JP2005095014A - Macrolide antibiotic-binding peptide and gene encoding the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a peptide binding to a macrolide antibiotic. <P>SOLUTION: The peptide is composed of an amino acid sequence binding to the macrolide antibiotic or the peptide or a protein comprises a sequence having the homology to the amino acid sequence. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドとこれをコードする遺伝子に関する。   The present invention relates to a peptide that binds to a macrolide antibiotic and a gene that encodes the peptide.

クラリスロマイシン（ＣＡＭ：６−Ｏ−メチルエリスロマイシンの同義語、（非特許文献１参照））は、アボット社（Abbott）の市販薬として１９９０年に送り出されたマクロライド系抗生物質の１つであり、ヒトの細菌感染を防御するために今日まで世界的に使用されてきた。エリスロマイシン（ＥＭ）およびその構造的同族体によって代表されるマクロライド系抗生物質は、特に細菌の５０Ｓリボソームサブユニットに結合し、タンパク質合成を抑制する（非特許文献２参照）。ＣＡＭはまた、胃のヘリコバクター＝ピロリ菌（Helicobacter pylori）を死滅させるために一般的に用いられる（前記菌は胃潰瘍および胃癌の両方の原因菌であると強く疑われている（非特許文献３参照））。ＣＡＭ、ＥＭおよびアジスロマイシン（ＡＭ）（非特許文献４参照）を含むマクロライド系抗生物質の新規な医薬的用途を開発するために例えば以下のような多くの研究が報告されている。
ヒト白血球のＩＬ８分泌の増加（非特許文献５〜７参照）；ヒト肺癌細胞におけるヘパラナーゼｍＲＮＡの増殖因子誘発発現のin vitro調節（非特許文献８参照）；血管形成および腫瘍増殖のin vivo抑制（非特許文献９参照）などである。ヒト細胞または癌さえもマクロライド系抗生物質に反応するという非常に多くの証拠が存在する（非特許文献１０参照）。
しかし、ヒトのタンパク質と結合するマクロライド系抗生物質の存在は明瞭ではない。 Clarithromycin (CAM: synonymous with 6-O-methylerythromycin (see Non-Patent Document 1)) is one of the macrolide antibiotics released in 1990 as a marketed medicine of Abbott. Yes, it has been used worldwide to date to protect against human bacterial infections. Macrolide antibiotics represented by erythromycin (EM) and its structural homologues specifically bind to the bacterial 50S ribosomal subunit and inhibit protein synthesis (see Non-Patent Document 2). CAM is also commonly used to kill gastric Helicobacter pylori (which is strongly suspected to be the cause of both gastric ulcers and gastric cancer (see Non-Patent Document 3). )). Many studies have been reported to develop new pharmaceutical uses of macrolide antibiotics including CAM, EM and azithromycin (AM) (see Non-Patent Document 4).
Increase in IL8 secretion of human leukocytes (see Non-Patent Documents 5 to 7); In vitro regulation of growth factor-induced expression of heparanase mRNA in human lung cancer cells (see Non-Patent Document 8); In vivo suppression of angiogenesis and tumor growth (see Non-Patent Document 9). There is a great deal of evidence that human cells or even cancer respond to macrolide antibiotics (see Non-Patent Document 10).
However, the existence of macrolide antibiotics that bind to human proteins is not clear.

現在のところ、タンパク質と小分子との相互作用を特定することは非常に重要なことである。それは哺乳類の生化学的プロセスの解明に役立ち、さらに、おそらく新規な医薬および農薬の標的の立証を容易にするであろう。また、検査薬としてタンパク質又はペプチドを用い、これと結合する物質を調査することにより、薬効の有無、新たな効能、用途を持つ医薬の開発に役立つことが期待される。   At present, it is very important to identify the interactions between proteins and small molecules. It will help elucidate the biochemical processes in mammals, and will likely facilitate the identification of new pharmaceutical and pesticide targets. In addition, using a protein or peptide as a test agent and investigating a substance that binds to the protein or peptide is expected to be useful for the development of a drug having a medicinal effect, a new effect, and a use.

タンパク質と結合する小分子を同定するためのもっとも新しい方法の１つは、スミス（Smith）が報告したいわゆる“ファージディスプレー”である。これにより、Ｍ１３バクテリオファージが提示するペプチドで構成されるランダムライブラリーの親和性選別を実施して、パクリタキセル（タキソール（Taxol））結合抗アポトーシスヒトタンパク質Ｂｃｌ−２が特定された。前記はチューブリンの配列と顕著な配列相同性をもたない。別の興味深い例によって、アントラサイクリン系抗生物質のドキソルビシン（アドリアマイシンの同義語）（固形腫瘍に広く用いられている抗癌剤の１つ）は核のリンタンパク質ｈＮｏｐｐｌ４０（ヒト肝ｃＤＮＡを発現しているＴ７ファージライブラリーから選別された）と結合することが示された。
しかしながら、マクロライド系抗生物質、特にクラリスロマイシンに結合するペプチドについては、研究されておらず、知られていなかった。
モリモトら（Morimoto,S.; Takahashi,Y.、Watanabe,Y.,Omura,S.(1984).J.Antibiotic.37,187.） シュンゼンら（Schunzen,F., Zarivach,R., Harms,J., Bachan,A., Tocilj,A., Albrecht,R., Yonath,A., Francescbi,F.(2001).Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase centre in eubacteria. Nature,413,814-821,and references therein.） プリスマスタディー（ Helicobacter pylori and gastric cancer:current status of the Austrain Czech German gastric cancer prevention trial (PRISMA Study).） ミエルケら（ Miehlke S., Kirsch C., Dragosics B., Gschwantler M., Oberhuber G,. Antos D., Dite P., Lauter J., Labenz J., Leodolter A., Malfertheiner P., Neubauer A., Ehninger G., Stolte M., Bayerdorffer E. (2001). World J. Gastroenterol,7,243-247.） 5. Jacks S. S., Giguere S., Nguyen A. (2003). In vitro susceptibilities of Rhodococcus equi and other common equine pathogens to azithromycin, clarithromycin, and 20 other antimicrobials. Antimicrob Agents Chemother.47, 1742-1745. クルドウスカら（ Kurdowska, A., Noble, J. M., Griffith D.E.(2001). The effect of azithromycin and clarithromycin on ex vivo interleukin-8 (IL-8) release from whole blood and IL-8 production by human alveolar macrophages. J. Antimicrob. Chemother.47,867-870.） キクチら（ Kikuchi T., Hagiwara K., Honda Y., Gomi K., Kobayashi T., Takahashi H., Tokue Y., Watanabe A., Nukiwa T. (2002). Clarithromycin suppresses lipopolysaccharide-induced interleukin-8 production by human monocytes through AP- 1 and NF-kappa B transcription factors. J. Antimicrob. Chemother.49,745-755.） サカキら（ Sasaki M., Ito T., Kashima M., Fukui S., Izumiyama N., Watanabe A., Sano M., Fujiwara Y, Miura M. (2001). Erythromycin and clarithromycin modulation of growth factor-induced expression of heparanase mRNA on human lung cancer cells in vitro. Mediators Inflamm.10,259-267.） ヤツナミら（Yatsunami J., Hayashi S. (2001). Fourteen-membered ring macrolides as anti-angiogenic compounds. Anticancer Res.21,4253-4258. モリスら（Morris T. C., Ranaghan L., Morrison, J. (2001). Phase II trial of claritnromycin and pamidronate therapy in myeloma. Med. Oncol.,18,79-84.） One of the newest methods for identifying small molecules that bind to proteins is the so-called “phage display” reported by Smith. Thereby, affinity selection of a random library composed of peptides presented by M13 bacteriophage was performed, and paclitaxel (Taxol) binding anti-apoptotic human protein Bcl-2 was identified. It has no significant sequence homology with the tubulin sequence. According to another interesting example, the anthracycline antibiotic doxorubicin (a synonym for adriamycin) (an anticancer drug widely used in solid tumors) is the nuclear phosphoprotein hNopppl40 (T7 phage expressing human liver cDNA) Selected from the library).
However, macrolide antibiotics, particularly peptides that bind to clarithromycin have not been studied and are not known.
Morimoto, S .; Takahashi, Y., Watanabe, Y., Omura, S. (1984). J. Antibiotic. 37, 187. Schunzen et al. (Schunzen, F., Zarivach, R., Harms, J., Bachan, A., Tocilj, A., Albrecht, R., Yonath, A., Francescbi, F. (2001). Structural basis for the interaction of antibiotics with the peptidyl transferase center in eubacteria. Nature, 413,814-821, and references inside.) Prismasterdy (Helicobacter pylori and gastric cancer: current status of the Austrain Czech German gastric cancer prevention trial (PRISMA Study).) Miehlke S., Kirsch C., Dragosics B., Gschwantler M., Oberhuber G ,. Antos D., Dite P., Lauter J., Labenz J., Leodolter A., Malfertheiner P., Neubauer A. , Ehninger G., Stolte M., Bayerdorffer E. (2001). World J. Gastroenterol, 7, 243-247.) 5. Jacks SS, Giguere S., Nguyen A. (2003). In vitro susceptibilities of Rhodococcus equi and other common equine pathogens to azithromycin, clarithromycin, and 20 other antimicrobials. Antimicrob Agents Chemother. 47, 1742-1745. Kurdowska et al. (Kurdowska, A., Noble, JM, Griffith DE (2001). The effect of azithromycin and clarithromycin on ex vivo interleukin-8 (IL-8) release from whole blood and IL-8 production by human alveolar macrophages. J Antimicrob. Chemother. 47,867-870.) Kikuchi T., Hagiwara K., Honda Y., Gomi K., Kobayashi T., Takahashi H., Tokue Y., Watanabe A., Nukiwa T. (2002). Clarithromycin suppresses lipopolysaccharide-induced interleukin-8 production by human monocytes through AP- 1 and NF-kappa B transcription factors. J. Antimicrob. Chemother. 49,745-755.) Sasaki M., Ito T., Kashima M., Fukui S., Izumiyama N., Watanabe A., Sano M., Fujiwara Y, Miura M. (2001). Erythromycin and clarithromycin modulation of growth factor-induced expression of heparanase mRNA on human lung cancer cells in vitro. Mediators Inflamm. 10,259-267.) Yatsunami J., Hayashi S. (2001). Fourteen-membered ring macrolides as anti-angiogenic compounds. Anticancer Res. 21,4253-4258. Morris et al. (Morris TC, Ranaghan L., Morrison, J. (2001). Phase II trial of claritnromycin and pamidronate therapy in myeloma. Med. Oncol., 18, 79-84.)

