JP2005065605A - Method for analyzing microorganism community - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物群集の解析方法に関し、より詳しくは、さまざまな環境系における微生物群集の概況を簡便に把握することができる微生物群集の解析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing a microbial community, and more particularly, to a method for analyzing a microbial community that can easily grasp an overview of a microbial community in various environmental systems.
古来から人間は、医薬、食品等の分野に微生物を利用してきた。特に、近年のバイオテクノロジーの進歩は、社会生活を豊かで快適なものとしている。また、微生物は有機物の分解者として重要な役割を果たしており、環境の保持に寄与している。しかし、近年では生活排水、工場排水等による富栄養化のため、生態系のバランスが崩れ、微生物の酸素消費による青潮や、病原菌の増殖など微生物に起因したり，微生物が深く関与している環境問題が深刻となっている。 Since ancient times, humans have used microorganisms in fields such as medicine and food. In particular, recent advances in biotechnology have made social life rich and comfortable. Microorganisms play an important role as organic matter decomposers and contribute to environmental preservation. However, in recent years, due to eutrophication due to domestic wastewater, factory wastewater, etc., the balance of the ecosystem has been lost, and due to microorganisms such as the blue tide due to oxygen consumption of microorganisms and the growth of pathogenic bacteria, microorganisms are deeply involved Environmental problems have become serious.
しかしながら、環境中の微生物は、培養が困難なものが多く、正確な群集構造の把握や、病原菌の検出が困難な場合が多い。 However, many microorganisms in the environment are difficult to cultivate, and it is often difficult to accurately grasp the community structure and detect pathogenic bacteria.
ところで、近年のＤＮＡの構造解析技術の急速な進展に伴い、微生物（例えば、大腸菌、枯草菌、ラン藻、超好熱菌、酵母など）、植物（例えばイネ、シロイヌナズナなど）、哺乳動物（例えばヒト、マウスなど）などの多くの生物種について、解析が進んだ。各種生物由来のゲノム塩基配列データベースは急ピッチに整備されてきており、これらの情報を利用した環境浄化への応用も期待されている。 By the way, with recent rapid progress in DNA structure analysis technology, microorganisms (eg, E. coli, Bacillus subtilis, cyanobacteria, hyperthermophilic bacteria, yeast, etc.), plants (eg, rice, Arabidopsis etc.), mammals (eg, Analysis has progressed for many biological species such as humans and mice. Databases of genome sequences derived from various organisms have been prepared at a rapid pace, and application to environmental purification using such information is also expected.
生態環境系おける微生物群の変化又は差異の検出については、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を抽出してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅し、濃度勾配電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｒａdｉｅｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、以下「ＤＧＧＥ」という）によって核酸の分離を行い、塩基配列を解析して、生態環境系の変化または差異を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。 For the detection of changes or differences in the microbial community in the ecological environment, 16S rRNA genes are extracted and amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) method, and then concentration gradient electrophoresis (hereinafter referred to as “DGGE”) is used. A method is known in which a nucleic acid is separated and a base sequence is analyzed to detect a change or difference in an ecological environment (for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
上記のような状況の下、本発明は、簡便に生態環境系内の微生物群集の状況を把握することができる、微生物群集の解析方法を提供することを課題とする。 Under the circumstances as described above, an object of the present invention is to provide a method for analyzing a microbial community that can easily grasp the state of a microbial community in an eco-environment system.
本発明者らは、上記目課題を解決すべく、鋭意研究を進めたところ、所定の試験対象区から微生物を採取して核酸を抽出・増幅し、これを変性高速液体クロマトグラフィー（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下「ＤＨＰＬＣ」という）により分離させて得られる結果により、微生物群集の概況を把握できることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-described problems. As a result, microorganisms are collected from a predetermined test area, nucleic acids are extracted and amplified, and this is subjected to denaturing high-performance liquid chromatography (Denaturing high- It was found that the general condition of the microbial community could be grasped from the results obtained by separation by performance liquid chromatography (hereinafter referred to as “DHPLC”), and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
〔１〕 試験対象区内に含まれる微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析する、微生物群集の解析方法。
〔２〕 前記所定部位が、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の少なくとも一部を含むことを特徴とする、上記〔１〕に記載の微生物群集の解析方法。
〔３〕 複数の異なる試験対象区ごとに、分離結果を対比させて解析することを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の微生物群集の解析方法。
〔４〕 同一の試験対象区について、経時的に対比させて分離結果を解析することを特徴とする、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔５〕 変性高速液体クロマトグラフィーにより得られるクロマトグラムの形状パターンを対比して、分離結果を解析することを特徴とする、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔６〕 変性高速液体クロマトグラフィーにより分離して得られる画分中に含まれる核酸の塩基配列を解析し、当該塩基配列を他の塩基配列と比較して、試験対象区内に含まれる微生物の種類を同定する、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔７〕 試験対象区についての分離結果を解析し、生態環境系の汚染原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の、微生物群集の解析方法。
〔８〕 試験対象区についての分離結果を解析し、アコヤガイの幼生原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
〔９〕 試験対象区内の海水を試験サンプルとし、海水中のＣＯ2濃度と、変性高速液体クロマトグラフィーによる試験対象区についての分離結果とを求め、式（１）に従って群集多様度Ｈ’を算出し、海水のＣＯ2濃度と微生物群集との関係を評価する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。
[1] Extract nucleic acids from the microorganisms contained in the test area, amplify a predetermined portion of the extracted nucleic acids, separate the amplified nucleic acids by denaturing high-performance liquid chromatography, and obtain the separation results for the test areas. Analyzing method of microbial community to analyze.
