JP2005065540A - Method for modifying heat-resistant dna polymerase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質の触媒活性を向上または低下させる方法に関し、詳しくは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレアーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列および/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を調節する方法、その変異導入によって得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、その製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。 The present invention relates to a method for improving or decreasing the catalytic activity of a protein, and in particular, it exists on the C-terminal side of an ExoI motif present in the “exonuclease domain” of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity. A method for regulating the 3′-5 ′ exonuclease activity of a thermostable DNA polymerase, characterized by introducing a mutation into the loop sequence and / or the amino acid sequence at the tip of the “Thumb domain” adjacent thereto, and obtained by introducing the mutation The present invention relates to a thermostable DNA polymerase and a method for producing the same. Furthermore, the present invention relates to a nucleic acid amplification method using the heat-resistant DNA polymerase, and a reagent containing the DNA polymerase.
近年、ＰＣＲは生化学、分子生物学および臨床病理分野における研究、検査において必須の技術の一つとなっている。ＰＣＲの特徴は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるところにあり、現在最も頻繁に利用されているＤＮＡポリメラーゼは主として、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase）やサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Tth DNA polymerase)などのPolＩ型と呼ばれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。PolＩ型ＤＮＡポリメラーゼの特徴は、増幅効率が良く、条件設定が容易であるところにある。しかしながら、増幅の際に核酸の取り込みの正確性(fidelity)が悪いという問題があり、増幅された遺伝子をクローニングするような場合には適していないとされている。 In recent years, PCR has become one of the essential techniques in research and testing in the fields of biochemistry, molecular biology and clinical pathology. PCR is characterized by the use of thermostable DNA polymerases, and the most frequently used DNA polymerases are currently thermostable DNA polymerases (Taq DNA polymerase) derived from Thermus aquaticus and Thermus aquaticus. It is a thermostable DNA polymerase called PolI type, such as thermostable DNA polymerase (Tth DNA polymerase) derived from Thermus thermophilus. PolI type DNA polymerase is characterized by good amplification efficiency and easy condition setting. However, there is a problem that the fidelity of nucleic acid incorporation is poor at the time of amplification, and it is not suitable for the case of cloning an amplified gene.
一方、超好熱始原菌由来のα型と呼ばれるＤＮＡポリメラーゼ、例えばパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献１、特許文献２)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Vent)ポリメラーゼ、特許文献３）、パイロコッカス・コダカラエンシス (Pyrococcus kodakaraensis) ＫＯＤ１（旧名：Pyrococcus sp. KOD1）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ；特許文献４)なども知られている。これら、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性(Proof reading活性)を有し、核酸の取り込み際の正確性は、Taq ＤＮＡポリメラーゼなどのpolI型ＤＮＡポリメラーゼに比べて優れているという特徴を有する。
On the other hand, a DNA polymerase called α-form derived from a hyperthermophilic archaeon, such as a thermostable DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (Pfu DNA polymerase;
しかしながら、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅においては、その増幅効率が十分でないなどの問題が存在している。また、これらＤＮＡポリメラーゼには、ＰＣＲの反応時間、酵素量及びプライマー濃度等の至適条件の幅が狭いものが多い。 However, in PCR amplification using α-type DNA polymerase, there are problems such as insufficient amplification efficiency. Many of these DNA polymerases have a narrow range of optimum conditions such as PCR reaction time, enzyme amount and primer concentration.
α型ＤＮＡポリメラーゼにおけるＰＣＲ増幅における上記問題点の原因として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の強さが関与していることが考えられる。すなわち、ＰＣＲ時にプライマーなどがその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって削られることにより、ＰＣＲにおける増幅効率が低下すると考えられている。また、α型ＤＮＡポリメラーゼは単一タンパク内に３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す領域と、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す領域が存在するため、両活性はお互いに相互作用しており、それぞれの領域の核酸への親和性などの違いなどもＰＣＲ増幅に影響を及ぼしていると考えられる。 As a cause of the above problems in PCR amplification in α-type DNA polymerase, it is considered that the strength of 3′-5 ′ exonuclease activity is involved. That is, it is considered that the amplification efficiency in PCR is reduced by removing the primer or the like by the 3'-5 'exonuclease activity during PCR. In addition, since α-type DNA polymerase has a region showing 3′-5 ′ exonuclease activity and a region showing DNA polymerase activity in a single protein, both activities interact with each other. It is considered that differences in the affinity for nucleic acids affect PCR amplification.
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の発現を担っているＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中には、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与していると思われる高度に保存されたアミノ酸領域（EXOI（図１）, EXOII, EXOIII）が存在していることが知られている。EXO I領域にはXDXEXモチーフ(D:アスパラギン酸、E:グルタミン酸、X:任意のアミノ酸)が存在し、アスパラギン酸とグルタミン酸はエキソヌクレアーゼ活性の発現に必須であることが知られている。これらのアミノ酸配列におけるアスパラギン酸とグルタミン酸を中性のアミノ酸であるアラニンに置換することによって、エキソヌクレアーゼ活性を欠失または１万分の１以下に低減できることが報告されている（Kongら(1993)、Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975）。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性を欠失又は1万分の1以下に低減させることにより、α型ＤＮＡポリメラーゼの特徴であるＤＮＡ複製時の正確性も同時に失われるという問題が存在した。 In the amino acid sequence of the DNA polymerase responsible for the expression of 3′-5 ′ exonuclease activity, a highly conserved amino acid region (EXOI ( Fig. 1), EXOII, EXOIII) are known to exist. The EXO I region has an XDXEX motif (D: aspartic acid, E: glutamic acid, X: any amino acid), and aspartic acid and glutamic acid are known to be essential for the expression of exonuclease activity. It has been reported that exonuclease activity can be deleted or reduced to 1 / 10,000 or less by substituting aspartic acid and glutamic acid in these amino acid sequences with neutral amino acid alanine (Kong et al. (1993), Journal of Biological Chemistry, vol. 268,1965-1975). However, there has been a problem that the accuracy at the time of DNA replication, which is a characteristic of α-type DNA polymerase, is also lost by deleting or reducing the exonuclease activity to 1 / 10,000 or less.
さらに、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにおける上記XDXEXモチーフのXで示されるアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することにより、エキソヌクレアーゼ活性を段階的に減衰させる試みも行われている（特許文献５）。この方法によると、エキソヌクレアーゼ活性が低下するにつれてＰＣＲ効率の上昇と増幅における正確性(fidelity)の低下が同時に観察される。したがって、この方法を用いるには正確性が損なわれない程度にエキソヌクレアーゼ活性の低下したクローンを用いることが重要となる。しかしながら、この方法によって得られた酵素、例えばＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換した変異体(ＩＱ)や、リジンに置換した変異体(ＩＫ)は、コピー数の低いＤＮＡからの増幅率が必ずしも良いとは言えないことが、優れたＰＣＲ効率を有する耐熱性ポリメラーゼ開発の障害となっていた。 Furthermore, an attempt has been made to gradually attenuate the exonuclease activity by substituting the amino acid represented by X of the XDXEX motif in the KOD DNA polymerase with an arbitrary amino acid (Patent Document 5). According to this method, as exonuclease activity decreases, an increase in PCR efficiency and a decrease in fidelity in amplification are observed simultaneously. Therefore, in order to use this method, it is important to use a clone having reduced exonuclease activity to such an extent that accuracy is not impaired. However, an enzyme obtained by this method, for example, a mutant (IQ) in which the 142nd isoleucine of KOD DNA polymerase is substituted with glutamine, or a mutant in which lysine is substituted (IK) is derived from DNA having a low copy number. The fact that the amplification factor is not necessarily good has been an obstacle to the development of a thermostable polymerase having excellent PCR efficiency.
また特許文献５によれば、この方法を用いる限りにおいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（proof reading活性）の上昇した変異体を得ることは困難である。このことは、この方法に従っては野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ以上に正確性に優れる酵素の取得が困難であることを示唆しているものと思われる。 According to Patent Document 5, as long as this method is used, it is difficult to obtain a mutant having an increased 3'-5 'exonuclease activity (proof reading activity). This seems to suggest that according to this method, it is difficult to obtain an enzyme with higher accuracy than the wild type KOD DNA polymerase.
これらの問題点を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの種々の変異体が作製され、EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す）を種々のアミノ酸に置換することにより、様々な強さの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、ＰＣＲ効率及び正確性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの取得が可能であることが報告されている（特許文献６）。しかし、このヒスチジン残基の置換がどのようなメカニズムで作用し、ポリメラーゼの性質が変化したのかは不明であり、更なる水平展開が困難な状況であった。
その一方で、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの立体構造が明かとなり（J Mol Biol.(2001)00,1-9）、１４７番目のヒスチジンのタンパク質中での位置が明確になったことから、メカニズム解明が進む可能性も浮上していた。また、他の幾つかのα型DNAポリメラーゼの立体構造も詳しく調べられるようになった。
On the other hand, the steric structure of KOD DNA polymerase has been clarified (J Mol Biol. (2001) 00, 1-9), and the position of the 147th histidine in the protein has been clarified. The possibility was also emerging. In addition, the three-dimensional structure of some other α-type DNA polymerases can now be examined in detail.
このような理由から、立体構造情報を利用したＤＮＡポリメラーゼ改変が求められていた。 For these reasons, DNA polymerase modification using three-dimensional structure information has been demanded.
すなわち本発明の目的は、まず、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジンの変異によるポリメラーゼ特性の変化のメカニズムを解明し、新しい性質を示すＤＮＡポリメラーゼを作り出す方法論を見出すことである。また、それら新たなＤＮＡポリメラーゼ候補を提供することである。 That is, the object of the present invention is to first elucidate the mechanism of change in polymerase properties by mutation of the 147th histidine of KOD DNA polymerase and to find a methodology for producing a DNA polymerase exhibiting new properties. It is also to provide these new DNA polymerase candidates.