従って、本発明の目的は、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドを得、さらにこれをコードする遺伝子を得ることにある。   Accordingly, an object of the present invention is to obtain a peptide that binds to a macrolide antibiotic, and further to obtain a gene encoding it.

斯かる実状に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、マクロライド系抗生物質に結合するペプチドを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次のものを提供するものである。 In view of such a situation, the present inventor conducted intensive research and found a peptide that binds to a macrolide antibiotic and completed the present invention.
That is, the present invention provides the following.

＜１＞ マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該アミノ酸配列と相同性のある配列を含むペプチド若しくはタンパク質。 <1> A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 that binds to a macrolide antibiotic, or a peptide or protein comprising a sequence homologous to the amino acid sequence.

＜２＞ マクロライド系抗生物質がクラリスロマイシンである＜１＞記載のペプチド又はタンパク質。 <2> The peptide or protein according to <1>, wherein the macrolide antibiotic is clarithromycin.

＜３＞ マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相同性のある配列を含む遺伝子。 <3> DNA encoding a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 that binds to a macrolide antibiotic, or a gene containing a sequence homologous to this DNA.

本発明のペプチドは、マクロライド抗生物質に結合する性質を持ち、この配列を含むタンパク質は、マクロライド抗生物質と結合する。それらのタンパク質には、膵臓癌及び慢性膵臓炎に強く発現するヒトｐ８タンパク質が含まれており、それらの治療にマクロライド抗生物質が適用されることが期待される。すなわち、本発明のペプチドを用いることにより、新たな薬効の発見が期待される。   The peptides of the present invention have the property of binding to macrolide antibiotics, and proteins containing this sequence bind to macrolide antibiotics. These proteins include human p8 protein that is strongly expressed in pancreatic cancer and chronic pancreatitis, and macrolide antibiotics are expected to be applied to their treatment. That is, discovery of a new medicinal effect is expected by using the peptide of the present invention.

クラリスロマイシン（ＣＡＭ）に結合するペプチド（又はタンパク質）の特定
ＣＡＭ結合タンパク質を特定するために、我々は、表面キャプシドタンパク質上にランダムペプチドを表示する、ヒト白血球およびショウジョウバエ（Drosophilae）のｃＤＮＡフラグメントを含む２つのＴ７ファージライブラリーを用いた。ＣＡＭのビオチン化誘導体による生物選別（biopanning）後にペプチドを発現するファージクローンを選択的に増幅させた。本実験によって、ファージディスプレーペプチドライブラリーを用い、クラリスロマイシン結合ヒトｐ８タンパク質の存在が示された。さらにまた、発現ヒトｐ８タンパク質と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との結合は、ゲル移動性シフトアッセイでＣＡＭ１（１）、ＥＭ（２）およびＡＭ（３）によって妨害された。 Identification of peptides (or proteins) that bind to clarithromycin (CAM) To identify CAM-binding proteins, we identified cDNA fragments of human leukocytes and Drosophilae that display random peptides on surface capsid proteins. Two T7 phage libraries containing were used. Phage clones expressing peptides were selectively amplified after biopanning with biotinylated derivatives of CAM. This experiment demonstrated the presence of clarithromycin-binding human p8 protein using a phage display peptide library. Furthermore, the binding of the expressed human p8 protein to double stranded DNA (dsDNA) was blocked by CAM1 (1), EM (2) and AM (3) in a gel mobility shift assay.

以下に詳細に述べる
ビオチン化クラリスロマイシンの合成：
結合タンパク質のスクリーニングのために、炭水化物環のＣ２’でビオチン化したＣＡＭの誘導体をＣＡＭから製造した（化１）。 Synthesis of biotinylated clarithromycin, described in detail below:
For screening of binding proteins, derivatives of CAM biotinylated with C2 ′ of the carbohydrate ring were prepared from CAM (Chemical Formula 1).

化学物質総収量が１４％のビオチン化誘導体を得るため以下の３つの合成工程によった。
工程１：ＣＡＭとＮ−ベンジル−β−アラニンとの縮合反応によるリンカー部分のビオチンのＣ２’への導入、
工程２：還元的水素添加によるベンジル保護基の除去、および
工程３：６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるビオチン化によるビオチン化ＣＡＭ（５）の生成。 In order to obtain a biotinylated derivative having a total chemical yield of 14%, the following three synthesis steps were used.
Step 1: Introduction of biotin of a linker moiety into C2 ′ by condensation reaction of CAM and N-benzyl-β-alanine,
Step 2: Removal of the benzyl protecting group by reductive hydrogenation and Step 3: Generation of biotinylated CAM (5) by biotinylation with 6- (biotinamidocaproylamide) caproic acid N-hydroxysuccinimide ester.