[2] The method for analyzing a microbial community according to [1] above, wherein the predetermined site includes at least a part of a region encoding 16S rRNA.
[3] The method for analyzing a microbial community according to [1] or [2], wherein the analysis is performed by comparing separation results for each of a plurality of different test target sections.
[4] The method for analyzing a microbial community according to any one of [1] to [3] above, wherein the separation results are analyzed with respect to the same test target section over time.
[5] The microbial community according to any one of [1] to [4], wherein the separation result is analyzed by comparing shape patterns of chromatograms obtained by denaturing high performance liquid chromatography. Analysis method.
[6] Analyze the base sequence of the nucleic acid contained in the fraction obtained by separation by denaturing high performance liquid chromatography, compare the base sequence with other base sequences, and identify the microorganisms contained in the test target zone. The method for analyzing a microbial community according to any one of [1] to [5] above, wherein the type is identified.
[7] The method for analyzing a microbial community according to any one of [1] to [6], wherein the separation result of the test target area is analyzed to detect the causative bacteria of the ecological environment.
[8] The method for analyzing a microbial community according to any one of the above [1] to [6], wherein the separation result of the test target section is analyzed to detect the larvae causative fungus of the pearl oyster.
[9] Using seawater in the test area as a test sample, obtain the CO 2 concentration in the seawater and the separation results for the test area by denaturing high performance liquid chromatography, and calculate the community diversity H ′ according to equation (1). The method for analyzing a microbial community according to any one of [1] to [6], wherein the method calculates and evaluates a relationship between a CO 2 concentration in seawater and a microbial community.
〔１０〕 試験対象区についての分離結果を解析し、活性汚泥中の酸敗原因菌を検出する、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載の微生物群集の解析方法。 [10] The method for analyzing a microbial community according to any one of [1] to [6] above, wherein the result of separation of the test target section is analyzed to detect a causative agent in the activated sludge.
本発明によれば、微生物群集の概況を簡便に解析することができる。本発明は、微生物に関連する様々な生態環境解析に極めて好適である。より具体的には、本発明は、農林業関連、漁業関連、環境汚染調査、環境モニタリングなどにおける微生物の解析に極めて有用である。 According to the present invention, the general condition of the microbial community can be easily analyzed. The present invention is extremely suitable for various ecological environment analyzes related to microorganisms. More specifically, the present invention is extremely useful for analysis of microorganisms in agriculture and forestry-related, fishery-related, environmental pollution investigation, environmental monitoring and the like.
本発明の微生物群集の解析方法は、試験対象区内に含まれる微生物から核酸を抽出し、抽出された核酸の所定部位を増幅し、増幅した核酸を変性高速液体クロマトグラフィーで分離処理し、試験対象区についての分離結果を解析する。試験対象区とは、試験の対象とする区域・領域であり、空間的なものも平面的なものも含まれる。試験対象区は、解析を行う者（以下「試験者」という）の任意であり、例えば、海、河川、湖沼、土壌、森林などの屋外環境的な領域を試験対象区としてもよいし、また工場、研究所、家屋などの室内を試験対象区としてもよい。試験対象区内に含まれる微生物を得る方法は特に限定されない。例えば、試験対象区内に含まれる微生物を得るために、試験対象区から微生物が存在する試験サンプルを採取する。具体的には、上記のような試験対象区から採取される、水、土、空気などを試験サンプルとすることができる。 The method for analyzing a microbial community of the present invention comprises extracting nucleic acids from microorganisms contained in a test area, amplifying a predetermined portion of the extracted nucleic acids, separating the amplified nucleic acids by denaturing high-performance liquid chromatography, Analyze the separation results for the target area. The test area is an area / area to be tested, and includes both a spatial area and a planar area. The test target area is arbitrary for the person who performs the analysis (hereinafter referred to as “tester”). For example, an outdoor environmental area such as the sea, river, lake, soil, forest, etc. may be the test target area. Indoors such as factories, laboratories, and houses may be used as test areas. The method for obtaining the microorganisms contained in the test area is not particularly limited. For example, in order to obtain a microorganism contained in the test target area, a test sample in which the microorganism is present is collected from the test target area. Specifically, water, soil, air or the like collected from the test target section as described above can be used as the test sample.
試験サンプルから、そこに含まれている微生物の核酸を抽出する。核酸は、二本鎖ポリヌクレオチドとして回収することが好ましい。核酸の抽出方法は、定法によればよく、例えば、濾過、培養、遠心、溶解等を行い、回収できる。なお、本明細書において核酸とは、ポリヌクレオチドのことであり、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。また、ポリヌクレオチドとは、少なくとも２以上のヌクレオチドが結合した高分子をいう。 From the test sample, the nucleic acid of the microorganism contained therein is extracted. The nucleic acid is preferably recovered as a double-stranded polynucleotide. The nucleic acid extraction method may be a conventional method, and can be collected by filtration, culture, centrifugation, lysis and the like, for example. In the present specification, the nucleic acid refers to a polynucleotide, and includes DNA and RNA. Polynucleotide refers to a polymer in which at least two or more nucleotides are bound.
