JP2005058228A - Method for production of ester compound using cutinase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酵素を用いたエステル化合物の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an ester compound using an enzyme.
エステル化合物はカルボン酸とアルコールの縮合物であり、多価カルボン酸と多価アルコールが重縮合したポリエステルは、合成繊維やフィルム等として古くから利用されている。さらに最近では、高粘度、高弾性を有するエンジニアリング・プラスチックが開発される等、工業的に極めて重要なポリマーである。 An ester compound is a condensate of a carboxylic acid and an alcohol, and a polyester obtained by polycondensation of a polyvalent carboxylic acid and a polyhydric alcohol has long been used as a synthetic fiber or film. Furthermore, recently, engineering plastics having high viscosity and high elasticity have been developed.
多価カルボン酸と多価アルコールを用いるポリエステルの製造法は多数報告されている。化学触媒を用いる従来法では、ジカルボン酸の融点が高いために反応温度を高温にするか、反応触媒を用いなければいけないという問題点を有する。これに対し、酵素触媒であるリパーゼを用いて多価カルボン酸と多価アルコールを用いるポリエステルの合成方法が報告されている。例えば、高度に活性化されたジカルボン酸ジエステル（２，２，２−トリクロロエステル）から、またはヒドロキシカルボン酸のエステルおよびヒドロキシカルボン酸のジエステルから出発して、高い質量平均分子量を有するポリエステルを合成するのに成功した例が報告されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。しかしながら、これらの方法は有機溶剤の使用に頼っていた。
Many methods for producing polyesters using polyvalent carboxylic acids and polyhydric alcohols have been reported. In the conventional method using a chemical catalyst, since the melting point of dicarboxylic acid is high, there is a problem that the reaction temperature must be increased or the reaction catalyst must be used. On the other hand, a polyester synthesis method using polyvalent carboxylic acid and polyhydric alcohol using lipase which is an enzyme catalyst has been reported. For example, starting from highly activated dicarboxylic acid diesters (2,2,2-trichloroesters) or starting from esters of hydroxycarboxylic acids and diesters of hydroxycarboxylic acids, polyesters having a high mass average molecular weight are synthesized. Examples that have been successfully achieved have been reported (for example, see
また、有機溶剤を用いない方法としては、溶剤不在下、かつリパーゼの存在下で反応させるポリエステルの製造方法が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法では、系内の水分量が多くなる程、反応が阻害され、収率が低下することが報告されている。そのため、ポリエステルの収率を上げて製造するには、反応により生成した水を除去する必要があり、反応系を減圧下に置いたり、モレキュラーシーブ等の乾燥剤を用いなければならないといった問題点を有していた。
製造コストや環境への影響を考えると、酵素を用いた穏和な条件でポリエステルを安価に合成する方法が望まれているが、これまで多価カルボン酸と多価アルコールを反応中に脱水操作を行わずに効率的にポリエステル製造を行った報告例は無かった。
Moreover, as a method not using an organic solvent, a method for producing a polyester that is reacted in the absence of a solvent and in the presence of lipase has been reported (for example, see Patent Document 1). However, it has been reported that in this method, the reaction is inhibited and the yield decreases as the amount of water in the system increases. Therefore, in order to increase the yield of polyester, it is necessary to remove the water produced by the reaction, and there is a problem that the reaction system must be placed under reduced pressure or a desiccant such as molecular sieve must be used. Had.
Considering the production cost and environmental impact, there is a demand for a method of synthesizing polyester at low cost under mild conditions using enzymes. Until now, dehydration operations have been performed during the reaction of polycarboxylic acids and polyhydric alcohols. There have been no reports of efficient polyester production without this.
一方、クチナーゼは植物の表層を覆うクチンを分解する事が可能な酵素である。リパーゼ同様にトリグリセリドを分解できるが、リパーゼとは根本的に異なる酵素の種類である事が報告されている。例えば、リパーゼを使用した系では水と油の２層の界面上で酵素反応が行われることが特徴であるのに対し、クチナーゼを使用した系では界面上で反応が行なわれていないことが、タンパク質の立体構造の違いと共に報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。クチナーゼを用いたエステル合成反応についての報告も幾つか有るが、これらの反応は有機溶媒の使用に頼った逆ミセル反応である（例えば、非特許文献４参照。）。
本発明は、有機溶媒（出発原料のアルコールは除く。）を必須とすることなく、良好な収率を確保しつつ、脱水操作を不要化もしくは低減することが可能なエステル化合物の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a method for producing an ester compound that can eliminate or reduce the dehydration operation while ensuring a good yield without requiring an organic solvent (excluding starting alcohol). The purpose is to do.
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討し、酵素触媒としてクチナーゼを用いても、有機溶媒を用いることなくエステル化合物を製造できること、さらには、酵素触媒としてリパーゼを用いる場合には、上記の如く、水分存在下では反応が阻害され、反応効率が低下するのに対し、酵素触媒としてクチナーゼを用いる場合には、水分存在下でも反応が阻害されず、寧ろ、適度な水分存在下で、最適な酵素活性を示すことを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems, and that even when cutinase is used as an enzyme catalyst, an ester compound can be produced without using an organic solvent. Further, when a lipase is used as an enzyme catalyst, As described above, the reaction is inhibited in the presence of moisture, and the reaction efficiency is lowered.When cutinase is used as an enzyme catalyst, the reaction is not inhibited even in the presence of moisture, rather, in the presence of moderate moisture, The inventors have found that the enzyme activity is optimal and completed the present invention.