前記縮合反応（工程１）では、クロマトグラフィーによって分離される３つの生成物が得られた。前記の各々の構造は、ＮＭＲ実験によってカルディノース上のＣ２’およびデソサミン上のＣ２”で二置換された生成物、およびＣ２’またはＣ２”で一置換された２つの生成物であることが判明した。前記一置換生成物のＮＭＲデータでは、ＣＡＭのＣ２’の¹Ｈ化学シフト（内部標準としてのＴＭＳから２Ｈ，δ３．２ｐｐｍ）は４．７９（２Ｈ）にシフトし、一方、Ｃ２”のそれは顕著にはシフトしなかった（各プロトンシグナルについて１．６１および２．３６）。ＨＭＢＣ実験では、Ｃ２’の１Ｈシグナル（４．７９）はエステルの炭素シグナルと１７０．４でクロスピークを有し、Ｎ−ベンジル−β−アラニンのＣ２’エステルの存在を示唆した。Ｃ２”誘導体は複雑な混合物を生じる水素添加反応に耐えられないので、Ｃ２’で一置換された生成物を次の工程で用いた。 In the condensation reaction (step 1), three products separated by chromatography were obtained. Each of the above structures was found by NMR experiments to be a product disubstituted with C2 ′ on cardinose and C2 ″ on desosamine, and two products monosubstituted with C2 ′ or C2 ″. did. The NMR data of the monosubstituted product, shifts (from TMS 2H, δ3.2ppm as internal standard) to 4.79 (2H) ¹ H chemical shifts of the CAM of C2 ', whereas, C2 "it is notable (1.61 and 2.36 for each proton signal) In the HMBC experiment, the C2 ′ 1H signal (4.79) has a cross peak at 170.4 with the carbon signal of the ester, The presence of a C2 ′ ester of N-benzyl-β-alanine was suggested. Since the C2 ″ derivative cannot withstand the hydrogenation reaction resulting in a complex mixture, the product monosubstituted with C2 ′ was used in the next step. It was.

生物選別による高親和性ファージの選別：
生物選別によるスクリーニングのために、Ｔ７ファージライブラリーは、キャプシドタンパク質のマルチクローニング部位内に提示されるべきペプチドの種々のｃＤＮＡ配列をもつ必要がある。このために、２つのＴ７ファージライブラリーをヒト白血球およびショウジョウバエ（ドロソフィラ＝メラノガスター、Drosophila melanogaster）のｃＤＮＡライブラリーから調製した。ＣＡＭのビオチン化誘導体をストレプトアビジン被覆ウェルに固定し、それを、それぞれヒト白血球およびショウジョウバエのｃＤＮＡフラグメントの挿入物を含む２つのＴ７ファージライブラリーとともにインキュベートした。生物選別によって選別し、数回緩衝液で洗浄して基質にランダムに結合した非特異物質を除去し、さらに溶出させて回収した各ファージは、ビオチン化ＣＡＭと親和性を示す可能性があるものの混合物であった。４回の生物選別を実施し、各回で洗浄し溶出させた溶液の各々についてファージの力価をチェックした。リガンドによって選別し回収したファージは、４回の選別後に白血球ファージライブラリーについては０．７８％およびショウジョウバエファージライブラリーについては０．２３％に増加し、一方、コントロールの回収ファージでは両方のケースで無視できる値であった。 Selection of high affinity phage by biological selection:
For screening by biological selection, the T7 phage library needs to have different cDNA sequences for the peptides to be displayed within the multiple cloning site of the capsid protein. For this, two T7 phage libraries were prepared from human leukocytes and a Drosophila melanogaster cDNA library. Biotinylated derivatives of CAM were immobilized on streptavidin-coated wells, which were incubated with two T7 phage libraries containing inserts of human leukocytes and Drosophila cDNA fragments, respectively. Each phage collected by biological selection, washed several times with a buffer solution to remove nonspecific substances randomly bound to the substrate, and further eluted and recovered may have an affinity for biotinylated CAM. It was a mixture. Four rounds of biological selection were performed and the phage titer was checked for each of the washed and eluted solutions each time. Phage sorted and recovered by ligand increased to 0.78% for leukocyte phage library and 0.23% for Drosophila phage library after 4 rounds of selection, while control recovered phage in both cases It was a negligible value.

リガンド選別ファージの配列分析およびペプチド配列の相同性検索：
回収したファージのｃＤＮＡ挿入物をアガロースゲル電気泳動分析のためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させた。４回目の選別後（図１、Ｂ）、回収されたｃＤＮＡ挿入物は３回選別生成物（図１、Ａ）よりもはるかに均質であった。ショウジョウバエファージライブラリーの場合では、４回選別後の８３個の配列決定クローンの８９％が５７ヌクレオチド配列と同定され、前記はまたヒト白血球ライブラリーからも主要配列として得られた（配列決定クローンの６０％）。前記選別されたヌクレオチドの同族物の１９アミノ酸配列を、配列番号１（ＮＳＰＡＧＩＳＲＥＬＶＤＫＬＡＡＡＬＥ）に示す。 Sequence analysis of ligand-selected phage and peptide sequence homology search:
The recovered phage cDNA insert was amplified by polymerase chain reaction (PCR) for agarose gel electrophoresis analysis. After the fourth round of selection (FIG. 1, B), the recovered cDNA insert was much more homogeneous than the triple sort product (FIG. 1, A). In the case of the Drosophila phage library, 89% of the 83 sequencing clones after 4 rounds of identification were identified as 57 nucleotide sequences, which were also obtained as major sequences from the human leukocyte library (of the sequencing clones). 60%). The 19 amino acid sequence of the selected nucleotide homologue is shown in SEQ ID NO: 1 (NSPAGISRELVDKLAAALE).

この配列をＦＡＳＡプログラムを用いてスイスプロットタンパク質データベース検索で調べた。相同性検索の結果、前記調査配列の１３アミノ酸は、核タンパク質として知られておりｄｓＤＮＡと結合するヒトｐ８タンパク質（８２アミノ酸）の５８−７０の領域で６６％の相同性インデックスを有していた。前記はプロアポトーシス刺激に対する反応に参画し、さらに組織が種々の損傷を相殺するために役立つような態様で細胞増殖を促進することができた。前記はまた、転移性表現型に寄与することができるが、その役割および機能ままだ明確ではない。   This sequence was examined by Swiss plot protein database search using the FASA program. As a result of homology search, 13 amino acids of the survey sequence were known as nucleoprotein and had a 66% homology index in the 58-70 region of human p8 protein (82 amino acids) that binds to dsDNA. . It participated in the response to pro-apoptotic stimuli and was able to promote cell proliferation in such a way that the tissue helps to offset various injuries. The above can also contribute to the metastatic phenotype, but its role and function are still unclear.

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析：
ヒトｐ８タンパク質とリガンドとしてのビオチン化ＣＡＭの結合を確認するために、ＢＩＡコアにリガンドを固定したセンサーチップを用いて解離定数を決定した。３種の異なるタンパク質濃度（２、４および６μＭ）を結合分析に用いた。リガンドはストレプトアビジンセンサーチップに固定し、続いてタンパク質溶液を前記リガンドに添加した。前記リガンドは注入によるヒトｐ８タンパク質と結合した。リガンドとタンパク質との結合の解離定数（Ｋ_D）は５×１０^-5Ｍであった（図２）。この結果は、ビオチン化ＣＡＭは、ファージペプチドライブラリーから生物選別によって選別したヒトｐ８タンパク質と直接相互作用することを示唆した。 Surface plasmon resonance (SPR) analysis:
In order to confirm the binding of human p8 protein and biotinylated CAM as a ligand, the dissociation constant was determined using a sensor chip in which the ligand was immobilized on the BIA core. Three different protein concentrations (2, 4 and 6 μM) were used for binding analysis. The ligand was immobilized on a streptavidin sensor chip, and then a protein solution was added to the ligand. The ligand bound to human p8 protein upon injection. The dissociation constant (K _D ) of the binding between the ligand and the protein was 5 × 10 ⁻⁵ M (FIG. 2). This result suggested that biotinylated CAM interacts directly with human p8 protein selected by phage selection from phage peptide libraries.