本発明者らは本課題を解決するためＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの変異体EXOI領域中のXDXEXモチーフのグルタミン酸から数えて４つ目のヒスチジン残基（１４７番目；以下、Ｈとも示す)をグルタミン酸に置換した変異体（Ｈ１４７Ｅ）のＸ線構造解析を実施し、野生型酵素の構造と比較することで、「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸残基が静電的相互作用をすることにより、その二つの構造の間に形成されるEditing cleft（校正溝）の幅が狭まることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（Ａ）触媒活性を有する蛋白質の、その溝中に基質結合部位および／または活性中心を有している溝の周辺に位置する２つのドメインの近接部分の一方又は両方のドメインのアミノ酸配列に変異を導入することにより両ドメイン間の距離を大きく又は小さく又はズレを生じさせて、溝の大きさ又は形状を変化させて当該蛋白質の性質を変化させる方法。
（１）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソ ヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」が近接した部分のアミノ酸配列に変異 を導入することによる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。ただし、「エキソヌクレ ーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒス チジン残基（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）の改変 方法は除外する。
（２）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソ ヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列お よび/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導 入することにより得られる、（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（３）ループ配列が(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Glyからなることを特徴とする、（１）に記 載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（４）Thumbドメイン先端配列が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)- Gly-(Val/Ile)
-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)であることを特徴とする、（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポ リメラーゼの改変方法。
（５）ループ配列のLysもしくはPheを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性ア ミノ酸に置換することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方 法。
（６）ループ配列のTyrを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換 することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（７）ループ配列のGluを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換 することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（８）ループ配列のGlyを酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換 することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（９）ループ配列Tyr-His-Glu-Glyの複数のアミノ酸を酸性アミノ酸、または塩基性アミ ノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする（１）に記載の耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼの改変方法。
（１０）Thumbドメイン先端配列が(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg )-Gly-
(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸 、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする（１）に 記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１１）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが始原菌由来であることを特徴とする（１）に記載の 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１２）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴と する、（１）〜（１１）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラー ゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、9#N-7 ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とす る、（１）〜（１１）記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法。
（１４）（１）〜（１３）の改変方法によって改変された耐熱性DNAポリメラーゼ。
（１５）（１４）に記載のタンパク質を発現させるため、その遺伝子をベクターに挿入さ れてなる遺伝子組換えベクター。
（１６）ベクターがpLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターである（１５）の遺伝 子組換えベクター。
（１７） （１５）または（１６）に記載の遺伝子組換えベクターを用いて宿主細胞を形 質転換した組換え細胞。
（１８） 宿主細胞がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である（１７）記載の組 換え細胞。
（１９） （１８）記載の組換え細胞を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを 採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
（２０） ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１４）に記載の耐熱性ＤＮ Ａポリメラーゼを反応させることによりプライマーを伸長させてＤＮＡプライマー伸長 物を合成することを特徴とする核酸増幅方法。
（２１）プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ伸長物に 相補的である（２０）記載の核酸増幅方法。
（２２） 加熱および冷却を繰り返す（２０）記載の核酸増幅方法。
（２３） 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ マー、ｄＮＴＰ、および（１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１ 価イオン及び緩衝液を含むことを特徴とする核酸増幅用試薬。
（２４） 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ マー、ｄＮＴＰ、（１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、 アンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオン、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、非 イオン性界面活性剤、及び緩衝液を含有することを特徴とする核酸増幅用試薬。
（２５） 一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物である２種のプライ マー、ｄＮＴＰ、（１）〜（１１）のいずれかに記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マ グネシウムイオン、アンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオン、ＢＳＡ、非イ オン性界面活性剤、緩衝液、及び該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性およ び／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含有する 核酸増幅用試薬。
（２６） （１４）に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合されたことを特徴 とするＤＮＡポリメラーゼ組成物。
（２７） ＤＮＡを鋳型として、変異導入プライマー、ｄＮＴＰ及び（１４）に記載の耐 熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させることによりプライマーを伸長させてＤＮＡプライ マー伸長物を合成することを特徴とする遺伝子変異導入方法。
（２８） 変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び（１４）のいずれかに記載の耐熱性ＤＮ Ａポリメラーゼ含んでなることを特徴とする遺伝子変異導入用試薬
（２９） ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの近接した「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」において、
(i)該Ｔｈｕｍｂドメイン先端部分の塩基性及び／又は疎水性を増大させる；並びに／或 いは
(ii)該エキソヌクレーゼドメインの酸性及び／又は疎水性を増大させる
アミノ酸変異（置換、欠失、挿入又は付加）を行うことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下する方法。
（３０） ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの近接した「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」において、
(i) Thumbドメイン先端部分の塩基性及び／又は疎水性を減少させる；並びに／或いは
(ii)該エキソヌクレーゼドメインの酸性及び／又は疎水性を減少させる
アミノ酸変異（置換、欠失、挿入又は付加）を行うことを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を増大させて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの増幅における正確性を向上する方法。
（３１） 野生型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼよりも「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」の間の距離が、0.1〜15Å、好ましくは0.3〜10Å、より好ましくは0.5〜5Å縮小している（２９）に記載の方法。、
（３２） 野生型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼよりも「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」の間の距離が、0.1〜15Å、好ましくは0.3〜10Å、より好ましくは0.5〜5Å拡大している（３０）に記載の方法。
In order to solve this problem, the present inventors substituted the glutamic acid for the fourth histidine residue (position 147; hereinafter also referred to as H) counted from the glutamic acid of the XDXEX motif in the mutant EXOI region of KOD DNA polymerase. The X-ray structural analysis of the mutant (H147E) was carried out and compared with the structure of the wild-type enzyme, so that the loop structure present on the C-terminal side of the ExoI motif present in the “exonuclease domain” and its adjacent “ The inventors have found that the amino acid residue at the tip of the “Thumb domain” interacts electrostatically to narrow the width of the editing cleft (calibration groove) formed between the two structures.
That is, the present invention has the following configuration.
(A) Mutation in the amino acid sequence of one or both domains of a proximate part of two domains located in the periphery of a groove having a substrate binding site and / or an active center in the groove of a protein having catalytic activity A method of changing the properties of the protein by changing the size or shape of the groove by increasing or decreasing the distance between the two domains by introducing a gap, or causing a shift.
(1) A method for modifying a thermostable DNA polymerase by introducing a mutation into the amino acid sequence in the vicinity of the “exonuclease domain” and the “Thumb domain” of the thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity . However, the method of modifying the histidine residue on the loop sequence existing on the C-terminal side of the ExoI motif existing in the “exonuclease domain” (147th histidine residue in the case of KOD DNA polymerase) is excluded.
(2) The loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif present in the “exonuclease domain” of thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity and / or the “Thumb domain” adjacent thereto The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), which is obtained by introducing a mutation into the amino acid sequence at the tip.
(3) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein the loop sequence is (Lys / Phe) -Tyr-His-Glu-Gly.
(4) Thumb domain tip sequence is (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / Ile)
The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), which is (Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met).
(5) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein Lys or Phe in the loop sequence is substituted with an acidic amino acid, a basic amino acid, or a hydrophobic amino acid.
(6) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein Tyr in the loop sequence is substituted with an acidic amino acid, a basic amino acid, or a hydrophobic amino acid.
(7) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein Glu in the loop sequence is substituted with an acidic amino acid, a basic amino acid, or a hydrophobic amino acid.
(8) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein Gly in the loop sequence is substituted with an acidic amino acid, a basic amino acid, or a hydrophobic amino acid.
(9) The thermostable DNA polymerase according to (1), wherein a plurality of amino acids of the loop sequence Tyr-His-Glu-Gly are substituted with acidic amino acids, basic amino acids, or hydrophobic amino acids. Modification method.
(10) Thumb domain tip sequence is (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly-
One or more amino acids of (Val / Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met) are substituted with acidic amino acids, basic amino acids, or hydrophobic amino acids, The method for modifying a heat-resistant DNA polymerase according to (1).
(11) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (1), wherein the thermostable DNA polymerase is derived from a protozoan bacterium.
(12) The method for modifying a thermostable DNA polymerase according to any one of (1) to (11), wherein the thermostable DNA polymerase is KOD DNA polymerase.
(13) The thermostable DNA polymerase is Pfu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, Tag DNA polymerase, Tgo DNA polymerase, 9 # N-7 DNA polymerase, (1) A method for modifying a thermostable DNA polymerase according to (11).
(14) A thermostable DNA polymerase modified by the modification method of (1) to (13).
(15) A gene recombination vector obtained by inserting the gene into a vector in order to express the protein according to (14).
(16) The genetic recombination vector according to (15), wherein the vector is a vector derived from pLED-MI or pBluescript.
(17) A recombinant cell obtained by transforming a host cell using the gene recombinant vector according to (15) or (16).
(18) The recombinant cell according to (17), wherein the host cell is Escherichia coli.
(19) A method for producing a thermostable DNA polymerase, comprising culturing the recombinant cell according to (18) and collecting the thermostable DNA polymerase from the culture.
(20) A nucleic acid amplification method characterized in that DNA is used as a template, a primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase described in (14) are reacted to extend the primer to synthesize a DNA primer extension product.
(21) The nucleic acid amplification method according to (20), wherein the primers are two kinds of oligonucleotides, one of which is complementary to the other DNA extension product.
(22) The nucleic acid amplification method according to (20), wherein heating and cooling are repeated.
(23) One primer contains two primers, dNTPs, which are DNA extension products of the other primer, and the thermostable DNA polymerase, divalent ion, monovalent ion and buffer described in (14) A nucleic acid amplification reagent characterized by the above.
(24) Two primers whose one primer is a DNA extension product of the other primer, dNTP, heat-resistant DNA polymerase according to (14), magnesium ion, ammonium ion and / or potassium ion, BSA (cow A reagent for nucleic acid amplification, comprising serum albumin), a nonionic surfactant, and a buffer solution.
(25) Two primers, one of which is a DNA extension product of the other primer, dNTP, the heat-resistant DNA polymerase according to any one of (1) to (11), magnesium ion, ammonium ion, and And / or potassium ions, BSA, nonionic surfactants, buffers, and antibodies having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3′-5 ′ exonuclease activity of the thermostable DNA polymerase Reagent for nucleic acid amplification.
(26) A DNA polymerase composition, wherein one or more heat-resistant DNA polymerases according to (14) are mixed.
(27) Gene mutagenesis characterized by synthesizing a DNA primer extension product by extending a primer by reacting with a mutagenesis primer, dNTP and the heat-resistant DNA polymerase described in (14) using DNA as a template Method.
(28) A mutation induction reagent comprising a mutation introduction primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase according to any one of (14) (29) having 3′-5 ′ exonuclease activity In the adjacent "exonuclease domain" and "Thumb domain" of thermostable DNA polymerase,
(i) increase the basicity and / or hydrophobicity of the Thumb domain tip; and / or
(ii) 3′-5 ′ exonuclease activity of a thermostable DNA polymerase characterized by performing amino acid mutation (substitution, deletion, insertion or addition) that increases the acidity and / or hydrophobicity of the exonuclease domain How to lower.
(30) In the adjacent “exonuclease domain” and “Thumb domain” of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity,
(i) reduce the basicity and / or hydrophobicity of the Thumb domain tip; and / or
(ii) 3'-5 'exonuclease activity of a thermostable DNA polymerase characterized by carrying out an amino acid mutation (substitution, deletion, insertion or addition) that reduces the acidity and / or hydrophobicity of the exonuclease domain To improve accuracy in amplification of thermostable DNA polymerase.
(31) The distance between the “exonuclease domain” and the “Thumb domain” is 0.1 to 15 mm, preferably 0.3 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm smaller than the wild type thermostable DNA polymerase ( 29). ,
(32) The distance between the “exonuclease domain” and the “Thumb domain” is 0.1 to 15 mm, preferably 0.3 to 10 mm, more preferably 0.5 to 5 mm more than the wild type thermostable DNA polymerase ( 30).
２００１年にＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの立体構造が明らかとなり（J Mol Biol.(2001)00,1-9）、アミノ酸置換することで正確性を保ったままＰＣＲ効率を向上させることのできるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジンのタンパク質内での立体的位置関係が明らかになった。１４７番目のヒスチジン残基は、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造の先端に存在し、Ｔｈｕｍｂドメイン（正確にはThumb-2ドメイン）の先端にも近接していることが明かとなった。一方、Ｔｈｕｍｂドメインの先端はＸ線結晶解析ではディスオーダーしており、すなわち不安定で、明瞭な像が得られおらず、非常にフレキシビリティーに富んだ領域であることが窺えた。また、この領域は塩基性、疎水性に富む領域であることも非常に興味深い発見であった。 In 2001, the three-dimensional structure of KOD DNA polymerase was clarified (J Mol Biol. (2001) 00, 1-9), and KOD DNA polymerase that can improve PCR efficiency while maintaining accuracy by amino acid substitution. The steric positional relationship within the protein of the 147th histidine was revealed. It was revealed that the 147th histidine residue is present at the tip of the loop structure existing on the C-terminal side of the ExoI motif and close to the tip of the Thumb domain (exactly the Thumb-2 domain). . On the other hand, the tip of the Thumb domain was disordered in the X-ray crystal analysis, that is, it was unstable, a clear image was not obtained, and the region was very flexible. It was also a very interesting discovery that this region is rich in basicity and hydrophobicity.
このＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とＴｈｕｍｂドメインの先端が作る溝は、Ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｌｅｆｔ（Ｅ−Ｃｌｅｆｔ）と呼ばれ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性中心がその内部に存在することから、３’−５’エキソヌクレアーゼの発現制御に深く関わっていることが推察されている。
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ複製機構は以下のように考えられる。
（１）複製すべきＤＮＡを挟み込むようにして、ポリメラーゼ活性中心で５’から３’側 へ向けて伸長反応（DNA合成反応）が進む（合成モード）。
（２）伸長反応に対してある割合で校正モードへの切り換え（スイッチング）が行われ、 合成されつつある１本鎖核酸がＥ−Ｃｌｅｆｔ（校正溝：エキソヌクレアーゼドメイン とＴｈｕｍｂドメインの隙間に形成される）に進入し、３’−５’エキソヌクレアーゼ 活性中心で３’側から５’側に数塩基から数十塩基削られる。この時、誤って取りこま れた塩基は校正される。
（３）スイッチングが行われ、合成モードへ戻り合成が再開される。
The loop structure present on the C-terminal side of this ExoI motif and the groove formed by the tip of the Thumb domain are called Editing clef (E-Cleft), and the 3′-5 ′ exonuclease active center is present inside the groove. It is presumed to be deeply involved in the regulation of 3′-5 ′ exonuclease expression.
The DNA replication mechanism of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity is considered as follows.
(1) An extension reaction (DNA synthesis reaction) proceeds from the 5 ′ to 3 ′ side of the polymerase active center so as to sandwich the DNA to be replicated (synthesis mode).
(2) Switching to the calibration mode at a certain ratio to the extension reaction (switching) is performed, and the single-stranded nucleic acid being synthesized is formed in the gap between E-Cleft (calibration groove: exonuclease domain and Thumb domain). 3'-5 'exonuclease is deleted from several bases to several tens of bases from the 3' side to the 5 'side at the active center. At this time, the wrongly taken base is calibrated.
(3) Switching is performed, returning to the synthesis mode, and synthesis is resumed.
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４７番目のヒスチジン残基を酸性アミノ酸、すなわち負電荷を帯びたアミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下し、ＰＣＲ効率が向上する傾向にある。一方、１４７番目のヒスチジン残基を塩基性アミノ酸、すなわち正電荷を帯びたアミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が上昇し、ＰＣＲ効率が低下する傾向にある。さらに、一方、１４７番目のヒスチジン残基を疎水性アミノ酸に置換することで、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が若干低下し、ＰＣＲ効率が若干向上する傾向にある（表１）。 By substituting the 147th histidine residue of KOD DNA polymerase with an acidic amino acid, ie, a negatively charged amino acid, the 3'-5 'exonuclease activity tends to decrease and the PCR efficiency tends to improve. On the other hand, by replacing the 147th histidine residue with a basic amino acid, that is, a positively charged amino acid, the 3'-5 'exonuclease activity increases and the PCR efficiency tends to decrease. Furthermore, by substituting the 147th histidine residue with a hydrophobic amino acid, the 3'-5 'exonuclease activity tends to be slightly reduced and the PCR efficiency tends to be slightly improved (Table 1).
表１は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの１４７変異体の性質を示す。 Table 1 shows the properties of the 147 variant of KOD DNA polymerase.
本発明者等はこれら立体構造的知見と変異体での知見をもとに鋭意考察し、以下のような仮説に至った。すなわち、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とＴｈｕｍｂドメインの先端は近接しており、アミノ酸の性質に従って相互作用しており、特に、それぞれの配列の先端付近のアミノ酸が重要で、それぞれの電荷、疎水性などが深く、その相互作用に関与しているというものである。１４７番目のヒスチジン残基はＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造のほぼ先端に存在し、その相互作用に最も影響を及ぼしやすいと推察される。１４７番目のヒスチジンの変異体を例にとると以下のような推論が成り立つ。まず、ヒスチジンを酸性アミノ酸（負電荷）に置換した場合、Ｔｈｕｍｂドメインの先端部分が塩基性（正電荷）に富んでいることから、お互い引き合い、Ｅ−Ｃｌｅｆｔを押し縮めるように作用することが考えられる。このことにより、校正されるべき一本鎖ＤＮＡは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に到達しにくくなり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下するものと考えられる。また、特開２００２−２５３２６５では、Ｈ１４７ＥやＨ１４７Ｄなどの酸性アミノ酸への変異体は、同等の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に変異を導入した変異体に比べＰＣＲ効率が向上していることを述べている。これは、活性中心に変異を導入した変異体では、校正されるべき一本鎖ＤＮＡが野生型酵素同様にＥ−Ｃｌｅｆｔに進入するのに対し、Ｈ１４７ＥやＨ１４７Ｄなどの酸性アミノ酸への変異体では、Ｅ−Ｃｌｅｆｔへの一本鎖ＤＮＡの進入が制御されることにより、無駄な動きが軽減されるためであると推察される。
また、Ｈ１４７AやＨ１４７Ｙなどの疎水性変異体においても、酸性アミノ酸への変異体ほど顕著ではないが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下とＰＣＲ効率の向上が認められる。これは、Ｔｈｕｍｂドメインの先端部分が疎水性に富んでいることから、疎水的相互作用を介して、二つのドメインが引き合った結果、Ｅ−Ｃｌｅｆｔを押し縮められたことに起因していると考えられる。
一方、Ｈ１４７ＫやＨ１４７Ｒなどの塩基性変異体に関しては、酸性変異体とは全く逆の結果が得られている。すなわち、これらの変異体においては、反発の作用が働きＥ−Ｃｌｅｆｔが開き、一本鎖ＤＮＡが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性中心に到達しやすい構造になっていると推察することが出来る。
本発明は上記の仮説を証明することにより、更に幅広い性質を有する変異体を作製することを可能にした。仮説の証明は、Ｈ１４７Ｅ変異体に焦点を当て、Ｘ線結晶解析を行い、野生型酵素との立体構造の比較を行うことによって実施した。Ｈ１４７Ｅは実施例３に示す条件で結晶化を行い、０．２０×０．０８×０．０８ｍｍの結晶を取得し（図３）、X線回折実験により約２．７５Åの分解能までの回折点を観測し、表２に示すような空間群と格子定数を決定することが可能であった。
The present inventors diligently studied based on these three-dimensional structural knowledge and knowledge of mutants, leading to the following hypothesis. That is, the loop structure present on the C-terminal side of the ExoI motif and the tip of the Thumb domain are close to each other and interact according to the nature of the amino acid. In particular, the amino acid near the tip of each sequence is important. It has deep charge and hydrophobicity and is involved in the interaction. It is surmised that the 147th histidine residue is present almost at the tip of the loop structure existing on the C-terminal side of the ExoI motif, and is most likely to affect the interaction. Taking the 147th histidine mutant as an example, the following reasoning holds. First, when histidine is substituted with an acidic amino acid (negative charge), the tip part of the Thumb domain is rich in basicity (positive charge), so that it attracts each other and acts to compress E-Cleft. It is done. As a result, the single-stranded DNA to be calibrated is unlikely to reach the active center of the 3′-5 ′ exonuclease activity, and the 3′-5 ′ exonuclease activity is considered to decrease. In JP-A-2002-253265, mutations to acidic amino acids such as H147E and H147D introduce mutations into the active center of 3′-5 ′ exonuclease activity, which has equivalent 3′-5 ′ exonuclease activity. It describes that the PCR efficiency is improved compared to the mutants. This is because the single-stranded DNA to be calibrated enters E-Cleft in the same manner as the wild-type enzyme in the mutant in which the mutation is introduced into the active center, whereas in the mutant to acidic amino acids such as H147E and H147D. It is inferred that unnecessary movement is reduced by controlling the entry of single-stranded DNA into E-Clleft.
In addition, hydrophobic mutants such as H147A and H147Y also show a decrease in 3′-5 ′ exonuclease activity and an improvement in PCR efficiency, although not as remarkable as the mutants to acidic amino acids. This is thought to be due to the fact that the tip portion of the Thumb domain is rich in hydrophobicity, and as a result of the two domains attracting each other through hydrophobic interaction, E-Clleft was compressed. It is done.
On the other hand, with respect to basic mutants such as H147K and H147R, the results are completely opposite to those of the acidic mutants. That is, it can be inferred that in these mutants, the repulsive action acts to open E-Cleft, and the single-stranded DNA has a structure that easily reaches the 3′-5 ′ exonuclease activity center.
The present invention proved the above hypothesis and made it possible to produce mutants having a wider range of properties. The hypothesis was proved by focusing on the H147E mutant, conducting X-ray crystallography, and comparing the three-dimensional structure with the wild-type enzyme. H147E was crystallized under the conditions shown in Example 3 to obtain a 0.20 × 0.08 × 0.08 mm crystal (FIG. 3), and a diffraction point up to a resolution of about 2.75 mm by X-ray diffraction experiments. It was possible to determine the space group and lattice constant as shown in Table 2.
表２は、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データを示す。 Table 2 shows X-ray diffraction data of crystals of KOD DNA polymerase mutant (H147E).
そのデータを元にプログラムDenzo,Scalepackを用い計算を行った後、立体モデルを構築した。その結果、図４に示すような像を得ることができ、野生型酵素同様に、Ｎ−ｔｅｒドメイン、Ｅｘｏドメイン、Ｆｉｎｇｅｒドメイン、Ｐａｌｍドメイン、Ｔｈｕｍｂドメインの５つのドメインからなることが分かった。また、ＥｘｏドメインとＴｈｕｍｂドメインを間の距離を比較するために、Ｅｘｏドメインを対照として、Ｈ１４７Ｅ変異体と野生型酵素を重ね合わせた結果、Ｈ１４７Ｅ変異体のＴｈｕｍｂドメインが相対的にＥｘｏドメイン側にシフトしていることが明らかになった（図５）。ただ、図をみて分かるようにＴｈｕｍｂドメインの先端部分で３箇所、構造がｄｉｓｏｒｄｅｒしている領域（点線部分）が存在した。Ｎ末端側から順にＤｉｓｏｒｄｅｒ領域Ｉでは、Ｔ６６７からＧ６
７７までの１１残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIでは、Ｒ６８９からＧ６９６までの８残基
、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIIでは、Ｋ７０５からＤ７１２までの８残基について構造が確認
できなかった。これらについては、野生型酵素の構造解析においても同様の結果が得られている。野生型酵素の研究からＴｈｕｍｂドメインは、温度要因が他のドメインに比べ非常に高く、フレキシブルであることが明かとなっており、このためにＴｈｕｍｂドメインの先端部分の電子密度が薄くなり、構造が欠落したのではないかと考えられている。ＴｈｕｍｂドメインのＥｘｏドメイン側へのシフトは、Ｔｈｕｍｂドメイン先端のへリックス領域（６７８−６８８）で、およそ１．５Åであった。当然、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列であるＤｉｓｏｒｄｅｒ領域IIも、Ｅｘｏドメイン側へシフトしていると考えられる
。
Based on the data, calculations were performed using the programs Denzo and Scalepack, and then a solid model was constructed. As a result, an image as shown in FIG. 4 can be obtained, and it has been found that it consists of five domains, N-ter domain, Exo domain, Finger domain, Palm domain, and Thumb domain, as in the case of the wild-type enzyme. In addition, in order to compare the distance between the Exo domain and the Thumb domain, using the Exo domain as a control, the H147E mutant and the wild-type enzyme were superimposed. As a result, the Thumb domain of the H147E mutant was relatively located on the Exo domain side. It became clear that there was a shift (Fig. 5). However, as can be seen from the figure, there were three regions (dotted line portions) where the structure was disordered at the tip of the Thumb domain. In the Disorder region I in order from the N-terminal side, T667 to G6
The structure could not be confirmed for 11 residues up to 77, 8 residues from R689 to G696 in the Disorder region II, and 8 residues from K705 to D712 in the Disorder region III. About these, the same result was obtained also in the structural analysis of the wild-type enzyme. From the research of wild-type enzymes, it is clear that the Thumb domain has a very high temperature factor compared to other domains and is flexible, which reduces the electron density at the tip of the Thumb domain and makes the structure It is thought that it was missing. The shift of the Thumb domain toward the Exo domain was approximately 1.5 mm in the helix region (678-688) at the tip of the Thumb domain. Naturally, the Disorder region II, which is the tip sequence of the Thumb domain, is also considered to have shifted to the Exo domain side.