すなわち、本発明は、クチナーゼと０．５質量％〜８．５％質量％の水の存在下、カルボン酸とアルコールとを反応させることを特徴とするエステル化合物の製造方法である。
なお、本明細書において、「０．５質量％〜８．５％質量％の水の存在下、（カルボン酸とアルコールとを）反応させる」とは、反応開始から反応終了までの間、少なくとも一時、反応系内の水分量を０．５質量％〜８．５％質量％とすることを意味するものとする。また、水分量は「反応系全体１００質量％に対する水分量」を意味するものとする。
本発明はまた、カルボン酸が多価カルボン酸であり、アルコールが多価アルコールであり、エステル化合物がポリエステルである上記製造方法に関する。
さらに、クチナーゼがクリプトコッカス エスピー エス−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２）由来のものである、上記製造方法に関する。
That is, this invention is a manufacturing method of the ester compound characterized by making a carboxylic acid and alcohol react in presence of 0.5 mass%-8.5 mass% water of cutinase.
In the present specification, “reacting carboxylic acid and alcohol in the presence of 0.5% by mass to 8.5% by mass of water” means at least from the start of the reaction to the end of the reaction. It means that the amount of water in the reaction system is temporarily 0.5 to 8.5% by mass. In addition, the amount of water means “the amount of water relative to 100% by mass of the entire reaction system”.
The present invention also relates to the above production method, wherein the carboxylic acid is a polyvalent carboxylic acid, the alcohol is a polyhydric alcohol, and the ester compound is a polyester.
Furthermore, it is related with the said manufacturing method whose cutinase is a thing derived from Cryptococcus sp S-2 (Cryptococcus sp S-2).
本発明によれば、有機溶媒（出発原料のアルコールは除く。）を必須とすることなく、良好な収率を確保しつつ、脱水操作を不要化もしくは低減することが可能なエステル化合物の製造方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a method for producing an ester compound that can eliminate or reduce the dehydration operation while ensuring a good yield without requiring an organic solvent (excluding starting alcohol). Can be provided.
本発明のエステルの製造方法は、クチナーゼ酵素を触媒とするエステル化合物の製造方法である。通常のリパーゼ酵素を触媒とする場合と同様に、カルボン酸とアルコールからの水の脱離を伴って反応が進行する酵素反応である。通常、リパーゼ酵素を触媒とするエステル化合物の製造方法では、生成する縮合水は、エステル化反応の逆反応である加水分解反応を促進し、エステル化合物の製造を阻害する方向に働く。このため、反応を迅速に進行させるためには、酵素を水和するのに必要な最低量以外の水を除去する必要がある。そのために、反応系を真空に近い減圧処理を施して縮合水を除いたり、モレキュラーシーブスによる縮合水の除去操作を行う必要がある。本発明の製造方法は、このような縮合水の除去操作にかかる負荷を軽減、つまり減圧処理や、モレキュラーシーブスによる縮合水の除去作業にかかる負荷を軽減できる。 The method for producing an ester of the present invention is a method for producing an ester compound using a cutinase enzyme as a catalyst. As in the case of using a normal lipase enzyme as a catalyst, the reaction proceeds with the elimination of water from the carboxylic acid and alcohol. In general, in a method for producing an ester compound using a lipase enzyme as a catalyst, the condensed water produced acts in a direction that promotes a hydrolysis reaction, which is the reverse reaction of the esterification reaction, and inhibits the production of the ester compound. For this reason, in order for the reaction to proceed rapidly, it is necessary to remove water other than the minimum amount necessary to hydrate the enzyme. Therefore, it is necessary to remove the condensed water by subjecting the reaction system to a pressure reduction process close to vacuum, or to perform an operation of removing condensed water using molecular sieves. The production method of the present invention can reduce the load on the operation of removing the condensed water, that is, the load on the operation of removing the condensed water by the decompression process or molecular sieves.
具体的には、反応系に少量の水を含んでいても反応は阻害されることなく進行し、その反応系の水分量が０．５質量％〜８．５質量％であるとき、エステル化合物の合成の反応が良好に行われる。さらに好ましくは、反応系の水分量が１質量％〜６質量％であるときに合成の反応が良好に行われる。例えば、これらの水分量の範囲にエステル合成の反応系をコントロールするのであれば、減圧処理による脱水を行う場合も真空に近い減圧処理の必要はない。また、溶剤や界面活性剤の使用に頼った逆ミセルの反応系を用いなくても、エステル合成の反応が良好に行われる。
本発明の製造方法では、反応開始から反応終了までの間、少なくとも一時、反応系内の水分量を上記範囲とすればよい。ただし、反応効率等を考慮すれば、水分量が上記範囲を充足する時間が長い程好ましく、反応開始から反応終了まで常時、上記範囲の水分量が維持されることが最も好ましい。
Specifically, even when the reaction system contains a small amount of water, the reaction proceeds without being inhibited, and when the water content of the reaction system is 0.5 mass% to 8.5 mass%, an ester compound The synthesis reaction of More preferably, the synthesis reaction is favorably performed when the water content of the reaction system is 1% by mass to 6% by mass. For example, if the reaction system for ester synthesis is controlled within these water content ranges, there is no need for a vacuum treatment close to vacuum even when dehydration is performed by a vacuum treatment. Further, the ester synthesis reaction can be carried out satisfactorily without using a reverse micelle reaction system that relies on the use of a solvent or a surfactant.