ヒトｐ８タンパク質とマクロライド系抗生物質との間の結合の分析：
ヒトｐ８タンパク質のＤＮＡ結合活性を分析した。図３、Ａはｐ８タンパク質のｄｓＤＮＡ（２３７塩基対）のゲル移動度シフトアッセイを示している。前記結合アッセイでは、１０ｎＭｏｌ（ヌクレオチド）のｄｓＤＮＡを０−９．６μＭｏｌのｐ８タンパク質に添加した（図３、Ａ、レーン３−８）。ｄｓＤＮＡに結合したｐ８タンパク質はゲル内の位置が変化したが（レーン４−８）、一方、ＣＡＭまたは１．５％ＤＭＳＯ（溶媒として）を含むｄｓＤＮＡは変化しなかった（それぞれレーン２および３）。ビオチン化ＣＡＭ（エントリー１）、ＣＡＭ（エントリー２）、ＥＭ（エントリー３）およびＡＭ（エントリー４）は、ｐ８タンパク質（２．４μＭ）およびｄｓＤＮＡ（１０ｎＭｏｌ）との間の複合体形成を妨害した（図３Ｂ）。ビオチン化ＣＡＭ、ＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭによるｐ８タンパク質のＤＮＡ結合活性の抑制は、それぞれ２．４、１．２、２．４および０．６ｍＭで観察された。 Analysis of binding between human p8 protein and macrolide antibiotics:
The DNA binding activity of human p8 protein was analyzed. FIG. 3A shows a gel mobility shift assay of dsDNA (237 base pairs) of the p8 protein. In the binding assay, 10 nMol (nucleotide) dsDNA was added to 0-9.6 μMol of p8 protein (FIG. 3, A, lanes 3-8). p8 protein bound to dsDNA changed position in the gel (lanes 4-8), whereas dsDNA containing CAM or 1.5% DMSO (as solvent) did not change (lanes 2 and 3, respectively). . Biotinylated CAM (entry 1), CAM (entry 2), EM (entry 3) and AM (entry 4) prevented complex formation between p8 protein (2.4 μM) and dsDNA (10 nMol) ( FIG. 3B). Inhibition of DNA binding activity of p8 protein by biotinylated CAM, CAM, EM and AM was observed at 2.4, 1.2, 2.4 and 0.6 mM, respectively.

実施例１
実験方法
材料：エリスロマイシンはシグマ（Sigma, USA）から購入した。他のマクロライド系抗生物質、ＣＡＭおよびＡＭは錠剤からＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出し、各サンプルはシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。全てのマクロライドの構造および合成生成物はＮＭＲ（AVANCE DRX-400および600, Bruker BioSpin, Germany）およびＥＳＩ−ＭＳ（Esquire 3000 plus, Bruker Daltonics, Germany）の両方でチェックした。ＮＭＲデータの化学的シフトいずれも、ＸＷＩＮ−ＮＭＲおよびデータアナリシス（DataAnalysis）でそれぞれ処理した。発現されたタンパク質のＭＳは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Reflex IV, Bruker Daltonics, Germany）で決定した。ＳＰＲデータはバイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅ３０００（Sweden）で収集し、ストレプトアビジン研究用等級のセンサーチップはＢＩＡｃｏｒｅ（Sweden）から購入した。ＤＮＡ配列は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ^R３１００ジネティックアナライザー（Applied Bioscience, USA）を用いて分析した。他の試薬はいずれも分析用等級で、本文で特に述べないかぎりジュンセイ社（Japan）から購入した。 Example 1
Experimental Method Materials: Erythromycin was purchased from Sigma, USA. Other macrolide antibiotics, CAM and AM were extracted from tablets with CH ₂ Cl ₂ and each sample was purified by silica gel column chromatography. All macrolide structures and synthetic products were checked by both NMR (AVANCE DRX-400 and 600, Bruker BioSpin, Germany) and ESI-MS (Esquire 3000 plus, Bruker Daltonics, Germany). All chemical shifts of the NMR data were processed with XWIN-NMR and DataAnalysis, respectively. The MS of the expressed protein was determined by MALDI-TOFMS (Reflex IV, Bruker Daltonics, Germany). SPR data was collected with the biosensor BIAcore 3000 (Sweden) and streptavidin research grade sensor chips were purchased from BIAcore (Sweden). DNA sequences, ABI PRISM ^R 3100 Genetics tick Analyzer (Applied Bioscience, USA) were analyzed using. All other reagents were of analytical grade and were purchased from Junsei (Japan) unless otherwise stated in the text.

ビオチン化ＣＡＭの合成：
Ｎ−カルボベンキシルオキシ−β−Ｌ−アラニン（９０ｍｇ、０．４ｍＭｏｌ）、１−（３−ジメチルアモノロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ、１００ｍｇ、０．５２ｍＭｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６ｍｇ、０．０５ｍＭｏｌ）を、乾燥ピリジン中のＣＡＭ（１）の溶液（２００ｍｇ、０．６２ｍＭｏｌ）に添加し、続いて前記混合物を５０℃で５日間攪拌した。前記反応混合物に水を注ぎいれ、続いて酢酸エチルで抽出した。硫酸マグネシウム無水物上で乾燥させた後、ろ液を真空中で蒸発させシロップを得た。前記シロップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーでクロマトグラフィーに付して生成物（４）（５５．３ｍｇ、０．０５８ｍＭｏｌ、２２．３％）を得た。生成物（４）の陽性ＥＳＩ−ＭＳは、Ｃ₄₉Ｈ₈₁Ｎ₂Ｏ₁₆のＭ＋Ｈイオンとしてｍ／ｚ９５３．５を示した。 Synthesis of biotinylated CAM:
N-carbobenxyloxy-β-L-alanine (90 mg, 0.4 mMol), 1- (3-dimethylamonoropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI, 100 mg, 0.52 mMol) and 4-dimethyl Aminopyridine (DMAP, 6 mg, 0.05 mMol) was added to a solution of CAM (1) (200 mg, 0.62 mMol) in dry pyridine, followed by stirring the mixture at 50 ° C. for 5 days. Water was poured into the reaction mixture, followed by extraction with ethyl acetate. After drying over anhydrous magnesium sulfate, the filtrate was evaporated in vacuo to give a syrup. The syrup was chromatographed on silica gel column chromatography to give the product (4) (55.3 mg, 0.058 mMol, 22.3%). Positive ESI-MS of product (4) showed m / z 953.5 as the M + H ion for C ₄₉ H ₈₁ N ₂ O ₁₆ .

化２は、クラリスロマイシン（ＣＡＭ、（１））、エリスロマイシン（ＥＭ、（２））およびアジスロマイシン（ＡＭ、（３））の構造、並びにビオチン化クラリスロマイシン（５）の合成経路を示す。（５）を精製するためには以下の３つの合成工程が存在する。工程１：ＣＡＭ（１）とＮ−ベンジル−β−アラニンとの縮合反応によりモノエステル（４）を生じる、工程２：還元的水素添加、工程３：６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによるビオチン化。
Ｂは、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹの部分的同定を示す。Ｎ−カルボベンキシルオキシ−β−Ｌ−アラニニルクラリスロマイシンのＣＯＳＹおよびＨＭＢＣにおける¹Ｈ−¹Ｈ相関関係がそれぞれ太線および矢印で表されている。 Chemical formula 2 shows the structure of clarithromycin (CAM, (1)), erythromycin (EM, (2)) and azithromycin (AM, (3)) and the synthetic route of biotinylated clarithromycin (5). In order to purify (5), the following three synthesis steps exist. Step 1: Condensation reaction between CAM (1) and N-benzyl-β-alanine yields monoester (4), Step 2: Reductive hydrogenation, Step 3: 6- (Biotinamide caproylamide) caproic acid Biotinylation with N-hydroxysuccinimide ester.
B shows partial identification of HMBC and COSY. The ¹ H- ¹ H correlation in COSY and HMBC of N-carbobenxyloxy-β-L-alaninyl clarithromycin is represented by bold lines and arrows, respectively.

ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）；マクロライド部分、１Ｈ：δ５．０５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝２．３２、１１．１２Ｈｚ，Ｈ−１３），３．７４（１Ｈ，Ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，Ｈ−３），３．７２（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１０），３．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５６Ｈｚ，Ｈ−５），３．０２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２２），２．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），２．８３（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝７．２８，９．１２Ｈｚ，Ｈ−２），２．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），１．９６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１４ｂ），１．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４），１．６８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７ｂ），１．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−７ａ），１．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１４ａ），１．４１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８），１．２１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１２Ｈｚ，Ｈ−１６），１．１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２４Ｈｚ，Ｈ−１９），１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ，Ｈ−２０），１．１０（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２１），０．８４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−１５），０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ−１７），¹³Ｃ：δ２２１．１（Ｃ−９），１７５．１（Ｃ−１），８０．８（Ｃ−５），７８．２（Ｃ−６およびＣ−３），７４．６（Ｃ−１３），７４．２（Ｃ−１２），６９．１（Ｃ−１１），５０．５（Ｃ−２２），４５．２（Ｃ−８），４５．０（Ｃ−２），３８．７（Ｃ−７），３８．０（Ｃ−４），１９．８（Ｃ−１８），２１．０（Ｃ−１４），１０．６（Ｃ−１５），１５．９（Ｃ−１６），１７．９（Ｃ−１９），１６．１（Ｃ−２１），１２．３（Ｃ−２０），８．９（Ｃ−１７）； NMR (CDCl ₃ ); macrolide moiety, 1H: δ 5.05 (1H, dd, J = 2.32, 11.12 Hz, H-13), 3.74 (1H, D, J = 7.28 Hz, H -3), 3.72 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-10), 3.61 (1H, d, J = 6.56 Hz, H-5), 3.02 (3H, s, H-22), 2.97 (1H, m, H-9), 2.83 (1H, dq, J = 7.28, 9.12 Hz, H-2), 2.58 (1H, m, H -8), 1.96 (1H, m, H-14b), 1.88 (1H, m, H-4), 1.68 (1H, m, H-7b), 1.61 (1H, m , H-7a), 1.50 (1H, m, H-14a), 1.41 (3H, s, H-18), 1.21 (3H, d, J = 9.12 Hz, H-16) , 1.13 (3H d, J = 7.24 Hz, H-19), 1.11 (3H, d, J = 6.88 Hz, H-20), 1.10 (3H, s, H-21), 0.84 (3H) , T, J = 7.6 Hz, H-15), 0.84 (3H, d, J = 7.6 Hz, H-17), ¹³ C: δ221.1 (C-9), 175.1 (C -1), 80.8 (C-5), 78.2 (C-6 and C-3), 74.6 (C-13), 74.2 (C-12), 69.1 (C- 11), 50.5 (C-22), 45.2 (C-8), 45.0 (C-2), 38.7 (C-7), 38.0 (C-4), 19. 8 (C-18), 21.0 (C-14), 10.6 (C-15), 15.9 (C-16), 17.9 (C-19), 16.1 (C-21) ), 12.3 (C-20), 8.9 (C-17);

カルディノース部分、¹Ｈ：δ４．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４４，１０．６８Ｈｚ，Ｈ−２’），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，Ｈ−１’），３．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５’），２．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３’），２．１５（６Ｈ，ｓ，Ｈ−７’およびＨ−８’），１．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’ａ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０４Ｈｚ，Ｈ−６’），１．２３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’ｂ），¹³Ｃ：δ１００．３（Ｃ−１’），７１．５（Ｃ−２’），６８．３（Ｃ−５’），６３．８（Ｃ−３’），３９．７（Ｃ−７’および８’），２８．２２（Ｃ−４’），２１．５（Ｃ−６’）； Cardinose part, ¹ H: δ 4.79 (1H, dd, J = 7.44, 10.68 Hz, H-2 ′), 4.60 (1H, d, J = 7.44 Hz, H−1 ′) , 3.50 (1H, m, H-5 ′), 2.61 (1H, m, H-3 ′), 2.15 (6H, s, H-7 ′ and H-8 ′), 1. 75 (1H, m, H-4′a), 1.24 (3H, d, J = 6.04 Hz, H-6 ′), 1.23 (1H, m, H-4′b), ¹³ C : Δ 100.3 (C-1 ′), 71.5 (C-2 ′), 68.3 (C-5 ′), 63.8 (C-3 ′), 39.7 (C-7 ′ and 8 '), 28.22 (C-4'), 21.5 (C-6 ');

デソサミン部分、¹Ｈ：δ４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４８Ｈｚ，Ｈ−１”），３．９５（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝６．３２，６．２４Ｈｚ，Ｈ−５”），３．３２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−８”），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８８，８．８８Ｈｚ，Ｈ−４”），２．３６（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２”ａ），１．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５２，２．２８Ｈｚ，Ｈ−２”），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２４Ｈｚ，Ｈ−６”），１．２５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−７”），¹³Ｃ：δ９５．９（Ｃ−１”），７７．８（Ｃ−４”），７２．９（Ｃ−３”），６５．９（Ｃ−５”），４９．４（Ｃ−８”），２１．５（Ｃ−７”），１８．６（Ｃ−６”）。 Desosamine moiety, ¹ H: δ 4.92 (1H, d, J = 4.48 Hz, H-1 ″), 3.95 (1H, dq, J = 6.32, 6.24 Hz, H-5 ″), 3.32 (3H, s, H-8 "), 3.05 (1H, dd, J = 8.88, 8.88 Hz, H-4"), 2.36 (1H, brs, H-2 ") a), 1.61 (1H, dd, J = 4.52, 2.28 Hz, H-2 "), 1.29 (3H, d, J = 6.24 Hz, H-6"), 1.25 (3H, s, H-7 "), ¹³ C: δ 95.9 (C-1"), 77.8 (C-4 "), 72.9 (C-3"), 65.9 (C- 5 "), 49.4 (C-8"), 21.5 (C-7 "), 18.6 (C-6").

エタノール（２０ｍＬ）中の生成物（４）の溶液（４６ｍｇ、０．０４８ｍＭｏｌ）を１０％のＰｄ／Ｃ（１０ｍｇ）の存在下で水素雰囲気下で１２時間室温で攪拌した。前記反応混合物をろ過し、ろ液を真空中で蒸発させた。残留油（３９ｍｇ）および６−（ビオチンアミドカプロイルアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３０ｍｇ、０．０５ｍＭｏｌ）を乾燥ピリジン（１０ｍＬ）中で溶解し、続いて２時間室温で攪拌した。前記反応混合物を真空中で蒸発させ，残留物をシリカゲルカラムでクロマトグラフィーに付し、生成物（５）を得た（４１．５ｍｇ、０．０３３ｍＭｏｌ、６９％）。生成物（５）の陽性ＥＳＩ−ＭＳは、Ｃ₆₃Ｈ₁₁₁Ｎ₆Ｏ₁₈ＳのＭ＋Ｈイオンとしてｍ／ｚ１２７１．７を示した。 A solution of product (4) (46 mg, 0.048 mMol) in ethanol (20 mL) was stirred in the presence of 10% Pd / C (10 mg) under hydrogen atmosphere for 12 hours at room temperature. The reaction mixture was filtered and the filtrate was evaporated in vacuo. Residual oil (39 mg) and 6- (biotinamidocaproylamide) caproic acid N-hydroxysuccinimide ester (30 mg, 0.05 mMol) were dissolved in dry pyridine (10 mL), followed by stirring for 2 hours at room temperature. The reaction mixture was evaporated in vacuo and the residue was chromatographed on a silica gel column to give product (5) (41.5 mg, 0.033 mMol, 69%). Positive ESI-MS of product (5) showed m / z 1271.7 as the M + H ion of C ₆₃ H ₁₁₁ N ₆ O ₁₈ S.