更に、図６にＴｈｕｍｂドメインのｄｉｓｏｒｄｅｒしていない複数箇所からの１４７番目のアミノ酸までの距離、およびＥ−Ｃｌｅｆｔと推定される領域を示した。このように、１４７番目のアミノ酸を酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換することで、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさが変化することが示された。これは、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存
在するループ配列とＴｈｕｍｂドメインの先端配列が、相互作用しやすい位置に存在し、実際に静電的もしくは疎水的相互作用をしていることを意味していると思われ、今回試した他のアミノ酸への変異体においても同様の原理が働き、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさや形が変化することで、KOD DNAポリメラーゼの性質を変化させたことが示唆される。
Further, FIG. 6 shows the distance to the 147th amino acid from a plurality of locations where the Thumb domain is not disordered, and the region estimated to be E-Cleft. Thus, it was shown that the size of E-Cleft changes by replacing the 147th amino acid with glutamic acid, which is an acidic amino acid. This means that the loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif and the tip sequence of the Thumb domain are located at positions where they are likely to interact, and actually have an electrostatic or hydrophobic interaction. The same principle also works in the mutants to other amino acids tested this time, suggesting that the size and shape of E-Cleft changed and changed the properties of KOD DNA polymerase. .
Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列の電子密度が薄いということは、この領域が揺らいでいることを示しており、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインと容易に相互作用しやすい構造を取っていることを示している可能性も考えられる。 The low electron density of the tip sequence of the Thumb domain indicates that this region is fluctuating, indicating that it has a structure that easily interacts with the 3′-5 ′ exonuclease domain. It is possible that
Ｈ１４７Ｅ変異体は酸性アミノ酸（負電荷）変異体であり、仮説では３’−５’エキソヌクレアーゼドメインとＴｈｕｍｂドメインの間隔を縮める、すなわちＥ−Ｃｌｅｆｔの幅を縮めると予想されていた変異体である。今回の、Ｘ線立体構造解析の結果、この仮説が証明される結果となり、本発明を明確なものとすることができた。 The H147E mutant is an acidic amino acid (negative charge) mutant, hypothesized to be a mutant that was predicted to reduce the distance between the 3′-5 ′ exonuclease domain and the Thumb domain, that is, to reduce the width of E-Cleft. . As a result of this X-ray three-dimensional structure analysis, this hypothesis was proved, and the present invention could be clarified.
すなわち本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレーゼドメイン」と「Ｔｈｕｍｂドメイン」が近接した部分のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法である。ただし、既に報告されている「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒスチジン残基（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）に変異を導入した変異体は本発明の範囲から除く。 That is, the present invention is characterized by introducing a mutation into the amino acid sequence in the vicinity of the “exonuclease domain” and the “Thumb domain” of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity. This is a method for modifying a DNA polymerase. However, a mutation was introduced into the histidine residue on the loop sequence existing on the C-terminal side of the ExoI motif existing in the already reported “exonuclease domain” (147th histidine residue in the case of KOD DNA polymerase). Variants are excluded from the scope of the present invention.
ここでいう近接した部分とは、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域を意味する。ドメイン間には数箇所そのような場所が存在する。KOD DNAポリメラーゼにおいてはエキソヌクレアーゼドメインのＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ構造とThumbドメイン（詳しくはThumb-2）の先端領域にあたる領域である。 The close part here means an area close to the boundary part (interface) of the domain. There are several such places between domains. In KOD DNA polymerase, a region corresponding to the loop structure present on the C-terminal side of the ExoI motif of the exonuclease domain and the tip region of Thumb domain (specifically Thumb-2).
また、近接した領域の片方、もしくは両方は構造的に柔軟性（フレキシビリティー）に富んでいることが好ましい。KOD DNAポリメラーゼにおけるThumbドメインの先端はX線解析においてdisorderしていることが示唆されており、柔軟性が高いことが推察される。 Further, it is preferable that one or both of the adjacent regions are structurally flexible (flexibility). It is suggested that the tip of the Thumb domain in KOD DNA polymerase is disordered in X-ray analysis, suggesting that it is highly flexible.
ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離に関して、一般的に好ましい変異の戦略としては、酵素基質の反応部位（または触媒部位・結合部位など）への進入を妨げることが出来る程度に距離を近接させる、または、反対に進入しやすいように遠ざける、もしくはサブユニット同士をずらすことなどが挙げられる。 例えば、KOD DNAポリメラーゼにおいては、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離が近づくと一本鎖ＤＮＡが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の活性中心に到達しにくくなり、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下し、PCR性能が向上する傾向がある。一方、距離が遠くなると、エキソヌクレアーゼ活性が向上して、PCR性能が低下する傾向があるが、正確性が向上するという利点がある。 Regarding the distance between adjacent regions at the domain boundary (interface), the generally preferred mutation strategy is to prevent the enzyme substrate from entering the reaction site (or catalytic site, binding site, etc.) For example, the distance may be close to each other, or the distance may be increased so as to easily enter the opposite direction, or the subunits may be shifted. For example, in KOD DNA polymerase, when the distance between adjacent regions at the domain boundary (interface) approaches, single-stranded DNA hardly reaches the active center of 3′-5 ′ exonuclease activity, 3′-5 ′ exonuclease activity tends to decrease and PCR performance tends to improve. On the other hand, when the distance is increased, exonuclease activity is improved and PCR performance tends to be lowered, but there is an advantage that accuracy is improved.
このような観点から、本発明においてDNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低下させる、もしくはPCR性能向上させる場合、ドメインの境界部分（インターフェース）で近接している領域間の距離として好ましいのは、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度距離を近くした場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度距離を近くした場合である。具体的な変異としては、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を酸性アミノ酸もしくは疎水性アミノ酸、好ましくは酸性アミノ酸に変換することにより実現される。さらに好ましくは、既に効果の確認されているHisのAsp、Glu、Tyr、もしくはAlaへの変異を含む方が好ましいといえる。また、もう一つのアプローチとしては、Thumbドメイン先端部分のアミノ酸配列（(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)）の一つ以上のアミノ酸を置換することにより実現される。また、それぞれの変異は、デリーションもしくは挿入を含んでも良い。 From such a point of view, in the present invention, when the 3′-5 ′ exonuclease activity of DNA polymerase is reduced or the PCR performance is improved, the distance between adjacent regions at the domain boundary (interface) is preferable. Is a case where the lower limit of the enzyme not introduced with mutation is 0.1 Å, more preferably 0.3 Å, and still more preferably about 0.5 Å. Alternatively, it is a case where the upper limit is 15 centimeters, more preferably 10 centimeters, and even more preferably about 5 centimeters higher than the enzyme into which no mutation is introduced. Specific mutations include converting one or more amino acids of the (Lys / Phe) -Tyr-His-Glu-Gly sequence of the exonuclease domain loop structure to acidic or hydrophobic amino acids, preferably acidic amino acids. It is realized by. More preferably, it can be said that it is preferable to include a mutation of His, which has been confirmed to be effective, to Asp, Glu, Tyr, or Ala. As another approach, the amino acid sequence at the tip of the Thumb domain ((Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / It is realized by substituting one or more amino acids of (Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met)). Each mutation may also include a deletion or insertion.
一方、本発明においてDNAポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を増大させ、正確性を向上させるためには、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度距離を遠くした場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度距離を遠くした場合である。具体的な変異としては、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を塩基アミノ酸もしくは親水性アミノ酸、好ましくは塩基性アミノ酸に置換することにより実現される。さらに好ましくは、既に効果の確認されているHisのLysもしくはArgへの変異を含む方が好ましいといえる。また、もう一つのアプローチとしては、Thumbドメイン先端部分のアミノ酸配列（(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)）の一つ以上のアミノ酸を置換することにより実現される。また、それぞれの変異は、デリーションもしくは挿入を含んでも良い。 On the other hand, in the present invention, in order to increase the 3′-5 ′ exonuclease activity of DNA polymerase and improve accuracy, the lower limit is 0.1 Å, more preferably 0.3 Å, compared to the enzyme into which no mutation has been introduced. More preferably, the distance is increased by about 0.5 mm. Alternatively, the upper limit is 15 centimeters, more preferably 10 centimeters, and even more preferably about 5 centimeters as the upper limit of the enzyme into which no mutation has been introduced. As specific mutations, one or more amino acids in the (Lys / Phe) -Tyr-His-Glu-Gly sequence of the loop structure of the exonuclease domain are replaced with basic amino acids or hydrophilic amino acids, preferably basic amino acids. Is realized. More preferably, it may be preferable to include a mutation of His that has been confirmed to be effective in Lys or Arg. As another approach, the amino acid sequence at the tip of the Thumb domain ((Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / It is realized by substituting one or more amino acids of (Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met)). Each mutation may also include a deletion or insertion.
また、図６に示したように、測定する領域で接近距離が異なる（１Åと３Å）ように、今回の事例においてもエキソヌクレアーゼドメインとThumbドメインの接近には「ズレ」の要素も含まれていることが予想される。よって、ドメインを近づける、もしくは遠ざける以外にも適度にずらすことによっても良い効果が得られる。「ズレ」を導入する場合、変異を導入していない酵素よりも下限として０．１Å、より好ましくは０．３Å、さらに好ましくは０．５Å程度のズレを生じさせる場合である。あるいは、変異を導入していない酵素よりも上限として１５Å、より好ましくは１０Å、さらに好ましくは５Å程度ズレを生じさせる場合である。ズレの方向は左右、上下どちらでも良く、また、近づけたり、遠ざけたりする変化と混合しても良い。具体的な方法としては、上に挙げたアミノ酸変異を組み合わせることが考えられる。 In addition, as shown in FIG. 6, the approach distance between the exonuclease domain and the Thumb domain also includes a “displacement” element so that the approach distance differs in the measurement region (1Å and 3Å). It is expected that Therefore, a good effect can be obtained by appropriately shifting the domain in addition to moving it closer or further away. In the case of introducing “deviation”, it is a case where a lower limit of 0.1 Å, more preferably 0.3 Å, and even more preferably about 0.5 と し て is generated as a lower limit than the enzyme in which no mutation is introduced. Alternatively, it is a case where an upper limit of 15 し て, more preferably 10 Å, and still more preferably about 5 よ り is produced as compared with an enzyme into which no mutation has been introduced. The direction of misalignment may be left or right or up and down, and may be mixed with changes that move closer or further away. As a specific method, it is possible to combine the amino acid mutations listed above.
ただ、ドメイン間の距離が近づきすぎる、または、遠ざかりすぎると弊害が起きる可能性も考慮する必要がある。極端な場合、ポリメラーゼとして機能しなくなる可能性も考えなくてはならない。 However, it is also necessary to consider the possibility of harmful effects if the distance between domains is too close or too far. In extreme cases, you must also consider the possibility of not functioning as a polymerase.
また、二つのドメインのそれぞれに１つ以上のアミノ酸に変異を導入する場合も考えられる。ただ、その場合も、上に示した考え方、すなわち、ドメイン間の距離もしくはズレを電荷や疎水的相互作用から推測すれば良い。例えば、KOD DNAポリメラーゼの147番目のヒスチジンを負電荷のアスパラギン酸に置換した変異体の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をさらに低下させる、もしくはPCR性能向上させる場合、Thumbドメインの先端配列を更に塩基性のアミノ酸に変異させることなどが考えられる。 It is also conceivable that mutations are introduced into one or more amino acids in each of the two domains. However, even in that case, the above-described concept, that is, the distance or deviation between domains may be estimated from the charge or hydrophobic interaction. For example, when further reducing the 3′-5 ′ exonuclease activity of a mutant in which 147th histidine of KOD DNA polymerase is substituted with negatively charged aspartic acid or improving the PCR performance, the tip sequence of the Thumb domain is further based. It may be possible to mutate to a sex amino acid.
