JP2005102701A - ANTI-IgE VACCINES - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、IgE分子のε重鎖のFc部分から誘導される抗原性ペプチドの、IgE介在アレルギー性障害の治療及び予防のワクチンとしての使用についての組成物及び方法に関する。特に、本発明は、所望により異種担体タンパク質にカップルしたIgE分子のCH3ドメイン又はCH3−CH4ドメイン連結部から誘導される少なくとも1つの抗原性ペプチドを含んでなる組成物に関する。本発明の組成物はまたアジュバントを含む場合がある。本発明の組成物は抗IgE抗体を誘発し、それは血清及び他の体液中の可溶性(フリー)IgEに結合するが、受容体結合性IgEとは架橋結合しない。さらに本発明は、IgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために動物、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒトへ本発明の組成物を投与する方法と、IgE介在性アレルギー障害の治療についてワクチン及び他の治療法を評価するための方法に関する。 The present invention relates to compositions and methods for the use of antigenic peptides derived from the Fc portion of the ε heavy chain of IgE molecules as vaccines for the treatment and prevention of IgE-mediated allergic disorders. In particular, the present invention relates to a composition comprising at least one antigenic peptide derived from a CH3 domain or CH3-CH4 domain junction of an IgE molecule, optionally coupled to a heterologous carrier protein. The composition of the present invention may also contain an adjuvant. The compositions of the invention elicit anti-IgE antibodies that bind to soluble (free) IgE in serum and other body fluids, but do not cross-link with receptor-bound IgE. Furthermore, the present invention provides a method of administering a composition of the invention to an animal, preferably a mammal, and most preferably a human for the treatment or prevention of an IgE-mediated allergic disorder, and a vaccine for the treatment of an IgE-mediated allergic disorder. And methods for evaluating other therapies.
免疫介在性アレルギー(過敏性)反応は、アレルギー症状の発現につながる根底の機序により、4つのタイプ(I〜IV)に分類される。I型アレルギー反応は、ヒスタミンのような血管作用物質のマスト細胞及び好塩基球からのIgE介在性放出により特徴づけられる。これら物質の放出と後続するアレルギー症状の表出は、アレルゲンに結合したIgEがマスト細胞及び好塩基球の表面にあるその受容体に架橋結合することによって開始される。 Immune-mediated allergic (hypersensitivity) reactions are classified into four types (I-IV) according to the underlying mechanism that leads to the development of allergic symptoms. Type I allergic reactions are characterized by IgE-mediated release of vasoactive substances such as histamine from mast cells and basophils. The release of these substances and subsequent expression of allergic symptoms is initiated by cross-linking of allergen-bound IgE to its receptors on the surface of mast cells and basophils.
IgE抗体は、ジスルフィド結合により「Y」形の配置でつながった2つの同一なH(重)鎖と2つの同一なL(軽)鎖からなる複合分子である。各L鎖は1つの定常ドメイン(CL)に連結した1つの可変(VL)ドメインからなり、各H鎖は1つの可変(VH)ドメインと4つの定常ドメイン(CH1、CH2、CH3、及びCH4;それぞれCε1、Cε2、Cε3、及びCε4としても知られる)からなる。IgE抗体の2つのアームはIgE抗体が特異抗原(アレルゲン)に結合する部位を含み、各アームはFab(抗原結合フラグメント)フラグメントと言われる。IgE抗体のテールは、抗体のFabフラグメントから分離されたときに適切な実験条件下で結晶を形成し得るので、Fc(結晶性フラグメント)と呼ばれる。IgE抗体のFcフラグメントはCε2、Cε3及びCε4ドメインからなり、IgE抗体の生物学的に活性な構造(例、受容体に結合する部位)を含有する。 An IgE antibody is a complex molecule consisting of two identical H (heavy) chains and two identical L (light) chains connected in a “Y” configuration by disulfide bonds. Each light chain consists of one variable (V L ) domain linked to one constant domain (C L ), and each H chain has one variable (V H ) domain and four constant domains (CH1, CH2, CH3, And CH4; also known as Cε1, Cε2, Cε3, and Cε4, respectively). The two arms of the IgE antibody contain sites where the IgE antibody binds to a specific antigen (allergen), and each arm is referred to as a Fab (antigen-binding fragment) fragment. The tail of an IgE antibody is called Fc (crystalline fragment) because it can form crystals under appropriate experimental conditions when separated from the Fab fragment of the antibody. The Fc fragment of an IgE antibody consists of Cε2, Cε3, and Cε4 domains and contains the biologically active structure of the IgE antibody (eg, the site that binds to the receptor).
IgE抗体の産生には、3つの細胞;抗原提示細胞(APC)、Tリンパ球(ヘルパーT細胞;Th)及び抗体産生細胞(Bリンパ球;B細胞)間の相互作用及び協調作用が必要とされる。異物であるアレルゲンが(例えば、環境アレルゲンの吸入、ある食物の摂取、又は皮膚を介して)被検者の体内に初めて導入されると、このアレルゲンはAPC(例、マクロファージ)により取り込まれ、次いでAPCはアレルゲンより小さい分子(エピトープ)に消化及び処理する。これらフラグメントは、主要組織適合性複合タンパク質(MHC)として知られる特定の分子と結びついて、APCの表面上に提示される。APCの表面に提示されたアレルゲンフラグメント/MHC複合体は、特定のTリンパ球の表面にある受容体により認識されて結合される。この認識及び結合の反応がTリンパ球の活性化と、後続するインターロイキン−4(IL−4)のようなサイトカインの発現及び分泌につながる。これらサイトカインは、問題となるアレルゲンに特異的なB細胞(即ち、このアレルゲンに結合し得る免疫グロブリン受容体をその表面上に発現するB細胞)の増殖、クローン増大及び分化を誘発し、究極的にこれらB細胞からのIgE抗体の産生をもたらす。活性化されたTリンパ球とIgE産生B細胞の一部は、最終的に、記憶T細胞及び記憶B細胞と呼ばれる細胞のプールに決定付けられる。これは、後にこのアレルゲンに曝されたときにアレルゲンをより速やかに認識することができる。 The production of IgE antibodies requires interaction and coordination between three cells; antigen presenting cells (APC), T lymphocytes (helper T cells; Th) and antibody producing cells (B lymphocytes; B cells). Is done. When a foreign allergen is first introduced into the subject's body (eg, through inhalation of environmental allergens, ingestion of some food, or skin), the allergen is then taken up by APC (eg, macrophages) and then APC digests and processes smaller molecules (epitopes) than allergens. These fragments are presented on the surface of the APC in association with a specific molecule known as the major histocompatibility complex protein (MHC). Allergen fragments / MHC complexes displayed on the surface of APC are recognized and bound by receptors on the surface of specific T lymphocytes. This recognition and binding reaction leads to T lymphocyte activation and subsequent expression and secretion of cytokines such as interleukin-4 (IL-4). These cytokines induce proliferation, clonal expansion and differentiation of B cells specific for the allergen in question (ie, B cells that express immunoglobulin receptors on their surface that can bind to this allergen) and ultimately Resulting in the production of IgE antibodies from these B cells. Activated T lymphocytes and a portion of IgE-producing B cells are ultimately determined into a pool of cells called memory T cells and memory B cells. This allows the allergen to be recognized more quickly when later exposed to this allergen.
I型アレルギー反応に罹患している個体では、2回目のアレルゲン曝露により、IgE産生に必要な3細胞相互作用に記憶B及びT細胞が関与することの結果として、このアレルゲンに特異的な高レベルのIgE抗体が産生される。2回目の抗原曝露の間に産生された高レベルのIgE抗体は、アレルゲン結合性IgEによりマスト細胞及び好塩基球上のIgE受容体と架橋結合し、次いでそれがこれら細胞の活性化と、I型アレルギー疾患の臨床症状の原因となる薬理学的メディエーターの放出につながる。 In individuals suffering from a type I allergic reaction, the second allergen exposure results in high levels specific for this allergen as a result of the involvement of memory B and T cells in the three-cell interaction required for IgE production. Of IgE antibody is produced. High levels of IgE antibodies produced during the second antigen exposure cross-link with IgE receptors on mast cells and basophils by allergen binding IgE, which then activates these cells, Leading to the release of pharmacological mediators that cause clinical symptoms of type I allergic diseases.
IgEに対して異なるアフィニティーを有する2種の受容体が同定され、特徴づけられている。高アフィニティー受容体(FcεRI)はマスト細胞及び好塩基球の表面上に発現されている。低アフィニティー受容体(FcεRII/CD23)は、B細胞、T細胞、マクロファージ、好酸球及びランゲルハンス細胞を含む、多くの細胞型で発現している。高アフィニティーIgE受容体は3つのサブユニット(α、β及びγ鎖)からなる。いくつかの研究は、IgEの結合に関与するのはα鎖だけであり、β及びγ鎖(これらは膜貫通タンパク質か細胞質タンパク質である)はシグナル伝達反応に必要であることを示している。IgEがマスト細胞及び好塩基球上のFcεRIに結合するのに必要なIgE構造を同定することは、IgE介在性アレルギーの治療又は予防の戦略を設計するのにきわめて重要である。例えば、IgE受容体結合部位の解明が、受容体を担う細胞にIgEが in vivo で結合することを阻止するペプチド又は低分子を同定することにつながる可能性がある。 Two receptors with different affinities for IgE have been identified and characterized. The high affinity receptor (FcεRI) is expressed on the surface of mast cells and basophils. The low affinity receptor (FcεRII / CD23) is expressed on many cell types including B cells, T cells, macrophages, eosinophils and Langerhans cells. The high affinity IgE receptor consists of three subunits (α, β and γ chains). Several studies have shown that only the α chain is involved in IgE binding, and β and γ chains, which are either transmembrane or cytoplasmic proteins, are required for signal transduction reactions. Identifying the IgE structure that is necessary for IgE to bind to FcεRI on mast cells and basophils is critical for designing strategies for the treatment or prevention of IgE-mediated allergies. For example, elucidation of the IgE receptor binding site may lead to the identification of peptides or small molecules that block IgE binding to cells bearing the receptor in vivo.
この15年間にわたり、IgE上のFcεRI結合部位を決定するために多種多様なアプローチが利用されてきた。これらのアプローチは5つの異なるカテゴリーへ分類され得る。第一のアプローチでは、IgE分子のFc部分の一部に対応する低ペプチドが産生され、IgEをその受容体から阻害するそれらの能力について分析された。例えば、Nakamura et al., EP0263655(1988年4月13日公開)、Burt et al., 1987, European Journal Immunology, 17: 437-440; Helm et al., 1988, Nature 331: 180-183; Helm et al., 1989, PNAS 86: 9465-9469; Vercelli et al., 1989, Nature 338: 649-651; Nio et al., 1990, Peptide Chemistry, 2: 203-208; Nio et al., 1993, FEBS Lett. 319: 225-228; 及び Nio et al., 1992 FEBS Lett. 314: 229-231 を参照のこと。これらの研究に記載されているペプチドの多くはIgEのその受容体への結合を阻害することが示されたものの、IgE結合の原因となる配列については試験ごとに異なっていた。 Over the last 15 years, a wide variety of approaches have been utilized to determine the FcεRI binding site on IgE. These approaches can be classified into five different categories. In the first approach, low peptides corresponding to part of the Fc portion of the IgE molecule were produced and analyzed for their ability to inhibit IgE from its receptor. See, for example, Nakamura et al., EP 0263655 (published April 13, 1988), Burt et al., 1987, European Journal Immunology, 17: 437-440; Helm et al., 1988, Nature 331: 180-183; Helm et al., 1989, PNAS 86: 9465-9469; Vercelli et al., 1989, Nature 338: 649-651; Nio et al., 1990, Peptide Chemistry, 2: 203-208; Nio et al., 1993, FEBS Lett. 319: 225-228; and Nio et al., 1992 FEBS Lett. 314: 229-231. Although many of the peptides described in these studies have been shown to inhibit IgE binding to its receptor, the sequences responsible for IgE binding differed from test to test.
Helm et al.(1988, Nature 331: 180-183)は、IgEのCH2及びCH3ドメインの間にある連結部に広がる75個のアミノ酸のペプチドを同定し、このペプチドがネーティブなIgE分子に近いアフィニティーでIgE受容体に結合することを示した。一方、Basu et al.(1993, Journal of Biological Chemistry 268: 13118-13127)は、IgE分子から様々なフラグメントを発現させ、CH3とCH4ドメインの両方を含有するフラグメントだけがIgEに結合することができて、CH2ドメインは結合に必要でないことを見出した。Vangelista et al.(1999, Journal of Clinical Investigation 103: 1571-1578)は、IgEのCH3ドメインだけを発現させ、このドメインだけでIgE受容体に結合し、IgEのその受容体への結合を防ぐことができることを示した。Basu et al. とVangelista et al.の結果は一致せず、上記に引用した Helm et al.の結果とも矛盾する。 Helm et al. (1988, Nature 331: 180-183) identified a 75 amino acid peptide spanning the junction between the CH2 and CH3 domains of IgE, and this peptide is close in affinity to the native IgE molecule. Were shown to bind to the IgE receptor. On the other hand, Basu et al. (1993, Journal of Biological Chemistry 268: 13118-13127) express various fragments from IgE molecules, and only fragments containing both CH3 and CH4 domains can bind to IgE. And found that the CH2 domain is not required for binding. Vangelista et al. (1999, Journal of Clinical Investigation 103: 1571-1578) expresses only the CH3 domain of IgE and binds to the IgE receptor only by this domain and prevents binding of IgE to that receptor. It was shown that you can. The results of Basu et al. And Vangelista et al. Are inconsistent and conflict with the results of Helm et al. Cited above.
IgE上のFcRI結合部位を同定する第二のアプローチでは、CH2ドメイン、CH3ドメイン又はCH4ドメインの一部に対応するペプチドに対するポリクローナル抗体が産生され、IgE上の受容体結合部位を探すのに使用された(Robertson et al. 1988, Molecular Immunol. 25: 103-118)。Robertson et al.は、CH4ドメインに由来するペプチドにより規定されるアミノ酸残基は受容体結合に関わっていそうにないが、IgEのCH3ドメインに由来するペプチドにより規定されるアミノ酸残基はIgE受容体結合部位(アミノ酸387−401)に最も隣接している可能性が高いと結論した。しかしながら、抗CH3ペプチド抗体がIgE負荷したマスト細胞からヒスタミンを放出させたので、このことは、CH3ペプチドにより規定されるアミノ酸では真のIgE受容体結合部位が明確にされず、抗CH3ペプチド抗体がアナフィラキシーを引き起こす可能性があることを示した。 In a second approach to identifying FcRI binding sites on IgE, polyclonal antibodies against peptides corresponding to CH2 domain, CH3 domain or part of CH4 domain are produced and used to look for receptor binding sites on IgE. (Robertson et al. 1988, Molecular Immunol. 25: 103-118). Robertson et al. Show that amino acid residues defined by peptides derived from the CH4 domain are unlikely to be involved in receptor binding, but amino acid residues defined by peptides derived from the CH3 domain of IgE are IgE receptors. It was concluded that it is most likely adjacent to the binding site (amino acids 387-401). However, since anti-CH3 peptide antibody released histamine from mast cells loaded with IgE, this does not clarify the true IgE receptor binding site with amino acids defined by CH3 peptide, and anti-CH3 peptide antibody It has been shown that it may cause anaphylaxis.
IgE上のFcεRI結合部位を同定する第三のアプローチでは、数名の研究者が、受容体結合に関わるアミノ酸残基を同定しようとして、IgEの突然変異体を産生した(例えば、Schwarzbaum et al., 1989, European Journal of Immunology 19: 1015-1023; Weetall et al., 1990, Journal of Immunology 145: 3849-3854; 及び Presta et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 26368-26373 を参照のこと)。Schwartzbaum et al.は、CH4ドメイン内のアミノ酸残基442でプロリンをヒスチジンに点突然変異させたマウスIgE抗体がIgE受容体に対して2倍減少したアフィニティーを有することを示した。Schwartzbaum et al.は、IgE抗体のCH4ドメインがIgEのその受容体への結合に関わっていると結論したが、Schwartzbaum の結論は、マウスIgEのその高アフィニティー受容体への結合にはIgE抗体のCH4ドメインではなく、CH2及びCH3ドメインの部分が関わるとする Weetall et al.の結論と矛盾する。さらに、Schwartzbaum et al.の結論は、FcεRIへの結合に重要なIgE抗体のアミノ酸残基はCH3ドメイン内に位置するという Presta et al.の結論とも矛盾する。 In a third approach to identifying FcεRI binding sites on IgE, several researchers have produced mutants of IgE in an attempt to identify amino acid residues involved in receptor binding (see, eg, Schwarzbaum et al. , 1989, European Journal of Immunology 19: 1015-1023; Weetall et al., 1990, Journal of Immunology 145: 3849-3854; and Presta et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 26368-26373. ). Schwartzbaum et al. Showed that a mouse IgE antibody in which proline was mutated to histidine at amino acid residue 442 in the CH4 domain has a 2-fold reduced affinity for the IgE receptor. Schwartzbaum et al. Concluded that the CH4 domain of IgE antibody is involved in IgE binding to its receptor, but Schwartzbaum concluded that IgE antibody binding of mouse IgE to its high affinity receptor Contradicts with Weetall et al.'S conclusion that portions of the CH2 and CH3 domains are involved rather than the CH4 domain. Furthermore, Schwartzbaum et al.'S conclusion contradicts Presta et al.'S conclusion that the amino acid residues of the IgE antibody important for binding to FcεRI are located within the CH3 domain.
IgE上のFcεRI結合部位を同定する第四のアプローチでは、キメラIgE分子が構築され、FcεRIへ結合する能力について分析された。Weetall et al., 同上は、マウスIgE−ヒトIgGのキメラ分子系列を構築し、IgE受容体への結合性を試験した。 Weetall et al., 同上は、受容体結合にCH4ドメインは参画せず、CH2とCH3ドメインがいずれもマスト細胞上の高アフィニティー受容体への結合に必要であると結論した。別の研究で、Nissim et al.(1993, Journal of Immunol 150: 1365-1374)は、 ヒトIgE−マウスIgEのキメラ系列がFcεRIへ結合する能力について試験し、FcεRIへの結合にはCH3ドメインだけが必要とされると結論した。Nissim et al.による結論は、IgEのCH3ドメインだけがFcεRIへ結合するという Vangelista et al.による結論を確証するが、Weetall et al.と Robertson et al.の結論とは矛盾する。 In a fourth approach to identifying FcεRI binding sites on IgE, chimeric IgE molecules were constructed and analyzed for their ability to bind to FcεRI. Weetall et al., Supra constructed a chimeric molecular series of mouse IgE-human IgG and tested its binding to IgE receptor. Weetall et al., Supra, concluded that the CH4 domain did not participate in receptor binding, and that both CH2 and CH3 domains are required for binding to high affinity receptors on mast cells. In a separate study, Nissim et al. (1993, Journal of Immunol 150: 1365-1374) tested the ability of the human IgE-mouse IgE chimeric line to bind to FcεRI, with only the CH3 domain binding to FcεRI. It is concluded that is needed. The conclusion by Nissim et al. Confirms the conclusion by Vangelista et al. That only the CH3 domain of IgE binds to FcεRI, but contradicts the conclusions by Weetall et al. And Robertson et al.
Presta et al., 同上は、CH2をヒトIgE由来のCH3で置換したキメラのヒトIgGを産生した。受容体結合について試験すると、このキメラはFcεRIへ結合したものの、ネーティブIgEに比較して4倍減少したアフィニティーであった。Presta et al.の結果は、Nissim et al.の結果の確証になるようにみえるが、上記に引用した、Weetall et al., Helm et al., 及び Basu et al.,のそれとは矛盾する。IgEのその受容体への結合に必須である正確なアミノ酸残基を明確にしようとするさらなる試みにおいて、Presta et al.は、ヒトIgEのCH2−CH3ヒンジ部とCH3ドメイン由来の3つのループに対応する特定のアミノ酸残基をヒトIgG内部の類似位置へ挿入し、この突然変異体をIgGELと呼んだ。残念ながら、受容体結合性についてこのIgGEL変異体を試験すると、ネーティブなIgE、又は完全長のCH3ドメインが完全長のCH2ドメインに置換したIgGに比較して、ごく弱い結合しか示さなかった。 Presta et al., Supra produced chimeric human IgG with CH2 replaced with CH3 from human IgE. When tested for receptor binding, this chimera bound to FcεRI but had a 4-fold reduced affinity compared to native IgE. The results of Presta et al. Seem to confirm the results of Nissim et al., But are inconsistent with those of Weetall et al., Helm et al., And Basu et al., Cited above. In a further attempt to define the exact amino acid residues that are essential for IgE binding to its receptor, Presta et al. Categorized three loops derived from the CH2-CH3 hinge and CH3 domains of human IgE. The corresponding specific amino acid residue was inserted into a similar position within human IgG and this mutant was called IgGEL. Unfortunately, testing this IgGEL variant for receptor binding showed only weak binding compared to native IgE or IgG in which the full-length CH3 domain was replaced with a full-length CH2 domain.
