JP2005106570A - Measuring method of intraoral number of mutans streptococcus - Google Patents

Measuring method of intraoral number of mutans streptococcus Download PDF

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Sei Fujita
聖 藤田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a measuring method of the intraoral number of mutans streptococci capable of measuring accurately and simply the number of mutans streptococci in a specimen, concerning a conventional method wherein bacteria in the specimen such as saliva or plaque are multiplied to form colonies, and the number of the bacteria is determined from the number of the colonies. <P>SOLUTION: In this measuring method of the intraoral number of mutans streptococci, the specimen collected from inside a mouth cavity of a subject is applied on agar media, and the bacteria in the specimen are multiplied under necessary conditions in each agar medium to form a colony group, and the bacteria forming the colonies are identified to be the mutans streptococci by utilizing an antigen-antibody reaction to the plurality of colonies selected optionally from the colony group, and the number of mutans streptococci in the specimen is determined from the number of colonies on the agar media, the number of the plurality of colonies selected optionally, and the number of colonies identified to be the mutans streptococci. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、口腔内のミュータンス連鎖球菌数を正確且つ簡単に測定することが可能な唾液中や歯垢中のミュータンス連鎖球菌数の測定方法に関するものである。   The present invention relates to a method for measuring the number of mutans streptococci in saliva and plaque that can accurately and easily measure the number of mutans streptococci in the oral cavity.

ヒトの口腔内におけるミュータンス連鎖球菌の存在と齲蝕の発生との間には密接な関係があることが知られており、ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の有無や量を簡便に検査できれば齲蝕に対する罹患リスクや現在の罹患状況の把握ができ、極めて多くの人々に恩恵をもたらすことが可能である。   It is known that there is a close relationship between the presence of mutans streptococci in the human oral cavity and the occurrence of caries, and if the presence or amount of mutans streptococci in the human oral cavity can be easily examined, It is possible to grasp the risk of caries and the current status of caries, which can benefit a great many people.

細菌数（細菌濃度）の一般的な測定方法は、必要により染色した細菌を含む一定量の液(例えば10μl)を細胞計測盤を用いて顕微鏡(400倍率程度)で計測に必要とされる菌の数を算定し、その数に計測盤に指定されている倍数(例えば100倍)を乗じ単位量（例えば1ml）中の細菌数を算出する。また、顕微鏡による細菌数の測定が困難な場合には最初の液を水等で希釈し、その希釈倍数を最終数値に乗じることにより細菌数を測定したり、フィルタをかけてから細菌を各種センサー等により機械的に測定する方法が一般的である（例えば、特許文献１〜３参照。）。しかし、試料として唾液や特に歯垢を用いた場合には、唾液や歯垢に多く含まれる不純物により顕微鏡等で細菌を選択して数えることは困難であり、特に特定の細菌を選択して数えることは不可能であった。   The general method for measuring the number of bacteria (bacterial concentration) is to use a certain amount of liquid (eg 10 μl) containing the necessary stained bacteria with a microscope (about 400 magnifications) using a cell counter. The number of bacteria is calculated by multiplying the number by a multiple (for example, 100 times) designated on the measuring board and multiplying that number by a unit amount (for example, 1 ml). If it is difficult to measure the number of bacteria with a microscope, dilute the first solution with water, etc., and multiply the final value by the dilution factor. The method of measuring mechanically by the method etc. is common (for example, refer patent documents 1-3). However, when saliva or particularly plaque is used as a sample, it is difficult to select and count bacteria with a microscope or the like due to impurities contained in saliva or plaque. In particular, specific bacteria are selected and counted. It was impossible.

そのため、ミュータンス連鎖球菌が発育できるための栄養素(例えばペプトン, 肉エキス,植物エキス,酵母エキス,ビタミン類,糖類,血液成分等)を含めた寒天培地に唾液や歯垢等を検体として塗布し細菌を増殖させてコロニーを形成させ、そのコロニー数から細菌数（細菌濃度：単位 CFU/ml；Colony Forming Unit）を求める方法が行われており、この方法を用いると唾液や歯垢中の細菌でも精度良く計測することができる。しかし、寒天培地はミュータンス連鎖球菌は勿論検体中の殆どの細菌を増殖させてしまうため、測定した全細菌数から求めようとするミュータンス連鎖球菌の割合を導く必要があった。   Therefore, apply saliva, plaque, etc. as a specimen to an agar medium containing nutrients (for example, peptone, meat extract, plant extract, yeast extract, vitamins, sugars, blood components, etc.) that allow mutans streptococci to grow. Bacteria are grown to form colonies, and the number of bacteria (bacterial concentration: CFU / ml; Colony Forming Unit) is calculated from the number of colonies. Using this method, bacteria in saliva and plaque are used. But it can be measured accurately. However, since the agar medium causes most of the bacteria in the specimen to grow, not to mention mutans streptococci, it was necessary to derive the ratio of mutans streptococci to be determined from the total number of bacteria measured.