In the production method of the present invention, the amount of water in the reaction system may be within the above range at least temporarily from the start of the reaction to the end of the reaction. However, considering the reaction efficiency and the like, it is preferable that the time for which the amount of water satisfies the above range is longer, and it is most preferable that the amount of water in the above range is always maintained from the start of the reaction to the end of the reaction.
本発明で使用することのできるクチナーゼとしては、種々の起源のものを使用できるが、例えば、クチナーゼが、クリプトコッカス エスピー エス−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２；ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５５）、フサリウム ソラニ ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｕ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ；ＩＦＯ ９４２５、ＩＦＯ ９９７５等）、ボトリチス シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ；ＡＴＣＣ １１５４２等）、グロメレラ シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ；ＩＦＯ ５２５７、ＩＦＯ ５９０７、ＩＦＯ ５９１０等）、ファイトフソーラ ブラシカエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＣＢＳ １７８．８７、ＣＢＳ １７９．８７等）、ファイトフソーラ カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ；ＣＢＳ １２８．８３、ＣＢＳ １７８．２６等）、ネクトリア ハエマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｃｏｃａ；ＡＴＣＣ １６２３９等）、モニリニア フルクチコラ（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ；ＩＦＯ ９０６８、ＩＦＯ ３０４５１等）、ブルメリア グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ；ＩＦＯ ４０７５、ＩＦＯ ３０１０２等）、ピレノペジザ ブラシカエ（Ｐｙｒｅｎｏｐｅｚｉｚａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ；ＡＴＣＣ ２００７０９、ＡＴＣＣ ２００７１０、ＡＴＣＣ ４８３４６、ＡＴＣＣ ６４６８０等）、アルテルナリア ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ；ＩＦＯ ３１２２６、ＩＦＯ ３１２２７等）、アスコチタ ラビエイ（Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｒａｂｉｅｉ；ＡＴＣＣ ２４８９１等）、の由来のものを好適な例として挙げることができる。特にＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２由来のクチナーゼが好ましい。これらのクチナーゼは少なくとも一種使用することが必要であるが、場合によって２種以上のものを組み合わせて使用する事も可能である。 As the cutinase that can be used in the present invention, those of various origins can be used. For example, the cutinase is Cryptococcus sp S-2 (FERM P-15155), Fusarium solanipi Solani pisi; IFO 9425, IFO 9975 etc.), Botrytis cinerea (Botrytis cinerea; ATCC 11542 etc.), Glomerella singulata (Gomerella cingulata; IFO 5257, IFO 5907, IFO 5910, B 87, CBS 179.87, etc.), Fight Fusora Kapsi (Ph topophora capsici; CBS 128.83, CBS 178.26, etc.), Nectria haematococca (Nectria haematococa; ATCC 16239, etc.), moniline fructicola (Monilinia fluticola; IFO 9068, IFO 9068, Aspergillus oryzae; IFO 4075, IFO 30102, etc.), Pyrenopeziza brassicae (ATCC 200709, ATCC 200710, ATCC 48346, ATCC 64680, etc.), Alternaria terridium terridium terrier assicicola; IFO 31226, IFO 31227, etc.), Asukochita Rabiei (Ascochyta rabiei; ATCC 24891, etc.) may be mentioned as preferred examples those derived from. A cutinase derived from Cryptococcus sp S-2 is particularly preferable. These cutinases need to be used in at least one kind, but in some cases, two or more kinds can be used in combination.
また、他のエステル合成を行う事が可能な酵素、例えばリパーゼ等と組み合わせて使用する事も可能である。
なお、従来、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２由来の酵素はリパーゼであると考えられていたが（例えば、特開平11-244892号公報）、その後、遺伝子などを詳細に研究した結果、クチナーゼである事が明らかとなっている(日本生物工学会大会、講演番号805「Cryptococcus sp. S-2由来リパーゼ(クチナーゼ)によるポリ乳酸の分解」、特願2002-239842号)。
It can also be used in combination with other enzymes capable of synthesizing esters, such as lipases.
Conventionally, an enzyme derived from Cryptococcus sp S-2 was considered to be a lipase (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-244892). It has been clarified (Japan Society for Biotechnology, Lecture No. 805 “Cryptococcus sp. S-2 lipase (cutinase) degradation of polylactic acid”, Japanese Patent Application No. 2002-239842).
本発明で使用するクチナーゼは、上記クチナーゼ生産微生物を常法に従って培養し、培養物から分離、精製する事によって取得する事が出来る。例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２の場合、ＹＭ培地（酵母エキス０．３質量％、麦芽エキス０．５質量％、ペプトン０．５質量％、グルコース１質量％）にて２５℃、４０時間前後培養し、得られた菌体（５．４〜５．８×１０８ヶ／ｍｌ）を本培養の接種菌とする。
The cutinase used in the present invention can be obtained by culturing the above cutinase-producing microorganism according to a conventional method, and separating and purifying it from the culture. For example, in the case of Cryptococcus sp S-2, cultivation is performed at 25 ° C. for about 40 hours in a YM medium (yeast extract 0.3 mass%, malt extract 0.5 mass%, peptone 0.5 mass%,
酵母エキス０．５質量％、ＫＨ２ＰＯ４１質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ．１質量％、トリオレイン１質量％を酵素生産培地とし、前培養した菌を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃１００ｒｐｍの振とう培養にて、クチナーゼの生産を行えば良い。 Yeast extract 0.5% by mass, KH 2 PO 4 1% by mass, MgSO 4 .7H 2 O.I. 1% by mass and 1% by mass of triolein are used as the enzyme production medium, 1% (v / v) of the pre-cultured bacteria is inoculated, and cutinase is produced by shaking culture at 25 ° C. and 100 rpm.
