction system is shown below.
PC12h cells were seeded at 1 × 10 5 cells / well in a collagen-coated 24-well plate (IWAKI). D-MEM (10% horse serum, 5% fetal calf serum,
After about 6 hours, the transfection solution is discarded and low serum D-MEM medium (0.5% horse serum, 0.25% fetal bovine serum,
As shown in FIG. 1, the activity of the luciferase, which is a reporter gene product, increases depending on the concentration of the ligand histamine. For example, histamine 0.1 μM has a 32 times increase without addition of histamine, and 100 μM has a 123 fold increase. The assay system was shown to be much more responsive than the prior art.
When PC12h cells were transformed with the pME18S vector plasmid instead of the histamine receptor expression vector, activation of the reporter gene by histamine was not observed, and this reaction was forcibly expressed in the H1 receptor specific It is also confirmed that.
実施例８
Ｇs情報伝達系を活性化するリガンド／受容体によるレポーター遺伝子の活性化。
Ｇs情報伝達系を活性化する、グルカゴン様ペプチド（GLP）/GLP1受容体の本発明アッセイ系におけるレポーター遺伝子の活性化の例を以下に示す。
使用した受容体発現ベクター（pEF-GLPR）及びリガンドが異なる以外、他の条件は実施例７と同様に行った。GLP（7-37、WAKO製）刺激は１pM〜10nMで行った。図２に示すように、GLP濃度依存的にルシフェラーゼ活性の増加が認められ、例えば、10pMで12倍、10nMで50倍のルシフェラーゼ活性の増加が認められた。
Example 8
Activation of a reporter gene by a ligand / receptor that activates the Gs signaling system.
An example of activation of a reporter gene in the assay system of the present invention of glucagon-like peptide (GLP) / GLP1 receptor that activates the Gs signal transduction system is shown below.
Other conditions were the same as in Example 7 except that the receptor expression vector (pEF-GLPR) and the ligand used were different. GLP (7-37, manufactured by WAKO) stimulation was performed at 1 pM to 10 nM. As shown in FIG. 2, an increase in luciferase activity was observed depending on the GLP concentration. For example, an increase in luciferase activity of 12-fold at 10 pM and 50-fold at 10 nM was observed.
実施例９
Ｇi情報伝達系を活性化するリガンド／受容体によるレポーター遺伝子活性化の変化。
アドレナリンα2A受容体のリガンドの１つであるUK14304は、10nM程度でＧi情報伝達系を活性化することが知られている。また、Ｇs情報伝達系のアデニレートシクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンによって活性化されたＧｓ情報伝達系は、10nM程度のUK14304で抑制されることが知られている。この現象を本発明アッセイ系で評価した例を以下に示す。
薬剤の刺激条件、及び、受容体発現ベクターにアドレナリンα2A受容体発現ベクター（pME-α2AR）を使用した以外は実施例７と同じ条件で行った。薬剤刺激は、フォルスコリン（RBI Research Biochemicals International; 10μM）あるいは、フォルスコリン（10μM）とUK14304（RBI Research Biochemicals International; 10ｎM）で10分間、37℃で行い、培地を低血清D-MEM培地（0.5％馬血清, 0.25％牛胎児血清,
ペニシリン50単位/ml, ストレプトマイシン50μｇ/ml)に交換後さらに約６時間、37℃培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
図３に示すように、アデニレートシクラーゼ活性化剤であるフォルスコリン刺激によりルシフェラーゼ活性は約10倍増加し、10nMのUK14304によるＧsの阻害（Giの活性化）はルシフェラーゼ活性の約40％の減少としてとらえられることが示された。
Example 9
Changes in reporter gene activation by ligands / receptors that activate the Gi signaling system.
UK14304, which is one of the ligands of the adrenergic α2A receptor, is known to activate the Gi signaling system at about 10 nM. Further, it is known that the Gs information transmission system activated by forskolin, which is an adenylate cyclase activator of the Gs information transmission system, is suppressed by UK14304 of about 10 nM. An example of evaluating this phenomenon with the assay system of the present invention is shown below.