寒天培地上の任意のコロニーがミュータンス連鎖球菌であるか否かを判断する方法は、コロニーの形状や色等から測定者が判断する方法が一般的であるが、この方法は計測者の経験と感覚に大きく依存するために正確なミュータンス連鎖球菌数を求めることができなかった。また、ミュータンス連鎖球菌を選択的に培養できる培地を用いてその培地に培養されたコロニー数を計測する方法も考えられが（例えば、特許文献４，５参照。）、実際には選択培養されたコロニーはミュータンス連鎖球菌でない細菌が繁殖していることも多くミュータンス連鎖球菌数を正確に測定できているとは言えなかった。また、この方法ではミュータンス連鎖球菌の種類（例えばストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌス）を同時に選択して細菌数を測定することも更に難しかった。   The method for determining whether any colony on an agar medium is Streptococcus mutans is generally determined by the measurer from the shape and color of the colony. It was not possible to determine the exact number of Streptococcus mutans because it greatly depends on the sense. In addition, a method of measuring the number of colonies cultured in a medium that can selectively culture mutans streptococci is also conceivable (for example, see Patent Documents 4 and 5). Many colonies were bred with non-mutans streptococci, and it was not possible to accurately measure the number of mutans streptococci. Further, in this method, it was more difficult to simultaneously select the type of Streptococcus mutans (for example, Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus) and measure the number of bacteria.

前述の顕微鏡等による形態学分析よりも正確にミュータンス連鎖球菌であるかどうかを確認するためには、例えば発酵試験等の生化学的な試験や、酵素抗体法やミュータンス連鎖球菌に特異的な配列をもつ合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）を行い、増幅された遺伝子断片をアガロースゲルで電気泳動を行うことにより菌株の確認を行う分子生物学的検査等がある（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、いずれにしても大掛かりで高価な設備と高度な技術、更に日数が必要となり一般的ではなかった。
In order to confirm the presence of mutans streptococci more accurately than morphological analysis using the microscope described above, for example, biochemical tests such as fermentation tests, enzyme antibody methods and mutans streptococci specific There is a molecular biological test that performs a PCR reaction (polymerase chain reaction) using a synthetic DNA having a correct sequence as a primer, and confirms the strain by electrophoresis on an amplified gene fragment on an agarose gel (for example, (Refer nonpatent literature 1.). However, in any case, it is not common because it requires large-scale and expensive equipment, advanced technology, and more days.

特開平５−２１５６６６号公報JP-A-5-215666 特開平５−３２８９９５号公報JP-A-5-328995 特開平６−２０９７９０号公報JP-A-6-209790 特開２００２−２７９７５号公報JP 2002-27975 A 特開２００３−３８１６７号公報JP 2003-38167 A 松本優子、他４名、”モノクロナール抗体を応用したS.mutansの迅速検出キットにおける検出力の評価、口腔衛生学会雑誌、2001年；51：604-605Yuko Matsumoto, 4 others, “Evaluation of power in rapid detection kit of S.mutans using monoclonal antibody, Journal of Oral Hygiene, 2001; 51: 604-605

本発明は、従来の唾液や歯垢等の検体中の細菌を増殖させてコロニーを形成させ、そのコロニー数から細菌数を求める方法に於いて、検体中のミュータンス連鎖球菌数を正確且つ簡単に測定することが可能な口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法を提供することを課題とする。   The present invention relates to a conventional method for multiplying bacteria in a specimen such as saliva and plaque to form colonies and obtaining the number of bacteria from the number of colonies. In this method, the number of mutans streptococci in a specimen is accurately and easily determined. It is an object of the present invention to provide a method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity that can be measured easily.

本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コロニーを形成している細菌の種類がミュータンス連鎖球菌であるか否かを確認する手段として、抗原抗体反応を利用すれば簡単に且つ非常に正確に口腔内のミュータンス連鎖球菌を同定できることを見いだして本発明を完成した。   As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have simply used an antigen-antibody reaction as a means for confirming whether or not the type of bacteria forming a colony is mutans streptococci. The present invention has been completed by finding that the mutans streptococci in the oral cavity can be identified very accurately.

即ち本発明は、被験者の口腔内から採取した検体を寒天培地上に塗布し、寒天培地ごと必要な条件下で検体中の細菌を培養してコロニー群を形成させ、該コロニー群中から任意に選出した複数のコロニーに対して抗原抗体反応を利用してコロニーを形成する細菌がミュータンス連鎖球菌であることを同定し、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数とから検体中のミュータンス連鎖球菌数を求める口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法である。   That is, the present invention is to apply a specimen collected from the oral cavity of a subject on an agar medium, and form a colony group by cultivating bacteria in the specimen under the necessary conditions together with the agar medium. Identifying the bacterium that forms a colony using antigen-antibody reaction against multiple selected colonies as Streptococcus mutans, the number of colonies on the agar medium and the number of arbitrarily selected multiple colonies and mutans This is a method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity from which the number of mutans streptococci in a sample is obtained from the number of colonies identified as streptococci.

特に抗原抗体反応の利用方法が、特定のミュータンス連鎖球菌とのみ結合しうる抗体が担持された担体と、先の担体に担持されたものとは別の先のミュータンス連鎖球菌とのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とを用いるクロマトグラフィー法であること、更にはミュータンス連鎖球菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス及び／またはストレプトコッカス・ソブリヌスであることが好ましい。   In particular, the antigen-antibody reaction uses only a carrier carrying an antibody capable of binding only to a specific mutans streptococci and a mutans streptococci different from those carried on the previous carrier. It is preferable that the chromatography method uses a liquid containing a labeled antibody in which an identification substance is bound to a possible antibody, and that the Streptococcus mutans is Streptococcus mutans and / or Streptococcus sobrinus.

