JP2005091251A - Bioassay method and bioassay apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のマイクロアレイ技術に関する技術に関する。より詳細には、マイクロ波照射を行うことによって、ＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板に設けられた反応領域の温度を調節する方法に関する。 The present invention relates to a technique related to microarray technology such as a DNA chip and a protein chip. More specifically, the present invention relates to a method of adjusting the temperature of a reaction region provided on a bioassay substrate such as a DNA chip by performing microwave irradiation.
本発明の主たる従来技術を以下説明する。現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。 The main prior art of the present invention will be described below. Currently, integrated substrates for bioassays called DNA chips or DNA microarrays (hereinafter collectively referred to as “DNA chips”), in which predetermined DNA is finely arranged by microarray technology, are used for gene mutation analysis, SNPs (single nucleotides). Polymorphism) analysis, gene expression frequency analysis, etc., and has begun to be widely used in drug discovery, clinical diagnosis, pharmacogenomics, forensic medicine and other fields.
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。 Since this DNA chip has a large number of DNA oligo chains and cDNA (complementary DNA) integrated on a glass substrate or silicon substrate, comprehensive analysis of intermolecular interactions such as hybridization becomes possible. It is characterized by dots.
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。 To briefly explain an analysis method using a DNA chip, a fluorescent probe dNTP is obtained by reverse transcription PCR reaction or the like by extracting mRNA extracted from cells, tissues, etc. with respect to a DNA probe solid-phased on a glass substrate or a silicon substrate. In this method, PCR amplification is carried out while incorporating, hybridization is performed on the substrate, and fluorescence is measured with a predetermined detector.
ここで、ＤＮＡチップは二つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である（例えば、特許文献１参照）。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。 Here, DNA chips can be classified into two types. The first type is one in which oligonucleotides are directly synthesized on a predetermined substrate using a photolithographic technique applying a semiconductor exposure technique, and a typical one is by Affymetrix (Affymetrix). (For example, refer to Patent Document 1). Although this type of chip has a high degree of integration, there is a limit to DNA synthesis on the substrate, and the length is about several tens of bases.
第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを
用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである（例えば、特許文献２参照）。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。
The second type is also referred to as “Stanford method”, and is prepared by dispensing and solidifying a prepared DNA on a substrate using a tip-breaking pin ( For example, see Patent Document 2). This type of chip is less integrated than the former, but has the advantage that a DNA fragment of about 1 kb can be immobilized.
また、現在、プロテインチップを含むバイオセンサーチップと称される、薄い平板状に設けられた微小な検出表面部位に所定の検出物質を固相化し、この検出物質に対して、標的物質を含む溶液を、微容量だけ通水し、両物質の相互反応を表面プラズモン共鳴原理や水晶発振子等の原理を用いて観察・分析するバイオセンサー技術が進展しており、抗原抗体反応やホルモン応答反応等の物質間相互反応の分析における有用な技術となっている。 In addition, a solution that contains a target substance for this detection substance is solidified on a minute detection surface portion provided in a thin flat plate shape, which is currently called a biosensor chip including a protein chip. Biosensor technology has been developed to observe and analyze the interaction between both substances using the principle of surface plasmon resonance, quartz oscillator, etc., such as antigen-antibody reaction and hormone response reaction. It has become a useful technique in analyzing the interaction between substances.
そして、これら一連のＤＮＡチップ、プロテインチップ等の反応効率を高めるために、ヒーター等を用いて温度を調節し、反応効率を高める事が行われている。
しかしながら、従来の技術には、以下のような解決すべき課題があった。 However, the conventional techniques have the following problems to be solved.
上記した従来のＤＮＡチップ技術やバイオセンサー技術では、二次元である基板の狭小な反応部において、ＤＮＡプローブ等の検出用核酸やタンパク質等を固相化（固定化）し、ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応等の物質間の相互作用を進行させるという技術であることから、空間的に反応生成物の自由度が制限され、専ら標的ヌクレオチド鎖等のブラウン運動に基づいてハイブリダイゼーション等の相互作用をさせていた。このため、従来のＤＮＡチップ技術又はバイオセンサー技術では、相互作用の効率が悪く、反応時間が長いという技術的課題があった。 In the above-described conventional DNA chip technology and biosensor technology, in a narrow reaction part of a two-dimensional substrate, a detection nucleic acid such as a DNA probe or protein is immobilized (immobilized), and a hybridization reaction or antigen is detected. Because it is a technology that promotes interactions between substances such as antibody reactions, the degree of freedom of reaction products is limited spatially, and interactions such as hybridization are performed exclusively based on Brownian motion of the target nucleotide chain, etc. I was letting. For this reason, the conventional DNA chip technology or biosensor technology has a technical problem that the interaction efficiency is low and the reaction time is long.
また、ヒーター等を用いて反応領域の温度を上げる場合には、一部ハイブリダイゼーション等の反応が促進される傾向があるものの、温度管理が難しいだけでなく、装置が大型化してしまうという課題もあった。そして、反応領域内で温度ムラが発生し、所望の反応効率が得られないという問題もあった。 In addition, when the temperature of the reaction region is increased using a heater or the like, although there is a tendency for some reactions such as hybridization to be promoted, there is a problem that not only temperature management is difficult, but also the apparatus becomes large. there were. Further, there is a problem that temperature unevenness occurs in the reaction region and a desired reaction efficiency cannot be obtained.
さらに、反応領域内の媒質をゲルで構成した場合、反応領域内で液層の対流が起こらないため、温度伝搬が専ら輻射によって行われ、更にハイブリダイゼーション効率が悪くなっていた。 Furthermore, when the medium in the reaction region is composed of a gel, no convection of the liquid layer occurs in the reaction region. Therefore, temperature propagation is performed exclusively by radiation, which further deteriorates the hybridization efficiency.
そこで、本発明は、ハイブリダイゼーション等の物質間の相互作用が行われる反応領域の温度を調節することにより、検出物質と標的物質の相互作用（ハイブリダイゼーション等）の効率を高めることを可能にしたバイオアッセイ方法並びにバイオアッセイ装置を提供することを主目的とする。 Therefore, the present invention makes it possible to increase the efficiency of the interaction between the detection substance and the target substance (hybridization, etc.) by adjusting the temperature of the reaction region where the interaction between substances such as hybridization occurs. The main object is to provide a bioassay method and a bioassay device.
上記の技術的課題を解決するために、本発明では、以下の手段を提供する。 In order to solve the above technical problem, the present invention provides the following means.
本発明では、まず、物質間の相互作用の場となる反応領域に対してマイクロ波の照射を行うことにより、反応領域の温度を調節する方法を提供する。反応領域に対して、マイクロ波を照射することにより、反応領域内の媒質（緩衝液、ゲル等）の温度を上昇させることができる。そこで、反応領域が、物質間の相互作用に最も適した温度になるように、マイクロ波照射によって反応領域の温度を調節することにより、目的の相互反応を促進することができる。 In the present invention, first, a method for adjusting the temperature of a reaction region by irradiating microwaves to the reaction region serving as an interaction field between substances is provided. By irradiating the reaction region with microwaves, the temperature of the medium (buffer solution, gel, etc.) in the reaction region can be raised. Therefore, the target interaction can be promoted by adjusting the temperature of the reaction region by microwave irradiation so that the reaction region has a temperature most suitable for the interaction between substances.
この方法は、例えば、一本鎖核酸同士の相互作用（ハイブリダイゼーション）に利用することができる。ハイブリダイゼーションとは、一本鎖にした核酸同士が相補性を持つ塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成することをいう。 This method can be used, for example, for interaction (hybridization) between single-stranded nucleic acids. Hybridization refers to the formation of a double-stranded nucleic acid by hydrogen bonding between base pairs in which single-stranded nucleic acids are complementary.