IgE上のFcεRI結合部位を同定する第五のアプローチでは、モノクローナル抗体が開発され、FcεRIに対するIgE結合を阻止する能力について分析された。例えば、Del Prado et al., 1991, Molecular immunology 28: 839-844; Keegan et al., 1991, Molecular Immunology 28: 1149-1154; Hook et al., 1991, Molecular Immunology 28: 631-639; Takemoto et al., 1994, Microbiology and Immunology 38: 63-71; 及び Baniyash et al., 1988, Molecular Immunology 25: 705-711 を参照のこと。多くのモノクローナル抗体が開発されてきたが、多くの場合、これらモノクローナル抗体により認識されるアミノ酸配列が同定されてなかったり、又は同定され得ないために、真のIgE受容体結合部位についてほとんど情報を提供してこなかった。さらに、開発されたモノクローナル抗体は、受容体結合に直接関わるIgE残基の結合及びマスキングによるのではなく、立体障害やIgE分子内の重大なコンホメーション変化の誘導によりIgEがその受容体へ結合することを阻止する可能性がある。 In a fifth approach to identifying FcεRI binding sites on IgE, monoclonal antibodies were developed and analyzed for their ability to block IgE binding to FcεRI. For example, Del Prado et al., 1991, Molecular immunology 28: 839-844; Keegan et al., 1991, Molecular Immunology 28: 1149-1154; Hook et al., 1991, Molecular Immunology 28: 631-639; Takemoto et al., 1994, Microbiology and Immunology 38: 63-71; and Baniyash et al., 1988, Molecular Immunology 25: 705-711. Many monoclonal antibodies have been developed, but in many cases the amino acid sequence recognized by these monoclonal antibodies has not been identified or cannot be identified, so little information about the true IgE receptor binding site is available. I didn't offer it. Furthermore, the developed monoclonal antibody does not rely on the binding and masking of IgE residues that are directly involved in receptor binding, but IgE binds to its receptor by induction of steric hindrance and significant conformational changes within the IgE molecule. May prevent you from doing it.
上記の論考から、IgE上の受容体結合部位を同定するために設計された種々のアプローチが一致しない結果を生んだことが明らかである。受容体結合に必須なIgEのアミノ酸残基を同定することの困難さは、受容体へ結合するために使用されるIgE上の部位が、合成ペプチドにより模倣され得るような、直線状のアミノ酸配列ではないかもしれないという可能性により、さらに複雑なものになり得る。むしろ、結合部位は、IgEタンパク質配列内の離れたところにあって、IgEのネーティブな三次元構造においてのみごく近傍に集結される、多数のアミノ酸により形成される配座(コンホメーション)決定基であるのかもしれない。IgE変異体、IgEキメラ、及びモノクローナル抗IgE抗体を用いた数々の試験は、結合部位が配座決定基であることを強く示唆する。 From the above discussion, it is clear that the various approaches designed to identify receptor binding sites on IgE have produced inconsistent results. The difficulty in identifying the amino acid residues of IgE essential for receptor binding is the linear amino acid sequence such that the site on IgE used to bind to the receptor can be mimicked by a synthetic peptide The possibility that it may not be more complicated. Rather, the binding site is a conformational determinant formed by a number of amino acids that are remote within the IgE protein sequence and are only closely congregated in the native three-dimensional structure of IgE. It may be. Numerous studies with IgE mutants, IgE chimeras, and monoclonal anti-IgE antibodies strongly suggest that the binding site is a conformational determinant.
現在では、IgE介在性アレルギー反応は、マスト細胞及び好塩基球から放出される血管作用物質の効果を打ち消すことによって、アレルギー反応に関連した症状を軽減しようとする抗ヒスタミン剤やコルチコステロイド剤のような薬物で治療される。高用量の抗ヒスタミン剤及びコルチコステロイド剤には、腎毒性や胃腸毒性のような重篤な副作用がある。従って、I型アレルギー反応を治療する他の方法が求められている。 Currently, IgE-mediated allergic reactions, such as antihistamines and corticosteroids that try to alleviate symptoms associated with allergic reactions by counteracting the effects of vasoactive substances released from mast cells and basophils Treated with drugs. High doses of antihistamines and corticosteroids have serious side effects such as nephrotoxicity and gastrointestinal toxicity. Accordingly, there is a need for other methods of treating type I allergic reactions.
I型アレルギー障害を治療する1つのアプローチは、血清中の可溶性(フリー)IgEと反応し、IgEがマスト細胞及び好塩基球上のその受容体に結合することを阻止し、受容体結合性IgEとは結合しない(即ち、アナフィラキシーを起こさない)モノクローナル抗体を産生することである。そのような2種類のモノクローナル抗体(rhuMab E25とCGP56901)がIgE介在性アレルギー反応の治療を目的とする臨床開発の後期段階にある(Chang, T. W., 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62 を参照のこと)。これらモノクローナル抗体により認識されるIgE分子のアミノ酸残基の同一性については知られてなく、これらモノクローナル抗体はIgE上の配座決定基を認識すると仮定されている。 One approach to treating type I allergic disorders is to react with soluble (free) IgE in serum, blocking IgE from binding to its receptor on mast cells and basophils, and receptor-bound IgE. Is to produce a monoclonal antibody that does not bind (ie does not cause anaphylaxis). Two such monoclonal antibodies (rhuMab E25 and CGP56901) are in late stages of clinical development aimed at treating IgE-mediated allergic reactions (see Chang, TW, 2000, Nature Biotechnology 18: 157-62) about). It is not known about the identity of the amino acid residues of the IgE molecule recognized by these monoclonal antibodies, and these monoclonal antibodies are postulated to recognize conformational determinants on IgE.
治療用抗IgEモノクローナル抗体を用いた臨床治験の初期結果は、これらの治療法がアトピー性アレルギーの治療に有効であることを示唆しているが、モノクローナル抗体をアレルギーの長期治療に使用することにはいくつかの重大な短所がある。第一に、これらモノクローナル抗体は元来ネズミにおいて産生されたので、マウスの配列をヒトのコンセンサスIgG配列に置き換えるように再処理しなければならなかった(Presta et al., 1993, The Journal of Immunology 151: 2623-2632)。この「ヒト化」法によりヒトの配列を95%含有するモノクローナル抗体が産生されたが、マウス起源の配列はいくつか残っている。これら抗IgE抗体を用いた治療はこの抗体を長期間にわたりしばしば投与することを必要とするので、治療されたアレルギー患者では、この治療用抗体の内部に依然として残るマウスの配列に対する抗体反応を生じる可能性がある。治療用抗IgEに対する抗体の誘発は、少なくとも一部の患者において、これら抗IgE抗体の治療効果を無効にすることだろう。第二に、これら抗体を用いた治療のコストは、治療効果を誘発するのにこれらモノクローナル抗体の高用量が必要とされるので、非常に高くなるだろう。さらに、これらの抗体が投与される頻度と投与経路は不便なものである。IgE介在性障害の治療にとってより魅力的な戦略は、抗IgE抗体の産生を誘発するペプチドを投与することである。 Initial results of clinical trials using therapeutic anti-IgE monoclonal antibodies suggest that these treatments are effective in the treatment of atopic allergies, but the use of monoclonal antibodies for long-term treatment of allergies Has some serious disadvantages. First, since these monoclonal antibodies were originally produced in mice, they had to be reprocessed to replace the mouse sequence with the human consensus IgG sequence (Presta et al., 1993, The Journal of Immunology). 151: 2623-2632). This “humanization” method produced monoclonal antibodies containing 95% human sequences, but some sequences of mouse origin remain. Because treatment with these anti-IgE antibodies requires frequent administration of this antibody over a long period of time, allergic patients who are treated can develop an antibody response against the mouse sequence still remaining inside the therapeutic antibody. There is sex. Induction of antibodies against therapeutic anti-IgE will abolish the therapeutic effect of these anti-IgE antibodies in at least some patients. Second, the cost of treatment with these antibodies will be very high since high doses of these monoclonal antibodies are required to elicit a therapeutic effect. Furthermore, the frequency and route of administration of these antibodies is inconvenient. A more attractive strategy for the treatment of IgE-mediated disorders is to administer peptides that induce the production of anti-IgE antibodies.
IgE介在性アレルギー反応にとって最も有望な治療の1つは、内因性IgE上の適切なアナフィラキシー非産生エピトープに対する能動免疫化である。Stanworth et al.(米国特許第5,601,821号)は、異種担体タンパク質がカップルした、ヒトIgEのCH4ドメインに由来するペプチドの、アレルギーワクチンとしての使用に関する戦略について説明した。しかしながら、このペプチドは、可溶性ネーティブIgEと反応する抗体の産生を誘発することが示されていない。さらに、Hellman(米国特許第5,653,980号)は、異種担体タンパク質に融合した完全長のCH2−CH3ドメイン(約220個のアミノ酸の長さ)に基づいた、抗IgEワクチン組成物を提唱した。しかしながら、Hellman により提唱されたこの抗IgEワクチン組成物により誘発される抗体は、IgE分子のCH2及びCH3ドメインのある部分に対する抗体がマスト細胞及び好塩基球の表面にあるIgE受容体と架橋結合し、アナフィラキシーのメディエーターの産生をもたらすので、アナフィラキシーを生じる可能性がきわめて高い(例えば、Stadler et al., 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102: 121-126 を参照のこと)。従って、IgE介在性アレルギー反応を治療するための、アナフィラキシー抗体を誘発しないワクチンが依然求められている。 One of the most promising treatments for IgE-mediated allergic reactions is active immunization against appropriate non-anaphylactic epitopes on endogenous IgE. Stanworth et al. (US Pat. No. 5,601,821) described a strategy for the use of peptides derived from the CH4 domain of human IgE coupled with heterologous carrier proteins as allergy vaccines. However, this peptide has not been shown to induce the production of antibodies that react with soluble native IgE. In addition, Hellman (US Pat. No. 5,653,980) proposes an anti-IgE vaccine composition based on a full-length CH2-CH3 domain (approximately 220 amino acids long) fused to a heterologous carrier protein. did. However, antibodies elicited by this anti-IgE vaccine composition proposed by Hellman show that antibodies against certain portions of the CH2 and CH3 domains of the IgE molecule cross-link with IgE receptors on the surface of mast cells and basophils. It leads to the production of mediators of anaphylaxis and is therefore very likely to cause anaphylaxis (see, for example, Stadler et al., 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102: 121-126). Accordingly, there remains a need for vaccines that do not induce anaphylactic antibodies to treat IgE-mediated allergic reactions.
アナフィラキシーの誘発に関わる有意義な懸念から、動物へ投与されたときに抗IgEポリクローナル抗体の産生を誘発し得るミモトープ(mimotope)からなる、I型アレルギー障害の治療に対するもう1つのアプローチが開発された(例えば、Rudolf et al., 1998, Journal of Immunology 160: 3315-3321 を参照のこと)。Kricek et al.(国際公開WO97/31948号)は、ファージディスプレイされたペプチドライブラリーをモノクローナル抗体のBSWI7でスクリーニングして、IgE受容体結合部位のコンホメーションを模倣し得るペプチドミモトープを同定した。これらのミモトープは、フリーのネーティブIgEと反応するが受容体結合性IgEとは反応せず、IgEがその受容体に結合することを阻止するポリクローナル抗体を誘発するために使用し得るだろう。Kricek et al.により、IgE分子のいかなる部分とも相同ではなく、従って、本発明に開示されるペプチドとは異なるペプチド・ミモトープが開示された。 Due to significant concerns regarding the induction of anaphylaxis, another approach to the treatment of type I allergic disorders has been developed consisting of mimotopes that can induce the production of anti-IgE polyclonal antibodies when administered to animals ( See, for example, Rudolf et al., 1998, Journal of Immunology 160: 3315-3321). Kricek et al. (WO 97/31948) screened a phage-displayed peptide library with the monoclonal antibody BSWI7 to identify peptide mimotopes that can mimic the conformation of the IgE receptor binding site. . These mimotopes could be used to elicit polyclonal antibodies that react with free native IgE but not with receptor-bound IgE and block IgE from binding to its receptor. Kricek et al. Disclosed a peptide mimotope that is not homologous to any part of the IgE molecule and is therefore different from the peptides disclosed in the present invention.
抗IgEワクチンの開発が直面する主要な難題は、アレルギーの被検者を免疫化し、アナフィラキシー非産生ポリクローナル抗体(即ち、受容体結合性IgEには結合しないポリクローナル抗IgE抗体)を誘発するために安全に使用し得る、アナフィラキシー非産生IgE決定基を表出するアミノ酸に関する正確な情報が不足していることである。本発明のペプチド組成物は、アナフィラキシー非産生であるように選択される;即ち、このペプチド組成物は、マスト細胞又は好塩基球に結合したIgEの架橋結合を引き起こし得る抗IgE抗体の産生を生じない。従って、本発明のペプチドは優れた安全性プロフィールを有し、完全長のCH2−CH3ドメインに基づいて開示されたワクチンから配列組成により差別化される。 The major challenge faced by the development of anti-IgE vaccines is to immunize allergic subjects and to elicit anaphylaxis non-producing polyclonal antibodies (ie polyclonal anti-IgE antibodies that do not bind to receptor-bound IgE) The lack of accurate information about the amino acids that express non-anaphylactic IgE determinants that can be used for The peptide composition of the present invention is selected to be non-anaphylactic producing; that is, the peptide composition results in the production of anti-IgE antibodies that can cause cross-linking of IgE bound to mast cells or basophils. Absent. Thus, the peptides of the present invention have an excellent safety profile and are differentiated by sequence composition from the disclosed vaccines based on the full-length CH2-CH3 domain.
IgE介在性アレルギーの治療に対して意図される療法の安全性及び効力は、通常マウス、ラット及びイヌのような動物モデルで評価される。喘息、アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーのようないくつかのタイプのIgE介在性アレルギーに対し、様々なマウス及びラットのモデルが開発されてきた(Xin-Min Li, et al., J. Allergy Clin. Immunol 1999, 103: 206-214, Xui-Min et al., J. Allergy Clin. Immunol 2001, 107: 693-702)。これらのモデルは低分子をベースとする治療モダリティの評価に有用であるが、それらはワクチンをベースとする治療の評価に適してはいない。これは、非げっ歯類の種、例えばイヌに対するワクチンの開発に使用されるIgE由来ペプチドエピトープがマウス及びラットのそれとは有意に異なり得るからである。天然に存在するイヌのアレルギーモデルは利用可能である(例えば、Ermel RW, et al., Laboratory Animal Science 1997, 47: 40-48)が、これらのモデルは開発するのに長い時間がかかり、一回にごく限られた数の動物しか得られない。さらに、これらのイヌは、いったんワクチンの試験に使用すると、次ぎからの試験には使用し得ない。イヌはノミアレルゲンのようなアレルゲンに実験的に感作し得るが、上記に論じた制限がやはりあてはまる(例えば、McDermott, MJ, et al., Molecular Immunology, 2000, 37: 361-375)。従って、所望されるターゲット種におけるアレルギーの治療のためにワクチン及び他の治療法を迅速に評価することを可能にするために、イヌにおいて高レベルのIgEとI型過敏症の臨床徴候を誘発するための適切な方法が求められている。 The safety and efficacy of the intended therapy for the treatment of IgE-mediated allergies is usually evaluated in animal models such as mice, rats and dogs. Various mouse and rat models have been developed for several types of IgE-mediated allergies such as asthma, atopic dermatitis and food allergies (Xin-Min Li, et al., J. Allergy Clin Immunol 1999, 103: 206-214, Xui-Min et al., J. Allergy Clin. Immunol 2001, 107: 693-702). While these models are useful for assessing small molecule based therapeutic modalities, they are not suitable for assessing vaccine based therapies. This is because the IgE-derived peptide epitopes used in the development of vaccines for non-rodent species such as dogs can be significantly different from those of mice and rats. Naturally occurring canine allergy models are available (eg Ermel RW, et al., Laboratory Animal Science 1997, 47: 40-48), but these models take a long time to develop and are Only a limited number of animals can be obtained at one time. In addition, these dogs, once used for vaccine testing, cannot be used for subsequent testing. Although dogs can be experimentally sensitized to allergens such as flea allergens, the limitations discussed above still apply (eg, McDermott, MJ, et al., Molecular Immunology, 2000, 37: 361-375). Thus, elicits high levels of IgE and clinical signs of type I hypersensitivity in dogs to allow rapid assessment of vaccines and other therapies for treatment of allergies in the desired target species There is a need for an appropriate method for this.
リシンは、トウゴマに見出されるレクチンで、多種多様な抗原に対して向けられたIgE産生を強めることが見出されている。例えば、抗原とともにリシンを投与すると、本来はIgEが低いラットにおいてIgEの産生を高めることができる(例えば、Underwood, SL et al.; Immunology, 1995; 85: 256-61, Underwood, SL et al.; Int Arch Allergy immunol. 1995; 107: 119-21 及び Diaz-Sanchez D. et al.; Immunology, 1991; 72: 297-303)。いくつかの研究は、リシンが、活性化CD8+Tリンパ球の集団を選好的に阻害することによってIgE応答を高めることを示した。これらCD8+細胞は、Bリンパ球にIgEを発現させるクラススイッチシグナルを提供する、CD4+リンパ球により放出されるTh2サイトカイン(IL−4、IL−10及びIL−5)をダウンレギュレートする逆調節サイトカイン(例、γ−インターフェロン)を発現すると考えられている(Noble A et al.; Immunology 1993, 80: 326 及び Diaz-Sanchez D. et al.; Immunology, 1993; 78: 226-236)。これまでの研究はまた、免疫抑制性のCD8+Tリンパ球の養子移入を受けたラットでは、ハチ毒ホスホリパーゼA2に対するIgE応答が90%減少したことを示している(Diaz-Sanchez D. et al.; Immunology, 1993; 78: 226-236)。CD4+細胞に比較すると、この調節性CD8+Tリンパ球の集団は、リシンレクチンに対する高アフィニティー受容体を有する。このレクチンが活性化細胞へ入った後に、細胞のタンパク質合成が阻害され、細胞死をもたらす。抗原及びリシンで免疫化したラットは、免疫化から7〜21日後に起こるCD8+Tリンパ球の40%減少により、CD4/CD8比の劇的な増加を示す(Diaz-Sanchez D. et al.; Immunology, 1993; 78: 226-236)。 Lysine is a lectin found in castor bean that has been found to enhance IgE production directed against a wide variety of antigens. For example, administration of lysine with an antigen can increase IgE production in rats that are originally low in IgE (eg, Underwood, SL et al .; Immunology, 1995; 85: 256-61, Underwood, SL et al. Int Arch Allergy immunol. 1995; 107: 119-21 and Diaz-Sanchez D. et al .; Immunology, 1991; 72: 297-303). Several studies have shown that ricin enhances the IgE response by selectively inhibiting a population of activated CD8 + T lymphocytes. These CD8 + cells down-regulate Th2 cytokines (IL-4, IL-10 and IL-5) released by CD4 + lymphocytes, providing a class switch signal that causes IgE to be expressed on B lymphocytes (Eg, γ-interferon) (Noble A et al .; Immunology 1993, 80: 326 and Diaz-Sanchez D. et al .; Immunology, 1993; 78: 226-236). Previous studies have also shown a 90% reduction in IgE response to bee venom phospholipase A2 in rats receiving adoptive transfer of immunosuppressive CD8 + T lymphocytes (Diaz-Sanchez D. et al .; Immunology, 1993; 78: 226-236). Compared to CD4 + cells, this population of regulatory CD8 + T lymphocytes has a high affinity receptor for ricin lectin. After this lectin enters activated cells, cellular protein synthesis is inhibited, leading to cell death. Rats immunized with antigen and ricin show a dramatic increase in the CD4 / CD8 ratio with a 40% reduction in CD8 + T lymphocytes occurring 7-21 days after immunization (Diaz-Sanchez D. et al .; Immunology 1993; 78: 226-236).