培養後、クチナーゼを培養物から分離精製する。その方法は常法に従えばよいが、酵母細胞を除いた培養液に対して１０，０００ｒｐｍ２０分間の遠心分離を行った後、平均孔径０．４５μｍのメンブランフィルターを用い、限外濾過により精製濃縮することが好ましい。さらに、必要に応じて、クロマトグラフィー処理等を実施してもよい。 After cultivation, cutinase is separated and purified from the culture. The method may be according to a conventional method, but after centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes with respect to the culture solution excluding the yeast cells, it is purified and concentrated by ultrafiltration using a membrane filter having an average pore size of 0.45 μm. It is preferable to do. Furthermore, you may implement a chromatography process etc. as needed.
本発明で使用することの出来るクチナーゼは、酵素タンパク質そのままで使用可能であるが、クチナーゼの酵素としての機能を失わない限り、酵素の安定化や基質選択性を高める等の必要に応じて、酵素の修飾処理を行ったり固定化処理を行って使用する事も可能である。 The cutinase that can be used in the present invention can be used as an enzyme protein as it is. However, as long as the function of cutinase as an enzyme is not lost, the enzyme can be used as needed to stabilize the enzyme or increase the substrate selectivity. It is also possible to perform the modification process or the immobilization process.
出発原料のカルボン酸としては制限なく、１価カルボン酸と、１分子中にカルボキシ基を２個以上有する多価カルボン酸のいずれを用いることもできる。 The starting carboxylic acid is not limited, and any of monovalent carboxylic acid and polyvalent carboxylic acid having two or more carboxy groups in one molecule can be used.
１価カルボン酸としては、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸等が挙げられる。
２価の多価カルボン酸としては、例えば、１）シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカンジカルボン酸、ドデカンジカルボン酸、テトラデカンジカルボン酸、フマル酸、イタコン酸、マレイン酸、リンゴ酸等の脂肪族ジカルボン酸、２）フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、テトラクロルフタル酸、クロルフタル酸、ニトロフタル酸、ｐ−カルボキシフェニル酢酸、ｐ−フェニレン二酢酸、ｍ−フェニレンジグリコール酸、ｐ−フェニレンジグリコール酸、ｏ−フェニレンジグリコール酸、ジフェニル酢酸、ジフェニル−ｐ，ｐ’−ジカルボン酸、ナフタレン−１，４−ジカルボン酸、ナフタレン−１，５−ジカルボン酸、ナフタレン−２，６−ジカルボン酸、アントラセンジカルボン酸等の芳香族ジカルボン酸、３）ヘキサヒドロテレフタル酸等の脂環式ジカルボン酸等が挙げられる。
３価以上の多価カルボン酸としては、例えば、クエン酸、トリメリット酸、メチルシクロヘキセントリカルボン酸、ピロメリット酸、ナフタレントリカルボン酸、ナフタレンテトラカルボン酸、ピレントリカルボン酸、ピレンテトラカルボン酸等が挙げられる。
Examples of the monovalent carboxylic acid include formic acid, acetic acid, propionic acid, butanoic acid, pentanoic acid, hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, nonanoic acid, decanoic acid and the like.
Examples of the divalent polycarboxylic acid include 1) oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, undecanedicarboxylic acid, dodecanedicarboxylic acid, tetradecane Aliphatic dicarboxylic acids such as dicarboxylic acid, fumaric acid, itaconic acid, maleic acid and malic acid, 2) phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, tetrachlorophthalic acid, chlorophthalic acid, nitrophthalic acid, p-carboxyphenylacetic acid, p -Phenylenediacetic acid, m-phenylenediglycolic acid, p-phenylenediglycolic acid, o-phenylenediglycolic acid, diphenylacetic acid, diphenyl-p, p'-dicarboxylic acid, naphthalene-1,4-dicarboxylic acid, naphthalene- 1,5-dicarboxylic acid, naphthalene-2,6-dicarbo Examples thereof include aromatic dicarboxylic acids such as acid and anthracene dicarboxylic acid, and 3) alicyclic dicarboxylic acids such as hexahydroterephthalic acid.
Examples of the trivalent or higher polyvalent carboxylic acid include citric acid, trimellitic acid, methylcyclohexeric acid, pyromellitic acid, naphthalenetricarboxylic acid, naphthalenetetracarboxylic acid, pyrenetricarboxylic acid, and pyrenetetracarboxylic acid. .
カルボン酸は、酸無水物の形態で、反応に供することができる。この場合には、反応系内の水と反応してカルボン酸が生成され、アルコールと反応する。
酸無水物としては、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、テトラヒドロ無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸、テトラブロモ無水フタル酸、テトラクロル無水フタル酸、無水ヘット酸、無水ハイミック酸、無水トリメリット酸、メチルシクロヘキセントリカルボン酸無水物、無水ピロメリット酸等が挙げられる。
カルボン酸及び／又はその酸無水物は、１種又は２種以上を用いることができる。
Carboxylic acid can be subjected to the reaction in the form of an acid anhydride. In this case, it reacts with water in the reaction system to produce carboxylic acid and reacts with alcohol.
Acid anhydrides include succinic anhydride, maleic anhydride, phthalic anhydride, tetrahydrophthalic anhydride, hexahydrophthalic anhydride, tetrabromophthalic anhydride, tetrachlorophthalic anhydride, het acid anhydride, hymic anhydride, trimellitic anhydride Methylcyclohexene carboxylic anhydride, pyromellitic anhydride and the like.