本発明に係る口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法によれば、従来では高価な設備や高度な技術が必要不可欠であった口腔内のミュータンス連鎖球菌数を正確且つ短期間に簡単に測定することが可能である。特に同じミュータンス連鎖球菌であるストレプトコッカス・ミュータンスの菌数とストレプトコッカス・ソブリヌスの菌数とを同一の培地上で測定することも可能となる。   According to the method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity according to the present invention, the number of mutans streptococci in the oral cavity, which conventionally required expensive equipment and advanced technology, can be easily and accurately determined in a short time. It is possible to measure. In particular, the number of Streptococcus mutans, which are the same mutans streptococci, and the number of Streptococcus sobrinus can be measured on the same medium.

本発明に係る口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法は、先ず被験者から採取した唾液や歯垢等の検体を寒天培地上に塗布する。この場合の塗布とは、従来からコロニーを形成させるために用いられている手段を示すものであり、唾液や歯垢を希釈してから又は直接の塗布，塗抹，滴下，噴霧等の手段を含む。寒天培地は、MSB培地，BHI培地，MS培地等、従来から用いられている寒天培地を特に限定することなく使用できる。その後、通法に従い寒天培地ごと必要な条件下で培養してコロニーを１シャーレにつき１００〜１０００個程度形成させ、この時のコロニー数を計測しておく。このときの培養の条件は、その菌数を求めるミュータンス連鎖球菌やコロニーの形成状態によって定められるが、一般的にはMSB培地で４８時間，嫌気培養等の条件で培養をおこなう。   In the method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity according to the present invention, first, a specimen such as saliva or plaque collected from a subject is applied on an agar medium. Application in this case refers to means conventionally used to form colonies, and includes means such as direct application, smearing, dripping, spraying, etc. after diluting saliva and plaque. . As the agar medium, conventionally used agar medium such as MSB medium, BHI medium, MS medium and the like can be used without particular limitation. Thereafter, the whole agar medium is cultured under necessary conditions according to a conventional method to form about 100 to 1000 colonies per petri dish, and the number of colonies at this time is counted. The culture conditions at this time are determined by the mutans streptococci for which the number of bacteria is obtained and the formation state of the colonies. In general, the culture is performed in an MSB medium for 48 hours under conditions such as anaerobic culture.

形成されたコロニー群の中から複数のコロニーを選出するが、選出方法はコロニーの形態的な特徴に影響されずに任意に選出する必要がある。選出する数は全コロニー数であることが最も好ましいが、シャーレ内のコロニー数が多い場合にはコロニー群の一部の選出となる。実際には選出するコロニー数が１０〜１５０個であることが好ましく、１０個以下であると求める細菌数の精度が得られ難い傾向がある。また、１５０個を超えて選出するのは労力的に好ましくなく、約１５０個を選出する場合も培地上の選択の対象となるコロニー数の４０〜１００％であることが測定精度の点から好ましい。より現実的な選出数の範囲は２０〜１００個である。   A plurality of colonies are selected from the formed colony group, and the selection method needs to be arbitrarily selected without being influenced by the morphological characteristics of the colonies. Most preferably, the number to be selected is the total number of colonies, but when the number of colonies in the petri dish is large, a part of the colony group is selected. Actually, the number of colonies to be selected is preferably 10 to 150, and if it is 10 or less, the accuracy of the desired number of bacteria tends to be difficult to obtain. Moreover, it is not preferable from the viewpoint of labor to select more than 150, and when selecting about 150, it is preferable from the viewpoint of measurement accuracy that it is 40 to 100% of the number of colonies to be selected on the medium. . A more realistic selection range is 20 to 100.

選出した複数のコロニーの全てに対してそのコロニーを形成している細菌がミュータンス連鎖球菌であるか否か、または、どのようなミュータンス連鎖球菌であるかを抗原抗体反応を利用して同定する。抗原抗体反応を利用した同定方法は従来から用いられている方法を特に限定することなく利用でき、例えば酵素を用いた発色濃度で同定、定量を行う酵素抗体法，抗体を蛍光色素で標識し抗体と反応した抗原を特異的に染色しそれを蛍光顕微鏡で測定する蛍光抗体法等がある。   Uses antigen-antibody reaction to identify whether or not the bacteria that form the colonies of all of the selected colonies are mutans streptococci or what kind of mutans streptococci To do. Identification methods using antigen-antibody reactions can be used without any particular limitation to conventional methods. For example, an enzyme antibody method for identifying and quantifying at a coloring concentration using an enzyme, an antibody labeled with a fluorescent dye, and an antibody There is a fluorescent antibody method that specifically stains the antigen that has reacted with the antibody and measures it with a fluorescence microscope.