The conditions were the same as in Example 7 except that the drug stimulation conditions and the adrenaline α2A receptor expression vector (pME-α2AR) were used as the receptor expression vector. Drug stimulation is performed with forskolin (RBI Research Biochemicals International; 10 μM) or forskolin (10 μM) and UK14304 (RBI Research Biochemicals International; 10 nM) for 10 minutes at 37 ° C., and the medium is low serum D-MEM medium (0.5 μm). % Horse serum, 0.25% fetal bovine serum,
After exchanging with
As shown in FIG. 3, the stimulation of forskolin, an adenylate cyclase activator, increased the luciferase activity by about 10-fold, and the inhibition of Gs (activation of Gi) by 10 nM UK14304 was about 40% of the luciferase activity. It was shown to be seen as a decrease.
実施例１０
ＧqiキメラＧ蛋白質発現ベクターの構築
ＧqiキメラＧ蛋白質発現ベクターpME-Gqiを以下のようにして構築した。
Ｇ蛋白質Ｇqのαサブユニットのカルボキシ末端側９アミノ酸残基を、Ｇ蛋白質Ｇiのαサブユニットのカルボキシ末端側の９アミノ酸残基に置き換えたキメラＧ蛋白質の発現ベクター）を以下のようにして調製した。
マウスの脳より調製したＲＮＡから、オリゴｄＴプライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型としてプライマーＦ５（5'-GGACTAGTGAGGCACTTCGGAAGAATGACTCTGGA-3'）及びプライマーＲ５（5'-GGACTAGTTAGAACAGACCGCAATCCTTCAGGTTATTCTGCAGG-3'）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を制限酵素SpeIにて消化した。なお、プライマーＲ５の一部の塩基配列（GAACAGACCGCAATCCTTCAGGTTATT）の相補鎖配列はＧiのＣ末端アミノ酸配列をコードし、他の一部の塩基配列（CTGCAGG-3'）の相補鎖配列はＧqのアミノ酸配列をコードしている。
発現ベクターpME18Sを制限酵素XhoIにて消化し、セルフライゲーション反応により、XhoI断片（スタッファー断片）を含まない発現ベクターを作製した。その後、その発現ベクターを制限酵素SpeIにて消化後、上記のＰＣＲにて増幅したＤＮＡ断片をpME18SのSpeIサイトにクローン化した。
Example 10
Construction of Gqi chimeric G protein expression vector A Gqi chimeric G protein expression vector pME-Gqi was constructed as follows.
A chimeric G protein expression vector in which the 9 amino acid residues on the carboxy terminal side of the α subunit of G protein Gq were replaced with the 9 amino acid residues on the carboxy terminal side of the α subunit of G protein Gi was prepared as follows. did.
CDNA was synthesized from RNA prepared from mouse brain using oligo dT primer. Using this cDNA as a template, PCR was performed using primer F5 (5′-GGACTAGTGAGGCACTTCGGAAGAATGACTCTGGA-3 ′) and primer R5 (5′-GGACTAGTTAGAACAGACCGCAATCCTTCAGGTTATTCTGCAGG-3 ′), and the amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme SpeI. The complementary chain sequence of a part of the base sequence of primer R5 (GAACAGACCGCAATCCTTCAGGTTATT) encodes the C-terminal amino acid sequence of Gi, and the complementary chain sequence of the other part of the base sequence (CTGCAGG-3 ') is the amino acid sequence of Gq. Is coded.
The expression vector pME18S was digested with the restriction enzyme XhoI, and an expression vector containing no XhoI fragment (stuffer fragment) was prepared by self-ligation reaction. Thereafter, the expression vector was digested with the restriction enzyme SpeI, and the DNA fragment amplified by the PCR was cloned into the SpeI site of pME18S.