このように、アレルギーモデルの開発を促進して迅速化するには、アレルゲン及びリシンへの同時曝露の後で正常なイヌにおいて高レベルのIgEを誘発することとアレルギーの臨床徴候を同時誘発することについて、本発明の方法において提供されるようなニーズが存在する。本方法では、すぐに入手できる正常なイヌを利用し、比較的短い時間にイヌの大部分を感作させる。 Thus, to facilitate and expedite the development of an allergy model, induce high levels of IgE in normal dogs after simultaneous exposure to allergen and lysine and simultaneously induce clinical signs of allergy There exists a need as provided in the method of the present invention. The method utilizes normal dogs that are readily available and sensitizes most of the dogs in a relatively short time.
本発明は、IgE分子のεH鎖のFc部分から誘導される抗原性ペプチドを、IgE介在性アレルギーの治療及び予防のワクチンとして使用するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、IgE分子のCH3ドメインから誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原量を含んでなる、IgE介在性アレルギー障害の治療及び予防用の組成物を提供する。 The present invention provides compositions and methods for using antigenic peptides derived from the Fc portion of the εH chain of IgE molecules as vaccines for the treatment and prevention of IgE-mediated allergies. In particular, the present invention provides a composition for the treatment and prevention of IgE-mediated allergic disorders, comprising an immunogenic amount of one or more antigenic peptides derived from the CH3 domain of an IgE molecule.
好ましくは、本発明の組成物は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原量を含む。さらに好ましい本発明の組成物は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原量を含む。図10〜16は、そのようなヒトCH3/CH4ペプチド配列を図示する。 Preferably, the composition of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7. An immunogenic amount of one or more antigenic peptides. Further preferred compositions of the invention comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14. An immunogenic amount of one or more antigenic peptides. Figures 10-16 illustrate such human CH3 / CH4 peptide sequences.
この抗原性ペプチドは、直接投与によるか、又は体細胞遺伝子治療を使用する「プロドラッグ」として間接的に供給され得る。
本発明はまた、IgE分子のCH3ドメインから誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量と1つ又はそれ以上の製剤的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。1つの態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3ドメインから誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量と1つ又はそれ以上の製剤的に許容される担体を含む。もう1つの態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部から誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量と1つ又はそれ以上の製剤的に許容される担体を含む。
The antigenic peptide can be supplied by direct administration or indirectly as a “prodrug” using somatic cell gene therapy.
The present invention also includes a pharmaceutical comprising an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides derived from the CH3 domain of an IgE molecule and one or more pharmaceutically acceptable carriers. A composition is provided. In one aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides derived from the CH3 domain of an IgE molecule and one or more pharmaceutically acceptable. A carrier to be prepared. In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides derived from the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule and one or more thereof. The above pharmaceutically acceptable carrier is included.
特定の態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、IgE分子のCH3ドメインから誘導される抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。もう1つの特定の態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部から誘導される抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。 In a particular embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutical carriers, one or more antigens comprising an antigenic peptide derived from the CH3 domain of an IgE molecule and a heterologous carrier protein. An immunogenically effective amount of the sex fusion protein. In another specific aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutical carriers, an antigenic peptide derived from the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule and a heterologous carrier protein. An immunogenically effective amount of one or more antigenic fusion proteins.
好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、異種担体タンパク質にカップルした、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる抗原性融合タンパク質を含む。 In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutical carriers and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutical carriers and a heterologous carrier protein, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4. An antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7 is included.
さらに好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、1つ又はそれ以上の医薬担体と、異種担体タンパク質にカップルした、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる抗原性融合タンパク質を含む。 In a further preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more pharmaceutical carriers and SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: : 13, or an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention is coupled to one or more pharmaceutical carriers and a heterologous carrier protein, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11. An antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14 is included.
本発明はまた、IgE分子のCH3ドメインから誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量、製剤的に許容される担体、及びアジュバントを含んでなる医薬組成物を提供する。アジュバントには、抗原に対する免疫応答を増強し得る化合物が含まれる。有効であり得るアジュバントの例には、限定しないが、水酸化アルミニウム、モノリン脂質A(MPLA)、アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン、単純免疫刺激オリゴヌクレオチド、IL−12、IL−2又はIL−1のようなサイトカイン、サポニン、及びコレラトキシン、易熱性トキシンのような細菌性トキシン、及びそれらの遺伝学的に変化させた誘導体が含まれる。 The present invention also includes a pharmaceutical composition comprising an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides derived from the CH3 domain of an IgE molecule, a pharmaceutically acceptable carrier, and an adjuvant. provide. Adjuvants include compounds that can enhance the immune response to an antigen. Examples of adjuvants that may be effective include, but are not limited to, aluminum hydroxide, monophospholipid A (MPLA), acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl. -L-alanyl-D-isoglutamine, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -Ethylamine, simple immunostimulatory oligonucleotides, cytokines such as IL-12, IL-2 or IL-1, saponins, and bacterial toxins such as cholera toxin, heat-labile toxin, and their genetically altered Derivatives.
1つの態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3ドメインから誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量、製剤的に許容される担体、及びアジュバントを含む。もう1つの態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部から誘導される1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量、製剤的に許容される担体、及びアジュバントを含む。もう1つの態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及びIgE分子のCH3ドメインから誘導される抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。さらにもう1つ態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及びIgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部から誘導される抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。 In one aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides derived from the CH3 domain of an IgE molecule, a pharmaceutically acceptable carrier, and an adjuvant. including. In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises an immunogenically effective amount, pharmaceutically acceptable, of one or more antigenic peptides derived from the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule. Carrier, and adjuvant. In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and one or more antigenic fusion proteins comprising an antigenic peptide derived from the CH3 domain of an IgE molecule and a heterologous carrier protein. In an immunogenically effective amount of. In yet another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and one or more antigenic peptides derived from the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule and a heterologous carrier protein. An immunogenically effective amount of the above antigenic fusion protein is included.
好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及び配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及び異種担体タンパク質にカップルした、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。 In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or a sequence. An immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of No. 7. In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: coupled to a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and a heterologous carrier protein. : An immunogenically effective amount of one or more antigenic fusion proteins comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7.
さらに好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及び配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量を含む。なおもう1つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、医薬担体、アジュバント、及び異種担体タンパク質にカップルした、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質の免疫原的に有効な量を含む。 In a further preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or An immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. In yet another preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutical carrier, an adjuvant, and a heterologous carrier protein, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, sequence. An immunogenically effective amount of one or more antigenic fusion proteins comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14.
本発明はまた、IgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために動物、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒトへ本発明の組成物を投与する方法を提供する。本発明の組成物は、動物、好ましくは伴侶動物(例、イヌ、ネコ、及びウマ)及び家畜(例、ウシ、及びブタ)のような哺乳動物、及び最も好ましくはヒトへ投与されるのに適している。本発明の組成物は、免疫応答、例えばIgE分子に特異性があるポリクローナル抗体の産生を誘発するのに有効な量で投与される。1つの態様では、本発明の組成物が、IgEがその受容体に結合するのに必要なIgE分子のFc部分(即ち、IgE分子のCH3ドメイン)に特異性があるポリクローナル抗体の産生を誘発するのに有効な量で投与される。好ましい態様では、本発明の組成物が、血清及び他の体液中の可溶性(フリー)IgEに結合し、IgEがマスト細胞及び好塩基球の上にあるその高アフィニティー受容体に結合することを防ぎ、受容体結合性IgEとは架橋結合しない抗IgE抗体の産生を誘発するのに有効な量で投与される。従って、本発明の組成物は、IgE介在性アレルギー障害の治療及び予防のためにアナフィラキシーを誘発しないポリクローナル抗体の産生を誘発するのに有効な量で投与される。 The invention also provides a method of administering a composition of the invention to an animal, preferably a mammal, and most preferably a human for the treatment or prevention of IgE-mediated allergic disorders. The compositions of the present invention are intended to be administered to animals, preferably mammals such as companion animals (eg, dogs, cats and horses) and livestock (eg, cows and pigs), and most preferably humans. Are suitable. The compositions of the invention are administered in an amount effective to induce an immune response, such as the production of polyclonal antibodies specific for IgE molecules. In one embodiment, the composition of the invention induces the production of polyclonal antibodies that are specific for the Fc portion of the IgE molecule (ie, the CH3 domain of the IgE molecule) that is required for IgE to bind to its receptor. Is administered in an effective amount. In a preferred embodiment, the composition of the invention binds to soluble (free) IgE in serum and other body fluids and prevents IgE from binding to its high affinity receptor on mast cells and basophils. , Administered in an amount effective to induce the production of anti-IgE antibodies that are not cross-linked with receptor-bound IgE. Accordingly, the compositions of the invention are administered in an amount effective to induce the production of polyclonal antibodies that do not induce anaphylaxis for the treatment and prevention of IgE-mediated allergic disorders.
本発明はまた、抗IgEワクチンの効果をイヌにおいて評価する方法を提供し、前記方法は、イヌにおいて過敏症を誘発するのに十分な量のアレルゲン及びリシンの同時投与によりイヌをこのアレルゲンへ感作させること、次いでこのアレルゲンでチャレンジして、このチャレンジ・アレルゲンに対して生じるイヌの敏感性を観察することを含む。本発明の特定の態様には、アレルゲンがノミアレルゲンであるか、又は回虫アレルゲンのような食物アレルゲンであるものが含まれる。本方法の1つの態様では、過敏症がI型過敏症である。本方法のもう1つの態様では、感作により、過敏症になったイヌにおいて、過敏症になっていないイヌにおいて見出されるよりも高いレベルのIgEが生じる。 The present invention also provides a method for assessing the effect of an anti-IgE vaccine in a dog, said method sensitizing the dog to this allergen by co-administration of a sufficient amount of allergen and lysine to induce hypersensitivity in the dog. And then challenge with the allergen and observe the sensitivity of the dog to the challenge allergen. Particular embodiments of the invention include those where the allergen is a flea allergen or a food allergen such as a roundworm allergen. In one embodiment of the method, the hypersensitivity is type I hypersensitivity. In another aspect of the method, sensitization results in higher levels of IgE in dogs that are hypersensitive than are found in dogs that are not hypersensitive.
さらに本発明は、抗IgEワクチンの効果をイヌにおいて評価するためにイヌにおいて高レベルのIgEと過敏症の臨床徴候を誘発する方法を提供し、前記方法は、イヌにおいて過敏症を誘発するのに十分な量のアレルゲン及びリシンの同時投与によりイヌをこのアレルゲンへ感作させること、次いでこのアレルゲンでチャレンジして、このチャレンジ・アレルゲンに対して生じるイヌの敏感性を観察することを含む。 The present invention further provides a method for inducing high levels of IgE and clinical signs of hypersensitivity in dogs to assess the effects of anti-IgE vaccines in dogs, said method being used to induce hypersensitivity in dogs. Sensitizing the dog to the allergen by co-administration of a sufficient amount of allergen and lysine, then challenged with the allergen and observing the sensitivity of the dog to the challenge allergen.
本発明は、IgE分子のεH鎖のFc部分から誘導される抗原性ペプチドを、IgE介在性アレルギーの治療及び予防のワクチンとして使用するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、IgE分子のCH3ドメインから誘導される抗原性ペプチドの免疫原量を含んでなる、IgE介在性アレルギー障害の治療及び予防用の組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7(図3〜9)のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原量を含む。さらに好ましい本発明の組成物は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14(図10〜16)のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドの免疫原量を含む。 The present invention provides compositions and methods for using antigenic peptides derived from the Fc portion of the εH chain of IgE molecules as vaccines for the treatment and prevention of IgE-mediated allergies. In particular, the present invention provides a composition for the treatment and prevention of IgE-mediated allergic disorders, comprising an immunogenic amount of an antigenic peptide derived from the CH3 domain of an IgE molecule. Preferably, the composition of the invention comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7 (FIGS. 3-9). The immunogenic amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of More preferred compositions of the invention are SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14 (FIGS. 10-16). The immunogenic amount of one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of
本発明の抗原性ペプチドは、IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含み、アナフィラキシーではない、抗IgE抗体の産生を誘発する。本発明はまた、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部のアミノ酸配列を含んでなる抗原性ペプチドを含み、これがアナフィラキシーではない抗IgE抗体を誘発する。特に、本発明の抗原性ペプチドは、血清及び他の体液中の可溶性(フリー)IgEに結合し、IgEがマスト細胞及び好塩基球の上にあるその高アフィニティー受容体に結合することを防ぎ、受容体結合性IgEとは架橋結合しない抗IgE抗体の産生を誘発する。本発明の抗原性ペプチドは、1つ又はそれ以上の異種ペプチドにカップルし得る。本発明の抗原性ペプチドは、直接投与によるか、又は体細胞遺伝子治療を使用する「プロドラッグ」として間接的に供給され得る。 The antigenic peptides of the present invention comprise the amino acid sequence of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof and induce the production of anti-IgE antibodies that are not anaphylaxis. The present invention also includes an antigenic peptide comprising the amino acid sequence of the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule, which elicits an anti-IgE antibody that is not anaphylaxis. In particular, the antigenic peptides of the present invention bind to soluble (free) IgE in serum and other body fluids, preventing IgE from binding to its high affinity receptor on mast cells and basophils, It induces the production of anti-IgE antibodies that are not cross-linked with receptor-bound IgE. An antigenic peptide of the invention can be coupled to one or more heterologous peptides. The antigenic peptides of the invention can be supplied by direct administration or indirectly as a “prodrug” using somatic cell gene therapy.
1つの態様では、本発明の抗原性ペプチドは、任意種のIgE分子のCH3ドメイン全体を含む。もう1つの態様では、本発明の抗原性ペプチドは任意種のIgE分子のCH3ドメインのフラグメントを含み、ここでこのフラグメントは、少なくとも5個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基の長さ、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも20個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも25個のアミノ酸残基の長さ、又は少なくとも30個のアミノ酸残基の長さである。好ましい態様では、本発明の抗原性ペプチドは、28〜31個のアミノ酸残基である、IgE分子のCH3ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の抗原性ペプチドは、21個のアミノ酸残基、22個のアミノ酸残基、23個のアミノ酸残基、24個のアミノ酸残基、又は25個のアミノ酸残基により分離される2個のシステインアミノ酸残基を有さない、IgE分子のCH3ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含む。特定の態様では、本発明の抗原性ペプチドは、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントを含み、ここでこのフラグメントは、少なくとも5個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基の長さ、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも20個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも25個のアミノ酸残基の長さ、又は少なくとも30個のアミノ酸残基の長さである。 In one aspect, the antigenic peptide of the invention comprises the entire CH3 domain of any kind of IgE molecule. In another aspect, the antigenic peptide of the invention comprises a fragment of the CH3 domain of any kind of IgE molecule, wherein the fragment is at least 5 amino acid residues long, preferably at least 10 amino acids. Residue length, more preferably at least 15 amino acid residue lengths, at least 20 amino acid residue lengths, at least 25 amino acid residue lengths, or at least 30 amino acid residues Is the length of In a preferred embodiment, the antigenic peptide of the invention comprises the amino acid sequence of a fragment of the CH3 domain of an IgE molecule that is 28-31 amino acid residues. In another preferred embodiment, the antigenic peptide of the present invention comprises 21 amino acid residues, 22 amino acid residues, 23 amino acid residues, 24 amino acid residues, or 25 amino acid residues. Comprising the amino acid sequence of a fragment of the CH3 domain of an IgE molecule that does not have two cysteine amino acid residues separated by In a particular embodiment, the antigenic peptide of the invention comprises a linking portion of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule or a fragment thereof, wherein the fragment is at least 5 amino acid residues long, preferably at least 10 Length of amino acid residues, more preferably length of at least 15 amino acid residues, length of at least 20 amino acid residues, length of at least 25 amino acid residues, or at least 30 amino acid residues The length of the amino acid residue.
好ましい態様では、本発明の抗原性ペプチドは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7(図3〜9)のアミノ酸配列を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の抗原性ペプチドは、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14(図10〜16)のアミノ酸配列を含む。 In a preferred embodiment, the antigenic peptide of the invention comprises SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7 (FIG. 3). To 9). In another preferred embodiment, the antigenic peptide of the invention comprises SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 14. The amino acid sequence of (FIGS. 10-16) is included.
本発明はまた、抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる抗原性融合タンパク質を提供する。特定の態様では、抗原性融合タンパク質は、IgE分子のCH3ドメイン全体と異種担体タンパク質を含む。もう1つの特定の態様では、抗原性融合タンパク質は、異種担体タンパク質にカップルしたIgE分子のフラグメントを含み、ここでこのCH3ドメインのフラグメントは、少なくとも5個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基の長さ、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも20個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも25個のアミノ酸残基の長さ、又は少なくとも30個のアミノ酸残基の長さである。もう1つの態様では、本発明の抗原性融合タンパク質は、異種担体タンパク質にカップルした、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントを含む。好ましい態様では、本発明の抗原性融合タンパク質は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸配列を含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の抗原性融合タンパク質は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を含む。 The present invention also provides an antigenic fusion protein comprising an antigenic peptide and a heterologous carrier protein. In certain aspects, the antigenic fusion protein comprises the entire CH3 domain of an IgE molecule and a heterologous carrier protein. In another specific embodiment, the antigenic fusion protein comprises a fragment of an IgE molecule coupled to a heterologous carrier protein, wherein the CH3 domain fragment is at least 5 amino acid residues long, preferably at least 10 amino acid residues long, more preferably at least 15 amino acid residues long, at least 20 amino acid residues long, at least 25 amino acid residues long, or at least 30 Of amino acid residues. In another aspect, the antigenic fusion protein of the invention comprises a CH3 and CH4 domain junction of an IgE molecule or a fragment thereof coupled to a heterologous carrier protein. In a preferred embodiment, the antigenic fusion protein of the invention comprises the amino acids of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7. Contains an array. In another preferred embodiment, the antigenic fusion protein of the invention comprises SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: Contains 14 amino acid sequences.
本発明はまた、1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失が導入された、IgE分子のCH3ドメインから誘導されるアミノ酸配列を含んでなる抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を提供する。当業者に周知の標準技術により突然変異を導入し得る。 The invention also provides an antigenic peptide or antigenic fusion protein comprising an amino acid sequence derived from the CH3 domain of an IgE molecule into which one or more amino acid substitutions, additions or deletions have been introduced. Mutations can be introduced by standard techniques well known to those skilled in the art.
例えば、1つ又はそれ以上のアミノ酸の突然変異を生じるヌクレオチドレベルでの1つ又はそれ以上の突然変異は、部位特異的突然変異誘発又はPCR介在性突然変異誘発により導入し得る。好ましくは、1つ又はそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基において保守的アミノ酸置換がなされる。「保守的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されることである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷の極性側鎖(例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分岐側鎖(例、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族の側鎖(例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。他のやり方では、飽和突然変異誘発のように、コーディング配列のあらゆる部分に無作為に突然変異を導入し得て、生成した突然変異体は、アナフィラキシーを引き起こさない抗IgE抗体を誘発する能力についてスクリーニングし得る。 For example, one or more mutations at the nucleotide level that result in mutation of one or more amino acids can be introduced by site-directed mutagenesis or PCR-mediated mutagenesis. Preferably, conservative amino acid substitutions are made at one or more predicted non-essential amino acid residues. A “conservative amino acid substitution” is one in which the amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine) , Tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), and aromatic side Amino acids with chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) are included. Alternatively, mutations can be introduced randomly at any part of the coding sequence, such as saturation mutagenesis, and the resulting mutants screened for the ability to induce anti-IgE antibodies that do not cause anaphylaxis. Can do.