また、H147Y変異体のようにエキソヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性が共に向上しているクローンも存在する。このクローンにおいて、相対エキソヌクレアーゼ活性(EXO/POL)は0.9であり、ほとんど野生型と同等であるにも関らず、PCR効率の向上が確認されている。この結果は、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が低下することと、PCR効率が向上することとはある程度独立して規定されていることを示していると思われる。この効果は、相対エキソヌクレアーゼ活性が同等であってもPCR効率が異なるクローンがある（H147DとI142K、H147EとI142Q）ことからも予想される。H147YではこのPCR効率を向上させる効果が顕著に出現した例であると推察される。すなわち、本発明の方法に従うと、このように総合評価的に良いDNAポリメラーゼも取得することが出来る。その方法としては、H147Yのように、エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換することによって達成することができる。また、H147D、H147Eにおいても上に示したように3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が低下した効果以上に、PCR効率を高める効果が確認されていることから、(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Gly配列の一つ以上のアミノ酸を酸性性アミノ酸に置換することによっても達成されることが予想される。これらの効果は、エキソヌクレアーゼドメインとThumbドメイン間の距離を縮小させる、もしくは「ズレ」を導入する効果に加えて、Thumbドメインを安定化したことによる効果も含まれると思われる。ポリメラーゼの活性中心で合成された二本鎖DNAは、PalmドメインとThumbドメインに挟まれる形で安定化されることが知られている。上に示したように、特にKOD DNAポリメラーゼのThumbドメインの先端は柔軟性に富んでいることが知られていることから、この柔軟性をエキソヌクレアーゼドメイン-Thumbドメインの相互作用により安定化した結果、ポリメラーゼ活性へも影響が及びPCR効率が向上した可能性があると考えられる。これらの効果は複合的な現象として発現することが多いが、ほぼ上記の方法に従うことにより、意図した方向へ変異させることが可能である。 There are also clones such as the H147Y mutant that have improved exonuclease activity and polymerase activity. In this clone, the relative exonuclease activity (EXO / POL) was 0.9, and it was confirmed that the PCR efficiency was improved despite being almost equivalent to the wild type. This result seems to indicate that the decrease in 3′-5 ′ exonuclease activity and the increase in PCR efficiency are regulated to some extent independently. This effect is expected from the fact that there are clones with different PCR efficiency (H147D and I142K, H147E and I142Q) even though the relative exonuclease activity is equivalent. It is speculated that H147Y is an example in which the effect of improving the PCR efficiency has remarkably appeared. That is, according to the method of the present invention, a DNA polymerase having a good overall evaluation can be obtained in this way. The method can be achieved by replacing one or more amino acids in the (Lys / Phe) -Tyr-His-Glu-Gly sequence of the loop structure of the exonuclease domain with a hydrophobic amino acid, such as H147Y. it can. In addition, as shown above in H147D and H147E, the effect of increasing the PCR efficiency was confirmed in addition to the effect of reducing the 3′-5 ′ exonuclease activity, so (Lys / Phe) -Tyr-His It is also expected to be achieved by replacing one or more amino acids of the -Glu-Gly sequence with acidic amino acids. These effects may include the effect of stabilizing the Thumb domain in addition to the effect of reducing the distance between the exonuclease domain and the Thumb domain or introducing “deviation”. It is known that double-stranded DNA synthesized at the active center of a polymerase is stabilized in a form sandwiched between a Palm domain and a Thumb domain. As shown above, the tip of the Thumb domain of KOD DNA polymerase is known to be particularly flexible, and this flexibility was stabilized by the exonuclease domain-Thumb domain interaction. It is considered that the polymerase activity may be affected and the PCR efficiency may be improved. These effects often appear as a complex phenomenon, but can be mutated in the intended direction by almost following the above method.
また、KOD DNAポリメラーゼ以外のポリメラーゼにおいては、野生型酵素におけるエキソヌクレアーゼドメインとThumbドメインの距離がKOD DNAポリメラーゼと異なるものも多く、それぞれの酵素の性質を規定していると推定される。よって、KOD DNAポリメラーゼ以外のDNAポリメラーゼのドメイン間の距離やズレをどの程度変化させるかについては、変異させるアミノ酸の、種類を検討することが望ましい。ただ、変異の方向性としては、KOD DNAポリメラーゼの例に倣えば良い。 In addition, in many polymerases other than KOD DNA polymerase, the distance between the exonuclease domain and the Thumb domain in the wild-type enzyme is different from that in KOD DNA polymerase, and it is presumed that the properties of each enzyme are defined. Therefore, it is desirable to examine the type of amino acid to be mutated as to how much the distance and deviation between domains of DNA polymerases other than KOD DNA polymerase are changed. However, as the direction of mutation, it may follow the example of KOD DNA polymerase.
さらに、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの「エキソヌクレアーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列および/またはそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列に変異を導入することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの改変方法である。 Furthermore, the present invention relates to a loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif present in the “exonuclease domain” of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity and / or a “Thumb domain” adjacent thereto. This is a method for modifying a thermostable DNA polymerase, characterized by introducing a mutation into the amino acid sequence at the tip of.
本発明は、始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応用され得る。本発明の要となる「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列、およびそれに近接する「Ｔｈｕｍｂドメイン」の先端のアミノ酸配列は、始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの間で驚くほど保存されている。エキソヌクレアーゼドメインのループ構造の配列は全て、(Lys/Phe)-Tyr-His-Glu-Glyからなっており、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列は(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)で表すことができる。括弧内はどちらかのアミノ酸を採用することができるが、どれもほぼ同一カテゴリーに分類されるアミノ酸であり、化学的性質はほぼ同等であることが予想される。 The present invention can be applied to thermostable DNA polymerases derived from primordial bacteria. The loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif present in the “exonuclease domain” and the amino acid sequence at the tip of the “Thumb domain” adjacent thereto are the thermostable DNA polymerase derived from protozoa Is surprisingly preserved between. The sequence of the loop structure of the exonuclease domain consists of (Lys / Phe) -Tyr-His-Glu-Gly, and the tip sequence of the Thumb domain is (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met). Either amino acid can be adopted in the parentheses, but all are amino acids classified into almost the same category, and the chemical properties are expected to be almost equivalent.
特に、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列は高度に保存されており、既にヒスチジン残基を用いた検討で非常に効果的に様々な性質を有する変異体の創出に成功していることもあり、重要である。 In particular, the loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif is highly conserved, and has already succeeded in creating mutants with various properties very effectively in studies using histidine residues. It is also important.
本発明において、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列のチロシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基は、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に好適に変異させうる。それぞれの効果は、１４７番目のヒスチジン残基の変異の場合と同様な効果を期待することができ、ＰＣＲ効率の向上には、酸性アミノ酸、もしくは疎水性アミノ酸への置換が好ましく行われる。複数のアミノ酸変異を伴っても良いが、ループ構造を壊さない程度の変異が好ましいといえる。
本明細書において：
「酸性アミノ酸」は、Ｇｌｕ、Ａｓｐを含む。
「塩基性アミノ酸」は、Ａｒｇ，Ｌｙｓ、Ｈｉｓを含む
「疎水性アミノ酸」は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Tyrを含む
一方、正確性を向上させる用途では、塩基性アミノ酸への置換が好ましいといえる。この場合も、１４７番目のヒスチジン残基の変異の場合と同様な効果を期待することができる。複数のアミノ酸変異を伴っても良いが、上記同様、ループ構造を壊さない程度の変異が好ましいといえる。
また、本発明はＴｈｕｍｂドメインの先端配列を変異されることでも実現される。すなわち、(Val/Ile)-Ala-Lys-(Lys/Arg)-Leu-Ala-Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)配列の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする。ただ、この配列は複雑で、Ｘ線結晶解析においても電子密度が薄く詳細な構造が決まっていないことから、明確にどのアミノ酸を変異されるべきかは、慎重に吟味して決定する必要がある。
In the present invention, the tyrosine residue, glutamic acid residue, and glycine residue of the loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif can be suitably mutated to acidic amino acids, basic amino acids, or hydrophobic amino acids. Each effect can be expected to be the same as in the case of mutation of the 147th histidine residue, and for the improvement of PCR efficiency, substitution with an acidic amino acid or a hydrophobic amino acid is preferably performed. Although a plurality of amino acid mutations may be involved, it can be said that a mutation that does not break the loop structure is preferable.
In this specification:
“Acid amino acid” includes Glu and Asp.
“Basic amino acid” includes Arg, Lys, His, and “hydrophobic amino acid” includes Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Met, Pro, Ala, Tyr. Substitution with basic amino acids is preferred. In this case, the same effect as that in the mutation of the 147th histidine residue can be expected. Although it may be accompanied by a plurality of amino acid mutations, it can be said that a mutation that does not break the loop structure is preferable as described above.
The present invention can also be realized by mutating the tip sequence of the Thumb domain. That is, (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met) One or more amino acids of the sequence are substituted with acidic amino acids, basic amino acids, or hydrophobic amino acids. However, since this sequence is complex and the electron density is low and the detailed structure has not been determined in X-ray crystallography, it is necessary to carefully determine which amino acid should be mutated. .
先ほども述べたが、本発明は始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されない。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、9#N-7 ＤＮＡポリメラーゼが好適に用いられ、特に、好ましくはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。 As described above, the present invention is not particularly limited as long as it is a thermostable DNA polymerase derived from protozoa. KOD DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Deep Vent DNA polymerase, Tag DNA polymerase, Tgo DNA polymerase, and 9 # N-7 DNA polymerase are preferably used, and KOD DNA polymerase is particularly preferably used.
ただ、それぞれのポリメラーゼの野生型酵素のＥ−Ｃｌｅｆｔの幅は様々であり、それぞれの希望する性質に合わせて、変異させるアミノ酸を選択することが好ましい。例えば野生型酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を向上させたい場合はExoIモチーフのC末端側に存在するループ配列のいずれかを塩基性アミノ酸に変換すれば良い。または、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を減少させる、もしくはPCR効率を向上させたい場合は、ExoIモチーフのC末端側に存在するループ配列のいずれかを酸性性アミノ酸もしくは疎水性アミノ酸に変換すれば良い。 However, the range of E-Cleft of the wild-type enzyme of each polymerase varies, and it is preferable to select an amino acid to be mutated in accordance with each desired property. For example, in order to improve the 3'-5 'exonuclease activity of the wild-type enzyme, one of the loop sequences existing on the C-terminal side of the ExoI motif may be converted to a basic amino acid. Or, if you want to reduce 3'-5 'exonuclease activity or improve PCR efficiency, convert any of the loop sequences present on the C-terminal side of the ExoI motif to acidic or hydrophobic amino acids. good.
また、本発明は上記の様々な方法によって作成された改変された３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにも関する。 The present invention also relates to thermostable DNA polymerases having modified 3'-5 'exonuclease activity made by the various methods described above.
さらに、本発明は、それらのタンパク質を発現させるために構築されたベクターにも及ぶ。特に、pLED-MIもしくはpBluescript由来のベクターが好適に使用される。 Furthermore, the present invention extends to vectors constructed to express those proteins. In particular, vectors derived from pLED-MI or pBluescript are preferably used.
さらに、本発明は、これらベクターにより形質転換された宿主細胞にも及び、特に、大腸菌（Escherichia coli）が好ましく用いられる。 Furthermore, the present invention extends to host cells transformed with these vectors, and Escherichia coli is particularly preferably used.