1 type (s) or 2 or more types can be used for carboxylic acid and / or its acid anhydride.
出発原料のアルコールとしては制限なく、１価アルコールと、１分子中に水酸基を２個以上有する多価アルコールのいずれを用いることもできる。
１価アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール等が挙げられる。
２価の多価アルコールとしては、例えば、エタンジオール、プロパンジオール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、トリエチレングリコール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ドデカンジオール等の脂肪族ジオール、水素化ビスフェノールＡ、ビスフェノールＡ、シクロヘキサンジオール等の芳香族、または脂環式のジオールが挙げられる。
３価以上の多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、トリスヒドロキシメチルアミノペンタン、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ヘキサメチロールメラミン、ヘキサエチロールメラミン、テトラメチロールベンゾグアナミン、テトラエチロールベンゾグアナミン等が挙げられる。
これらアルコールは１種又は２種以上を用いることができる。
The starting alcohol is not limited, and any of monohydric alcohols and polyhydric alcohols having two or more hydroxyl groups in one molecule can be used.
Examples of the monohydric alcohol include methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol and the like.
Examples of the divalent polyhydric alcohol include ethanediol, propanediol, butanediol, pentanediol, hexanediol, diethylene glycol, dipropylene glycol, neopentyl glycol, triethylene glycol, heptanediol, octanediol, nonanediol, decane. Examples thereof include aliphatic diols such as diol and dodecanediol, aromatics such as hydrogenated bisphenol A, bisphenol A, and cyclohexanediol, or alicyclic diols.
Examples of the trihydric or higher polyhydric alcohol include glycerin, trimethylol ethane, trimethylol propane, trishydroxymethylaminopentane, pentaerythritol, dipentaerythritol, hexamethylol melamine, hexaethylol melamine, tetramethylol benzoguanamine, tetraethyl. Examples thereof include roll benzoguanamine.
These alcohols can be used alone or in combination of two or more.
カルボン酸とアルコールとの組み合わせは制限なく、目的物に合わせて選定される。
本発明の製造方法では、クチナーゼを触媒として使用することにより、系内に水分が存在しても、エステル化反応の反応性が水分の影響を受けにくい。このため、本発明は、１価カルボン酸と１価アルコールの組み合わせよりも、反応中により多くの水が発生する多価カルボン酸と多価アルコールの組み合わせによるポリエステルの製造に好ましく適用できる。
The combination of carboxylic acid and alcohol is selected according to the object without limitation.
In the production method of the present invention, by using cutinase as a catalyst, the reactivity of the esterification reaction is hardly affected by moisture even if moisture is present in the system. Therefore, the present invention can be preferably applied to the production of a polyester using a combination of a polyvalent carboxylic acid and a polyhydric alcohol that generate more water during the reaction than a combination of a monovalent carboxylic acid and a monohydric alcohol.
出発原料のカルボン酸及び／又はその酸無水物とアルコールの仕込量は特に制限されないが、カルボン酸のカルボキシ基とアルコールの水酸基が等モルとなるように使用することが好ましい。
クチナーゼの添加量も制限されないが、カルボン酸及び／又はその酸無水物１モルに対して、タンパク質質量で０．０１ｇ〜１０ｇ、特に０．５ｇ〜５ｇが好ましい。
The amount of the carboxylic acid and / or acid anhydride and alcohol used as the starting material is not particularly limited, but it is preferably used so that the carboxy group of the carboxylic acid and the hydroxyl group of the alcohol are equimolar.
The amount of cutinase added is not limited, but is preferably 0.01 g to 10 g, and particularly preferably 0.5 g to 5 g in terms of protein mass with respect to 1 mol of carboxylic acid and / or acid anhydride thereof.
反応温度は制限されないが、良好な収率が得られることから、２０℃〜７０℃が好ましい。
本発明では脱水操作が基本的には不要であるので、反応圧力も特に制限なく、常圧で実施することができる。
但し、水分量が規定する上限（８．５質量％）を超える時間が著しく長くなるような場合には、必要に応じて、減圧下で脱水する操作を実施することは差し支えない。脱水操作を行うにしても、本発明では水分量の許容範囲が広いので、リパーゼを用いる場合に比して、減圧度は低く設定すればよく、常時脱水する必要はないので、脱水操作の時間も短く、操作はより簡略である。
Although reaction temperature is not restrict | limited, Since a favorable yield is obtained, 20 to 70 degreeC is preferable.
In the present invention, since dehydration is basically unnecessary, the reaction pressure is not particularly limited and can be carried out at normal pressure.
However, if the amount of water exceeds the upper limit (8.5% by mass) specified, the operation of dehydrating under reduced pressure may be performed as necessary. Even when the dehydration operation is performed, in the present invention, since the allowable range of water content is wide, the degree of vacuum may be set lower than when lipase is used, and it is not necessary to always dehydrate, so the time for the dehydration operation Shorter and the operation is simpler.
本発明のエステル化合物の製造方法は、有機溶媒（出発原料のアルコールは除く。）を用いる必要がないため、環境への影響が小さく好ましいが、必要に応じて各種有機溶媒を添加することは差し支えない。有機溶媒としては、イソプロピルエーテルやイソオクタン等が挙げられる。 The production method of the ester compound of the present invention is preferable because it does not require the use of an organic solvent (excluding the starting alcohol) and has a small impact on the environment. However, various organic solvents may be added as necessary. Absent. Examples of the organic solvent include isopropyl ether and isooctane.