二本鎖の核酸は、熱を加えることにより、二本鎖構造が解きほぐされて、一本鎖となる。二本鎖核酸が一本鎖に融解する温度は、融解温度Ｔｍ（Melting Temperature）といい、二本鎖を形成する核酸の塩基配列のＧＣ含量に基づいて、各核酸の融解温度Ｔｍは異なる。一般に、ハイブリダイゼーションは、融解温度Ｔｍよりも約５℃低い時に、最も反応が促進されるといわれている。そこで、ハイブリダイゼーションに最も適した温度になるように、反応領域内の温度を調節することにより、目的のハイブリダイゼーションを促進することができる。 The double-stranded nucleic acid is unwound from the double-stranded structure by applying heat to become single-stranded. The temperature at which a double-stranded nucleic acid melts into a single strand is referred to as a melting temperature Tm (Melting Temperature), and the melting temperature Tm of each nucleic acid is different based on the GC content of the base sequence of the nucleic acid forming the double strand. In general, it is said that hybridization is most accelerated when the temperature is about 5 ° C. lower than the melting temperature Tm. Therefore, target hybridization can be promoted by adjusting the temperature in the reaction region so that the temperature is most suitable for hybridization.
また、目的のハイブリダイゼーション反応の前に、マイクロ波照射により反応領域の温度を融解温度Ｔｍよりも高くしておくことにより、反応に用いる一本鎖核酸が、反応前に、ミスハイブリしてしまうことを防止することができる。 Further, by setting the temperature of the reaction region to be higher than the melting temperature Tm by microwave irradiation before the target hybridization reaction, the single-stranded nucleic acid used for the reaction is mishybridized before the reaction. This can be prevented.
その他、各核酸の融解温度Ｔｍに応じて、マイクロ波照射による反応領域の温度調節を適宜行うことにより、目的のハイブリダイゼーション反応の際に生じるミスハイブリした核酸のみを一本鎖に融解させて、除去することも可能となる。 In addition, according to the melting temperature Tm of each nucleic acid, by appropriately adjusting the temperature of the reaction region by microwave irradiation, only the mishybridized nucleic acid generated in the target hybridization reaction is melted into a single strand, It can also be removed.
マイクロ波は、照射エネルギーの強度を調節することが可能である。そこで、反応領域に適当量のマイクロ波を照射することにより、反応領域中の媒質だけでなく、核酸自体にも作用を及ぼすことが可能である。マイクロ波は、核酸に対して、主に、（１）核酸が反応領域内で活発に移動できる状態にする作用、（２）核酸のブラウン運動を活発化させ、一本鎖核酸同士の会合機会を増進させる作用、（３）ミスハイブリした核酸の結合を解離させ、正しいハイブリダイゼーションを促進する作用等を発揮する。 Microwaves can adjust the intensity of irradiation energy. Therefore, by irradiating the reaction region with an appropriate amount of microwaves, it is possible to affect not only the medium in the reaction region but also the nucleic acid itself. Microwaves are mainly used for nucleic acids: (1) the action of allowing nucleic acids to move actively within the reaction region; (2) the activation of the Brownian movement of nucleic acids and the opportunity for association of single-stranded nucleic acids. (3) Dissociates mishybridized nucleic acid bonds and promotes correct hybridization.
以上のように、マイクロ波の照射を、適当な強度、適当な時間、適当な間隔、適当なタイミングで行い、また、そのような照射を適宜組み合わせることにより、目的のハイブリダイゼーション等の相互作用を、効率的に促進させることができる。 As described above, microwave irradiation is performed at an appropriate intensity, at an appropriate time, at an appropriate interval, and at an appropriate timing, and by appropriately combining such irradiations, the desired interaction such as hybridization can be achieved. Can be promoted efficiently.
なお、本発明において、核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオチドのリン酸エステルの重合体を意味し、ＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ等を広く含む。 In the present invention, nucleic acid means a polymer of a phosphate ester of a nucleotide in which a purine or pyrimidine base and a sugar are glycosidically bonded, and an oligonucleotide, a polynucleotide containing a DNA probe, a purine nucleotide and a pyrimidine nucleotide are polymerized. Widely includes DNA (full length or a fragment thereof), cDNA obtained by reverse transcription (cDNA probe), RNA and the like.
次に、本発明では、物質間の相互作用の場となる反応領域が少なくとも設けられたバイオアッセイ用基板の反応領域に対してマイクロ波照射を行う反応領域の温度調節方法を提供する。なお、バイオアッセイ用基板には、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等がある。 Next, the present invention provides a method for adjusting the temperature of a reaction region in which microwave irradiation is performed on the reaction region of a bioassay substrate provided with at least a reaction region serving as an interaction field between substances. Bioassay substrates include DNA chips and protein chips.
例えば、ＤＮＡチップの場合、一方の一本鎖核酸を検出用物質として反応領域中に予め存在させておき、もう一方の一本鎖核酸を標的物質として、反応領域内に、滴下する。その結果、両方の一本鎖核酸が相補的である場合には、一本鎖核酸同士の相互作用（ハイブリダイゼーション）が起きる。 For example, in the case of a DNA chip, one single-stranded nucleic acid is previously present in the reaction region as a substance for detection, and the other single-stranded nucleic acid is dropped as a target substance into the reaction region. As a result, when both single-stranded nucleic acids are complementary, interaction (hybridization) between the single-stranded nucleic acids occurs.
また、プロテインチップの場合、一方の物質（タンパク質等）を検出用物質として反応領域中に予め存在させておき、もう一方の物質（タンパク質、核酸等）を標的試料として、反応領域内に、添加する。その結果、両者に相互作用がある場合には、抗原抗体反応、タンパク質同士の結合、酵素（タンパク質）とその基質（タンパク質、核酸等）との間の作用、等の相互作用が起きる。。 In the case of a protein chip, one substance (protein, etc.) is preliminarily present in the reaction area as a detection substance, and the other substance (protein, nucleic acid, etc.) is added as a target sample to the reaction area. To do. As a result, when there is an interaction between the two, interactions such as an antigen-antibody reaction, protein binding, an action between an enzyme (protein) and its substrate (protein, nucleic acid, etc.), etc. occur. .
そして、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のバイオアッセイ用基板の反応領域でおこる相互作用の中には、その反応に最も適した温度があるものが多い。例えば、前記のとおり、核酸同士のハイブリダイゼーションは、融解温度Ｔｍよりも約５℃低い温度で、最も反応が起こりやすいといわれている。また、酵素の場合、反応速度が最大となる最適温度があるので、反応領域内の媒質の温度を調節する必要がある。そこで、本発明では、バイオアッセイ用基板の反応領域に対してマイクロ波照射を行うことにより、反応領域内の温度を調節する。これによって、目的の相互作用が最も起こりやすい温度にバイオアッセイ用基板の反応領域の温度を調節することが可能となる。 Many of the interactions that occur in the reaction region of a bioassay substrate such as a DNA chip or protein chip have the most suitable temperature for the reaction. For example, as described above, it is said that hybridization between nucleic acids is most likely to occur at a temperature about 5 ° C. lower than the melting temperature Tm. In the case of an enzyme, since there is an optimum temperature at which the reaction rate is maximized, it is necessary to adjust the temperature of the medium in the reaction region. Therefore, in the present invention, the temperature in the reaction region is adjusted by performing microwave irradiation on the reaction region of the bioassay substrate. As a result, the temperature of the reaction region of the bioassay substrate can be adjusted to a temperature at which the target interaction is most likely to occur.
また、上記と同様に、マイクロ波は、照射エネルギーの強度を調節することができるので、反応領域に適当量のマイクロ波を照射することにより、反応領域中の媒質に対してだけでなく、反応領域内の物質自体に対しても作用を及ぼすことが可能である。 Similarly to the above, since the intensity of the irradiation energy of the microwave can be adjusted, by irradiating the reaction region with an appropriate amount of microwave, not only the medium in the reaction region but also the reaction. It is also possible to act on the substance itself in the region.