またその他にも、近年、抗原抗体反応を簡便に利用する方法が数多く提案されており、例えば、米国特許第5,591,645号、米国特許第4,855,240号、米国特許第4,435,504号、米国特許第4,980,298号、特開昭61-145459号、特開平6-160388号等に開示されているクロマトグラフィーを利用した測定方法は、採取したコロニーの一部を同定を目的とする抗原を含んだ試験溶液に混入して検査器具に染み込ませるだけで、抗原の有無を知ることができる簡便性に優れた方法である。このような方法は一般に免疫クロマトグラフィー法と呼ばれており、その同定の原理はSe-Hwan Paekらの報告(Se-Hwan Paek, Seung-Hwa Lee, Joung-Hawan Cho, and Young-Sang KiＭ, DevelopＭent of Rapid One-Step IＭＭunochroＭatographic Assay, Ｍethods, 22, 53-60, 2000)に詳細に記述されている。   In addition, in recent years, many methods for simply using antigen-antibody reactions have been proposed. For example, U.S. Patent No. 5,591,645, U.S. Patent No. 4,855,240, U.S. Patent No. 4,435,504, U.S. Patent No. 4,980,298, In the measurement method using chromatography disclosed in Kaisho 61-145459, JP-A-6-160388, etc., a part of the collected colonies is mixed into a test solution containing an antigen for identification. It is a simple and excellent method that can detect the presence or absence of an antigen simply by soaking it into a test instrument. Such a method is generally called an immunochromatography method, and the principle of identification is reported by Se-Hwan Paek et al. (Se-Hwan Paek, Seung-Hwa Lee, Joung-Hawan Cho, and Young-Sang KiM, DevelopMent of Rapid One-Step IMMunochroMatographic Assay, Methods, 22, 53-60, 2000).

選出したコロニーの同定が終了した後に、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数とから口腔内のミュータンス連鎖球菌数を求める。更に詳細には、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数とによって、従来から行われているコロニー数から細菌濃度を求める方法を用いて口腔内のミュータンス連鎖球菌数を求める。   After the identification of the selected colonies is completed, the number of mutans streptococci in the oral cavity is obtained from the number of colonies on the agar medium, the number of arbitrarily selected colonies, and the number of colonies identified as mutans streptococci. . More specifically, a method for obtaining a bacterial concentration from the number of colonies conventionally performed by the number of colonies on the agar medium, the number of colonies arbitrarily selected and the number of colonies identified as mutans streptococci. To determine the number of Streptococcus mutans in the oral cavity.

具体的には、例えば、寒天培地上のコロニー数から検体中の全細菌濃度を求め、任意に選出した複数のコロニー数に対するミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数の割合を先の全細菌濃度に掛け合わせて口腔内のミュータンス連鎖球菌数（細菌濃度）を算出する。   Specifically, for example, the total bacterial concentration in the specimen is obtained from the number of colonies on the agar medium, and the ratio of the number of colonies identified as mutans streptococci to the arbitrarily selected number of colonies is calculated as The number of mutans streptococci in the oral cavity (bacterial concentration) is calculated by multiplying by the bacterial concentration.

本発明に係る口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法は、前述した算出順序に限定されることはなく、例えば、任意に選出した複数のコロニー数に対するミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数の割合を全コロニー数に掛け合わせた後に、そのコロニー数から検体中の細菌濃度、即ち、この場合には求めようとする口腔内のミュータンス連鎖球菌数を算出しても良い。   The method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity according to the present invention is not limited to the calculation order described above, and for example, it was identified as a mutans streptococcus for a plurality of arbitrarily selected colonies. After multiplying the ratio of the number of colonies by the total number of colonies, the bacterial concentration in the sample, that is, the number of mutans streptococci in the oral cavity to be obtained in this case may be calculated from the number of colonies.

以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例のみに制限されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

実施例１
抗原抗体反応に以下に説明するクロマトグラフィー法を利用した。 Example 1
The chromatographic method described below was used for the antigen-antibody reaction.

ミュータンス連鎖球菌としてストレプトコッカス・ミュータンス菌（ＡＴＣＣ２５１７５菌株、以下Ｓ・ミュータンスと記することがある。）をＢＨＩ培地（Brain Heart Infusion培地，ＤＩＦＣＯ社製）を用いて、３７℃で一晩培養を行い、培養液から遠心分離によって菌体を回収した後、ＰＢＳ（１０ｍｍｏｌリン酸緩衝化生理食塩水）にて２回洗浄後、ホルムアルデヒド水溶液により生育を停止させた。この菌の分散液をそのままマウスに免疫し、KohlerとＭilsteinによる細胞融合を用いたハイブリドーマの樹立法によって以下に示す精製抗体を得た。   Streptococcus mutans (ATCC25175 strain, hereinafter sometimes referred to as S. mutans) as a mutans streptococcus is cultured overnight at 37 ° C. using BHI medium (Brain Heart Infusion medium, manufactured by DIFCO). After the cells were collected from the culture by centrifugation, the cells were washed twice with PBS (10 mmol phosphate buffered saline), and then the growth was stopped with an aqueous formaldehyde solution. The mouse dispersion was immunized as it was, and the purified antibody shown below was obtained by the hybridoma establishment method using cell fusion by Kohler and Milstein.