なお、本発明における遺伝子工学的な処理、例えば、核酸、タンパク質、プラスミド、種々の酵素、形質転換体などの調製、形質転換体の選抜、ＰＣＲ法などの諸操作については、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、1989、COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、それらを参照して行えばよい。 The genetic engineering treatment in the present invention, such as preparation of nucleic acids, proteins, plasmids, various enzymes, transformants, etc., selection of transformants, PCR methods, etc., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, edited by J. Sambrook et al., 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, new genetic engineering handbook revised third edition, edited by Muramatsu et al., Yodosha (1999), etc. You can refer to them.
抽出された核酸の所定部位を増幅する。核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法により、容易に行うことができる。また、核酸をＧＣクランプを用いてさらに増幅してもよい。 A predetermined site of the extracted nucleic acid is amplified. Nucleic acid amplification can be easily performed, for example, by PCR. In addition, the nucleic acid may be further amplified using a GC clamp.
増幅する部位は、解析の目的などに応じて適宜調整可能であるが、一つの基準としては、微生物群に共通して存在している領域であり、かつ、種または属などの違いを反映しているなどの条件を満たすことが好ましい。微生物群に共通している領域を用いることにより、試験対象区内に存在することが予測される微生物の種類ごとに増幅部位を調整する手間を減らし、微生物の種類にかかわらず、１サンプルにつき特定のプライマーを用いて増幅することができる。また、種や属などの違いにより異なる配列を有する領域であれば、微生物群の選別を明確にできる。増幅する所定部位として、例えば、好ましくは１６Ｓ ｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ＤＮＡ ｇｙｒａｓｅ Ｂなどが挙げられる。１６Ｓ ｒＲＮＡは、原核生物などに代表される微生物のほとんどが有しており、また種または属ごとの保存安定性が良いため、多数の微生物種が混在するサンプルについて、微生物群集の状況に関する定性的、定量的な解析を行うのに適している。なお、上記のような目的を達するために、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域すべてを増幅してもよいし、または、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域の一部を増幅してもよい。 The site to be amplified can be adjusted as appropriate according to the purpose of the analysis, but one criterion is that it is a region that exists in common with microbial groups and reflects differences in species or genera. It is preferable to satisfy the conditions such as By using an area common to microbial groups, the effort to adjust the amplification site for each type of microorganism that is expected to exist in the test area is reduced, and it is specified for each sample regardless of the type of microorganism. Amplification can be performed using the primers. In addition, if the region has a different sequence depending on the species or genus, the microorganism group can be clearly selected. Examples of the predetermined site to be amplified preferably include 16S rRNA, 23S rRNA, DNA gyase B, and the like. 16S rRNA has most of the microorganisms represented by prokaryotes and the like, and has good storage stability for each species or genus. Suitable for performing quantitative analysis. In order to achieve the above object, the entire region encoding 16S rRNA may be amplified, or a part of the region encoding 16S rRNA may be amplified.
次に、増幅した核酸をＤＨＰＬＣによって分離する。ＤＨＰＬＣによる分析条件等は、適宜調整してよい。分析条件の設定、操作は、ＤＨＰＣＬの通常の手法により適宜定められる。例えば、解析温度や濃度勾配などの条件により調整し、溶出時間の差を調整することができる。ＤＨＰＬＣによる核酸の分離は、二本鎖核酸配列の違いによる分離性能が高く、また再現性もよいため、微生物群の解析を的確に行うことができる。また、ＤＨＰＬＣに関しては、文献：Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhog Xiao et al, HUMAN MUTATION 17:439-474(2001)などを参照してよい。 The amplified nucleic acids are then separated by DHPLC. The analysis conditions by DHPLC may be adjusted as appropriate. The setting and operation of analysis conditions are appropriately determined by the usual DHPCL method. For example, the difference in elution time can be adjusted by adjusting according to conditions such as analysis temperature and concentration gradient. Nucleic acid separation by DHPLC has high separation performance due to the difference in double-stranded nucleic acid sequences and good reproducibility, so that the analysis of the microorganism group can be performed accurately. Regarding DHPLC, the literature: Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A Review, Wenzhog Xiao et al, HUMAN MUTATION 17: 439-474 (2001) may be referred to.
ＤＨＰＬＣの結果を基に試験対象区についての分離結果を解析する。ＤＨＰＬＣの結果は、例えばクロマトグラムとして表され、クロマトグラムの形状パターンを、分離結果を解析することにより、微生物群の解析を行うことができる。クロマトグラムの形状パターンは、そのピーク位置、高さ、数などとして構成され、特定の点に着目して解析してもよいし、また、クロマトグラム全体像として解析することもできる。また、予め微生物種などに特異的なクロマトグラムの形状パターンを調査しておき、これと対比して、試験対象区内に存在する微生物種の概要を把握することも可能である。また、クロマトグラムの形状パターンと、特定の環境現象との関係を予め調査しておき、これに基づいて、環境状況の把握、環境変化の予測を行うこともできる。 Based on the results of DHPLC, the separation results for the test area are analyzed. The result of DHPLC is expressed as, for example, a chromatogram, and the microorganism group can be analyzed by analyzing the separation result of the chromatogram shape pattern. The shape pattern of the chromatogram is configured as its peak position, height, number, etc., and may be analyzed by paying attention to a specific point, or may be analyzed as an entire chromatogram image. It is also possible to investigate the shape pattern of the chromatogram specific to the microorganism species in advance and to grasp the outline of the microorganism species existing in the test target area. In addition, the relationship between the chromatogram shape pattern and a specific environmental phenomenon is investigated in advance, and based on this, it is possible to grasp the environmental situation and predict environmental changes.