従って、マイクロ波の照射を、適当な強度、適当な時間、適当な間隔、適当なタイミングで行い、また、そのような照射を適宜組み合わせることにより、バイオアッセイ用基板の反応領域における、目的の相互作用を、効率的に促進させることができる。 Therefore, microwave irradiation is performed at an appropriate intensity, an appropriate time, an appropriate interval, and an appropriate timing, and by appropriately combining such irradiations, the target mutual in the reaction region of the bioassay substrate can be obtained. The action can be promoted efficiently.
その他、ＤＮＡチップの場合には、一本鎖核酸だけでなく、二本鎖核酸を標的物質として反応領域に添加することも、本発明により可能となる。本発明に係るマイクロ波照射により、反応領域の温度を調節することができるので、標的物質を反応領域に滴下した後、反応領域の媒質の温度を標的物質のＴｍ（融解温度）以上に上げれば、標的物質は一本鎖に融解する。その後、反応領域の媒質の温度を下げれば、大部分の標的物質は、二本鎖核酸に戻るが、標的物質の一部は検出用物質（一本鎖核酸）と相互作用（ハイブリダイゼーション）を起こす。従って、本発明により、ＤＮＡチップの使用手順を簡略化することも可能である。 In addition, in the case of a DNA chip, it is possible to add not only single-stranded nucleic acids but also double-stranded nucleic acids as target substances to the reaction region. Since the temperature of the reaction region can be adjusted by microwave irradiation according to the present invention, if the target material is dropped onto the reaction region, the temperature of the medium in the reaction region is increased to Tm (melting temperature) or more of the target material. The target substance melts into a single strand. After that, if the temperature of the medium in the reaction region is lowered, most of the target substance returns to double-stranded nucleic acid, but part of the target substance interacts with the detection substance (single-stranded nucleic acid) (hybridization). Wake up. Therefore, according to the present invention, it is possible to simplify the procedure for using the DNA chip.
なお、バイオアッセイ用基板は、ＤＮＡチップ、プロテインチップに限定されるわけではなく、高分子同士、低分子同士、高分子と低分子との反応、等の物質間の相互作用の場となる反応領域が少なくとも設けられたバイオアッセイ用基板を広く包含するものとする。 The substrate for bioassay is not limited to a DNA chip or a protein chip, but is a reaction that acts as a field for interaction between substances such as a reaction between polymers, a reaction between molecules, a reaction between a polymer and a molecule. It is intended to broadly encompass a bioassay substrate provided with at least a region.
続いて、検出用物質が存在する反応領域が設けられたバイオアッセイ用基板を用いて物質間の相互作用を検出するための装置であって、反応領域に対して標的物質を含むサンプル溶液を滴下する手段と、反応領域に対するマイクロ波照射手段と、マイクロ波の照射を制御する手段と、を少なくとも備えるバイオアッセイ装置を提供する。 Subsequently, an apparatus for detecting an interaction between substances using a bioassay substrate provided with a reaction region in which a detection substance exists, in which a sample solution containing a target substance is dropped onto the reaction area. There is provided a bioassay device comprising at least means for performing microwave irradiation on the reaction region, and means for controlling the microwave irradiation.
例えば、バイオアッセイ用基板がＤＮＡチップの場合、バイオアッセイ用基板の反応領域には、予め、検出用物質として、一本鎖核酸が存在している。本発明に係るバイオアッセイ装置により、もう一方の標的物質となる核酸を含むサンプル溶液をバイオアッセイ用基板の反応領域に滴下すると、標的物質が目的のものである場合には、相互作用（ハイブリダイゼーション）が起こる。 For example, when the bioassay substrate is a DNA chip, a single-stranded nucleic acid is present in advance as a detection substance in the reaction region of the bioassay substrate. When a sample solution containing a nucleic acid serving as another target substance is dropped onto the reaction region of the bioassay substrate using the bioassay device according to the present invention, if the target substance is the target substance, an interaction (hybridization) ) Occurs.
そして、本発明に係るバイオアッセイ装置は、反応領域に対してマイクロ波を照射する手段を備えているので、反応領域内の媒質の温度を、相互作用（ハイブリダイゼーション）に最も適した温度に調節することができる。前記のとおり、一般的に、ハイブリダイゼーションは、核酸の融解温度Ｔｍよりも約５℃低い温度で、最も促進されるといわれている。従って、マイクロ波照射により、反応領域の温度を、所定の温度に調節することにより、目的の相互作用が促進される。 Since the bioassay device according to the present invention includes means for irradiating the reaction region with microwaves, the temperature of the medium in the reaction region is adjusted to a temperature most suitable for interaction (hybridization). can do. As described above, it is generally said that hybridization is most promoted at a temperature about 5 ° C. lower than the melting temperature Tm of nucleic acid. Therefore, the target interaction is promoted by adjusting the temperature of the reaction region to a predetermined temperature by microwave irradiation.
また、本装置は、マイクロ波の照射を制御する手段も備えているので、マイクロ波の照射を、適当な強度、適当な時間、適当な間隔、適当なタイミングで行い、また、そのような照射を適宜組み合わせることができる。従って、目的に応じて、適宜、バイオアッセイ用基板の反応領域の温度を調節することができる。また、マイクロ波の照射エネルギーも調節することができるので、前述したとおり、反応領域中の媒質だけでなく、核酸自体にも、（１）核酸が反応領域内で活発に移動できる状態にする作用、（２）核酸のブラウン運動を活発化させ、一本鎖核酸同士の会合機会を増進させる作用、（３）ミスハイブリした核酸の結合を解離させ、正しいハイブリダイゼーションを促進する作用、等の作用を及ぼすことが可能である。従って、目的のハイブリダイゼーション等の相互作用を、効率的に促進させることができる。 In addition, since this apparatus also includes means for controlling the microwave irradiation, the microwave irradiation is performed at an appropriate intensity, at an appropriate time, at an appropriate interval, and at an appropriate timing. Can be combined as appropriate. Therefore, the temperature of the reaction region of the bioassay substrate can be appropriately adjusted according to the purpose. In addition, since the irradiation energy of the microwave can be adjusted, as described above, not only the medium in the reaction region but also the nucleic acid itself is (1) an action that enables the nucleic acid to move actively in the reaction region. , (2) the action of activating the Brownian movement of nucleic acids and increasing the chance of association of single-stranded nucleic acids, (3) the action of dissociating mishybridized nucleic acids and promoting correct hybridization, etc. Can be exerted. Therefore, it is possible to efficiently promote the interaction such as the target hybridization.
その他、本装置により、バイオアッセイ用基板の反応領域の温度を調節することができるので、前述したように、標的物質となる核酸は、一本鎖だけでなく、二本鎖核酸であっても、使用することが可能である。 In addition, since the temperature of the reaction region of the bioassay substrate can be adjusted by this apparatus, the nucleic acid serving as the target substance is not limited to a single-stranded nucleic acid as described above. Can be used.
なお、本装置は、ＤＮＡチップを用いる場合に限定されるわけではなく、プロテインチップをはじめ、高分子同士、低分子同士、高分子と低分子との反応、等の物質間の相互作用の場となる反応領域が少なくとも設けられたバイオアッセイ用基板を用いる場合を広く含むものとする。例えば、プロテインチップの場合、タンパク質は、反応速度が最大になる最適温度がある場合が多いので、バイオアッセイ用基板の反応領域の温度を調整できる本装置は、有効である。 Note that this apparatus is not limited to the case of using a DNA chip, but a field of interaction between substances such as a protein chip, a polymer, a low molecule, a reaction between a polymer and a low molecule. The case where a substrate for bioassay provided with at least a reaction region is used is widely included. For example, in the case of a protein chip, the protein often has an optimum temperature at which the reaction rate is maximized. Therefore, the present apparatus that can adjust the temperature of the reaction region of the bioassay substrate is effective.