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシヌクレオチド５’−トリホスフェートのα-ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオチド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。 In the present invention, DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid bonded to deoxyribonucleic acid by covalently binding the α-phosphate of deoxynucleotide 5′-triphosphate to the 3′-hydroxyl group of the oligonucleotide or polynucleotide annealed to the template DNA. It refers to the activity of catalyzing the reaction of introducing 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
その活性測定法は、酵素活性が強い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl、滅菌水１０μl、及び酵素溶液５μlをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。その後氷冷し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ：１０mg/ml サケ***ＤＮＡ
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とはＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。その活性測定は、５０μlの反応液（１２０mM Tris-塩酸緩衝液(ｐＨ８．８、２５℃)、１０mM ＫＣｌ、６mM 硫酸アンモニウム、１mM ＭｇＣｌ2、０．１％Triton X-100、０．００１％ ＢＳＡ、５μgトリチウムラベルされた大腸菌）を１．５mlのマイクロチューブに分注しＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして０．１％のＢＳＡ ５０μlを加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液１００μlを加えて混合する。氷上で１５分放置した後、１２０００回転にて１０分間遠心分離し沈殿を分離する。上清１００μlの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
When the enzyme activity is strong, the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer. In the present invention, 25 μl of the following solution A, 5 μl of solution B, 5 μl of solution C, 10 μl of sterilized water, and 5 μl of enzyme solution are added to a microtube and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. After cooling with ice, 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added. After stirring, the mixture is further ice-cooled for 10 minutes. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to measure nucleotide incorporation of the template DNA. To do. One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
A: 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 μg / ml BSA (bovine serum albumin)
B: 2 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 10mg / ml salmon sperm DNA
In the present invention, the 3′-5 ′ exonuclease activity refers to the activity of excising the 3 ′ terminal region of DNA and releasing 5′-mononucleotide. The activity was measured using 50 μl of a reaction solution (120 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8, 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, Dispense 5 μg of tritium-labeled E. coli) into a 1.5 ml microtube and add DNA polymerase. After reacting at 75 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 μl of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
本発明において、ＤＮＡ合成速度とは単位時間あたりのＤＮＡ合成数をいう。その測定法はＤＮＡポリメラーゼの反応液(２０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)、８mM 塩化マグネシウム、７．５mM ジチオスレイトール、１００μg/ml ＢＳＡ、０．１mM ｄＮＴＰ、０．２μCi[α-32Ｐ]ｄＣＴＰ)を、プライマーをアニーリングさせたM13mp18 1本鎖ＤＮＡと７５℃で反応させる。反応停止は等量の反応停止液(５０mM 水酸化ナトリウム、１０mM ＥＤＴＡ、５％フィコール、０．０５％ブロモフェノールブルー)を加えることにより行う。上記反応にて合成されたＤＮＡをアルカリアガロースゲル電気泳動にて分画した後、ゲルを乾燥させオートラジオグラフィーを行う。ＤＮＡサイズマーカーとしてはラベルされたλ/HindIIIを用いる。このマーカーのバンドを指標として合成されたＤＮＡのサイズを測定することによってＤＮＡ合成速度を求める。 In the present invention, the DNA synthesis rate refers to the number of DNA synthesis per unit time. The measurement method was a DNA polymerase reaction solution (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 7.5 mM dithiothreitol, 100 μg / ml BSA, 0.1 mM dNTP, 0.2 μCi [α- 32 P] dCTP) is reacted at 75 ° C. with M13mp18 single-stranded DNA with annealed primers. The reaction is stopped by adding an equal amount of a stop solution (50 mM sodium hydroxide, 10 mM EDTA, 5% Ficoll, 0.05% bromophenol blue). After the DNA synthesized by the above reaction is fractionated by alkaline agarose gel electrophoresis, the gel is dried and autoradiography is performed. Labeled λ / HindIII is used as a DNA size marker. The DNA synthesis rate is determined by measuring the size of the synthesized DNA using the marker band as an index.
本発明において、熱安定性とはポリメラーゼ５単位を１００μｌの緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８；２５℃での測定値）、１０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に混合し、９５℃、６時間の処理での残存活性を意味する。 In the present invention, thermostability refers to 5 units of polymerase in 100 μl buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.8; measured value at 25 ° C.), 10 mM potassium chloride, 10 mM ammonium sulfate, 2 mM magnesium sulfate, 0.1%. TritonX-100, 0.1 mg / ml BSA, 5 mM 2-mercaptoethanol) and the residual activity after treatment at 95 ° C. for 6 hours.
また、本発明において、ＤＮＡポリメラーゼの正確性とはＤＮＡ複製時における塩基の取り込みの正確性をいう。本発明におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性の評価には、ストレプトマイシン耐性に関与するリボゾーマルタンパク質Ｓ１２（rpsL）遺伝子を指標として行う。ストレプトマイシンは原核細胞のタンパク質合成を阻害する抗生物質であり、細菌の３０ＳリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合してタンパク質合成の開始複合体形成反応を阻害し、また遺伝子暗号の誤読を引き起こす。ストレプトマイシン耐性変異株ではリボゾームタンパク質Ｓ１２に変異が見られる。この変異はリボゾームの翻訳忠実度を上げるため、サプレッサーｔＲＮＡによる終始コドンの読み取りを抑制するなど多面的効果(pleiotropic effect）を示すことが知られている。したがって、rpsL遺伝子をＰＣＲにより増幅し菌に形質転換した場合、変異が多く導入されるほどストレプトマイシン耐性菌の出現頻度が増すこととなる。 In the present invention, the accuracy of DNA polymerase refers to the accuracy of base incorporation during DNA replication. The accuracy of the DNA polymerase in the present invention is evaluated using the ribosomal protein S12 (rpsL) gene involved in streptomycin resistance as an index. Streptomycin is an antibiotic that inhibits prokaryotic protein synthesis, binds to bacterial 30S ribosomal RNA (rRNA), inhibits the initiation complex formation reaction of protein synthesis, and causes misreading of the genetic code. In the streptomycin resistant mutant, ribosomal protein S12 is mutated. This mutation is known to exhibit a pleiotropic effect such as suppression of reading of the termination codon by suppressor tRNA in order to increase the translation fidelity of the ribosome. Therefore, when the rpsL gene is amplified by PCR and transformed into a bacterium, the more the mutations are introduced, the more frequently the streptomycin-resistant bacterium appears.
プラスミドpMol21(Journal of Molecular Biology(1999)289,835-850に記載)は、rpsL遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いるのが好ましい。このプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子上にＰＣＲ増幅用プライマーセット（片方をビオチン化、MluI制限酵素サイトを導入）を設計し、プラスミドの全長を様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、ストレプトアビジンビーズを用いて精製し、制限酵素MluIを用いて切り出した後、ＤＮＡリガーゼを用いて結合して大腸菌を形質転換して、アンピシリンとアンピシリン及びストレプトマイシンを含有する２種類のプレートに接種し、それぞれのプレートに出現したコロニーの比を算出することにより遺伝子複製の正確性を求める。 The plasmid pMol21 (described in Journal of Molecular Biology (1999) 289, 835-850) is preferably a plasmid containing an rpsL gene and an ampicillin resistance gene. A primer set for PCR amplification (biotinylated on one side and MluI restriction enzyme site introduced) was designed on the ampicillin resistance gene of this plasmid, and the entire length of the plasmid was PCR amplified with various thermostable DNA polymerases, and streptavidin beads were And then excised with the restriction enzyme MluI, ligated with DNA ligase, transformed into E. coli, inoculated into two types of plates containing ampicillin, ampicillin and streptomycin. The accuracy of gene duplication is determined by calculating the ratio of colonies that appeared.
これらの改変された酵素を製造する方法としては、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある。 As a method for producing these modified enzymes, there is a method for producing a mutant KOD DNA polymerase having a new function by introducing a mutation into a gene encoding wild-type KOD DNA polymerase and using a protein engineering technique. .
変異を導入するＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、例えば、パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株由来の配列表・配列番号３に記載の遺伝子が挙げられる。 The gene encoding the DNA polymerase for introducing the mutation is not particularly limited, and examples thereof include the gene described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 3 derived from Pyrococcus kodakaraensis strain KOD1.
野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は既知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と変異原となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などからタンパク質工学的手法、例えばＰＣＲや部位特異的変異などの方法を用いることができる。 Any known method may be used for introducing a mutation into the wild-type KOD DNA polymerase gene. For example, protein engineering techniques such as PCR and site-directed mutagenesis can be used, such as a method of contacting a wild-type KOD DNA polymerase gene with a mutagen agent or a method using ultraviolet irradiation.
本発明で使用したQuickChange site-directed mutagenesisキット（ストラタジーン製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてPfu ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素DpnIを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成されたプラスミドにより大腸菌を形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。 The QuickChange site-directed mutagenesis kit (manufactured by Stratagene) used in the present invention is (1) denatured the plasmid into which the target gene is inserted, anneals the mutation primer to the plasmid, and then uses Pfu DNA polymerase. (2) Repeat the cycle of (1) 15 times, (3) Selectively cleave only the plasmid as a template using the restriction enzyme DpnI, (4) E. coli with the newly synthesized plasmid Is a kit that can obtain a transformant carrying a plasmid into which the target mutation has been introduced.
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、pLED-MIもしくはpBluescript由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。 この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。次に３’−５ ’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、両者の活性比率を野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと比較することにより３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の変化を測定することができる。 The modified DNA polymerase gene is transferred to an expression vector as necessary, and after transforming, for example, E. coli as a host, it is applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form a colony. The colony is inoculated in a nutrient medium such as LB medium or 2 × YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted. A vector derived from pLED-MI or pBluescript is preferred. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells. For example, ultrasonic treatment, a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used. This crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured. Next, the change in 3'-5 'exonuclease activity can be measured by measuring the 3'-5' exonuclease activity and comparing the activity ratio of both to wild type KOD DNA polymerase.
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスG-25（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロース、ヘパリンセファロースなどのカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。 Any method may be used as a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method, for example, the following method. After collecting the cells obtained by culturing in a nutrient medium, the crude enzyme solution is obtained by crushing and extraction by enzymatic or physical crushing methods. The obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the KOD DNA polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation. This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by column chromatography such as Q Sepharose and heparin Sepharose to obtain a purified enzyme preparation. The purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows an almost single band.
また、得られた酵素を用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、その増幅の有無もしくは強度からＰＣＲ効率の評価を行うことができ、またＤＮＡ複製の正確性も評価することができる。 Moreover, by performing PCR amplification using the obtained enzyme, PCR efficiency can be evaluated from the presence or absence or strength of the amplification, and the accuracy of DNA replication can also be evaluated.
また、本発明の核酸増幅方法は、本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰを反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法を挙げることができる。プライマーは２種のオリゴヌクレオチドであって、一方は他方のＤＮＡ生成物に相補的であるプライマーであることが好ましい。また、加熱および冷却を繰り返すのが好ましい。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その活性を維持するために、例えばマグネシウムイオンのような２価のイオン、及び例えばアンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンのような１価のイオンを共存させることが好ましい。また、ＰＣＲ反応液には、緩衝液及びこれらのイオンを含むと共に、ＢＳＡ、例えばTriton X-100のような非イオン性界面活性剤、及び緩衝液が存在してもよい。緩衝剤としては、主にトリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが挙げられる。 In addition, the nucleic acid amplification method of the present invention uses the modified heat-resistant DNA polymerase of the present invention to synthesize a DNA primer extension product by extending the primer by reacting the primer and dNTP using DNA as a template. The method of doing can be mentioned. The primer is preferably two oligonucleotides, one of which is complementary to the other DNA product. Moreover, it is preferable to repeat heating and cooling. In order to maintain the activity of the DNA polymerase of the present invention, it is preferable that a divalent ion such as magnesium ion and a monovalent ion such as ammonium ion and / or potassium ion coexist. The PCR reaction solution may contain a buffer solution and these ions, and may contain BSA, for example, a nonionic surfactant such as Triton X-100, and a buffer solution. Examples of the buffer mainly include Good buffer such as Tris and Hepes, and phosphate buffer.