以上説明したように、本発明のエステル化合物の製造方法は、酵素触媒としてクチナーゼを用い、かつ、反応開始から反応終了までの間、少なくとも一時、反応系内の水分量を０．５質量％〜８．５％質量％とすることで、良好な収率を確保しつつ、脱水操作を不要化もしくは低減することを実現したものである。
本発明では、反応が水分により阻害されないので、良好な収率を安定的に確保できる。また、脱水操作が不要化又は低減できるので、製造装置や製造工程を簡略化でき、製造性を著しく向上できる。また、有機溶媒（出発原料のアルコールは除く。）を用いる必要がないので、環境にも優しい。
さらに、本発明では、反応が水分により阻害されないので、ポリエステルの製造に適用した場合、リパーゼを用いる場合に比して、重合反応がより効率良く進行し、同じ時間重合を行っても、ポリエステルの重合度が相対的に高まる（比較的低分子量成分が少なく、比較的高分子量成分が多くなる）傾向にあり、好適である。
As described above, the method for producing an ester compound of the present invention uses cutinase as an enzyme catalyst, and at least temporarily during the period from the start of the reaction to the end of the reaction, By setting the content to 8.5% by mass, it is possible to eliminate or reduce the dehydration operation while securing a good yield.
In the present invention, since the reaction is not inhibited by moisture, a good yield can be stably secured. Further, since the dehydration operation can be eliminated or reduced, the manufacturing apparatus and the manufacturing process can be simplified, and the productivity can be remarkably improved. In addition, since it is not necessary to use an organic solvent (excluding starting alcohol), it is environmentally friendly.
Furthermore, in the present invention, since the reaction is not inhibited by moisture, when applied to the production of polyester, the polymerization reaction proceeds more efficiently than when lipase is used. The degree of polymerization tends to be relatively high (relatively low molecular weight component is small and relatively high molecular weight component is relatively large), which is preferable.
以下に、本発明に係る試験例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、「％」は特に断りの無い限り質量％を表す。 Although the test example which concerns on this invention is given to the following, this invention is not limited to these. “%” Represents mass% unless otherwise specified.
（製造例）
酵母エキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１％、トリオレイン１％からなるクチナーゼ生産培地に前培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ Ｓ−２菌（ＦＥＲＭ Ｐ１５１５５）を１％接種し、初期ｐＨ５．６、２５℃、１００ｒｐｍで１２０時間振とう培養した。
クチナーゼの精製は次のようにして行った。酵母細胞を除いた培養液に対して１０，０００ｒｐｍ２０分間の遠心分離を行った後、平均孔径０．４５μｍのメンブランフィルター（旭化成ケミカルズ社製、マイクローザＵＦ ＡＰＩ−１０１３：分画分子量６０００ＫＤ）を用い、限外濾過により精製濃縮し酵素液を得た。
得られたクチナーゼを下記試験例に供した。
(Production example)
1% Cryptococcus sp S-2 (FERM P15155) pre-cultured in a cutinase production medium consisting of yeast extract 0.5%, KH 2 PO 4 1%, MgSO 4 .7H 2 O 0.1%, triolein 1% Inoculated and cultured with shaking at initial pH 5.6, 25 ° C., 100 rpm for 120 hours.
Cutinase was purified as follows. After centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes with respect to the culture solution excluding the yeast cells, a membrane filter having an average pore size of 0.45 μm (manufactured by Asahi Kasei Chemicals Corporation, Microza UF API-1013: molecular weight cut off 6000 KD) was used. Then, it was purified and concentrated by ultrafiltration to obtain an enzyme solution.
The obtained cutinase was subjected to the following test examples.
（試験例１）
１０ｍｌ容の試験管に、アジピン酸０．１５ｇ、ブタノール３ｇ、クチナーゼ０．００５ｇを入れ、さらに水を０〜１０％の範囲の種々の濃度となるように加えて、４０℃で２４時間反応させた時のアジピン酸ジブチルの生成量をガスクロマトグラフィーで測定した（試験Ｎｏ．１〜１１）。
比較のため、クチナーゼの代わりに、市販Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来リパーゼ(Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ ＡＳ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｎｏ ＳＰ ４３５)を０．０１ｇ用いた以外は同様の操作を行った（試験Ｎｏ．１２〜１６）。
(Test Example 1)
In a 10-ml test tube, add 0.15 g of adipic acid, 3 g of butanol, and 0.005 g of cutinase, add water to various concentrations ranging from 0 to 10%, and react at 40 ° C. for 24 hours. The amount of dibutyl adipate produced was measured by gas chromatography (Test Nos. 1 to 11).
For comparison, the same operation was performed except that 0.01 g of commercially available Candida antarctica-derived lipase (Novo Industry AS Catalogue no SP 435) was used instead of cutinase (Test Nos. 12 to 16).