本装置は、上記の手段に加えて、反応領域に相互作用検出用の励起光を照射する手段を備えることができる。反応領域に励起光を照射する手段を備えることにより、バイオアッセイ用基板の反応領域で、検出用物質と標的物質が相互作用を起こしている場合には、反応領域中の物質から励起された光等のシグナルが発せられるため、検出用物質と標的物質との間に相互作用が起こっているかどうかを検出・測定等する手段として、有効である。 In addition to the above-described means, the apparatus can include means for irradiating the reaction region with excitation light for detecting interaction. By providing a means for irradiating the reaction region with excitation light, if the detection substance and the target substance interact in the reaction region of the bioassay substrate, the light excited from the substance in the reaction region Are effective as means for detecting and measuring whether or not an interaction occurs between the detection substance and the target substance.
励起光を照射した際に光等のシグナルを発するようにする方法としては、例えば、標的物質に予め蛍光標識する方法、標的物質滴下時に蛍光物質を混合して反応領域に滴下する方法、標的物質と蛍光物質をほぼ同時又は時系列的に前後して、かつ別々に滴下する方法等がある。これらの方法を用いることにより、物質間の相互作用の検出・測定等を、正確かつ高感度に行うことができる。また、核酸同士の相互作用（ハイブリダイゼーション）を検出等する場合、インターカレータを用いる方法もある。「インターカレータ」は、検出用核酸物質と標的核酸物質との塩基間の水素結合中に挿入されるようにして、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸に取り込まれる。これにより、インターカレータを含まない二本鎖核酸からの蛍光波長に比べ、長波長側に蛍光波長がシフトし、かつ、蛍光強度と二本鎖ヌクレオチド鎖に取り込まれたインターカレータの量との間には相関関係があるので、この相関関係に基づいて、定量的な検出が可能となる。 Examples of the method for emitting a signal such as light when irradiated with excitation light include, for example, a method of fluorescently labeling a target substance in advance, a method of mixing a fluorescent substance when dropping the target substance, and dropping the reaction substance onto the reaction region, a target substance And a method in which the fluorescent substance is dripped approximately simultaneously or in time series and separately. By using these methods, it is possible to detect and measure the interaction between substances accurately and with high sensitivity. In addition, when detecting an interaction (hybridization) between nucleic acids, there is a method using an intercalator. The “intercalator” is incorporated into the hybridized double-stranded nucleic acid so as to be inserted into the hydrogen bond between the bases of the detection nucleic acid substance and the target nucleic acid substance. This shifts the fluorescence wavelength to the longer wavelength side compared to the fluorescence wavelength from a double-stranded nucleic acid not containing an intercalator, and between the fluorescence intensity and the amount of intercalator incorporated into the double-stranded nucleotide chain. Since there is a correlation, quantitative detection is possible based on this correlation.
本装置は、励起光を照射したことにより、反応領域内の物質から発せられる光を集光して光強度を検出する光学手段を備えることができる。これにより、反応領域内で物質間の相互作用が起こった場合に励起された光を、集光して光強度を検出することができるので、物質間の相互作用の検出性能を高めることができる。 This apparatus can be provided with an optical means for collecting light emitted from the substance in the reaction region and detecting the light intensity by irradiating the excitation light. As a result, it is possible to collect the light excited when the interaction between the substances occurs in the reaction region and detect the light intensity, thereby improving the detection performance of the interaction between the substances. .
その他、本発明に係るバイオアッセイ装置は、さらに、バイオアッセイ用基板に記録した信号等の記録再生を行う記録再生部分、インターネットに接続するためのインターネット接続機能を有する部分、記録再生部やインターネット接続機能を制御し、所定のデータを加工、生成してバイオアッセイ用基板に情報を記録したり、情報を読み出したりする制御部分、等を備える構成とすることができる。これにより、一連の手順を自動化したり、簡単な入力手段等で装置を制御したりすることができるようになる。また、予め記録しておいたサンプル等の情報や、実験結果等のデータを、簡単に処理、加工することができ、さらに、その情報を、バイオアッセイ用基板に記憶させておく等の作業も可能となる。 In addition, the bioassay device according to the present invention further includes a recording / reproducing part for recording / reproducing signals recorded on the bioassay substrate, a part having an Internet connection function for connecting to the Internet, a recording / reproducing part, and an Internet connection. A control part that controls functions, processes and generates predetermined data, records information on a bioassay substrate, reads information, and the like can be employed. As a result, a series of procedures can be automated, and the apparatus can be controlled by simple input means or the like. In addition, information such as pre-recorded samples and data such as experimental results can be easily processed and processed, and the information can be stored on a bioassay substrate. It becomes possible.
本発明によって奏される効果は、以下の通りである。 The effects produced by the present invention are as follows.
物質間の相互作用の場となる反応領域に対してマイクロ波の照射を行うことにより、反応領域内の温度を調節することができる。反応領域の温度を、物質間の相互作用に最適な温度に調節することができるので、相互作用を促進することができる。 The temperature in the reaction region can be adjusted by irradiating the reaction region serving as an interaction field between substances with microwaves. Since the temperature of the reaction region can be adjusted to a temperature optimal for the interaction between substances, the interaction can be promoted.
マイクロ波照射は、反応領域の媒質に対してだけでなく、核酸、タンパク質等の相互作用する物質自体に対しても作用を及ぼす。従って、マイクロ波の照射エネルギーを調節することにより、目的の相互作用（ハイブリダイゼーション等）を起こりやすくすることができる。 Microwave irradiation acts not only on the medium in the reaction region, but also on the interacting substance itself such as nucleic acid and protein. Therefore, the target interaction (hybridization or the like) can easily occur by adjusting the microwave irradiation energy.
マイクロ波の照射を、適当な強度、適当な時間、適当な間隔、適当なタイミングで行い、また、そのような照射を適宜組み合わせることにより、目的のハイブリダイゼーション等の相互作用を、効率的に促進させることができる。 Microwave irradiation is performed at an appropriate intensity, at an appropriate time, at an appropriate interval, at an appropriate timing, and by appropriately combining such irradiations, the desired interaction such as hybridization is efficiently promoted. Can be made.
ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のバイオアッセイ用基板の反応領域に、マイクロ波を照射することにより、前記と同様の、効果を得ることができる。 By irradiating the reaction region of a bioassay substrate such as a DNA chip or protein chip with microwaves, the same effects as described above can be obtained.
本発明に係るバイオアッセイ装置は、反応領域に対するマイクロ波照射手段とマイクロ波の照射を制御する手段とを備えているので、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のバイオアッセイ用基板の反応領域に対して、マイクロ波の照射を、適当な大きさ、適当な時間、適当な間隔、適当なタイミングで行うことができる。従って、バイオアッセイ用基板の反応領域内における物質間の相互作用を調節・促進することができる。 Since the bioassay device according to the present invention comprises a microwave irradiation means for the reaction region and a means for controlling the microwave irradiation, the reaction region of the bioassay substrate such as a DNA chip or a protein chip, Microwave irradiation can be performed at an appropriate size, an appropriate time, an appropriate interval, and an appropriate timing. Therefore, the interaction between substances in the reaction region of the bioassay substrate can be regulated and promoted.
本発明に係るバイオアッセイ装置は、蛍光物質、インターカレータ等を用いることにより、目的の相互作用を高感度に検出・測定することができる。 The bioassay device according to the present invention can detect and measure a target interaction with high sensitivity by using a fluorescent substance, an intercalator, or the like.
（マイクロ波照射パターン）
本発明に係るマイクロ波の照射は、目的に応じて、適宜、照射強度（照射エネルギー）、照射時間、照射間隔、照射タイミングを、いろいろ組み合わせることができる。
(Microwave irradiation pattern)
In the microwave irradiation according to the present invention, irradiation intensity (irradiation energy), irradiation time, irradiation interval, and irradiation timing can be appropriately combined depending on the purpose.