本発明はまた、アナフィラキシーを誘発しない医薬組成物を投与することを含んでなる、動物、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒトにおいてIgE介在性アレルギー障害を治療するか又は予防する方法を提供する。本発明の方法により投与される医薬組成物は、IgE分子のCH3ドメインから誘導される抗原性ペプチドを包含する。本発明の方法により投与される医薬組成物には:(i)IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる組換え抗原性ペプチド;(ii)IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列と異種担体タンパク質を含んでなる、組換え抗原性融合タンパク質;(iii)IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる組換え抗原性ペプチド;(iv)IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる組換え抗原性融合タンパク質;(v)IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を有する抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド組成物;(vi)IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列と異種担体タンパク質を含んでなる抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド組成物;(vii)IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を有する抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド組成物;及び(viii)IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるプラスミド組成物が含まれる。 The present invention also provides a method of treating or preventing IgE-mediated allergic disorders in animals, preferably mammals, and most preferably humans, comprising administering a pharmaceutical composition that does not induce anaphylaxis. . The pharmaceutical composition administered by the method of the present invention includes an antigenic peptide derived from the CH3 domain of an IgE molecule. The pharmaceutical composition administered by the method of the present invention comprises: (i) a recombinant antigenic peptide comprising the amino acid sequence of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof; (ii) of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof A recombinant antigenic fusion protein comprising an amino acid sequence and a heterologous carrier protein; (iii) a recombinant antigenic peptide comprising the amino acid sequence of a CH3 and CH4 domain junction of an IgE molecule or a fragment thereof; (iv) A recombinant antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of the CH3 and CH4 domain junction of an IgE molecule or a fragment thereof; (v) a polypeptide encoding an antigenic peptide having the amino acid sequence of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof; Plasmid composition comprising nucleotides (Vi) a plasmid composition comprising a polynucleotide encoding an antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of the CH3 domain of an IgE molecule or fragment thereof and a heterologous carrier protein; (vii) of the CH3 and CH4 domains of the IgE molecule; A plasmid composition comprising a polynucleotide encoding an antigenic peptide having the amino acid sequence of the junction or fragment thereof; and (viii) comprising the amino acid sequence of the junction of the CH3 and CH4 domains of the IgE molecule or a fragment thereof A plasmid composition comprising a polynucleotide encoding an antigenic fusion protein is included.
1つの態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3ドメイン全体のアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドを含む。もう1つの態様では、本発明の抗原性ペプチドは、IgE分子のCH3ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドを含み、ここでこのフラグメントは、少なくとも5個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも10個のアミノ酸残基の長さ、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも20個のアミノ酸残基の長さ、少なくとも25個のアミノ酸残基の長さ、又は少なくとも30個のアミノ酸残基の長さである。好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、28〜31個のアミノ酸残基である、IgE分子のCH3ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる、1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドを含む。もう1つの好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、21個のアミノ酸残基、22個のアミノ酸残基、23個のアミノ酸残基、24個のアミノ酸残基、又は25個のアミノ酸残基により分離される2個のシステインアミノ酸残基を有さない、IgE分子のCH3ドメインのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる、1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドを含む。これらの態様によれば、本発明の医薬組成物はさらにアジュバントを含む。 In one aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of the entire CH3 domain of an IgE molecule. In another aspect, the antigenic peptide of the invention comprises one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of a fragment of the CH3 domain of an IgE molecule, wherein the fragment comprises at least 5 Amino acid residue length, preferably at least 10 amino acid residue lengths, more preferably at least 15 amino acid residue lengths, at least 20 amino acid residue lengths, at least 25 amino acid residues The length of the residue or the length of at least 30 amino acid residues. In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of the CH3 domain fragment of an IgE molecule, which is 28-31 amino acid residues. In another preferred embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention comprises 21 amino acid residues, 22 amino acid residues, 23 amino acid residues, 24 amino acid residues, or 25 amino acid residues. One or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of a fragment of the CH3 domain of an IgE molecule that does not have two cysteine amino acid residues separated by According to these embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention further comprises an adjuvant.
特定の態様では、本発明の医薬組成物は、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる1つ又はそれ以上の抗原性ペプチドを含む。この態様によれば、この医薬組成物はさらにアジュバントを含む場合がある。好ましくは、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる抗原性ペプチドは28〜31個のアミノ酸残基である。 In a particular aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more antigenic peptides comprising the amino acid sequence of the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule or a fragment thereof. According to this aspect, the pharmaceutical composition may further comprise an adjuvant. Preferably, the antigenic peptide comprising the amino acid sequence of the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule or a fragment thereof is 28 to 31 amino acid residues.
本発明はまた、1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質を含んでなる医薬組成物を提供する。特定の態様では、本発明の医薬組成物は、本発明の抗原性ペプチドと異種担体タンパク質を含んでなる、1つ又はそれ以上の抗原性融合タンパク質を含む。この態様によれば、この医薬組成物はさらにアジュバントを含む場合がある。 The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising one or more antigenic fusion proteins. In a particular aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises one or more antigenic fusion proteins comprising an antigenic peptide of the invention and a heterologous carrier protein. According to this aspect, the pharmaceutical composition may further comprise an adjuvant.
本明細書で使用されるように、「異種担体タンパク質」という用語は、本発明の組成物を受けている生物種に見出されるタンパク質への高い相同性を有さず、免疫応答を誘発するタンパク質を意味する。タンパク質は、2種のアミノ酸配列の比較に利用される既知の数学的アルゴリズムにより決定されるように、あるタンパク質に対して少なくとも75%同一、より好ましくは少なくとも85%同一、又は少なくとも90%同一である場合、高い相同性を有する(例えば、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; 及び Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8 を参照のこと)。好ましくは、2種のアミノ酸配列の同一性比率は、XBLASTプログラム(スコア=50、語長=3)を用いるBLASTタンパク質検索により決定される。異種担体タンパク質の例には、限定しないが、KLh、PhoE、rmLT、TraT、又はBhV−1ウイルス由来のgDが含まれる。 As used herein, the term “heterologous carrier protein” refers to a protein that elicits an immune response without high homology to a protein found in the species receiving the composition of the invention. Means. A protein is at least 75% identical, more preferably at least 85% identical, or at least 90% identical to a protein, as determined by known mathematical algorithms used to compare two amino acid sequences. In some cases, it has high homology (eg, Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 -5877; Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5; and Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8). Preferably, the identity ratio of the two amino acid sequences is determined by BLAST protein search using the XBLAST program (score = 50, word length = 3). Examples of heterologous carrier proteins include, but are not limited to, gD from KLh, PhoE, rmLT, TraT, or BhV-1 virus.
異種担体タンパク質は、本発明の抗原性ペプチドのN末端又はC末端へ融合し得る。本発明の抗原性融合タンパク質は、当業者に既知の技術、例えば、標準的な組換えDNA技術により産生し得る。例えば、抗原性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、自動化DNA合成機を含む、従来技術により合成し得る。他のやり方では、ヌクレオチドフラグメントのPCR増幅は、2種の連続したヌクレオチドフラグメント間に相補的な重複部分(overhangs)を生じるアンカープライマーを使用して実行され、次いでこれをアニールして、再増幅させて、抗原性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を産生することができる(例えば、Ausubel et al., 下記、を参照のこと)。さらに、融合部分(例、GSTポリペプチド)をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている。本発明の抗原性ペプチドをコードする核酸は、融合部分が本発明の抗原性ペプチドに正しいフレームで連結するように、そのような発現ベクターへクローン化され得る。さらに、異種担体タンパク質は、当業者に知られている化学的な方法により抗原性ペプチドへ融合し得る。 The heterologous carrier protein can be fused to the N-terminus or C-terminus of the antigenic peptide of the invention. The antigenic fusion proteins of the invention can be produced by techniques known to those skilled in the art, for example, standard recombinant DNA techniques. For example, a nucleotide sequence encoding an antigenic fusion protein can be synthesized by conventional techniques including automated DNA synthesizers. In other ways, PCR amplification of nucleotide fragments is performed using anchor primers that produce complementary overhangs between two consecutive nucleotide fragments, which are then annealed and re-amplified. Thus, a nucleotide sequence encoding an antigenic fusion protein can be produced (see, eg, Ausubel et al., Below). Moreover, many expression vectors are commercially available that already encode a fusion moiety (eg, a GST polypeptide). A nucleic acid encoding an antigenic peptide of the invention can be cloned into such an expression vector such that the fusion moiety is linked in the correct frame to the antigenic peptide of the invention. Furthermore, the heterologous carrier protein can be fused to the antigenic peptide by chemical methods known to those skilled in the art.
特定の態様では、本発明の医薬組成物は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、又は配列番号:7のアミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列を有する抗原性ペプチドを提供する。もう1つの態様では、本発明の医薬組成物は、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:1のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:2のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:3のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:4のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:5のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:6のアミノ酸配列、又は異種担体タンパク質にカップルした配列番号:7のアミノ酸配列を含んでなる抗原性融合タンパク質を提供する。もう1つの特定の態様では、本発明の医薬組成物は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する抗原性融合タンパク質を提供する。もう1つの態様では、本発明の医薬組成物は、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:8のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:9のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:10のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:11のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:12のアミノ酸配列、異種担体タンパク質にカップルした配列番号:13のアミノ酸配列、又は異種担体タンパク質にカップルした配列番号:14のアミノ酸配列を含んでなる抗原性融合タンパク質を提供する。これらの態様によれば、この医薬組成物はさらにアジュバントを含む場合がある。 In certain embodiments, the pharmaceutical composition of the invention comprises amino acids of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 7. Provided is an antigenic peptide having an amino acid sequence comprising residues. In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 coupled to a heterologous carrier protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 coupled to a heterologous carrier protein, and the SEQ ID NO coupled to a heterologous carrier protein. : Amino acid sequence of 3; SEQ ID NO: 4 coupled to heterologous carrier protein; amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 coupled to heterologous carrier protein; amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 coupled to heterologous carrier protein; An antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 coupled to a carrier protein is provided. In another specific embodiment, the pharmaceutical composition of the invention comprises SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: An antigenic fusion protein having a 14 amino acid sequence is provided. In another aspect, the pharmaceutical composition of the invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 coupled to a heterologous carrier protein, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 coupled to a heterologous carrier protein, and the SEQ ID NO coupled to a heterologous carrier protein. : 10 amino acid sequences, amino acid sequence SEQ ID NO: 11 coupled to heterologous carrier protein, amino acid sequence SEQ ID NO: 12 coupled to heterologous carrier protein, amino acid sequence SEQ ID NO: 13 coupled to heterologous carrier protein, or heterologous An antigenic fusion protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 coupled to a carrier protein is provided. According to these embodiments, the pharmaceutical composition may further comprise an adjuvant.
本発明の医薬組成物は、IgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために伴侶動物(例、イヌ及びネコ)及び家畜(例、ブタ、ウシ、及びウマ)のような動物とヒトへ投与されるのに適した製剤の中にある。好ましくは、本発明の医薬組成物は、IgE介在性アレルギー障害を治療又は予防するために抗原性ペプチドを受けるのと同じ種のIgE分子のCH3ドメインから誘導される抗原性ペプチドを含む。IgE介在性アレルギーには、限定しないが、喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーのような胃腸のアレルギー、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎及び移植片対宿主病が含まれる。本発明の医薬組成物は、IgE介在性アレルギー障害の治療、予防又は阻害に有効な量、又はアナフィラキシーではない抗IgE免疫応答(即ち、抗IgEポリクローナル抗体の産生)を誘発するのに有効な量、又はヒスタミンのような血管作用物質の放出を阻害するか又は低下させるのに有効な量、又はIgE介在性アレルギー障害に関連した1つ又はそれ以上の症状を軽減するのに有効な量において、被検者(動物)へ投与される。 The pharmaceutical compositions of the invention are administered to animals and humans such as companion animals (eg, dogs and cats) and livestock (eg, pigs, cows, and horses) for the treatment or prevention of IgE-mediated allergic disorders. In a suitable formulation. Preferably, the pharmaceutical composition of the invention comprises an antigenic peptide derived from the CH3 domain of the same species of IgE molecule that receives the antigenic peptide to treat or prevent an IgE-mediated allergic disorder. IgE-mediated allergies include, but are not limited to, asthma, allergic rhinitis, gastrointestinal allergies such as food allergies, eosinophilia, conjunctivitis, glomerulonephritis and graft-versus-host disease. The pharmaceutical composition of the present invention is an amount effective to treat, prevent or inhibit IgE-mediated allergic disorders, or an amount effective to elicit an anti-IgE immune response that is not anaphylaxis (ie, production of anti-IgE polyclonal antibodies). Or in an amount effective to inhibit or reduce the release of a vasoactive agent such as histamine, or in an amount effective to alleviate one or more symptoms associated with an IgE-mediated allergic disorder, It is administered to a subject (animal).
本発明の医薬組成物は、IgE介在性アレルギー障害を治療する既知の方法とともに使用し得る。1つの態様では、1つ又はそれ以上の本発明の医薬組成物と1つ又はそれ以上の抗ヒスタミン剤がIgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために動物へ投与される。もう1つの態様では、1つ又はそれ以上の本発明の医薬組成物と1つ又はそれ以上のコルチコステロイド剤がIgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために動物へ投与される。さらにもう1つの態様では、1つ又はそれ以上の本発明の医薬組成物と1つ又はそれ以上の抗IgEモノクローナル抗体(例、BSW17)がIgE介在性アレルギー障害の治療又は予防のために動物へ投与される。 The pharmaceutical compositions of the present invention may be used with known methods of treating IgE-mediated allergic disorders. In one aspect, one or more pharmaceutical compositions of the present invention and one or more antihistamines are administered to an animal for the treatment or prevention of IgE-mediated allergic disorders. In another aspect, one or more pharmaceutical compositions of the present invention and one or more corticosteroids are administered to an animal for the treatment or prevention of IgE-mediated allergic disorders. In yet another aspect, one or more pharmaceutical compositions of the present invention and one or more anti-IgE monoclonal antibodies (eg, BSW17) are delivered to an animal for the treatment or prevention of IgE-mediated allergic disorders. Be administered.
本発明はまた、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、遺伝暗号の縮重性により、同一の抗原性ペプチド及び抗原性融合タンパク質をコードする異なるポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を含む。本発明には、任意種のポリヌクレオチド配列によりコードされる、IgE分子のCH3ドメイン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる抗原性ペプチドが含まれる。IgE分子のCH3ドメインのポリヌクレオチド配列は、科学文献、Genbankからか、又は当業者に周知のクローニング技術を使用して得ることができる。特に、本発明には、Genbank受け入れ番号AAB59424.1及びAAA56797.1にそれぞれ開示され、参照により本明細書に組込まれているヒト及びイヌのIgE分子のCH3ドメインをコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。さらに本発明には、任意種のポリヌクレオチド配列によりコードされる、IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部又はそのフラグメントのアミノ酸配列を含んでなる抗原性ペプチドが含まれる。IgE分子のCH3及びCH4ドメインの連結部のポリヌクレオチド配列は、科学文献、Genbankからか、又は当業者に周知のクローニング技術を使用して得ることができる。 The invention also includes polynucleotide sequences that encode the antigenic peptides or antigenic fusion proteins of the invention. The present invention includes nucleic acid molecules comprising different polynucleotide sequences encoding the same antigenic peptide and antigenic fusion protein due to the degeneracy of the genetic code. The present invention includes an antigenic peptide comprising the amino acid sequence of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof encoded by any type of polynucleotide sequence. The polynucleotide sequence of the CH3 domain of an IgE molecule can be obtained from the scientific literature, Genbank, or using cloning techniques well known to those skilled in the art. In particular, the present invention includes polynucleotide sequences encoding the CH3 domains of human and canine IgE molecules disclosed in Genbank accession numbers AAB59424.1 and AAA56797.1, respectively, and incorporated herein by reference. . Furthermore, the present invention includes an antigenic peptide comprising the amino acid sequence of the junction of the CH3 and CH4 domains of an IgE molecule or a fragment thereof encoded by any kind of polynucleotide sequence. The polynucleotide sequence at the junction of the CH3 and CH4 domains of the IgE molecule can be obtained from the scientific literature, Genbank, or using cloning techniques well known to those skilled in the art.
本発明にはまた、任意種のポリヌクレオチド配列によりコードされる抗原性ペプチドと、この抗原性ペプチドとは異なる種のポリヌクレオチド配列によりコードされる異種担体タンパク質を含んでなる抗原性融合タンパク質が含まれる。異種担体タンパク質のポリヌクレオチド配列は、科学文献、Genbankからか、又は当業者に周知のクローニング技術を使用して得ることができる。 The present invention also includes an antigenic fusion protein comprising an antigenic peptide encoded by a polynucleotide sequence of any species and a heterologous carrier protein encoded by a polynucleotide sequence of a species different from the antigenic peptide. It is. The polynucleotide sequence of the heterologous carrier protein can be obtained from the scientific literature, Genbank, or using cloning techniques well known to those skilled in the art.
本発明の抗原性ペプチド及び抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクター、即ち、挿入されるタンパク質コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含有するベクターへ挿入し得る。必要な転写及び翻訳シグナルはまた、ネーティブなIgE遺伝子又はその隣接領域により供給され得る。タンパク質コーディング配列を発現させるには多様な宿主−ベクター系が利用され得る。これには、限定しないが、ウイルス(例、ワクシニアウイルス、アデノウイルス)で感染した哺乳動物細胞系;ウイルス(例、バキュロウイルス)で感染した昆虫細胞系;酵母ベクターを含有する酵母、又はバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNAで形質転換した細菌のような微生物が含まれる。ベクターの発現要素は、その強度及び特異性において異なる。利用される宿主−ベクター系に依存して、数多くの好適な転写及び翻訳要素のいずれか1つを使用し得る。 The polynucleotide sequences encoding the antigenic peptides and antigenic fusion proteins of the invention can be inserted into a suitable expression vector, i.e. a vector containing the elements necessary for transcription and translation of the inserted protein coding sequence. Necessary transcriptional and translational signals can also be supplied by the native IgE gene or its flanking regions. A variety of host-vector systems may be utilized to express the protein coding sequence. This includes, but is not limited to, mammalian cell lines infected with viruses (eg, vaccinia virus, adenovirus); insect cell lines infected with viruses (eg, baculovirus); yeast containing yeast vectors, or bacteriophages , Microorganisms such as bacteria transformed with DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA. The expression elements of vectors vary in their strengths and specificities. Depending on the host-vector system utilized, any one of a number of suitable transcription and translation elements can be used.
DNAフラグメントのベクターへの挿入についてこれまでに記載された方法のいずれかを使用して、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、好適な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法には、in vitro 組換えDNA及び合成技術と、in vivo 組換え体(遺伝的組換え)が含まれ得る。本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸配列の発現は、組換えDNA分子で形質転換した宿主において抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質が発現されるように、第二の核酸配列により調節され得る。例えば、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の発現は、当技術分野で知られている任意のプロモーター又はエンハンサー要素により制御され得る。本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の発現を制御するのに使用され得るプロモーターには、限定しないが、サイトメガロウイルス(CMV)の極初期プロモーター領域、SV40の初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’−LTR(長い末端繰り返し配列)に含まれるプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42);β−ラクタマーゼプロモーターのような原核性の発現ベクター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)、又はtacプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25);("Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242: 74-94 も参照のこと);ノパリン(nopaline)シンテターゼプロモーター領域(Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213)又はカリフラワーモザイクウイルスの35S・RNAプロモーター(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871)、及び光合成酵素のリブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120)を含んでなる植物の発現ベクター;Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターのような酵母又は他の真菌由来のプロモーター要素、及び、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用されてきた以下の動物の転写制御領域:膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼI遺伝子調節領域(Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515);膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子調節領域(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122);リンパ球様細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; 及び Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444);精巣、***、リンパ球様及びマスト細胞において活性であるマウス乳癌ウイルス調節領域(Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495);肝臓において活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276);肝臓において活性であるα−フェトプロテイン遺伝子調節領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; 及び Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58);肝臓において活性であるα1−抗トリプシン遺伝子調節領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171);骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子調節領域(Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; 及び Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94);脳内の希突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の調節領域(Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712);骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−2遺伝子調節領域(Sani, 1985, Nature 314: 283-286);筋肉において活性であるブタのα−骨格アクチン遺伝子調節領域(Reecy, M. et al., 1998, Animal Biotechnology 9: 101-120);及び視床下部において活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域(Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378)が含まれる。 Expression vector containing a polynucleotide encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein and suitable transcriptional and translational control signals using any of the methods previously described for insertion of DNA fragments into a vector Can be built. These methods can include in vitro recombinant DNA and synthetic techniques and in vivo recombinants (genetic recombination). The expression of the nucleic acid sequence encoding the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the present invention is such that the antigenic peptide or antigenic fusion protein is expressed in a host transformed with the recombinant DNA molecule. Can be adjusted by. For example, the expression of an antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention can be controlled by any promoter or enhancer element known in the art. Promoters that can be used to control the expression of the antigenic peptides or antigenic fusion proteins of the present invention include, but are not limited to, cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter region, SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon , 1981, Nature 290: 304-310), promoter (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797) contained in the 3′-LTR (long terminal repeat sequence) of Rous sarcoma virus, herpes thymidine kinase promoter ( Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445), regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); like the β-lactamase promoter Prokaryotic expression vectors (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) or tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 21-25); ("Us See also eful proteins from recombinant bacteria ", Scientific American, 1980, 242: 74-94); nopaline synthetase promoter region (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) or cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) and ribose diphosphate carboxylase promoter of photosynthetic enzyme (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115-120) A plant expression vector comprising; a promoter element from yeast or other fungi, such as a Gal4 promoter, an ADC (alcohol dehydrogenase) promoter, a PGK (phosphoglycerol kinase) promoter, an alkaline phosphatase promoter, and exhibiting tissue specificity The following animal transcription control regions that have been used for transgenic animals: : Elastase I gene regulatory region active in pancreatic acinar cells (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); insulin gene regulatory region active in pancreatic β cells (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); immunoglobulin gene regulatory region active in lymphoid cells (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; and Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); Mouse mammary tumor virus regulatory region active in testis, breast, lymphoid and mast cells (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-495); albumin gene regulatory region active in liver (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276); α-fetoprotein gene regulatory region active in the liver (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; and Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); α1-antitrypsin gene regulatory region active in the liver (Kelsey et al. ., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171); β-globin gene regulatory region active in myeloid cells (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; and Kollias et al., 1986 , Cell 46: 89-94); regulatory region of myelin basic protein gene that is active in oligodendrocytes in the brain (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); active in skeletal muscle One myosin light chain-2 gene regulatory region (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); porcine α-skeletal actin gene regulatory region active in muscle (Reecy, M. et al., 1998, Animal Biotechnology 9 : 101-120); and the gonadotropin releasing hormone gene regulatory region that is active in the hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378 ) Is included.