ＤＨＰＬＣによる分離結果に基づいて微生物群の解析を行う限り、分離結果に基づく微生物群の解析の手法は特に限定されるものはないが、好ましい形態としては例えば、以下のような解析方法が挙げられる。例えば、複数の異なる試験対象区ごとに、分析結果を対比させて解析する形態が挙げられる。このようにすることにより、各試験対象区の違いを解析することができる。また、少なくとも１つ正常区の分析結果を得ておくことにより、他の試験対象区が正常であるか、何らかの異常を生じているかなどを判断あるいは予測することができる。 As long as the analysis of the microorganism group is performed based on the separation result by DHPLC, the method of analyzing the microorganism group based on the separation result is not particularly limited, but preferred examples include the following analysis methods. . For example, the form which compares and analyzes an analysis result for every several different test object section is mentioned. By doing in this way, the difference of each test object section can be analyzed. Further, by obtaining the analysis result of at least one normal section, it is possible to judge or predict whether another test target section is normal or some abnormality has occurred.
また、他の解析形態としては、同一の試験対象区について、経時的に対比させて分離結果を解析する形態が例示される。このように解析することにより、経時的な微生物群の変動を把握することができ、環境モニタリングなどとして好適である。 Moreover, as another analysis form, the form which analyzes a separation result by comparing with time about the same test object section is illustrated. By analyzing in this way, it is possible to grasp the fluctuation of the microorganism group over time, which is suitable for environmental monitoring and the like.
また、本発明の解析方法の他の実施形態として、ＤＨＰＬＣにより分離して得られる画分中に含まれる核酸の塩基配列を解析し、当該塩基配列を他の塩基配列と比較して、試験対象区内に含まれる微生物種を同定する形態が挙げられる。塩基配列の解析は、サンガー法、マクサム・ギルバート法、またはこれらの改変法などの定法によって行うことができる。得られた塩基配列のデータは、既知の各種データベースを利用して、既知の配列との相同性（ホモロジー）などのパラメータに基づき、微生物の種類を特定する。核酸またはアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratry, EMBL nucleic acid sequence data library）、ＧｅｎＢａｎｋ（Genetic sequence data bank）などのデータベースを利用する。 Further, as another embodiment of the analysis method of the present invention, the base sequence of the nucleic acid contained in the fraction obtained by separation by DHPLC is analyzed, the base sequence is compared with other base sequences, and the test object The form which identifies the microbial species contained in a ward is mentioned. The analysis of the base sequence can be performed by a conventional method such as the Sanger method, the Maxam-Gilbert method, or a modified method thereof. The obtained base sequence data uses various known databases to identify the type of microorganism based on parameters such as homology with known sequences. The database of nucleic acids or amino acids is not particularly limited. For example, DDBJ (DNA Data Bank of Japan), EMBL (European Molecular Biology Laboratory, EMBL nucleic acid sequence data library), GenBank (Genetic sequence data bank) Use a database such as
本発明の方法は、生態環境系の汚染原因菌の検出に特に有効である。すなわち、その生態環境系に微生物に起因する汚染が生じた場合、そのような汚染が生じていない生態環境系と対比することにより、汚染原因菌を検出することができる。例えば、養殖中のアコヤガイの幼生が大量に斃死したとき、その原因が特定微生物の増殖によるものである場合には、該特定微生物を検出することができる。また、本発明の方法は、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響の評価手法などの環境評価法としても適用することができる。本発明の解析方法にそってＤＨＰＬＣを用いて分析し、ＤＨＰＬＣのピーク数、ピーク強度から群集多様度を求めることにより、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響を評価することができる。また、活性汚泥を利用したメタン発酵においては、酸敗がメタン発酵装置の安定運転を妨げる原因となっている。ここで、正常状態における塩基配列のデータベースを蓄積しておき、酸敗が発生したときの塩基配列のデータと対比することにより、酸敗関連微生物を検出することができる。メタン発酵装置運転中は、酸敗関連微生物の動向をＰＣＲ等でモニタリングし、検出された場合には発酵の負荷を減少させることで酸敗を防止し、安定運転を行うことが可能となる。 The method of the present invention is particularly effective for detecting the causative bacteria of the eco-environment system. That is, when contamination due to microorganisms occurs in the ecological environment, the causative bacteria can be detected by comparing with the ecological system in which such contamination does not occur. For example, when a large number of larvae of pearl oysters that have been cultured are drowned, the specific microorganism can be detected if the cause is due to the growth of the specific microorganism. The method of the present invention can also be applied as an environmental evaluation method such as a method for evaluating the influence of CO 2 ocean sequestration on the ecosystem. By analyzing using DHPLC according to the analysis method of the present invention and obtaining the community diversity from the number of peaks and peak intensity of DHPLC, the influence of CO 2 ocean sequestration on the ecosystem can be evaluated. Moreover, in methane fermentation using activated sludge, rancidity is a cause of hindering stable operation of the methane fermentation apparatus. Here, by accumulating a base sequence database in a normal state and comparing it with the base sequence data at the time of the occurrence of the spoilage, the spoilage related microorganism can be detected. During operation of the methane fermentation apparatus, the trend of spoilage-related microorganisms is monitored by PCR or the like, and when detected, it is possible to prevent the spoilage by reducing the fermentation load and to perform stable operation.