バイオアッセイ用基板をＤＮＡチップとして用いる場合、一本鎖核酸同士の相互作用（ハイブリダイゼーション）が最も効率的に起こるのは、融解温度Ｔｍから約５℃低い温度であるといわれている。本発明では、図１に示すように、マイクロ波を照射することにより、反応領域の温度を、融解温度Ｔｍより約５℃低い温度まで上昇させることができ、また、マイクロ波を間欠的に照射することにより、反応領域の温度をある程度一定に保つことができる。 When a bioassay substrate is used as a DNA chip, it is said that the interaction (hybridization) between single-stranded nucleic acids occurs most efficiently at a temperature about 5 ° C. lower than the melting temperature Tm. In the present invention, as shown in FIG. 1, by irradiation with microwaves, the temperature of the reaction region can be raised to a temperature about 5 ° C. lower than the melting temperature Tm, and the microwaves are intermittently irradiated. By doing so, the temperature of the reaction region can be kept constant to some extent.
図２に示すように、マイクロ波を間欠的に照射する際に、照射する間隔を短くするとともに、照射強度を徐々に弱くしていくと、さらに、反応領域の温度を一定に保つことが可能となる。また、マイクロ波照射により、一度、目的の温度まで、反応領域の温度を上昇させた後、照射強度の弱いマイクロ波を、間断なく照射することによっても、反応領域の温度を、目的の温度で、一定に保つことができる。 As shown in FIG. 2, when intermittently irradiating microwaves, the temperature of the reaction region can be kept constant by shortening the irradiation interval and gradually decreasing the irradiation intensity. It becomes. In addition, by raising the temperature of the reaction region once to the target temperature by microwave irradiation, and then irradiating microwaves with low irradiation intensity without interruption, the temperature of the reaction region can be reduced to the target temperature. Can be kept constant.
以上のようにマイクロ波の照射強度（照射エネルギー）、照射時間、照射間隔、照射タイミング、等を適宜調節することにより、反応領域の温度を調節することが可能となる。 As described above, the temperature of the reaction region can be adjusted by appropriately adjusting the microwave irradiation intensity (irradiation energy), irradiation time, irradiation interval, irradiation timing, and the like.
(バイオアッセイ用基板)
図３は、バイオアッセイ用基板１の上面及び断面を模式的に示した図である。このバイオアッセイ用基板１は、ＣＤ（Compact Ｄｉｓｃ）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等の光ディスクと同様に、主面が円形の平板状の形状をしており、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円板状に成形可能な合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって形成される。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来のガラスチップに比して低ランニングコストを実現できる。なお、バイオアッセイ用基板１は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等に用いるものであり、図３のバイオアッセイ用基板１の形状、材料に限定されるわけではなく、バイオアッセイのために用いられる基板を広く包含する。
(Bioassay substrate)
FIG. 3 is a diagram schematically showing an upper surface and a cross section of the bioassay substrate 1. This bioassay substrate 1 has a flat plate shape with a circular main surface, like an optical disc such as a CD (Compact Disc) and a DVD (Digital Versatile Disc), and is composed of quartz glass, silicon, polycarbonate, polystyrene, It is formed of a synthetic resin that can be molded into a disc shape, preferably a synthetic resin that can be injection molded. By using an inexpensive synthetic resin substrate, a low running cost can be realized as compared with a conventional glass chip. The bioassay substrate 1 is used for a DNA chip, protein chip, etc., and is not limited to the shape and material of the bioassay substrate 1 in FIG. Widely encompass.
バイオアッセイ基板１の中心には、中心孔１１が形成されている。中心孔１１には、バイオアッセイ基板１がバイオアッセイ装置に装着されたときに、バイオアッセイ基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構等が挿入される。 A central hole 11 is formed at the center of the bioassay substrate 1. A chucking mechanism or the like for holding and rotating the bioassay substrate 1 is inserted into the center hole 11 when the bioassay substrate 1 is mounted on the bioassay device.
バイオアッセイ基板１の円形の主面は、半径方向に同心円状に形成された記録部位３及び反応部位４の２つの部位に分けられている。本例では、記録部位３が内周側に位置し、反応部位４が外周側に位置している。記録部位３は、光ディスク情報記録媒体と同様に、レーザ光を照射して光学的に情報の記録再生がされる部位である。反応部位４は、検出用物質と標的物質との相互反応（ハイブリダイゼーション等）の場となる部位である。
The circular main surface of the bioassay substrate 1 is divided into two parts, a
バイオアッセイ基板１の層構造は、図３に示すように、情報層５と反応層６とから形成されている。ここでは、情報層５が下層、反応層６が上層に位置するものとする。また、バイオアッセイ基板１の反応層６側の表面を上面１ａ、情報記録層５側の表面を下面１ｂというものとする。
The layer structure of the bioassay substrate 1 is formed of an
情報層５には、記録部位３に対応する部位に、例えば、ピットや相変化材料等のレーザ光が照射されることによりデータの再生又は記録再生がされる信号記録膜７が形成されている。このような信号記録膜７は、ＣＤ、ＤＶＤ等の光ディスクと同様のディスク作成方法により形成することができる。
The
信号記録膜７は、バイオアッセイ基板１の下面１ｂ側からレーザ光を照射することにより、信号の再生又は記録再生がされる。また、情報層５は、解析時に照射される励起光及び制御光、並びに、解析時に蛍光標識剤Ｌから発光される蛍光の波長を透過する材料により形成されている。例えば、情報層５は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の材料で形成されている。なお、励起光、制御光及び蛍光については詳細を後述する。
The
バイオアッセイ用基板１の上面（主面）には、裏面方向に微細にくぼんだ反応領域１２が集積している。この反応領域１２は、検出用物質と標的物質との間の相互作用の場となる領域であり、例えば、ＤＮＡチップの場合は、プローブＤＮＡ（検出用物質、検出用ヌクレオチド鎖）とサンプルＤＮＡ（標的物質、標的ヌクレオチド鎖）との相互反応の場、具体的にはハイブリダイゼーション反応の場となる領域である。
On the upper surface (main surface) of the bioassay substrate 1,
図４は、バイオアッセイ用基板１上の反応領域１２の一つを模式的に示した断面模式図である。バイオアッセイ用基板１の主面からくぼんだ形状になっている反応領域１２には、相互作用する物質の安定性を保ち、また、相互作用を効率的に起こすため、緩衝液やゲル等の媒質を容れることができるようになっている。
FIG. 4 is a schematic cross-sectional view schematically showing one of the
そして、例えば、バイオアッセイ用基板１をＤＮＡチップ等として用いる場合、反応領域１２の底面１３に、検出用物質に用いる核酸の一端を固定化させるための材料を用いることができる。例えば、図４のように、シランにより表面修飾可能なＳｉＯ２を、スパッタリングや電子ビーム蒸着により５０ｎｍ程度の厚さに成膜して、底面１３に層状に形成することができる。これにより、ＮＣＯ基で一端が修飾された核酸を、反応領域１２の底面１３に結合させることができる。その他、ストレプトアビジンによって底面１３を処理した場合には、ビオチン化されたヌクレオチド鎖の固定化に適する。また、核酸の末端に磁気ビーズを取り付け、裏面から磁石等で当該ヌクレオチド鎖を一時的に固定するようにすれば、表面処理を特段施す必要もない。
For example, when the bioassay substrate 1 is used as a DNA chip or the like, a material for immobilizing one end of a nucleic acid used as a detection substance on the