実施例１１
受容体／レポーター／ＧqiキメラＧ蛋白質を組み合わせることによるＧｓ，Ｇq，Ｇi共役型受容体を介したレポーター遺伝子の活性化。
実施例７乃至実施例９に示したように、本アッセイ系ではＧs及びＧqの情報伝達をルシフェラーゼ活性の増加という形で感度よくとえれられ、Ｇiの情報伝達はフォスルコリン等を用いたＧs情報伝達系の活性化と組み合わせることで、ルシフェラーゼ活性の抑制という形でとらえられる。
一方、Ｇq蛋白質αサブユニットのＣ末端側の４から９残基程度をＧi蛋白質のαサブユニットにおきかえたキメラＧ蛋白質（Ｇqi）は、Ｇi共役型受容体に結合し、Ｇq情報伝達系を活性化することがすでに報告されている（Nature, Vol.363, p.274-276, 1993（非特許文献３５）;
Molecular Pharmacology, Vol.50, p.923-930, 1996（非特許文献３６））。
本発明アッセイ系において、細胞中にさらにＧq蛋白質αサブユニットのＣ末端側の９残基をＧi蛋白質のαサブユニットにおきかえたＧqiのキメラＧ蛋白質を強制発現させることにより、Ｇs及びＧqのみならずＧiの任意と共役する受容体を介した情報伝達もルシフェラーゼ活性の増加の形でとらえられる例を以下に示す。
トランスフェクションには、ウェル当たり、受容体発現ベクター（100ng）、レポータープラスミド（pGL2-zif; 20ng）、Ｇqi発現ベクター（pME-Gqi; 30mg）を用いた。なお、最終プラスミド量をウェルあたり200ngにそろえる目的で、pME18Sベクタープラスミドを50ng加えた。他の条件は実施例７と同じとした。
図４に示すように、Ｇi情報伝達系を活性化する10nMのUK14304刺激によりルシフェラーゼ活性は18倍程度増強され、Ｇi情報伝達系をルシフェラーゼ活性の増加として感度良くとらえられることが示された。
また、Ｈ１受容体発現ベクター（Ｇq情報伝達系）あるいはGLP受容体発現ベクター（Ｇs情報伝達系）をＧqi発現ベクター及びレポータープラスミドで共形質転換した細胞を、ヒスタミンあるいはGLPで刺激した場合も、それぞれの情報伝達系活性化を、それぞれ約160倍及び９倍のルシフェラーゼ活性の増加としてとらえられることが示された。
すなわち、PC12h細胞を、受容体発現ベクター、レポータープラスミド、及びＧqi発現ベクターで共形質転換（co-transfection）することにより、Ｇq、Ｇs、及びＧiの任意を介する情報伝達系活性化の全てをルシフェラーゼ活性の増加として感度良く検出できることが示された。
Example 11
Activation of a reporter gene via a Gs, Gq, Gi-coupled receptor by combining a receptor / reporter / Gqi chimeric G protein.
As shown in Example 7 to Example 9, in this assay system, Gs and Gq information can be transmitted with high sensitivity in the form of an increase in luciferase activity, and Gi information can be transmitted using fosulcholine or the like. Combined with the activation of the system, it is captured in the form of suppression of luciferase activity.
On the other hand, the chimeric G protein (Gqi), in which about 4 to 9 residues on the C-terminal side of the Gq protein α subunit are replaced with the α subunit of the Gi protein, binds to the Gi-coupled receptor and establishes the Gq signal transduction system. It has already been reported to be activated (Nature, Vol.363, p.274-276, 1993 (Non-patent Document 35);
Molecular Pharmacology, Vol. 50, p. 923-930, 1996 (Non-patent Document 36)).
In the assay system of the present invention, the Gqi chimeric G protein in which 9 residues at the C-terminal side of the Gq protein α subunit are replaced with the α subunit of the Gi protein in the cell is forced to express only Gs and Gq. The following is an example in which information transmission via a receptor coupled with any of Gi is also considered in the form of an increase in luciferase activity.