特定の態様では、抗原性ペプチドをコードする核酸に機能可能的に連結したプロモーター、1つ又はそれ以上の複製起点、及び、所望により、1つ又はそれ以上の選択マーカー(例、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターが使用される。もう1つの特定の態様では、抗原性融合タンパク質をコードする核酸に機能可能的に連結したプロモーター、1つ又はそれ以上の複製起点、及び、所望により、1つ又はそれ以上の選択マーカー(例、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターが使用される。 In certain embodiments, a promoter operably linked to a nucleic acid encoding an antigenic peptide, one or more origins of replication, and optionally one or more selectable markers (eg, antibiotic resistance genes) ) Is used. In another specific embodiment, a promoter operably linked to a nucleic acid encoding an antigenic fusion protein, one or more origins of replication, and optionally one or more selectable markers (eg, A vector containing an antibiotic resistance gene) is used.
遺伝子インサートを含有する発現ベクターは、3種の一般的なアプローチ:(a)核酸ハイブリダイゼーション;(b)「マーカー」遺伝子機能の有無;及び(c)挿入配列の発現、により同定され得る。第一のアプローチでは、発現ベクターに挿入された、抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド又は抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在が、挿入されたポリヌクレオチド配列に相同である配列を含んでなるプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションにより検出され得る。第二のアプローチでは、遺伝子のベクター中への挿入により引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子の機能(例、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への抵抗性、形質転換の表現型、バキュロウイルスにおける咬合体の形成、等)の有無に基づいて、組換えベクター/宿主系が同定され得る。例えば、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸分子がベクターのマーカー遺伝子配列の内部に挿入されると、この抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質のインサートをコードする核酸分子を含有する組換え体は、マーカー遺伝子の機能の不在により同定され得る。第三のアプローチでは、組換え体により発現される遺伝子産物をアッセイすることによって、組換え発現ベクターが同定され得る。そのようなアッセイは、例えば、in vitro アッセイ系における抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の物理的又は機能的な特性(例、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の抗IgE抗体との結合)に基づき得る。 Expression vectors containing gene inserts can be identified by three general approaches: (a) nucleic acid hybridization; (b) presence or absence of “marker” gene function; and (c) expression of the inserted sequence. In the first approach, the presence of a polynucleotide encoding an antigenic peptide or a polynucleotide encoding an antigenic fusion protein inserted into an expression vector comprises a sequence that is homologous to the inserted polynucleotide sequence. It can be detected by nucleic acid hybridization using a probe. In the second approach, certain “marker” gene functions caused by insertion of the gene into the vector (eg, thymidine kinase activity, resistance to antibiotics, transformation phenotype, occlusion in baculoviruses) The recombinant vector / host system can be identified based on the presence or absence of For example, when a nucleic acid molecule encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein is inserted inside the marker gene sequence of a vector, a recombinant containing the nucleic acid molecule encoding the antigenic peptide or antigenic fusion protein insert The body can be identified by the absence of marker gene function. In the third approach, recombinant expression vectors can be identified by assaying the gene product expressed by the recombinant. Such assays are based, for example, on the physical or functional properties of an antigenic peptide or antigenic fusion protein in an in vitro assay system (eg, binding of the antigenic peptide or antigenic fusion protein to an anti-IgE antibody). obtain.
特定の組換えDNA分子が同定され、単離されると、当技術分野で知られているいくつかの方法を使用してそれを増殖し得る。好適な宿主系及び増殖条件が確立すれば、組換え発現ベクターを増殖させ、多量に製造し得る。すでに説明したように、使用し得る発現ベクターには、限定しないが、以下のベクター又はその類似体が含まれる:少し挙げると、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなヒト又は動物のウイルス;バキュロウイルスのような昆虫ウイルス;酵母ベクター;バクテリオファージベクター(例、λ:ラムダ)、プラスミド及びコスミドDNAベクター。 Once a particular recombinant DNA molecule has been identified and isolated, it can be propagated using several methods known in the art. Once a suitable host system and growth conditions are established, recombinant expression vectors can be propagated and produced in large quantities. As already explained, expression vectors that can be used include, but are not limited to, the following vectors or analogs thereof: human or animal viruses such as vaccinia virus or adenovirus; Insect viruses such as: yeast vectors; bacteriophage vectors (eg, lambda: lambda), plasmids and cosmid DNA vectors.
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用されるように、組換えDNA分子が導入される特定の被検細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的な子孫も意味する。後継世代においては、突然変異又は環境上の影響のいずれかによりある種の変化が起こり得るので、そのような子孫は、実際は親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも、本明細書で使用されるような用語の範囲内に含まれる。 The term “host cell” as used herein means not only the particular test cell into which the recombinant DNA molecule is introduced, but also the progeny or potential progeny of such a cell. In subsequent generations, certain changes may occur, either due to mutations or environmental effects, so such progeny may not actually be identical to the parent cell, but Included within the scope of terms as used.
宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレートするか、又は所望される特定の形式で遺伝子産物を修飾及び加工するものが選択される。ある種のプロモーターからの発現は、ある種のインデューサーの存在下で上昇され得る;このように、遺伝子操作されたものの発現は調節し得る。さらに、様々な宿主細胞は、翻訳及び翻訳後のプロセシング及び修飾(例、タンパク質の糖鎖結合、リン酸化)について特徴的で特定の機序を有する。発現される異種タンパク質の所望される修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞系又は宿主系を選択し得る。例えば、細菌系での発現は、糖鎖結合の無いコアタンパク産物を産生するのに使用し得る。酵母における発現は糖鎖結合のある産物を産生する。哺乳動物細胞における発現は、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の「ネーティブ」な糖鎖結合を確実にするために使用され得る。さらに、ベクター/宿主発現系が違えば、プロセシング反応を起こす程度も違ったものになり得る。 A host cell line is chosen that modulates the expression of the inserted sequences, or modifies and processes the gene product in the specific fashion desired. Expression from certain promoters can be increased in the presence of certain inducers; thus, the expression of the engineered one can be regulated. Furthermore, various host cells have characteristic and specific mechanisms for translation and post-translational processing and modification (eg, protein glycosylation, phosphorylation). Appropriate cell lines or host systems can be chosen to ensure the desired modification and processing of the foreign protein expressed. For example, expression in bacterial systems can be used to produce a core protein product that is free of sugar linkages. Expression in yeast produces a product with sugar chain bonds. Expression in mammalian cells can be used to ensure “native” glycosylation of the antigenic peptides or antigenic fusion proteins of the invention. Furthermore, different vector / host expression systems can have different levels of processing reactions.
組換えタンパク質を長期にわたり高収率で産生するには、安定な発現が好ましい。例えば、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を安定的に発現する細胞系が設計され得る。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりは、適切な発現制御要素(例、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等)と選択マーカーにより制御されるDNAで宿主細胞を形質転換することができる。異種DNAの導入後、設計された細胞を濃厚培地で1〜2日間増殖させ、次いで選択培地へ転換させる。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を与え、細胞がプラスミドを染色体へ安定的に組込み、フォーカスを形成するまで増殖することを可能にする。次いで、これをクローン化し、細胞系になるように増加し得る。この方法は、有利にも、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を発現する細胞系を設計するために使用し得る。そのように設計された細胞系は、IgE分子のその受容体への結合に影響を及ぼす抗IgE抗体又は他の作用因子(例、有機分子、無機分子、有機/無機複合体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模擬体、多糖類、サッカライド、糖タンパク質、核酸、DNA及びRNA鎖、及びオリゴヌクレオチド、等)のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。 Stable expression is preferred for producing recombinant proteins in high yield over a long period of time. For example, a cell line that stably expresses the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the present invention can be designed. Rather than using an expression vector containing a viral origin of replication, the host cells are treated with appropriate expression control elements (eg, promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and DNA controlled by a selectable marker. Can be transformed. After introduction of the heterologous DNA, the engineered cells are grown for 1-2 days in a concentrated medium and then converted to a selective medium. The selectable marker in the recombinant plasmid provides resistance to selection and allows the cell to stably integrate the plasmid into the chromosome and grow until it forms a focus. This can then be cloned and expanded to a cell line. This method can advantageously be used to design cell lines that express an antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention. Cell lines so designed are anti-IgE antibodies or other agents that affect the binding of IgE molecules to their receptors (eg, organic molecules, inorganic molecules, organic / inorganic complexes, polypeptides, peptides Peptidomimetics, polysaccharides, saccharides, glycoproteins, nucleic acids, DNA and RNA strands, and oligonucleotides, etc.) and can be particularly useful for screening and evaluation.
数多くの選択系を使用し得て、限定しないが、tk-、hgprt-、又はaprt-細胞においてそれぞれ利用される、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977, Cell 11: 223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48; 2026)、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980, Cell 22: 817)遺伝子が含まれる。また、メトトレキセートに対する抵抗性を与えるdhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O' Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072);マイコフェノール酸に対する抵抗性を与えるgpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072);アミノグリコシドG−418に対する抵抗性を与えるneo(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1);及びヒグロマイシンに対する抵抗性を与えるhygro(Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)遺伝子についての選択の基礎として、代謝拮抗薬への抵抗性を使用し得る。 Numerous selection systems may be used, including, but not limited to, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223) utilized in tk − , hgprt − , or aprt − cells, respectively. Contains the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48; 2026) and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) genes . Also, dhfr (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O 'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: which gives resistance to methotrexate 2072); gpt which gives resistance to mycophenolic acid (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo which gives resistance to aminoglycoside G-418 (Colberre-Garapin et al. 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); and resistance to antimetabolites as a basis for selection for the hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147) gene conferring resistance to hygromycin Can be used.
特定の態様では、本発明の抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる1つ又はそれ以上の核酸分子が、遺伝子治療により、IgE介在性アレルギー障害を治療するか又は予防するために投与される。もう1つの特定の態様では、抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる1つ又はそれ以上の核酸分子が、遺伝子治療により、IgE介在性アレルギー障害を治療するか又は予防するために投与される。さらにもう1つの特定の態様では、本発明の抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる1つ又はそれ以上の核酸分子、及び本発明の抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる1つ又はそれ以上の核酸分子が、遺伝子治療により、IgE介在性アレルギー障害を治療するか又は予防するために投与される。遺伝子治療とは、発現されるか又は発現され得る核酸を被検者へ投与することによって実施される治療を意味する。本発明のこの態様では、この核酸は、抗IgE抗体の産生のような免疫応答を誘発することにより治療効果に介在する、そのコードされた抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を産生する。 In certain embodiments, one or more nucleic acid molecules comprising a polynucleotide sequence encoding an antigenic peptide of the invention are administered by gene therapy to treat or prevent IgE-mediated allergic disorders. Is done. In another particular embodiment, one or more nucleic acid molecules comprising a polynucleotide sequence encoding an antigenic fusion protein are used to treat or prevent IgE-mediated allergic disorders by gene therapy. Be administered. In yet another specific embodiment, comprising one or more nucleic acid molecules comprising a polynucleotide sequence encoding an antigenic peptide of the invention, and a polynucleotide sequence encoding an antigenic fusion protein of the invention. One or more nucleic acid molecules consisting of are administered to treat or prevent IgE-mediated allergic disorders by gene therapy. Gene therapy refers to treatment performed by administering to a subject a nucleic acid that is or can be expressed. In this aspect of the invention, the nucleic acid produces its encoded antigenic peptide or antigenic fusion protein that mediates a therapeutic effect by inducing an immune response such as the production of anti-IgE antibodies.
当技術分野で利用し得る遺伝子治療のいずれの方法も本発明により使用し得る。典型的な方法を以下に説明する。
遺伝子治療の方法の概説については、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligun, 1993, Science 260: 926-932 及び Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215 を参照のこと。使用し得る組換えDNA技術の当技術分野で一般的に知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), 1983, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; 及び Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. に説明されている。
Any method of gene therapy available in the art can be used according to the present invention. A typical method is described below.
For an overview of gene therapy methods, see Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 : 573-596; Mulligun, 1993, Science 260: 926-932 and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215 about. Commonly known methods in the art of recombinant DNA technology that can be used are Ausubel et al. (Eds.), 1983, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler, 1990. , Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.
好ましい側面では、医薬組成物は本発明の抗原性ペプチドをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、好適な宿主において抗原性ペプチドを発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸配列は、抗原性ペプチドのコーディング領域に機能可能的に連結したプロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導され得るか又は構成的であり、所望により、組織特異的である。もう1つの好ましい側面では、医薬組成物は本発明の抗原性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、好適な宿主において抗原性融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸配列は、抗原性融合タンパク質のコーディング領域に機能可能的に連結したプロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導され得るか又は構成的であり、所望により、組織特異的である。もう1つの特定の態様では、本発明の抗原性ペプチドのコーディング配列と他の所望される配列に、ゲノム内の所望される部位での相同的組換えを促進する領域が隣接し、それによって抗原性ペプチドをコードする核酸の染色体内発現がもたらされる、核酸分子が使用される(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; 及び Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438)。もう1つの特定の態様では、本発明の抗原性融合タンパク質のコーディング配列と他の所望される配列に、ゲノム内の所望される部位での相同的組換えを促進する領域が隣接し、それによって抗原性融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現がもたらされる、核酸分子が使用される。 In a preferred aspect, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid sequence encoding an antigenic peptide of the invention, said nucleic acid sequence being part of an expression vector that expresses the antigenic peptide in a suitable host. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the coding region of the antigenic peptide, said promoter being inducible or constitutive and optionally tissue specific. In another preferred aspect, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid sequence encoding an antigenic fusion protein of the invention, said nucleic acid sequence being part of an expression vector that expresses the antigenic fusion protein in a suitable host. In particular, such nucleic acid sequences have a promoter operably linked to the coding region of the antigenic fusion protein, said promoter being inducible or constitutive and optionally tissue specific. . In another specific embodiment, the coding sequence of the antigenic peptide of the invention and other desired sequences are flanked by regions that promote homologous recombination at the desired site in the genome, thereby allowing antigen Nucleic acid molecules are used that result in the chromosomal expression of nucleic acids encoding sex peptides (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; and Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438). In another specific embodiment, the coding sequence of the antigenic fusion protein of the invention and other desired sequences are flanked by regions that promote homologous recombination at the desired site in the genome, thereby Nucleic acid molecules are used that provide for chromosomal expression of the nucleic acid encoding the antigenic fusion protein.
患者への核酸のデリバリーは、直接的(この場合、患者は核酸又は核酸を担うベクターに直接曝露される)であるか、又は間接的(この場合、先ずこの核酸を用いて細胞を in vitro で形質転換し、次いで患者へ移植する)であり得る。上記2種のアプローチは、それぞれ、in vivo 又は ex vivo の遺伝子治療として知られている。 Delivery of the nucleic acid to the patient can be direct (in this case, the patient is directly exposed to the nucleic acid or vector carrying the nucleic acid) or indirectly (in this case, the nucleic acid is first used to incubate the cells in vitro). Transformed and then transplanted into the patient). The above two approaches are known as in vivo or ex vivo gene therapy, respectively.
特定の態様では、核酸配列が直接 in vivo で投与され、そこで発現されてコード化される産物を産生する。このことは、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それが細胞内のものになるように投与すること、例えば欠陥又は弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスのベクターを使用して感染させること(米国特許第4,980,286号)、又は裸のDNAの直接注入、又は微粒子衝撃(例、遺伝子銃;Biolistic,デュポン)の使用、又は脂質や細胞表面受容体でのコーティング又は作用因子のトランスフェクション、リポソーム、微粒子又はマイクロカプセルにおける被包、又は核に入ることが知られているペプチドに連結して投与すること、受容体介在性エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与すること(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 を参照のこと)(受容体を特に発現する細胞型をターゲットにするために使用され得る)、等の当技術分野で知られている多数の方法のいずれかにより達成され得る。もう1つの態様では、核酸−リガンド複合体が形成され得るが、ここではリガンドがエンドソームを破壊する融合性の(fusogenic)ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避することができる。さらにもう1つの態様では、核酸は、特定の受容体をターゲットにすることによって、細胞特異的な取込み及び発現の in vivo ターゲットにされ得る(例えば、1992年4月16日付のPCT特許公開WO92/06180(Wu et al.);1992年12月23日付のWO92/22635(Wilson et al.);1992年11月26日付のWO92/20316(Findeis et al.);1993年7月22日付のWO93/14188(Clarke et al.);及び1993年10月14日付のWO93/20221(Young);を参照のこと)。他のやり方では、核酸は、相同的組換えにより、発現のために細胞内に導入され、宿主細胞DNAの内部に取り込まれ得る(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438)。 In certain embodiments, the nucleic acid sequence is administered directly in vivo, where it is expressed to produce the encoded product. This can be done, for example, by constructing it as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it so that it is intracellular, eg using a defective or attenuated retroviral or other viral vector. Infecting (US Pat. No. 4,980,286), direct injection of naked DNA, or use of microparticle bombardment (eg, gene gun; Biolistic, DuPont), or coating with lipids or cell surface receptors Or transfection with an agent, encapsulation in liposomes, microparticles or microcapsules, or linking to a peptide known to enter the nucleus, linking to a ligand undergoing receptor-mediated endocytosis Administration (see eg, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (cells that specifically express the receptor) The can be used to target) can be accomplished by any of numerous methods known in the art and the like. In another aspect, a nucleic acid-ligand complex can be formed, where the ligand comprises a fusogenic viral peptide that disrupts the endosome and the nucleic acid can avoid lysosomal degradation. In yet another aspect, nucleic acids can be targeted in vivo for cell-specific uptake and expression by targeting specific receptors (eg, PCT patent publication WO 92/1992 dated 16 April 1992). 06180 (Wu et al.); WO92 / 22635 dated 23 December 1992 (Wilson et al.); WO92 / 20316 dated November 26, 1992 (Findeis et al.); WO93 dated 22 July 1993 / 14188 (Clarke et al.); And WO 93/20221 (Young), Oct. 14, 1993;). In other ways, nucleic acids can be introduced into cells for expression by homologous recombination and incorporated into the host cell DNA (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
特定の態様では、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが使用される。例えば、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸を含有するレトロウイルスベクターが使用され得る(例えば、Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599 を参照のこと)。これらのレトロウイルスベクターでは、ウイルスゲノムのパッケージングと宿主細胞DNAへの組込みに必要ではないレトロウイルス配列が削除された。遺伝子治療に使用される抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸配列は1つ又はそれ以上のベクターへクローン化され、それによりこの遺伝子の患者へのデリバリーが促進される。レトロウイルスベクターについての詳細は、Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302 に見出し得るが、これは造血幹細胞を化学療法抵抗性にするためにこの幹細胞へmdr1遺伝子をデリバリーするためのレトロウイルスベクターの使用について説明する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の文献は以下のものである:Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 及び Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114。 In a particular embodiment, a viral vector containing a nucleic acid sequence encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein is used. For example, retroviral vectors containing nucleic acids encoding antigenic peptides or antigenic fusion proteins can be used (see, eg, Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). These retroviral vectors have deleted retroviral sequences that are not necessary for packaging of the viral genome and integration into host cell DNA. A nucleic acid sequence encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein used in gene therapy is cloned into one or more vectors, thereby facilitating delivery of this gene to the patient. Details on retroviral vectors can be found in Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302, which is a retro for delivering the mdr1 gene to stem cells to make them hematopoietic resistant. The use of viral vectors will be described. Other references describing the use of retroviral vectors in gene therapy are: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Kiem et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141 and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3: 110-114.