次に、本発明の微生物群の解析方法を適用した実施形態についてより具体的に例示する。
（アコヤガイの幼生大量斃死原因菌の推定）
アコヤガイ幼生大量弊死海水と正常海水とを試験サンプルとして採取し、これらの試験サンプルそれぞれについて核酸を抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡに含まれる１６ＳＶ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣに供して、それぞれの試験サンプルについてピークパターンを得る。
Next, the embodiment to which the method for analyzing a microorganism group of the present invention is applied will be illustrated more specifically.
(Estimation of large-scale moribund mortality of pearl oysters)
A large amount of pearl oyster larvae dead seawater and normal seawater are collected as test samples, nucleic acids are extracted from each of these test samples, and a DNA fragment containing the 16SV3 region contained in 16S rRNA is amplified. The amplified DNA fragment is subjected to DHPLC to obtain a peak pattern for each test sample.
アコヤガイ幼生大量弊死海水と正常海水中のバクテリア群集構造をピークパターンにより比較し、アコヤガイ幼生大量弊死海水中に特徴的なピークが検出された画分を回収する。回収した画分に含まれるＤＮＡ断片をシークエンスし、塩基配列をデータベースを利用して解析することにより、例えばVibrio pectenicidaなどのバクテリアがアコヤガイ幼生大量弊死海水の試験サンプル中に含まれているなどのように、アコヤガイ幼生大量弊死海水の原因と関連すると推定されるバクテリアを特定できる。 Bacterial community structures in oyster larvae mass killed seawater and normal seawater are compared with peak patterns, and fractions in which characteristic peaks are detected in pearl oyster larvae mass killed seawater are collected. By sequencing the DNA fragments contained in the collected fractions and analyzing the nucleotide sequence using a database, for example, bacteria such as Vibrio pectenicida are included in the test sample of pearl oyster larvae mass killed seawater In this way, it is possible to identify bacteria that are presumed to be associated with the cause of a large amount of pearl oyster larvae.
このように原因と推定されるバクテリアが特定されることにより、そのバクテリアに特有のＤＮＡ領域とハイブリダイズするポリヌクレオチド断片を調製し、他の海水試験サンプルについて蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization）を行うことにより、前もってアコヤガイ幼生大量弊死を予測することが出来るため、アコヤガイ幼生を正常な海水に移動させれば大量弊死を防ぐことが出来る。例えば、Vibrio pectenicidaを検出するための塩基配列としては、：5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号１）を用いることができ、このＤＮＡ断片を用いて蛍光イン・サイチュー・ハイブリダイゼーションを行う。また、Vibrio pectenicidaの検出には、5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号２）を固定したＤＮＡマイクロアレイもしくはフォワードプライマー（forward primer） 5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3'（配列番号３）、リバースプライマー（riverse primer） 5'-ATCACCGGCAGTCTCCCTGG-3'（配列番号４）を用いてＰＣＲを行うことでも可能である。 Thus, by identifying the bacteria presumed to be the cause, a polynucleotide fragment that hybridizes with a DNA region unique to the bacteria is prepared, and fluorescence in situ hybridization (Fluorescence in situ hybridization is performed on other seawater test samples. By performing in situ hybridization, it is possible to predict the mass mortality of the pearl oyster larvae in advance, so that the mass mortality can be prevented by moving the pearl oyster larvae to normal seawater. For example, as a nucleotide sequence for detecting Vibrio pectenicida: 5′-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) can be used, and fluorescence in situ hybridization is performed using this DNA fragment. For detection of Vibrio pectenicida, DNA microarray or forward primer (forward primer) 5'-CTTTTGTTTGTAATGAACGG-3 '(SEQ ID NO: 3), reverse primer (riverse) primer) PCR is also possible using 5'-ATCACCGGCAGTCTCCCTGG-3 '(SEQ ID NO: 4).
（ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響の評価）
近年、大気中のＣＯ2濃度上昇に伴う地球温暖化の問題がクローズアップされているところ、その解決手段の１つとして、ＣＯ2海洋隔離（Ｏｃｅａｎ Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＯ2）技術の研究開発が進められている。ＣＯ2海洋隔離技術は大気中のＣＯ2を海水中に投入することにより大気中のＣＯ2濃度の上昇を抑制しようとする技術である（第１５回海洋工学シンポジウム（日本造船学会）講演集、「海洋生態系に対するＣＯ2影響調査のためのメソコスム実験」、平成１２年１月２０、２１日など参照）。
(Evaluation of the impact of CO 2 ocean sequestration on the ecosystem)
Recently, when the global warming caused by CO 2 concentration increases in the atmosphere problem has been highlighted, As one of the solutions, the research and development of CO 2 Ocean Sequestration (Ocean Sequestration of CO 2) technology is advanced ing. CO 2 ocean sequestration technology is a technology that attempts to suppress the rise in atmospheric CO 2 concentration by introducing atmospheric CO 2 into seawater (The 15th Ocean Engineering Symposium (Japan Shipbuilding Society) Lectures, (See “Mesocosm Experiments for Investigation of CO 2 Effects on Marine Ecosystems”, January 20, 21 and 2000).