For transfection, a receptor expression vector (100 ng), a reporter plasmid (pGL2-zif; 20 ng), and a Gqi expression vector (pME-Gqi; 30 mg) were used per well. In order to adjust the final plasmid amount to 200 ng per well, 50 ng of pME18S vector plasmid was added. Other conditions were the same as in Example 7.
As shown in FIG. 4, luciferase activity was enhanced about 18-fold by 10 nM UK14304 stimulation that activates the Gi signaling system, indicating that the Gi signaling system can be detected with high sensitivity as an increase in luciferase activity.
In addition, when H1 receptor expression vector (Gq signal transduction system) or GLP receptor expression vector (Gs signal transduction system) is co-transformed with Gqi expression vector and reporter plasmid, the cells are stimulated with histamine or GLP, respectively. It has been shown that the activation of the signal transduction system can be regarded as an increase in luciferase activity of about 160-fold and 9-fold, respectively.
That is, by co-transfection of a PC12h cell with a receptor expression vector, a reporter plasmid, and a Gqi expression vector, all of the information transmission system activation via any of Gq, Gs, and Gi is luciferase. It was shown that the increase in activity can be detected with high sensitivity.
実施例１２
受容体遺伝子／レポーター遺伝子安定形質転換体の作製及び安定形質転換体のリガンドに対する応答性。
PC12h細胞をコラーゲンコート済みのシャーレ（内径10cm；IWAKI製）に３ｘ106個播き１日培養した後に、製造業者の説明書に従いリポフェクトアミン試薬（GIBCO BRL製）を用いて、レポータープラスミド（pGL2-zifあるいはpGL2-fos；６μｇ)及び薬剤耐性プラスミド（pBK-CMV；ネオマイシン耐性遺伝子（STRATAGENE製）若しくはpCMV-pur；ピューロマイシン耐性遺伝子(0.6μg））で共形質転換（co-transfection）した。約６時間後にトランスフェクション液を捨て、D-MEM培地（10％馬血清, ５％牛胎児血清, ペニシリン50単位/ml, ストレプトマイシン50μg/ml)をシャーレ当たり10ml加えた。２日間37℃で培養後に、細胞を１／３に希釈し、選択薬剤（G418；GIBCO BRL製、あるいはピューロマイシン；SIGMA製）を加えた。１〜２週間後に、シャーレ内に形成されたコロニーをコラーゲンコート済み24穴プレート（IWAKI製）にピックアップした。培養を続け各クローン（細胞）が十分に増殖した時点で、各クローンのレポーター活性を以下の方法で測定した。すなわち、PC12h細胞をNGF（Nerve
Growth Factor）で刺激することにより、本発明アッセイ系で使用しているレポーター遺伝子（pGL2-zifまたはpGL2-fos）が活性化される性質を利用して、各クローンを実施例７と同様に24穴プレートに播き、トランスフェクション操作は行わず、２日後にNGF刺激を行い、６時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。そして、無刺激でのルシフェラーゼ活性が低く、NGF刺激で高い応答性を示すクローンを選択した。選択されたクローンについて、限界希釈法により細胞のクローン化を再度行いレポーター遺伝子安定形質転換体を樹立した。
ついで、ネオマイシン耐性遺伝子及びzif268レポーター遺伝子安定形質転換体の１クローンであるz/n36-2を、Ｈ１ヒスタミン受容体発現ベクター（pME-H1R; ６μｇ）及び薬剤耐性プラスミド（pBS-pur；ピューロマイシン耐性; 0.6μｇ）で共形質転換した。
上記と同様の方法でコロニーをピックアップし、得られたＨ１ヒスタミン受容体／zif268-レポーター遺伝子安定形質転換体の各クローンについて、ヒスタミンに対する応答性を測定し、高応答性のクローンを選択した。
同様の方法で、アドレナリンα2A受容体／zif268-レポーター遺伝子、GLP1受容体／zif268-レポーター遺伝子をそれぞれに発現する安定形質転換体を樹立した。
これらの安定形質転換体は表１に示すように、何れも受容体に対応したリガンドに対して高い応答性を持つことが示された。
Example 12
Preparation of receptor gene / reporter gene stable transformant and responsiveness of stable transformant to ligand.