本発明の核酸増幅用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。 The nucleic acid amplification reagent of the present invention comprises two primers whose one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase, divalent ion in the present invention as described above, More specifically, two kinds of primers containing a monovalent ion and a buffer, and one primer is complementary to the other primer DNA extension product, dNTP and the above heat-resistant DNA polymerase, magnesium ion, ammonium ion And / or potassium ions, BSA, nonionic surfactants and buffers as described above.
本発明の核酸増幅用試薬の別な態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。 As another embodiment of the reagent for nucleic acid amplification of the present invention, two primers, one of which is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase of the present invention as described above, There are nucleic acid amplification reagents including divalent ions, monovalent ions, buffers, and, if necessary, antibodies having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3′-5 ′ exonuclease activity of thermostable DNA polymerase. Examples of the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody.
本発明の遺伝子変異導入用試薬は、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である変異導入プライマー、ｄＮＴＰ、及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。さらに上述したような２価イオン、１価イオン、緩衝液を含んでもよい。 The reagent for gene mutation introduction of the present invention includes a mutation introduction primer in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer, dNTP, and the heat-resistant DNA polymerase in the present invention as described above. Further, divalent ions, monovalent ions, and buffer solutions as described above may be included.
また、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を化学的もしくは遺伝子工学的手法を用いて減衰もしくは失活させ、様々な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するものであってもよい。 In addition, the thermostable DNA polymerase of the present invention attenuates or inactivates the polymerase activity of the thermostable DNA polymerase of the present invention as described above by using chemical or genetic engineering techniques, and various 3′-5 ′ exo. It may have nuclease activity.
また、本発明の実施態様としては、上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを１種以上混合したことを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ組成物がある。具体的には、上述のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと別なＤＮＡポリメラーゼ、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼなどを混合せしめることによって、長鎖核酸を増幅する場合、例えばｌｏｎｇＰＣＲの際に有用な組成物を得ることができる。実際、長鎖核酸を増幅する方法として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼまたはＴｉポリメラーゼまたはこれらの変異酵素を混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いて、ＰＣＲを行う方法が報告されている（Barns, W.M.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220）。 As an embodiment of the present invention, there is a DNA polymerase composition characterized in that one or more heat-resistant DNA polymerases according to the present invention as described above are mixed. Specifically, when a long-chain nucleic acid is amplified by mixing a thermostable DNA polymerase in the present invention as described above with another DNA polymerase, such as a DNA polymerase with low 3′-5 ′ exonuclease activity, For example, a composition useful for long PCR can be obtained. In fact, as a method for amplifying a long-chain nucleic acid, a DNA polymerase composition in which Taq polymerase lacking 3′-5 ′ exonuclease activity and Pfu polymerase or Ti polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity or these mutant enzymes are mixed A method for performing PCR using a product has been reported (Barns, WM (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2216-2220).
上述したように、本発明により、様々な性質耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの効率的改変方法が明かとなった。この方法を用いることにより、従来の始原菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを様々な用途、すなわち長い領域の増幅や、更に正確性の高い増幅など様々な用途に使用できるように、改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを創出することが可能となる。 As described above, according to the present invention, an efficient method for modifying a heat-resistant DNA polymerase having various properties has been clarified. By using this method, heat-resistant DNA polymerase derived from conventional protozoa has been modified so that it can be used in various applications, such as amplification of long regions and amplification with higher accuracy. It becomes possible to create a DNA polymerase.
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明する。
参考例１ 超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
鹿児島県子宝島において単離した超好熱始原菌パイロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ１株を９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従ってＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調製した。パイロコッカス・フリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼ(Pfu ＤＮＡポリメラーゼ)の保存領域アミノ酸配列に基づいて、２種のプライマー(5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3' 及び5'-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3')を合成した。この２種のプライマーを使用して調製したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Reference Example 1 Cloning of a DNA polymerase gene derived from the hyperthermophilic archaeon KOD1 strain After culturing the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1 strain isolated at Kotakara Island, Kagoshima Prefecture at 95 ° C, the cells were recovered. did. Chromosomal DNA of KOD1 strain was prepared from the obtained bacterial cells according to a conventional method. Two kinds of primers (5′-GGATTAGTATAGTGCCAATGGSSGGCGA-3 ′ and 5′-GAGGGCAGAAGTTTATTCCGAGCTT-3 ′) were synthesized based on the amino acid sequence of the conserved region of Pyrococcus furiosus-derived DNA polymerase (Pfu DNA polymerase). PCR was performed using DNA prepared using these two primers as a template.
ＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を決定した後、この増幅ＤＮＡをプローブとして、ＫＯＤ１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコードする断片のサイズを求めた（約４〜７Kbp）。更に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収し、プラスミドpBluescript（ストラタジーン製）に挿入し、これらの混合物よりエシェリヒア・コリ(Escherichia coli) JM109を形質転換してライブラリーを作製した。サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライブラリーからＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有すると考えられるクローン株(エシェリヒア・コリJM109/pBSKOD1)を取得した。 After determining the base sequence of the PCR amplified fragment and determining the amino acid sequence, Southern hybridization was performed on the KOD1 strain chromosomal DNA restriction enzyme treatment product using this amplified DNA as a probe, and the size of the fragment encoding DNA polymerase was determined. Determined (about 4-7 Kbp). Furthermore, a DNA fragment of this size was recovered from an agarose gel, inserted into a plasmid pBluescript (Stratagene), and Escherichia coli JM109 was transformed from these mixtures to prepare a library. Colony hybridization was performed using the probe used for Southern hybridization, and a clonal strain (Escherichia coli JM109 / pBSKOD1) thought to contain a DNA polymerase gene derived from the KOD1 strain was obtained from the above library.
取得した上記クローン株よりプラスミド、pBSKOD1を回収し、定法に従い、塩基配列を決定した。さらに求められた塩基配列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７０個のアミノ酸がコードされていた（配列番号１)。 Plasmid and pBSKOD1 were collected from the obtained clone strain and the nucleotide sequence was determined according to a conventional method. Further, the amino acid sequence was estimated from the obtained base sequence. The DNA polymerase gene derived from the KOD1 strain was composed of 5010 bases and encoded 1670 amino acids (SEQ ID NO: 1).
完全なポリメラーゼ遺伝子を作製するために、２箇所の介在配列(１３７４〜２４５３bp及び２７０８〜４３１６bp）をＰＣＲ融合法により取り除いた。ＰＣＲ融合法では、クローン株より回収したプラスミドを鋳型に３組のプライマーを組み合わせて各々ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を増幅した。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように設計した。また、両端には別々な制限酵素サイト（Ｎ末端側：EcoRV、Ｃ末端側：BamHI）が創出されるように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中構造***に位置する断片とＮ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。また、同様に構造***に位置する断片と、Ｃ末端側に位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。 In order to produce a complete polymerase gene, two intervening sequences (1374-2453 bp and 2708-4316 bp) were removed by PCR fusion. In the PCR fusion method, a plasmid recovered from a clonal strain was used as a template and 3 sets of primers were combined to perform PCR, and 3 fragments excluding intervening sequences were amplified. At this time, the primers used for PCR were designed so that the same sequence as the binding partner would be on the side that binds to other fragments. Moreover, it designed so that a separate restriction enzyme site (N terminal side: EcoRV, C terminal side: BamHI) might be created at both ends. Next, the fragment located in the center of the PCR amplified fragment and the fragment located on the N-terminal side were mixed, and PCR was performed using each fragment as a primer. Similarly, a fragment located in the center of the structure and a fragment located on the C-terminal side were mixed, and PCR was performed using each fragment as a primer.
このようにして得られた２種の断片を用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末端側にEcoRV、Ｃ末端側にBamHIサイトを有するＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な形の遺伝子断片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロモーターで誘導可能な発現ベクターpET-8cのNcoI/BamHIサイト、先に創出した制限酵素サイトを利用してサブクローニングを行い、組換え発現ベクター、pET-pol）を得た。なお、エシェリヒア・コリ BL21(DE3)/pET-polは生命工学工業研究所へ寄託されている(FERM BP-5513)。
実施例１
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを改変するために、プラスミドpET-polからＫＯＤポリメラーゼ遺伝子を切り出し、pBluescriptにサブクローニングを行った。すなわち、pET-polを制限酵素XbaIとBamHI（東洋紡績製）にて切断し、約２．３kbのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を切り出した。次にこのＤＮＡ断片をライゲーションキット(東洋紡績製 Ligation high）を用いて、XbaIとBamHIで切断したプラスミドpBluescript SK(-)と連結し、コンピテントセル（東洋紡績製 competent high JM109）を形質転換した。１００μg/mlのアンピシリンを含んだＬＢ寒天培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天；ギブコ製）で３５℃で１６時間培養し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。更に、部分塩基配列を確認してＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含むプラスミドpKOD1を得た。
実施例２ 改変型遺伝子(Ｈ１４７Ｅ）の作製及び改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
実施例１で得られたプラスミドpKOD1を用いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの第１４７番目のヒスチジンをグルタミン酸に置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつプラスミドを作製した(pKOD HE)。該プラスミドの作製はQuickChange site directed mutagenesis kit（ストラタジーン製）を用いた。方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号４及び５に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。選られたプラスミドによりエシェリヒア・コリJM109を形質転換し、エシェリヒア・コリJM109(pKOD HE)を得た。
PCR was performed again using the two kinds of fragments thus obtained, the intervening sequence was removed, and a complete DNA encoding a DNA polymerase derived from KOD1 strain having EcoRV on the N-terminal side and BamHI site on the C-terminal side was obtained. Shaped gene fragments were obtained. Furthermore, subcloning was performed using the NcoI / BamHI site of the expression vector pET-8c inducible with the T7 promoter and the previously created restriction enzyme site to obtain a recombinant expression vector, pET-pol). Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-pol has been deposited with the Biotechnology Institute (FERM BP-5513).
Example 1
In order to modify the thermostable DNA polymerase, the KOD polymerase gene was excised from the plasmid pET-pol and subcloned into pBluescript. That is, pET-pol was cleaved with restriction enzymes XbaI and BamHI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to cut out an approximately 2.3 kb KOD DNA polymerase gene. Next, this DNA fragment was ligated with a plasmid pBluescript SK (-) cleaved with XbaI and BamHI using a ligation kit (Toyobo Ligation high), and transformed into a competent cell (Toyobo competent high JM109). . Incubate for 16 hours at 35 ° C. in LB agar medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 1.5% agar; Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin, A plasmid was prepared from the obtained colonies. Furthermore, the partial base sequence was confirmed to obtain a plasmid pKOD1 containing KOD DNA polymerase.
Example 2 Production of Modified Gene (H147E) and Purification of Modified Thermostable DNA Polymerase Modified thermotolerant obtained by substituting glutamic acid for the 147th histidine of KOD DNA polymerase using plasmid pKOD1 obtained in Example 1 A plasmid having a DNA polymerase gene was prepared (pKOD HE). The plasmid was prepared using a QuickChange site directed mutagenesis kit (Stratagene). The method was performed according to the instruction manual. As the mutagenesis primers, the primers described in SEQ ID NOs: 4 and 5 were used. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the selected plasmid to obtain Escherichia coli JM109 (pKOD HE).