本発明の微生物群集の解析方法は、海水中のＣＯ2濃度差による微生物群集への影響を評価する方法に適用することができ、より具体的な適用例として、ＣＯ2海洋隔離の生態系への影響評価に用いることができる。 The microbial community analysis method of the present invention can be applied to a method for evaluating the influence on the microbial community due to the difference in CO 2 concentration in seawater. As a more specific application example, to an ecosystem of CO 2 ocean sequestration Can be used to evaluate the impact of
海水中のＣＯ2濃度差による微生物群集への影響の評価は、例えば、次のように行うことができる。まず、試験サンプルとなる海水を用意する。試験サンプルは海から採取したそのものについてＣＯ2を測定しておいてもよいし、また、予めＣＯ2を所定の濃度に調整して複数のＣＯ2濃度の試験サンプルを調製し、シミュレーションするように設定してもよい。他方、所定のＣＯ2濃度の海水の微生物群集の状態を解析するために、試験サンプル（海水）から核酸を抽出し、１６ＳＶ３領域をＰＣＲ法で増幅し、増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣで分離して、その結果を解析する。 The evaluation of the influence on the microbial community due to the difference in CO 2 concentration in seawater can be performed, for example, as follows. First, seawater is prepared as a test sample. As for the test sample, CO 2 may be measured for the sample taken from the sea, or a test sample having a plurality of CO 2 concentrations prepared by adjusting CO 2 to a predetermined concentration in advance may be simulated. It may be set. On the other hand, in order to analyze the state of microbial communities in seawater with a predetermined CO 2 concentration, nucleic acids are extracted from the test sample (seawater), the 16SV3 region is amplified by the PCR method, and the amplified DNA fragments are separated by DHPLC. Analyze the results.
解析手法の具体例としては、ＤＨＰＬＣのピーク数、ピーク強度から群集多様度（例えば、Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｅａｖｅｒ ｉｎｄｅｘ Ｈ’）を求め、影響の程度を推定する方法などが例示される。群集多様度：Ｈ’は、ピーク数：Ｄ、Ｄ個のピークの高さの合計に占めるｉ番目のピーク高さの割合をａiとして、下記式１に基づいて計算する。Ｈ’の数値が高いほど微生物群集の多様性が高いことを示し、Ｈ’の数値が低いほど微生物群集の多様性が低いことが推定される。Ｈ’の数値とＣＯ2濃度とを照らし合わせることにより、海水中のＣＯ2濃度の微生物群集に対する影響を評価することができる。 As a specific example of the analysis technique, a method of obtaining a crowd diversity (for example, Shannon-Weaver index H ′) from the number of DHPLC peaks and peak intensity and estimating the degree of influence is exemplified. Crowd diversity: H ′ is calculated based on Equation 1 below, where a i is the ratio of the i-th peak height to the total number of peaks: D and D peaks. It is estimated that the higher the value of H ′, the higher the diversity of the microbial community, and the lower the value of H ′, the lower the diversity of the microbial community. By comparing the value of H ′ with the CO 2 concentration, the influence of the CO 2 concentration in the seawater on the microbial community can be evaluated.
（メタン発酵装置における酸敗関連微生物の解析）
活性汚泥を利用したメタン発酵装置において、活性汚泥を試験サンプルとして採取し、試験サンプルから核酸を抽出し、１６ＳＶ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。増幅したＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣに供して、ピークパターンを得て、活性汚泥中の微生物群集を解析する。
(Analysis of spoilage-related microorganisms in methane fermentation equipment)
In a methane fermentation apparatus using activated sludge, activated sludge is collected as a test sample, nucleic acid is extracted from the test sample, and a DNA fragment containing the 16SV3 region is amplified. The amplified DNA fragment is subjected to DHPLC to obtain a peak pattern, and the microbial community in the activated sludge is analyzed.
メタン発酵では酸敗が安定運転を妨げる原因となっているため，正常状態と酸敗した状態との微生物群集を比較し，酸敗関連微生物を推定する。メタン発酵装置運転中は，酸敗関連微生物の動向をＰＣＲ等でモニタリングし，検出された場合には負荷を減少させることで酸敗を防ぎ，安定運転が可能となる。 In methane fermentation, rancidity is a cause that hinders stable operation. Therefore, microorganisms related to rancidity are estimated by comparing the microbial communities in the normal state and in the rancid state. During operation of the methane fermentation apparatus, the trend of spoilage-related microorganisms is monitored by PCR and, if detected, the load is reduced to prevent spoilage and stable operation is possible.
以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
（１）ＤＮＡの抽出
ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いて行った。試薬、Ｂｕｆｆｅｒ等は、特に記載がないものについてはキット添付のものを用いた。
(Example 1)
(1) Extraction of DNA It was carried out using ISOPLANT (NIPPON GENE). Reagents, Buffers, etc. were used unless otherwise specified.
（１−ａ）試薬の調製
（試薬１）；１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ１２．１１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＨＣｌでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬２）；０．５ ＥＤＴＡＥＤＴＡＮａ2・２Ｈ2Ｏ １８．６１ｇ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。ＮａＯＨでｐＨ８．０に調整後オートクレーブ処理。
（試薬３）；ＴＥ１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬ０．５ ＥＤＴＡ ２００μＬ／１００ｍＬ ｄＨ2Ｏ（メスアップ）。
混合後オートクレーブ処理。
(1-a) Preparation of Reagent (Reagent 1); 1 Tris-HCl (pH 8.0)
Tris (hydroxymethyl) aminomethane 12.11 g / 100 mL dH 2 O (mess up). Adjust to pH 8.0 with HCl and autoclave.