The PC12h cell collagen-coated Petri dish; after culturing 3x10 6 cells were plated 1 day (inner diameter 10cm Ltd. IWAKI), using Lipofectamine reagent (manufactured by GIBCO BRL) according to the manufacturer's instructions, the reporter plasmid (pGL2- zif or pGL2-fos (6 μg) and a drug resistance plasmid (pBK-CMV; neomycin resistance gene (manufactured by STRATAGENE) or pCMV-pur; puromycin resistance gene (0.6 μg)) were co-transfected. About 6 hours later, the transfection solution was discarded, and 10 ml of D-MEM medium (10% horse serum, 5% fetal calf serum,
By utilizing the property that the reporter gene (pGL2-zif or pGL2-fos) used in the assay system of the present invention is activated by stimulating with the growth factor, each clone is treated in the same manner as in Example 7. The cells were seeded in a well plate, no transfection operation was performed, NGF stimulation was performed 2 days later, and luciferase activity was measured 6 hours later. Then, clones were selected that showed low luciferase activity without stimulation and high responsiveness with NGF stimulation. The selected clone was cloned again by the limiting dilution method to establish a stable reporter gene transformant.
Subsequently, z / n36-2 which is one clone of neomycin resistance gene and zif268 reporter gene stable transformant was transformed into H1 histamine receptor expression vector (pME-H1R; 6 μg) and drug resistance plasmid (pBS-pur; puromycin resistance). 0.6 μg).
Colonies were picked up in the same manner as described above, and the responsiveness to histamine was measured for each of the resulting H1 histamine receptor / zif268-reporter gene stable transformants, and a highly responsive clone was selected.
In the same manner, stable transformants expressing adrenaline α2A receptor / zif268-reporter gene and GLP1 receptor / zif268-reporter gene were established.
As shown in Table 1, all of these stable transformants were shown to have high responsiveness to ligands corresponding to the receptors.
実施例１３
宿主細胞とレポーター遺伝子発現調節プロモーターとの各種組み合せでのレポーター遺伝子の応答性の比較
ヒスタミン／Ｈ１ヒスタミン受容体間の相互作用で誘導されるシグナル伝達のレポータージーンアッセイによる検出において、該レポーター遺伝子の該シグナルに対する応答性を、各種の宿主細胞（PC12h細胞、PC12細胞、CHO細胞またはCOS細胞）と各種のプロモーター／レポーター遺伝子（zif-ルシフェラーゼレポーター遺伝子またはfos-ルシフェラーゼレポーター遺伝子）を組み合せることにより検証した。
PC12h細胞、PC12細胞、CHO細胞、COS細胞、それぞれに、レポータープラスミド（pGL2-zifあるいはpGL2-fos）、及び、受容体発現ベクター（pME-H1R）をトランスフェクトし、ヒスタミン刺激に応答したルシフェラーゼ活性化を測定した。トランスフェクションからルシフェラーゼ活性測定までの一連の操作及び条件は、実施例７に準じた。
表２に示すように、PC12h細胞／zif-ルシフェラーゼの組み合わせが最も高いリガンド応答性（130倍の活性化）を示した。一方、他の組み合わせについても応答性は落ちるものの、何れの組み合わせにおいてもリガンド（ヒスタミン）によるレポーター遺伝子の活性化が認められた。
Example 13
Comparison of reporter gene responsiveness in various combinations of host cells and reporter gene expression-regulated promoters In the detection of signal transduction induced by the interaction between histamine / H1 histamine receptors, the signal of the reporter gene Responsiveness to the cells was verified by combining various host cells (PC12h cells, PC12 cells, CHO cells or COS cells) with various promoter / reporter genes (zif-luciferase reporter gene or fos-luciferase reporter gene).