例えば、以上のような処理を施すことにより、反応領域１２の底面１３に、図５のように、検出用物質として用いる核酸Ｎを固定化することができる。そして、反応領域１２に、標的物質Ｎ’を含有する試料溶液等を滴下すると、検出用物質Ｎと標的物質Ｎ’が相互作用（ハイブリダイゼーション）を起こし、目的の相互作用を検出することができる。
For example, the nucleic acid N used as the detection substance can be immobilized on the
なお、例えば、媒質にゲルを用いる場合には、検出用物質は、ゲル内に閉じ込めておけばよいので、必ずしも、検出用物質を底面１３に固定化する必要はない。従って、本発明は、前記のような、底面１３に検出用物質を限定するものに限定されない。また、前記した例は、ＤＮＡチップを用いたものであるが、本発明は、ＤＮＡチップに限定されるわけでなく、プロテインチップを始め、バイオアッセイに用いられる基板を広く包含する。特に、本発明に係るバイオアッセイ用基板１は、媒質にゲル等を用いることもできるため、タンパク質やその他の高分子、低分子の物質等、底面１３に固定化しにくいものについても、ゲル等に閉じ込めることにより、反応領域１２に固定できるという利点を有する。
For example, when a gel is used as the medium, the detection substance only needs to be confined in the gel, and therefore it is not always necessary to immobilize the detection substance on the
（バイオアッセイ装置）
次に、上述したバイオアッセイ用基板１を用いて、物質間の相互作用を解析するバイオアッセイ装置２について、図６を参照して説明をする。
(Bioassay device)
Next, a
バイオアッセイ装置２は、図６に示すように、バイオアッセイ用基板１の反応領域１２に対してマイクロ波を照射するマイクロ波照射部２１と、バイオアッセイ用基板１を保持して回転をさせるディスク装填部２２と、ハイブリダイゼーション等の相互作用のための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ用基板１の反応領域１２にその溶液を滴下する滴下部２３と、バイオアッセイ用基板１の反応領域１２から励起光を検出するための励起光検出部２４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部２５と、バイオアッセイ用基板１の信号記録膜７に対して信号の記録再生を行う記録再生部２６と、インターネットに接続するためのインターネット接続機能２７と、マイクロ波照射部２１、記録再生部２６、インターネット接続機能２７等を制御して、装置Ｍを統合し、所定のデータ処理等を行う制御部２８とを備えている。
As shown in FIG. 6, the
マイクロ波照射部２１は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の上方側、すなわち、上面１ａ側に配置されている。マイクロ波照射部２１は、バイオアッセイ用基板１の上面１ａに設けられている反応領域１２に向けて、マイクロ波を照射する。
The
ディスク装填部２２は、バイオアッセイ用基板１の中心孔１１内に挿入してバイオアッセイ用基板１を保持するチャッキング機構３１と、チャッキング機構３１を駆動することによりバイオアッセイ用基板１を回転させるスピンドルモータ３２と有している。ディスク装填部２２は、上面１ａ側が上方向となるようにバイオアッセイ用基板１を水平に保持した状態で、バイオアッセイ用基板１を回転駆動する。
The
滴下部２３は、試料溶液を貯留する貯留部３３と、貯留部３３内の試料溶液をバイオアッセイ用基板１に滴下する滴下ヘッド３４とを有している。滴下ヘッド３４は、水平に装填されたバイオアッセイ用基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド３４は、図３記載のバイオアッセイ用基板１のアドレスピット９から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアッセイ用基板１との相対位置を半径方向に制御し、プローブＤＮＡ（Ｎ）、サンプルＤＮＡ（Ｎ’）又は蛍光標識剤Ｌを含有する試料溶液を所定の反応領域１２に正確に追従して滴下する構成とされている。
The dropping
励起光検出部２４は、（１）光学ヘッド４０、（２）励起光Ｐを出射する励起光源４４と、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ４５と、コリメータレンズ４５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー４３に照射する第１のダイクロックミラー４６とからなる部分、（３）蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード４７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ４８と、光学ヘッド４０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード４７に照射する第２のダイクロックミラー４９とからなる部分、（４）制御光Ｖを出射する制御光源５０と、制御光源５０から出射された制御光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ５１と、制御光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路５２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路５２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ５３と、制御光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ５４とからなる部分、からなる。
The
光学ヘッド４０は、対物レンズ４１と、対物レンズ４１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ４２と、導光ミラー４３とを有している。対物レンズ４１は、その中心軸がバイオアッセイ用基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ４２に支持されている。従って、対物レンズ４１は、バイオアッセイ基板１の下方側から入射された光束を当該バイオアッセイ用基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ４２は、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ用基板１の半径方向の２方向に対物レンズ４１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ４２を駆動することにより、対物レンズ４１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ用基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。従って、この光学ヘッド４０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
The
導光ミラー４３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド４０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー４３には、励起光Ｐ及び制御光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー４３は、励起光Ｐ及び制御光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ４１に入射する。対物レンズ４１に入射された励起光Ｐ及び制御光Ｖは、当該対物レンズ４１により集光されてバイオアッセイ用基板１に照射される。また、導光ミラー４３には、蛍光Ｆ及び制御光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ用基板１から対物レンズ４１を介して入射される。導光ミラー４３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。なお、光学ヘッド４０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ４２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部２５から与えられる。
The
励起光源４４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源４４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４５は、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー４６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及び制御光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー４６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ４５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー４３に励起光Ｐを照射している。
The
アバランジェフォトダイオード４７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード４７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ４８は、アバランジェフォトダイオード４７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー４９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第１のダイクロックミラー４６の後段に配置されている。従って、第２のダイクロックミラー４９には、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー４９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、制御光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー４９は、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ４８を介してアバランジェフォトダイオード４７に蛍光Ｆを照射する。
The
制御光源５０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、制御光Ｖの波長は、アドレスピット９が検出でき、且つ、信号記録膜７に対して情報の記録及び再生ができる波長に設定されている。さらに、制御光Ｖの波長は、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なった波長に設定されている。このような波長であれば、制御光Ｖの波長は、７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ５１は、制御光源５０から出射された制御光Ｖを平行光束にする。平行光束とされた制御光Ｖは光セパレータ５４に入射される。
The control