「ＳＭ１抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する特異抗体
「ＳＭ２抗体」…ストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する特異抗体 "SM1 antibody" ... specific antibody against Streptococcus mutans "SM2 antibody" ... specific antibody against Streptococcus mutans

粒径４０ｎｍの金コロイドをＳＭ２抗体に標識した。金コロイドは市販品（British Biocell，International社製）のものを使用し、ウシ血清アルブミン（商品名：ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）１％、非イオン性界面活性剤（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０，ＳＩＧＭＡ社製）１％を添加したＰＢＳで抗体濃度０．１μｇ／ｍｌとなるように希釈した。金コロイドで標識した特異抗体液をＳＭ２標識抗体と称する。   Gold colloid with a particle size of 40 nm was labeled with the SM2 antibody. Colloidal gold is commercially available (British Biocell, manufactured by International), bovine serum albumin (trade name: BSA, manufactured by SIGMA) 1%, nonionic surfactant (trade name: Tween 20, manufactured by SIGMA) ) The antibody was diluted to 1 μg / ml with PBS supplemented with 1%. The specific antibody solution labeled with gold colloid is referred to as SM2-labeled antibody.

多孔質膜としてプラスティックフィルムで裏打ちをしたニトロセルロースメンブレン（商品名：ＳＸＨＦ、日本ミリポア社製）を用いた。この膜を５ｍｍ×４０ｍｍの長方形に切り出し、ＳＭ１抗体を１％ウシ血清アルブミン含有５０ｍｍｏｌリン酸緩衝液に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈し、この抗体希釈液を切り出したニトロセルロースメンブレンの中央部、長手方向と直角にマイクロピペットで凡そ１μｌ／ｃｍとなるように塗布した。この膜の一方の端に１５ｍｍ四方の濾紙を密着するようにクリップで固定し吸水体とした。また、吸水体と反対側の端に標識抗体の保持体（以下、標識抗体保持体と称する）として５ｍｍ×２０ｍｍのポリプロピレン製マトリクス（商品名：クイックリリース コンジュゲートパッド，日本ミリポア社製）をクリップで固定し、そこにＳＭ２標識抗体液を３０μｌ滴下した。この器具を３７℃で２時間乾燥し、使用直前までデシケーター中に保管した。   A nitrocellulose membrane (trade name: SXHF, manufactured by Nihon Millipore) was used as the porous membrane lined with a plastic film. This membrane was cut into a 5 mm × 40 mm rectangle, SM1 antibody was diluted to a concentration of 1 mg / ml in a 50 mmol phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin, and the antibody dilution was cut out in the center of the nitrocellulose membrane. The sample was applied with a micropipette at approximately 1 μl / cm perpendicular to the longitudinal direction. A 15 mm square filter paper was fixed to one end of this membrane with a clip so as to be in close contact with each other, thereby forming a water absorbing body. In addition, a 5 mm x 20 mm polypropylene matrix (trade name: Quick Release Conjugate Pad, manufactured by Nihon Millipore) is clipped as a labeled antibody holder (hereinafter referred to as labeled antibody holder) at the end opposite to the water absorbent. 30 μl of SM2-labeled antibody solution was added dropwise thereto. The instrument was dried at 37 ° C. for 2 hours and stored in a desiccator until just before use.

ミュータンス連鎖球菌と特異抗体固定化ストリップ上に固定化された抗体との反応性は以下の原理で検出される。唾液が特異抗体固定化ストリップの標識抗体保持体を通過する際、唾液中のミュータンス連鎖球菌に特異的な標識抗体が結合し赤色に発色する。更にミュータンス連鎖球菌と標識抗体との複合体は特異抗体固定化ストリップ中を移動していき、特異抗体固定化ストリップに例えば帯状に固定化された特異抗体（捕捉抗体）に捕捉され帯状の染みが確認される。帯状の染みが確認された場合には陽性，されなかった場合が陰性となる。   The reactivity between Streptococcus mutans and the antibody immobilized on the specific antibody immobilization strip is detected by the following principle. When saliva passes through the labeled antibody holder of the specific antibody-immobilized strip, the labeled antibody specific to mutans streptococci in saliva binds and develops a red color. Furthermore, the complex of Streptococcus mutans and the labeled antibody moves through the specific antibody-immobilized strip, and is captured by the specific antibody (capture antibody) immobilized on the specific antibody-immobilized strip, for example, in a band. Is confirmed. If a band-like stain is confirmed, it is positive, and if it is not, it is negative.

検体を唾液として、被験者に唾液採取用ガムを５分間咀嚼させ唾液を試験管に採取した。採取した唾液の一部をＰＢＳにて１０倍，１００倍，１０００倍に希釈し試料とした。各試料５０μｌをＭＳＢ培地に塗布した。２日間、３７℃で嫌気培養を行った後、コロニーを観測したところ、１００倍希釈の試料を用いたＭＳＢ培地におおよそ１００個前後のコロニーが確認されたため、この試料のコロニー数を測定したところ１３１個であった。   Using the sample as saliva, the test subject chewed the saliva collection gum for 5 minutes, and saliva was collected in a test tube. A part of the collected saliva was diluted 10 times, 100 times, and 1000 times with PBS to prepare a sample. 50 μl of each sample was applied to MSB medium. After anaerobic culture at 37 ° C. for 2 days, when colonies were observed, about 100 colonies were confirmed in the MSB medium using a 100-fold diluted sample, and the number of colonies in this sample was measured. There were 131 pieces.