初期水分量と得られたアジピン酸ジブチルのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）収量を図１に示す。なお、図示するアジピン酸ジブチルの収量はＧＣピークの生データであり、２００００００は、アジピン酸ジブチル濃度４．５８ミリモル／lに相当する。
リパーゼを用いた場合には、初期水分量の上昇に伴い、アジピン酸ジブチルの生成量が減少した。これに対し、クチナーゼを用いた場合は、初期水分量が４％までは、初期水分量の上昇に伴ってアジピン酸ジブチルの生成量が上昇し、初期水分量が４％を超えると、初期水分量の上昇に伴ってアジピン酸ジブチルの生成量が減少し、水分量に好適な範囲があることが明らかとなった。
すなわち、リパーゼを用いる場合には、系内に存在する水（発生する縮合水を含む）の影響を受け、反応が阻害されるのに対し、クチナーゼでは、水によって反応が阻害されることなく、寧ろ反応が促進されることが、明らかとなった。
エステル生成時には縮合水が発生するが、仮にこの反応系でブタノールとアジピン酸が完全に反応した場合、理論上１．２％相当の縮合水が発生する。参考のため、各試験における初期水分量と理論上の反応後の水分量の関係を表１に示す。
図１、表１に示す結果から、クチナーゼを用いる場合には、初期水分量が４％を挾む所定範囲の時に良好な収率が得られること、具体的には、反応中少なくとも一時、０．５質量％〜８．５質量％の水が存在している時、良好な収率が得られることが明らかとなった。
The initial water content and the gas chromatography (GC) yield of the resulting dibutyl adipate are shown in FIG. The yield of dibutyl adipate shown in the figure is raw data of the GC peak, and 2000000 corresponds to a dibutyl adipate concentration of 4.58 mmol / l.
When lipase was used, the production amount of dibutyl adipate decreased as the initial water content increased. In contrast, when cutinase was used, the amount of dibutyl adipate increased with an increase in the initial water content up to 4% of the initial water content, and the initial water content exceeded 4% when the initial water content exceeded 4%. As the amount increased, the production amount of dibutyl adipate decreased, and it became clear that there was a suitable range for the amount of water.
That is, when lipase is used, the reaction is affected by the water present in the system (including the condensed water generated), whereas the reaction is not inhibited by water in cutinase, Rather, it became clear that the reaction was promoted.
Condensed water is generated when the ester is produced. If butanol and adipic acid are completely reacted in this reaction system, theoretically 1.2% of condensed water is generated. For reference, Table 1 shows the relationship between the initial moisture content in each test and the theoretical moisture content after the reaction.
From the results shown in FIG. 1 and Table 1, when cutinase is used, a good yield can be obtained when the initial water content is within a predetermined range including 4%. Specifically, at least once during the reaction, 0 It has been found that good yields are obtained when from 0.5% to 8.5% by weight of water is present.
（試験例２）
１５×１５×１５０ｍｍの試験管に、アジピン酸１．０ｇ、１，４−ブタンジオール０．６ｇ、クチナーゼ０．００３ｇを入れ、さらに水を０〜６％の範囲の種々の濃度となるように加えて、４０℃で３時間反応させた時のポリエステルの生成量を、酸価（試料１ｇ中に存在するカルボキシ基を中和するのに要する水酸化カリウムのｍｇ数）の低下により測定した（試験Ｎｏ．１７〜２０）。酸価が低い程、カルボキシ基の残存量が少なく、合成反応が進んでいることを示す。
比較のため、クチナーゼの代わりに、試験例１試験Ｎｏ．１２〜１６と同じリパーゼを０．００３ｇ用いた以外は同様の操作を行った（試験Ｎｏ．２１〜２４）。
(Test Example 2)
In a 15 × 15 × 150 mm test tube, 1.0 g of adipic acid, 0.6 g of 1,4-butanediol and 0.003 g of cutinase are added, and water is adjusted to various concentrations ranging from 0 to 6%. In addition, the amount of polyester produced when reacted at 40 ° C. for 3 hours was measured by a decrease in acid value (mg of potassium hydroxide required to neutralize carboxy groups present in 1 g of sample) ( Test No. 17-20). The lower the acid value, the smaller the residual amount of carboxy groups, indicating that the synthesis reaction is progressing.
For comparison, instead of cutinase, Test Example 1 Test No. The same operation was performed except that 0.003 g of the same lipase as 12 to 16 was used (Test Nos. 21 to 24).
初期水分量と測定した酸価の関係を図２に示す（図中、酸価の単位は「ｍｇＫＯＨ／ｇ」である。）。
リパーゼを用いた場合には、初期水分量の上昇に伴って酸価が上昇し、反応効率が低下したのに対し、クチナーゼを用いた場合は、評価した範囲内では、初期水分量の上昇に伴って酸価が大きく低下し、反応効率が大きく上昇した。
各試験における、初期水分量と反応後の水分量（カールフィッシャー水分計による実測値）の関係を表２に示す。
一般に、ポリエステル合成時には縮合水が大量に発生する傾向にある。本試験例では脱水操作を行っていないため、例えば、リパーゼを用いた初期水分量が０％の試験Ｎｏ．２１において、３時間後の水分量は３％に達していた。
しかしながら、クチナーゼを用いる場合には、大量の水分が発生するポリエステルの製造においても、良好な収率が確保されることが明らかとなった。
The relationship between the initial water content and the measured acid value is shown in FIG. 2 (in the figure, the unit of the acid value is “mgKOH / g”).
When lipase was used, the acid value increased with an increase in the initial moisture content, and the reaction efficiency decreased.When cutinase was used, the initial moisture content increased within the evaluated range. Along with this, the acid value decreased greatly, and the reaction efficiency increased greatly.
Table 2 shows the relationship between the initial moisture content and the moisture content after reaction (actually measured value by Karl Fischer moisture meter) in each test.
In general, a large amount of condensed water tends to be generated during polyester synthesis. Since no dehydration operation was performed in this test example, for example, test No. 1 with an initial water content of 0% using lipase was used. 21, the water content after 3 hours reached 3%.