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及び、アドレスピット９の再生信号、並びに、信号記録膜７の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、制御光Ｖがバイオアッセイ用基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、制御光と同一の７８０ｎｍである。
The
なお、光学ヘッド４０によりバイオアッセイ用基板１の反応部位４（外周側の部位、図３参照）にレーザ光を照射している場合、フォーカスエラー信号は、対物レンズ４１により集光された光の合焦位置とバイオアッセイ用基板１の反応層６との位置ずれ量を示すエラー信号となり、位置決めエラー信号は、所定の反応領域１２の位置と焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号となる。光学ヘッド４０によりバイオアッセイ用基板１の記録部位３（内周側の部位、図３参照）にレーザ光を照射している場合、フォーカスエラー信号は、対物レンズ４１により集光された光の合焦位置と信号記録膜７との位置ずれ量を示すエラー信号となり、位置決めエラー信号は、信号記録膜７のトラック位置と焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号となる。
Note that when the
アドレスピット９の再生信号は、反応部位４（外周側の部位）にレーザ光を照射している場合のみに検出され、バイオアッセイ用基板１に記録されているアドレスピット９に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在、制御光Ｖを照射している反応領域１２を特定することができる。
The reproduction signal of the
信号記録膜７の再生信号は、記録部位３（内周側の部位）にレーザ光を照射している場合のみに検出され、信号記録膜７のトラックに記録されている情報内容を示す信号である。
The reproduction signal of the
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット９の再生信号を制御／サーボ部２５に供給する。
The
シリンドリカルレンズ５３は、フォトディテクト回路５２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路５２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
The
光セパレータ５４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面５４ａと１／４波長板５４ｂにより構成されている。光セパレータ５４では、１／４波長板５４ｂの逆側から入射された光を光分離面５４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板５４ｂ側から入射された場合には光分離面５４ａが反射する機能を有している。光セパレータ５４は、光分離面５４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第２のダイクロックミラー４９の後段に配置されている。従って、光セパレータ５４では、コリメータレンズ５１から出射された制御光Ｖを透過して光学ヘッド４０内の導光ミラー４３に対してその制御光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ５３介してフォトディテクト回路５２に反射光Ｒを照射する。
The optical separator 54 includes a
制御／サーボ部２５は、励起光検出部２４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット９の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
The control /
反応部位４（外周側の部位）にレーザ光を照射している場合には、制御／サーボ部２５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１と反応領域１２との間の間隔を制御し、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１と反応領域１２との半径方向の位置関係を制御し、アドレスピット９の再生信号に基づき光学ヘッド４０のスレッド移動制御を行って光学ヘッド４０を所定の半径位置に移動する。
When the reaction site 4 (outer side) is irradiated with laser light, the control /
記録部位３（内周側の部位）にレーザ光を照射している場合には、制御／サーボ部２５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１と信号記録膜７との間の間隔を制御し、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１と信号記録膜７の記録トラックとの半径方向の位置関係を制御する。
When the recording part 3 (inner peripheral part) is irradiated with the laser beam, the control /
記録再生部２６は、情報記録層７に記録されているデータの再生信号の復調及び復号処理を行ってデータを出力するとともに、情報記録層７に記録する記録データの符号化及び変調を行う。記録再生部２６は、再生時には、励起光検出部２４から出力された再生信号が入力され、外部に復調及び復号したデータを出力する。また、記録再生部２６は、記録時には、外部から記録データが入力され、符号化及び変調がされたデータを励起光検出部２４に供給して、制御光Ｖを出射する制御光源５０を駆動する。
The recording / reproducing
インターネット接続機能２７は、予めバイオアッセイ用基板１のいずれかの領域に記録されたＵＲＬ情報や、図示しない入力手段により指示されたＵＲＬなどを用いて情報にアクセスするための機能である。
The
制御部２８は、図６に示すとおり、入力手段、表示手段を有し、マイクロ波照射部２１、記録再生部２６、インターネット接続機能部２７の制御を行う。
As shown in FIG. 6, the
マイクロ波照射部２１から照射されるマイクロ波の、照射強度（照射エネルギー）、照射時間、照射間隔、照射タイミング等は、制御部２８からの指示で調節されるように、設計する。
The irradiation intensity (irradiation energy), irradiation time, irradiation interval, irradiation timing, and the like of the microwave irradiated from the
記録再生部２６で読み出されたハイブリダイゼーション結果に基づく画像イメージを所定のフォーマット（例えばＪＰＧ）に圧縮し、記録再生部２６を介してバイオアッセイ基板１に記録する。また、インターネット接続機能２７を制御して関連情報を収集すると共に、そのデータも同様に記録する。
The image image based on the hybridization result read by the recording / reproducing
その他、バイオアッセイ用基板１がバイオアッセイ装置２に装着された際に、基板１が既に検査に使用されたか否かを書き込まれた情報から判断し、既に検査に使用されたと判断された場合には書き込まれている画像イメージや収集データを表示したり、再度当該基板を検査に使用する際には既に検査済みである警告を表示し、測定動作を制限したりすることができるように、制御部２８を、設計する。
In addition, when the bioassay substrate 1 is mounted on the
なお、検査に使用されたか否かを判断するために、３．５インチフロッピーディスク、ＭＤの書き込み済みを示すスイッチや、ビデオテープにおける消去防止用爪などを設けるようにしても良い。 In order to determine whether or not the disk has been used for inspection, a 3.5-inch floppy disk, a switch indicating that MD has been written, a claw for preventing erasure in a video tape, and the like may be provided.
以上のような構成のバイオアッセイ装置２では、例えば、ＤＮＡチップとして、核酸のバイオアッセイを行う場合には、次のような動作を行う。
In the
バイオアッセイ装置２は、バイオアッセイ基板１を回転させながら、図７に示すように反応領域１２にサンプルＤＮＡ（Ｎ’）が含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡ（Ｎ）とサンプルＤＮＡ（Ｎ’）とを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。
While rotating the bioassay substrate 1, the
ハイブリダイゼーション処理の済んだバイオアッセイ基板１上に蛍光標識剤Ｌを含んだバッファ溶液を滴下して、図７に示すようにプローブＤＮＡ（Ｎ）とサンプルＤＮＡ（Ｎ’）との二重らせん内に蛍光標識剤Ｌを挿入する。また、バイオアッセイ装置２は、蛍光標識剤Ｌが滴下された後のバイオアッセイ用基板１を回転させ、励起光Ｐをバイオアッセイ用基板１の下面１ｂ側から入射させて反応領域１２内の蛍光標識剤Ｌに照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤Ｌから発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ用基板１の下方から検出する。
A buffer solution containing a fluorescent labeling agent L is dropped on the bioassay substrate 1 after the hybridization treatment, and as shown in FIG. 7, the probe DNA (N) and sample DNA (N ′) are in a double helix. Fluorescent labeling agent L is inserted into In addition, the
ここで、バイオアッセイ装置２では、励起光Ｐと制御光Ｖとを同一の対物レンズ４１を介してバイオアッセイ用基板１に照射している。そのため、バイオアッセイ装置２では、制御光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡ（Ｎ’）と結合したプローブＤＮＡ（Ｎ）を特定することができる。
Here, in the
その他、バイオアッセイ装置２は、励起光Ｐの出射を停止して、制御光Ｖのみを出射して、バイオアッセイ基板１を回転させながらサーボ制御を行い、信号記録膜７上のトラックに対して、データの記録又は再生を行うことができる。
In addition, the
（ＤＮＡ解析方法）
つぎに、物質間の相互作用を解析する方法の一例として、本発明をＤＮＡ解析方法に使用した場合を例に、説明をする。
(DNA analysis method)
Next, as an example of a method for analyzing an interaction between substances, a case where the present invention is used in a DNA analysis method will be described as an example.