ショウジョウバエ（D. melanogaster）のＴ７ファージライブラリーの構築：
ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ、ランダムプライマー、５’−メチル化ｄＣＴＰ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカー、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ７セレクト１０−３ｂベクターおよびＴ７パッケージングエキストラクトはノバゲン（Novagen, USA）から購入した。全ＲＮＡの部分標本８０μｇは、ショウジョウバエ（D. melanogaster）のＫｃ細胞から抽出した。オリゴテックス−ｄｔ３０（スーパー）（Takara, Japan）を２回目の単離に用いて材料の損失を最小限にし、ランダムプライミングによるｃＤＮＡ合成に適したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを生成した。ｃＤＮＡ合成は、ランダムプライマーを有する４μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡでプライミングを実施し、続いて５’−メチル化ｄＣＴＰを両方の鎖に取り込ませ、１回目と２回目の鎖の合成の間には抽出も沈澱も実施しなかった。続いてｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、末端を平滑にし方向性を有するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカーで連結した。リンカーとの連結の後、ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで連続的に消化し、続いてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化Ｔ７セレクト１０−３ｂベクターアームに挿入した。得られたｃＤＮＡをＴ７ファージ１０−３ｂベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ファージへの充填を実施した。このライブラリーの力価は１．６×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍＬであった。 Construction of a D7 melanogaster T7 phage library:
Poly (A) ⁺ RNA, random primer, 5′-methylated dCTP, T4 DNA polymerase, EcoRI / HindIII linker, EcoRI, HindIII, T7 select 10-3b vector and T7 packaging extract are purchased from Novagen (USA) did. A 80 μg aliquot of total RNA was extracted from D. melanogaster Kc cells. Oligotex-dt30 (Super) (Takara, Japan) was used for the second isolation to minimize material loss and to generate poly (A) ⁺ RNA suitable for cDNA synthesis by random priming. cDNA synthesis was primed with 4 μg poly (A) ⁺ RNA with random primers, followed by incorporation of 5′-methylated dCTP into both strands, during the first and second strand synthesis. Neither extraction nor precipitation was performed. Subsequently, the cDNA was treated with T4 DNA polymerase and ligated with an EcoRI / HindIII linker having smooth ends and directional properties. After ligation with the linker, the cDNA was digested sequentially with HindIII and EcoRI and subsequently inserted into the EcoRI / HindIII digested T7 select 10-3b vector arm. The obtained cDNA was inserted into the EcoRI / HindIII site of the T7 phage 10-3b vector and filled into the phage. The titer of this library was 1.6 × 10 ¹⁰ pfu / mL.

ヒト白血球のＴ７ファージライブラリーの構築：
ＨｉｎｄＩＩＩランダムプライマー（ｄＴＴＮＮＮＮ）、ＭＭＬＶ−ＲＴ、メチル化ｄＮＴＰ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡｐｏｌＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリンカーはノバゲンNovagen, USA）から購入した。ペプチド配列を交互に入れ換えるＴ７ファージライブラリーは以下のように作製した。ＲＮイージーマクシ（Rneasy Maxi, Quiagen, USA）で抽出したヒト白血球由来全ＲＮＡの４００μｇをオリゴテックス−ｄＴ３０樹脂（oligotex-dT30, Takara, Japan）に適用してポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを精製した。４μｇのポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡからＨｉｎｄＩＩＩランダムプライマー（ｄＴＴＮＮＮＮ）を用いてＤＮＡ合成を開始し、第一鎖ｃＤＮＡは基質としてメチル化ｄＮＴＰを用いＭＭＬＶ−ＲＴで合成した。第二鎖ｃＤＮＡは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成し、得られた二本鎖ｃＤＮＡの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした。平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにつなぎ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られたｃＤＮＡをＴ７ファージ１０−３ｂベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ファージに充填した。一次リコンビナントの力価は４×１０⁶ｐｆｕ／ｍＬであった。 Construction of human leukocyte T7 phage library:
HindIII random primer (dTTNNNN), MMLV-RT, methylated dNTP, E. coli DNApolI, T4 DNA polymerase and EcoRI / HindIII linker were purchased from Novagen, USA. A T7 phage library in which peptide sequences are alternately replaced was prepared as follows. Poly (A) ⁺ mRNA was purified by applying 400 μg of human leukocyte-derived total RNA extracted with RN Easy Maxi, Quiagen, USA to Oligotex-dT30 resin (oligotex-dT30, Takara, Japan). DNA synthesis was started from 4 μg of poly (A) ⁺ mRNA using HindIII random primer (dTTNNNN), and the first strand cDNA was synthesized by MMLV-RT using methylated dNTP as a substrate. Second strand cDNA was synthesized using E. coli DNA polymerase I, and the ends of the resulting double stranded cDNA were smoothed with T4 DNA polymerase. Double-stranded cDNA with blunt ends was ligated to EcoRI / HindIII and digested with EcoRI and HindIII. The obtained cDNA was inserted into the EcoRI / HindIII site of the T7 phage 10-3b vector and filled into the phage. The titer of the primary recombinant was 4 × 10 ⁶ pfu / mL.

生物選別および配列分析：
４回の選別後、約４０個のプラークを任意にＬＢプレートから単離し、各々をファージ抽出緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇＳＯ₄）に溶解させた。ファージを破壊するために、前記抽出物を６５℃で１０分加熱した。続いて以下のプライマーを用いてファージＤＮＡをＰＣＲで増幅した：前進方向プライマー（配列番号２）５’−ＧＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＣ−３’および逆方向プライマー（配列番号３）５’−ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡ−３’。増幅後、ＰＣＲフラグメントをＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Amersham Biosciences）でクリーンアップし、１００％エタノールを添加して精製しＰＣＲ生成物を沈澱させた。続いて精製ＰＣＲフラグメントの配列を決定した。配列の結果をもとにして、Ｔ７ファージキャプシドに提示されているアミノ酸配列を決定した。候補クローンを増幅し、ビオチン化ＣＡＭ誘導体に対する親和性をチェックした。 Biological selection and sequence analysis:
After 4 rounds of sorting, approximately 40 plaques were optionally isolated from the LB plate and each was dissolved in phage extraction buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 6 mM MgSO ₄ ). In order to destroy the phage, the extract was heated at 65 ° C. for 10 minutes. Subsequently, the phage DNA was amplified by PCR using the following primers: forward primer (SEQ ID NO: 2) 5′-GACTTGGCTCTGGAGCGCGC-3 ′ and reverse primer (SEQ ID NO: 3) 5′-AACCCCCTCAAGACCCGTTTA-3 ′. After amplification, the PCR fragment was cleaned up with ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) and purified by adding 100% ethanol to precipitate the PCR product. Subsequently, the sequence of the purified PCR fragment was determined. Based on the sequence results, the amino acid sequence displayed on the T7 phage capsid was determined. Candidate clones were amplified and checked for affinity for biotinylated CAM derivatives.

ｐ８の発現と精製：
ＴＧ緩衝液は以下の試薬を含む；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、０．０１％ノニデット−Ｐ４５０、プロテアーゼインヒビター（１ｍｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチン）および１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）。
Ｈｉｓタグ結合緩衝液は以下の試薬を含む：２０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．５。
Ｈｉｓタグ溶出緩衝液は以下の試薬を含む：２０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．５ＭＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．５。 p8 expression and purification:
The TG buffer contains the following reagents: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10% glycerol, 0.01% nonidet-P450, protease inhibitors (1 mg / mL leupeptin and pepstatin) and 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride. (PMSF).
The His tag binding buffer contains the following reagents: 20 mM NaH ₂ PO ₄ , 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, 10% glycerol (v / v), pH 7.5.
The His tag elution buffer contains the following reagents: 20 mM NaH ₂ PO ₄ , 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 10% glycerol (v / v), pH 7.5.

リコンビナントＰ８タンパク質のｃＤＮＡクローニング、発現および精製：
Ｐ８フラグメントはヒトの完全長ＥＳＴクローン（クローンＩＤ：ＣＳ０ＤＩ０１５ＹＰ０５（Invitrogen））から得た。完全なＰ８コード配列を含むベクターｐＥＴ２８ａ（Novagen）をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。プライマーは以下を用いた。（配列番号４）５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣ−３’および（配列番号５）５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣ−３’。 CDNA cloning, expression and purification of recombinant P8 protein:
The P8 fragment was obtained from a human full-length EST clone (clone ID: CS0DI015YP05 (Invitrogen)). The vector pET28a (Novagen) containing the complete P8 coding sequence was digested with NdeI and XhoI. The following primers were used. (SEQ ID NO: 4) 5′-CATATGGCCACCTTCCCACCAGCAAC-3 ′ and (SEQ ID NO: 5) 5′-CTCGAGTCAGCGCCGTGCC-3 ′.