アデノウイルスは遺伝子治療に使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸上皮へデリバリーするのに特に魅力的な運搬体である。アデノウイルスは、天然では呼吸上皮に感染し、そこで軽微な疾患を引き起こす。アデノウイルスをベースとするデリバリー系の他のターゲットは肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスには、非***細胞に感染し得るという利点がある。Kozarsky and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 499-503 は、アデノウイルスをベースとする遺伝子治療の概説を提示する。Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10 は、アカゲザルの呼吸上皮へ遺伝子を移入するためのアデノウイルスの使用を示した。アデノウイルスの遺伝子治療における使用の他の例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234;PCT出願WO94/12649;及び Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783 に見出し得る。好ましい態様では、アデノウイルスベクターが使用される。アデノ関連ウイルス(AAV)も遺伝子治療における使用について提案されてきた(例えば、Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300;及び米国特許第5,436,146号を参照のこと)。 Adenoviruses are other viral vectors that can be used for gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive carriers for delivering genes to the respiratory epithelium. Adenoviruses naturally infect respiratory epithelia where they cause minor disease. Other targets for adenovirus-based delivery systems are the liver, central nervous system, endothelial cells and muscle. Adenoviruses have the advantage that they can infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3: 499-503 provides an overview of adenoviral-based gene therapy. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10 demonstrated the use of adenovirus to transfer genes to the respiratory epithelium of rhesus monkeys. Other examples of the use of adenovirus in gene therapy are Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234; PCT application WO 94/12649; and Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783. In a preferred embodiment, adenoviral vectors are used. Adeno-associated virus (AAV) has also been proposed for use in gene therapy (eg, Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300; and US Pat. No. 5,436). 146).
遺伝子治療に対するもう1つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム介在性トランスフェクション、又はウイルス感染のような方法により組織培養内の細胞へ核酸分子を導入することに関する。通常、この導入法には選択マーカーの細胞への導入が含まれる。この場合、細胞は、導入された遺伝子を取込み、発現している細胞を単離するための選択下に置かれる。次いで、そのような細胞が患者へデリバリーされる。 Another approach to gene therapy involves introducing nucleic acid molecules into cells in tissue culture by such methods as electroporation, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, or viral infection. This introduction usually involves the introduction of a selectable marker into the cells. In this case, the cells are placed under selection to isolate those cells that have taken up and are expressing the introduced gene. Such cells are then delivered to the patient.
この態様では、核酸分子を細胞へ導入した後に、生成した組換え細胞を in vivo で投与する。そのような導入は、当技術分野で知られている方法により実行され得るが、それには、限定しないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターを用いた感染、細胞融合、染色体介在性の遺伝子導入、マイクロセル介在性の遺伝子導入、スフェロプラスト融合、等が含まれる。異種核酸分子の細胞内への導入については、当技術分野で数多くの技術が知られていて(例えば、Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92 を参照のこと)、レシピエント細胞に必要な発達及び生理上の機能が妨げられない限りにおいて、本発明により使用され得る。この技術は、核酸が細胞により発現され得て、好ましくはその細胞子孫により遺伝され、発現され得るような、核酸の細胞への安定な導入を提供すべきである。 In this embodiment, the produced recombinant cells are administered in vivo after introduction of the nucleic acid molecule into the cells. Such introduction can be performed by methods known in the art including, but not limited to, using transfection, electroporation, microinjection, viral or bacteriophage vectors containing nucleic acid sequences. Infection, cell fusion, chromosome-mediated gene transfer, microcell-mediated gene transfer, spheroplast fusion, and the like. Numerous techniques are known in the art for introducing heterologous nucleic acid molecules into cells (eg, Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92), as long as the developmental and physiological functions required for the recipient cells are not disturbed. Can be used. This technique should provide stable introduction of the nucleic acid into the cell such that the nucleic acid can be expressed by the cell, preferably inherited and expressed by its cell progeny.
生成した組換え細胞は、当技術分野で知られている様々な方法により被検者へデリバリーし得る。組換え血液細胞(例、造血幹細胞又は前駆細胞)は、好ましくは静脈内で投与される。使用に想定される細胞の量は、所望される効果、被検者の状態等に依存し、当業者により決定され得る。 The generated recombinant cells can be delivered to a subject by various methods known in the art. Recombinant blood cells (eg, hematopoietic stem cells or progenitor cells) are preferably administered intravenously. The amount of cells envisioned for use depends on the desired effect, the condition of the subject, etc., and can be determined by one skilled in the art.
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞には、所望される、利用可能な細胞型が含まれ、限定しないが、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞;Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核芽球、顆粒球のような血液細胞;様々な幹又は前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓等から得られる造血幹細胞又は前駆細胞が含まれる。 Cells into which a nucleic acid can be introduced for gene therapy purposes include the desired and available cell types, including but not limited to epithelial cells, endothelial cells, keratinocytes, fibroblasts, muscle cells, Hepatocytes; blood cells such as T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, megakaryoblasts, granulocytes; various stem or progenitor cells, in particular bone marrow, umbilical cord blood , Hematopoietic stem cells or progenitor cells obtained from peripheral blood, fetal liver and the like.
好ましい態様では、遺伝子治療に使用される細胞は被検者に対して自己のものである。
組換え細胞が遺伝子治療において使用される態様では、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸配列が、細胞又はその子孫により発現され得るように細胞へ導入され、次いでこの組換え細胞が治療効果のためにin vivo で投与される。特定の態様では、幹又は前駆細胞が使用される。in vitro で単離されて維持され得る任意の幹及び/又は前駆細胞が本発明の態様により潜在的に使用され得る(例えば、1994年4月28日付のPCT特許公開WO94/08598;Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229 及び Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771を参照のこと)。
In a preferred embodiment, the cells used for gene therapy are autologous to the subject.
In embodiments where recombinant cells are used in gene therapy, a nucleic acid sequence encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention is introduced into the cell so that it can be expressed by the cell or its progeny, and then the recombinant Cells are administered in vivo for therapeutic effect. In certain embodiments, stem or progenitor cells are used. Any stem and / or progenitor cells that can be isolated and maintained in vitro can potentially be used in accordance with embodiments of the present invention (eg, PCT patent publication WO 94/08598 dated 28 April 1994; Stemple and Anderson 1992, Cell 71: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229 and Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771).
特定の態様では、遺伝子治療のために導入され得る核酸は、この核酸の発現が適切な転写インデューサーの有無を制御することによって調節されるように、コーディング領域に機能可能的に連結した誘導プロモーターを含む。 In certain embodiments, a nucleic acid that can be introduced for gene therapy is an inducible promoter operably linked to a coding region such that expression of the nucleic acid is regulated by controlling the presence or absence of an appropriate transcriptional inducer. including.
本発明はまた、本発明の抗原性ペプチド又は本発明の抗原性融合タンパク質を産生する方法に関し、前記方法は、本発明の細胞の培養物を好適な培地で増殖させること、及びこのタンパク質を培地から単離することを含む。例えば、本発明の方法には、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を産生する方法が含まれ、ここでは抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する好適な発現ベクターを含有する宿主細胞(即ち、原核又は真核細胞)が、コード化された抗原性ペプチド又はコード化された抗原性融合タンパク質の発現を可能にする条件の下で培養される。抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質は培養物、簡便にも培地から回収され、さらに精製され得る。精製された抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質は、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質に結合する抗IgE抗体を同定するために、当技術分野でよく知られている in vitro 免疫アッセイにおいて使用され得る。 The invention also relates to a method for producing an antigenic peptide of the invention or an antigenic fusion protein of the invention, said method comprising growing a culture of cells of the invention in a suitable medium and Isolating from. For example, the method of the present invention includes a method of producing the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the present invention, wherein a suitable expression vector comprising a polynucleotide encoding the antigenic peptide or antigenic fusion protein. Host cells containing (i.e. prokaryotic or eukaryotic cells) are cultured under conditions allowing the expression of the encoded antigenic peptide or encoded antigenic fusion protein. The antigenic peptide or antigenic fusion protein can be recovered from the culture, conveniently from the medium, and further purified. The purified antigenic peptide or antigenic fusion protein can be used in in vitro immunoassays well known in the art to identify anti-IgE antibodies that bind to the antigenic peptide or antigenic fusion protein. .
このタンパク質はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを1つ又はそれ以上の昆虫の発現ベクターにある好適な制御配列へ機能可能的に連結し、昆虫の発現系を利用することによって産生され得る。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系の材料及び方法は、例えばInvitrogen(サンディエゴ、カリフォルニア、米国)製のキット(MaxBat.RTMキット)で市販され、そのような方法は、参照により本明細書に組込まれている、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) に記載のように、当技術分野でよく知られている。本明細書で使用されるように、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る昆虫細胞は、「形質転換」されている。 This protein is also produced by operably linking the isolated polynucleotide of the present invention to a suitable control sequence in one or more insect expression vectors and utilizing an insect expression system. obtain. Materials and methods for baculovirus / insect cell expression systems are commercially available, for example, in kits (MaxBat. RTM kit) from Invitrogen (San Diego, California, USA), and such methods are incorporated herein by reference. Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), is well known in the art. As used herein, an insect cell that can express a polynucleotide of the invention has been “transformed”.
他のやり方では、本発明の抗原性ペプチド又は本発明の抗原性融合タンパク質はまた、精製を促進する形態で発現され得る。例えば、抗原性ペプチドは、マルトース結合タンパク質(MBP)グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)又はチオレドキシン(TRX)のような、精製を促進する異種タンパク質を含んでなる融合タンパク質として発現され得る。そのような融合タンパク質の発現及び精製のキットは、New England BioLab(ベヴァリー、Mass.)、ファルマシア(ピスカタウェイ、N.J.)及びInvitrogenからそれぞれ市販されている。このタンパク質はまた、エピトープのタグを付けた後に、そのようなエピトープへ向けられた特異抗体を使用して精製し得る。そのようなエピトープの1つ(「Flag」)がコダック(ニューへーヴン、Conn.)から市販されている。 In other ways, the antigenic peptide of the invention or the antigenic fusion protein of the invention can also be expressed in a form that facilitates purification. For example, the antigenic peptide can be expressed as a fusion protein comprising a heterologous protein that facilitates purification, such as maltose binding protein (MBP) glutathione-S-transferase (GST) or thioredoxin (TRX). Kits for expression and purification of such fusion proteins are commercially available from New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, NJ) and Invitrogen, respectively. The protein can also be purified using specific antibodies directed to such epitopes after tagging of the epitopes. One such epitope (“Flag”) is commercially available from Kodak (New Haven, Conn.).
本発明の抗原性ペプチド又は本発明の抗原性融合タンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物として、例えば、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞又は生殖細胞により特徴づけられる、トランスジェニックのウシ、ヤギ、ブタ、又はヒツジの乳の成分としても発現され得る。 The antigenic peptide of the invention or the antigenic fusion protein of the invention can also be characterized as a product of a transgenic animal, for example by somatic cells or germ cells containing a nucleotide sequence encoding the antigenic peptide or antigenic fusion protein. Or expressed as a component of transgenic bovine, goat, pig, or sheep milk.
本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を産生するには、当技術分野の当業者に知られた任意の方法を使用し得る。最も単純なレベルでは、市販のペプチド合成機を使用して、アミノ酸配列を合成し得る。これは、低ペプチドとより大きいポリペプチドのフラグメントを産生するときに特に有用である。本発明の単離された抗原性ペプチド及び抗原性融合タンパク質は、例えば、このネーティブポリペプチドに対する抗体を産生するのに有用である。 Any method known to those skilled in the art can be used to produce the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention. At the simplest level, amino acid sequences can be synthesized using commercially available peptide synthesizers. This is particularly useful when producing fragments of low and larger polypeptides. The isolated antigenic peptides and antigenic fusion proteins of the present invention are useful, for example, in producing antibodies against this native polypeptide.
当業者は、ペプチド及びタンパク質を単離するための既知の方法に従って、本発明の単離された抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の1つを容易に得ることができる。これには、限定しないが、免疫クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag (1984); Sambrook et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology を参照のこと。 One skilled in the art can readily obtain one of the isolated antigenic peptides or antigenic fusion proteins of the present invention according to known methods for isolating peptides and proteins. This includes, but is not limited to, immunochromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, and immunoaffinity chromatography. . See, for example, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag (1984); Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology.
本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質は、細胞性の物質又はこのタンパク質が由来する細胞又は組織の源からの他の混入タンパク質が実質的にないか、又は化学合成されたときは、化学前駆体か又は他の化学品が実質的にない場合に、「単離」又は「精製」されている。「細胞性の物質が実質的にない」という術語には、タンパク質が単離されるか又は組換え的に産生される細胞の細胞性成分からそれが分離されているタンパク質の調製物が含まれる。従って、細胞性の物質が実質的にないタンパク質には、約30%、20%、10%、又は5%(乾燥重量)未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質が組換え的に産生される場合、それはまた、好ましくは培地が実質的にない、即ち、培地がタンパク調製物の量の約20%、10%、又は5%未満である。本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質が化学合成により産生される場合、それはまた、好ましくは化学前駆体か又は他の化学品が実質的にない、即ち、それは、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の合成に関わる化学前駆体又は他の化学品から分離されている。従って、そのようなタンパク質の調製物は、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質以外の化学前駆体又は化合物の約30%、20%、10%、5%(乾燥重量)未満を有する。 The antigenic peptide or antigenic fusion protein of the present invention is substantially free of cellular material or other contaminating proteins from the source of the cell or tissue from which it is derived or chemically synthesized. “Isolated” or “purified” when it is substantially free of precursors or other chemicals. The term “substantially free of cellular material” includes a preparation of a protein in which the protein is isolated or separated from the cellular components of the cell in which it is produced recombinantly. Thus, proteins substantially free of cellular material include protein preparations with less than about 30%, 20%, 10%, or 5% (dry weight) contaminating protein. Where the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention is produced recombinantly, it is also preferably substantially free of medium, ie, the medium is about 20%, 10% of the amount of protein preparation, Or less than 5%. Where the antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention is produced by chemical synthesis, it is also preferably substantially free of chemical precursors or other chemicals, i.e., it is antigenic peptide or antigenic. Separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis of the fusion protein. Accordingly, such protein preparations have less than about 30%, 20%, 10%, 5% (dry weight) of chemical precursors or compounds other than antigenic peptides or antigenic fusion proteins.
本発明の組成物は、ヒトにおける使用に先立って、所望される治療又は予防の活性について、好ましくは in vitro で、次いで in vivo で試験される。例えば、特定の組成物の投与が望ましいかどうかを決定するために使用され得る in vitro アッセイには、患者の組織サンプルを培養して増殖させ、組成物へ曝露するか又は他の方法で投与し、そのような組成物の組織サンプルに対する効果を観察する in vitro 細胞培養アッセイが含まれる。 The compositions of the invention are preferably tested in vitro and then in vivo for the desired therapeutic or prophylactic activity prior to use in humans. For example, in vitro assays that can be used to determine whether administration of a particular composition is desirable include culturing and expanding patient tissue samples, exposing to the composition, or otherwise administering. In vitro cell culture assays to observe the effect of such compositions on tissue samples are included.
抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の発現は、免疫アッセイ、ゲル電気泳動後の視覚化、又は当業者に既知の方法によりアッセイされ得る。
様々な特定の態様では、患者の障害に関わる細胞型の代表的な細胞を用いて、組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を有するかどうかを決定するために、in vitro アッセイが実行され得る。本発明によれば、抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の機能活性が、ヒスタミンのような血管作用物質の放出を誘発せずに、IgEがマスト細胞又は好塩基球上のその受容体に結合することを in vitro で阻害する好IgE抗体を誘発するその能力により測定され得る。
Expression of the antigenic peptide or antigenic fusion protein can be assayed by immunoassay, visualization after gel electrophoresis, or methods known to those skilled in the art.
In various specific embodiments, an in vitro assay is used to determine whether a composition has a desired effect on such a cell type using cells representative of the cell type involved in the patient's disorder. Can be executed. According to the present invention, the functional activity of an antigenic peptide or antigenic fusion protein causes IgE to bind to its receptor on mast cells or basophils without inducing the release of a vasoactive agent such as histamine. This can be measured by its ability to elicit pro-IgE antibodies that inhibit this in vitro.
治療に使用される組成物は、ヒトにおける試験に先立って、好適な動物モデル系で試験され得るが、それにはブタ、ニワトリ、ウシ又はサルが含まれるが、これらに限定されるものではない。 The compositions used for treatment can be tested in a suitable animal model system prior to testing in humans, including but not limited to pigs, chickens, cows or monkeys.
本発明は、アナフィラキシーを引き起こさない抗IgE抗体の産生を誘発するのに有効な本発明の組成物の量を被検者へ投与することによる治療(及び予防)の方法を提供する。好ましい側面では、本発明の組成物は実質的に精製されている(例えば、その効果を制限するか又は望ましくない副作用を産生する物質が実質的にない)。被検者は、好ましくは動物であり、限定しないがウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物が含まれ、好ましくは哺乳動物、及び最も好ましくはヒトである。 The present invention provides a method of treatment (and prevention) by administering to a subject an amount of a composition of the invention effective to induce the production of anti-IgE antibodies that do not cause anaphylaxis. In preferred aspects, the compositions of the invention are substantially purified (eg, substantially free of substances that limit their effectiveness or produce undesirable side effects). The subject is preferably an animal, including but not limited to animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs, etc., preferably mammals, and most preferably humans.
本発明の組成物が核酸を含むときに利用され得る投与の製剤及び方法は上記に説明されているが、追加の適切な投与製剤及び経路は、本明細書の以下に説明されるものの中から選択され得る。 While administration formulations and methods that may be utilized when the compositions of the present invention include nucleic acids are described above, additional suitable administration formulations and routes are among those described hereinbelow. Can be selected.
様々なデリバリー系が知られていて、本発明の組成物を投与するために使用され得る。例えば、リポソーム、微粒子又はマイクロカプセルにおける被包、組成物を発現し得る組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 を参照のこと)、レトロウイルス又は他のウイルスの一部として核酸を構築すること、等である。導入の方法には、限定しないが、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が含まれる。組成物は、好便な経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜・皮膚性の内層(例えば、口内粘膜、直腸及び腸の粘膜、等)を介した吸収により投与され得て、他の生物学的活性因子とともに投与され得る。投与は全身性又は局所性であり得る。さらに、例えば吸入器又は噴霧器、及びエーロゾル化剤入り製剤の使用による、肺への投与も利用され得る。 Various delivery systems are known and can be used to administer the compositions of the present invention. For example, encapsulation in liposomes, microparticles or microcapsules, recombinant cells capable of expressing the composition, receptor-mediated endocytosis (eg, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). See), constructing nucleic acids as part of a retrovirus or other virus, and the like. Methods of introduction include, but are not limited to, intratumoral, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The composition can be administered by a convenient route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through the epithelium or mucosal dermal inner layer (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) It can be administered with other biologically active factors. Administration can be systemic or local. In addition, pulmonary administration may be utilized, eg, by use of an inhaler or nebulizer, and a formulation with an aerosolizing agent.
特定の態様では、治療が必要な範囲へ本発明の医薬組成物を局所的に投与することが所望され得るが、このことは、例えば、限定しないが、局所注入、局所塗布、注射、又はインプラントにより達成され得る。ここで、前記インプラントは、シアラスティック(sialastic)膜のような膜を含む、多孔性、無孔性、又はゼラチン状の素材、又は繊維である。1つの態様では、投与は、アレルギー反応の部位(又は以前の部位)での直接注射によりなし得る。 In certain embodiments, it may be desirable to administer the pharmaceutical composition of the present invention locally to the extent that treatment is necessary, including, but not limited to, local infusion, topical application, injection, or implant Can be achieved. Here, the implant is a porous, non-porous, or gelatinous material, or fiber, including a membrane such as a sialastic membrane. In one aspect, administration can be by direct injection at the site of allergic reaction (or previous site).