寒天培地上のコロニー数の約３１％に当たる４０個のコロニーを任意に選 出した。全ての任意に選出した複数のコロニーの各１個をそれぞれＰＢＳ 100μLが入ったテストチューブに入れ混和し、超音波ホモジナイザー（商品名：Digital Sonifier ，Branson社製）で５分処理したものをサンプルとした。サンプルを、作製しておいた ストレプトコッカス・ミュータンス検出用特異抗体固定化ストリップに流し、１５分後に陽性・陰性の判断をした。ストレプトコッカス・ミュータンス菌であると同定された（陽性だった）コロニー数を求めたところ、１８個であった。   Forty colonies corresponding to about 31% of the number of colonies on the agar medium were arbitrarily selected. Put each one of all arbitrarily selected colonies into a test tube containing 100 μL of PBS and mix them for 5 minutes with an ultrasonic homogenizer (trade name: Digital Sonifier, manufactured by Branson). did. The sample was applied to the prepared specific antibody-immobilized strip for detecting Streptococcus mutans, and a positive / negative judgment was made after 15 minutes. The number of colonies identified (positive) as Streptococcus mutans was 18 and found to be 18.

最終的に、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とストレプトコッカス・ミュータンス菌であると同定されたコロニー数とから唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス菌数を求めた。   Finally, the number of Streptococcus mutans in saliva was determined from the number of colonies on the agar medium, the number of colonies arbitrarily selected and the number of colonies identified as Streptococcus mutans.

寒天培地上のコロニー数＝131個
任意に選出した複数のコロニー数＝40個
Ｓ・ミュータンス菌であると同定されたコロニー数＝18個
唾液中の菌数＝100（希釈率）×131個×1000μl/50μl（ml換算）＝2.6×105 CFU/ml
唾液中のＳ・ミュータンス菌数＝2.6×105 CFU/ml×18個/40個＝1.2×105 CFU/ml Number of colonies on agar medium = 131 Number of colonies selected arbitrarily = 40 Number of colonies identified as S. mutans = 18 Number of bacteria in saliva = 100 (dilution rate) × 131 × 1000μl / 50μl (ml conversion) = 2.6 × 10 5 CFU / ml
Number of S. mutans bacteria in saliva = 2.6 x 10 5 CFU / ml x 18/40 = 1.2 x 10 5 CFU / ml

即ち、この被験者の唾液中（口腔内）の菌の中でミュータンス連鎖球菌の数は、ストレプトコッカス・ミュータンス菌の数が2.6×105 CFU/mlであることが分かった。 That is, it was found that the number of Streptococcus mutans among the bacteria in the saliva (in the oral cavity) of this test subject was 2.6 × 10 5 CFU / ml.

本実施例に於いて、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とストレプトコッカス・ミュータンス菌であると同定されたコロニー数と唾液中の菌濃度求める計算は、下記のように順序を変更しても良いのは勿論である。
唾液中のＳ・ミュータンス菌の数＝
100（希釈率）×18個×131個/40個×1000μl/50μl（ml換算）＝1.2×105 CFU/ml In this example, the number of colonies on the agar medium, the number of colonies arbitrarily selected, the number of colonies identified as Streptococcus mutans, and the calculation for determining the bacterial concentration in saliva are as follows: Of course, the order may be changed.
Number of S. mutans bacteria in saliva =
100 (dilution rate) x 18 x 131 x 40 x 1000 μl / 50 μl (ml conversion) = 1.2 x 10 5 CFU / ml

実施例２
実施例１のクロマトグラフィー法を用いた測定に於いて、のストレプトコッカス・ミュータンス菌（ＡＴＣＣ２５１７５菌株）を用いた特異抗体固定化ストリップに加えてストレプトコッカス・ソブリヌス菌（ＡＴＣＣ３３４７８菌株、以下Ｓ・ソブリヌスと記することがある。）を用いた特異抗体固定化ストリップを準備した以外は実施例１と同様の方法によりミュータンス連鎖球菌、即ち本実施例の場合にはストレプトコッカス・ミュータンス菌とストレプトコッカス・ソブリヌス菌の菌濃度を測定した。 Example 2
In the measurement using the chromatography method of Example 1, in addition to the specific antibody-immobilized strip using Streptococcus mutans (ATCC 25175 strain), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478 strain, hereinafter referred to as S. sobrinus) is described. Except that a specific antibody-immobilized strip was prepared using the same method as in Example 1, except that Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus were used in this example. The bacterial concentration of was measured.

被験者に唾液採取用ガムを５分間咀嚼させ唾液を試験管に採取した。採取した唾液の一部をＰＢＳにて１０倍，１００倍，１０００倍に希釈し試料とした。各試料50μlをＭＳＢ培地に塗布した。２日間、３７℃で嫌気培養を行った後、コロニーを観測したところ、１００倍希釈の試料を用いたＭＳＢ培地におおよそ１００個前後のコロニーが確認されたため、この試料のコロニー数を測定したところ１１５個であった。   The test subject chewed the saliva collection gum for 5 minutes and collected saliva in a test tube. A part of the collected saliva was diluted 10 times, 100 times, and 1000 times with PBS to prepare a sample. 50 μl of each sample was applied to MSB medium. After anaerobic culture at 37 ° C. for 2 days, when colonies were observed, about 100 colonies were confirmed in the MSB medium using a 100-fold diluted sample, and the number of colonies in this sample was measured. There were 115.