Ｐ８の開放読み枠（GenBank Accession No. AL545570）は８２個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードし、質量は８．９ｋＤａであった。リコンビナントタンパク質の発現およびＰ８タンパク質の精製のために、前記得られた構築物で大腸菌ＢＬ２１（DE3 pLys S）をヒートショックにより形質転換し、１つのコロニーを用いてＬＢ培地（１％グルコースおよび１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン含有）に３０℃で接種した。前記培養を一晩増殖させ、この１００ｍＬを２リットルのＳＢ培地中の１％グルコースに３０℃で接種した。１時間増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。２時間３０℃で増殖させた後、前記培養を１５０００ｇで１０分４℃で遠心沈澱させた。ペレットをＴＧ緩衝液に懸濁し、３０秒で１０回超音波処理し、３００００ｇで２０分４℃で遠心沈澱させた。続いてチャージおよび洗浄を実施した５ｍＬのＨｉｓ結合樹脂（Novagen）と上清を混合した。カラムを１００ｍＬのＴＧ緩衝液で洗浄し、１％グリセロールと１００ｍＭのグルタチオン（還元型）を含むトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させた。ＴＧ緩衝液で透析後の溶出リコンビナントｐ８タンパク質を種々のアッセイに用いた。   The open reading frame of P8 (GenBank Accession No. AL545570) encoded a polypeptide of 82 amino acid residues and had a mass of 8.9 kDa. For the expression of the recombinant protein and the purification of the P8 protein, E. coli BL21 (DE3 pLys S) was transformed by heat shock with the obtained construct, and one colony was used for LB medium (1% glucose and 100 mg / mL). Ampicillin-containing) was inoculated at 30 ° C. The culture was grown overnight and 100 ml of this was inoculated at 30 ° C. into 1% glucose in 2 liters of SB medium. After 1 hour growth, 1 mM IPTG was added. After growing for 2 hours at 30 ° C., the culture was centrifuged at 15000 g for 10 minutes at 4 ° C. The pellet was suspended in TG buffer, sonicated 10 times in 30 seconds, and centrifuged at 30000g for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was then mixed with 5 mL of His-binding resin (Novagen) that was subsequently charged and washed. The column was washed with 100 mL of TG buffer, and the protein bound to the resin was eluted with Tris-HCl (pH 7.5) containing 1% glycerol and 100 mM glutathione (reduced form). Eluted recombinant p8 protein after dialysis with TG buffer was used in various assays.

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：
ヒトｐ８タンパク質とビオチン化ＣＡＭの結合分析は、バイオセンサーＢＩＡコア３０００装置（ストレプトアビジン研究用等級センサーチップ付き）を用いて実施した。全ての緩衝液は使用前にろ過した。カップリング緩衝液（８％ＤＭＳＯ含有１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中のビオチン化ＣＡＭ（０．０１Ｍ、ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、０．１５ＭＮａＣｌ，０．００５％Ｐ２０，３ｍＭＥＤＴＡ）を含むカップリング緩衝液（１０％ＤＭＳＯ、ｐＨ５．０）２０μＬを流速２０μＬ／分で注入してストレプトアビジンセンサーチップ上にリガンドとして固定した。非結合リガンドを１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて洗浄した。ヒトｐ８タンパク質の結合分析は、前記タンパク質を含む泳動緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中で流速２０μＬ／分で２５℃で実施した。動態パラメーターはＢＩＡ評価ソフト３．１を用いて決定した。ヒトＰ８タンパク質とクラリスロマイシンの結合分析は、バイオセンサーＢＩＡコア装置、ＢＩＡＣＯＲＥＸ（BIAcore, Sweden）を用いて実施した。全ての緩衝液は使用前にろ過した。動態パラメーターはＢＩＡ評価ソフト３．１を用いて決定した。 Surface plasmon resonance (SPR):
Binding analysis of human p8 protein and biotinylated CAM was performed using a Biosensor BIA Core 3000 instrument (with a streptavidin research grade sensor chip). All buffers were filtered before use. Coupling buffer containing biotinylated CAM (0.01 M, HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% P20, 3 mM EDTA) in coupling buffer (10 mM sodium acetate containing 8% DMSO, pH 5.0) 20 μL of a solution (10% DMSO, pH 5.0) was injected at a flow rate of 20 μL / min and immobilized as a ligand on the streptavidin sensor chip. Unbound ligand was washed with 1M ethanolamine-HCl (pH 8.0). The binding analysis of human p8 protein was performed at 25 ° C. at a flow rate of 20 μL / min in an electrophoresis buffer (10 mM sodium acetate, pH 5.0) containing the protein. Kinetic parameters were determined using BIA evaluation software 3.1. Binding analysis between human P8 protein and clarithromycin was performed using a biosensor BIAcore instrument, BIACOREX (BIAcore, Sweden). All buffers were filtered before use. Kinetic parameters were determined using BIA evaluation software 3.1.

ゲル移動度シフトアッセイ：
ゲル移動度シフトアッセイは、文献（Casas-Finet et al.）の記載にしたがって実施した。結合混合物（最終容積２０μＬ）は以下を含む：２０ｍＭＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ，０．０５％Ｐ４０，１０％グリセロール、１０ｎＭ２５４ｂｐＤＮＡ，及び０〜２．４μＭのｐ８タンパク質。種々の濃度の化合物を前記結合混合物に添加し、続いて２５℃で３０分インキュベートした。サンプルを１．０％アガロース（０．１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５ｍＭＥＤＴＡ含有）中で２時間４℃で５０ボルトで泳動させた。 Gel mobility shift assay:
The gel mobility shift assay was performed as described in the literature (Casas-Finet et al.). The binding mixture (final volume 20 μL) contains: 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05% P40, 10% glycerol, 10 nM 254 bp DNA, and 0-2.4 μM p8 protein. Various concentrations of compound were added to the binding mixture followed by 30 minutes incubation at 25 ° C. Samples were run in 50% at 4 ° C. for 2 hours in 1.0% agarose (containing 0.1 M Tris acetate buffer (pH 8.3), 5 mM EDTA).

図３ＡおよびＢの実験方法：
結合混合物（最終容積２０μＬ）は以下を含む：２５ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭＤＴＴ、０．０５％Ｐ−４０、１０％グリセロール、１０ｎＭ２５４ｂｐＤＮＡ，及び、０又は２．４μＭのｐ８タンパク質。 Experimental method of FIGS. 3A and B:
The binding mixture (final volume 20 μL) contains: 25 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05% P-40, 10% glycerol, 10 nM 254 bp DNA, and 0 or 2.4 μM p8 protein.

種々の濃度のＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭを前記混合物に添加し、続いて２５℃で１０分インキュベートした。サンプルは１％アガロースゲル（０．１Ｍトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５ｍＭＥＤＴＡ含有）で５０ボルトで２時間泳動させた。   Various concentrations of CAM, EM and AM were added to the mixture followed by 10 minutes incubation at 25 ° C. Samples were run on a 1% agarose gel (0.1 M Tris acetate buffer (pH 8.3), containing 5 mM EDTA) at 50 volts for 2 hours.

他の方法：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は標準的なレムリ（Laemli）法を用いて７．５％および１０％ゲルにより実施した。電気泳動後、ゲルをレイら（Wray et al.）の記載にしたがって銀染色した。タンパク質濃度は標準物質としてｇ−グロブリンを用いるタンパク質アッセイキット（Bio-Rad）によりブラッドフォード（Bradford）の方法にしたがって決定した。 Other method:
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed on 7.5% and 10% gels using standard Laemli methods. After electrophoresis, the gel was silver stained as described by Wray et al. The protein concentration was determined according to the method of Bradford with a protein assay kit (Bio-Rad) using g-globulin as a standard substance.

以上を各図に示す。
図１は、生物選別で選別されたＴ７ファージに挿入されたショウジョウバエのｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す。Ａ：３回選別後のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ、Ｂ：４回選別後のＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ。４回選別後、選別ファージの８９％がアガロースゲル電気泳動分析で類似のバンドを示した。 The above is shown in each figure.
FIG. 1 shows an agarose gel electrophoresis analysis of Drosophila cDNA inserted into T7 phage selected by biological sorting. A: PCR amplified cDNA after three selections, B: PCR amplified cDNA after four selections. After 4 rounds of selection, 89% of the selected phages showed similar bands by agarose gel electrophoresis analysis.