PC12h cells, PC12 cells, CHO cells, and COS cells were each transfected with a reporter plasmid (pGL2-zif or pGL2-fos) and a receptor expression vector (pME-H1R), and luciferase activity in response to histamine stimulation Measured. A series of operations and conditions from transfection to luciferase activity measurement were in accordance with Example 7.
As shown in Table 2, the combination of PC12h cells / zif-luciferase showed the highest ligand responsiveness (130-fold activation). On the other hand, activation of the reporter gene by a ligand (histamine) was observed in any combination, although the responsiveness of other combinations also decreased.
実施例１４
MAPキナーゼの活性化を指標としたシグナル伝達の検出とレポーター遺伝子の発現を指標としたシグナル伝達の検出の比較
ヒスタミン／Ｈ１受容体間の相互作用により誘導されるシグナル伝達を、MAPキナーゼ（mitogen activated protein kinase）の活性化を指標として解析した。
該H1受容体発現細胞の作製の宿主細胞として、PC12h細胞、CHO細胞、CV1細胞、及びHEK293細胞を用い、各種細胞でのMAPキナーゼの活性化の程度を比較した。
MAPキナーゼ活性化測定にはPathDetect
Elk1trans Reporting System(pFR Luc プラスミド; レポータープラスミド；pFA2 Elk1プラスミド；及びフュージョントランスアクティベータープラスミドを含む。STRATAGENE製）を用いた。PC12h細胞、CHO細胞、CV1細胞、HEK293細胞（0.5〜２ｘ105細胞／ウェル）をコラーゲンコート済み24穴プレート（IWAKI製）に撒き、それぞれの細胞に、pFR Luc（40〜200ng/ウェル）、pFA2 Elk1（10〜300ng/ウェル）、及び受容体発現ベクター（pME-H1R；200〜400ng/ウェル）をトランスフェクトし、ヒスタミン刺激に応答したルシフェラーゼ活性化を測定した。トランスフェクションにはSuperFectトランスフェクション試薬（1.5〜５μl/ウェル；QUAGEN製、カタログ番号：#301307）を用いて、製造業者の説明書に従いコトランスフェクトした。なお、試験に用いた細胞数、各種プラスミド及びトランスフェクション試薬の量は、事前に検討した各細胞に最適な条件に設定した。
ヒスタミン刺激からルシフェラーゼ活性測定までの一連の操作は実施例７に準じた。
表３に示すように、リガンドと受容体の相互作用により誘導されるシグナル伝達の有無をMAPキナーゼ活性化を指標として検出した場合には、検出の感度は、前記実施例で示したzif-ルシフェラーゼをレポーターに用いた場合に比べ極めて低いことが示された。
しかしながら、MAPキナーゼ活性化を指標としたシグナルの検出においても、該受容体を発現させる宿主細胞については、前記実施例で示したzif-ルシフェラーゼを用いるレポータージーンアッセイでのシグナル伝達と同様に、PC12h細胞を用いた場合に最も感度良くシグナル伝達を捉えられることが示された。
Example 14
Comparison of detection of signal transduction using MAP kinase activation as an indicator and detection of signal transduction using reporter gene expression as an indicator Signal transduction induced by histamine / H1 receptor interaction is expressed by MAP kinase (mitogen activated Protein kinase) activation was analyzed as an index.
PC12h cells, CHO cells, CV1 cells, and HEK293 cells were used as host cells for producing the H1 receptor-expressing cells, and the degree of activation of MAP kinase in various cells was compared.
PathDetect for MAP kinase activation measurement
Elk1trans Reporting System (including pFR Luc plasmid; reporter plasmid; pFA2 Elk1 plasmid; and fusion transactivator plasmid, manufactured by STRATAGENE) was used. PC12h cells, CHO cells, CV1 cells, HEK293 cells (0.5-2 × 10 5 cells / well) are spread on a collagen-coated 24-well plate (IWAKI). Elk1 (10-300 ng / well) and receptor expression vector (pME-H1R; 200-400 ng / well) were transfected and luciferase activation in response to histamine stimulation was measured. For transfection, SuperFect transfection reagent (1.5 to 5 μl / well; manufactured by QUAGEN, catalog number: # 301307) was used for cotransfection according to the manufacturer's instructions. The number of cells used in the test, the amount of various plasmids, and the transfection reagent were set to the optimum conditions for each cell examined in advance.