寒天培地上のコロニー数の約６１％に当たる７０個のコロニーを任意に選出した。全て
の任意に選出した複数のコロニーの各１個をそれぞれＰＢＳ 100μLが入ったテストチューブに入れ混和し、超音波ホモジナイザー（商品名：Digital Sonifer ，Branson社製）で５分処理したものをサンプルとした。サンプルを、作製しておいた S.mutans検出用特異抗体固定化ストリップ及びストレプトコッカス・ソブリヌス検出用特異抗体固定化ストリップに流し、１５分後に陽性・陰性の判断をした。ストレプトコッカス・ミュータンス菌であると同定された（陽性だった）コロニー数は２４個であった。また、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌であると同定された（陽性だった）コロニー数は９個であった。 70 colonies corresponding to about 61% of the number of colonies on the agar medium were arbitrarily selected. Each one of all arbitrarily selected colonies was mixed in a test tube containing 100 μL of PBS and mixed with an ultrasonic homogenizer (trade name: Digital Sonifer, manufactured by Branson) for 5 minutes. did. The sample was passed through the prepared specific antibody-immobilized strip for detecting S. mutans and the specific antibody-immobilized strip for detecting Streptococcus sobrinus, and a positive / negative judgment was made after 15 minutes. The number of colonies identified (positive) as Streptococcus mutans was 24. In addition, the number of colonies identified (positive) as Streptococcus sobrinus was 9.

寒天培地上のコロニー数＝115個
任意に選出した複数のコロニー数＝70個
Ｓ・ミュータンス菌であると同定されたコロニー数＝24個
Ｓ・ソブリヌス菌であると同定されたコロニー数＝9個
唾液中の菌数＝100（希釈率）×115個×1000μl/50μl（ml換算）＝2.3×105 CFU/ml
唾液中のＳ・ミュータンス菌数＝2.3×105 CFU/ml×24個/70個＝7.8×104 CFU/ml
唾液中のＳ・ソブリヌス菌数＝2.3×105 CFU/ml×9個/70個＝2.9×104 CFU/ml Number of colonies on agar medium = 115 Number of colonies arbitrarily selected = 70 Number of colonies identified as S. mutans = 24 Number of colonies identified as S. sobrinus = 9 Number of bacteria in saliva = 100 (dilution rate) × 115 cells × 1000μl / 50μl (ml conversion) = 2.3 × 10 5 CFU / ml
Number of S. mutans bacteria in saliva = 2.3 x 10 5 CFU / ml x 24/70 = 7.8 x 10 4 CFU / ml
Number of S. sobrinus bacteria in saliva = 2.3 x 10 5 CFU / ml x 9/70 = 2.9 x 10 4 CFU / ml

即ち、この被験者の唾液中（口腔内）の菌の中でミュータンス連鎖球菌の数は、
ストレプトコッカス・ミュータンス菌が7.8×104 CFU/ml、
ストレプトコッカス・ソブリヌス菌が2.9×104 CFU/mlであることが分かった。 That is, the number of Streptococcus mutans among the bacteria in the saliva of the subject (in the oral cavity)
Streptococcus mutans bacteria is 7.8 × 10 4 CFU / ml,
It was found that Streptococcus sobrinus was 2.9 × 10 4 CFU / ml.

実施例３
実施例１または２と同様の方法によりストレプトコッカス・ミュータンス菌に対する特異抗体及びストレプトコッカス・ソブリヌス菌に対する特異抗体（以後、ＳＭ１及びＳＳ１抗体と称することがある）を作製した。 Example 3
A specific antibody against Streptococcus mutans and a specific antibody against Streptococcus sobrinus (hereinafter sometimes referred to as SM1 and SS1 antibodies) were prepared by the same method as in Example 1 or 2.

検体を唾液とし、被験者に唾液採取用ガムを５分間咀嚼させ唾液を試験管に採取した。採取した唾液の一部をＰＢＳにて１０倍，１００倍，１０００倍に希釈し試料とした。各試料50μlをＭＳＢ培地に塗布した。２日間、３７℃で嫌気培養を行った後、コロニーを観測したところ、１００倍希釈の試料を用いたＭＳＢ培地におおよそ１００個前後のコロニーが確認されたため、この試料のコロニー数を測定したところ９８個であった。   The sample was saliva, and the test subject chewed the saliva collection gum for 5 minutes, and saliva was collected in a test tube. A part of the collected saliva was diluted 10 times, 100 times, and 1000 times with PBS to prepare a sample. 50 μl of each sample was applied to MSB medium. After anaerobic culture at 37 ° C. for 2 days, when colonies were observed, about 100 colonies were confirmed in the MSB medium using a 100-fold diluted sample, and the number of colonies in this sample was measured. There were 98.

寒天培地上のコロニー数の約２０％に当たる２０個のコロニーを任意に選出した。全て
の任意に選出した複数のコロニーの各１個をそれぞれＰＢＳ 20μLが入ったテストチューブに入れ混和し、超音波ホモジナイザー（商品名：Digital Sonifer ，Branson社製）で５分処理したものを10μlに分けて２つのテストチューブに入れサンプルとした。各々のサンプルの一方にＳＭ１抗体を、残りの片方にＳＳ１抗体を１μl添加し室温で３０分間放置した。 Twenty colonies corresponding to about 20% of the number of colonies on the agar medium were arbitrarily selected. Each one of all arbitrarily selected colonies was mixed in a test tube containing 20 μL of PBS, and mixed with an ultrasonic homogenizer (trade name: Digital Sonifer, manufactured by Branson) for 5 minutes to 10 μl. The sample was divided into two test tubes. SM1 antibody was added to one side of each sample, and 1 μl of SS1 antibody was added to the other side and left at room temperature for 30 minutes.