図２は、ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す。ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナル（BIAcore, 実験方法の項を参照）によって検出され、反応ユニットとして示されている。３種の異なる濃度のｐ８タンパク質（曲線１：６μＭｏｌ、曲線２：４μＭｏｌ、および曲線３：２μＭｏｌ）を、ストレプトアビジンセンサーチップ上の固定ビオチン化ＣＡＭ（３０μｇ／μＬ）に２０μＬ／分で３分間注入し、２０μＬ／分で９０秒間解離させた。泳動緩衝液単独の注入から生じるバックグラウンドは作図前にデータから差し引いた。陰性コントロールのためには、３種の異なる濃度のＢＳＡ（曲線４：６μＭｏｌ、曲線５：４μＭｏｌ、および曲線６：２μＭｏｌ）を、ストレプトアビジンセンサーチップ上の固定ビオチン化ＣＡＭ（５）に同じ態様で注入した。   FIG. 2 shows a BIAcore analysis of the binding of biotinylated clarithromycin to human p8 protein. The binding of biotinylated clarithromycin to human p8 protein was detected by surface plasmon resonance (SPR) signal (see BIAcore, Experimental Methods) and is shown as a reaction unit. Three different concentrations of p8 protein (Curve 1: 6 μMol, Curve 2: 4 μMol, and Curve 3: 2 μMol) were injected at 20 μL / min for 3 min into immobilized biotinylated CAM (30 μg / μL) on a streptavidin sensor chip. And was dissociated at 20 μL / min for 90 seconds. The background resulting from the injection of running buffer alone was subtracted from the data before plotting. For negative control, three different concentrations of BSA (curve 4: 6 μMol, curve 5: 4 μMol, and curve 6: 2 μMol) were applied in the same manner to the immobilized biotinylated CAM (5) on the streptavidin sensor chip. Injected.

図３は、ｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲル電気泳動移動度シフト分析を示す。最終容積２０μＬで各サンプルを１．０％アガロースゲル上で５０Ｖで２時間泳動させた。臭化エチジウム染色ゲルの写真が示されている。
Ａ：ヒトｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲルシフト分析。
合成ｄｓＤＮＡ（１０ｍＭｏｌ、５１２ｂｐ）およびヒトｐ８タンパク質を混合した。レーン１−３はタンパク質を含まない；レーン４−８はそれぞれ０．６、１．２、２．４、４．８および９．６μＭの濃度のタンパク質と混合された；レーン２−８は１．５％のＤＭＳＯを含み、レーン２はＣＡＭ（１ｍＭ）を含んでいた。
Ｂ：ヒトｐ８タンパク質、ｄｓＤＮＡおよびマクロライド類（エントリー１−４はそれぞれビオチン化ＣＡＭ、ＣＡＭ、ＥＭおよびＡＭ）との間の結合のゲルシフト分析。
合成ｄｓＤＮＡ（１０ｍＭｏｌ、５１２ｂｐ）、ヒトｐ８タンパク質（それぞれ０μＭ（レーン１）および２．４μＭ（レーン２−６））を混合した。レーン１−２はマクロライドを含まず、レーン３−６では各々以下の濃度のマクロライド類が混合された（それぞれ０．３、０．６、１．２および２．４ｍＭｏｌ）。
本実験によって、クラリスロマイシン結合ヒトｐ８タンパク質の存在が示された。さらにまた、発現ヒトｐ８タンパク質と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との結合は、ゲル移動性シフトアッセイでＣＡＭ１、ＥＭおよびＡＭによって妨害されることが判った。 FIG. 3 shows gel electrophoresis mobility shift analysis of the binding of p8 protein and dsDNA. Each sample was run on a 1.0% agarose gel at 50 V for 2 hours in a final volume of 20 μL. Photographs of ethidium bromide stained gel are shown.
A: Gel shift analysis of binding between human p8 protein and dsDNA.
Synthetic dsDNA (10 mMol, 512 bp) and human p8 protein were mixed. Lanes 1-3 contain no protein; lanes 4-8 were mixed with proteins at concentrations of 0.6, 1.2, 2.4, 4.8 and 9.6 μM, respectively; lanes 2-8 were 1 Lane 5 contained CAM (1 mM), containing 5% DMSO.
B: Gel shift analysis of binding between human p8 protein, dsDNA and macrolides (entries 1-4 are biotinylated CAM, CAM, EM and AM, respectively).
Synthetic dsDNA (10 mMol, 512 bp) and human p8 protein (0 μM (lane 1) and 2.4 μM (lanes 2-6), respectively) were mixed. Lanes 1-2 did not contain macrolides, and lanes 3-6 were each mixed with the following macrolides (0.3, 0.6, 1.2, and 2.4 mMol, respectively).
This experiment showed the presence of clarithromycin-binding human p8 protein. Furthermore, binding of the expressed human p8 protein to double stranded DNA (dsDNA) was found to be disturbed by CAM1, EM and AM in a gel mobility shift assay.

マクロライド抗生物質は、抗感染症薬として世界中で広く処方されている。マクロライド系抗生物質が抗腫瘍薬として利用できることは、すでにＷＯ９５／２８９３９に示されている。本発明によるマクロライド系抗生物質結合ペプチド、そのアミノ酸配列を含むタンパク質及びそれらをコードする遺伝子群は、癌化学療法を行う場合に鍵となる標的をしめしている。従って、臨床的には、このアミノ酸配列を含むタンパク質及びそれらをコードする遺伝子群の発現を基に、マクロライド系抗生物質の適用拡大が可能となる。特にこれまで有効な坑腫瘍薬が開発されていない癌治療に期待が持たれる。
かように、検査薬として本発明のタンパク質又はペプチドを用い、これと結合する物質を調査することにより、薬効の有無、新たな効能、用途を持つ医薬の開発に役立つことが期待される。 Macrolide antibiotics are widely prescribed throughout the world as anti-infective drugs. It has already been shown in WO95 / 28939 that macrolide antibiotics can be used as antitumor agents. The macrolide antibiotic-binding peptide according to the present invention, the protein containing the amino acid sequence thereof, and the gene group encoding them represent key targets for cancer chemotherapy. Therefore, clinically, it is possible to expand the application of macrolide antibiotics based on the expression of proteins containing these amino acid sequences and the genes that encode them. In particular, there are expectations for cancer treatment for which no effective antitumor drug has been developed so far.
Thus, by using the protein or peptide of the present invention as a test drug and investigating substances that bind to it, it is expected to be useful for the development of a drug having the presence or absence of a drug effect, a new effect, and a use.

生物選別で選別されたＴ７ファージに挿入されたショウジョウバエのｃＤＮＡのアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis analysis of the Drosophila cDNA inserted in T7 phage selected by biological selection. ビオチン化クラリスロマイシンとヒトｐ８タンパク質との結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す図であるIt is a figure which shows the BIAcore analysis of the coupling | bonding of biotinylated clarithromycin and human p8 protein. 図３は、ｐ８タンパク質とｄｓＤＮＡとの結合のゲル電気泳動移動度シフト分析を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing gel electrophoresis mobility shift analysis of the binding between p8 protein and dsDNA.

Claims (3)

マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該アミノ酸配列と相同性のある配列を含むペプチド若しくはタンパク質。   A peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which binds to a macrolide antibiotic, or a peptide or protein comprising a sequence homologous to the amino acid sequence マクロライド系抗生物質がクラリスロマイシンである請求項１記載のペプチド又はタンパク質。   The peptide or protein according to claim 1, wherein the macrolide antibiotic is clarithromycin. マクロライド系抗生物質に結合する配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相同性のある配列を含む遺伝子。   A DNA encoding a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 that binds to a macrolide antibiotic or a gene containing a sequence homologous to this DNA.

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