(Reagent 2); 0.5 EDTAEDTANa 2 .2H 2 O 18.61 g / 100 mL dH 2 O (meas up). Autoclave after adjusting to pH 8.0 with NaOH.
(Reagent 3); TE1 Tris-HCl (pH 8.0) 1 mL 0.5 EDTA 200 μL / 100 mL dH 2 O (meas up).
Autoclave after mixing.
（１−ｂ）操作
使用した上記培養株は詳細は次の通りである。なお、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
(1-b) Operation The details of the culture strain used are as follows. In addition, what is described in the ATCC number is deposited with the American Type Culture Collection (PO Box 1549 Manassas, VA 20110), and can be sold with reference to each number.
Edwardsiella tarda；長崎大学金井助教授より分譲を受けた(番号：NUF805)。
Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132
Vibrio harveyi ATCC 14126
Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046
Edwardsiella tarda; received from Nagasaki University assistant professor Kanai (number: NUF805).
Marinobacter hydrocarbonoclasticus ATCC 27132
Vibrio harveyi ATCC 14126
Pseudoalteromonas aurantia ATCC 33046
上記の菌株をそれぞれ培養した培養液１．５ｍＬマイクロチューブに入れ、遠心により菌を回収した。次いでフィルターを５０ｍＬ遠心管（Ｎａｌｇｅ Ｃｏ．，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れ、菌を回収した１．５ｍＬマイクロチューブにＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を３００μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした。その後５０℃で３０分間インキュベートした。これに、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて５〜６秒ボルテックスした後、５０℃で１５分間インキュベートした。これにＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製 ＩＳＯＰＬＡＮＴに附属）を１５０μＬ加えて１〜２秒ボルテックスした後、氷上に１５分間静置した。これを１２０００×ｇ、１５分間、４℃の条件で遠心し、水相を１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。これに２〜２．５倍量のエタノールを加え、よく混合し、１２０００×ｇ、１０分間、４℃の条件で遠心した。これの上清を捨て、沈殿を７５％エタノールでリンス後、試薬３ ５０μＬに溶解させた。
Each of the above strains was placed in a culture solution 1.5 mL microtube, and the bacteria were collected by centrifugation. Next, the filter was placed in a 50 mL centrifuge tube (Nalge Co., NY, USA), and 300 μL of Solution I (attached to ISOPLANT manufactured by NIPPON GENE) was added to the 1.5 mL microtube from which the bacteria were collected, and vortexed for 1 to 2 seconds. Thereafter, it was incubated at 50 ° C. for 30 minutes. To this, 150 μL of Solution II (attached to ISOPLANT manufactured by NIPPON GENE) was added and vortexed for 5 to 6 seconds, and then incubated at 50 ° C. for 15 minutes. 150 μL of Solution III (attached to ISOPLANT manufactured by NIPPON GENE) was added thereto and vortexed for 1-2 seconds, and then left on ice for 15 minutes. This was centrifuged at 12,000 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the aqueous phase was fractionated into 1.5 mL microtubes. To this was added 2-2.5 times the amount of ethanol, mixed well, and centrifuged at 12000 × g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded, and the precipitate was rinsed with 75% ethanol and dissolved in 50 μL of
（２）ＤＮＡの精製
抽出したＤＮＡは、ＤＮＡ精製用カラムＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。試薬の調製、精製方法は、マニュアルに従った。
(2) Purification of DNA The extracted DNA was subjected to DNA purification column QIAGEN Genomic-tip (QIAGEN). The reagent preparation and purification method followed the manual.
（３）ＰＣＲ反応
精製されたＤＮＡをＧＣクランプつきバクテリア特異的プライマー（フォワードプライマー 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'（配列番号５、図１、５’側から４０ｂｐがＧＣクランプに相当）、リバースプライマー 5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'（配列番号６））を用いてＰＣＲにより１６Ｓ Ｖ３領域を含むＤＮＡ断片を増幅させた（図２）。
(3) PCR reaction Bacteria specific primer with GC clamp (forward primer 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 '(SEQ ID NO: 5, 40 bp from the 5 ′ side corresponds to GC clamp), and a
ＰＣＲ反応に用いたdNTP MIX、Ｂｕｆｆｅｒは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添付のものを用いた。 The dNTP MIX and Buffer used for the PCR reaction were those attached to AmpliTaq Gold (Applied Biosystems).
また、ＰＣＲ反応においてチューブには以下の溶液を入れて混合した。
10×PCR Buffer 10μL
dNTP MIX 10μL
primer forward 1μL
primer reverse 1μL
template DNA 10ng
AmpliTaq Gold 0.5μL
滅菌水
総容量 100μL
In the PCR reaction, the following solutions were put in a tube and mixed.