However, when cutinase is used, it has been clarified that a good yield can be secured even in the production of polyester that generates a large amount of moisture.
（試験例３）
１０ｍｌ容の試験管に、アジピン酸１．４２ｇ、１，４−ブタンジオール０．９ｇ、クチナーゼ０．０２ｇを入れ、水を１％となるように加えて、４０℃で７２時間反応させた。得られたポリエステルの分子量分布をゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定した。得られたＧＰＣチャートを図３に示す。反応後の理論上の水分量は、１６．５％であった。
クチナーゼの代わりに、試験例１試験Ｎｏ．１２〜１６と同じリパーゼを０．０２ｇ用い、水を加えなかった以外は同様の操作を行った。反応後の理論上の水分量は、１６．５％であった。
(Test Example 3)
In a 10 ml test tube, 1.42 g of adipic acid, 0.9 g of 1,4-butanediol and 0.02 g of cutinase were added, water was added to 1%, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 72 hours. The molecular weight distribution of the obtained polyester was measured by gel permeation chromatography (GPC). The obtained GPC chart is shown in FIG. The theoretical water content after the reaction was 16.5%.
Instead of cutinase, Test Example 1 Test No. The same operation was performed except that 0.02 g of the same lipase as 12 to 16 was used and water was not added. The theoretical water content after the reaction was 16.5%.
図３に示すように、いずれの酵素を用いた場合も、質量平均分子量１２００程度のポリエステルが得られたが、リパーゼを用いた場合のチャートの符号５〜８等で示す成分の比較から、リパーゼに比して、クチナーゼでは比較的低分子量成分が少なく、比較的高分子量成分が多く生成されており、相対的に重合度の高いポリエステルが生成されることが明らかとなった。
この結果からも、リパーゼを用いる場合には、系内に存在する水の影響を受け、重合反応が阻害されるのに対し、クチナーゼでは、系内に存在する水によって反応が阻害されることなく、寧ろ反応が促進されることが、裏付けられた。
なお、図３に示すチャートでは、例えば、ゲル透過時間３３分が分子量約１０００KDに相当する。
As shown in FIG. 3, when any enzyme was used, a polyester having a mass average molecular weight of about 1200 was obtained. From the comparison of components indicated by
From this result, when lipase is used, the polymerization reaction is inhibited due to the influence of water present in the system, whereas in cutinase, the reaction is not inhibited by the water present in the system. Rather, it was confirmed that the reaction was promoted.
In the chart shown in FIG. 3, for example, a gel permeation time of 33 minutes corresponds to a molecular weight of about 1000 KD.
（試験例４）
３００ｍＬ容のフラスコに、アジピン酸２．１９ｇ、１，４−ブタンジオール１．５ｇ、クチナーゼ０．０２ｇを入れ、水を４％となるように加え、４０℃に加熱してポリエステル合成を行った。反応開始１時間後に、酸価（単位「ｍｇＫＯＨ／ｇ」は４５６．７(理論値)から２７２．９（実測値）まで低下し、良好に反応が進行していることが確認された。この時点の系内の水分量は７．７％であった。水分量が本発明で規定する範囲の上限に近い値であったので、これ以降は、緩やかに減圧にし（２０ｋＰａ）、脱水を行いながら反応を続けた。
反応開始８時間後の酸価は４６．８まで低下しており、重合度７９２．９（酸価から算出）のポリエステルが合成されていることが確認された。このときの反応系内の水分量は０．７％であった。
その後、６０℃に昇温し、さらに２時間反応を続けることで、酸価は３３まで低下し、重合度９７８．２（酸価から算出）のポリエステルが合成された。このときの水分量は０．３％であった。
酸価と水分量の経時変化を図４に示す。
本試験例では、略全反応工程で、水分量は０．５〜８．５％の範囲内であった。
図示するように、本発明の製造方法を適用することで、反応の進行と共に、酸価が大きく低下し、良好な収率でポリエステルを製造することができた。
(Test Example 4)
Into a 300 mL flask, 2.19 g of adipic acid, 1.5 g of 1,4-butanediol, and 0.02 g of cutinase were added, water was added to 4%, and the mixture was heated to 40 ° C. to synthesize polyester. . One hour after the start of the reaction, the acid value (unit “mgKOH / g” decreased from 456.7 (theoretical value) to 272.9 (actual value), confirming that the reaction was proceeding well. The water content in the system at that time was 7.7%, and since the water content was close to the upper limit of the range defined in the present invention, the pressure was gradually reduced (20 kPa) and dehydration was performed thereafter. The reaction continued.
The
Thereafter, the temperature was raised to 60 ° C., and the reaction was further continued for 2 hours, whereby the acid value was lowered to 33, and a polyester having a polymerization degree of 978.2 (calculated from the acid value) was synthesized. The water content at this time was 0.3%.
FIG. 4 shows changes with time in the acid value and the water content.
In this test example, the water content was in the range of 0.5 to 8.5% in almost all reaction steps.
As shown in the figure, by applying the production method of the present invention, the acid value greatly decreased with the progress of the reaction, and it was possible to produce the polyester with a good yield.
本発明のエステル化合物の製造方法は、ポリエステルの製造等に好ましく適用できる。 The method for producing an ester compound of the present invention can be preferably applied to the production of polyester.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6010014549, 日本醸造協会誌， ２００３．０１， Ｖｏｌ．９８， Ｎｏ．１， ｐ．３７−３８ * |
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