A series of operations from histamine stimulation to luciferase activity measurement was in accordance with Example 7.
As shown in Table 3, when the presence or absence of signal transduction induced by the interaction between the ligand and the receptor is detected using MAP kinase activation as an index, the sensitivity of the detection is the zif-luciferase shown in the above example. It was shown to be very low compared with the case where is used as a reporter.
However, even in the detection of a signal using MAP kinase activation as an indicator, the host cell that expresses the receptor is the same as the signal transduction in the reporter gene assay using zif-luciferase shown in the above-mentioned Examples. It was shown that signal transduction can be captured with the highest sensitivity when using.
実施例１５
ＳＲＥをプロモーターに有するレポーター遺伝子とzif268-レポーター遺伝子の応答性の比較
zif268(EGR-1)プロモーターにはSRE(serum
response element）が４ヵ所含まれている。そこで、SREをプロモーターに有するレポーター遺伝子とzifレポーター遺伝子の応答性を、ヒスタミン／Ｈ１ヒスタミン受容体発現細胞及びGLP/GLP1受容体発現細胞の各々について比較検討した例を以下に示す。
PC12h細胞に、レポータープラスミド（pGL2-zifあるいはpSRE-Luc［SREをプロモーターに有するルシフェラーゼレポータープラスミド；STRATAGENE製、カタログ番号：＃219080］）、及び受容体発現ベクター（pME-H1RあるいはpEF-GLPR）をトランスフェクトし、リガンド刺激に応答したルシフェラーゼ活性化を測定した。トランスフェクションからルシフェラーゼ活性測定までの一連の操作及び条件は、実施例７に準じた。
表４に示すように、zif-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた場合には、ヒスタミン／Ｈ１ヒスタミン受容体発現細胞及びGLP/GLP1受容体発現細胞のいずれにおけるシグナル伝達の検出においても高い応答性を示した。
一方、SRE-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた場合には、ヒスタミン／Ｈ１ヒスタミン受容体発現細胞系でのシグナル伝達には応答するものの、その程度はzif-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いる場合に比べると約１／２であり、またGLP/GLP1受容体発現細胞でのシグナル伝達に対しての応答性は低いものであった。
Example 15
Comparison of responsiveness between reporter gene with SRE promoter and zif268-reporter gene
zif268 (EGR-1) promoter contains SRE (serum
4 response elements) are included. Thus, an example in which the responsiveness of a reporter gene having an SRE promoter and a zif reporter gene is compared for each of a histamine / H1 histamine receptor-expressing cell and a GLP / GLP1 receptor-expressing cell is shown below.
Reporter plasmid (pGL2-zif or pSRE-Luc [luciferase reporter plasmid with SRE as promoter; manufactured by STRATAGENE, catalog number: # 219080]) and receptor expression vector (pME-H1R or pEF-GLPR) Transfected and luciferase activation in response to ligand stimulation was measured. A series of operations and conditions from transfection to luciferase activity measurement were in accordance with Example 7.
As shown in Table 4, when the zif-luciferase reporter gene was used, it showed high responsiveness in detection of signal transduction in both histamine / H1 histamine receptor-expressing cells and GLP / GLP1 receptor-expressing cells. .
On the other hand, when the SRE-luciferase reporter gene is used, it responds to signal transduction in the histamine / H1 histamine receptor-expressing cell line, but the extent is about 1 / compared to that when the zif-luciferase reporter gene is used. 2 and the response to signal transduction in GLP / GLP1 receptor-expressing cells was low.