全てのサンプルにFITC（フルオロセインイソチオシアネート）で標識されたマウス抗体（商品名 Anti-mouse IgG FITC cinjugate，シグマ社製）を１μｌ添加し、遮光して室温に３０分間放置した。その後、各々のサンプルを蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にて観察し、抗体の反応の有無を確認した。その結果、ストレプトコッカス・ミュータンス菌であると同定されたサンプル（コロニー数）は４個であった。また、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌であると同定された（陽性だった）コロニー数は０個であった。   1 μl of mouse antibody (trade name: Anti-mouse IgG FITC cinjugate, manufactured by Sigma) labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) was added to all samples, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes while being protected from light. Thereafter, each sample was observed with a fluorescence microscope (manufactured by Olympus) to confirm the presence or absence of antibody reaction. As a result, the number of samples (number of colonies) identified as Streptococcus mutans was 4. In addition, the number of colonies identified (positive) as Streptococcus sobrinus was 0.

寒天培地上のコロニー数＝98個
任意に選出した複数のコロニー数＝20個
Ｓ・ミュータンス菌であると同定されたコロニー数＝8個
Ｓ・ソブリヌス菌であると同定されたコロニー数＝0個
唾液中の菌数＝100（希釈率）×98個×1000μl/50μl（ml換算）＝2.0×105 CFU/ml
唾液中のＳ・ミュータンス菌数＝2.0×105 CFU/ml×4個/20個＝4.0×104 CFU/ml
唾液中のＳ・ソブリヌス菌数＝2.0×105 CFU/ml×0個/70個＝0 CFU/ml Number of colonies on agar medium = 98 Number of arbitrarily selected colonies = 20 Number of colonies identified as S. mutans = 8 Number of colonies identified as S. sobrinus = 0 Number of bacteria in saliva = 100 (dilution rate) × 98 × 1000 μl / 50 μl (ml conversion) = 2.0 × 10 5 CFU / ml
Number of S. mutans bacteria in saliva = 2.0 x 10 5 CFU / ml x 4/20 = 4.0 x 10 4 CFU / ml
Number of S. sobrinus bacteria in saliva = 2.0 x 10 5 CFU / ml x 0/70 = 0 CFU / ml

即ち、この被験者の唾液中（口腔内）の菌の中でミュータンス連鎖球菌の数は、
ストレプトコッカス・ミュータンス菌が4.0×104 CFU/ml、
ストレプトコッカス・ソブリヌス菌は０であることが分かった。
That is, the number of Streptococcus mutans among the bacteria in the saliva of the subject (in the oral cavity)
Streptococcus mutans bacteria is 4.0 × 10 4 CFU / ml,
Streptococcus sobrinus was found to be zero.

Claims (3)

被験者の口腔内から採取した検体を寒天培地上に塗布し、寒天培地ごと必要な条件下で検体中の細菌を培養してコロニー群を形成させ、該コロニー群中から任意に選出した複数のコロニーに対して抗原抗体反応を利用してコロニーを形成する細菌がミュータンス連鎖球菌であることを同定し、寒天培地上のコロニー数と任意に選出した複数のコロニー数とミュータンス連鎖球菌であると同定されたコロニー数とから検体中のミュータンス連鎖球菌数を求める口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法。   A plurality of colonies arbitrarily selected from the colony group are formed by applying a sample collected from the oral cavity of the subject on the agar medium, culturing the bacteria in the specimen under the necessary conditions together with the agar medium, and forming a colony group. The bacterium that forms colonies using the antigen-antibody reaction is identified as Streptococcus mutans, and the number of colonies on the agar medium and the number of colonies selected arbitrarily and the mutans streptococci A method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity from which the number of mutans streptococci in a sample is determined from the number of identified colonies. 抗原抗体反応の利用方法が、特定のミュータンス連鎖球菌とのみ結合しうる抗体が担持された担体と、先の担体に担持されたものとは別の先のミュータンス連鎖球菌とのみ結合しうる抗体に識別物質を結合させた標識抗体を含む液体とを用いるクロマトグラフィー法である請求項１に記載の口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法。   The antigen-antibody reaction utilization method can bind only to a carrier carrying an antibody that can bind only to a specific mutans streptococci and to a mutans streptococcus that is different from the carrier carried on the previous carrier. 2. The method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity according to claim 1, wherein the method is a chromatography method using a liquid containing a labeled antibody in which an identification substance is bound to an antibody. ミュータンス連鎖球菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス及び／またはストレプトコッカス・ソブリヌスである請求項１または２に記載の口腔内のミュータンス連鎖球菌数の測定方法。
The method for measuring the number of mutans streptococci in the oral cavity according to claim 1 or 2, wherein the mutans streptococci is Streptococcus mutans and / or Streptococcus sobrinus.
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