得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μg/mlのアンピシリンを含有するＴＢ培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注した。この培地に予め１００μg/mlのアンピシリンを含有する５０mlのＬＢ培地(１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリJM109(pKOD HE）(５００ml坂口フラスコ使用）を接種し、３５℃にて１２時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、４００mlの破砕緩衝液(１０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、８０mM ＫＣｌ、５mM ２−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡ）に懸濁後、フレンチプレス処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて３０分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(５０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ８．０)、５０mM 塩化カリウム、１mM ジチオスレイトール、０．１％ Tween20、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、変異型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＨＥ)を得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合は保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行った。
（試薬）
Ａ：４０mM Tris-HCl緩衝液(ｐＨ７．５)
１６mM 塩化マグネシウム
１５mM ジチオスレイトール
１００μg/ml ＢＳＡ
Ｂ： ２μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５mM ｄＮＴＰ(２５０cpm/pmol [３Ｈ]ｄＴＴＰ)
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸(２mMピロリン酸ナトリウム)
Ｅ： １０mg/mlサケ***ＤＮＡ
（方法）
Ａ液２５μl、Ｂ液５μl、Ｃ液５μl及び滅菌水１０μlをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μlを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μl、Ｄ液１００μlを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
実施例３ 変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）の結晶の作製
結晶化の条件を以下に示す。
方法： Hanging drop vapor diffusion法
タンパク質溶液組成： 6.0mg/ml KOD DNAポリメラーゼ（H147E）
50mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1mM EDTA
1.0mM DTT
0.001% Tween20
50% Glycerol
リザーバー溶液組成： 3% Polyethylene glycol 1450
10mM NiCl
Glycine-NaOH
17.5% Glycerol
Drop: タンパク質溶液 2μl+リザーバー溶液2μl
結晶化温度: 20℃
この条件を用いて数日後には図３に示すような良好な結晶（0.2ｃｍ×0.08ｃｍ×0.08ｃｍ）をえることができ、次の実験に用いた。
実施例４ 変異型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈ１４７Ｅ）の結晶のＸ線回折データ測定
Ｘ線照射による結晶の損傷を抑えるため、１００Ｋの液体窒素蒸気下で回折強度データの測定を行った。この際、抗凍結剤としてタンパク質溶液とリザーバー溶液を等量混合した溶液にＭＰＤ（和光純薬製）を１２％になるように加えた溶液を用いた。その結果、0.20×0.08×0.08mmの結晶を取得することができた（図３）。その結晶を用いてX線回折実験を行ったところ、約２．７５Åの分解能までの回折点が観測でき、表２示すような空間群と格子定数を決定することができた。このようにして収集されたデータの処理は、プログラムDenzo,Scalepackを用いることにより行った。その結果、図４に示すような像をえることができ、野生型酵素同様に、Ｎ−ｔｅｒドメイン、Ｅｘｏドメイン、Ｆｉｎｇｅｒドメイン、Ｐａｌｍドメイン、Ｔｈｕｍｂドメインの５つのドメインからなることが分かった。また、ＥｘｏドメインとＴｈｕｍｂドメインを間の距離を比較するために、Ｅｘｏドメインを対照として、Ｈ１４７Ｅ変異体と野生型酵素を重ね合わせた（図５）。その結果、Ｈ１４７Ｅ変異体のＴｈｕｍｂドメインが相対的にＥｘｏドメイン側にシフトしていることが明らかになった。ただ、図５を見て分かるようにＴｈｕｍｂドメインの先端部分で３箇所、構造がｄｉｓｏｒｄｅｒしている領域（点線部分）が存在した。Ｎ末端側から順にＤｉｓｏｒｄｅｒ領域Ｉでは、Ｔ６６７からＧ６７７までの１１残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIでは、Ｒ６８９からＧ６９６までの８残基、Ｄｉｓｏｒｄｅｒ領域IIIでは、Ｋ７０５からＤ７１２までの８残基について構造が確認できなかった。これらについては、野生型酵素の構造解析においても同様の結果が得られている。野生型酵素の研究からＴｈｕｍｂドメインは、温度要因が他のドメインに比べ非常に高く、フレキシブルであることが明かとなっており、このためにＴｈｕｍｂドメインの先端部分の電子密度が薄くなり、構造が欠落したのではないかと考えられている。ＴｈｕｍｂドメインのＥｘｏドメイン側へのシフトは、Ｔｈｕｍｂドメイン先端のへリックス領域（６７８−６８８）で、およそ１．５Åであった。このことより、Ｔｈｕｍｂドメインの先端配列であるＤｉｓｏｒｄｅｒ領域IIも、Ｅｘｏドメイン側Ｎシフトしていると考えられる。
更に、図６にＴｈｕｍｂドメインのｄｉｓｏｒｄｅｒしていない複数箇所から、１４７番目のアミノ酸までの距離、およびＥ−Ｃｌｅｆｔと推定される領域を示した。このように、１４７番目のアミノ酸配列を置換することで、Ｅ−Ｃｌｅｆｔの大きさが変化することが示された。これは、ＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列とＴｈｕｍｂド
メインの先端配列が、相互作用しやすい位置に存在し、実際に静電的もしくは疎水的相互作用をしていることを意味していると思われる。
The obtained cells were cultured as follows. First, 6 L of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, pA2) containing sterilized 100 μg / ml ampicillin was dispensed into a 10 L jar fermenter. Escherichia cultivated at 37 ° C. for 16 hours in 50 ml of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco) containing 100 μg / ml ampicillin in advance. Cori JM109 (pKOD HE) (using a 500 ml Sakaguchi flask) was inoculated and cultured at 35 ° C. for 12 hours with aeration. The cells are collected from the culture by centrifugation, suspended in 400 ml of disruption buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 80 mM KCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA), and then subjected to French press treatment. The cells were crushed by the above to obtain a cell lysate. Next, the cell lysate was treated at 85 ° C. for 30 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and heparin sepharose chromatography were performed. Finally, storage buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerin) to obtain a mutant thermostable DNA polymerase (HE). The DNA polymerase activity measurement in the purification step was performed by the following operation. When the enzyme activity was high, the sample was diluted with a storage buffer and measured.
(reagent)
A: 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 μg / ml BSA
B: 2 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 10 mg / ml salmon sperm DNA
(Method)
Add 25 μl of solution A, 5 μl of solution B, 5 μl of solution C, and 10 μl of sterilized water to the microtube, stir and mix, then add 5 μl of the purified enzyme dilution and react at 75 ° C. for 10 minutes. After cooling, 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added. The solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), washed thoroughly with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Packard). Uptake was measured. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that incorporated 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
Example 3 Preparation of Crystal of Mutant KOD DNA Polymerase (H147E) The conditions for crystallization are shown below.
Method: Hanging drop vapor diffusion method Protein solution composition: 6.0mg / ml KOD DNA polymerase (H147E)
50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
0.1mM EDTA
1.0mM DTT
0.001% Tween20
50% Glycerol
Reservoir solution composition: 3% Polyethylene glycol 1450
10 mM NiCl
Glycine-NaOH
17.5% Glycerol
Drop: 2 μl protein solution + 2 μl reservoir solution
Crystallization temperature: 20 ℃
Using these conditions, good crystals (0.2 cm × 0.08 cm × 0.08 cm) as shown in FIG. 3 could be obtained after a few days and used for the next experiment.
Example 4 Measurement of X-ray diffraction data of crystal of mutant KOD DNA polymerase (H147E) In order to suppress damage to the crystal due to X-ray irradiation, diffraction intensity data was measured under 100K liquid nitrogen vapor. At this time, a solution obtained by adding MPD (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to 12% to a solution obtained by mixing equal amounts of a protein solution and a reservoir solution was used as an antifreezing agent. As a result, 0.20 × 0.08 × 0.08 mm crystals could be obtained (FIG. 3). When X-ray diffraction experiments were performed using the crystal, diffraction points up to a resolution of about 2.75 mm were observed, and the space groups and lattice constants shown in Table 2 could be determined. The data collected in this way was processed by using the program Denzo, Scalepack. As a result, an image as shown in FIG. 4 can be obtained, and it was found that the domain consists of five domains, N-ter domain, Exo domain, Finger domain, Palm domain, and Thumb domain, like the wild-type enzyme. Further, in order to compare the distance between the Exo domain and the Thumb domain, the H147E mutant and the wild type enzyme were overlaid using the Exo domain as a control (FIG. 5). As a result, it was revealed that the Thumb domain of the H147E mutant was relatively shifted to the Exo domain. However, as can be seen from FIG. 5, there were three regions (dotted line portions) where the structure was disordered at the tip portion of the Thumb domain. From the N-terminal side, the structure is confirmed for 11 residues from T667 to G677 in the Disorder region I, 8 residues from R689 to G696 in the Disorder region II, and 8 residues from K705 to D712 in the Disorder region III. could not. About these, the same result was obtained also in the structural analysis of the wild-type enzyme. From the research of wild-type enzymes, it is clear that the Thumb domain has a very high temperature factor compared to other domains and is flexible, which reduces the electron density at the tip of the Thumb domain and makes the structure It is thought that it was missing. The shift of the Thumb domain toward the Exo domain was approximately 1.5 mm in the helix region (678-688) at the tip of the Thumb domain. From this, it is considered that the Disorder region II, which is the tip sequence of the Thumb domain, is also shifted N on the Exo domain side.
Further, FIG. 6 shows the distance from a plurality of locations where the Thumb domain is not disordered to the 147th amino acid, and the region presumed to be E-Clleft. Thus, it was shown that the size of E-Cleft changes by replacing the 147th amino acid sequence. This means that the loop sequence present on the C-terminal side of the ExoI motif and the tip sequence of the Thumb domain are located at positions where they are likely to interact, and actually have an electrostatic or hydrophobic interaction. It seems that there is.
Claims (8)
（ただし、「エキソヌクレーゼドメイン」に存在するＥｘｏＩモチーフのＣ末端側に存在するループ配列上のヒスチジン残基（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの場合１４７番目のヒスチジン残基）への変異の導入は除外する）。 A method of changing the properties of a DNA polymerase by introducing a mutation into the amino acid sequence in the vicinity of the “exonuclease domain” and the “Thumb domain” of a thermostable DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity.
(However, the introduction of mutations into histidine residues on the loop sequence existing on the C-terminal side of the ExoI motif in the “exonuclease domain” (the 147th histidine residue in the case of KOD DNA polymerase) is excluded.) .
Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)からなり、該先端部分に少なくとも１つのアミノ酸変異（アミノ酸の置換、付加、挿入、欠失）を導入することを特徴とする、請求項２に記載の方法。 Thumb domain tip is (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-Ala- (Lys / Arg)-
It consists of Gly- (Val / Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met) and introduces at least one amino acid mutation (amino acid substitution, addition, insertion, deletion) at the tip. The method according to claim 2, wherein:
Ala-(Lys/Arg)-Gly-(Val/Ile)-(Lys/Arg)-Pro-Gly-(Thr/Met)からなり、該アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸を、酸性アミノ酸、または塩基性アミノ酸、または疎水性アミノ酸に置換することを特徴とする請求項２に記載の方法。 The amino acid sequence at the tip of the Thumb domain is (Val / Ile) -Ala-Lys- (Lys / Arg) -Leu-Ala-
Ala- (Lys / Arg) -Gly- (Val / Ile)-(Lys / Arg) -Pro-Gly- (Thr / Met), wherein one or more amino acids of the amino acid sequence are acidic amino acids, or The method according to claim 2, wherein the amino acid is substituted with a basic amino acid or a hydrophobic amino acid.
8. A modified thermostable DNA polymerase in which catalytic activity, in particular 3′-5 ′ exonuclease activity and / or PCR efficiency is modulated by the method of claims 1-7.
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| JP2010239881A (en) * | 2009-04-02 | 2010-10-28 | Toyobo Co Ltd | Improved heat-resistant dna polymerase |
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