「配列表フリーテキスト」
配列番号：１
他の情報：人工配列についての記載：プライマーF3
配列番号：２
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配列番号：３
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配列番号：４
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配列番号：９
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他の情報：人工配列についての記載：プライマーR5
SEQ ID NO: 1
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Claims (9)
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｄ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。 A method for identifying a receptor that interacts with a substance, comprising the following steps (a) to (d) (wherein the substance acts as an agonist for the receptor): :):
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a); and (d) Determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (a) possessed by cells in the selected sample.
（ａ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）蛋白質をコードする１または複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｂ）工程（ａ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ａ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；
（ｄ）少なくとも下記（１）及び（２）の外来性遺伝子：
（１）工程（ｃ）で選択された該試料中の細胞が有する外来性遺伝子であ
って、工程（ａ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする１または
複数の遺伝子；及び
（２）Ｇ蛋白質を介する刺激により発現が誘導される遺伝子のプロモータ
ー領域に発現可能に連結されたレポーター遺伝子；
を有するＰＣ１２由来細胞からなる試料の複数を準備し、該試料の各々に該物質を接触させる工程（ここで、該各々の試料中の該細胞は、試料毎に互いに異なる前記（１）の遺伝子を有する。）；
（ｅ）工程（ｄ）で該物質に接触させた各々の試料について、該試料中の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルを、及び所望に応じて該物質に接触させていない該各々の試料の各細胞において発現した該レポーター遺伝子が生ずる検出可能なシグナルの各々を定量的に決定する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で決定した該各々試料についてのシグナルの量を互いに比較し、工程（ｄ）で試験された該複数の試料から１または複数の試料を選択する工程；及び
（ｇ）該選択された試料中の細胞が有する工程（ｄ）の（１）に記載の該蛋白質をコードする遺伝子を塩基配列を決定する工程。 A method for identifying a receptor that interacts with a substance, comprising the following steps (a) to (g) (wherein the substance acts as an agonist for the receptor): :)
(A) At least exogenous genes (1) and (2) below:
(1) one or more genes encoding a protein; and (2) a promoter of a gene whose expression is induced by stimulation through a G protein.
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(B) For each sample contacted with the substance in step (a), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(C) comparing the amount of signal for each sample determined in step (b) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (a);
(D) At least exogenous genes of (1) and (2) below:
(1) A foreign gene possessed by cells in the sample selected in step (c)
1 which encodes the protein according to (1) of step (a) or
A plurality of genes; and (2) promoters of genes whose expression is induced by stimulation via G protein
A reporter gene operably linked to the region;
Preparing a plurality of samples made of PC12-derived cells having a contact with the substance (wherein the cells in each sample are different from one another in each sample) );
(E) For each sample contacted with the substance in step (d), a detectable signal generated by the reporter gene expressed in each cell in the sample, and optionally contacted with the substance Quantitatively determining each of the detectable signals produced by the reporter gene expressed in each cell of the respective sample not present;
(F) comparing the amount of signal for each of the samples determined in step (e) with each other and selecting one or more samples from the plurality of samples tested in step (d); and (g) A step of determining the nucleotide sequence of the gene encoding the protein according to (1) of step (d) possessed by cells in the selected sample.
（ａ）ＧαｑのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の一
部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする遺伝
子；
（ｂ）ＧαｓのＣ末端アミノ酸配列の一部がＧαｉのＣ末端アミノ酸配列の一
部に置換されてなるキメラＧ蛋白質Ｇαサブユニットをコードする遺伝
子；または、
（ｃ）受容体特異性を有さずに受容体と共役し、フォスフォリパーゼＣを活性
化することによりシグナルを伝達するＧ蛋白質をコードする遺伝子。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the PC12-derived cell further has a foreign gene of any of the following (a) to (c):
(A) a gene encoding a chimeric G protein Gα subunit in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαq is substituted with a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαi;
(B) a gene encoding a chimeric G protein Gα subunit in which a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαs is substituted with a part of the C-terminal amino acid sequence of Gαi; or
(C) A gene encoding a G protein that transmits a signal by activating phospholipase C, coupled to a receptor without receptor specificity.
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