もう1つの態様では、本発明の組成物は、小胞、特にリポソームにおいてデリバリーされ得る(例えば、Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989) 及び Lopez-Berestein, 同上、pp. 317-327 を参照のこと;一般的には、同文献を参照のこと)。 In another embodiment, the compositions of the invention can be delivered in vesicles, particularly liposomes (eg, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., In Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and See Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989) and Lopez-Berestein, ibid., Pp. 317-327; See
さらにもう1つの態様では、本発明の組成物は、制御放出系においてデリバリーされ得る。1つの態様では、ポンプが使用され得る(例えば、Langer, 上記;Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; 及び Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574 を参照のこと)。もう1つの態様では、ポリマー素材が使用され得る(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 を参照のこと;また、Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351;及び Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105 を参照のこと)。さらにもう1つの態様では、制御放出系を治療ターゲットの近傍に配置し、全身用量のごく一部だけを必要とし得る(例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 同上、vol. 2, pp. 115-138 (1984) を参照のこと)。 In yet another aspect, the compositions of the invention can be delivered in a controlled release system. In one embodiment, a pump can be used (eg, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; and Saudek et al ., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). In another embodiment, polymeric materials can be used (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; see also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; and Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). In yet another embodiment, a controlled release system may be placed in the vicinity of the therapeutic target, requiring only a fraction of the systemic dose (see, eg, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, ibid., Vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
他の制御放出系については Langer (1990, Science 249: 1527-1533)の概説に論じられている。
本発明の組成物が本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質をコードする核酸である特定の態様では、この核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えばレトロウイルスベクターの使用により(米国特許第4,980,286号)、又は直接の注射により、又は微粒子衝撃(例、遺伝子銃;Biolistic,デュポン)の使用により、又は脂質か細胞表面受容体でコーティングし、作用因子をトランスフェクトすること、又は核に入ることが知られている(例えば、Joliot et al., 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868 を参照のこと)ホメオボックス様ペプチドへそれを連結して投与すること、等によって、それが細胞内になるようにそれを投与することによって、in vivo 投与され、そのコード化された抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の発現を促進することができる。他のやり方では、核酸は、細胞内に導入され、相同的組換えにより、発現用の宿主細胞DNAの内部に組込まれ得る。
Other controlled release systems are discussed in the review by Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
In certain embodiments where the composition of the invention is a nucleic acid encoding an antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention, the nucleic acid is constructed as part of a suitable nucleic acid expression vector, eg, a retroviral vector. (US Pat. No. 4,980,286) or by direct injection or by use of microparticle bombardment (eg, gene gun; Biolistic, DuPont) or coated with lipid or cell surface receptors To homeobox-like peptides known to transfect factors or enter the nucleus (see, eg, Joliot et al., 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868) Administered in vivo, such as by linking it, etc., by administering it so that it is intracellular, and the encoded antigenic peptide De or is capable of promoting the expression of the antigenic fusion protein. In other ways, the nucleic acid can be introduced into the cell and incorporated into the host cell DNA for expression by homologous recombination.
本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質の治療有効量、及び製剤的に許容される担体を含む。特定の態様では、「製剤的に許容される」という用語は、動物、より特定するとヒトにおける使用について、連邦政府か州政府の規制当局により承認されているか、又は米国薬局方又は他の公認薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がともに投与される希釈剤、賦形剤、又は運搬体(vehicle)を意味する。そのような医薬担体は、水及び油のような無菌の液体であり得て、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等のような、石油、動物、植物又は合成を起源とするものが含まれる。水は、医薬組成物が静脈内投与されるときに好ましい担体である。生理食塩液とデキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液では、液体の担体として利用され得る。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米粉、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、等が含まれる。組成物は、所望されるならば、微量の湿潤剤又は乳化剤、又はpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル剤、粉末、徐放性製剤、等の形態をとり得る。組成物は、トリグリセリドのような従来の結合剤及び担体を有する坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的な担体を含み得る。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin による "Remington's Pharmaceutical Sciences" に説明されている。そのような組成物は、治療有効量の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質を、好ましくは精製された形態で、その形態を患者へ適切に投与するのに適した量の担体とともに含有する。製剤はこの投与形式に適するべきである。 The present invention also provides a pharmaceutical composition. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of an antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the term “pharmaceutically acceptable” is approved by a federal or state regulatory authority for use in animals, and more particularly in humans, or is a United States Pharmacopeia or other recognized pharmacy. Means that it is published in The term “carrier” refers to a diluent, excipient, or vehicle with which the therapeutic is administered. Such pharmaceutical carriers can be sterile liquids, such as water and oils, and include those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. . Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions and dextrose and glycerol solutions can also be employed as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice flour, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dried skim milk, glycerol, propylene glycol , Water, ethanol, and the like. The composition can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents, if desired. These compositions can take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained release formulations and the like. The composition can be formulated as a suppository, with traditional binders and carriers such as triglycerides. Oral formulations may include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate and the like. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in “Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin. Such compositions contain a therapeutically effective amount of the antigenic peptide or antigenic fusion protein, preferably in purified form, with an appropriate amount of carrier to properly administer the form to the patient. The formulation should be suitable for this mode of administration.
好ましい態様では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として常法により製剤化される。典型的には、静脈内投与の組成物は等張の水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤と、注射部位での疼痛を和らげるために、リドカインのような局所麻酔剤を包含してよい。一般には、上記成分は個別にか、又は、有効成分の量を示すアンプルのような密封容器か小袋(sachette)において、例えば乾燥凍結粉末か無水濃縮物のような単位剤形のなかで一緒に混合して供給される。組成物が注入により投与される場合、それは無菌で医薬品グレードの水又は生理食塩水を含有する注入ボトルで調剤され得る。組成物が注射により投与される場合、上記成分を投与前に混合し得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが用意され得る。 In a preferred embodiment, the composition is formulated by conventional methods as a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration to humans. Typically, intravenous compositions are isotonic aqueous buffer solutions. If necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to ease pain at the site of the injection. In general, the ingredients are either individually or together in a sealed container such as an ampoule or sachette indicating the amount of active ingredient, for example in a unit dosage form such as a dry frozen powder or anhydrous concentrate. Supplied mixed. Where the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. Where the composition is administered by injection, an ampule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients can be mixed prior to administration.
本発明の抗原性ペプチド又は抗原性融合タンパク質は中性又は塩の形態として製剤化され得る。製剤的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、等から誘導されるようなフリーのアミノ基とともに形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等から誘導されるようなフリーのカルボキシル基とともに形成されるものが含まれる。 The antigenic peptide or antigenic fusion protein of the invention can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free amino groups such as those derived from hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, etc., and sodium, potassium, ammonium, calcium, hydroxylated Included are those formed with free carboxyl groups such as those derived from iron, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, and the like.
癌の治療に有効であり得る本発明の化合物の量は、既知の臨床技術により決定され得る。さらに、最適な投与量の範囲を決定することの助けとするために、in vitro アッセイを所望により利用し得る。さらに、製剤において利用されるべき正確な量は、投与経路と疾患又は障害の重症度に依存する。しかしながら、静脈内投与に適した投与量の範囲は、体重kgあたり約20〜約500ミリグラムの活性化合物である。鼻腔内投与に適した投与量の範囲は、体重1kgあたり約0.01pg〜約1mgである。有効用量は、in vitro 又は動物モデルの試験より導かれる用量応答曲線から外挿し得る。 The amount of a compound of the present invention that can be effective in the treatment of cancer can be determined by known clinical techniques. In addition, in vitro assays may be employed as desired to assist in determining optimal dosage ranges. Moreover, the exact amount to be utilized in the formulation depends on the route of administration and the severity of the disease or disorder. However, suitable dosage ranges for intravenous administration are from about 20 to about 500 milligrams of active compound per kg body weight. A suitable dosage range for intranasal administration is about 0.01 pg to about 1 mg per kg body weight. Effective doses may be extrapolated from dose-response curves derived from in vitro or animal model studies.
本発明はまた、本発明の医薬組成物の1種またはそれ以上の成分で満たされた1つ又はそれ以上の容器を含有する医薬パック又はキットを提供する。そのような容器には、所望により、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府当局により定められた形式の添付書が付けられるが、この添付書にはヒトへ投与するものの製造、使用又は販売に関する当局の承認が反映される。 The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit containing one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Such containers may optionally be accompanied by an attachment in the form prescribed by the government authorities that regulate the manufacture, use or sale of the pharmaceutical or biological product, which is intended for administration to humans. Reflects regulatory approvals for manufacturing, use or sales.
実施例1.ペプチドの選択とKLhへのコンジュゲーション
イヌIgEのCH3ドメイン、並びにCH3及びCH4ドメインの連結部をペプチドワクチン候補物質の選択の基礎とした。親水性、表面確率、柔軟性、抗原性インデックス、両親媒性ヘリックス、両親媒性シート、及び二次構造を含む、適切な抗原特性の決定についてのコンピュータプログラムを使用して、様々なネスティド、重複ペプチドを選択した。このペプチドを合成し、システイン指示カップリング法を使用して、Zymed Laboratories社(サンフランシスコ、CA)でKLhへコンジュゲートした。このKLhにコンジュゲートしたペプチドを使用して、Zymed Laboratories社(サウスサンフランシスコ)でウサギを免疫化した。ペプチドはまた、KLhへコンジュゲートさせずにN末端ビオチン残基を付けて、W.M.Keck Biotechnology Resource Center(ニューヘーヴン、CT)でも合成し、KLh−ペプチドコンジュゲートで免疫化された動物において誘発される抗ペプチド抗体を検出するELISAにおいて使用するための材料を用意した。本発明の好ましいペプチドには、配列番号:1〜配列番号:14のペプチドと他のIgE種由来のその相同配列が含まれる。
実施例2.ウサギ抗ペプチド抗体のIgE由来ペプチドとの反応性
ウサギ抗血清が本発明のペプチドと反応する能力を試験するために、以下のようにELISAアッセイを開発した:ビオチニル化IgEペプチドをコーティング緩衝液(重炭酸ナトリウム:pH9.0)1mlあたり5μgへ希釈した。希釈したペプチドを、ニュートラビジンプレート(Pierce Chemical Co.ロックフォード、IL)のウェルへ100μl/ウェルで加え、4℃で一晩インキュベートした。0.05% Tween−20含有リン酸緩衝化生理食塩水(PBST)で3回プレートを洗浄した。各ウェルへ200μl/ウェルで阻止緩衝液(2%スキムミルク/PBST)を加え、室温(RT)で60分間インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄した。適切なウサギ抗血清の100倍希釈液を、適切なウェルの最上列へ、各ウェルにつき100μl加え、血清サンプルを適切なプレート位置へ10倍希釈した。プレートをRTで60分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート−ヤギ抗ウサギIgG(KPL Laboratories,ゲイサースブルグ、MD)の20,000倍希釈液100μl/ウェルを各ウェルへ加え、このプレートをRTで60分インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄した。TMBマイクロウェル基質(KPL;ゲイサースブルグ、MD)100μl/ウェルを各ウェルへ加え、プレートをRTで10〜20分インキュベートし、発色させた。0.18M 硫酸50μl/ウェルでこの発色反応を止めた。全ウェルの吸光度(O.D.)を、ELISAプレートリーダー(Thermo Max;Molecular Devices,サニーヴェイル、CA)を使用して、450nmの波長で定量した。図1に示すように、本発明のペプチドで免疫化した後のウサギから得られる血清は、その指定ペプチドで免疫化する前のウサギから得られる血清より、各ペプチドに対してずっと高い反応性を有していた。
実施例3.ウサギ抗−ペプチド抗体のイヌIgEとの反応性
イヌのIgEモノクローナル抗体(Bethyl laboratories;モントゴメリー;TX)を、96穴プレートのウェルにおいて、100μl量あたり1μgで分配した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、各ウェルへ阻止緩衝液(2%スキムミルク/PBST)を加え、室温(RT)で60分間インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、適切なウサギ抗血清の200倍希釈液を、適切なウェルの最上列へ、各ウェルにつき100μl加えた。プレートをRTで60分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート−ヤギ抗ウサギIgG(KPL Laboratories)の10,000倍希釈液100μl/ウェルを各ウェルへ加えた。プレートをRTで60分インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、TMB基質100μl/ウェルを各ウェルへ加えた。発色反応を10〜20分発生させた。0.18M 硫酸50μl/ウェルを加えることによって、発色反応を止めた。全ウェルの吸光度(O.D.)を、上記のようにELISAプレートリーダーを使用して、450nmで定量した。図2に示すように、本発明のペプチドで免疫化した後のウサギから得られる血清は、その指定ペプチドで免疫化する前のウサギから得られる血清より、イヌIgEに対してずっと高い反応性を有していた。
Example 1. Selection of peptides and conjugation to KLh The CH3 domain of canine IgE and the junction of CH3 and CH4 domains were used as the basis for selection of peptide vaccine candidates. Various nested, overlapping, using computer programs for determining appropriate antigen properties, including hydrophilicity, surface probability, flexibility, antigenic index, amphiphilic helix, amphiphilic sheet, and secondary structure Peptides were selected. This peptide was synthesized and conjugated to KLh at Zymed Laboratories (San Francisco, Calif.) Using a cysteine directed coupling method. The KLh-conjugated peptide was used to immunize rabbits with Zymed Laboratories (South San Francisco). The peptide also has an N-terminal biotin residue without conjugation to KLh. M.M. Materials were also prepared for use in an ELISA to detect anti-peptide antibodies elicited in animals immunized with KLh-peptide conjugates, also synthesized at Keck Biotechnology Resource Center (New Haven, CT). Preferred peptides of the present invention include the peptide of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14 and its homologous sequences from other IgE species.
Example 2 To test the ability of rabbit anti-peptide antibodies to react with IgE-derived peptides, the rabbit antiserum reacts with the peptides of the present invention, an ELISA assay was developed as follows: biotinylated IgE peptide was coated with coating buffer (heavy Sodium carbonate: pH 9.0) diluted to 5 μg per ml. Diluted peptide was added to wells of neutravidin plates (Pierce Chemical Co. Rockford, IL) at 100 μl / well and incubated overnight at 4 ° C. Plates were washed 3 times with phosphate buffered saline (PBST) containing 0.05% Tween-20. Blocking buffer (2% skim milk / PBST) was added to each well at 200 μl / well and incubated for 60 minutes at room temperature (RT). The plate was washed 3 times with PBST. A 100-fold dilution of the appropriate rabbit antiserum was added to the top row of the appropriate wells, 100 μl per well, and the serum sample was diluted 10-fold into the appropriate plate location. Plates were incubated for 60 minutes at RT. The plate was washed 3 times with PBST. Horseradish peroxidase-conjugate-goat anti-rabbit IgG (KPL Laboratories, Gaithersburg, MD) 20,000-fold dilution was added to each well, and the plate was incubated at RT for 60 minutes. The plate was washed 3 times with PBST. 100 μl / well of TMB microwell substrate (KPL; Gaithersburg, MD) was added to each well and the plate was incubated for 10-20 minutes at RT to develop color. The color reaction was stopped with 50 μl / well of 0.18 M sulfuric acid. The absorbance (OD) of all wells was quantified using an ELISA plate reader (Thermo Max; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) at a wavelength of 450 nm. As shown in FIG. 1, serum obtained from rabbits after immunization with the peptides of the present invention is much more reactive against each peptide than serum obtained from rabbits prior to immunization with the designated peptide. Had.
Example 3 Reactivity of Rabbit Anti-Peptide Antibody with Canine IgE Dog IgE monoclonal antibody (Bethyl laboratories; Montgomery; TX) was dispensed at 1 μg per 100 μl volume in wells of a 96-well plate. Plates were incubated overnight at 4 ° C. Plates were washed 3 times with PBST, blocking buffer (2% skim milk / PBST) was added to each well and incubated for 60 minutes at room temperature (RT). The plate was washed 3 times with PBST and a 200-fold dilution of the appropriate rabbit antiserum was added to the top row of the appropriate wells, 100 μl per well. Plates were incubated for 60 minutes at RT. The plates were washed 3 times with PBST and a horseradish peroxidase-conjugate-goat anti-rabbit IgG (KPL Laboratories) 10,000-fold diluted 100 μl / well was added to each well. Plates were incubated for 60 minutes at RT. The plate was washed 3 times with PBST and 100 μl / well of TMB substrate was added to each well. A color reaction was allowed to occur for 10-20 minutes. The color reaction was stopped by adding 50 μl / well of 0.18 M sulfuric acid. The absorbance (OD) of all wells was quantified at 450 nm using an ELISA plate reader as described above. As shown in FIG. 2, serum obtained from rabbits after immunization with the peptides of the present invention is much more reactive to dog IgE than serum obtained from rabbits prior to immunization with the designated peptide. Had.
実施例4.in vitro 脱顆粒阻害アッセイ
IgEワクチンの開発は、血清又は他の体液中の可溶性(フリー)IgEに結合するが、受容体結合性IgEとは架橋結合せず、マスト細胞又は好塩基球からヒスタミンを放出させない抗体(即ち、非アナフィラキシー抗体)を誘発するIgEペプチドの同定に基づく。本発明のペプチドのような、ネスティド、又は重複したIgE由来ペプチドのセットに対して産生した抗体のアナフィラキシー発現可能性を評価するために、我々は、イヌIgEに対する高アフィニティー受容体でトランスフェクトしたラット好塩基球細胞系RBL−2H3に基づいて、in vitro のイヌ特異的脱顆粒アッセイを開発した。イヌIgEをRBL2H3細胞上のその受容体に結合させて、受容体に結合したIgEを抗イヌIgE抗体とともにインキュベートすると、この受容体は(抗IgE抗体が受容体結合性IgEと結合すれば)架橋結合する可能性があり、この受容体の架橋結合によりラット細胞からヒスタミンが放出される。ヒスタミン放出の量はIgE抗体のアナフィラキシー可能性の尺度になる。逆に、ヒスタミン放出の不足は、抗イヌIgE抗体が受容体結合性IgEとは架橋結合せず、これらの抗体を誘発したペプチドが、抗ペプチド抗体がフリーIgE(例えば、血清又は他の体液中のIgE)と反応するという条件で、ワクチンとしての使用に適していることを示す。このように、本発明のペプチドに対して産生される抗体を含め、抗IgE抗体がヒスタミン放出をもたらすことの潜在可能性は、このアッセイを使用すれば容易に判定し得る。
Example 4 In vitro degranulation inhibition assay The development of IgE vaccines binds to soluble (free) IgE in serum or other body fluids, but does not crosslink with receptor-bound IgE, and histamine from mast cells or basophils Based on the identification of IgE peptides that elicit antibodies that are not released (ie, non-anaphylactic antibodies). In order to assess the anaphylactic expression potential of antibodies raised against a set of nested or overlapping IgE-derived peptides, such as the peptides of the present invention, we transfected rats with a high affinity receptor for canine IgE. An in vitro canine specific degranulation assay was developed based on the basophil cell line RBL-2H3. When canine IgE is bound to its receptor on RBL2H3 cells and the receptor-bound IgE is incubated with an anti-canine IgE antibody, this receptor is cross-linked (if the anti-IgE antibody binds to receptor-bound IgE). There is a possibility of binding, and histamine is released from rat cells by cross-linking of this receptor. The amount of histamine release is a measure of the anaphylactic potential of IgE antibodies. Conversely, the lack of histamine release is due to the fact that anti-canine IgE antibodies do not cross-link with receptor-bound IgE, and the peptides that elicited these antibodies are free of anti-peptide antibodies (eg, in serum or other body fluids). It is suitable for use as a vaccine on the condition that it reacts with IgE). Thus, the potential for anti-IgE antibodies, including antibodies produced against the peptides of the present invention, to provide histamine release can be readily determined using this assay.