10 ×
dNTP MIX 10μL
primer forward 1μL
primer reverse 1μL
template DNA 10ng
AmpliTaq Gold 0.5μL
Sterile water Total volume 100μL
（４）ＤＨＰＬＣ
得られたＤＮＡ断片をＤＨＰＬＣにより分析した。分析は、トランスゲノミック社（ＴＲＡＮＳＧＥＮＯＭＩＣ， ＩＮＣ）のウェ−ブシステム（ＷＡＶＥ（登録商標）ＳＹＳＴＥＭ）核酸フラグメント解析装置を用いた。装置の操作は添付のマニュアルに従った。また、ＤＨＰＬＣの分析条件は次の通りとした。
DHPLC分析条件
Buffer A: 100 mM triethylammonium acetate (TEAA), pH 7.0
Buffer B: 100 mM TEAA, pH 7.0, 25% acetonitrile
Gradient: 48% - 57% Buffer B
Flow rate: 0.4 ml/min
Column temperature: 50℃、64.5℃、70℃
(4) DHPLC
The obtained DNA fragment was analyzed by DHPLC. For the analysis, a wave system (WAVE (registered trademark) SYSTEM) nucleic acid fragment analyzer of Transgenomic (INC) was used. The operation of the device followed the attached manual. The DHPLC analysis conditions were as follows.
DHPLC analysis conditions
Buffer A: 100 mM triethylammonium acetate (TEAA), pH 7.0
Buffer B: 100 mM TEAA, pH 7.0, 25% acetonitrile
Gradient: 48%-57% Buffer B
Flow rate: 0.4 ml / min
Column temperature: 50 ℃, 64.5 ℃, 70 ℃
その結果、６４．５℃の条件においてそれぞれのバクテリア由来のピークとしてＤＮＡ断片を分離することができた（図３）。 As a result, DNA fragments could be separated as a peak derived from each bacterium under the condition of 64.5 ° C. (FIG. 3).
（実施例２）
本発明の解析方法を環境サンプルに適用した。海水１リットルを０．２μｍヌクレポアフィルターで濾過し、次いでフィルターを１．５ｍｌマイクロチューブに入れ、上記実施例１と同様にして上記実施例１と同様にしてフィルター上バクテリアよりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを実施例１と同様にＰＣＲを行い，実施例１と同じ条件でＤＨＰＬＣにより分析を行った。その結果、図４のような結果が得られた。ピークパターンを見ることにより，時間の経過によってバクテリア群集構造が変化していることがわかった。
(Example 2)
The analysis method of the present invention was applied to environmental samples. One liter of seawater was filtered through a 0.2 μm Nuclepore filter, and then the filter was placed in a 1.5 ml microtube, and DNA was extracted from the bacteria on the filter in the same manner as in Example 1 above. This DNA was subjected to PCR in the same manner as in Example 1, and analyzed by DHPLC under the same conditions as in Example 1. As a result, a result as shown in FIG. 4 was obtained. By looking at the peak pattern, we found that the bacterial community structure changed over time.
配列番号１；In situ ハイブリダイゼーション用フラグメント
配列番号２；ＤＮＡアレイ用フラグメント
配列番号３；フォワードプライマー
配列番号４；リバースプライマー
配列番号５；ＧＣクランプを備えたＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号６；ＰＣＲ用リバースプライマー
SEQ ID NO: 1 Fragment for in situ hybridization SEQ ID NO: 2; Fragment SEQ ID NO: 3 for DNA array; Forward primer SEQ ID NO: 4; Reverse primer SEQ ID NO: 5; Forward primer SEQ ID NO: 6 with GC clamp; Primer
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009055788A (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-19 | Ihi Corp | Method for specifying contamination source |
| CN104073557A (en) * | 2014-06-11 | 2014-10-01 | 中国科学院海洋研究所 | Fluorescence quantitative reference genes for crassostrea gigas Poly (I:C) stress experiment as well as primers and applications of fluorescence quantitative reference genes |
| CN104830974A (en) * | 2015-03-27 | 2015-08-12 | 台州学院 | Soil microbial diversity analysis method |
| CN109187922A (en) * | 2018-09-10 | 2019-01-11 | 西北农林科技大学 | The research method of biological community structure and organic carbon response relation in revegetation |
| CN113671056A (en) * | 2020-05-15 | 2021-11-19 | 中国科学院理化技术研究所 | Method for detecting aerobic biodegradation performance of high polymer material in marine environment |
| KR20210151445A (en) * | 2020-06-05 | 2021-12-14 | 한국과학기술연구원 | Method for detecting chemical accident in soil |
-
2003
- 2003-08-25 JP JP2003300624A patent/JP2005065605A/en not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009055788A (en) * | 2007-08-29 | 2009-03-19 | Ihi Corp | Method for specifying contamination source |
| CN104073557A (en) * | 2014-06-11 | 2014-10-01 | 中国科学院海洋研究所 | Fluorescence quantitative reference genes for crassostrea gigas Poly (I:C) stress experiment as well as primers and applications of fluorescence quantitative reference genes |
| CN104073557B (en) * | 2014-06-11 | 2015-12-09 | 中国科学院海洋研究所 | The reference gene of long oyster Poly (I:C) stress tests fluorescent quantitation and primer thereof and application |
| CN104830974A (en) * | 2015-03-27 | 2015-08-12 | 台州学院 | Soil microbial diversity analysis method |
| CN109187922A (en) * | 2018-09-10 | 2019-01-11 | 西北农林科技大学 | The research method of biological community structure and organic carbon response relation in revegetation |
| CN113671056A (en) * | 2020-05-15 | 2021-11-19 | 中国科学院理化技术研究所 | Method for detecting aerobic biodegradation performance of high polymer material in marine environment |
| KR20210151445A (en) * | 2020-06-05 | 2021-12-14 | 한국과학기술연구원 | Method for detecting chemical accident in soil |
| KR102376566B1 (en) | 2020-06-05 | 2022-03-22 | 한국과학기술연구원 | Method for detecting chemical accident in soil |
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