まず、バイオアッセイ用基板１をバイオアッセイ装置２のディスク装填部２２に水平に装填する。次に、バイオアッセイ装置２により、アドレスピット９に基づく位置制御を行いながらバイオアッセイ用基板１を回転させ、滴下ヘッド３４から、一端がＮＣＯ基等で修飾されたプローブＤＮＡ（Ｎ）を含有した溶液を所定の反応領域１２に対して滴下する。このとき、１つのバイオアッセイ用基板１に対して、複数種類のプローブＤＮＡ（Ｎ）が滴下される。ただし、１つの反応領域１２内には１種類のプローブＤＮＡ（Ｎ）が入るようにする。なお、各反応領域１２にいずれの種類のプローブＤＮＡ（Ｎ）を滴下するかは、予め反応領域１２とプローブＤＮＡ（Ｎ）との対応関係を示す配置マップ等を信号記録膜７から読み出しておくか、インターネット接続機能２７を用いて情報収集しておき、その配置マップに基づき制御する。
First, the bioassay substrate 1 is horizontally loaded into the
続いて、バイオアッセイ用基板１の上面１ａ側から、電極を反応領域１２内の溶液に挿入して、１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を各反応領域１２に印加する。このように交流電界を印加すると、プローブＤＮＡ（Ｎ）がバイオアッセイ用基板１に対して垂直方向に伸張するとともに、プローブＤＮＡ（Ｎ）をバイオアッセイ用基板１に垂直方向に移動させて、予め表面修飾処理がされた底面１３に対して、プローブＤＮＡ（Ｎ）の修飾端を結合させ、反応領域１２内にプローブＤＮＡ（Ｎ）を固相化（固定化）することができる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa: “Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”, IEEE Transaction on Industrial Application Vol. 26,No26,P, 1165-1172(1900)参照）。
Subsequently, an electrode is inserted into the solution in the
続いて、バイオアッセイ装置２により滴下ヘッド３４からサンプルＤＮＡ（Ｎ’）が含有した溶液を、バッファ塩を含む溶液とともに、バイオアッセイ用基板１上の各反応領域１２に滴下する。
Subsequently, the solution containing the sample DNA (N ′) is dropped from the dropping
続いて、サンプルＤＮＡ（Ｎ’）の滴下後、バイオアッセイ用基板１の反応領域１２を、マイクロ波照射部２１を用いてマイクロ波を照射し、反応領域１２内を数十℃に加熱するとともに、加熱した状態のまま１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。このような処理をすると、サンプルＤＮＡ（Ｎ’）とプローブＤＮＡ（Ｎ）とが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡ（Ｎ’）がバイオアッセイ用基板１に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が対応したサンプルＤＮＡ（Ｎ’）とプローブＤＮＡ（Ｎ）とが同一の反応領域１２内にある場合には、それらがハイブリダイゼーションを起こす。
Subsequently, after the sample DNA (N ′) is dropped, the
続いて、ハイブリダイゼーションを起こさせた後に、バイオアッセイ装置２により、インターカレータ等の蛍光標識剤Ｌを、滴下ヘッド３４からバイオアッセイ用基板１の反応領域１２内に滴下する。このような蛍光標識剤Ｌは、ハイブリダイゼーションを起こしたプローブＤＮＡ（Ｎ）とサンプルＤＮＡ（Ｎ’）との二重らせんの間に挿入して結合する。
Subsequently, after causing hybridization, a fluorescent labeling agent L such as an intercalator is dropped from the dropping
続いて、バイオアッセイ用基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーションを起こしていない反応領域１２内のサンプルＤＮＡ（Ｎ’）及び蛍光標識剤Ｌを除去する。この結果、ハイブリダイゼーションを起こした反応領域１２内にのみ、蛍光標識剤Ｌが残存することとなる。
Subsequently, the
続いて、バイオアッセイ装置２により、制御光を用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらバイオアッセイ用基板１を回転させ、励起光Ｐを所定の反応領域１２に照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。
Subsequently, the
続いて、バイオアッセイ装置２は、バイオアッセイ用基板１上の各反応領域１２の位置と蛍光Ｆの発光の強度に応じた測定値を計算し、その結果及び撮像イメージをバイオアッセイ用基板１の信号記録膜７に記録して保存する。続いて、その測定値から標的物質の有無を判別し、ディスクイメージ上の判別マップを作成する。そして、その作成したマップ、並びに、各反応領域１２にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡ（Ｎ’）の塩基配列の解析を行う。この解析の結果を参照して、信号記録膜７に記録されているプローブＤＮＡ（Ｎ）と疾病との関係の情報に基づき、例えば疾病との関係等を解析してもよい。更にまた、バイオアッセイ用基板１に記録された遺伝子ネットワークに発現遺伝子を対応させ、その機能を図示するようにしても良い。
Subsequently, the
そして、バイオアッセイ装置２は、その解析結果や、検出した配置マップ等をバイオアッセイ用基板１の信号記録膜７に記録して保存する。
The
なお、本発明では光磁気ディスクを用いた円盤状のＤＮＡディスクを説明してきたが、形状は適宜適した形（例えば正方形、長方形、楕円形）にしても良い。また、ＤＮＡディスクに限らず、タンパク質その他の物質の相互作用の解析の場合にも、同様の方法を適宜使用することができる。その他、データ記録層として光磁気ディスクを用いた例を示していたが、所定の記録機能を有する磁気記録テープ、半導体メモリ（EEPROM やFRAM、MRAMなど）、印刷技術などを差し障りのない範囲で使用できるものとする。なお、マイクロ波の照射は、目的に応じて、適宜行うことができるものとし、マイクロ波を照射するタイミング、間隔、照射時間、照射エネルギー等は、場合に応じて、変化させることができる。 In the present invention, a disk-shaped DNA disk using a magneto-optical disk has been described. However, the shape may be appropriately set (for example, a square, a rectangle, or an ellipse). In addition to the DNA disk, the same method can be used as appropriate when analyzing the interaction of proteins and other substances. In addition, although an example using a magneto-optical disk as a data recording layer was shown, magnetic recording tape with a predetermined recording function, semiconductor memory (EEPROM, FRAM, MRAM, etc.), printing technology, etc. are used as long as there is no problem. It shall be possible. Note that the microwave irradiation can be appropriately performed according to the purpose, and the timing, interval, irradiation time, irradiation energy, and the like of the microwave irradiation can be changed according to circumstances.
本発明は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のバイオアッセイ用基板の反応領域に対して、マイクロ波を照射することにより、反応領域の温度を調整する方法である。バイオアッセイ用基板を用いて、検出・測定等を行う場合、反応を効率的に行う等のため、手順の中で温度調節が必要な場合が多い。従って、本発明により、簡便な検出・測定機器で、反応領域の温度調節を行うことができるようになるため、バイオアッセイ用基板の利用に関し、有用な技術である。 The present invention is a method of adjusting the temperature of a reaction region by irradiating microwaves to the reaction region of a bioassay substrate such as a DNA chip or a protein chip. When detection / measurement or the like is performed using a bioassay substrate, temperature adjustment is often required during the procedure in order to efficiently perform the reaction. Therefore, according to the present invention, the temperature of the reaction region can be adjusted with a simple detection / measurement instrument, which is a useful technique for using a bioassay substrate.
また、マイクロ波照射は、照射強度によっては、それ自体、反応領域内で行われる物質間の相互作用を促進する効果もあるため、バイオアッセイ用基板を用いた検出・測定を高感度で効率的なものにするうえでも、有用な技術である。 In addition, microwave irradiation itself has the effect of promoting interaction between substances in the reaction region depending on the irradiation intensity. Therefore, detection and measurement using a substrate for bioassay is highly sensitive and efficient. It is also a useful technique for making things easy.
さらに、本発明に係るバイオアッセイ装置は、マイクロ波照射手段を有するとともに、反応領域内の相互作用等の反応を高感度で検出・測定する機構を持つことから、産業上有用である。本装置は、マイクロ波照射を制御する手段、一連の検出・測定手順を管理・制御する手段、検出・測定したデータを加工したり記録したりする等の手段、インターネット接続手段等を有するため、一連の検出・測定手順を簡略化、自動化し、操作しやすいものになっている点で、産業上有用である。 Furthermore, the bioassay apparatus according to the present invention is industrially useful because it has a microwave irradiation means and a mechanism for detecting and measuring reactions such as interactions in the reaction region with high sensitivity. Since this apparatus has means for controlling microwave irradiation, means for managing and controlling a series of detection / measurement procedures, means for processing and recording detected / measured data, Internet connection means, etc. This is industrially useful in that a series of detection and measurement procedures are simplified, automated, and easy to operate.
１ バイオアッセイ用基板
１２ 反応領域
２ バイオアッセイ装置
２１ マイクロ波照射部
２３ 滴下部
２４ 励起光検出部
２８ 制御部
４４ 励起光源
４７ 光検出器
５２ フォトディテクト回路
Ｌ 蛍光標識剤
Ｎ プローブＤＮＡ（検出用物質）
Ｎ’ サンプルＤＮＡ（標的物質）
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Bioassay board |
N 'sample DNA (target substance)
Claims (9)
前記反応領域に対して標的物質を含むサンプル溶液を滴下する手段と、
前記反応領域に対するマイクロ波照射手段と、
前記マイクロ波の照射を制御する手段と、を少なくとも備えるバイオアッセイ装置。 An apparatus for detecting an interaction between substances using a bioassay substrate provided with a reaction region in which a substance for detection exists,
Means for dropping a sample solution containing a target substance to the reaction region;
Microwave irradiation means for the reaction region;
A bioassay device comprising at least means for controlling the microwave irradiation.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006322722A (en) * | 2005-05-17 | 2006-11-30 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Analyzer |
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2003
- 2003-09-19 JP JP2003327262A patent/JP2005091251A/en active Pending
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