イヌIgEの高アフィニティー受容体をコードする遺伝子を、ATG laboratories社(イーデンプレーリー、MN)においてポリメラーゼ連鎖反応により組立て、pCDNA6発現ベクター(Invitrogen;CA)へクローン化した。Fugeneトランスフェクション試薬を製造業者(ベーリンガーマンハイム)の推奨法により使用して、イヌIgE受容体をコードする遺伝子を含有するpCDNA6プラスミドを用いてラットRBL2H3細胞系(ATCC,ロックビル、MD)をトランスフェクトした。イヌの高アフィニティー受容体を発現するRBL−2H3細胞系を選択し、ブラスチシジン10μg/mlを含有する培地に維持した。フローサイトメトリーや細胞ベースのELISAを含む様々なアッセイにより、トランスフェクトされたラット細胞に結合するイヌIgEの能力を確かめた。
実施例5.回虫の感作と免疫化
本発明のペプチドを用いたワクチン接種のIgE介在性反応に及ぼす効果を、回虫抽出物へ感作した後の動物で誘発されるIgE介在性の皮膚膨疹反応の試験において評価した。この試験デザインを表1にまとめ、以下の方法により試験を実施した:
1)前感作法:試験開始に先立って(第−7日)、各イヌの頚静脈から血液サンプル5mlを血清分離管(SST)へ採取した。血清を−20℃で保存した。Asc−1アレルゲン(Greer laboratories)の皮内(ID)注射により全部のイヌに対して皮膚試験を実施した。ID注射は、各イヌの腹部の剃毛サイドで実施した。各動物は、Asc−1アレルゲンの10倍系列希釈液(50μg〜0.5ng)を表す6種の注射、ヒスタミン0.1μgの注射(陽性対照)、及びリン酸緩衝化生理食塩水(PBS;陰性対照)の注射を受けた。各注射は100μlの用量である。皮膚の応答は膨疹反応の範囲のサイズに基づいた。膨疹範囲の輪郭を取り、最大の寸法(長軸)とそれに垂直な寸法(短軸)/ミリメートルを掛け合わせ、膨疹の範囲を算出する。皮膚の応答は、アレルゲンの皮内注射から15分の時点でメートル定規を使用して定量した。膨疹反応を視覚化しやすくするために、皮膚試験に先立つ約5分前に無菌の1.0%エバンスブルー溶液5mlで各イヌをI/V注射した。
A gene encoding a high affinity receptor for canine IgE was assembled by polymerase chain reaction at ATG laboratories (Eden Prairie, MN) and cloned into a pCDNA6 expression vector (Invitrogen; CA). Transfect the rat RBL2H3 cell line (ATCC, Rockville, MD) with the pCDNA6 plasmid containing the gene encoding the canine IgE receptor, using Fugene transfection reagent as recommended by the manufacturer (Boehringer Mannheim). did. RBL-2H3 cell line expressing canine high affinity receptor was selected and maintained in medium containing 10 μg / ml blasticidin. Various assays, including flow cytometry and cell-based ELISA, confirmed the ability of canine IgE to bind to transfected rat cells.
Example 5 FIG. Sensitivity and immunization of roundworms The effect of vaccination with the peptides of the present invention on IgE-mediated responses was examined in an IgE-mediated skin wheal response elicited in animals after sensitization to roundworm extracts evaluated. This test design is summarized in Table 1 and tested by the following method:
1) Presensitization method: Prior to the start of the test (day -7), a 5 ml blood sample was collected from each jugular vein of each dog into a serum separator tube (SST). Serum was stored at -20 ° C. Skin testing was performed on all dogs by intradermal (ID) injection of Asc-1 allergen (Greer laboratories). ID injections were performed on the shaved side of each dog's abdomen. Each animal consists of 6 injections representing a 10-fold serial dilution of Asc-1 allergen (50 μg to 0.5 ng), 0.1 μg histamine injection (positive control), and phosphate buffered saline (PBS; Negative control). Each injection is a 100 μl dose. The skin response was based on the size of the range of the wheal reaction. The outline of the wheal range is taken and the maximum dimension (major axis) is multiplied by the dimension (minor axis) / mm perpendicular to the maximum dimension to calculate the wheal range. Skin response was quantified using a metric ruler at 15 minutes after intradermal injection of allergen. To facilitate visualization of the wheal response, each dog was I / V injected with 5 ml of sterile 1.0% Evans blue solution approximately 5 minutes prior to the skin test.
2)感作スケジュール:Asc−1の10μgとレヒドロゲル(Rehidrogel)2mgの混合液(0.5ml量)を動物に注射し、この混合液は皮下(S/C)で注射した。同時に、リシン(Ricin)500ng(0.5ml量)を腹腔内で(I/P)動物に注射した。上記の注射処方を2週間に1回で、5回以上繰り返した。Asc−1とリシンは滅菌PBSに溶かした。 2) Sensitization schedule: A mixture of 10 μg of Asc-1 and 2 mg of Rehydrogel (0.5 ml amount) was injected into the animal, and this mixture was injected subcutaneously (S / C). Concurrently, 500 ng of Ricin (0.5 ml volume) was injected intraperitoneally into (I / P) animals. The above injection formulation was repeated once every two weeks, 5 times or more. Asc-1 and lysine were dissolved in sterile PBS.
3)感作後の皮膚試験:感作フェーズの後で、全部のイヌを皮膚反応について評価する。上記の前感作皮膚試験で概説したようにして、全部のイヌについて皮膚試験を実施した。 3) Skin test after sensitization: After the sensitization phase, all dogs are evaluated for skin reaction. Skin tests were performed on all dogs as outlined in the pre-sensitized skin test above.
4)ワクチン接種:F群の動物にはワクチン接種しなかった。A、B、C、D、及びE群の動物を表Xに記載のようにワクチン接種した。対応する抗原50μgを含有する適切なワクチン1mlを動物に筋肉内注射した。 4) Vaccination: Group F animals were not vaccinated. Animals in groups A, B, C, D, and E were vaccinated as described in Table X. Animals were injected intramuscularly with 1 ml of the appropriate vaccine containing 50 μg of the corresponding antigen.
5)ワクチン接種後の皮膚試験:最後のワクチン接種から14日後に、皮膚反応についてイヌを評価した。前感作法に概説したようにして、全部のイヌについて皮膚試験を実施する。
実施例6.イヌの抗ペプチド抗体
本発明の特異抗原でワクチン接種したイヌにおける抗体の誘発を以下のようにELISAアッセイで評価する:コーティング緩衝液(重炭酸ナトリウム:pH9.0)1mlあたり5μgへペプチドを希釈し、ニュートラビジンプレート(Pierce)へ100μl/ウェルで加えた。プレートを4℃で一晩インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、各ウェルへ阻止緩衝液(2%スキムミルク/PBST)200μlを加えた。プレートをRTで60分間インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、適切なイヌ抗血清の100倍希釈液を、適切なウェルの最上列へ、各ウェルにつき100μl加えた。次いで血清サンプルを適切なプレート位置へ10倍希釈した。プレートをRTで60分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート−ヤギ抗イヌIgGの20,000倍希釈液100μl/ウェルを各ウェルへ加えた。プレートをRTで60分インキュベートした。PBSTで3回プレートを洗浄し、TMB基質100μl/ウェルを全ウェルへ加えた。発色反応をRTで10〜20分発生させた。0.18M 硫酸50μl/ウェルを加えることによって、発色反応を止め、上記のようにELISAリーダーにおいて、450nmで吸光度を定量した。表2に示すように、本発明のペプチドで免疫化した後のイヌから得られる血清は、その指定ペプチドで免疫化する前のイヌから得られる血清より、イヌIgEに対してずっと高い反応性を有していた。
実施例7.皮膚の膨疹反応性
皮膚膨疹反応の減少又は完全な消失があったワクチン接種動物の数を、ワクチン接種に先立つ同じ動物の皮膚膨疹反応に対して比較することによって、本発明のペプチドのIgE介在性皮膚膨疹反応を改善する効果を判定した。回虫抽出物を皮内注射した後のイヌの皮膚膨疹反応性は、回虫抽出物の10倍系列希釈液(50μg〜0.5ng)、並びにPBS及びヒスタミン(1μg/部位)100μlの注射により定量する。膨疹反応のサイズは、メートル定規を使用してミリメートルで測定される、膨疹の長軸及び短軸の積として定量される。表3から見られるように、CH3/CH4ドメインから誘導されるペプチド(配列番号:1〜配列番号:4)で動物をワクチン接種すると、約60%の動物で皮膚膨疹反応が完全に抑制される。
5) Skin test after vaccination: Dogs were evaluated for skin reaction 14 days after the last vaccination. Skin testing is performed on all dogs as outlined in Presensitization.
Example 6 Anti-peptide antibodies in dogs Induction of antibodies in dogs vaccinated with a specific antigen of the present invention is assessed by ELISA assay as follows: Dilute peptides to 5 μg per ml of coating buffer (sodium bicarbonate: pH 9.0) , And added to a neutravidin plate (Pierce) at 100 μl / well. Plates were incubated overnight at 4 ° C. The plate was washed 3 times with PBST and 200 μl of blocking buffer (2% skim milk / PBST) was added to each well. Plates were incubated for 60 minutes at RT. Plates were washed 3 times with PBST and 100 μl of the appropriate canine antiserum diluted 100-fold for each well was added to the top row of appropriate wells. Serum samples were then diluted 10-fold to the appropriate plate location. Plates were incubated for 60 minutes at RT. The plate was washed 3 times with PBST and 100 μl / well of a 20,000-fold dilution of horseradish peroxidase-conjugate-goat anti-dog IgG was added to each well. Plates were incubated for 60 minutes at RT. The plate was washed 3 times with PBST and 100 μl / well of TMB substrate was added to all wells. A color reaction was allowed to occur for 10-20 minutes at RT. The color reaction was stopped by adding 50 μl / well of 0.18 M sulfuric acid and the absorbance was quantified at 450 nm in an ELISA reader as described above. As shown in Table 2, sera obtained from dogs after immunization with the peptides of the invention are much more reactive to dog IgE than sera obtained from dogs prior to immunization with the designated peptide. Had.
Example 7 By comparing the number of vaccinated animals that had a reduced or complete disappearance of the skin wheal reaction to the skin wheal response of the same animal prior to vaccination, IgE-mediated The effect of improving the skin wheal response was determined. Canine skin rash reactivity after intradermal injection of roundworm extract is quantified by injection of 10-fold serial dilutions of roundworm extract (50 μg to 0.5 ng) and 100 μl of PBS and histamine (1 μg / site). . The size of the wheal response is quantified as the product of the long and short axes of the wheal, measured in millimeters using a metric ruler. As can be seen from Table 3, vaccination of animals with peptides derived from the CH3 / CH4 domain (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4) completely suppresses skin wheal response in approximately 60% of animals. .
食物アレルギーモデルを開発して、本発明の抗IgEワクチンの効果を評価するために、以下のように、50頭のイヌを回虫抽出物及びリシンの注射後に回虫の抗原へ感作し、次いで回虫抽出物で経口チャレンジした。
1.前感作法:Asc−1アレルゲン(Greer laboratories)の皮内(ID)注射により全部のイヌに対して皮膚試験を実施した。ID注射は、各イヌの腹部の剃毛サイドで実施した。各動物は、Asc−1アレルゲンの10倍系列希釈液(50μg〜0.5ng)を表す6種の注射、ヒスタミン0.1μgの注射(陽性対照)、及びリン酸緩衝化生理食塩水(PBS;陰性対照)の注射を受けた。各注射は100μlの用量である。皮膚の応答は膨疹反応の範囲のサイズに基づいた。膨疹範囲の輪郭を取り、最大の寸法(長軸)とそれに垂直な寸法(短軸)/ミリメートルを掛け合わせ、膨疹の範囲を算出する。皮膚の応答は、アレルゲンの皮内注射から15分の時点でメートル定規を使用して定量した。膨疹反応を視覚化しやすくするために、皮膚試験に先立つ約5分前に無菌の1.0%エバンスブルー溶液5mlを各イヌにI/V注射した。 1. Presensitization method: Skin tests were performed on all dogs by intradermal (ID) injection of Asc-1 allergens (Greer laboratories). ID injections were performed on the shaved side of each dog's abdomen. Each animal consists of 6 injections representing a 10-fold serial dilution of Asc-1 allergen (50 μg to 0.5 ng), 0.1 μg histamine injection (positive control), and phosphate buffered saline (PBS; Negative control). Each injection is a 100 μl dose. The skin response was based on the size of the range of the wheal reaction. The outline of the wheal range is taken and the maximum dimension (major axis) is multiplied by the dimension (minor axis) / mm perpendicular to the maximum dimension to calculate the wheal range. Skin response was quantified using a metric ruler at 15 minutes after intradermal injection of allergen. To facilitate visualization of the wheal reaction, each dog was injected I / V with 5 ml of sterile 1.0% Evans blue solution approximately 5 minutes prior to the skin test.
2.感作スケジュール:Asc−1の10μgとレヒドロゲル(Rehidrogel)2mgの混合液(0.5ml量)を動物に注射し、この混合液は皮下(S/C)で注射した。同時に、リシン(Ricin)500ng(0.5ml量)を腹腔内で(I/P)動物に注射した。上記の注射処方を2週間に1回で、4回以上繰り返した。Asc−1とリシンは滅菌PBSに溶かした。 2. Sensitization schedule: Animals were injected with a mixture of 10 μg Asc-1 and 2 mg of Rehydrogel (0.5 ml volume), which was injected subcutaneously (S / C). Concurrently, 500 ng of Ricin (0.5 ml volume) was injected intraperitoneally into (I / P) animals. The above injection prescription was repeated 4 times or more once every two weeks. Asc-1 and lysine were dissolved in sterile PBS.
3.感作後の皮膚試験:感作フェーズの後で、全部のイヌを皮膚反応について評価した。上記の前感作皮膚試験で概説したようにして、全部のイヌについて皮膚試験を実施した。 3. Skin test after sensitization: After the sensitization phase, all dogs were evaluated for skin reaction. Skin tests were performed on all dogs as outlined in the pre-sensitized skin test above.
4.経口チャレンジ:最後の皮膚試験から14日後に、蒸留水1mlに溶かした回虫抽出物2mgを経口経路によりイヌに与えた。嘔吐や下痢を含む、食物アレルギーの徴候についてイヌを観察した。経口チャレンジの結果は、感作されたイヌの約50%が経口チャレンジごとにアレルギーの臨床徴候で応答することを示す。
実施例9.ノミアレルギーモデル
イヌにおけるノミアレルギー皮膚炎の発症を促進するリシンの能力を評価するために、リシンの有無でノミアレルゲンにイヌを感作させる感作プロトコールを以下のように実施する:
1.ノミを寄生させない対照としてイヌ5頭を使用する。
4). Oral challenge: 14 days after the last skin test, dogs were given 2 mg of roundworm extract dissolved in 1 ml of distilled water by the oral route. Dogs were observed for signs of food allergy, including vomiting and diarrhea. The results of oral challenge indicate that about 50% of sensitized dogs respond with clinical signs of allergy with each oral challenge.
Example 9 To evaluate the ability of ricin to promote the development of flea allergic dermatitis in flea allergy model dogs, a sensitization protocol for sensitizing dogs to flea allergens with or without lysine is performed as follows:
1. Five dogs are used as controls that do not infest fleas.
2.イヌ5頭を、0日目にノミ16匹、次いで12週間(最終の寄生:84日目)、1日おきに16〜17匹以上のノミに各イヌを寄生させることによって、連続的にノミに曝露させる。全部で709匹のノミに曝す。
2. Fleas were continuously infested by infesting 5 dogs with 16 fleas on
3.イヌ15頭を、0日目にノミ109匹、次いで12週間、隔週で100匹のノミに各イヌを寄生させることによって、間欠的にノミに曝露させる(全部で709匹)。48時間の寄生/曝露期の後で、ノミを除去する。このことにより、再寄生の間ごとに12日間の非曝露期間が考慮される。ニテンピラム(Capstar;ノバルティスアニマルヘルス;11.4kg以下のイヌには11.4mg錠を投与し、11.4kg以上のイヌには57mg錠を投与する)の経口投与によりイヌからノミを除去する。試験により、この製品は、イヌについたノミを4時間以内に100%死滅させ、2.8時間のT1/2(半減期)で急速にイヌから消失することが確かめられた。
3. Fifteen dogs are exposed to fleas intermittently by infesting each dog with 109 fleas on
4.イヌ15頭を、0日目にノミ109匹、次いで12週間、隔週で100匹のノミに各イヌを寄生させることによって、間欠的にノミに曝露させる(全部で709匹)。48時間の寄生/曝露期の後で、ノミを除去する。このことにより、再寄生の間ごとに12日間の非曝露期間が考慮される。上記のように、ニテンピラムの経口投与によりイヌからノミを除去する。ノミに曝露するだけでなく、0日目に全部のイヌにリシン(1mg/mlのストック溶液から500ngを0.5mlの滅菌生理食塩水に溶かす)を腹膜内に注射する。前感作レベル(ノミ曝露前)から(14日目に)血清IgEの力価が有意に上昇しないイヌには、28日目にリシンの第二回目注射を与える。イヌにおいて抗−ノミIgEを誘発させるには、必要に応じてリシン注射を繰り返してよい。
本明細書に引用した参項文献はすべてそのまま参照により本明細書に組込まれている。
4). Fifteen dogs are exposed to fleas intermittently by infesting each dog with 109 fleas on
All references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
本発明は、本発明の個別の側面を端的に示すものとして意図されている特定の態様によって、その特許請求の範囲において制限されないし、機能的に同等な方法及び成分は本発明の特許請求の範囲内にある。実際、本発明の様々な変更は、本明細書に示されて説明されているものだけでなく、上述の説明と付帯の図面から、当業者には明らかであろう。そのような変更も本発明の特許請求の範囲内にあるとみなされる。 The invention is not limited in the claims by the specific embodiments, which are intended to be indicative of the individual aspects of the invention, and functionally equivalent methods and components are not claimed in the claims. Is in range. Indeed, various modifications of the invention will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings, as well as those shown and described herein. Such modifications are considered to be within the scope of the claims of the present invention.
Claims (23)
少なくとも1つの抗原性ペプチドが配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記医薬組成物。 An anti-IgE immune response that does not cause anaphylaxis, comprising one or more antigenic peptides having an amino acid sequence comprising the CH3 domain of an IgE molecule or an amino acid residue of a fragment thereof at least 5 amino acid residues long A pharmaceutical composition for inducing,
At least one antigenic peptide is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13. The pharmaceutical composition having the amino acid sequence of 13, or SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つの抗原性融合タンパク質が配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記医薬組成物。 Does not cause anaphylaxis comprising one or more antigenic fusion proteins and heterologous carrier proteins having an amino acid sequence comprising the CH3 domain of an IgE molecule or an amino acid residue of its fragment at least 5 amino acid residues long A pharmaceutical composition for inducing an anti-IgE immune response, comprising:
At least one antigenic fusion protein is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO. The pharmaceutical composition having the amino acid sequence of: 13 or SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つのポリヌクレオチドが配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する抗原性ペプチドをコードする、前記医薬組成物。 Does not cause anaphylaxis, comprising one or more polynucleotides encoding an antigenic peptide having an amino acid sequence comprising the CH3 domain of an IgE molecule or an amino acid residue of a fragment thereof at least 5 amino acid residues long A pharmaceutical composition for inducing an anti-IgE immune response, comprising:
At least one polynucleotide is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13. Or the above pharmaceutical composition, which encodes an antigenic peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つのポリヌクレオチドが配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する抗原性融合タンパク質をコードする、前記医薬組成物。 One or more polynucleotides encoding an antigenic fusion protein having an amino acid sequence comprising the amino acid residues of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof at least 5 amino acid residues long and comprising a heterologous carrier protein A pharmaceutical composition for inducing an anti-IgE immune response that does not cause anaphylaxis,
At least one polynucleotide is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13. Or the said pharmaceutical composition which codes the antigenic fusion protein which has an amino acid sequence of sequence number: 14.
少なくとも1つの抗原性ペプチドが配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記方法。 A method for treating or preventing an IgE-mediated allergic disorder, comprising an amino acid residue of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof to a non-human animal where such treatment or prevention is desired Administering an immunogenically effective amount of one or more antigenic peptides having an amino acid sequence;
At least one antigenic peptide is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or the method having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つの抗原性融合タンパク質が配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記方法。 A method for treating or preventing an IgE-mediated allergic disorder, wherein the amino acid sequence comprises the amino acid residue of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof to a non-human animal for which such treatment or prevention is desired Administering an immunogenically effective amount of one or more antigenic fusion proteins having and a heterologous carrier protein,
At least one antigenic fusion protein is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO. The method of claim 13 having the amino acid sequence of: 13 or SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つの抗原性ペプチドが配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記方法。 A method for treating or preventing an IgE-mediated allergic disorder, comprising an amino acid residue of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof to a non-human animal where such treatment or prevention is desired Administering an immunogenically effective amount of one or more polynucleotides encoding one or more antigenic peptides having an amino acid sequence;
At least one antigenic peptide is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, or the method having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
少なくとも1つの抗原性融合タンパク質が配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、又は配列番号:14のアミノ酸配列を有する、前記方法。 A method for treating or preventing an IgE-mediated allergic disorder, comprising an amino acid residue of the CH3 domain of an IgE molecule or a fragment thereof to a non-human animal where such treatment or prevention is desired Administering an immunogenically effective amount of one or more polynucleotides encoding one or more antigenic fusion proteins having an amino acid sequence and a heterologous carrier protein;
At least one antigenic fusion protein is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO. The method of claim 13 having the amino acid sequence of: 13 or SEQ ID NO: 14.
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